JP2022518207A - 酸化コレステロールを含有する薬物送達システム - Google Patents

Abstract

脂質ナノ粒子およびその組成物が本明細書で開示される。例示的なナノ粒子組成物は、イオン化脂質と、リン脂質と、ＰＥＧ－脂質と、Ｄステロール環の近くで、ヒドロキシル基で修飾されたコレステロールとを含む。開示されるナノ粒子組成物は、肝細胞よりも優先的に肝臓クッパー細胞および内皮細胞を標的化することができ、機能不全クッパー細胞および内皮細胞が病因に関与する肝臓疾患の処置に有益なはずである。

Description

関連出願情報
本出願は、２０１９年１月１７日に出願された米国特許出願第６２／７９３６７１号に基づく優先権を主張する。前記は、これにより全体が参照により本明細書に組み込まれる。

連邦政府資金による研究の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた１ＲＯ１ＤＥ０２６９４１－０１Ａ１、Ｔ３２ＧＭ００８４３３およびＴ３２ＥＢ０２１９６２の下で、政府支援を受けてなされた。政府は、本発明における一定の権利を有する。

本発明は、概して、薬物送達システムおよびその使用方法に関する。

治療用タンパク質を作製する、または遺伝子発現を修飾するためのＲＮＡの使用は、疾患を処置するための有望なアプローチである。局所および全身ｍＲＮＡ送達におけるいくつかの前進があった（K. A. Hajj, K. A. Whitehead, Nature Reviews Materials, 2, 17056 (2017)）。しかしながら、器官および腫瘍微小環境内の多くの細胞型への低用量ｍＲＮＡ送達は困難なままである。治療用ＲＮＡを一定の微小環境内の細胞に効率的に送達するナノ粒子の特定は、ナノ粒子が特定の細胞型を優先的に標的化する傾向がある、例えば、肝臓では、ナノ粒子が肝細胞を優先的に標的化するので、困難である。さらに、微小環境内の特定の細胞型を標的化するナノ粒子は、主に、インビボでのナノ粒子ｍＲＮＡ送達を研究するためのハイスループット法が存在しないために、設計するのが困難である。

細胞培養は複雑なインビボ微小環境内の送達の不十分な予測因子となり得るが（Paunovska, K. et al., Nano Letters, 18: 2148-2157 (2018)）、科学者はインビトロでハイスループットナノ粒子アッセイを実施させられるので、ナノメディシンにおけるこの普遍的な課題が、全てのＲＮＡ療法の開発を遅らせている。インビボｍＲＮＡ送達は、脈動血流、不均一な血管構造、ならびに腎臓、脾臓、肝臓、リンパ管および免疫系によるクリアランスによって影響を受ける。バーコード技術が、細胞質核酸送達に必要であるが、十分ではない脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）体内分布を定量化している。より具体的には、標的細胞に到達する薬物の３％未満が細胞質に逃れることがあり、ナノ粒子がエンドソームに逃れるかどうかを変更する遺伝子は、各細胞型によって異なる可能性がある。

したがって、器官または腫瘍微小環境中の特定の細胞を標的化するためのより有効なナノ粒子が必要とされている。

治療剤および予防剤を種々の器官の微小環境に送達するための組成物および方法を提供することが本発明の目的である。

肝臓疾患を含む疾患を処置および予防するためのナノ粒子組成物を提供することが本発明の別の目的である。

核酸を特定の細胞または組織微小環境に送達するための組成物が提供される。酸化コレステロールが、ナノ粒子の向性を修飾することができることが発見された。一実施形態は、酸化コレステロールを含有するナノ粒子を提供する。別の実施形態は、１つまたは複数の酸化コレステロールを含有する脂質ナノ粒子を提供する。例示的なナノ粒子組成物は、イオン化脂質と、リン脂質と、１つまたは複数のＰＥＧ脂質と、酸化コレステロールとを含む。特定の酸化コレステロールを使用することによって、ナノ粒子の向性を、所望の細胞型または組織微小環境に適合させることができる。

別の実施形態はナノ粒子を提供し、例えば、Ｄステロール環の近くで、ヒドロキシル基で修飾されたコレステロールを含有する脂質ナノ粒子は、カーゴを肝臓内の非肝細胞に優先的に送達することができる。一実施形態では、ナノ粒子組成物が、３，６－ビス（｛４－［ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ］ブチル｝）ピペラジン－２，５－ジオン（ＣＫＫ－Ｅ１２）、Ｃ_１４ＰＥＧ_２０００またはＣ_１８ＰＥＧ_２０００と、Ｄステロール環の近くで、ヒドロキシル基で修飾された酸化コレステロールとを含む。酸化コレステロールは、２０α－ヒドロキシコレステロール、６－ケト－５α－ヒドロキシコレステロール、７α－ヒドロキシコレステロール、７β－ヒドロキシコレステロール、７－ケトコレステロール、７β，２５－ジヒドロキシルコレステロール、２７－ヒドロキシコレステロール、２５－ヒドロキシコレステロール、またはこれらの組み合わせであり得る。

さらに別の実施形態は、約３０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％のイオン化脂質と、約５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％のコレステロールと、約１０ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％のリン脂質と、約０ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質とを有するナノ粒子組成物を提供する。

別の実施形態は、カーゴを搭載した開示されるナノ粒子を提供する。カーゴは、治療剤または予防剤であり得る。一実施形態では、治療剤が、それだけに限らないが、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、またはこれらの組み合わせを含む核酸である。ナノ粒子は、約２０ｎｍ～約２１５ｎｍの直径を有することができる。一実施形態では、ナノ粒子が、約５０ｎｍ～約１００ｎｍの直径を有することができる。

別の実施形態は、開示される脂質ナノ粒子の１つまたは複数と、薬学的に許容される賦形剤とを含有する医薬組成物を提供する。

さらに別の実施形態は、治療用核酸、例えば治療用タンパク質をコードする核酸、または抑制性もしくは酵素核酸を搭載した開示される脂質ナノ粒子組成物の１つまたは複数を、それを必要とする対象に投与することによって、治療剤または予防剤を対象に送達する方法を提供する。本方法は、第２の治療剤を投与することをさらに含むことができる。一実施形態では、ナノ粒子が、カーゴを肝臓内の細胞に優先的に送達する。

別の実施形態は、肝臓疾患を予防または処置するのに有効な量の開示される脂質ナノ粒子の１つまたは複数を、それを必要とする対象に投与することによって、対象の肝臓疾患を予防または処置する方法を提供する。脂質ナノ粒子は、０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与することができる。肝臓疾患は、肝がん、肝硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患、およびアルコール関連肝疾患であり得る。

図１Ａは、コレステロールの様々なステロールバリエーションを示す図である。図１Ｂは、イオン化マーカーｃＫＫ－Ｅ１２の化学構造を示す図である。図１Ｃは、コレステロールの化学構造を示す図である。図１Ｄは、Ｃ_１４ＰＥＧ_２０００の化学構造を示す図である。図１Ｅは、Ｃ_１８ＰＥＧ_２０００の化学構造を示す図である。図１Ｆは、ＤＯＰＥの化学構造を示す図である。図１Ｇは、１０個の異なる脂質ナノ粒子設計の配合比を示す棒グラフである。このグラフは、各製剤中のＤＯＰＥ、脂質－ＰＥＧ、コレステロール、およびｃＫＫ－Ｅ１２のモル％を示している。Ｘ軸は配合比を表し、Ｙ軸は脂質ナノ粒子の各成分のモル％を表す。 図１Ｈは、開示されるナノ粒子をバーコードするワークフローを示す図である。図１Ｉは、開示されるナノ粒子を試験するワークフローを示す図である。 図２Ａは、開示されるナノ粒子によって媒介されるｍＲＮＡ送達を定量化するワークフローを示す図である。 図２Ｂは、肝臓および脾臓の８個の細胞型におけるｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞％を示す棒グラフである。Ｘ軸は細胞型を表し、Ｙ軸はｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞％を表す。図２Ｃは、全ての投与した脂質ナノ粒子の流体力学的直径を示す散布ドットプロットである。図２Ｄは、肝臓および脾臓の８個の細胞型についての全ての投与した脂質ナノ粒子の正規化送達を示す散布ドットプロットである。Ｘ軸は細胞型を表し、Ｙ軸は正規化送達％を表す。図２Ｅは、肝臓および脾臓にわたって平均した全ての投与した脂質ナノ粒子についての正規化送達を示す図である。 図２Ｆは、組織による脂質ナノ粒子送達クラスター細胞型に基づく、２つの異なる組織の８個の異なる細胞型の偏りのないユークリッドクラスタリングである。アステリスクは裸のバーコードを表す。 図３Ａは、コレステロール型によって選別した脂質ナノ粒子の平均正規化送達を示す図である。 図３Ｂは、コレステロール尾部に修飾を有するコレステロールの化学構造を示す図である。図３Ｃは、コレステロール尾部に修飾を有するコレステロール（尾部）およびＢ環に修飾を有するコレステロール（環／Ｃｈｏｌ）を含む脂質ナノ粒子についての、全８個の肝臓および脾臓細胞型にわたって平均した正規化送達を示すドットプロットである。図３Ｄは、２７－ＯＨ、２５－ＯＨ、２０α－ＯＨ、７β－ＯＨ、７β－ＯＨ、７β－２５－ジヒドロキシ、７－ケト、６－ケト－５α－ＯＨ、およびコレステロールを含む様々なコレステロールを含む脂質ナノ粒子についての、全８個の肝臓および脾臓細胞型にわたって平均した正規化送達を示す棒グラフである。Ｘ軸は脂質ナノ粒子中のコレステロールの型を表し、Ｙ軸は平均動物全体正規化送達を表す。図３Ｅは、脂質ナノ粒子の上位１０％および下位１０％のコレステロールバリアントの濃縮を示す図である。図３Ｆは、脂質ナノ粒子の上位１０％の濃縮から脂質ナノ粒子の下位１０％の濃縮を差し引くことによって計算される、脂質ナノ粒子の上位１０％の濃縮倍率を示す棒グラフである。図３Ｇは、イオン化脂質ｃＫＫ－Ｅ１２の化学構造を示す図である。図３Ｈは、Ｃ_１８ＰＥＧ_２０００の化学構造を示す図である。図３Ｉは、ＤＯＰＥの化学構造を示す図である。図３Ｊは、２０α－ＯＨの化学構造を示す図である。 図３Ｋは、２つの製剤の各成分の脂質ナノ粒子モル％、脂質ナノ粒子の直径、多分散度（ＰＤＩ）およびｐＫａを示す図表である。図３Ｌは、０．２５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ１またはＬＮＰ２を投与したマウスにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ陽性内皮細胞％を示す棒グラフである。図３Ｍは、０．２５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ１またはＬＮＰ２を投与したマウスにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ陽性肝細胞％を示す棒グラフである。図３Ｎは、０．２５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ１またはＬＮＰ２を投与したマウスにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ陽性クッパー細胞％を示す棒グラフである。図３Ｏは、０．２５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ１またはＬＮＰ２を投与したマウスにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ陽性免疫細胞％を示す棒グラフである。Ｘ軸は脂質ナノ粒子用量を表し、Ｙ軸はｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞％を表す。 図４Ａは、算入脂質ナノ粒子および除外脂質ナノ粒子についての代表的な自己相関曲線を示す図である。Ｘ軸は時間（マイクロ秒）を表し、Ｙ軸は自己相関強度を表す。図４Ｂは、算入脂質ナノ粒子および除外脂質ナノ粒子についての直径分布を示す折れ線グラフである。Ｘ軸は直径（ｎｍ）を表し、Ｙ軸は質量％を表す。図４Ｃは、心臓、肺、腎臓、膵臓、および骨髄から単離した細胞型（内皮細胞、Ｅ；免疫細胞、Ｉ；マクロファージ、Ｍ；その他、Ｏ；および造血幹細胞、ＨＳＣ）についてのｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞％を示す棒グラフである。Ｘ軸は細胞型を表し、Ｙ軸はｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞％を表す。 図５Ａは、濃縮（倍率）差値、平均動物全体正規化送達（％）、ならびに脂質ナノ粒子の上位および下位１０％の濃縮を得るための濃縮計算を示す図表である。図５Ｂは、コレステロールモル％についての濃縮の倍率差を示す図である。図５Ｃは、コレステロールモル％についての濃縮の倍率差を示す図である。図５Ｄは、コレステロールモル％についての濃縮の倍率差を示す図である。図５Ｅは、イオン化脂質モル％についての濃縮の倍率差を示す図である。図５Ｆは、イオン化脂質モル％についての濃縮の倍率差を示す図である。図５Ｇは、イオン化脂質モル％についての濃縮の倍率差を示す図である。 図５Ｈは、リン脂質モル％についての濃縮の倍率差を示す図である。図５Ｉは、リン脂質モル％についての濃縮の倍率差を示す図である。図５Ｊは、リン脂質モル％についての濃縮の倍率差を示す図である。図５Ｋは、全ての脂質ナノ粒子についての平均動物全体正規化送達に対してプロットした脂質ナノ粒子直径を示すドットプロットである。図５Ｌは、尾部修飾コレステロールのみを含有する脂質ナノ粒子についての平均動物全体正規化送達に対してプロットした脂質ナノ粒子直径を示すドットプロットである。図５Ｍは、環酸化コレステロールを含有する脂質ナノ粒子についての平均動物全体正規化送達に対してプロットした脂質ナノ粒子直径を示すドットプロットである。図５Ｎは、使用したコレステロールバリアントに基づく形成された脂質ナノ粒子の％を示す棒グラフである。図５Ｏは、使用したコレステロールバリアントに基づく脂質ナノ粒子直径を示すドットプロットである。 図５Ｐは、コレステロールモル％に基づく形成された脂質ナノ粒子の％を示す棒グラフである。図５Ｑは、コレステロールモル％に基づく脂質ナノ粒子直径を示すドットプロットである。 図６Ａは、ＣＫＫ－Ｅ１２合成を示す図表である。図６Ｂは、ＣＫＫ－Ｅ１２合成を示す図表である。 図６Ｃは、ＣＫＫ－Ｅ１２構造を確認する^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 図７Ａは、１ｍｇ／ｋｇの脂質ナノ粒子プールを注射したマウスについての体重を示す棒グラフである。図７Ｂは、０．２５ｍｇ／ｋｇの用量のｃｒｅ ｍＲＮＡを含有するＬＮＰ１およびＬＮＰ２を注射したマウスについての体重を示す棒グラフである。図７Ｃは、０．０５ｍｇ／ｋｇおよび０．０１ｍｇ／ｋｇの用量のｃｒｅ ｍＲＮＡを含有するＬＮＰ１およびＬＮＰ２を注射したマウスについての体重を示す棒グラフである。図７Ｄは、対照と比較した０．０５ｍｇ／ｋｇの用量のｃｒｅ ｍＲＮＡを含有するＬＮＰ１を注射したマウスについての体重を示す棒グラフである。Ｘ軸は脂質ナノ粒子のｉｖ注射後の日数を表し、Ｙ軸は正規化マウス体重を表す。ＰＢＳ注射を対照として使用した。

Ｉ．定義
本開示は、本明細書に記載される組成物および方法、ならびに記載される実験条件に限定されず、よって、変化し得ることを理解すべきである。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、一定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、限定することを意図していないことも理解すべきである。

特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または等価な任意の組成物、方法および材料を、本発明の実施または試験で使用することができる。言及される全ての刊行物は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ここで主張される発明を説明する文脈における（特に特許請求の範囲の文脈における）「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語および同様の指示対象の使用は、本明細書で特に指示しない限り、または文脈上明確に矛盾しない限り、単数形と複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。

本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書で特に指示しない限り、その範囲に入る各別々の値に個別的に言及する速記法として働くことを意図しているにすぎず、各別々の値は、あたかも本明細書に個別的に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。

「約」という用語の使用は、およそ＋／－１０％の範囲内の言及される値より上または下の値を記載することを意図している；他の実施形態では、値が、およそ＋／－５％の範囲内の言及される値より上または下の値に及び得る；他の実施形態では、値が、およそ＋／－２％の範囲内の言及される値より上または下の値に及び得る；他の実施形態では、値が、およそ＋／－１％の範囲内の言及される値より上または下の値に及び得る。前記範囲は、文脈によって明らかにされることを意図しており、さらなる限定を暗示しない。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書で特に指示しない限り、または文脈上明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供される任意のおよび全ての例、または例示的な言語（例えば「などの」）の使用は、特に主張しない限り、本発明をより良く明らかにすることを意図しているにすぎず、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいずれの言語も、主張されていない要素を本発明の実施に必須なものとして示すものと解釈されるべきでない。

本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ」は、天然に存在し得る、または天然に存在し得ないリボ核酸を指す。例えば、ＲＮＡは、１つまたは複数の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーなどの修飾された、および／または天然に存在しない成分を含み得る。ＲＮＡは、キャップ構造、鎖終結ヌクレオシド、ステムループ、ポリＡ配列、および／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。ＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有し得る。例えば、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり得る。特定のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳、例えば、哺乳動物細胞内のｍＲＮＡのインビボ翻訳によって、コードされたポリペプチドが産生され得る。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー基質ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、およびこれらの混合物からなる非限定的な群から選択され得る。

「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって連結された少なくとも３個のアミノ酸の紐を指すために互換的に使用され得る。ペプチドは、個々のペプチドまたはペプチドの集合を指し得る。ペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸（すなわち、自然には生じないが、ポリペプチド鎖に組み込むことができる化合物）、および／またはアミノ酸類似体を含有することができる。また、ペプチド中のアミノ酸の１つまたは複数が、例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化、またはその他の修飾のためのリンカー等などの化学実体の付加によって修飾され得る。修飾は、ペプチドの環化、Ｄ－アミノ酸の組み込み等を含み得る。

本明細書で使用される場合、「ステロール」は、ステロイドのサブグループである有機分子を指す。ステロールはステロイドアルコールとしても知られている。ステロールは、植物（フィトステロールとして知られる）および動物（ゾーステロールとして知られる）で自然に生じる。

本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置すること」、「処置」および「治療的使用」という用語は、疾患または障害の１つまたは複数の症状の排除、低減または改善を指す。本明細書で使用される場合、「治療上有効量」は、このような症状の臨床的に関連する排除、低減または改善を媒介するのに十分な治療剤の量を指す。その大きさがレシピエント対象の健康または予後に影響を及ぼすのに十分である場合、効果は臨床的に関連する。治療上有効量は、疾患の開始を遅らせるまたは最小化する、例えばがんの広がりを遅らせるまたは最小化するのに十分な治療剤の量を指し得る。治療上有効量はまた、疾患の処置または管理において治療上の利益を提供する治療剤の量を指し得る。

本明細書で使用される場合、「予防剤」という用語は、障害または疾患の症状を検出する前に、このような障害または疾患の予防に使用することができる薬剤を指す。「予防上有効」量は、このような保護を媒介するのに十分な予防剤の量である。予防上有効量はまた、疾患の予防において予防上の利益を提供する予防剤の量を指し得る。

本明細書で使用される場合、「個体」、「宿主」、「対象」および「患者」という用語は本明細書で互換的に使用され、それだけに限らないが、ヒト、げっ歯類、例えばマウスおよびラット、ならびにその他の実験動物を含む哺乳動物を指す。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水、水およびエマルジョン、例えば油／水型または水／油型エマルジョン、および様々な種類の湿潤剤のいずれかを包含する。

本明細書で使用される場合、「クッパー細胞」は、常在性の肝臓マクロファージを指す。クッパー細胞は、門脈循環から粒子状物質を除去することを担うスカベンジャー細胞として機能する。クッパー細胞はまた、それだけに限らないが、ウイルス性肝炎、脂肪性肝炎、アルコール性肝疾患、肝内胆汁うっ滞、肝移植中の肝臓の活性化または拒絶、および肝線維症を含む肝臓のいくつかの病態に関係する。

本明細書で使用される場合、「肝臓微小環境」は、肝臓を囲み、肝臓を養う正常な細胞、分子および血管を指す。肝臓の例示的な細胞には、それだけに限らないが、類洞内皮細胞（ＳＥＣ）、クッパー細胞（ＫＣ）、肝星細胞（ＨＳＣ）；および肝細胞、ならびに種々の免疫細胞が含まれる。

「抑制性核酸」は、特定の遺伝子またはｍＲＮＡの発現を阻害する核酸を指す。抑制性核酸には、それだけに限らないが、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔａｓｉＲＮＡ、およびｒａｓｉＲＮＡが含まれる。

ＩＩ．脂質ナノ粒子
低分子薬物、タンパク質、および核酸などの生物活性物質の有効な標的化送達は、医学の分野での継続する課題である。核酸の送達は、具体的には、核酸の相対的不安定性および低い細胞透過性によって困難となる。修飾コレステロールバリアントを有する脂質ナノ粒子が、核酸を体内の特定の組織により有効に送達することができることが発見された。一実施形態では、脂質ナノ粒子が、核酸をイオン化脂質、ＰＥＧ－脂質、リン脂質、および修飾コレステロールと混合することによって製剤化され得る。例示的な脂質ナノ粒子製剤は、イオン化脂質様物質ｃＫＫ－Ｅ１２、ＰＥＧ－脂質、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および１つまたは複数のコレステロールバリアントを含むことができる。一実施形態では、開示される脂質ナノ粒子が、肝細胞よりも肝臓微小環境の他の細胞（すなわち、クッパー細胞、内皮細胞、免疫細胞）を優先的に標的化する。

一実施形態では、脂質ナノ粒子製剤が、約３０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％のイオン化脂質と、約１０ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％のリン脂質と、約５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％の修飾コレステロールと、約０ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質とを含む。別の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤が、約５０ｍｏｌ％のイオン化脂質と、約１５ｍｏｌ％のリン脂質と、約３０ｍｏｌ％の修飾コレステロールと、約５ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質とを含む。さらに別の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤が、約３０ｍｏｌ％のイオン化脂質と、約２０ｍｏｌ％のリン脂質と、約４５ｍｏｌ％の修飾コレステロールと、約５ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質とを含む。

脂質ナノ粒子サイズは、ナノ粒子分布に影響を及ぼし得る。一実施形態では、脂質ナノ粒子が、約２０～約２１５ｎｍの間の直径を有することができる。脂質ナノ粒子は、約２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、１５０ｎｍ、１５５ｎｍ、１６０ｎｍ、１６５ｎｍ、１７０ｎｍ、１７５ｎｍ、１８０ｎｍ、１８５ｎｍ、１９０ｎｍ、１９５ｎｍ、２００ｎｍ、２１０ｎｍ、または２１５ｎｍである直径を有することができる。好ましい実施形態では、ナノ粒子が、５０ｎｍ～１００ｎｍの間の直径を有する。

Ａ．ステロール
開示される脂質ナノ粒子は、１つまたは複数のステロールを含むことができる。一実施形態では、ステロールがコレステロールである。コレステロールは、修飾、例えば酸化され得る。非修飾コレステロールに酵素を作用させて側鎖または環酸化されているバリアントを形成することができる（図１Ａ）。コレステロールは、ベータ環構造上または炭化水素尾部構造上で酸化され得る。開示される脂質ナノ粒子での使用のために考慮される例示的なコレステロールには、それだけに限らないが、２５－ヒドロキシコレステロール（２５－ＯＨ）、２０α－ヒドロキシコレステロール（２０α－ＯＨ）、２７－ヒドロキシコレステロール、６－ケト－５α－ヒドロキシコレステロール、７－ケトコレステロール、７β－ヒドロキシコレステロール、７α－ヒドロキシコレステロール、７β－２５－ジヒドロキシコレステロール、またはこれらの組み合わせが含まれる。一実施形態では、側鎖酸化コレステロールが、他のコレステロールバリアントと比較してカーゴ送達を増強することができる。好ましい実施形態では、修飾コレステロールが、２５－ヒドロキシコレステロール（２５－ＯＨ）または２０α－ヒドロキシコレステロール（２０α－ＯＨ）である。

いずれか１つの理論によって拘束されるものではないが、酸化コレステロールを含有する脂質ナノ粒子が、カーゴを、既存の脂質ナノ粒子に特徴的であるように単に肝細胞ではなく、肝臓微小環境内の他の細胞に優先的に送達することができると考えられる。コレステロールは、順方向および逆方向輸送を使用してリポタンパク質で輸送され、内皮細胞、肝細胞およびマクロファージへの輸送は、インビボでのコレステロール構造によって変化し得る。さらに、脂質ナノ粒子およびリポタンパク質は類似のサイズおよび組成を有し、したがって、コレステロール構造が中に組み込まれた脂質ナノ粒子もリポタンパク質と同様に細胞に輸送され得る。

Ｂ．イオン化脂質
一実施形態では、開示される脂質ナノ粒子がイオン化脂質を含む。イオン化脂質は、生理的ｐＨで正電荷または部分的正電荷を有する。例示的なイオン化脂質には、それだけに限らないが、３，６－ビス（｛４－［ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ］ブチル｝）ピペラジン－２，５－ジオン（ｃＫＫ－Ｅ１２）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルカルバニオイルオキシ－３－ジメチルアニイノプロパン（1,2-Dilinoleylcarbanioyloxy-3-dimethylaniinopropane）（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイル－３－ジメチルアミノプロパン（1,2-Dilmoleoyl-3-dimethylammopropane）（ＤＬｍ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル１－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアエオンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、ジオクタデシルアミドグリシオカルボキシスペルミン（dioctadecylamidoglycyocarboxysperrnine）（ＤＯＧＳ）、スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ－６７）、ビス－グアニジニウム－スペルミジン－コレステロール（ＢＧＴＣ）、３β－（Ｎ－（Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（3β-(N-(N^N'-dimethylammoethanej-carbamoxlcholesterol）（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－ｔ－ブチル－Ｎ’－テトラデシルアミノ－プロピオンアミジン（ジＣ１４－アミジン）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲ１Ｅ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ３）プロピル－Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、２－ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、アミノプロピル－ジメチル－ビス（ドデシルオキシ）－プロパンアミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、またはこれらの組み合わせが含まれる。好ましい実施形態では、イオン化脂質がｃＫＫ－Ｅ１２である。

Ｃ．ＰＥＧ－脂質
開示されるナノ粒子組成物の脂質成分は、１つまたは複数のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含み得る。このような種は代わりにＰＥＧ化脂質とも呼ばれ得る。ＰＥＧ化脂質の包含を使用して、インビトロでの脂質ナノ粒子コロイド安定性およびインビボでの循環時間を増強することができる。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分が血液循環中で徐々に放出されるという点で、ＰＥＧ化が可逆的である。例示的なＰＥＧ脂質には、それだけに限らないが、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド（ＰＥＧ－ＣＥＲ）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、およびこれらの混合物が含まれる。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣまたはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。

好ましい実施形態では、ＰＥＧ脂質がＣ_１４ＰＥＧ_２０００またはＣ_１８ＰＥＧ_２０００である。

Ｄ．リン脂質
ナノ粒子組成物の脂質成分は、１つまたは複数の（ポリ）不飽和脂質などの１つまたは複数のリン脂質を含み得る。リン脂質は１つまたは複数の脂質二重層に会合し得る。一般的に、リン脂質は、リン脂質部分と、１つまたは複数の脂肪酸部分とを含み得る。

リン脂質部分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリン、およびスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。脂肪酸部分は、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。分岐、酸化、環化、およびアルキンを含む修飾および置換を有する天然種を含む非天然種も企図される。例えば、リン脂質は、１つまたは複数のアルキン（例えば、１つまたは複数の二重結合が三重結合で置き換えられているアルケニル基）で官能化され得る、またはこれと架橋し得る。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドに曝露すると銅触媒環化付加を受け得る。このような反応は、膜透過もしくは細胞認識を促進するためのナノ粒子組成物の脂質二重層の官能化、またはナノ粒子組成物と標的化部分もしくは画像化部分（例えば、色素）などの有用な成分のコンジュゲートにおいて有用となり得る。

例示的なリン脂質には、それだけに限らないが、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－０－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＣＩ ６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルコリン（ＳＯＰＣ）、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）が含まれる。好ましい実施形態では、リン脂質がＤＯＰＥである。

Ｅ．カーゴ
一実施形態では、開示される脂質ナノ粒子組成物が、対象に対する治療剤または予防剤を含む。治療剤または予防剤は、カーゴとして脂質ナノ粒子に含めることができる。ナノ粒子を介して伝統的に送達される例示的なカーゴには、それだけに限らないが、化学療法剤、細胞傷害剤、放射性イオン、低分子、タンパク質、ポリヌクレオチド、および核酸が含まれる。

代表的な化学療法剤には、それだけに限らないが、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフール－ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、またはこれらの組み合わせが含まれる。代表的なアポトーシス促進剤には、それだけに限らないが、フルダラビン、スタウロスポリン、シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤ、ラクトシルセラミド、１５ｄ－ＰＧＪ（２）およびこれらの組み合わせが含まれる。

代表的な核酸には、それだけに限らないが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、メッセンジャーｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むリボ核酸（ＲＮＡ）、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー－基質ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）リボザイム、触媒ＤＮＡ、三重螺旋形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクター、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ、およびプラスミドＤＮＡが含まれる。

Ｆ．医薬組成物
ナノ粒子組成物は、全体的にまたは部分的に、医薬組成物として製剤化され得る。医薬組成物は、１つまたは複数のナノ粒子組成物を含み得る。例えば、医薬組成物は、１つまたは複数の異なる治療剤および／予防剤を含む、１つまたは複数のナノ粒子組成物を含み得る。医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤または副成分、例えば本明細書に記載されるものをさらに含み得る。

開示される脂質ナノ粒子を含む医薬組成物が提供される。ナノ粒子を含有する医薬組成物は、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射）、経皮（受動的にまたはイオン導入もしくは電気穿孔を使用して）、または経粘膜（鼻、膣、直腸または舌下）投与経路による、あるいは生体侵食性挿入物を使用した投与のためのものであり得、各投与経路に適した剤形に製剤化することができる。

いくつかのインビボアプローチでは、本明細書に開示される組成物が、治療上有効量で対象に投与される。本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療上有効量」という用語は、処置される障害の１つまたは複数の症状を処置、阻害または軽減する、あるいは所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を提供するのに十分な投与量を意味する。正確な投与量は、対象に依存する可変要素（例えば、年齢、免疫系の健康等）、疾患、および行われている処置などの種々の因子によって変化する。

開示されるナノ粒子については、さらなる研究が行われているので、種々の患者における種々の状態の処置に適した投与量レベルに関する情報が出てくるだろう、また当業者は、治療内容、レシピエントの年齢、および健康全般を考慮して、適切な投与を確認することができるだろう。選択される投与量は、所望の治療効果、投与経路、および所望の処置の持続時間に依存する。開示されるナノ粒子については、一般的に毎日０．０１～５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量レベルが哺乳動物に投与される。より具体的には、開示されるナノ粒子についての優先的な用量は０．０５～０．２５ｍｇ／ｋｇである。一般的に、静脈内注射または注入については、投与量がより低くなり得る。

一定の実施形態では、脂質ナノ粒子組成物が、例えば処置される部位への直接的な注射によって、局所的に投与される。典型的には、注射が、全身投与によって達成され得るよりも高い、脂質ナノ粒子組成物の増加した局所濃度をもたらす。脂質ナノ粒子組成物を上記のマトリックスと組み合わせて、処置される部位の外へのポリペプチドの受動拡散を減少させることによって、ポリペプチド組成物の局所濃度増加をもたらすのを助けることができる。

１．非経口投与のための製剤
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子を含有するものを含む、本明細書に開示される組成物が、非経口注射によって、水溶液で投与される。製剤はまた、懸濁液またはエマルジョンの形態であってもよい。一般的に、有効量の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物が提供され、これらは、場合により薬学的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体を含む。このような組成物は、場合により以下について１つまたは複数を含む：希釈剤、滅菌水、種々の緩衝液内容物（例えば、トリス－ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の緩衝生理食塩水；ならびに界面活性剤および可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ ２０（ポリソルベート－２０）、ＴＷＥＥＮ ８０（ポリソルベート－８０））、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、および保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、および増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤。非水性溶媒またはビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油およびコーン油、ゼラチン、ならびに注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。製剤は凍結乾燥され、使用直前に再溶解／再懸濁され得る。製剤は、例えば、細菌保持フィルタを通した濾過によって、滅菌剤を組成物に組み込むことによって、組成物を照射することによって、または組成物を加熱することによって、滅菌され得る。

２．制御送達ポリマーマトリックス
本明細書に開示される脂質ナノ粒子はまた、制御放出製剤で投与することもできる。制御放出ポリマーデバイスは、ポリマーデバイス（ロッド、シリンダー、フィルム、ディスク）の埋め込みまたは注射（微粒子）後の全身的な長期放出用に作製され得る。マトリックスは、薬剤が固体ポリマーマトリックスまたはマイクロカプセル内に分散しており、コアがポリマーシェルとは異なる材料でできており、ペプチドが、液体または固体の性質であり得るコアに分散または懸濁している、ミクロスフェアなどの微粒子の形態であり得る。本明細書で特に定義しない限り、微粒子、ミクロスフェア、およびマイクロカプセルは互換的に使用される。あるいは、ポリマーは、ナノメートル～４センチメートルに及ぶ薄スラブもしくはフィルム、粉砕もしくはその他の標準的な技術によって製造される粉末、またはさらにはヒドロゲルなどのゲルとして鋳造され得る。

非生分解性または生分解性マトリックスを脂質ナノ粒子の送達に使用することができるが、いくつかの実施形態では、生分解性マトリックスが好ましい。これらは天然ポリマーまたは合成ポリマーであり得るが、いくつかの実施形態では、分解および放出プロファイルのより優れた特徴のために、合成ポリマーが好ましい。ポリマーは、放出が望まれる期間に基づいて選択される。いくつかの場合、線形放出が最も有用となり得るが、他の場合では、パルス放出または「バルク放出」がより有効な結果をもたらし得る。ポリマーは、ヒドロゲル（典型的には、最大約９０重量％の水を吸収する）の形態であり得、場合により、多価イオンまたはポリマーと架橋することができる。

マトリックスは、溶媒蒸発、噴霧乾燥、溶媒抽出および当業者に公知のその他の方法によって形成することができる。生体侵食性ミクロスフェアは、例えば、Mathiowitz and Langer, J. Controlled Release, 5:13-22 (1987)；Mathiowitz, et al., Reactive Polymers, 6:275-283 (1987)；およびMathiowitz, et al., J. Appl. Polymer Sci., 35:755-774 (1988)によって記載される、薬物送達用のミクロスフェアを調製するために開発された方法のいずれかを使用して調製することができる。

デバイスは、埋込もしくは注射の領域を処置するための局所放出－典型的には体全体を処置するための投与量よりはるかに少ない投与量を送達する－または全身送達のために製剤化することができる。これらは、皮下、筋肉、脂肪に埋め込むもしくは注射する、または飲み込むことができる。

ＩＩＩ．使用方法
カーゴを特定の細胞または器官に送達するために開示される脂質ナノ粒子を使用する方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ナノ粒子が、治療剤または予防剤を、それを必要とする対象の特定の細胞または器官に送達することができる。別の実施形態では、開示される脂質ナノ粒子を使用して、それを必要とする対象の疾患を処置または予防することができる。

Ａ．カーゴを細胞および器官に送達する方法
治療剤および／または予防剤を、それを必要とする対象に送達する方法が本明細書で提供される。

いくつかの実施形態では、開示される脂質ナノ粒子組成物が、特定の型またはクラスの細胞（例えば、その特定の器官または系の細胞）を標的化することができる。例えば、目的の治療剤および／または予防剤を含むナノ粒子組成物を、哺乳動物の肝臓、腎臓、脾臓、腸または肺に特異的に送達することができる。特定のクラスの細胞、器官もしくは系、またはその群への特異的送達は、他の行き先と比較してより高い割合の治療剤および／または予防剤を含むナノ粒子組成物が目的の行き先（例えば、組織）に送達されることを意味する。いくつかの実施形態では、特異的送達が、標的とする行き先の組織１ｇ当たりの治療剤および／または予防剤の量における２倍超、５倍超、１０倍超、１５倍超または２０倍超の増加をもたらし得る。

別の実施形態は、抗体もしくはその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチド、または細胞表面上の受容体などのタンパク質結合パートナーをコードするｍＲＮＡの標的化または特異的送達を提供する。ｍＲＮＡは、さらにまたは代わりに、脂質、炭水化物、またはその他の生物分子の合成および細胞外局在化を指示するために使用され得る。あるいは、他の治療剤および／または予防剤、あるいはナノ粒子組成物の要素は、ナノ粒子組成物が受容体を含む標的細胞集団とより迅速に相互作用することができるように、特定の受容体に対する親和性に基づいて選択され得る。例えば、リガンドには、それだけに限らないが、特異的結合対のメンバー、抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体およびその断片、ヒト化抗体およびその断片、ならびにこれらの多価バージョン；単一または二重特異性抗体、例えばジスルフィド安定化Ｆｖ断片、ｓｃＦｖタンデム、ダイアボディ（diabody）、トリボディ（tribody）またはテトラボディ（tetrabody）を含む多価結合試薬；ならびにアプタマー、受容体、および融合タンパク質が含まれ得る。

標的化細胞には、それだけに限らないが、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心臓細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、ベータ細胞、下垂体細胞、滑膜表層細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、および腫瘍細胞が含まれ得る。

一実施形態では、開示される脂質ナノ粒子が、肝細胞を除く、肝臓微小環境の細胞を標的化する。これらの細胞は、肝臓内皮細胞、クッパー細胞、および免疫細胞であり得る。

別の実施形態では、開示される脂質ナノ粒子が、免疫系の細胞を標的化する。例示的な免疫細胞には、それだけに限らないが、顆粒球、肥満細胞、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞および制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞が含まれる。

Ｂ．免疫応答を調節する方法
開示される脂質ナノ粒子を使用して、このような処置を必要とする対象の免疫応答を調節することができる。一実施形態では、開示される脂質ナノ粒子が、罹患器官、器官系の微小環境、または腫瘍の免疫細胞を標的化する。免疫細胞は、マクロファージ、より具体的にはクッパー細胞であり得る。

１．免疫応答刺激
ａ．治療戦略
対象の免疫応答を誘導または増強する方法が提供される。典型的には、本方法が、有効量の開示される脂質ナノ粒子または開示される脂質ナノ粒子を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む。免疫応答は、例えば、疾患または腫瘍部位での自然免疫の刺激、より具体的にはクッパー細胞の刺激であり得る。クッパー細胞は、消化管から誘導され、門脈を介して肝臓に輸送される細菌、細菌内毒素および微生物片と接触する最初の体のマクロファージ集団である。

あるいは、脂質ナノ粒子は、免疫細胞受容体を通してシグナル伝達を刺激し、免疫応答を促進または増強することができる。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子を使用して、腫瘍微小環境に対する抑制性免疫細胞を遮断することができる。別の実施形態では、脂質ナノ粒子を使用して、腫瘍転移を阻害、低減、または遮断することができる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子が、免疫抑制性マクロファージの活性を低減もしくは阻害する、Ｍ１マクロファージによるＩＬ－１２などのサイトカインの産生を低減する、マクロファージの分化を低減する、マクロファージの数を低減する、免疫細胞集団内のマクロファージの比を低減する、またはマクロファージの生存を低減することができる。

本方法をインビボまたはエキソビボで使用して、抑制性免疫応答を阻害、低減、または遮断し、それによって、刺激的な治療効果を有することができる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子を対象に直接投与する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子をエキソビボで細胞（例えば、免疫細胞）と接触させ、処理した細胞を対象に投与する（例えば、養子移植）。脂質ナノ粒子は、より堅牢な免疫応答を可能にすることができる。開示される組成物は、Ｔ細胞受容体を通して抑制性免疫シグナル伝達を阻害、低減、または遮断することによって、Ｔ細胞を伴う免疫応答を刺激または増強するのに有用である。

ｂ．処置される対象
ｉ．がんの処置
開示される組成物および方法を使用してがんを処置することができる。一般的に、脂質ナノ粒子を使用して、ある量の脂質ナノ粒子を対象に投与することによって、対象のがんに対する免疫応答を刺激または増強する。本方法は、がんの１つまたは複数の症状を低減することができる。一実施形態では、開示される脂質ナノ粒子が、腫瘍部位でのマクロファージの数を阻害、遮断、または低減し、それによって、腫瘍血管新生および抗腫瘍免疫細胞の抑制を低減する。

がん細胞は、種々の機序を通してその発達中に機能的能力の特徴的なセットを獲得する。このような能力には、アポトーシスの回避、増殖シグナルの自給自足、抗増殖シグナルに対する非感受性、組織浸潤／転移、無限の複製能、および持続した血管新生が含まれる。「がん細胞」という用語は、前悪性がん細胞と悪性がん細胞の両方を包含することを意図している。いくつかの実施形態では、がんが、局在化したままである、良性腫瘍を指す。他の実施形態では、がんが、隣接した身体構造に浸潤し、これを破壊し、遠隔部位に広がっている、悪性腫瘍を指す。さらに他の実施形態では、がんが、特異的がん抗原（例えば、汎癌抗原（ＫＳ１／４）、卵巣癌抗原（ＣＡ１２５）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＥＲ２／ｎｅｕ等）に関連する。

本明細書に開示される方法および組成物は、（それだけに限らないが）以下を含む、種々のがんまたはその他の異常な増殖性疾患の処置または予防に有用である：膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺および皮膚の癌を含む；扁平上皮癌を含む、癌；白血球、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含むリンパ系統の造血器腫瘍；急性および慢性骨髄性白血病ならびに前骨髄球性白血病を含む、骨髄系統の造血器腫瘍；線維肉腫および横紋筋肉腫を含む、間葉起源の腫瘍；黒色腫、セミノーマ、奇形癌腫、神経芽細胞腫および神経膠腫を含むその他の腫瘍；星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫およびシュワン腫を含む、中枢および末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫および骨肉腫を含む、間葉起源の腫瘍；ならびに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、セミノーマ、甲状腺濾胞がんおよび奇形癌腫を含む、その他の腫瘍。

アポトーシスの異常によって引き起こされるがんも、開示される方法および組成物によって処置することができる。このようながんには、それだけに限らないが、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を有する癌、乳房、前立腺および卵巣のホルモン依存性腫瘍、ならびに家族性腺腫性ポリポーシスおよび骨髄異形成症候群などの前がん病変が含まれ得る。具体的な実施形態では、悪性腫瘍または増殖異常（dysproliferative）変化（化生および異形成など）、または過剰増殖性障害が、卵巣、膀胱、乳房、結腸、肺、皮膚、膵臓、または子宮において本方法および組成物によって処置または予防される。他の具体的な実施形態では、肉腫、黒色腫、または白血病が、本方法および組成物によって処置または予防される。

本明細書に開示される方法および組成物によって処置または予防することができる具体的ながんおよび関連障害には、それだけに限らないが、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、例えば骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病白血病および骨髄異形成症候群、慢性白血病、例えばそれだけに限らないが、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病を含む白血病；真性多血症；リンパ腫、例えば、それだけに限らないが、ホジキン病または非ホジキン病リンパ腫（例えば、びまん性未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陰性、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）；びまん性未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陽性、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陽性、ＡＬＫ＋未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、急性骨髄性リンパ腫（ＡＭＬ））；多発性骨髄腫、例えば、それだけに限らないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌型骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫；ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症；意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症；良性単クローン性免疫グロブリン血症；重鎖病；骨および結合組織の肉腫、例えば、それだけに限らないが、骨の肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨の線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟部肉腫、血管肉腫（angiosarcoma）（血管肉腫（hemangiosarcoma））、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫；それだけに限らないが、神経膠腫、星細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起神経膠腫、非グリア腫瘍、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、原発性脳リンパ腫を含む脳腫瘍；それだけに限らないが、腺癌、小葉（小細胞）癌、乳管内癌、乳房の髄様がん、乳房の粘液がん、乳腺管状がん、乳頭状乳がん、パジェット病および炎症性乳がんを含む乳がん；それだけに限らないが、褐色細胞腫および副腎皮質癌を含む副腎がん；甲状腺がん、例えば、それだけに限らないが、乳頭様または濾胞性甲状腺がん、甲状腺髄様がんおよび甲状腺未分化がん；それだけに限らないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドまたは膵島細胞腫瘍を含む膵臓がん；それだけに限らないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症、および尿崩症を含む下垂体がん；それだけに限らないが、眼内黒色腫、例えば虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫および毛様体黒色腫、ならびに網膜芽細胞腫を含む眼がん；それだけに限らないが、扁平上皮癌、腺癌および黒色腫を含む膣がん；それだけに限らないが、扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫およびパジェット病を含む外陰がん；それだけに限らないが、扁平上皮癌および腺癌を含む子宮頸がん；それだけに限らないが、子宮内膜癌および子宮肉腫を含む子宮がん；それだけに限らないが、卵巣上皮癌、境界腫瘍、胚細胞腫瘍および間質腫瘍を含む卵巣がん；それだけに限らないが、扁平上皮がん、腺癌、腺様嚢胞癌、粘表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣贅癌および燕麦細胞（小細胞）癌を含む食道がん；それだけに限らないが、腺癌、茸型（ポリープ状）、潰瘍形成、表層拡大型、びまん性拡大型、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫および癌肉腫を含む胃がん；結腸がん；直腸がん；それだけに限らないが、肝細胞癌および肝芽腫を含む肝臓がん、それだけに限らないが、腺癌を含む胆嚢がん；それだけに限らないが、乳頭状、結節型、およびびまん性を含む胆管癌；それだけに限らないが、非小細胞肺がん、扁平上皮癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌および小細胞肺がんを含む肺がん；それだけに限らないが、胚腫瘍、セミノーマ、未分化、古典（典型）、精母細胞、非セミノーマ、胚性癌腫、奇形腫癌腫、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）を含む精巣がん、それだけに限らないが、腺癌、平滑筋肉腫および横紋筋肉腫を含む前立腺がん；陰茎がん；それだけに限らないが、扁平上皮癌を含む口腔がん；基底がん；それだけに限らないが、腺癌、粘表皮癌および腺様嚢胞癌を含む唾液腺がん；それだけに限らないが、扁平上皮がんおよび疣状を含む咽頭がん；それだけに限らないが、基底細胞癌、扁平上皮癌および黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫を含む皮膚がん；それだけに限らないが、腎細胞がん、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行上皮がん（腎盂および／または尿管）を含む腎臓がん；ウィルムス腫瘍；それだけに限らないが、移行上皮癌、扁平上皮がん、腺癌、癌肉腫を含む膀胱がんが含まれる。さらに、がんには、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原性癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、および乳頭状腺癌が含まれる（このような障害の概要については、Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia and Murphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of Americaを参照されたい）。

ｉｉ．感染症の処置
開示される脂質ナノ粒子を使用して、感染症および感染性疾患を処置することができる。一般的に、脂質ナノ粒子を使用して、対象の感染症に対する免疫応答を刺激または増強する。開示される脂質ナノ粒子は、マクロファージ、より具体的には肝臓のクッパー細胞を刺激することができる。一実施形態では、脂質ナノ粒子が、抑制性免疫シグナル伝達を阻害、低減、または遮断する。別の実施形態では、脂質ナノ粒子が、免疫細胞受容体を通したシグナル伝達を誘導、促進または増強することによって、免疫応答を誘導、促進または増強する。本方法は、感染症の１つまたは複数の症状を低減することができる。

感染症または疾患は、細胞内に侵入し、すなわち、細胞傷害性Ｔリンパ球によって攻撃される、細菌、ウイルス、原生動物、蠕虫またはその他の微生物病原体によって引き起こされ得る。

感染症または疾患は、急性または慢性であり得る。急性感染症は、典型的には短い持続時間の感染症である。急性微生物感染症の間、免疫細胞は、免疫調節受容体を発現し始める。したがって、いくつかの実施形態では、本方法が、急性感染症に対する免疫刺激応答を増加させることを含む。

感染症は、例えば、それだけに限らないが、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、大腸菌（Escherichia coli）、アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、またはマイコバクテリウム属（Mycobacterium）によって引き起こされ得る。

いくつかの実施形態では、開示される組成物を使用して、慢性感染症、例えば、Ｔ細胞枯渇またはＴ細胞アネルギーが起こって、感染症を長期間にわたって宿主に残ったままにする感染症を処置する。

処置される例示的な感染症は、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、ヘルペスウイルス、エプスタイン－バーウイルス、またはヒトパピローマウイルスによって引き起こされる慢性感染症である。

細菌感染症は主にマクロファージによって排除されるので、マクロファージ活性の増加が、感染性細菌作用因子のより迅速なまたは完全なクリアランスが動物またはヒト対象にとって有益となるような状況で治療上有用となるだろう。よって、開示される組成物を、局所または全身細菌感染症を処置するために投与することができる。

処置することができる代表的な感染症には、それだけに限らないが、アクチノマイセス属（Actinomyces）、アナベナ属（Anabaena）、バチルス属（Bacillus）、バクテロイデス属（Bacteroides）、デロビブリオ属（Bdellovibrio）、ボルデテラ属（Bordetella）、ボレリア属（Borrelia）、カンピロバクター属（Campylobacter）、カウロバクター属（Caulobacter）、クラミジア属（Chlamydia）、クロロビウム属（Chlorobium）、クロマチウム属（Chromatium）、クロストリジウム属（Clostridium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、サイトファーガ属（Cytophaga）、ディノコッカス属（Deinococcus）、大腸菌属（Escherichia）、フランシセラ属（Francisella）、ハロバクテリウム属（Halobacterium）、ヘリコバクター属（Heliobacter）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、ヘモフィルス・インフルエンザＢ型（Hemophilus influenza type B）(HIB)、ハイフォミクロビウム属（Hyphomicrobium）、レジオネラ属（Legionella）、レプトスピラ症（Leptspirosis）、リステリア属（Listeria）、髄膜炎菌（Meningococcus）Ａ、ＢおよびＣ、メタノバクテリウム属（Methanobacterium）、ミクロコッカス属（Micrococcus）、ミオバクテリウム属（Myobacteriu）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、ミキソコッカス属（Myxococcus）、ナイセリア属（Neisseria）、ニトロバクター属（Nitrobacter）、オシラトリア属（Oscillatoria）、プロクロロン属（Prochloron）、プロテウス属（Proteus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ロドスピリルム属（Phodospirillum）、リケッチア属（Rickettsia）、サルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）、スピリルム属（Spirillum）、スピロヘータ属（Spirochaeta）、ブドウ球菌属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、スルホロブス属（Sulfolobus）、サーモプラズマ属（Thermoplasma）、チオバチルス属（Thiobacillus）およびトレポネーマ属（Treponema）、ビブリオ属（Vibrio）、エルシニア属（Yersinia）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、ノカルジア・アステロイデス（Nocardia asteroides）、リケッチア・リケッチイ（Rickettsia ricketsii）、リケッチア・チフィ（Rickettsia typhi）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）、クラミジア・シタッシ（Chlamydial psittaci）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydial trachomatis）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）、腟トリコモナス（Trichomonas vaginalis）およびマンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）を含む微生物によって引き起こされる感染症が含まれる。

開示される組成物および方法を使用して処置することができるその他の微生物には、細菌、例えばクレブシエラ属（Klebsiella）、セラチア属（Serratia）、パスツレラ属（Pasteurella）のもの；コレラ、破傷風、ボツリヌス中毒、炭疽、ペストおよびライム病に関連する病原体；または真菌もしくは寄生生物病原体、例えばカンジダ属（Candida）（アルビカンス（albicans）、クルセイ（krusei）、グラブラタ（glabrata）、トロピカリス（tropicalis）等）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、アスペルギルス属（Aspergillus）（フミガーツス（fumigatus）、ニガー（niger）等）、ケカビ目（Mucorales）の属（ムコール（mucor）、アブシディア（absidia）、リゾプス（rhizophus））、スポロトリクス属（Sporothrix）（シェンキー（schenkii））、ブラストミセス属（Blastomyces）（デルマチチジス（dermatitidis））、パラコクシジオイデス属（Paracoccidioides）（ブラジリエンシス（brasiliensis））、コクシジオイデス属（Coccidioides）（イミチス（immitis））およびヒストプラズマ属（Histoplasma）(カプスラーツム（capsulatuma））、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、大腸バランチジウム（Balantidium coli）、ネグレリア・フォーレリ（Naegleria fowleri）、アカントアメーバ属（Acanthamoeba）種、ランブル鞭毛虫（Giardia lambia）、クリプトスポリジウム属（Cryptosporidium）種、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、ネズミバベシア（Babesia microti）、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）、トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondi）等）、スポロトリクス属（Sporothrix）、ブラストミセス属（Blastomyces）、パラコクシジオイデス属（Paracoccidioides）、コクシジオイデス属（Coccidioides）、ヒストプラズマ（Histoplasma）、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、バランチジウム属（Balantidium）、ネグレリア属（Naegleria）、アカントアメーバ属（Acanthamoeba）、ジアルジア属（Giardia）、クリプトスポリジウム属（Cryptosporidium）、ニューモシスチス属（Pneumocystis）、プラスモジウム属（Plasmodium）、バベシア属（Babesia）、またはトリパノソーマ属（Trypanosoma）等が含まれる。

２．免疫応答阻害
ａ．治療戦略
対象の免疫応答を低減または阻害する方法が提供される。典型的には、本方法は、有効量の開示される脂質ナノ粒子、またはこれらのナノ粒子によってエキソビボでプライミングされた細胞を対象に投与することを含む。免疫応答は、例えば、抑制性免疫応答を促進または増強することであり得る。一実施形態では、開示される組成物が、Ｍ１マクロファージまたはＭ１マクロファージシグナル伝達の活性を低減する、遮断する、または減少させ、ＩＬ－１２などのサイトカインの産生を減少させて、免疫抑制応答をもたらす。

別の実施形態では、脂質ナノ粒子が、免疫細胞受容体を通したシグナル伝達を誘導、促進または増強することによって、抑制性免疫応答を促進する。

本方法を、インビボまたはエキソビボで、免疫応答阻害治療適用として使用することができる。よって、いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子を対象に直接投与する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子をエキソビボで細胞（例えば、免疫細胞）と接触させ、処理した細胞を対象に投与する（例えば、養子移植）。一般的に、開示される脂質ナノ粒子を、対象の免疫系が過活動または不適切免疫応答を開始する任意の疾患または障害を有する、またはこれにかかりやすい対象を処置するために使用することができる。薬剤は、あまり堅牢でない免疫応答を可能にすることができる。開示される組成物は、Ｔ細胞を伴う免疫応答を低減または阻害するのに有用である。

ｂ．炎症性応答
開示される脂質ナノ粒子を使用して、炎症を処置することができる。一般的に、薬剤を使用して、所定量の開示される脂質ナノ粒子を対象に投与することによって、対象の免疫応答を低減または阻害する。本方法は、炎症の１つまたは複数の症状を低減することができる。炎症は、急性、慢性または持続性炎症であり得る。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子が、免疫系を減速させる。例えば、薬剤を使用して、健康な組織の損傷を引き起こす過剰炎症反応を制御することができる。したがって、いくつかの実施形態では、薬剤を、過剰炎症反応を経験している対象に投与する。このような場合、過剰な免疫応答を制御することが対象にとって有益となり得る。

ｃ．炎症性および自己免疫疾患／障害
開示される脂質ナノ粒子を使用して、炎症性または自己免疫疾患および障害を処置することもできる。代表的な炎症性または自己免疫疾患／障害には、それだけに限らないが、関節リウマチ、全身エリテマトーデス、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アディソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群（ａｌｐｓ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労症候群免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、デゴス病、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症－線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）、若年性関節炎、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフ・マン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症が含まれる。

いくつかの実施形態では、炎症または自己免疫疾患が、病原体によって引き起こされる、または感染症の結果である。

Ｃ．肝臓疾患を処置する方法
開示される方法および組成物を使用して、肝臓の疾患および障害の開始、発症、進行、徴候または症状を低減する、減少させる、予防する、または制限することができる。肝臓微小環境内の機能不全の肝臓内皮細胞、クッパー細胞、およびその他の細胞は、肝細胞よりも疾患を引き起こす。歴史的に、ナノ粒子は、肝臓微小環境内の他の細胞ではなく、肝細胞を優先的に標的化する傾向がある。

いずれか１つの理論によって拘束されるものではないが、本明細書に開示されるコレステロール修飾が、脂質ナノ粒子が、カーゴをインビボで肝臓微小環境内の細胞により強力に送達することを可能にすると考えられる。

一実施形態では、開示されるナノ粒子を、肝臓微小環境内のタンパク質補充療法に使用することができる。

脂質ナノ粒子は、例えば、肝臓の疾患を処置または予防するために、局所または全身応答を誘発するのに有効な量で局所または全身投与することができる。好ましい実施形態では、１つまたは複数の脂質ナノ粒子を、１週間に１回、０．０５～０．２５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与する。別の実施形態では、ナノ粒子を１カ月に２回、１カ月に１回、またはより少ない頻度で送達する。脂質ナノ粒子によって処置することができる例示的な肝臓疾患および障害を以下で提供する。

１．肝臓がん
開示される方法および組成物を使用して、肝臓がんの開始、発症、進行、徴候または症状を低減する、減少させる、予防する、または制限することができる。いくつかの実施形態では、処置される肝臓がんが無症候性肝臓がんである。いくつかの実施形態では、肝臓がんが、肝臓がんの開始、発症または進行に関連する診断マーカーの検出によって特定されている。さらなる実施形態では、肝臓がんの発症のリスク因子が、開示される方法および組成物による予防的処置から利益を得ることができる対象を特定する機序として使用される。

一実施形態では、開示される脂質ナノ粒子が、化学療法剤を肝臓に送達して、肝臓がんを処置する、および／または腫瘍量を低減することができる。別の実施形態では、開示される脂質ナノ粒子が、アポトーシス剤を肝臓に送達して、肝臓がんを処置する、および／または腫瘍量を低減することができる。

２．肝硬変
開示される方法および組成物を使用して、肝硬変の開始、発症、進行、徴候または症状を低減する、減少させる、予防する、または制限することができる。

肝硬変は、肝臓細胞が損傷を受け、瘢痕組織によって置き換えられる疾患である。硬変に寄与する因子には、それだけに限らないが、感染性疾患、アルコール乱用、レクリエーショナルドラッグ乱用、および非脂肪性肝疾患が含まれる。肝硬変は、肝臓がんの発症に関連する。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による慢性感染症が、肝細胞癌（ＨＣＣ）の増加したリスクとして認識されている。ＨＣＶ感染個体のおよそ２０％が硬変に進行する疾患を有し、これらの患者の約４０％が平均１０～１５年後にＨＣＣを発症する。肝臓の硬変は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による感染症によっても引き起こされ得る。

一実施形態では、開示される脂質ナノ粒子が、治療剤を肝臓に送達して、硬変の症状を処置する、または疾患の進行を停止させることができる。

３．脂肪性肝疾患
開示される方法および組成物を使用して、脂肪性肝疾患の開始、発症、進行、徴候または症状を低減する、減少させる、予防する、または制限することができる。脂肪性肝疾患は、米国における硬変の主因であるアルコール乱用の結果であり得る。

脂肪性肝疾患はまた、非アルコール性脂肪性肝疾患であり得る。肝臓の硬変は、アルコールをほとんどまたは全く消費しない人々が脂肪肝を発症する状態である、非アルコール性脂肪性肝疾患によって引き起こされ得る。非アルコール性脂肪性肝疾患は、肥満の人々に一般的である。非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）として知られる型のこの疾患を有する人々は、硬変の発症へと進み得る。２型糖尿病が、特に重度のアルコール使用および／または慢性ウイルス性肝炎などのその他の危険因子も有する患者において、肝臓がんの増加したリスクに関連付けられている。２型糖尿病を有する人々は、過体重または肥満である傾向があり、今度はこれらが肝臓の問題を引き起こし得るので、このリスクが増加し得る。

いくつかの実施形態では、開示される脂質ナノ粒子を予防的に使用する。したがって、脂質ナノ粒子を、肝臓疾患の症状もマーカーも存在しない状況で、毎日投与して、全体的な肝臓の健康を促進し、肝臓疾患のリスクがある個体における肝臓疾患の発症を予防することができる。

ＩＶ．併用療法
開示される脂質ナノ粒子を、単独で、または１つもしくは複数の追加の治療剤と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子と追加の治療剤を別々に、ただし同時に投与する。脂質ナノ粒子と追加の治療剤を同じ組成物の一部として投与することもできる。他の実施形態では、脂質ナノ粒子と第２の治療剤を別々にかつ異なる時間に、ただし、同じ処置体制の一部として投与する。

対象に、第２の治療剤の投与の１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間もしくはそれ以上の時間、または１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日もしくはそれ以上の日数前に、第１の治療剤を投与することができる。いくつかの実施形態では、対象に、第２の薬剤の第１の投与の前に１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日または４８日毎に、１回または複数回の第１の薬剤を投与することができる。脂質ナノ粒子は第１または第２の治療剤であり得る。

脂質ナノ粒子と追加の治療剤を治療レジメンの一部として投与することができる。例えば、第１の治療剤を４日毎に対象に投与することができる場合、第２の治療剤を１日目、２日目、３日目もしくは４日目、またはその組み合わせに投与することができる。第１の治療剤または第２の治療剤を、処置レジメンの全体にわたって繰り返し投与してもよい。

例示的な分子には、それだけに限らないが、サイトカイン、化学療法剤、放射性核種、他の免疫療法剤、酵素、抗生物質、抗ウイルス薬（特に、単独の、あるいはＨＩＶまたはＢ型もしくはＣ型肝炎を処置するためのヌクレオシドと組み合わせたプロテーゼ阻害剤）、抗寄生生物薬（蠕虫、原生動物）、増殖因子、増殖阻害剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、抗体およびその生理活性断片（ヒト化、一本鎖、およびキメラ抗体を含む）、抗原およびワクチン製剤（アジュバントを含む）、ペプチド薬、抗炎症薬、自然免疫系を活性化するためにＴｏｌｌ様受容体に結合するリガンド（それだけに限らないが、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む）、適応免疫系を動員および最適化する分子、細胞傷害性Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞およびヘルパーＴ細胞の作用を活性化または上方制御するその他の分子、ならびにサプレッサーまたは制御性Ｔ細胞を非活性化または下方制御するその他の分子が含まれる。

追加の治療剤は、処置される状態、障害または疾患に基づいて選択される。例えば、免疫調節剤を、免疫応答を増強もしくは促進する、または免疫応答を低減もしくは阻害するように機能する１つまたは複数の追加の薬剤と共投与することができる。

Ａ．免疫応答の増加
１．抗微生物薬
例えば、開示される脂質ナノ粒子を、上に論じられる疾患の処置および予防、ならびに大きな火傷、開放骨折、不慮の切断またはその他の創傷などの重度の外傷性傷害の状況においても予防または予防的役割で使用することができる。したがって、開示される脂質ナノ粒子を、抗生物質、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗寄生生物薬、または精油などの抗微生物薬と組み合わせて対象に投与することができる。

いくつかの実施形態では、対象に、入院時に脂質ナノ粒子および／または抗微生物薬を投与して、さらなる細菌、真菌またはウイルス合併症を予防する。抗生物質は病原体を標的化することができ、脂質ナノ粒子は免疫系を刺激して応答増強をもたらしてさらなる感染症または疾患を処置または予防することができる。

２．化学療法剤
開示される脂質ナノ粒子を、１つまたは複数の化学療法剤およびアポトーシス促進剤と組み合わせることができる。代表的な化学療法剤には、それだけに限らないが、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフール－ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、またはこれらの組み合わせが含まれる。代表的なアポトーシス促進剤には、それだけに限らないが、フルダラビン、スタウロスポリン、シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤ、ラクトシルセラミド、１５ｄ－ＰＧＪ（２）、およびこれらの組み合わせが含まれる。

３．他の免疫調節薬
ａ．ＰＤ－１アンタゴニスト
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子をＰＤ－１アンタゴニストと共投与する。プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）は、Ｔ細胞上で誘導されると負の免疫応答をもたらす受容体のＣＤ２８ファミリーのメンバーである。ＰＤ－１とそのリガンド（Ｂ７－Ｈ１またはＢ７－ＤＣ）の１つとの間の接触によって、Ｔ細胞増殖ならびに／あるいはＴ細胞応答の強度および／または持続時間を減少させる抑制性応答が誘導される。適切なＰＤ－１アンタゴニストは、全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる、米国特許第８１１４８４５号明細書、同第８６０９０８９号明細書および同第８７０９４１６号明細書に記載されており、ＰＤ－１のリガンドに結合し、これを遮断してリガンドのＰＤ－１受容体への結合を妨害もしくは阻害する、またはＰＤ－１受容体を通した抑制性シグナル伝達を誘導することなく、ＰＤ－１受容体に直接結合し、これを遮断する、化合物または薬剤を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１受容体アンタゴニストが、抑制性シグナル伝達を誘因することなくＰＤ－１受容体に直接結合し、ＰＤ－１受容体のリガンドにも結合して、リガンドがＰＤ－１受容体を通したシグナル伝達を誘因するのを低減または阻害する。ＰＤ－１受容体に結合し、抑制性シグナルの伝達を誘因するリガンドの数および／または量を低減することによって、ＰＤ－１シグナル伝達によって送達される負のシグナルによって減弱される細胞が少なくなり、より堅牢な免疫応答を達成することができる。

ＰＤ－１シグナル伝達は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示されるペプチド抗原に接近したＰＤ－１リガンド（Ｂ７－Ｈ１またはＢ７－ＤＣなど）への結合によって駆動される（例えば、Freeman, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 105:10275-10276 (2008)参照）と考えられる。したがって、Ｔ細胞膜上でのＰＤ－１とＴＣＲの共連結を防ぐタンパク質、抗体または低分子は、有用なＰＤ－１アンタゴニストでもある。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１受容体アンタゴニストが、特にＰＤ－１とＴＣＲの共連結が結合に従わず、よって、ＰＤ－１受容体を通した抑制性シグナル伝達を誘因しない場合に、ＰＤ－１のリガンドまたはＰＤ－１自体に結合することによって、ＰＤ－１受容体シグナル伝達を低減する、またはこれを妨害する、低分子アンタゴニストまたは抗体である。

本発明の方法によって企図されるその他のＰＤ－１アンタゴニストには、ＰＤ－１またはＰＤ－１のリガンドに結合する抗体、およびその他の抗体が含まれる。

適切な抗ＰＤ－１抗体には、それだけに限らないが、全て全体が参照により組み込まれる、以下の米国特許第７３３２５８２号明細書、同第７４８８８０２号明細書、同第７５２１０５１号明細書、同第７５２４４９８号明細書、同第７５６３８６９号明細書、同第７９８１４１６号明細書、同第８０８８９０５号明細書、同第８２８７８５６号明細書、同第８５８０２４７号明細書、同第８７２８４７４号明細書、同第８７７９１０５号明細書、同第９０６７９９９号明細書、同第９０７３９９４号明細書、同第９０８４７７６号明細書、同第９２０５１４８号明細書、同第９３５８２８９号明細書、同第９３８７２４７号明細書、同第９４９２５３９号明細書、同第９４９２５４０号明細書に記載されるものが含まれる。

Berger et al., Clin. Cancer Res., 14:3044-3051 (2008)も参照されたい。

例示的な抗Ｂ７－Ｈ１（抗ＰＤ－Ｌ１とも呼ばれる）抗体には、それだけに限らないが、全て全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる、以下の米国特許第８３８３７９６号明細書、同第９１０２７２５号明細書、同第９２７３１３５号明細書、同第９３９３３０１号明細書および同第９５８０５０７号明細書に記載されるものが含まれる。

抗Ｂ７－ＤＣ（抗ＰＤ－Ｌ２とも呼ばれる）抗体については、全て全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる、米国特許第７４１１０５１号明細書、同第７０５２６９４号明細書、同第７３９０８８８号明細書、同第８１８８２３８号明細書および同第９２５５１４７号明細書を参照されたい。

他の例示的なＰＤ－１受容体アンタゴニストには、それだけに限らないが、そのホモログおよびバリアントを含むＢ７－ＤＣポリペプチド、ならびに前記のいずれかの活性断片、ならびにこれらのいずれかを組み込む融合タンパク質が含まれる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質が、ヒトＩｇＧなどの、抗体のＦｃ部分にカップリングしたＢ７－ＤＣの可溶性部分を含み、ヒトＢ７－ＤＣの膜貫通部分の全部も一部も組み込まない。

ＰＤ－１アンタゴニストはまた、例えばマウスまたは霊長類、例えばヒト由来の哺乳動物Ｂ７－Ｈ１の断片であり得、この断片はＰＤ－１に結合し、これを遮断するが、ＰＤ－１を通した抑制性シグナル伝達をもたらさない。断片はまた、融合タンパク質、例えばＩｇ融合タンパク質の一部であり得る。

他の有用なポリペプチドＰＤ－１アンタゴニストには、ＰＤ－１受容体のリガンドに結合するものが含まれる。これらには、Ｂ７－Ｈ１またはＢ７－ＤＣなどのＰＤ－１リガンドに結合し、内因性ＰＤ－１受容体への結合を防ぎ、それによって、抑制性シグナル伝達を防ぐことができる、ＰＤ－１受容体タンパク質、またはその可溶性断片が含まれる。Ｂ７－Ｈ１はまた、タンパク質Ｂ７．１に結合することが示されている（Butte et al., Immunity, Vol. 27, pp. 111-122, (2007)）。このような断片には、天然リガンドへの結合を増加させる、Ａ９９Ｌ変異などの変異を含むＰＤ－１タンパク質の可溶性ＥＣＤ部分も含まれる（Molnar et al., PNAS, 105:10483-10488 (2008)）。Ｂ７－Ｈ１リガンドに結合し、内因性ＰＤ－１受容体への結合を防ぎ、それによって抑制性シグナル伝達を防ぐことができる、Ｂ７－１またはその可溶性断片も有用である。

ＰＤ－１およびＢ７－Ｈ１アンチセンス核酸（ＤＮＡとＲＮＡの両方）、ならびにｓｉＲＮＡ分子もＰＤ－１アンタゴニストになり得る。このようなアンチセンス分子は、Ｔ細胞上でのＰＤ－１の発現、ならびにＢ７－Ｈ１、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２などのＴ細胞リガンドの産生を防ぐ。例えば、ポリエチレンイミン（Cubillos-Ruiz et al., J. Clin. Invest. 119(8): 2231-2244 (2009)参照）などの担体と複合体形成したｓｉＲＮＡ（例えば、約２１ヌクレオチド長であり、ＰＤ－１をコードする、またはＰＤ－１リガンドをコードする遺伝子に特異的であり、そのオリゴヌクレオチドは容易に商業的に購入することができる）は、ＰＤ－１ならびにＰＤ－１のリガンドを発現する細胞によって容易に取り込まれ、これらの受容体およびリガンドの発現を低減して、Ｔ細胞における抑制性シグナル伝達の減少を達成し、それによって、Ｔ細胞を活性化する。

ｂ．ＣＴＬＡ４アンタゴニスト
免疫応答でＴ細胞の効果を媒介するのに有用なその他の分子も、追加の治療剤として企図される。いくつかの実施形態では、分子が、ＣＴＬＡ４のアンタゴニスト、例えばアンタゴニスト抗ＣＴＬＡ４抗体である。本発明の方法での使用のために企図される抗ＣＴＬＡ４抗体の例としては、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４３６９０（Ｆｉｓｃｈｋｏｆｆら、国際公開第２００７／０５６５３９号パンフレット）に記載される抗体が挙げられる。

抗ＰＤ－１、抗Ｂ７－Ｈ１および抗ＣＴＬＡ４抗体についての投与量は当技術分野で公知であり、例えば０．１～１００ｍｇ／ｋｇの範囲、または１～５０ｍｇ／ｋｇもしくは１０～２０ｍｇ／ｋｇのより短い範囲であり得る。ヒト対象のための適切な用量は、５～１５ｍｇ／ｋｇの間であり得、１０ｍｇ／ｋｇの抗体（例えば、ヒト抗ＰＤ－１抗体）が具体的な実施形態である。

本発明の方法で有用な抗ＣＴＬＡ４抗体の具体例は、例えば約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されるヒト抗ＣＴＬＡ４抗体であるイピリムマブ、および例えば約１５ｍｇ／ｋｇの用量で投与されるヒト抗ＣＴＬＡ４抗体であるトレメリムマブである。２００９年１２月にオンラインで公開された、Sammartino, et al., Clinical Kidney Journal, 3(2):135-137 (2010)も参照されたい。

他の実施形態では、アンタゴニストが低分子である。一連の低分子有機化合物が、Ｂ７－１リガンドに結合してＣＴＬＡ４への結合を防ぐことが示されている（Erbe et al., J. Biol. Chem., 277:7363-7368 (2002)参照）。このような低分子有機化合物を単独で、または抗ＣＴＬＡ４抗体と共に投与して、Ｔ細胞の抑制性シグナル伝達を低減することができるだろう。

４．増強剤
いくつかの実施形態では、追加の治療剤が増強剤を含む。増強剤は、おそらくは２つ以上の機序によって免疫応答上方制御剤の有効性を増加させるように作用するが、正確な作用機序は本発明の広範な実施に必須ではない。

いくつかの実施形態では、増強剤がシクロホスファミドである。シクロホスファミド（ＣＴＸ、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＮｅｏｓａｒ（登録商標））はオキサザホスホリン（oxazahosphorine）薬物であり、類似体には、イホスファミド（ＩＦＯ、Ｉｆｅｘ）、ペルホスファミド、トロホスファミド（トロホスファミド；Ｉｘｏｔｅｎ）、ならびにこれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、プロドラッグおよび代謝物が含まれる（全体が組み込まれる、米国特許出願公開第２００７０２０２０７７号明細書）。イホスファミド（ＭＩＴＯＸＡＮＡ（登録商標））はシクロホスファミドの構造類似体であり、その作用機序はシクロホスファミドのものと同一または実質的に類似であると考えられる。ペルホスファミド（４－ヒドロペルオキシシクロホスファミド）およびトロホスファミドも、シクロホスファミドと構造的に関連するアルキル化剤である。例えば、ペルホスファミドはＤＮＡをアルキル化し、それによって、ＤＮＡ複製ならびにＲＮＡおよびタンパク質合成を阻害する。低下した宿主毒性で、選択性および応答を改善しようとして、新たなオキサザホスホリン誘導体が設計および評価されてきた（Liang J, Huang M, Duan W, Yu XQ, Zhou S. Design of new oxazaphosphorine anticancer drugs. Curr Pharm Des. 2007;13(9):963-78. Review）。これらには、マホスファミド（ＮＳＣ３４５８４２）、グルホスファミド（Ｄ１９５７５、ベータ－Ｄ－グルコシルイソホスホラミドマスタード）、Ｓ－（－）－ブロモホスファミド（ＣＢＭ－１１）、ＮＳＣ６１２５６７（アルドホスファミドペルヒドロチアジン）およびＮＳＣ６１３０６０（アルドホスファミドチアゾリジン）が含まれる。マホスファミドは、４－ヒドロキシ－ＣＰＡの化学的に安定な４－チオエタンスルホン酸塩であるオキサザホスホリン類似体である。グルホスファミドは、ＩＦＯのアルキル化代謝物であるイソホスホラミドマスタードがベータ－Ｄ－グルコース分子にグリコシド結合しているＩＦＯ誘導体である。追加のシクロホスファミド類似体は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、「抗腫瘍剤として有用なシクロホスファミド類似体」と題された米国特許第５１９０９２９号明細書に記載されている。

ＣＴＸ自体は非毒性であるが、その代謝物の一部は、ＤＮＡ架橋、および高用量で、鎖破壊を誘導する細胞傷害性アルキル化剤である。多くの細胞は、高レベルの解毒酵素アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）を発現するので、ＣＴＸに耐性である。リンパ球（造血幹細胞を除く）は低レベルのＡＬＤＨしか発現せず、サイクリング細胞はＤＮＡアルキル化剤に最も感受性であるので、ＣＴＸは増殖しているリンパ球を標的化する。

低用量のＣＴＸ（２００ｍｇ／ｋｇ未満）は、ヒトおよびがんのマウスモデルにおいて抗腫瘍免疫応答の刺激を含む免疫刺激効果を有することができる（Brode & Cooke Crit Rev. Immunol. 28:109-126 (2008)）。これらの低用量は治療量以下であり、直接的な抗腫瘍活性は有さない。対照的に、高用量のＣＴＸは抗腫瘍応答を阻害する。いくつかの機序が、抗腫瘍免疫応答の増強におけるＣＴＸの役割を説明し得る：（ａ）ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ（および具体的には特に抑制性であり得る増殖Ｔｒｅｇ）の枯渇、（ｂ）Ｂリンパ球の枯渇；（ｃ）腫瘍細胞増殖の抑制をもたらす一酸化窒素（ＮＯ）の誘導；（ｄ）ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋ＭＤＳＣの動員および拡大。これらの一次効果は多数の二次効果を有する；例えば、Ｔｒｅｇ枯渇後、マクロファージはより多くのＩＦＮ－γおよびより少ないＩＬ－１０を産生する。ＣＴＸはまた、Ｉ型ＩＦＮ発現を誘導し、リンパ球の恒常性増殖を促進することが示されている。

Ｔｒｅｇ枯渇は、ＣＴＸが抗腫瘍免疫応答を増強する機序として最もよく引用される。この結論は、一部は、養子移植実験の結果に基づく。ＡＢ１－ＨＡ腫瘍モデルでは、９日目のＣＴＸ処置が７５％の治癒率をもたらす。１２日目の精製Ｔｒｅｇの移植はＣＴＸ応答をほぼ完全に阻害した（van der Most et al. Cancer Immunol. Immunother. 58:1219-1228 (2009)）。同様の結果が、ＨＨＤ２腫瘍モデルでも観察された：ＣＴＸ前処置後のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの養子移植は、ワクチンに対する治療応答を排除した（Taieb, J. J. Immunol. 176:2722-2729 (2006)）。

多数のヒト臨床試験が、低用量ＣＴＸが、抗腫瘍免疫応答を促進するための、安全で、忍容性が良好で、有効な薬剤であることを実証している（Bas, & Mastrangelo Cancer Immunol. Immunother. 47:1-12 (1998)）。

抗腫瘍免疫応答を増強するためのＣＴＸの最適用量は、Ｔｒｅｇレベルを正常範囲未満に低下させることによって全Ｔ細胞数を低下させるが、治療量未満である用量である（Machiels et al. Cancer Res. 61:3689-3697 (2001)参照）。

ＣＴＸが免疫増強剤として使用されたヒト臨床試験では、３００ｍｇ／ｍ２の用量が通常使用されている。平均男性（６フィート、１７０ポンド（７８ｋｇ）で体表面積１．９８ｍ２）では、３００ｍｇ／ｍ２は８ｍｇ／ｋｇ、または６２４ｍｇの総タンパク質である。がんのマウスモデルでは、３０ｇのマウスで０．４５～４．５ｍｇの総タンパク質に関連する１５～１５０ｍｇ／ｋｇに及ぶ用量で有効性が認められた（Machiels et al. Cancer Res. 61:3689-3697 (2001)、Hengst et al Cancer Res. 41:2163-2167 (1981)、Hengst Cancer Res. 40:2135-2141 (1980)）。

大型哺乳動物、例えばヒトなどの霊長類の患者では、このようなｍｇ／ｍ２用量を使用することができるが、有限時間間隔にわたって投与される単位用量を使用することもできる。このような単位用量を、有限期間にわたって毎日投与することができ、例えば最大３日間、または最大５日間、または最大７日間、または最大１０日間、または最大１５日間、または最大２０日間、または最大２５日間が全て本発明によって具体的に企図される。同じレジメンを本明細書で列挙されるその他の増強剤にも適用することができる。

他の実施形態では、増強剤が、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、抗ＴＧＦβまたはイマチニブ（ＧＬＥＥＶＡＣ（登録商標））などの制御性Ｔリンパ球（Ｔ－ｒｅｇ）の活性および／または数を低減する薬剤である。列挙される処置レジメンは、アジュバントを投与することも含み得る。

有用な増強剤には、パクリタキソールなどの有糸分裂阻害剤、アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール）および血管新生阻害剤（ＶＥＧＦ阻害剤、例えばアバスチン、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ）（例えば、Li et al., Vascular endothelial growth factor blockade reduces intratumoral regulatory T cells and enhances the efficacy of a GM-CSF-secreting cancer immunotherapy. Clin Cancer Res. 2006 Nov 15; 12(22):6808-16.参照）、アントラサイクリン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、ＴＬＲ４アンタゴニスト、およびＩＬ－１８アンタゴニストも含まれる。

Ｂ．免疫応答の低減
１．免疫抑制剤
いくつかの実施形態では、免疫応答、または炎症性／自己免疫疾患／障害が、開示される脂質ナノ粒子と、免疫抑制剤である第２の薬剤とを対象に投与することによって処置される。免疫抑制剤には、それだけに限らないが、その他のリンパ球表面マーカー（例えば、ＣＤ４０、アルファ－４インテグリン）もしくはサイトカインに対する抗体、融合タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ（Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標））、ＴＮＦＲ－Ｉｇ（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）））、ＴＮＦ－α遮断剤、例えばＥｎｂｒｅｌ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ、ＣｉｍｚｉａおよびＨｕｍｉｒａ、シクロホスファミド（ＣＴＸ）（すなわち、Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標））、メトトレキサート（ＭＴＸ）（すなわち、Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（登録商標）、Ｔｒｅｘａｌｌ（登録商標））、ベリムマブ（すなわち、Ｂｅｎｌｙｓｔａ（登録商標））、またはその他の免疫抑制薬（例えば、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６様化合物、ラパマイシン化合物またはステロイド）、抗増殖薬、細胞傷害剤、または免疫抑制を助け得るその他の化合物が含まれる。

治療剤は、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ（アバタセプト）などのＣＴＬＡ－４融合タンパク質であり得る。ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ融合タンパク質は、抗原提示細胞上のＣＤ８０／ＣＤ８６（Ｂ７－１／Ｂ７－２）への結合について、Ｔ細胞上の共刺激受容体、ＣＤ２８と競合し、よって、Ｔ細胞活性化を阻害するよう機能する。別の実施形態では、治療剤が、ベラタセプトとして知られるＣＴＬＡ－４－Ｉｇ融合タンパク質である。ベラタセプトは、インビボでＣＤ８６に対する結合活性を著しく増加させる２個のアミノ酸置換（Ｌ１０４ＥおよびＡ２９Ｙ）を含有する。別の実施形態では、治療剤がＭａｘｙ－４である。

別の実施形態では、治療剤がシクロホスファミド（ＣＴＸ）である。シクロホスファンとしても知られるシクロホスファミド（Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標）についての一般名）は、オキサゾホリン（oxazophorine）群のナイトロジェンマスタードアルキル化剤である。これは種々の型のがんおよび一部の自己免疫障害を処置するために使用される。シクロホスファミド（ＣＴＸ）は、腎ループスを有する患者のびまん性増殖性糸球体腎炎に使用される主要な薬物である。

治療剤は、抗二本鎖ＤＮＡ（抗ｄｓＤＮＡ）自己抗体の血液もしくは血清レベルを低減する、および／またはそれを必要とする患者のタンパク尿を低減するのに有効な量で投与することができる。

別の実施形態では、治療剤が、血清中のアデノシンの量を増加させる。例えば、国際公開第０８／１４７４８２号パンフレットを参照されたい。例えば、第２の治療剤は、ＣＤ７３－Ｉｇ、組換えＣＤ７３、またはＣＤ７３の発現を増加させる別の薬剤（例えば、サイトカインまたはモノクローナル抗体または低分子）であり得る。例えば、国際公開第０４／０８４９３３号パンフレットを参照されたい。別の実施形態では、治療剤がインターフェロン－ベータである。

治療剤は、Ｔｈ１、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、ならびに／あるいはそれだけに限らないが、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－ベータ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１８、ＩＬ－１７、ＩＬ－６、ＩＬ－２３、Ｉｌ－２２、ＩＬ－２１およびＭＭＰを含む炎症性分子を分泌するまたはその他の細胞に分泌させるその他の細胞による分化、増殖、活性および／またはサイトカイン産生および／または分泌を阻害するまたは低減する低分子であり得る。別の実施形態では、治療剤が、Ｔｒｅｇと相互作用する、Ｔｒｅｇ活性を増強する、ＴｒｅｇによるＩＬ－１０分泌を促進もしくは増強する、Ｔｒｅｇの数を増加させる、Ｔｒｅｇの抑制能を増加させる、またはこれらの組み合わせの低分子である。

いくつかの実施形態では、組成物がＴｒｅｇ活性または産生を増加させる。例示的なＴｒｅｇ増強剤には、それだけに限らないが、グルココルチコイドフルチカゾン、サルメテロール、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－４に対する抗体；ビタミンＤ３およびデキサメタゾン、ならびにこれらの組み合わせが含まれる。

いくつかの実施形態では、治療剤が、抗体、例えばＩＬ－６、ＩＬ－２３、ＩＬ－２２またはＩＬ－２１などの炎症促進分子に対する機能遮断抗体である。

本明細書で使用される場合、「ラパマイシン化合物」という用語には、中性三環式化合物ラパマイシン、ラパマイシン誘導体、ラパマイシン類似体、およびラパマイシンと同じ作用機序（例えば、サイトカイン機能の阻害）を有すると考えられるその他のマクロライド化合物が含まれる。「ラパマイシン化合物」という言葉には、ラパマイシンとの構造的類似性を有する化合物、例えばその治療有効性を増強するよう修飾されている、類似の大環状構造を有する化合物が含まれる。例示的なラパマイシン化合物は当技術分野で公知である（例えば、国際公開第９５１２２９７２号パンフレット、国際公開第９５１１６６９１号パンフレット、国際公開第９５１０４７３８号パンフレット、米国特許第６０１５８０９号明細書；同第５９８９５９１号明細書；米国特許第５５６７７０９号明細書；同第５５５９１１２号明細書；同第５５３０００６号明細書；同第５４８４７９０号明細書；同第５３８５９０８号明細書；同第５２０２３３２号明細書；同第５１６２３３３号明細書；同第５７８０４６２号明細書；同第５１２０７２７号明細書参照）。

「ＦＫ５０６様化合物」という言葉には、ＦＫ５０６、ならびにＦＫ５０６誘導体および類似体、例えばＦＫ５０６との構造的類似性を有する化合物、例えばその治療有効性を増強するよう修飾されている、類似の大環状構造を有する化合物が含まれる。ＦＫ５０６様化合物の例としては、例えば、国際公開第００１０１３８５号パンフレットに記載されるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される「ラパマイシン化合物」という言葉にＦＫ５０６様化合物が含まれない。

２．抗炎症薬
他の適切な治療剤には、それだけに限らないが、抗炎症薬が含まれる。抗炎症薬は、非ステロイド、ステロイド、またはこれらの組み合わせであり得る。一実施形態は、約１％（ｗ／ｗ）～約５％（ｗ／ｗ）、典型的には約２．５％（ｗ／ｗ）の抗炎症薬を含有する経口組成物を提供する。非ステロイド性抗炎症薬の代表的な例としては、限定されないが、ピロキシカム、イソキシカム、テノキシカム、スドキシカムなどのオキシカム；アスピリン、ジサルシド、ベノリラート、トリリセート、サファプリン（safapryn）、ソルプリン、ジフルニサルおよびフェンドサルなどのサリチレート；ジクロフェナク、フェンクロフェナク、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、イソキセパク、フロフェナク、チオピナク、ジドメタシン、アセメタシン、フェンチアザク、ゾメピラク、クリンダナク（clindanac）、オキセピナク、フェルビナクおよびケトロラクなどの酢酸誘導体；メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、ニフルミン酸およびトルフェナム酸などのフェナム酸；イブプロフェン、ナプロキセン、ベノキサプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、インドプロフェン、ピルプロフェン、カルプロフェン、オキサプロジン、プラノプロフェン、ミロプロフェン、チオキサプロフェン、スプロフェン、アルミノプロフェンおよびチアプロフェン酸などのプロピオン酸誘導体；フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、フェプラゾン、アザプロパゾンおよびトリメタゾンなどのピラゾールが挙げられる。これらの非ステロイド性抗炎症薬の混合物を使用してもよい。

ステロイド性抗炎症薬の代表的な例としては、限定されないが、ヒドロコルチゾン、ヒドロキシル－トリアムシノロン、アルファ－メチルデキサメタゾン、デキサメタゾン－リン酸エステル、ベクロメタゾンジプロピオン酸エステル、クロベタゾール吉草酸エステル、デソニド、デスオキシメタゾン、デスオキシコルチコステロン酢酸エステル、デキサメタゾン、ジクロリソン、ジフロラゾン二酢酸エステル、ジフルコルトロン吉草酸エステル、フルアドレノロン、フルクロロロンアセトニド、フルドロコルチゾン、フルメタゾンピバル酸エステル、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル、フルコルトロン、フルプレドニデン（フルプレドニリデン）酢酸エステル、フルランドレノロン、ハルシノニド、ヒドロコルチゾン酢酸エステル、ヒドロコルチゾン酪酸エステル、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、ジフルオロゾン二酢酸エステル、フルラドレノロン、フルドロコルチゾン、ジフルロゾン二酢酸エステル、フルラドレノロンアセトニド、メドリソン、アムシナフェル（amcinafel）、アムシナフィド、ベタメタゾンおよびそのエステルのバランス、クロロプレドニゾン、クロロプレドニゾン酢酸エステル、クロコルテロン、クレシノロン、ジクロリゾン、ジフルルプレドネート、フルクロロニド、フルニゾリド、フルオロメタロン、フルペロロン、フルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン吉草酸エステル、ヒドロコルチゾンシクロペンチルプロピオン酸エステル、ヒドロコルタメート（hydrocortamate）、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ベクロメタゾンジプロピオン酸エステル、トリアムシノロン、ならびにこれらの混合物などの副腎皮質ステロイドが挙げられる。

方法：
ＣＫＫ－Ｅ１２の合成：
化合物１（２０ｇ、４１．９ｍｍｏｌ）を、１００ｍｌフラスコに添加し、トリフルオロ酢酸（４２ｍＬ）を０℃でゆっくり添加し、次いで、室温で３０分間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、次いで、ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解した粗生成物を０℃でピリジン（３００ｍＬ）に滴加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させて白色固体を得て、酢酸エチルで洗浄して化合物２（８．４ｇ、１３．０４ｍｍｏｌ、収率３１％）を得た（図６Ｂ）。Ｐｄ／Ｃ（１０重量％、３．０ｇ）を化合物２の酢酸／ＣＨ２Ｃｌ２（１５０／１５０ｍＬ）中溶液に添加した。黒色懸濁液を水素で５分間脱気し、水素雰囲気下、室温で一晩撹拌した。反応混合物をｃｅｌｉｔｅによって濾過し、ＭｅＯＨで洗浄した。合わせた濾液を濃縮して粗黄色粘性油を得た。酢酸エチルを添加することによって油を凝固し、酢酸エチルで洗浄して化合物３を得た（図６Ｃ）。トリエチルアミン（０．１２ｍＬ、０．８８ｍｍｏｌ）を、化合物３（８４ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）および１，２－エポキシドデカン（２４７ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（２ｍＬ）中溶液に添加した。次いで、室温で３０分間撹拌した後、反応混合物をマイクロ波反応器中、１５０℃で５時間照射した。粗残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィーを介して精製した。４つのアルキル尾部を有するバージョンを、フラッシュカラムクロマトグラフィーを使用して精製した後、１Ｈ－ＮＭＲを使用して化学構造を確認した（図６Ｃ）。

ナノ粒子製剤化：
以前記載されたように（Poisson, et al., Journal of Hepatology, 66:212 (2017)）、Ｃｒｅ ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、イオン化脂質、ＰＥＧおよびコレステロールを混合することによって、マイクロ流体デバイスでナノ粒子を製剤化した。実験設計を図１Ｈで視覚化することができる。可変モル比のこれらの構成成分を用いて、ナノ粒子を調製した。核酸（例えば、ＤＮＡバーコード、ｍＲＮＡ）を１０ｍＭクエン酸緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａ）に希釈し、シリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）に充填した。ナノ粒子を構成する材料（ＣＫＫ－Ｅ１２、コレステロール、ＰＥＧ、ＤＯＰＥ）をエタノールに希釈し、第２のシリンジに充填した。シリンジポンプを使用して、マイクロ流体デバイスで、クエン酸相とエタノール相を合わせて混合した。

ＤＮＡバーコード：
ＤＮＡバーコードを使用してナノ粒子をスクリーニングおよび製剤化する方法は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５８１７１に記載されている。各々の化学的に異なるＬＮＰを、自身の異なるＤＮＡバーコードを有するように製剤化した。例えば、ＬＮＰ１はＣｒｅ ｍＲＮＡおよびＤＮＡバーコード１を有する一方、化学的に異なるＬＮＰ２はＣｒｅ ｍＲＮＡおよびＤＮＡバーコード２を有していた。ＤＮＡバーコードを、以前記載されたもの（Paunovaska, K., et al. Nano Lett, 18:2148 (2018)）と同様に、ユニバーサルプライマー部位および特異的８ヌクレオチドバーコード配列を用いて合理的に設計した。各配列の等しい増幅を確保するために、全てのバーコードにユニバーサル順方向および逆方向プライマー領域を含めた。８ｎｔ配列は４^８（６５５３６）超の異なるバーコードを生成することができる。

ナノ粒子特性評価：
動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、ＬＮＰ流体力学的直径を測定した。ＬＮＰを滅菌１×ＰＢＳに約０．０６μｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、分析した。３つの基準：直径２０ｎｍ超、直径２１５ｎｍ未満、およびただ１つの変曲点を有する自己相関関数を満たす場合に、ＬＮＰを算入した。これらの基準を満たす粒子をプールし、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で透析し、０．２２μｍフィルタで滅菌濾過した。

動物実験：
全ての動物実験は、ジョージア工科大学の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）に従って実施した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（番号０００６６４）およびＡｉ１４ ＬＳＬ－Ｔｏｍａｔｏ（番号００７９１４）マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。全ての実験で、マウスは５～８週齢とし、１群当たりＮ＝３～４匹のマウスに尾静脈を介して静脈内注射した。ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してナノ粒子濃度を決定した。全マウスについての体重を図７Ａ～図７Ｃに含める。

全ての場合で、ＬＮＰの投与３日後にマウスを屠殺し、右心房を通して２０ｍＬの１×ＰＢＳで直ちに灌流した。灌流直後に器官を単離した。組織を切断し、次いで、３７℃および７５０ｒｐｍで４５分間、コラゲナーゼＩ型（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、コラゲナーゼＸＩ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）およびヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む消化酵素溶液に入れた。心臓および脾臓用の消化酵素はコラゲナーゼＩＶ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含んでいた。消化した組織を７０μｍフィルタに通過させ、赤血球を溶解した。細胞を染色して具体的な細胞集団を特定し、ＢＤ ＦａｃｓＦｕｓｉｏｎセルソーターを使用して選別した。染色に使用した抗体クローンは、抗ＣＤ３１（３９０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ４５．２（１０４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ６８（ＦＡ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ３（１７Ａ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ１９（６Ｄ５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ３４（ＳＡ３７６Ａ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）であった。表１は、各細胞および組織型に使用したＦＡＣＳマーカーを示している。

ＰＣＲ増幅：
ネステッドＰＣＲプロトコルを使用して、全ての試料を増幅し、配列決定の準備をした。より具体的には、１μＬの各プライマー（１０μＭ逆方向／順方向）を、５μＬのＫａｐａ ＨｉＦｉ ２×マスターミックス、２μＬの滅菌Ｈ２Ｏおよび１μＬのＤＮＡ鋳型に添加した。第２のＰＣＲはＮｅｘｔｅｒａ ＸＴ化学インデックスおよびｉ５／ｉ７アダプター領域を加え、鋳型として「ＰＣＲ１」からの産物を使用した。

ディープシーケンシング：
Ｉｌｌｕｍｉｎａによって提案される標準的なプロトコルを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉｎｉＳｅｑ（商標）で、Ｉｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングを実施した。ジョージア工科大学分子進化コアでシーケンシングを行った。

データ正規化：
本発明者らが以前記載したように（Paunovaska, K., et al. Nano Lett, 18:2148 (2018)）、各粒子についてのカウントを、マウスに注射したバーコードＬＮＰ混合物に正規化した。

データ分析：
シーケンシング結果を、カスタムＰｈｙｔｈｏｎベースツールを使用して処理して、各組織についての生のバーコードカウントを抽出した。次いで、これらの生のカウントを、さらなる分析の前に、Ｒスクリプトで正規化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して統計分析を行った。特に明記しない限り、データを平均±標準誤差としてプロットする。

[実施例１]
酸化コレステロールを含有する合理的に設計されたナノ粒子のライブラリーの合成。
結果：
品質管理として、各個々のＬＮＰのサイズを分析した。その流体力学的直径が２０～２１５ｎｍの間であり、その自己相関曲線が１つの変曲点を含有する場合にのみ、ＬＮＰをプールした（図４Ａ～図４Ｂ）。１２５個の製剤化ＬＮＰのうちの８６個がこれらの基準を満たしたので、プールした。対照として、全８６個のＬＮＰの直径をプールしたＬＮＰ溶液の直径と比較したところ、これらが類似であることが認められた（図２Ｃ）。このことは、プールしたＬＮＰが混合後に凝集しなかったことを示唆している。裸のＤＮＡは細胞に容易には侵入しないので、裸のＤＮＡバーコードを陰性対照として添加した。細胞を単離し、ＮＧＳを実施した後、予想通り、裸のＤＮＡが、ＬＮＰによって送達される全ＤＮＡバーコードほど頻繁に細胞に送達されないことが決定された（図２Ｄ～図２Ｅ）。

プールしたＬＮＰの注射の７２時間後にマウスを屠殺した。この時点は、Ｃｒｅ ｍＲＮＡ送達後に細胞がｔｄＴｏｍａｔｏを発現するのを可能にする（図２Ａ）。次いで、肝臓、脾臓、心臓、腎臓、膵臓、肺および骨髄を単離した。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して、２８個の異なるｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞型を単離した（図２Ａ）。様々な器官におけるｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞型の割合を比較すると、肝臓の細胞が、他の器官の細胞よりも標的化される傾向があった（図２Ｂ）。ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の２番目に高い割合を有する器官は脾臓であった。残りの５つの器官は、無視できる送達を有していた（図４Ｃ）。偏りのないユークリッドアルゴリズムを使用して、バーコードシーケンシングデータをクラスタリングした。このバイオインフォマティクス技術を遺伝子発現データに規則的に適用し、ナノ粒子バーコードデータを分析することができる。ユークリッドクラスタリングは、４つの肝臓細胞型が、脾臓細胞型よりも密接に「クラスター化する」傾向があることを明らかにした（図２Ｆ）。ｔｄＴｏｍａｔｏ＋肝内皮細胞、肝免疫細胞およびクッパー細胞の割合は、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋肝細胞の割合よりもはるかに高いことが分かった（図２Ｂ）。

[実施例２]
修飾コレステロールはインビボでのナノ粒子送達を変化させ得る
方法：
非修飾コレステロールに酵素を作用させて、側鎖または環酸化されているバリアントを形成する（図１Ａ）。これらの修飾がＬＮＰ標的化を変化させたかどうかを調査するために、マイクロフルイディクスを使用して１２５個のＬＮＰを製剤化した（図１Ｂ～図１Ｇ）。コレステロール以外の成分からの変動を最小化するために、ＬＮＰをイオン化脂質様材料ｃＫＫ－Ｅ１２、２つの十分検証されたＰＥＧ－脂質、リン脂質１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および９個の異なるコレステロールバリアントのうちの１つから作製した（図１Ｂ～図１Ｇ）。

マイクロ流体デバイスで内容物を合わせて混合することによって、ＬＮＰを形成した。各ＬＮＰは、そのＬＮＰのタグとして作用する特有のＤＮＡバーコード、ならびに機能的ｍＲＮＡ送達をシグナル伝達するＣｒｅ ｍＲＮＡを有していた（図１Ｈ）。安定なＬＮＰを合わせてプールし（図１Ｉ）、１．０ｍｇ／ｋｇの合計核酸用量でＡｉ１４マウスに投与した。Ａｉ１４マウスは、ＣＡＧプロモーターの制御下、Ｌｏｘ－Ｓｔｏｐ－Ｌｏｘ－ｔｄＴｏｍａｔｏ構築物を含有しており；結果として、（１）Ｃｒｅ ｍＲＮＡが細胞質に送達され、（２）Ｃｒｅ ｍＲＮＡがＣｒｅタンパク質に翻訳され、（３）Ｃｒｅタンパク質が細胞質から核に移動し、（４）Ｃｒｅタンパク質がＬｏｘ部位間の「Ｓｔｏｐ」を除去することによってゲノムを編集したら、Ａｉ１４マウスの細胞がｔｄＴｏｍａｔｏ＋になる。したがって、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用してｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞型を単離し、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用してその中のバーコードを定量化することによって、機能的ｍＲＮＡ送達が起こった細胞中に位置するＬＮＰを特定することができる（図１Ｉ）。ＮＧＳシーケンシングデータを、ＲＮＡ－ｓｅｑにおける百万当たりのカウントと同様に、「正規化送達」として定量化した（図１Ｉ）。

結果：
全体的な脾臓および肝臓送達に対するコレステロール構造の影響を定量化するために、配列決定した全８個の細胞型（脾臓で４個および肝臓で４個）についての正規化送達を計算した（図３Ａ）。側鎖酸化コレステロールバリアントは、他のコレステロールバリアントと比較して送達を増強する傾向があった（図３Ｂ～図３Ｃ）。特に、２５－ヒドロキシコレステロール（２５－ＯＨ）および２０α－ヒドロキシコレステロール（２０α－ＯＨ）を用いて製剤化されたＬＮＰは、全８個の細胞型にわたってより高い正規化送達をもたらした（図３Ｄ）。これらの計算を補足するために、どのコレステロールバリアントがＬＮＰの上位１０％で濃縮されているかを決定した（図３Ｅ）。次いで、ＬＮＰの下位１０％の濃縮を計算し、上位１０％の濃縮から差し引いた（図３Ｅ～図３Ｆ）。これにより、所与のコレステロールバリアントが最も良く働くＬＮＰおよび最も悪く働くＬＮＰに見られる可能性がどれくらいかを特定する。濃縮計算を図５Ａに詳述する。追加の対照として、コレステロールモルパーセント、イオン化脂質モルパーセント、およびリン脂質モルパーセントについて、同じ２つの分析を実施した－全８個の細胞型にわたる正規化送達、および濃縮（図５Ｂ～図５Ｄ）。有意な傾向は観察されなかった。

これらのデータは、ＬＮＰコレステロール化学組成がＬＮＰ標的化における重要な因子であることを示唆した。しかしながら、これはＬＮＰのサイズを考慮していなかった。約２０～約２００ｎｍの間の流体力学的直径についてはナノ粒子のサイズと送達との間に関係がないことが前に分かった。この実験でサイズが送達をどれほど変化させたのかを調査するために、全てのＬＮＰ（図５Ｋ）、尾部酸化コレステロールを含むＬＮＰ（図５Ｌ）および環酸化コレステロールを含むＬＮＰ（図５Ｍ）について、正規化送達がＬＮＰサイズで変化するかどうかを計算した；関係は見られなかった。コレステロール構造およびコレステロール構造に基づく安定なＬＮＰの平均サイズの関数としての算入基準を満たした製剤化ＬＮＰのパーセントを計算した。有意な差は見られなかった（図５Ｎ～図５Ｏ）。同じ分析を、コレステロールモルパーセントの関数として実施したところ、同じ結論に達した（図５Ｐ～図５Ｑ）。よって、サイズが、２０～２１５ｎｍの間でＬＮＰ送達に影響を及ぼす証拠はなかった。

このために、特定した上位３個のＬＮＰ候補を、Ｃｒｅ ｍＲＮＡを用いて製剤化した。３個の製剤化したＬＮＰのうち、２５－ＯＨコレステロールを含有していた１個のＬＮＰは一貫して製剤化しなかったので、除外した。２０α－ＯＨコレステロールを含有していた残りの２個のＬＮＰ（図３Ｇ～図３Ｋ）は、安定なＬＮＰを形成したので、０．２５ｍｇ／ｋｇの合計ｍＲＮＡ用量でＡｉ１４マウスに投与した。励みになるように、両ＬＮＰは、前のスクリーニングからの結果を再現した（図３Ｌ～図３Ｏ）。ＬＮＰ１とＬＮＰ２の両方が、０．２５ｍｇ／ｋｇの注射後の微小環境で細胞を堅牢に標的化した。スクリーニングによって予測されるように、肝細胞はずっと効率的でなく標的化された。０．２５ｍｇ／ｋｇでの堅牢な送達によって励まされたので、ＬＮＰ１およびＬＮＰ２を０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で注射した。もう一度、堅牢な送達が観察された（図３Ｌ～図３Ｏ）。ＬＮＰ１およびＬＮＰ２は、共にＣｒｅベースの系を飽和することによって０．２５ｍｇ／ｋｇで等しく良く働いたが、０．０５ｍｇ／ｋｇというより低い用量では、ＬＮＰ１がＬＮＰ２より性能が優れていた。ＬＮＰ１はいずれの実験でもマウスの体重減少を引き起こさなかった；ＬＮＰ２は、０．２５ｍｇ／ｋｇでマウスを体重減少させた（図７Ａ～図７Ｃ）。

治療用ＲＮＡの肝細胞への全身送達は、ＦＤＡ承認薬をもたらした（Rizk, M and Tuzmen, S., Pharmacogenomics and Personalized Medicine, 10:267 (2017)）。非肝細胞への送達はより困難なままであった。よって、ＬＮＰがインビボでＲＮＡをどのように送達するかを研究するための偏りのないハイスループット法は、新たな向性を有するナノ粒子の発見を加速することができるだろう。ここでは、酸化コレステロールを含有するＬＮＰが、ｍＲＮＡを、肝細胞よりも強力に肝臓微小環境内の細胞に送達することができることが報告されている。特に、ヒトでのｓｉＲＮＡ療法に使用される投与体制未満の０．０５ｍｇ／ｋｇで堅牢な送達が起こった。疾患における肝臓内皮細胞（Poisson, et al., Journal of Hepatology, 66:212 (2017)）およびクッパー細胞（Kolios, G., et al., World Journal of Gastroenterology, 12:7413 (2006)）の重要性を考えると、これらのデータは、送達におけるさらなる前進が、最終的に、肝臓微小環境内のタンパク質補充療法をもたらし得ることを示唆している。

前記明細書において、本発明をその一定の実施形態に関して説明し、多くの詳細を例示目的で示してきたが、本発明が追加の実施形態を受け入れること、および本発明の基本原理から逸脱することなく、本明細書に記載される詳細のいくらかをかなり変更することができることが当業者に明らかであるだろう。

本明細書に引用される全ての参考文献は、全体が参照により組み込まれる。本発明は、その精神からも本質的な属性からも逸脱することなく、他の具体的な形態で具体化することができ、したがって、本発明の範囲を示すものとして、前記明細書ではなく、添付の特許請求の範囲を参照すべきである。

Claims (26)

1. イオン化脂質と、
   リン脂質と、
   ポリエチレングリコールと、
   酸化コレステロールと
   を含む、脂質ナノ粒子組成物。
2. 前記イオン化脂質が３，６－ビス（｛４－［ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ］ブチル｝）ピペラジン－２，５－ジオン（ＣＫＫ－Ｅ１２）である、請求項１に記載のナノ粒子組成物。
3. 前記リン脂質が１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項１または２に記載のナノ粒子組成物。
4. 前記ＰＥＧがＣ_１４ＰＥＧ_２０００またはＣ_１８ＰＥＧ_２０００である、請求項１から３のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物。
5. 前記酸化コレステロールが、Ｄステロール環の近くで、ヒドロキシル基で修飾されている、請求項１から４のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物。
6. 前記酸化コレステロールが、２０α－ヒドロキシコレステロール、６－ケト－５α－ヒドロキシコレステロール、７α－ヒドロキシコレステロール、７β－ヒドロキシコレステロール、７－ケトコレステロール、７β，２５－ジヒドロキシルコレステロール、２７－ヒドロキシコレステロール、２５－ヒドロキシコレステロール、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物。
7. 約３０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％のイオン化脂質と、約５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％のコレステロールと、約１０ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％のリン脂質と、約０ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質とを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物。
8. 治療剤または予防剤をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物。
9. 前記治療剤または予防剤が脂質ナノ粒子内にカプセル化されている、請求項８に記載のナノ粒子組成物。
10. 前記治療剤または予防剤がリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項８に記載のナノ粒子組成物。
11. 前記ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項１０に記載のナノ粒子組成物。
12. 約２０ｎｍ～約２１５ｎｍの直径を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物。
13. 請求項１から１２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
14. 治療剤または予防剤を、それを必要とする対象に送達する方法であって、請求項８から１２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
15. 第２の治療剤を投与するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ナノ粒子が、カーゴを肝臓内の細胞に優先的に送達する、請求項１４に記載の方法。
17. 前記肝臓細胞がクッパー細胞および内皮細胞を含む、請求項１６に記載の方法。
18. それを必要とする対象の肝臓疾患を予防または処置する方法であって、肝臓疾患を予防または処置するのに有効な量の請求項１から１２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子を前記対象に投与するステップを含む方法。
19. 前記対象に投与される脂質ナノ粒子の量が０．０５ｍｇ／ｋｇである、請求項１５に記載の方法。
20. 肝臓疾患が、肝がん、肝硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患、およびアルコール関連肝疾患からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
21. 薬物を、それを必要とする対象のクッパー細胞に送達する方法であって、
    前記薬物を前記クッパー細胞に送達するのに有効な量の請求項８から１２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子を投与するステップ
    を含む方法。
22. 薬物を、それを必要とする対象の肝臓内皮細胞に送達する方法であって、
    前記薬物を前記肝臓内皮細胞に送達するのに有効な量の請求項８から１２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子を投与するステップ
    を含む方法。
23. 薬物を、それを必要とする対象の免疫細胞に送達する方法であって、
    前記薬物を前記肝臓内皮細胞に送達するのに有効な量の請求項８から１２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子を投与するステップ
    を含む方法。
24. ＣＫＫ－Ｅ１２と、
    ＤＯＰＥと、
    Ｃ_１８ＰＥＧ_２０００と、
    ２０α－ヒドロキシコレステロールと
    を含む、脂質ナノ粒子組成物。
25. ＣＫＫ－Ｅ１２と、
    ＤＯＰＥと、
    Ｃ_１８ＰＥＧ_２０００と、
    ２５－ヒドロキシコレステロールと
    を含む、脂質ナノ粒子組成物。
26. 前記イオン化脂質、前記リン脂質、前記ポリエチレングリコールおよび前記酸化コレステロールを全て組み合わせて共に選択して、ナノ粒子内にカプセル化されたｍＲＮＡを、肝臓微小環境内の肝細胞よりも非肝細胞に強力に送達する能力を有する脂質ナノ粒子組成物を得る、請求項１から１２または２４から２５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子組成物、または請求項１３に記載の医薬組成物。
    

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