WO2018084168A1 - 皮膚線維症処置剤 - Google Patents

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skin
retinoid
extracellular matrix
carrier
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崇徳 豊嶋
大吾 橋本
洋司郎 新津
憲二郎 味呑
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日東電工株式会社
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    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Definitions

  • the present disclosure relates to a carrier for promoting substance delivery to extracellular matrix-producing cells in the skin, a composition for treating dermal fibrosis using the carrier, a method for treating dermal fibrosis, and the like.
  • Non-patent Documents 1 and 2 Systemic scleroderma and chronic graft-versus-host disease (cGVHD) that develops after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation often results in a high degree of skin fibrosis (Non-patent Documents 1 and 2). Fibrosis of the skin is not only a cosmetic problem, but at high levels, it causes skin hardening, resulting in, for example, limited range of motion of the joints, opening disorders, masked facial appearance, respiratory problems, and so on. ) Is significantly reduced.
  • immunosuppressive drugs are administered as a therapeutic method, but the effect is not always sufficient, and it is accompanied by extensive immunosuppression, which may lead to the development of infectious diseases and tumor recurrence. is there. In order to treat such patients safely and effectively, development of a fibrosis inhibitor without an immunosuppressive effect is awaited.
  • Some aspects of the present disclosure have been made to solve the above-described problems, and an object thereof is to provide a novel dermatofibrosis treatment agent and a dermatofibrosis treatment method.
  • Some aspects of the present disclosure relate to: ⁇ 1> A carrier for delivering a substance to an extracellular matrix-producing cell in the skin, comprising a retinoid as a component that promotes the substance delivery to the extracellular matrix-producing cell in the skin.
  • a carrier for delivering a substance to an extracellular matrix-producing cell in the skin comprising a retinoid as a component that promotes the substance delivery to the extracellular matrix-producing cell in the skin.
  • ⁇ 3> The carrier according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, further comprising a lipid.
  • a medicament for treating dermal fibrosis comprising the carrier according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> above and a drug that controls the activity or proliferation of extracellular matrix-producing cells in the skin. Composition.
  • a normal skin tissue from a fibrotic skin tissue comprising the carrier according to any one of the above ⁇ 1> to ⁇ 3> and a drug that controls the activity or proliferation of extracellular matrix-producing cells in the skin.
  • a drug that controls the activity or proliferation of extracellular matrix-producing cells in the skin is selected from the group consisting of substances that inhibit the production / secretion of extracellular matrix components, cytostatic substances, apoptosis inducers, and TIMP inhibitors
  • ⁇ 7> The pharmaceutical composition according to ⁇ 6>, wherein the substance that inhibits production / secretion of extracellular matrix components is an inhibitor of HSP47.
  • ⁇ 8> The pharmaceutical composition according to any one of the above ⁇ 4> to ⁇ 7>, which is a form prepared at the time of use.
  • ⁇ 9> One or more comprising a drug that controls the activity or proliferation of extracellular matrix-producing cells in the skin, a retinoid and / or a retinoid conjugate, and, if necessary, a carrier constituent other than a retinoid, alone or in combination
  • a method for producing a carrier for delivering a substance to an extracellular matrix-producing cell in the skin comprising a step of blending a retinoid and / or a retinoid conjugate as a substance delivery promoting component to the extracellular matrix-producing cell in the skin.
  • Skin fibrosis comprising a step of blending a retinoid as a substance delivery promoting component to an extracellular matrix-producing cell in the skin, and a drug that controls the activity or proliferation of the extracellular matrix-producing cell in the skin as an active ingredient.
  • the carrier of the present disclosure can efficiently deliver an active ingredient to a site of action (for example, extracellular matrix-producing cells in the skin). The onset can be prevented, and the contribution to human medicine and veterinary medicine is extremely large.
  • a site of action for example, extracellular matrix-producing cells in the skin.
  • the carrier of the present disclosure can be combined with an arbitrary drug (for example, an existing dermatofibrosis therapeutic drug) to increase its action efficiency, it has a wide range of pharmaceutical applications and can produce an effective treatment agent. There is also an advantage that it can be performed easily.
  • FIG. 1 is a graph showing HSP47 expression inhibition by HSP47 siRNA-containing retinoid-binding liposomes in skin myofibroblasts.
  • FIG. 2 is a diagram showing a regimen for administration to bleomycin (BLM) skin fibrosis induction model mice.
  • FIG. 3 is a photograph of a skin section collected from a skin fibrosis model mouse stained with MT.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of collagen dot density measurement (B) that enables image evaluation of dermal thickening (A) and collagen deposition collected from a dermatofibrosis model mouse.
  • FIG. 1 is a graph showing HSP47 expression inhibition by HSP47 siRNA-containing retinoid-binding liposomes in skin myofibroblasts.
  • FIG. 2 is a diagram showing a regimen for administration to bleomycin (BLM) skin fibrosis induction model mice.
  • FIG. 3 is a photograph of a skin section collected from a skin fibros
  • FIG. 5 is a graph showing the expression levels (A and B) of each of Col1a1 and HSP47 by qPCR method and the results (C) of the hydroxyproline assay.
  • FIG. 6 is a view showing a regimen for producing a model mouse for dermal fibrosis by cGVHD.
  • FIG. 7 is a graph showing a tissue image obtained by MT staining of a skin section collected from a cGVHD model mouse, a graph (A) showing the thickening of the dermis, and a result (B) of collagen dot density measurement.
  • FIG. 8 is a photograph showing the results of immunofluorescence staining of skin sections collected from cGVHD model mice.
  • FIG. 9 is a diagram showing a regimen for administration to cGVHD model mice.
  • FIG. 10 is a graph showing the survival rate (A) and weight transition (B) of the treatment group and the control group with HSP47 siRNA-containing retinoid-binding liposomes. Since diarrhea and death due to cGVHD were observed in the same level in both groups, there was no difference in the survival rate and weight transition. There was no increase in adverse events in the treatment group.
  • FIG. 10 is a graph showing the survival rate (A) and weight transition (B) of the treatment group and the control group with HSP47 siRNA-containing retinoid-binding liposomes. Since diarrhea and death due to cGVHD were observed in the same level in both groups, there was no difference in the survival rate and weight transition. There was no increase in adverse events in the treatment group.
  • FIG. 11 shows a tissue image (A) obtained by MT staining of skin sections collected from a treatment group and a control group of cGVHD model mice treated with HSP47 siRNA-containing retinoid-binding liposomes, a graph showing the thickening of the dermis (B), and collagen dot density measurement. It is the figure which showed the result (C).
  • FIG. 12 is a graph showing the results of the expression level of Hsp47 mRNA by the qPCR method.
  • FIG. 13 is a graph showing the results of a collagen assay.
  • FIG. 14 is a photograph showing the localization of HSP47 and ⁇ -SMA positive cells in the skin tissue of cGVHD model mice (Allo) and control mice (Syn). The scale bar represents 50 ⁇ m.
  • FIG. 15 is a graph showing the collagen amount reduction effect (A) and dermal thickening reduction effect (B) by HSP47 siRNA-containing retinoid-binding liposomes in cGVHD model mice.
  • FIG. 16 is a photograph showing suppression of HSP47 expression by HSP47 siRNA-containing retinoid-binding liposomes in cGVHD model mice. The lower part is an enlarged image of the upper part.
  • FIG. 14 is a photograph showing the localization of HSP47 and ⁇ -SMA positive cells in the skin tissue of cGVHD model mice (Allo) and control mice (Syn). The scale bar represents 50 ⁇ m.
  • FIG. 15 is a graph showing the
  • FIG. 17 shows HSP47 siRNA-containing retinoid-binding liposomes for the CD4 and CD8 positive cell count (A) contained in the thymus of cGVHD model mice, the CD4 positive cell count (B) or the CD8 positive cell count (C) contained in the spleen. It is the graph which showed the influence of administration. N.S indicates that no significant difference was observed (Mann-Whitney U test, P> 0.5).
  • FIG. 18 is a graph showing the effect of administration of HSP47 siRNA-containing retinoid-binding liposomes on the proportion of donor T cells (left) and CD11b positive donor bone marrow cells (right).
  • FIG. 19 is a photograph showing the delivery of label by retinoid-binding liposomes in normal skin tissue (left) or fibrotic lesion (right) of a bleomycin-induced skin fibrosis model mouse.
  • the lower stage is an enlarged image of the upper stage image.
  • the scale bar represents 50 ⁇ m.
  • FIG. 20 is a graph showing the effect of administration of HSP47 siRNA-containing retinoid-binding liposomes on the dermal thickening of normal skin tissue or fibrotic lesions in bleomycin-induced skin fibrosis model mice.
  • FIG. 21 is a graph showing the dermal thickening reduction effect (left) and collagen content reduction effect (right) of HSP47 siRNA-containing retinoid-binding liposomes against cGVHD established skin fibrosis.
  • One aspect of the present disclosure includes an extracellular matrix in skin comprising a retinoid as a component that facilitates substance delivery to extracellular matrix-producing cells in the skin (sometimes referred to herein as “target cells”).
  • the present invention relates to a carrier for delivering a substance to a production cell.
  • the carrier of the present disclosure comprises an effective amount of a retinoid to facilitate substance delivery to extracellular matrix-producing cells in the skin.
  • One embodiment of the carrier of the present disclosure also relates to a carrier that promotes substance delivery to extracellular matrix-producing cells in the skin by a retinoid.
  • an extracellular matrix-producing cell in the skin is a cell having an extracellular matrix-producing ability existing in the skin, for example, fibroblasts, pericytes, fibrosites and myofibroblasts existing in the skin.
  • Extracellular matrix-producing cells present in the skin can include those derived from fibrosites in the circulating blood as well as those derived from cells present in the skin.
  • Extracellular matrix-producing cells in the skin are converted from endothelial cells (eg, vascular endothelial cells) by endothelial mesenchymal transition (EndoMT), or epithelial cells (eg, keratinocytes) by epithelial-mesenchymal transition (EMT). It may be an extracellular matrix-producing cell (eg, fibroblast or myofibroblast) converted from.
  • Extracellular matrix-producing cells in the skin may be present in one or more sites selected from the group consisting of epidermis, dermis and subcutaneous tissue. In one embodiment, extracellular matrix-producing cells in the skin are present in the dermis and / or subcutaneous tissue. In one embodiment, extracellular matrix-producing cells in the skin are present in skin fibrosis. The fibrotic lesion of the skin can occur at one or more sites selected from the group consisting of epidermis, dermis and subcutaneous tissue. In certain embodiments, extracellular matrix-producing cells in the skin are present in fibrotic lesions of the dermis and / or subcutaneous tissue.
  • extracellular matrix-producing cells in the skin express CRABP (cellular retinoic acid binding protein).
  • CRABP includes CRABP1 and CRABP2. Therefore, the extracellular matrix-producing cell in the above embodiment expresses CRABP1 and / or CRABP2.
  • extracellular matrix-producing cells in the skin express ⁇ -SMA (alpha-smooth muscle actin).
  • the extracellular matrix producing cells in the skin express vimentin.
  • extracellular matrix-producing cells in the skin express HSP47 (heat shock protein 47). In certain embodiments, the extracellular matrix producing cells in the skin express CRABP and HSP47.
  • markers such as CRABP, ⁇ -SMA, vimentin, and HSP47 in cells can be confirmed by, for example, detecting the expression of each marker in the cells. Since the gene sequences of CRABP1, CRABP2, ⁇ -SMA, vimentin and HSP47 are known and antibodies against them have been developed, their expression can be determined using known nucleic acid or protein detection techniques such as, but not limited to, antibodies.
  • Immunoprecipitation method EIA (enzyme-immunoassay) (for example, ELISA (emzyme-linked immunosorbent assay)), RIA (radio-immunoassay) (for example, IRMA (immunoradiometric assay), RAST (radioallergosorbent-test), RIST (radioimmunosorbent test) )), Western blotting, immunohistochemistry, immunocytochemistry, flow cytometry, CRABP1, CRABP2, ⁇ -SMA, vimentin, or a unique fragment thereof, or a transcript of the nucleic acid ( For example, mRNA) or Using nucleic acid that specifically hybridizes to the pricing products, various hybridization methods, Northern blot, can be detected by such as Southern blotting, various PCR methods.
  • EIA enzyme-immunoassay
  • ELISA emzyme-linked immunosorbent assay
  • RIA radio-immunoassay
  • retinoid refers to natural and synthetic retinoids, including first generation, second generation and third generation retinoids.
  • naturally occurring retinoids include, but are not limited to, 11-cis-retinal, all-trans retinol, retinyl palmitate, all-trans retinoic acid, 13-cis-retinoic acid, and the like.
  • the term “retinoid” encompasses retinoic acid, retinol, retinal, and derivatives and analogs thereof.
  • the retinoid has a skeleton with four isoprenoid units linked in a head-to-tail manner.
  • Non-limiting examples of retinoids include, for example, retinol (including all-trans-retinol), retinal, retinoic acid (including tretinoin), ester of retinol and fatty acid, ester of aliphatic alcohol and retinoic acid, etretinate, isotretinoin, Retinoid derivatives such as adapalene, acitretin, tazarotene, retinol palmitate, retinol, retinoic acid, retinal, etretinate, isotretinoin, acitretin and other saturated derivatives, and vitamin A analogs such as fenretinide (4-HPR) and bexarotene. it can.
  • retinol including all-trans-retinol
  • retinal includes retinoic acid (including tretinoin)
  • ester of retinol and fatty acid ester of aliphatic alcohol and retinoic acid
  • the retinoid includes retinoic acid and analogs thereof.
  • the retinoic acid analog is CRABP binding.
  • Non-limiting examples of CRABP-binding retinoic acid analogs include, for example, SRI 2965-38, Ro 13-7410, Ro31-3689, St 80, SRI 6409-40, TTNN, TTAB, Ch 80, Az 80, Am 580 Am 555, Am 80, 5,6-epoxy-retinoic acid, 4-OH-retinoic acid, 4-oxo-retinoic acid, retinoic acid glucuronide, 9-cis-retinoic acid and the like (Trown et al., Cancer Res.
  • the binding of a compound to CRABP can be determined by, for example, a competitive binding assay using radiolabeled retinoic acid.
  • the retinoid may exist as a retinoid conjugate in which a retinoid and another compound are bound.
  • the other compound may be the same kind of retinoid as the retinoid, a retinoid different from the retinoid, or a non-retinoid compound (for example, lipid).
  • the retinoid and the other compound may be directly bonded by a condensation reaction or the like, or may be bonded via a linker.
  • the retinoid conjugate has the structure I XYZ I
  • X is a retinoid or lipid
  • Z is a retinoid
  • Y is a linker
  • Retinoids or lipids included as X and Z in structure I are free retinoids to provide a point of attachment to the linker, even if it is part of the free retinoid or lipid, depending on the mode of binding to the linker Or what added the coupling group to the lipid may be used.
  • X and Z are portions obtained by removing the OH group from retinoic acid.
  • X and Z may each independently contain one or more retinoids.
  • X and Z may each independently contain, for example, 1, 2, 3, 4 or 5 retinoids.
  • each retinoid may be the same or different.
  • the lipid contained as X in the structure I is not limited, and examples thereof include a lipid containing one or more alkyl chains and a head group containing an amide.
  • the lipid included as X in Structure I is selected from the group consisting of DODC, HEDODC, DSPE, DOPE, and DC-6-14.
  • linker includes any linker capable of binding a retinoid.
  • the linker may be linear or branched.
  • the linker is a chemical bond. Chemical bonds include single bonds, double bonds and thirty bonds.
  • the linker comprises polyethylene glycol (PEG).
  • the average molecular weight of PEG is not particularly limited, and may be, for example, in the range of 200 to 5000, 500 to 3000, 550 to 2000, and the like.
  • PEG may contain one or more amide groups and / or amino groups.
  • PEG may contain one or more linking groups such as lysine residues.
  • PEG comprises one or more amide groups and one or more lysine residues.
  • the linker is selected from the group consisting of Glu, hexanoyl, Gly 3 or GluNH.
  • the PEG is bis-amide-PEG, tris-amide-PEG, tetra-amide-PEG, Lys-bis-amide-PEG-Lys, Lys-tris-amide-PEG-Lys, Lys-tetra. It may be -amide-PEG-Lys, Lys-PEG-Lys. In some embodiments, the PEG comprises 5-50, 6-40, 7-30, 8-25, 9-20, 10-15, etc. repeating units —CH 2 CH 2 O—. Have.
  • X and Z are each two retinoic acids and the linker is Lys-bis-amide-PEG-Lys.
  • q, r, and s are each independently 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10.
  • the compound when the retinoid or retinoid conjugate includes a stereoisomer, the compound includes each of the stereoisomers or any mixture of stereoisomers.
  • the retinoid or retinoid conjugate may also be substituted with one or more substituents.
  • the retinoid or retinoid conjugate includes not only the isolated state but also the retinoid or retinoid conjugate in a state dissolved or mixed in a medium capable of dissolving or retaining the retinoid or retinoid conjugate.
  • the carrier of the present disclosure may be constituted by these retinoids and / or retinoid conjugates themselves, or may be constituted by binding or inclusion of retinoids and / or retinoid conjugates in another carrier component. May be. Therefore, the carrier of the present disclosure may contain a carrier component other than the retinoid or the retinoid conjugate. Such components are not particularly limited, and any of those known in the field of medicine and pharmacy can be used, and can include or bind to retinoids and / or retinoid conjugates. Is preferred.
  • the carrier constituents other than retinoids and retinoid conjugates include lipids.
  • lipids include phospholipids such as glycerophospholipids, sphingolipids such as sphingomyelin, sterols such as cholesterol, vegetable oils such as soybean oil and poppy oil, and lecithins such as mineral oil and egg yolk lecithin.
  • lipids include dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC), dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), distearoyl phosphatidylcholine (DSPC), dioleyl phosphatidylethanolamine (DOPE), dilauroyl phosphatidylcholine (DLPC), cholesterol and the like.
  • DMPC dimyristoyl phosphatidylcholine
  • DPPC dipalmitoyl phosphatidylcholine
  • DSPC distearoyl phosphatidylcholine
  • DOPE dioleyl phosphatidylethanolamine
  • DLPC dilauroyl phosphatidylcholine
  • the lipid may be a cationic lipid or a non-cationic lipid such as an anionic lipid or a neutral lipid.
  • the carrier includes a cationic lipid. Cationic lipids are particularly useful for introducing nucleic acid molecules having negative charges into cells.
  • the carrier comprises an ionizable cationic lipid. Ionizable cationic lipids are nonionic at a pH above PKa but have the property of becoming cationic at a pH lower than PKa. In some embodiments, the ionizable cationic lipid has a tertiary amine.
  • the PKa of the ionizable cationic lipid may be 7.0 or higher, 7.5 or higher, 7.6 or higher, 7.8 or higher, 8.0 or higher, and the like.
  • cationic lipids that are always positively charged are sometimes referred to as always charged cationic lipids.
  • lipids include normally charged cationic lipids and PEG-conjugated lipids (PEG-lipids) described in WO 2012/170952, ionizable cationic lipids described in WO 2013/185116, etc. .
  • Non-limiting examples of the constantly charged cationic lipid include, for example, the following.
  • Non-limiting examples of the PEG-lipid include, for example, 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-PEG (PEG-DMPE), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3 -Phosphoethanolamine-N-PEG (PEG-DPPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-PEG (PEG-DSPE), 1,2-dioleoyl-sn-glycero- Examples include 3-phosphoethanolamine-N-PEG (PEG-DOPE) and PEG ceramide.
  • PEG-DMPE 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-PEG
  • PEG-DPPE 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3 -Phosphoethanolamine-N-PEG
  • PEG-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-
  • the molecular weight of PEG is not particularly limited, and for example, about 200 to about 5000, about 500 to about 3000, about 550 to about 2000, more specifically about 550, about 750, about 1000, about 1250, about 2000, etc. It may be.
  • Non-limiting examples of PEG include, for example, PEG550, PEG750, PEG1000, PEG1250, PEG2000, and the like.
  • the ionizable cationic lipid has the formula II: Wherein n and m are independently 1, 2, 3 or 4, R 1 and R 2 are independently C 10 -C 18 alkyl or C 12 -C 18 alkenyl, Is —CH 2 —, S, O, N or absent, and L is C 1-4 alkylene, —S—C 1-4 alkylene, —O—C 1-4 alkylene, —O—C (O ) —C 1-4 alkylene, —S (O) 2 —C 1-4 alkylene, or Or Together with Is, Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Non-limiting examples of the ionizable cationic lipid include, for example, the following.
  • the method for producing the lipid is described in WO 2012/170952 and WO 2013/185116, and those skilled in the art can produce the lipid based on the descriptions in these documents.
  • the carrier may contain one kind or two or more kinds of lipids.
  • the carrier comprises a normally charged cationic lipid and an ionizable cationic lipid. By blending the ionizable cationic lipid, it is possible to reduce the adverse effects of the constantly charged cationic lipid.
  • the carrier includes lipids selected from the group consisting of helper lipids, PEG-lipids and sterols, in addition to normally charged cationic lipids, ionizable cationic lipids.
  • Non-limiting examples of lipid combinations included in the carrier include, for example, lipid P2 and lipid I8 combinations, lipid P2, lipid I8, DOPE, cholesterol and PEG-DMPE combinations, DODC, DOPE, cholesterol and PEG-lipid. Combinations, lipid P9, DOPE, cholesterol and PEG-lipid combinations, DC-6-14, DOPE and cholesterol combinations, and the like.
  • lipid combinations included in the carrier include, for example, lipid P2: lipid I8 (1: 1 molar ratio), lipid P2: lipid I8: DOPE: cholesterol: PEG-DMPE (4: 4: 6: 5: 1 molar ratio), DODC: DOPE: cholesterol: PEG-lipid (25: 5: 19: 1 molar ratio), lipid P9: DOPE: cholesterol: PEG-lipid (25: 5: 19: 1) And a molar ratio of DC-6-14: DOPE: cholesterol (4: 3: 3 molar ratio).
  • the carrier component other than the retinoid or retinoid conjugate comprises a polymer.
  • polymers include polyethylene glycol (PEG), polyethyleneimine (PEI) and polylysine (eg, poly-L-lysine (PLL)) and other cationic polymers (polycation), polylactic acid (PLA), Those based on non-cationic polymers such as polyglycolic acid (PGA), lactic acid-glycolic acid copolymer (PLGA) and / or their derivatives.
  • the carrier in the present disclosure may have a specific three-dimensional structure.
  • a structure include, but are not limited to, a linear or branched linear structure, a film-like structure, and a spherical structure.
  • the carrier may have any three-dimensional form such as, but not limited to, dendrimers, dendrons, micelles, liposomes, emulsions, microspheres, nanospheres.
  • Non-limiting examples of such carriers are known from Marcucci and ef Lefoulon, Drug Discov Today. 2004 Mar 1; 9 (5): 219-28, Torchilin, Eur J Pharm Sci. 2000 Oct; 11 Suppl 2: S81-91, etc. ing.
  • the carrier of the present disclosure may be cationic or non-cationic (for example, anionic, nonionic, electrically neutral).
  • the carrier is cationic.
  • the carrier is electrically neutral under physiological conditions (eg, a zeta potential ranging from ⁇ 10 mV to +10 mV), but becomes cationic under acidic conditions, such as within endosomes.
  • the carrier of the present disclosure may have binding properties for albumin and / or low density lipoprotein (LDL).
  • LDL low density lipoprotein
  • the carrier may be capable of forming a lipoplex or polyplex with the substance to be carried.
  • the lipoplex is, for example, between a cationic lipid and a substance having a negative charge (for example, a nucleic acid such as DNA or RNA), and the polyplex is, for example, between a polycation and a substance having a negative charge, respectively. Can be formed.
  • the carrier may be a lipid structure.
  • the lipid structure means a structure having an arbitrary three-dimensional structure, for example, a linear shape, a film shape, a spherical shape, and the like, including lipid as a constituent component, and is not limited to liposomes, micelles, lipid microparticles. Includes spheres, lipid nanoglobules, lipid emulsions and the like.
  • Lipid structures for example, salts, sugars such as sucrose, glucose, maltose, polyhydric alcohols such as glycerin, propylene glycol, etc., preferably osmotic pressure is adjusted using an osmotic pressure regulator such as sucrose or glucose By doing so, it can be stabilized.
  • the concentration of the osmotic pressure adjusting agent is preferably adjusted to be isotonic with blood.
  • the concentration in the medium is not limited and may be 3 to 15% by weight, preferably 5 to 12% by weight, more preferably 8 to 10% by weight, particularly 9% by weight.
  • the concentration in the medium is not limited and may be 1 to 10% by weight, preferably 3 to 8% by weight, more preferably 4 to 6% by weight, especially 5% by weight.
  • Binding or inclusion of a retinoid and / or retinoid conjugate to a carrier of the present disclosure binds or includes the retinoid and / or retinoid conjugate to other components of the carrier by chemical and / or physical methods. This is possible.
  • the retinoid and / or retinoid conjugate can be bound or included in the carrier of the present disclosure by mixing the retinoid and / or retinoid conjugate and other carrier components at the time of producing the carrier. It becomes.
  • the amount of retinoid and / or retinoid conjugate in the carrier of the present disclosure can be, for example, 0.01 to 1000 nmol / ⁇ l, preferably 0.1 to 100 nmol / ⁇ l.
  • the carrier of the present disclosure including a retinoid and / or a retinoid conjugate and a carrier component other than the retinoid and the retinoid conjugate, the retinoid and / or the retinoid conjugate, and a carrier component other than the retinoid and the retinoid conjugate;
  • the molar ratio is not limited, and may be, for example, 8: 1 to 1: 4, or 4: 1 to 1: 2.
  • the binding or inclusion of the retinoid and / or retinoid conjugate to the carrier may be performed before the delivery product is loaded on the carrier, or the carrier, the retinoid and / or retinoid conjugate, and the delivery product are mixed simultaneously.
  • the present disclosure also provides retinoids and / or retinoid conjugates to any existing drug binding carrier or drug encapsulating carrier, eg, liposomal formulations such as DaunoXome®, Doxil, Caelyx®, Myocet®. It also relates to a method for producing a preparation specific for extracellular matrix-producing cells in the skin, comprising a step of binding.
  • Binding or inclusion of a retinoid and / or retinoid conjugate with a carrier of the present disclosure also binds or includes the retinoid and / or retinoid conjugate with other components of the carrier by chemical and / or physical methods. Can also be realized.
  • the binding or inclusion of retinoids and / or retinoid conjugates with a carrier of the present disclosure may also include retinoids having a forming affinity and / or basic components of the retinoid conjugate and carrier during carrier preparation. You may carry out by mixing in a support
  • the amount of retinoid and / or retinoid conjugate bound or included in the carrier of the present disclosure is 0.01% to 100%, preferably 0.2% to 20%, more preferably as a weight ratio to the carrier component. It may be 1% to 5%.
  • Carriers of the present disclosure may include, for example, aqueous and non-aqueous gels, creams, multiple emulsions, microemulsions, liposomes, ointments, aqueous and non-aqueous solutions, lotions, aerosols, hydrocarbon bases and powders, and solubilized. Excipients such as agents, penetration enhancers (eg, fatty acids, fatty acid esters, fatty alcohols and amino acids), and hydrophilic polymers (eg, polycarbophil and polyvinylpyrrolidone) can be included.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is a liposome or a transdermal absorption enhancer.
  • liposomes examples include the following: CellFectin, ie, the cationic lipid N, N I , N II , N III -tetramethyl-N, N I , N II , N III -tetrapalmityl-spermine and dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) 1: 1.5 (M / M) liposome formulation (GIBCO BRL), Cytofectin GSV, a 2: 1 (M / M) liposomal formulation of cationic lipid and DOPE (Glen Research), DOTAP (N- [1- (2,3-dioleoyloxy) -N, N, N-trimethyl-ammonium methyl sulfate) (Boehringer Manheim), Lipofectamine, a 3: 1 (M / M) liposome formulation (GIBCO BRL) of polycationic lipid DOSPA, neutral lipid DOPE and dialkylated amino acid (DiLA2), Lipo
  • the present disclosure also relates to a method for producing a carrier for substance delivery to extracellular matrix-producing cells in the skin, comprising a step of blending a retinoid as a substance delivery promoting component to extracellular matrix-producing cells in the skin.
  • a method for blending retinoids for example, various methods described in this specification can be used.
  • retinoid formulations can include retinoids and / or retinoid conjugates bound to or included in other components of the carrier by chemical and / or physical methods, or when the carrier is made.
  • the retinoid conjugate can be mixed with other carrier constituents.
  • the amount of retinoid and / or retinoid conjugate compounded is as already described for the carrier of the present disclosure.
  • the delivery material of the carrier of the present disclosure is not particularly limited, but preferably has a size that can be physically moved from the administration site to the lesion site where the target cell exists in the living body. Therefore, the carrier of the present disclosure carries not only substances such as atoms, molecules, compounds, proteins, and nucleic acids, but also objects such as vectors, virus particles, cells, drug release systems composed of one or more elements, and micromachines. be able to.
  • the delivery product preferably has a property of affecting the target cell in some way, for example, a label for the target cell or a product that controls (for example, enhances or suppresses) the activity or proliferation of the target cell. Including.
  • the delivery product of the carrier includes a “drug that controls the activity or proliferation of extracellular matrix-producing cells in the skin”.
  • the activity of extracellular matrix-producing cells in the skin refers to various activities such as secretion, uptake and migration exhibited by the extracellular matrix-producing cells in the skin.
  • it typically, In particular, it means activity involved in the onset, progression and / or recurrence of dermal fibrosis.
  • Examples of such activities include, but are not limited to, production / secretion of extracellular matrix components such as collagen, proteoglycan, tenascin, fibronectin, thrombospondin, osteopontin, osteonectin, and elastin, and these extracellular matrix components. For example, suppression of the decomposition activity of.
  • a drug that controls the activity or proliferation of extracellular matrix-producing cells in the skin refers to the physical, chemical and / or physiological properties of the cells involved in the onset, progression and / or recurrence of dermal fibrosis.
  • Any drug that directly or indirectly suppresses a general action may be used, and is not limited to, but is not limited to, a substance that inhibits production / secretion of the extracellular matrix component, a cell growth inhibitor, an apoptosis inducer, TIMP (Tissue inhibitor of metalloproteinase) inhibitors are included.
  • Substances that inhibit the production and secretion of extracellular matrix components and the like are not limited, but include, for example, expression of extracellular matrix components such as collagen, proteoglycan, tenascin, fibronectin, thrombospondin, osteopontin, osteonectin, and elastin.
  • extracellular matrix components such as collagen, proteoglycan, tenascin, fibronectin, thrombospondin, osteopontin, osteonectin, and elastin.
  • examples include substances that suppress, such as interfering nucleic acids, ribozymes, and antisense nucleic acids, or substances that have a dominant negative effect such as dominant negative mutants, vectors that express these, and cells transformed with these.
  • the drugs that inhibit the production and secretion of collagen are not limited. For example, collagen essential for intracellular transport and molecular maturation common to various types of collagen synthesis processes.
  • HSP47 expression inhibitors such as interfering nucleic acids, ribozymes, antisense nucleic acids, etc. to HSP47, or substances having a dominant negative effect such as dominant negative mutants of HSP47 Examples include vectors, cells transformed with these, and the like.
  • the cell growth inhibitor examples include, but are not limited to, alkylating agents such as ifosfamide, nimustine (for example, nimustine hydrochloride), cyclophosphamide, dacarbazine, melphalan, and ranimustine, gemcitabine (for example, gemcitabine hydrochloride), and inositabine Cytarabine ocphosphate, cytarabine preparation, tegafur uracil, tegafur gimeracil oteracil potassium combination drug (for example, TS-1), doxyfluridine, hydroxycarbamide, fluorouracil, methotrexate, mercaptopurine and other antimetabolites, idarubicin (for example, Idarubicin hydrochloride), epirubicin (eg epirubicin hydrochloride), daunorubicin (eg daunorubicin hydrochloride, daunorubicin citrate), doxorubic
  • Examples of apoptosis inducers include, but are not limited to, compound 861, gliotoxin, atorvastatin, and the like.
  • Examples of inhibitors of TIMP include, but are not limited to, TIMP activity inhibitors such as antibodies against TIMP, TIMP production inhibitors such as interfering nucleic acids, ribozymes, and antisense nucleic acids against TIMP. , Vectors expressing these, and cells transformed with these.
  • the “drug that regulates the activity or proliferation of extracellular matrix-producing cells in the skin” in the present disclosure refers to extracellular matrix production in the skin that is directly or indirectly related to the suppression of the onset, progression, and / or recurrence of dermal fibrosis. Any drug that directly or indirectly promotes the physical, chemical and / or physiological actions of cells may be used.
  • the carrier of the present disclosure can deliver one or more of the above drugs.
  • Interfering nucleic acids in the present disclosure include double-stranded RNAs such as siRNA (small interfering RNA), miRNA (micro RNA), shRNA (short hairpin RNA), piRNA (Piwi-interacting RNA), rasiRNA (repeat associated siRNA) and the like. Including variants.
  • the nucleic acid in the present disclosure includes RNA, DNA, PNA, or a composite thereof.
  • the nucleic acid may have various known modifications. Modifications can provide beneficial properties such as improved nucleic acid stability.
  • the modifications may be at various parts of the nucleic acid, such as one or more parts such as sugars, nucleobases, phosphate groups and phosphodiester backbones.
  • modified sugar moieties include 2'-O-methyl, 2'-methoxyethoxy, 2'-deoxy, 2'-fluoro, 2'-allyl, 2'-O- [2- (methylamino) -2-oxoethyl], 4′thio, 4 ′-(CH 2 ) 2 —O-2 ′ bridge, 2 ′ locked nucleic acid, 2′-O— (N-methylcarbamate) and the like.
  • Non-limiting examples of modified nucleobases include xanthine, hypoxanthine, 2-aminoadenine, 6-methyl and other alkyl derivatives of adenine and guanine, 2-propyl and other alkyl derivatives of adenine and guanine, 5-halouracil and 5-halocytosine, 5-propynyluracil and 5-propynylcytosine, 6-azouracil, 6-azocytosine and 6-azothymine, 5-uracil (pseudouracil), 4-thiouracil, 8-halo, amino, thiol, thioalkyl, hydroxy and Other 8-substituted adenines and guanines, 5-trifluoromethyl and other 5-substituted uracils and cytosines, 7-methylguanine and acyclonucleotides and the like.
  • Non-limiting examples of modifications to the phosphodiester backbone include phosphodiester linkages, phosphorothioate, 3 '-(or -5') deoxy-3 '-(or -5') thio-phosphorothioate, phosphorodithioate, phospho Loselenate, 3'- (or -5 ') deoxyphosphinate, boranophosphate, 3'- (or -5') deoxy-3'- (or 5'-) aminophosphoramidate, hydrogen phosphonate, Examples include substitution with boranophosphates, phosphoramidates, alkyl or aryl phosphonates and phosphotriesters or phosphorus bonds.
  • the delivery of the carrier of the present disclosure is also not limited to drugs other than those described above that suppress the onset, progression and / or recurrence of dermal fibrosis, such as, but not limited to, TGF- ⁇ 1 inhibitor (anti-TGF - ⁇ 1 antibody, including TGF- ⁇ 1 vaccine), pentoxifylline and its metabolites, calcium channel blockers (such as nifedipine), prostanoid receptor agonists (such as iloprost), ACE inhibitors (such as captopril, enalapril), Endothelin receptor inhibitors (such as bosentan), PDE-5 inhibitors (such as sildenafil), interferon ⁇ , CD20 inhibitors (such as anti-CD20 antibodies such as rituximab), anti-TNF ⁇ antibodies (such as infliximab), mTOR inhibitors (sirolimus) , Everolimus, etc.), thalidomide, Examples thereof include hydroxychloroquine, tacrolimus
  • composition of the present disclosure includes administration of the composition of the present disclosure and the drug substantially simultaneously, and administration at time intervals within the same treatment period.
  • the composition of the present disclosure may be mixed with the above drug or may be continuously administered without mixing.
  • the composition of the present disclosure may be administered before or after the drug.
  • the drug that controls the activity or proliferation of extracellular matrix-producing cells in the skin includes an inhibitor of HSP47, such as an interfering nucleic acid against HSP47.
  • interfering nucleic acids for HSP47 are described in WO 2011/072082.
  • the interfering nucleic acid for HSP47 has the structure (A1): 5 ′ (N) xZ 3 ′ (antisense strand) 3 'Z'-(N ') yz "5' (sense strand) Where each N and N ′ are unmodified, optionally modified nucleotides, or atypical moieties;
  • Each (N) x and (N ′) y is an oligonucleotide wherein each successive N or N ′ is covalently linked to the next N or N ′;
  • Each Z and Z ′ is independently present or absent, but if present is independently 1 to 5 covalently attached to the 3 ′ end of the chain in which it is present.
  • a continuous nucleotide or non-nucleotide portion of or a combination thereof, z ′′ may be present or absent, but if present is a capping moiety covalently attached to the 5 ′ end of (N ′) y; each of x and y is independently an integer between 18 and 40;
  • the sequence of (N ′) y has complementarity to the sequence of (N) x, and (N) x contains an antisense sequence for mRNA encoding HSP47. Is a double-stranded nucleic acid.
  • the interfering nucleic acid for HSP47 has the structure (A2): 5 ′ N 1- (N) xZ 3 ′ (antisense strand) 3 ′ Z′—N 2 — (N ′) yz ′ 5 ′ (sense strand) Where each of N 2 , N and N ′ is an unmodified ribonucleotide or a modified ribonucleotide or an atypical moiety; Each of (N) x and (N ′) y is an oligonucleotide wherein each successive N or N ′ is covalently linked to an adjacent N or N ′; each of x and y is independently an integer between 17 and 39; The sequence of (N ′) y has complementarity to the sequence of (N) x, (N) x has complementarity to the contiguous sequence of mRNA encoding HSP47, N 1 is covalently linked to (N) x and is mismatched to the m
  • the atypical part in the above structures (A1) and (A2) is not limited, and includes, for example, a non-nucleotide part (eg, abasic part, inverted abasic part (inverted abasic deoxyribose moiety, Base ribose moieties), hydrocarbon (alkyl) moieties (such as non-nucleotide C3, C4 or C5 moieties), derivatives thereof, deoxyribonucleotides, modified deoxyribonucleotides, mirror nucleotides (L-DNA, L-RNA, etc.), From the group consisting of non-base-paired nucleotide analogs, nucleotides linked to adjacent nucleotides by 2'5 'internucleotide phosphate bonds, cross-linked nucleic acids (LNA, ethylene cross-linked nucleic acids, etc.), bond-modified nucleotides (PACE, etc.) and base-modified nucleot
  • the capping moiety in structures (A1) and (A2) above includes a moiety that can be covalently linked to the 5 ′ end of (N ′) y and is not limited to, for example, an abasic ribose moiety, abasic deoxy Modified forms of ribose moieties, abasic ribose and abasic deoxyribose moieties (including 2′O alkyl modifications), inverted abasic ribose and abasic deoxyribose moieties and modified forms thereof, C6-imino-Pi, C6- Amino-Pi, mirror nucleotides (L-DNA, L-RNA, etc.), 5′OMe nucleotides, and nucleotide analogs such as 4 ′, 5′-methylene nucleotides, 1- ( ⁇ -D-erythrofuranosyl) nucleotides 4 ′ thionucleotide, carbocyclic nu
  • the non-nucleotide moiety in the above structures (A1) and (A2) is not limited, for example, an abasic moiety such as deoxyribobasic moiety (sometimes referred to herein as “dAb”) or riboabasic A moiety (sometimes referred to herein as “rAb”), two covalently (preferably via a phosphate-based linkage) abasic moieties (eg, dAb-dAb or rAb-rAb) Or dAb-rAb or rAb-dAb), an alkyl moiety (optionally a propane [(CH 2 ) 3 ] moiety (C3), or derivatives thereof including propanol (C3OH) and propanediol (“C3Pi”)).
  • an abasic moiety such as deoxyribobasic moiety (sometimes referred to herein as “dAb”) or riboabasic A moiety (sometimes referred to herein as “rAb”)
  • abasic moieties
  • the phosphate-based linkage comprises a phosphorothioate, phosphonoacetate or phosphodiester linkage.
  • the non-nucleotide moiety is a C2, C3, C4, C5 or C6 alkyl moiety, optionally a C3 [propane, — (CH 2 ) 3 —] moiety, or propanol (C3OH), propanediol, And derivatives thereof including phosphodiester derivatives of propanediol ("C3Pi").
  • the alkyl moiety comprises an alkyl derivative comprising a C3 alkyl, C4 alkyl, C5 alkyl or C6 alkyl moiety, including a terminal hydroxyl group, a terminal amino group, or a terminal phosphate group.
  • the alkyl moiety is a C3 alkyl or C3 alkyl derivative moiety.
  • the C3 alkyl moiety comprises propanol, propyl phosphate, propyl phosphorothioate or combinations thereof.
  • the non-nucleotide moiety comprises propyl phosphate, propyl phosphorothioate, propyl phospho-propanol, propyl phospho-propyl phosphorothioate, propyl phospho-propyl phosphate, (propyl phosphate) 3, (propyl phosphate) 2-propanol, (propyl Phosphate) selected from 2-propyl phosphorothioate.
  • the mRNA encoding HSP47 in structures (A1) and (A2) above has the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Non-limiting examples of combinations of antisense strands and sense strands in structure (A1) are shown in Table 5.
  • Non-limiting examples of combinations of antisense strands and sense strands in structure (A2) are shown in Table 6.
  • Combination 1 Sense strand is covalently attached to 3 'ends, 5 consecutive 2'5' ribonucleotides at positions 15, 16, 17, 18 and 19 (5 '>3')
  • An antisense abasic moiety covalently attached to the 5 'end and the antisense strand is in positions 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 and 19 (5'> 3 It includes a 2'OMe sugar modified ribonucleotide in '), a 2'5' ribonucleotide in position 7, and a C3Pi-C3OH moiety covalently attached to the 3 'end.
  • Combination 2 2'OMe sugar modified ribonucleotides at positions 2, 14, and 18 (5 '>3'), C3OH moiety covalently attached to the 3 'end and covalently attached to the 5' end 2'OMe sugar modified ribonucleotide at position 1, 3, 5, 9, 12, 13, and 17 (5 '>3'), containing an inverted abasic deoxyribonucleotide moiety attached It contains a 2'5 'ribonucleotide and a C3Pi-C3OH moiety covalently attached to the 3' end.
  • sense strand is shared 2′5 ′ ribonucleotide at positions 15, 16, 17, 18 and 19 (5 ′> 3 ′), a C3OH moiety covalently attached to the 3 ′ end and the 5 ′ end 2'OMe sugars at positions 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, and 19 (5 '>3'), including an indirect abasic deoxyribonucleotide moiety attached in a bond It includes a modified ribonucleotide, a 2′5 ′ ribonucleotide at position 7 and a C3Pi-C3OH moiety covalently attached to the 3 ′ end.
  • Combination 4 sense strand covalently attached to 2'OMe sugar modified ribonucleotide at positions 4, 11, 13 and 17 (5 '>3'),2'5'ribonucleotide at position 9 and 3' end A C3OH moiety and an inverted abasic deoxyribonucleotide moiety covalently attached to the 5 ′ end, wherein the antisense strand is 2′OMe at positions 1, 4, 8, 11 and 15 (5 ′> 3 ′) Contains a sugar-modified ribonucleotide, a 2'5 'ribonucleotide at position 6 and a C3Pi-C3OH moiety covalently attached to the 3' end.
  • Combination 5 Sense strand covalently attached to the 2′OMe sugar modified ribonucleotide at positions 7, 13, 16 and 18 (5 ′> 3 ′), 2′5 ′ ribonucleotide at position 9 and 3 ′ end
  • Combination 6 5 consecutive 2′5 ′ ribonucleotides at positions 15, 16, 17, 18 and 19 (5 ′> 3 ′), a C3Pi moiety covalently attached to the 3 ′ end and Contains an inverted abasic moiety covalently attached to the 5 ′ end, and the antisense strand is 2 at positions 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 and 19 (5 ′> 3 ′) It contains an 'OMe sugar modified ribonucleotide, a 2'5' ribonucleotide at position 7, and a C3Pi-C3OH moiety covalently attached to the 3 'end.
  • Combination 7 A sense strand is covalently attached to a 2'OMe sugar modified ribonucleotide at positions 2, 14 and 18 (5 '>3'), a C3OH moiety covalently attached to the 3 'end and the 5' end 2'OMe sugar modified ribonucleotide at position 1, 3, 5, 9, 11, 13 and 17 (5 '>3'), containing an inverted abasic deoxyribonucleotide moiety attached It contains a 2'5 'ribonucleotide and a C3Pi-C3OH moiety covalently attached to the 3' end.
  • Combination 8 2'OMe sugar modified ribonucleotides at positions 4, 11, 13 and 17 (5 '>3'), C3OH moiety covalently attached to the 3 'end and covalent bond to the 5' end 2'OMe sugar modified ribonucleotides at positions 1, 4, 8, 13 and 15 (5 '>3'), 2 'at position 6 It includes a 5 'ribonucleotide and a C3Pi-C3OH moiety covalently attached to the 3' end.
  • Combination 9 2'OMe sugar modified ribonucleotides at positions 2, 4, 11, 13, and 17 (5 '>3'), C3OH moiety covalently attached to the 3 'end and 5' end 2'OMe sugar modified ribonucleotide at position 1, 4, 8, 11 and 15 (5 '>3'), comprising a covalently attached inverted abasic deoxyribonucleotide moiety, at position 6, It contains a 2'5 'ribonucleotide and a C3Pi-C3OH moiety covalently attached to the 3' end.
  • each of the above parts has the following structure:
  • the phosphate group at the left end represents a phosphate group bonded to the 3 ′ end of the nucleic acid.
  • the “3 ′ end” of the nucleic acid means an end opposite to the 5 ′ end.
  • the chemical moiety is actually Is bound to the 2 ′ end of the nucleic acid, but in the present disclosure, even in such a case, it is expressed as bound to the 3 ′ end for convenience.
  • the interfering nucleic acid for HSP47 has the following structure: Structure 1: In the above structure, the antisense strand (SEQ ID NO: 17) is a 2′OMe sugar modified ribonucleotide at positions 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17, and 19 (5 ′> 3 ′), 2 at position 7.
  • Z is a C3Pi-C3OH moiety
  • the sense strand (SEQ ID NO: 16) is a 2'5 'ribonucleotide at positions 15, 16, 17, 18 and 19 (5'> 3 ')
  • Z ′ is a C3Pi moiety and z ′′ is an inverted abasic deoxyribonucleotide moiety.
  • the antisense strand (SEQ ID NO: 25) is a 2′OMe sugar-modified ribonucleotide at positions 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, and 19 (5 ′> 3 ′), position 7.
  • Z is C3Pi-C3OH
  • the sense strand (SEQ ID NO: 24) is 2'5 'ribo at positions 15, 16, 17, 18 and 19 (5'> 3 ') Contains nucleotides, Z ′ is the C3OH moiety, and z ′′ is the inverted abasic deoxyribonucleotide moiety.
  • the antisense strand comprises 2′OMe sugar-modified ribonucleotides at positions 1, 4, 8, 11 and 15 (5 ′> 3 ′) and 2′5 ′ ribonucleotides at position 6.
  • Z is a C3Pi-C3OH moiety
  • the sense strand is a 2′OMe sugar modified ribonucleotide at positions 4, 11, 13, and 17 (5 ′> 3 ′), 2′5 at position 9 ' contains ribonucleotides
  • Z' is a C3OH moiety
  • the substance or object delivered by the carrier of the present disclosure may or may not be labeled. By labeling, it becomes possible to monitor the success or failure of delivery to target cells and the increase / decrease of target cells, which is useful not only at the test / research level but also at the clinical level.
  • the label may be any substance known to those skilled in the art, for example, any radioisotope, magnetic substance, gas or substance that generates gas under physiological conditions, an element that undergoes nuclear magnetic resonance (eg, hydrogen, phosphorus, sodium, fluorine Etc.), substances that affect the relaxation time of elements that undergo nuclear magnetic resonance (for example, metal atoms or compounds containing them), substances that bind to labeled substances (for example, antibodies), fluorescent substances, fluorophores, chemiluminescent substances , Biotin or a derivative thereof, avidin or a derivative thereof, an enzyme, or the like.
  • the label may also be attached to the carrier component or may be carried on the carrier as an independent delivery.
  • extracellular matrix-producing cells in skin or “for delivering extracellular matrix-producing cells in skin” means that extracellular matrix-producing cells in skin are suitable for use as target cells. Includes, for example, the ability to deliver substances to the same cell more rapidly, efficiently and / or in larger quantities than other cells, eg, normal cells.
  • the carrier of the present disclosure can be used as an extracellular matrix-producing cell in the skin 1.1 times or more, 1.2 times or more, 1.3 times or more, 1.5 times or more, 2 times or more, compared to other cells
  • the substance can be delivered at a rate and / or efficiency that is three times or more.
  • “delivery” includes a series of processes including a step of incorporating a delivery product into a target cell and a step of allowing the delivery product incorporated into the cell to reach a cell site of action. , Implying promotion of any one or more of these steps.
  • the step of incorporating the delivery product into the target cell includes, but is not limited to, incorporation of the delivery product by endocytosis, pinocytosis, and the like.
  • the step of reaching a delivery site taken up by a cell reaches the site of action of the cell includes, but is not limited to, endosomal escape, translocation to a specific site in the cell (eg, cell nucleus, cytoplasm, cell membrane, mitochondria, etc.) .
  • Enhanced delivery is assessed, for example, by comparing the behavior of the delivery product at each step of delivery and the effect of the delivery product as a result of delivery compared to a similar carrier that does not contain a delivery enhancing component.
  • uptake into the cell can be achieved by observing changes in position of the delivery product with a detectable label over time, and endosomal escape can be detected in cells that have specifically stained endosomes.
  • the action of the delivery product can be evaluated by a technique according to the delivery product.
  • the delivery product when the delivery product is an inhibitory nucleic acid for a specific gene, its action can be evaluated by determining the expression level of the gene.
  • the degree of promotion is not particularly limited and is, for example, 1.1 times or more, 1.2 times or more, 1.3 times or more, 1.5 times or more, 2 times or more than a similar carrier that does not include a delivery enhancing component, or It may be 3 times or more promotion.
  • the disclosure also includes dermatofibrosis or dermatosis for controlling the activity or proliferation of extracellular matrix-producing cells in the skin, comprising the carrier and a drug that controls the activity or proliferation of extracellular matrix-producing cells in the skin. It relates to a composition for treating fibrosis by GVDH or for regenerating normal skin tissue from fibrotic skin tissue, and to the use of said carrier for the production of these compositions.
  • One aspect of the composition of the present disclosure includes an effective amount of a retinoid to facilitate substance delivery to extracellular matrix-producing cells in the skin.
  • the retinoid promotes substance delivery to extracellular matrix-producing cells in the skin.
  • Dermal fibrosis in this disclosure refers to a condition characterized by excessive accumulation of extracellular matrix (eg, collagen etc.) in the skin, including, but not limited to, all incidental and iatrogenic (surgery) Abnormal scar formation (hypertrophic scar, keloid, etc.), scleroderma associated with possible types of skin damage (trauma, surgical wounds, burns (including chemical burns, heat burns or radiation burns), skin grafts, etc.) (Systemic scleroderma, mottled scleroderma, etc.), skin GVHD, dupuytren contracture, epidermolysis bullosa, drugs (eg, taxane, bleomycin, etc.) induced skin fibrosis, restrictive skin disorders, , Skin fibrosis associated with diseases such as late cutaneous porphyria, renal systemic fibrosis, eosinophilia myalgia syndrome, toxic oil syndrome and the like. Fibrosis by
  • Skin GVHD is a skin symptom associated with GVHD and often develops in subjects with cGVHD.
  • GVHD is a hematopoietic tumor (eg, acute myeloid leukemia, acute promyelocytic leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia and other leukemias, Hodgkin lymphoma, non-Hodgkin lymphoma and other lymphomas, multiple Leukocytes of the donor after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation as part of the treatment of neoplastic diseases such as myeloma and solid tumors (especially metastatic solid tumors), myelodysplastic syndrome (MDS) and aplastic anemia Is a pathological condition that can be caused by attacking recipient tissues (especially normal tissues) and can be fatal if severe.
  • neoplastic diseases such as myeloma and solid tumors (especially metastatic solid tumors), my
  • GVHD is also a phenomenon indicating that transplanted donor cells have been successfully established.
  • pretransplantation treatment treatment of the tumor with radiation and / or a chemotherapeutic agent
  • NMAC treatment
  • RIC reduced intensity pretreatment
  • graft cells versus leukemia the transplanted donor cells attack and eliminate the remaining tumor cells because the tumor cells are likely not to be eradicated
  • GVL transplanted donor cells
  • GVT graft versus tumor
  • the compositions of the present disclosure have been shown not to significantly affect donor-derived immune cells that are the source of the GVL / GVT effect, treatment of GVHD (especially skin GVHD) after low-intensity pretreatment It is particularly useful for the treatment of subjects who developed GVHD (especially cutaneous GVHD) after low-intensity pretreatment.
  • the dermal fibrosis is GVHD after low-strength pretreatment, in particular skin GVHD after low-strength pretreatment.
  • the dermal fibrosis is GVHD after low intensity pretreatment for neoplastic disease, in particular skin GVHD after low intensity pretreatment for neoplastic disease.
  • the present disclosure relates to a composition for treating cutaneous GVHD comprising the carrier and a drug that controls the activity or proliferation of extracellular matrix-producing cells in the skin.
  • the composition is a composition for treating cutaneous GVHD resulting from allogeneic hematopoietic stem cell transplantation after low intensity pretreatment.
  • the composition is a composition for treating cutaneous GVHD resulting from allogeneic hematopoietic stem cell transplantation after low-intensity pretreatment in elderly or comorbid patients.
  • the composition is a composition for treating cutaneous GVHD resulting from allogeneic hematopoietic stem cell transplantation after low-strength pretreatment without significantly affecting donor-derived immune cells. .
  • the composition is a composition for treating cutaneous GVHD resulting from allogeneic hematopoietic stem cell transplantation after low-intensity pretreatment for neoplastic disease.
  • the composition significantly affects (i) cutaneous GVHD produced by allogeneic hematopoietic stem cell transplantation after low-intensity pretreatment in elderly or comorbid patients with donor-derived immune cells.
  • the present disclosure relates to a composition for treating fibrosis associated with GVHD comprising the carrier and a drug that controls the activity or proliferation of extracellular matrix-producing cells in the skin.
  • the composition is a composition for treating fibrosis associated with GVHD caused by allogeneic hematopoietic stem cell transplantation after low intensity pretreatment.
  • the composition is a composition for treating fibrosis associated with GVHD caused by allogeneic hematopoietic stem cell transplantation after low-intensity pretreatment in an elderly person or a subject with complications.
  • the composition comprises a composition for treating fibrosis associated with GVHD caused by allogeneic hematopoietic stem cell transplantation after low-strength pretreatment without significantly affecting donor-derived immune cells. It is a thing.
  • the composition is a composition for treating fibrosis associated with GVHD caused by allogeneic hematopoietic stem cell transplantation after low-intensity pretreatment for neoplastic disease.
  • the composition comprises: (i) significant fibrosis associated with GVHD caused by allogeneic hematopoietic stem cell transplantation after low-intensity pretreatment in an elderly or comorbid patient in a donor-derived immune cell (Ii) To treat fibrosis associated with GVHD caused by allogeneic hematopoietic stem cell transplantation after low-intensity pretreatment for neoplastic disease in elderly or comorbid patients for treatment without impact, (Iii) to treat fibrosis associated with GVHD caused by allogeneic hematopoietic stem cell transplantation after low-intensity pretreatment for neoplastic disease without significantly affecting donor-derived immune cells, or (vi) elderly Patients with complications or those with complications have significant fibrosis associated with GVHD caused by allogeneic hematopoietic stem cell transplantation after low-intensity pretreatment for neoplastic disease in donor-derived immune cells Effect is a composition for
  • fibrosis associated with GVHD can also occur in tissues other than skin, such as the liver, lungs, and the like.
  • the composition for treating fibrosis associated with GVHD may be a systemic preparation (eg, an intravenous preparation).
  • “regenerating normal skin tissue from fibrotic skin tissue” means that the skin tissue altered by fibrosis is at least in a state where fibrosis is milder, more preferably in a state before fibrosis occurs. It means to recover. In other words, as skin fibrosis progresses, the skin tissue is replaced with a fibrous tissue centered on the extracellular matrix, but this flow can be reversed to replace the increased fibrous tissue with the original normal tissue. , Regeneration of normal skin tissue from fibrotic skin tissue in the present disclosure. Accordingly, regeneration of normal skin tissue from fibrotic skin tissue in the present disclosure not only fully restores the fibrotic skin tissue to the original state, but also partially restores the fibrotic skin tissue to the original state. Including.
  • the degree of regeneration of normal skin tissue may be evaluated based on normalization of the tissue structure, reduction of the area occupied by the fibrous tissue, expansion of the area occupied by the normal tissue, by histological examination such as a biopsy sample
  • an abnormality such as a biochemical index due to fibrosis is recognized before the treatment with the present composition, it may be evaluated by improving the index or the like.
  • the carrier may contain the delivery product inside, may be attached to the outside of the delivery product, or may be mixed with the delivery product.
  • the composition may be coated with a suitable material, such as an enteric coating or a time-disintegrating material, and a suitable drug release system. It may be incorporated.
  • the composition of the present disclosure may take the form of a complex of a retinoid-containing lipid carrier and a delivery product, ie, a lipoplex.
  • the composition of the present disclosure includes a drug that controls the activity or proliferation of extracellular matrix-producing cells in the skin and the retinoid and / or retinoid conjugate. And may take the form of a complex.
  • compositions of the present disclosure can be used as pharmaceuticals (ie, pharmaceutical compositions), and include various routes including both oral and parenteral, such as, but not limited to, oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, Local, intrapulmonary, intratracheal, intratracheal, intrabronchial, nasal, transgastric, enteral, intrarectal, intraarterial, portal vein, intraventricular, intramedullary, intralymphatic, intralymphatic, intracerebral, medullary It may be administered by routes such as intracavity, intraventricular, transmucosal, transdermal, intranasal, intraperitoneal, and intrauterine, and may be formulated into a dosage form suitable for each administration route.
  • oral and parenteral such as, but not limited to, oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, Local, intrapulmonary, intratracheal, intratracheal, intrabronchial, nasal, transgastric, enteral, intrarectal, intraarterial, portal vein, intraventricular
  • dosage forms suitable for oral administration include, but are not limited to, powders, granules, tablets, capsules, solutions, suspensions, emulsions, gels, syrups, etc.
  • Suitable dosage forms include injections such as solution injections, suspension injections, emulsion injections, and injections prepared at the time of use.
  • Formulations for parenteral administration can be in the form of aqueous or non-aqueous isotonic sterile solutions or suspensions.
  • Suitable dosage forms for transdermal administration include ointments, creams, emulsions, patches, cataplasms and the like.
  • the preparation for transdermal administration may contain components useful for transdermal administration, such as a transdermal absorption enhancer.
  • the present disclosure also includes a step of blending a retinoid as a substance for promoting substance delivery to extracellular matrix-producing cells in the skin, and a drug for controlling the activity or proliferation of extracellular matrix-producing cells in the skin as an active ingredient.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating fibrosis or fibrosis due to GVHD or a method for producing a composition for regenerating normal skin tissue from fibrotic skin tissue.
  • the method of blending the retinoid and / or retinoid conjugate is not particularly limited as long as the retinoid and / or the retinoid conjugate can function as a substance delivery promoting component to extracellular matrix-producing cells in the skin in the formulated composition.
  • Various techniques described in the specification can be used.
  • blending method of an active ingredient will not be specifically limited if an active ingredient can have a predetermined effect, Arbitrary well-known methods can be used.
  • the active ingredient may be blended simultaneously with the retinoid and / or retinoid conjugate, or before or after blending the retinoid.
  • the composition includes a carrier component other than retinoid and a retinoid conjugate
  • the formulation of the active ingredient mixes the active ingredient with a carrier in which the retinoid and / or retinoid conjugate is already formulated as a substance delivery promoting component.
  • retinoid and / or the retinoid conjugate May be carried out by mixing the retinoid and / or the retinoid conjugate, a carrier component other than the retinoid and the retinoid conjugate, and the active ingredient at the same time, or the retinoid and the retinoid conjugate. You may carry out by mix
  • the amount of retinoid compounded is as already described for the carrier of the present disclosure.
  • the active ingredient when administered as a composition, is mixed to suppress the onset and recurrence of dermal fibrosis or GVHD, improve the pathology, reduce symptoms, or delay or stop progression.
  • an amount that does not cause adverse effects exceeding the benefits of administration is preferred.
  • Such an amount is known or can be appropriately determined by an in vitro test using cultured cells, or a test in a model animal such as a mouse, rat, dog or pig. Such a test method is well known to those skilled in the art.
  • a test method is well known to those skilled in the art.
  • Examples of dermatofibrosis model animals include those described in Asano et al., Curr Rheumatol Rep. (2013) 15: 382 (for example, ROS (reactive oxygen species) -induced SS (systemic sclerosis) as a model model of scleroderma.
  • GVHD model animals with cutaneous GVHD include, but are not limited to, a minor histocompatibility antigen mismatch transplant model (transplantation of bone marrow cells, spleen cells, etc. from B10.D2 mice to BALB / c mice).
  • the compounding amount of the active ingredient may vary depending on the dosage form of the composition.
  • the amount of the active ingredient blended in one unit of the composition may be a plurality of the amount of the active ingredient necessary for one administration. it can.
  • Those skilled in the art can appropriately adjust the blending amount.
  • dosage levels on the order of about 0.1 mg to about 140 mg per kilogram of body weight per day are useful for the treatment of the above conditions (about 0.5 mg to about 7 g per subject per day).
  • the amount of active ingredient that can be combined with the carrier materials to produce a single dosage form will vary depending upon the host treated and the particular mode of administration. Dosage unit forms will generally contain about 1 mg to about 500 mg of an active ingredient.
  • the specific dose level for any particular subject is the activity, age, weight, general health, sex, diet, administration, administration time, route of administration, and elimination rate of the specific compound used, concomitant medications It is understood that it depends on a variety of factors, including the severity of the particular disease being treated.
  • the pharmaceutical composition according to the present disclosure can be administered once a day, qid, tid, bid, or any medically appropriate interval for any period.
  • the therapeutic agent can also be dosed in dosage units containing 2, 3, 4, 5, 6 or more sub-doses administered at appropriate intervals throughout the day. In that case, each sub-dose may contain correspondingly less active ingredient to achieve the total daily dosage unit.
  • Dosage units can also be combined for a single dose over several days, for example using conventional sustained release formulations that provide sustained and constant release of the active ingredient over several days. Sustained release formulations are well known in the art.
  • a dosage unit may include a corresponding plurality of daily doses. The compositions can be combined so that the sum of the units of the active ingredients together comprise a sufficient dose.
  • the carrier or composition of the present disclosure may be provided in a lyophilized state.
  • a lyoprotectant may be utilized.
  • lyophilization protectants include sucrose, lactulose, lactose, maltose, trehalose, cellobiose, cordobiose, nigerose, isomaltose, sophorose, laminaribiose, gentiobiose, turanose, maltulose, palatinose, gentiobiulose, mannobiose , Polysaccharides such as melibiose, melibiurose, rutinose, rutinulose and xylobiose.
  • the carrier or composition of the present disclosure is also provided in a form ready for use, such as a form that can be prepared by a physician and / or pharmacist, nurse, or other paramedical at or near a medical site. be able to.
  • the lyophilized form is an example of a form that can be prepared at the time of use.
  • the carrier or composition of the present disclosure is provided as one or more containers containing at least one of the essential components thereof and is used prior to use, for example, within 24 hours, preferably 3 Prepared within an hour and more preferably immediately before use. In the preparation, reagents, solvents, dispensing devices and the like that are usually available at the place of preparation can be appropriately used.
  • the present disclosure also provides one or more containers comprising retinoids and / or retinoid conjugates, and / or deliverables, and / or carrier components other than retinoids and retinoid conjugates, alone or in combination.
  • a preparation kit for the composition comprising the carrier, as well as the necessary components of the carrier or the composition provided in the form of such a kit.
  • the kit of the present disclosure includes instructions regarding the preparation method and administration method of the carrier and composition of the present disclosure, treatment of dermal fibrosis or fibrosis due to GVHD, such as instructions, and electronic records such as CDs and DVDs. A medium or the like may be included.
  • kit of the present disclosure may include all of the components for completing the carrier or composition of the present disclosure, but may not necessarily include all of the components. Therefore, the kit of the present disclosure may not contain reagents and solvents that are usually available at medical sites, laboratory facilities, and the like, for example, sterile water, physiological saline, and glucose solution.
  • the present disclosure further provides dermal fibrosis or GVHD fiber for controlling the activity or proliferation of extracellular matrix-producing cells in the skin, comprising administering an effective amount of said composition to a subject in need thereof.
  • the present invention relates to a method for treating oxidization or for regenerating normal skin tissue from fibrotic skin tissue.
  • the effective amount is, for example, the amount that suppresses the onset and recurrence of dermal fibrosis or GVHD, improves the pathological condition, reduces the symptoms, or delays or stops the progression of the latter.
  • it may be an amount that prevents or cures the onset and recurrence of dermal fibrosis or fibrosis due to GVHD, or an amount that can regenerate normal skin tissue from fibrotic skin tissue.
  • an amount that does not cause adverse effects exceeding the benefits of administration is preferred.
  • Such an amount can be appropriately determined by an in vitro test using cultured cells or the like and a test in a model animal such as a mouse, rat, dog or pig, and such a test method is well known to those skilled in the art. .
  • the doses of retinoid contained in the carrier and the drug used in the method of the present disclosure are known to those skilled in the art or can be appropriately determined by the above-described tests and the like.
  • the model animal for dermal fibrosis or GVHD is as described above.
  • the specific dose of the composition to be administered in the methods of the present disclosure can vary according to various conditions related to the subject in need of treatment, such as severity of symptoms, general health of the subject, age, weight, subject sex, diet, administration It can be determined in consideration of the route, the timing and frequency of administration, the drugs used in combination, the responsiveness to treatment, compliance with treatment, and the like.
  • Administration routes include various routes including both oral and parenteral, such as oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, topical, intrapulmonary, intratracheal, intratracheal, intrabronchial, nasal, transgastric, Enteral, intrarectal, intraarterial, portal vein, intraventricular, intramedullary, intralymphatic, intralymphatic, intracerebral, intrathecal, intraventricular, transmucosal, transdermal, intranasal, intraperitoneal and uterus Internal routes are included. The frequency of administration varies depending on the properties of the composition used and the conditions of the subject as described above.
  • the term “subject” means any living individual, preferably an animal, more preferably a mammal, more preferably a human individual.
  • a subject may be healthy or afflicted with some disease, but typically is afflicted with dermal fibrosis, for example, when treatment of dermal fibrosis is contemplated.
  • skin fibers such as, but not limited to, GVHD, late cutaneous porphyria, renal systemic fibrosis, eosinophilia myalgia syndrome, toxic oil syndrome, etc.
  • treatment is intended to encompass all types of medically acceptable prophylactic and / or therapeutic interventions intended to cure, temporarily ameliorate or prevent disease.
  • treatment includes medically acceptable interventions for various purposes, including delaying or stopping the progression of dermal fibrosis, regression or disappearance of lesions, preventing or preventing the onset of dermal fibrosis, etc. Is included.
  • a subject in the methods of the present disclosure is a subject who has or is likely to have low intensity pretreatment followed by allogeneic bone marrow stem cell transplantation.
  • such subjects are elderly subjects (eg, human subjects such as 55 years old or older, 65 years old or older, 70 years old or older, 75 years old or older, etc.), and / or other complications (eg, Diabetes, kidney disease, heart disease, etc.)
  • a neoplastic disease eg, a hematopoietic tumor, etc.
  • such a subject is an elderly subject suffering from a neoplastic disease and / or a subject suffering from a neoplastic disease and other complications.
  • the disclosed method further comprises identifying a subject having or at risk of developing dermatofibrosis or GVHD. In one aspect, the method of the present disclosure further comprises performing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation on the subject. In certain aspects, the methods of the present disclosure further comprise performing low intensity pretreatment on the subject and performing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation on the subject.
  • the present disclosure also relates to a method for delivering a substance to extracellular matrix-producing cells in the skin using the carrier.
  • This method is not limited, for example, a step of carrying a delivery product on the carrier, and a carrier carrying the delivery product is administered or added to an organism or medium containing extracellular matrix-producing cells in the skin, such as a culture medium. Including the step of. These steps can be appropriately achieved according to any known method or the method described in the present specification.
  • the delivery method can also be combined with other delivery methods, such as other delivery methods that target the skin.
  • the said method includes the aspect made in vitro, and the aspect which targets the extracellular-matrix production cell in the skin in a body.
  • the substance that can be transported by the carrier of the present disclosure is as described above.
  • siRNA-containing retinoid-binding liposomes containing siRNA and retinoid conjugate XR3 were prepared as described in WO 2012/170952.
  • lipid P2, lipid I8, DOPE, cholesterol, PEG-DMPE and XR3 were solubilized in absolute ethanol at a molar ratio of 20: 20: 30: 25: 5: 2 to obtain an ethanol / lipid mixture.
  • siRNA was solubilized in 50 mM citrate buffer and the temperature was adjusted to 35-40 ° C.
  • the ethanol / lipid mixture was added to the siRNA-containing buffer with stirring to form siRNA-containing liposomes.
  • siRNA-containing liposomes were diafiltered against 10 volumes of PBS (pH 7.2) to remove ethanol.
  • the obtained liposome (which may be abbreviated as “XR3 (+) liposome” or “siRNA-containing retinoid-binding liposome”) has an average particle size of 50 to 100 nm, PDI ⁇ 0.2, and siRNA encapsulation efficiency> 85%. It was. Moreover, when the zeta potential was measured, it was electrically neutral at a pH in the neutral region.
  • siRNA1 Sense strand 5'-GAGACACAUGGGUGCUAUA-3 '(SEQ ID NO: 16)
  • Antisense strand 5'-UAUAGCACCCAUGUGUCUC-3 '(SEQ ID NO: 17)
  • siRNA2 Sense strand 5'-UCCUGAGACACAUGGGUGA-3 '(SEQ ID NO: 26)
  • Antisense strand 5′-UCACCCAUGUGUCUCAGGA-3 ′ (SEQ ID NO: 27)
  • Scrambled siRNA Sense strand 5'-CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG-3 '(SEQ ID NO: 32)
  • Antisense strand 5'-GCAAUGAAGCCGGUCUAGCGAAUCGAU-3 '(SEQ ID NO: 33)
  • Example 2 Inhibition of HSP47 Expression in Skin Myofibroblasts
  • siRNA-containing retinoid-binding liposomes can inhibit the expression of HSP47 in skin myofibroblasts, which are thought to be involved in skin fibrosis, were prepared in vitro.
  • the siRNA-containing retinoid-binding liposome prepared in Example 1 was allowed to act on skin myofibroblasts, and the expression of HSP47 was measured.
  • Skin myofibroblasts were prepared by inducing skin fibroblasts with TGF- ⁇ 1.
  • serpinh1-P 5'-AGCCACACTGGGATGAGAAGTTTCACCA-3 '(SEQ ID NO: 34)
  • serpinh1-F 5'-CTGCTTGTGAACGCCATGTTC-3 '(SEQ ID NO: 35)
  • serpinh1-R 5'-TCACCATGAAGCCACGGTTG-3 '(SEQ ID NO: 36) From the results shown in FIG. 1, it can be seen that both siRNA1 and siRNA2 significantly suppress the expression of HSP47 in skin myofibroblasts.
  • Example 3 Treatment of Bleomycin-Induced Skin Fibrosis
  • BW siRNA-containing retinoid-binding liposomes were intravenously injected three times a week from the day after the start of bleomycin administration (BLM + siRNA group).
  • siRNA1 was used as the siRNA.
  • a vehicle (PBS) was administered to the control group (BLM + PBS group).
  • col1a1-P 5'-CGGGGTCGGAGCCCTCGCTTCC-3 '(SEQ ID NO: 37)
  • col1a1-F 5'-ACCGATGGATTCCCGTTCGA-3 '(SEQ ID NO: 38)
  • col1a1-R 5′-CATTAGGCGCAGGAAGGTCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 39)
  • Immunofluorescence staining Paraffin sections were prepared and stained with anti-HSP47 antibody (abcam) and secondary antibody anti-rabbit IgG antibody Alexa Fluor 594.
  • mice subcutaneously injected with bleomycin for 21 days produced marked fibrosis at the site of administration (FIG. 3), and increased dermal thickening and collagen deposition (measured by collagen dot density) (FIG. 4).
  • the expression of HSP47 was observed by the qPCR method, it was found that the expression was increased by the administration of bleomycin and decreased significantly in the BLM + siRNA group (FIG. 5B).
  • Example 4 Treatment of cutaneous GVHD 1
  • a donor mouse BALB / c
  • MHC major histocompatibility complex
  • mice B10.D2
  • half of allo group recipients are intravenously injected with retinoid-binding liposomes containing siRNA containing 4.5 mg / kg ⁇ BW from day 8 (day 8) to day 26 three times a week.
  • the treatment group (Allo + siRNA group).
  • siRNA1 was used as the siRNA.
  • the remaining Allo group recipients received only PBS as a control (Allo + PBS group).
  • the severity of skin fibrosis in mice surviving on day 42 was evaluated according to (1) to (6) above.
  • Example 5 Treatment of cutaneous GVHD 2
  • siRNA2 was used as the siRNA
  • administration of siRNA-containing retinoid-binding liposomes or vehicle (PBS) was continued from day 1 to day 41.
  • the types and ratios of cells contained in the spleen and thymus were analyzed by flow cytometry. More specifically, after collecting thymus and spleen on day 42 to prepare a cell suspension, erythrocytes were lysed using RBC lysis buffer (Biolegend), and the number of viable cells was counted after trypan blue staining.
  • Cell suspensions from the thymus were stained with anti-CD4 and anti-CD8 antibodies, and double positive cells were quantified by flow cytometry.
  • Cell suspensions from the spleen were quantified by flow cytometry as CD11b ⁇ TCRb + CD4 + cells as CD4 + T cells and CD11b ⁇ TCRb + CD8 + cells as CD8 + T cells, respectively.
  • the chimerism analysis was performed by staining a cell suspension from the spleen with an anti-Ly9.1 antibody and determining the ratio of recipient cells (Ly9.1 positive) by flow cytometry.
  • the skin on the back was collected on day 42 to prepare a paraffin section, immunostained with anti-Hsp47 antibody (Abcam) and / or anti- ⁇ -SMA antibody (Abcam), and nuclear stained with DAPI. .
  • Example 6 In vivo distribution of siRNA-containing retinoid-bound liposomes Retinoids labeled with the fluorescent dye Dy647 on day 22 in C57BL / 6 mice in which 100 ⁇ g of BLM was administered daily for 21 days from day 1 to day 21 to induce skin fibrosis Bound liposomes (containing a mixture of Dy647-labeled siRNA 1 (40%) and unlabeled siRNA 2 (60%)) were intravenously injected 3 times every 2 hours at a dose of 4.5 mg / kg ⁇ BW.
  • siRNA-containing retinoid-bound liposomes significantly reduced the dermis thickness at the fibrosis induction site compared to the control (“Fibrotic” vs. “Fibrotic + siRNA”), but the dermis thickness at the normal site was reduced. Had no significant effect (“Normal” vs. "Normal + siRNA”).
  • Example 7 Improvement of established cutaneous GVHD The same treatment as in Example 5 was carried out except that administration of siRNA-containing retinoid-binding liposomes or vehicle was carried out from day 21 to day 41 after the establishment of cutaneous GVHD. From the results shown in FIG. 21, it can be seen that the siRNA-containing retinoid-binding liposomes can be improved even for the established skin GVHD.
  • the composition of the present disclosure suppressed skin fibrosis by different mechanisms of bleomycin-induced skin fibrosis and skin GVHD, so that skin fibrosis caused by various diseases, skin trauma and surgery It is considered that it can be widely used for the treatment of scars caused by keratin, keloid treatment and the like.
  • cGVHD and the like not only skin but also systemic organ fibrosis becomes prominent, and in order to cope with such a wide range of organ fibrosis, a systemically administrable drug such as the composition of the present disclosure Is preferred.
  • composition of the present disclosure does not significantly affect the number and composition of donor-derived immune cells by allogeneic bone marrow stem cell transplantation.
  • composition of the present disclosure does not significantly affect GVL / GVT, and the composition of the present disclosure for treatment using GVL / GVT, such as tumor therapy with low intensity pretreatment.
  • the usefulness of In an experiment using a cGVHD model diarrhea occurred due to inflammation of the intestinal tract due to cGVHD, and mice were weakened or died (FIG. 9).
  • the disclosed compositions comprising siRNA against HSP47 have no effect on conditions that are not involved in such fibrosis.
  • symptoms other than fibrosis can be dealt with by using other treatments in combination.
  • no adverse effects were observed compared to the PBS administration group as a control. This suggests the high safety of the composition of the present disclosure.

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Abstract

本発明は、レチノイドを含む、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞用の物質送達担体、同担体を利用した皮膚線維症処置剤、同処置剤の調製キット、同担体の製造方法、および、同処置剤の製造方法に関する。

Description

皮膚線維症処置剤
　本開示は、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達を促進するための担体、ならびに該担体を利用した皮膚線維症処置用組成物および皮膚線維症の処置方法等に関する。
　全身性強皮症や、同種造血幹細胞移植後に発症する慢性移植片対宿主病（ｃＧＶＨＤ）では、しばしば高度な皮膚の線維化が生じる（非特許文献１および２）。皮膚の線維化は美容上の問題となるだけではなく、高度になると皮膚硬化のため、例えば関節の可動域制限、開口障害、仮面様顔貌、呼吸障害などを来し患者の生活の質（ＱＯＬ）を著しく低下させる。現在、その治療法として免疫抑制剤の投与が行われているものの、その効果は必ずしも充分とはいえず、また広汎な免疫抑制を伴うため、感染症の発症や腫瘍の再発を招く可能性がある。こうした患者を安全かつ効果的に治療するために、免疫抑制効果を伴わない線維化阻害剤の開発が待たれている。
Sticherling M. J Dtsch Dermatol Ges. 2012, 10(11):783-91 Martires KJ et al. Blood 2011, 118(15):4250-7
　本開示の一部の態様は、上記のような課題を解決するためになされたものであり、新規な皮膚線維症処置剤および皮膚線維症の処置方法を提供することを目的とする。
　本開示の一部の態様は以下に関する。
　＜１＞レチノイドを、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達を促進する成分として含む、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達用担体。
　＜２＞レチノイドが、レチノイド結合体として含まれる、上記＜１＞に記載の担体。
　＜３＞脂質をさらに含む、上記＜１＞または＜２＞に記載の担体。
　＜４＞上記＜１＞～＜３＞のいずれか一つに記載の担体と、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物とを含む、皮膚線維症を処置するための医薬組成物。
　＜５＞上記＜１＞～＜３＞のいずれか一つに記載の担体と、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物とを含む、線維化皮膚組織から正常皮膚組織を再生するための医薬組成物。
　＜６＞皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物が、細胞外マトリックス成分の産生・分泌を阻害する物質、細胞増殖抑制物質、アポトーシス誘導物質およびＴＩＭＰ阻害物質からなる群から選択される、上記＜４＞または＜５＞に記載の医薬組成物。
　＜７＞細胞外マトリックス成分の産生・分泌を阻害する物質が、ＨＳＰ４７の阻害剤である、上記＜６＞に記載の医薬組成物。
　＜８＞用時調製形態である、上記＜４＞～＜７＞のいずれか一つに記載の医薬組成物。
　＜９＞皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体、ならびに、必要に応じてレチノイド以外の担体構成物質を、単独でまたは組み合わせて含む１つまたはそれ以上の容器を含む、上記＜４＞～＜８＞のいずれか一つに記載の医薬組成物の調製キット。
　＜１０＞レチノイドおよび／またはレチノイド結合体を皮膚における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達促進成分として配合する工程を含む、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達をするための担体の製造方法。
　＜１１＞レチノイドを皮膚における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達促進成分として、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物を有効成分としてそれぞれ配合する工程を含む、皮膚線維症を処置するための医薬組成物または線維化皮膚組織から正常皮膚組織を再生するための医薬組成物の製造方法。
　本開示の担体により、有効成分を作用部位（例えば、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞）に効率的に送達できるため、これまで根本的な治療方法がなかった皮膚線維症の治癒、進行の抑制または発症の予防が可能となり、ヒト医療および獣医療への貢献は極めて大きい。
　また、本開示の担体は、任意の薬剤（例えば、既存の皮膚線維症治療薬）と組み合わせてその作用効率を高めることができるため、製剤的な応用範囲が広く、効果的な処置剤の製造を簡便に行うことができるという利点もある。
図１は、皮膚筋線維芽細胞における、ＨＳＰ４７　ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームによるＨＳＰ４７の発現阻害を示したグラフである。 図２は、ブレオマイシン（ＢＬＭ）皮膚線維化誘発モデルマウスへの投薬のためのレジメンを示した図である。 図３は、皮膚線維症モデルマウスから採取した皮膚切片をＭＴ染色した写真図である。 図４は、皮膚線維症モデルマウスから採取した真皮の肥厚（Ａ）およびコラーゲンの沈着を画像的に評価できるcollagen dot density測定の結果（Ｂ）を示したグラフである。 図５は、ｑＰＣＲ法によるＣｏｌ１ａ１およびＨＳＰ４７夫々のｍＲＮＡの発現量（ＡおよびＢ）ならびにヒドロキシプロリンアッセイの結果（Ｃ）を示したグラフである。 図６は、ｃＧＶＨＤによる皮膚線維化モデルマウスを作製するためのレジメンを示した図である。 図７は、ｃＧＶＨＤモデルマウスから採取した皮膚切片をＭＴ染色した組織像および真皮の肥厚を示すグラフ（Ａ）ならびにcollagen dot density測定の結果（Ｂ）を示した図である。
図８は、ｃＧＶＨＤモデルマウスから採取した皮膚切片の免疫蛍光染色結果を示す写真図である。 図９は、ｃＧＶＨＤモデルマウスへの投薬のためのレジメンを示した図である。 図１０は、ＨＳＰ４７　ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームによる治療群およびコントロール群の生存率（Ａ）および体重推移（Ｂ）を示したグラフである。ｃＧＶＨＤによる下痢、死亡が両群とも同程度に見られるため、生存率・体重推移に差異を認めなかった。治療群における有害事象の増加は見られなかった。 図１１は、ｃＧＶＨＤモデルマウスのＨＳＰ４７　ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームによる治療群およびコントロール群から採取した皮膚切片をＭＴ染色した組織像（Ａ）、真皮の肥厚を示すグラフ（Ｂ）およびcollagen dot density測定の結果（Ｃ）を示した図である。 図１２は、ｑＰＣＲ法によるＨｓｐ４７のｍＲＮＡの発現量の結果を示したグラフである。
図１３は、コラーゲンアッセイの結果を示したグラフである。 図１４は、ｃＧＶＨＤモデルマウス（Ａｌｌｏ）およびコントロールマウス（Ｓｙｎ）の皮膚組織におけるＨＳＰ４７およびα－ＳＭＡ陽性細胞の局在を示した写真図である。スケールバーは５０μｍを表す。 図１５は、ｃＧＶＨＤモデルマウスにおけるＨＳＰ４７　ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームによるコラーゲン量低減効果（Ａ）および真皮肥厚低減効果（Ｂ）を示したグラフである。 図１６は、ｃＧＶＨＤモデルマウスにおけるＨＳＰ４７　ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームによるＨＳＰ４７の発現抑制を示した写真図である。下段は上段の像の拡大像である。 図１７は、ｃＧＶＨＤモデルマウスの胸腺に含まれるＣＤ４、ＣＤ８両陽性細胞数（Ａ）、脾臓に含まれるＣＤ４陽性細胞数（Ｂ）またはＣＤ８陽性細胞数（Ｃ）に対する、ＨＳＰ４７　ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソーム投与の影響を示したグラフである。N.Sは有意差が認められなかったことを示す（Mann-Whitney U test、P>0.5）。
図１８は、ドナーＴ細胞（左）およびＣＤ１１ｂ陽性ドナー骨髄細胞（右）の割合に対する、ＨＳＰ４７　ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソーム投与の影響を示したグラフである。 図１９は、ブレオマイシン誘発皮膚線維化モデルマウスの正常皮膚組織（左）または線維化病変（右）における、レチノイド結合リポソームによる標識の送達を示した写真図である。下段は、上段の像の拡大像である。スケールバーは５０μｍを表す。 図２０は、ブレオマイシン誘発皮膚線維化モデルマウスの正常皮膚組織または線維化病変の真皮肥厚に対する、ＨＳＰ４７　ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソーム投与の影響を示したグラフである。 図２１は、ｃＧＶＨＤによる確立された皮膚線維化に対するＨＳＰ４７　ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームの真皮肥厚低減効果（左）およびコラーゲン量低減効果（右）を示したグラフである。
　本開示の１つの側面は、レチノイドを、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞（本明細書中で「標的細胞」と称することがある）への物質送達を促進する成分として含む、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達用担体に関する。一態様において、本開示の担体は皮膚における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達を促進するための有効量のレチノイドを含む。また、本開示の担体の一態様は、レチノイドによって皮膚における細胞外マトリックス産生細胞に対する物質送達が促進される担体に関する。
　本開示において、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞は、皮膚に存在する細胞外マトリックス産生能を有する細胞であり、例えば、皮膚に存在する線維芽細胞、周皮細胞、フィブロサイトおよび筋線維芽細胞を含む。皮膚に存在する細胞外マトリックス産生細胞は、皮膚に存在する細胞に由来するものばかりでなく、循環血液中のフィブロサイトに由来するものを含み得る。また、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞は、内皮間葉転換（EndoMT）により内皮細胞（例えば血管内皮細胞など）から転換された、または、上皮間葉転換（EMT）により上皮細胞（例えばケラチノサイトなど）から転換された、細胞外マトリックス産生細胞（例えば、線維芽細胞または筋線維芽細胞）であってもよい。
　皮膚における細胞外マトリックス産生細胞は、表皮、真皮および皮下組織からなる群から選択される１または２以上の部位に存在するものであってよい。一態様において、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞は、真皮および／または皮下組織に存在する。一態様において、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞は、皮膚の線維化病変に存在する。皮膚の線維化病変は、表皮、真皮および皮下組織からなる群から選択される１または２以上の部位に生じ得る。特定の態様において、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞は、真皮および／または皮下組織の線維化病変に存在する。
　一態様において、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞は、ＣＲＡＢＰ（cellular retinoic acid binding protein）を発現している。ＣＲＡＢＰは、ＣＲＡＢＰ１およびＣＲＡＢＰ２を含む。したがって、上記態様における細胞外マトリックス産生細胞は、ＣＲＡＢＰ１および／またはＣＲＡＢＰ２を発現している。一態様において、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞は、α－ＳＭＡ（alpha-smooth muscle actin）を発現している。一態様において、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞は、ビメンチンを発現している。一態様において、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞は、ＨＳＰ４７（heat shock protein 47）を発現している。特定の態様において、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞は、ＣＲＡＢＰおよびＨＳＰ４７を発現している。
　細胞におけるＣＲＡＢＰ、α－ＳＭＡ、ビメンチン、ＨＳＰ４７などのマーカーの発現は、例えば、同細胞における各マーカーの発現を検出することで確認することができる。ＣＲＡＢＰ１、ＣＲＡＢＰ２、α－ＳＭＡ、ビメンチンおよびＨＳＰ４７の遺伝子配列は既知であり、これらに対する抗体も開発されているため、その発現は、既知の核酸またはタンパク質検出手法、例えば、限定されずに、抗体を利用した免疫沈降法、ＥＩＡ（enzyme immunoassay）（例えば、ＥＬＩＳＡ（emzyme-linked immunosorbent assay）など）、ＲＩＡ（radio immuno assay）（例えば、ＩＲＭＡ（immunoradiometric assay）、RAST（radioallergosorbent test）、RIST（radioimmunosorbent test）など）、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、フローサイトメトリー法、ＣＲＡＢＰ１、ＣＲＡＢＰ２、α－ＳＭＡ、ビメンチンまたはＨＳＰ４７をコードする核酸もしくはそのユニークな断片または該核酸の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）もしくはスプライシング産物に特異的にハイブリダイズする核酸を利用した、種々のハイブリダイゼーション法、ノーザンブロット法、サザンブロット法、種々のＰＣＲ法などにより検出することができる。
　本開示において、「レチノイド」は、第１世代、第２世代および第３世代のレチノイドを含む、天然および合成のレチノイドを指す。天然に存在するレチノイドの例として、限定されないが、１１－シス－レチナール、オール－トランスレチノール、パルミチン酸レチニル、オール－トランスレチノイン酸、および１３－シス－レチノイン酸等が挙げられる。さらに、用語「レチノイド」は、レチノイン酸、レチノール、レチナール、ならびにそれらの誘導体およびアナログを包含する。一態様において、レチノイドは、４個のイソプレノイド単位がヘッド－トゥー－テイル式に連結した骨格を有する。
　レチノイドの非限定例としては、例えばレチノール（オールトランスレチノールを含む）、レチナール、レチノイン酸（トレチノインを含む）、レチノールと脂肪酸とのエステル、脂肪族アルコールとレチノイン酸とのエステル、エトレチナート、イソトレチノイン、アダパレン、アシトレチン、タザロテン、パルミチン酸レチノール、レチノール、レチノイン酸、レチナール、エトレチナート、イソトレチノイン、アシトレチン等の飽和誘導体などのレチノイド誘導体、およびフェンレチニド（４－ＨＰＲ）、ベキサロテンなどのビタミンＡアナログを挙げることができる。
　一態様において、レチノイドはレチノイン酸およびそのアナログ含む。一態様において、レチノイン酸アナログは、ＣＲＡＢＰ結合性である。ＣＲＡＢＰ結合性のレチノイン酸アナログの非限定例としては、例えば、SRI 2965-38、Ro 13-7410、Ro31-3689、St 80、SRI 6409-40、TTNN、TTAB、Ch 80、Az 80、Am 580、Am 555、Am 80、５，６－エポキシ－レチノイン酸、４－ＯＨ－レチノイン酸、４－オキソ－レチノイン酸、レチノイン酸グルクロニド、９－シス－レチノイン酸等が挙げられる（Trown et al., Cancer Res. 1980 Feb;40(2):212-20、Sani et al., Cancer Res. 1984;44(1):190-5、Lotan et al., Cancer Res. 1980;40(4):1097-102、Keidel et al., Eur J Biochem. 1993;212(1):13-26、Jetten et al., Cancer Res. 1987;47(13):3523-7など参照）。ある化合物のＣＲＡＢＰに対する結合性は、例えば、放射性標識したレチノイン酸を用いた競合結合アッセイなどにより決定することができる。
　レチノイドは、レチノイドと他の化合物とが結合したレチノイド結合体として存在してもよい。他の化合物は、前記レチノイドと同種のレチノイドであっても、前記レチノイドととは異なるレチノイドであっても、非レチノイド化合物（例えば、脂質など）であってもよい。レチノイドと他の化合物とは、縮合反応などにより直接結合していても、リンカーを介して結合していてもよい。
　一態様において、レチノイド結合体は、構造Ｉ
Ｘ－Ｙ－Ｚ　　　Ｉ
式中、
Ｘはレチノイドまたは脂質であり、
Ｚはレチノイドであり、
Ｙはリンカーである、
を有する化合物である。
　構造ＩにＸおよびＺとして含まれるレチノイドまたは脂質は、リンカーとの結合様式に応じて、遊離のレチノイドまたは脂質の一部であっても、リンカーとの付着点を提供するために、遊離のレチノイドまたは脂質に連結基を付加したものであってもよい。例えば、レチノイン酸と、末端にアミノ基を有するリンカーとを脱水縮合により結合させる場合、レチノイン酸の１５位のカルボキシル基に含まれるＯＨ基と、リンカーのアミノ基に含まれるＨとが脱離するため、ＸおよびＺはレチノイン酸からＯＨ基を除いた部分となる。
　ＸおよびＺは、それぞれ独立して１個または複数個のレチノイドを含んでもよい。ＸおよびＺは、それぞれ独立して、例えば、１、２、３、４または５個のレチノイドを含んでもよい。Ｘおよび／またはＺが複数個のレチノイドを含む場合、各レチノイドは同一であっても異なっていてもよい。
　構造ＩにＸとして含まれる脂質としては、限定されずに、例えば、１以上のアルキル鎖と、アミドを含む頭基とを含む脂質が挙げられる。特定の態様において、構造ＩにＸとして含まれる脂質は、ＤＯＤＣ、ＨＥＤＯＤＣ、ＤＳＰＥ、ＤＯＰＥおよびＤＣ－６－１４からなる群から選択される。
　本開示において、「リンカー」は、レチノイドを結合し得る任意のリンカーを含む。リンカーは直鎖状であっても分枝状であってもよい。一態様において、リンカーは化学結合である。化学結合は、単結合、二重結合および三十結合を含む。別の態様において、リンカーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。ＰＥＧの平均分子量は特に限定されず、例えば、２００～５０００、５００～３０００、５５０～２０００等の範囲であってよい。ＰＥＧは、１個以上のアミド基および／またはアミノ基を含んでもよい。ＰＥＧは、リジン残基などの１個以上の連結基を含んでもよい。一態様において、ＰＥＧは、１個以上のアミド基および１個以上のリジン残基を含む。別の態様において、リンカーは、Ｇｌｕ、ヘキサノイル、Ｇｌｙ３またはＧｌｕＮＨからなる群から選択される。
　一部の態様において、ＰＥＧは、ビス－アミド－ＰＥＧ、トリス－アミド－ＰＥＧ、テトラ－アミド－ＰＥＧ、Ｌｙｓ－ビス－アミド－ＰＥＧ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ－トリス－アミド－ＰＥＧ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ－テトラ－アミド－ＰＥＧ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ－ＰＥＧ－Ｌｙｓであってもよい。一部の態様において、ＰＥＧは、５～５０個、６～４０個、７～３０個、８～２５個、９～２０個、１０～１５個などの繰り返し単位－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－を有する。
　以下に、ＸおよびＺがそれぞれ２個のレチノイン酸であり、リンカーがＬｙｓ－ビス－アミド－ＰＥＧ－Ｌｙｓである化合物の非限定例を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　式中、ｑ、ｒ、ｓは、それぞれ独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。
　以下に、構造Ｉを有する化合物の非限定例を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　レチノイドまたはレチノイド結合体が立体異性体を含む場合、前記化合物は、その立体異性体のそれぞれ、または、立体異性体の任意の混合物を含む。レチノイドまたはレチノイド結合体はまた、１または２以上の置換基で置換されることもある。レチノイドまたはレチノイド結合体は、単離された状態のものはもちろんのこと、これを溶解または保持することができる媒体に溶解または混合した状態のレチノイドまたはレチノイド結合体をも含む。
　本開示の担体は、これらのレチノイドおよび／またはレチノイド結合体自体で構成してもよいし、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体を、これとは別の担体構成成分に結合または包含させることにより構成してもよい。したがって、本開示の担体は、レチノイドまたはレチノイド結合体以外の担体構成成分を含んでいてもよい。かかる成分としては、特に限定されずに、医薬および薬学の分野で知られる任意のものを用いることができるが、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体を包含し得るか、または、これと結合し得るものが好ましい。
　一態様において、レチノイドおよびレチノイド結合体以外の担体構成成分は脂質を含む。かかる脂質の非限定例としては、グリセロリン脂質などのリン脂質、スフィンゴミエリンなどのスフィンゴ脂質、コレステロールなどのステロール、大豆油、ケシ油などの植物油、鉱油、卵黄レシチンなどのレシチン類などが挙げられる。脂質のより具体的な例としては、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、コレステロールなどのステロール、Ｎ－（α－トリメチルアンモニオアセチル）－ジドデシル－Ｄ－グルタメートクロリド（ＴＭＡＧ）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－テトラメチル－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－テトラパルミチルスペルミン（ＴＭＴＰＳ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ジドデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレイルオキシ－３－トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、１，２－ジミリストイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｏ，Ｏ’－ジテトラデカノイル－Ｎ－（α－トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド（ＤＣ－６－１４）などが挙げられる。
　脂質はカチオン性脂質であっても、非カチオン性脂質、例えば、アニオン性脂質や中性脂質であってもよい。一態様において、担体はカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、負の電荷を有する核酸分子などを細胞内に導入するのに特に有用である。別の態様において、担体はイオン化可能カチオン性脂質を含む。イオン化可能カチオン性脂質は、ＰＫａ以上のｐＨでは非イオン性であるが、ＰＫａより低いｐＨでカチオン性となる性質を有する。一部の態様において、イオン化可能カチオン性脂質は３級アミンを有する。一部の態様において、イオン化可能カチオン性脂質のＰＫａは、７．０以上、７．５以上、７．６以上、７．８以上、８．０以上などであってよい。イオン化可能カチオン性脂質と区別するため、常時プラスに荷電されているカチオン性脂質を常時荷電カチオン性脂質と称することがある。
　脂質の別の非限定例としては、WO 2012/170952に記載された常時荷電カチオン性脂質およびＰＥＧ結合脂質（ＰＥＧ－脂質）、WO 2013/185116に記載されたイオン化可能カチオン性脂質などが挙げられる。
　前記常時荷電カチオン性脂質は、式Ｉ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、Ｃ１０～Ｃ１８アルキル、Ｃ１２～Ｃ１８アルケニル、およびオレイル基からなる群から選択され、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキル、およびＣ２～Ｃ６アルカノールからなる群から選択され、Ｘは、－ＣＨ２－、－Ｓ－、および－Ｏ－からなる群から選択されるか、または不在であり、Ｙは、－（ＣＨ２）ｎ、－Ｓ（ＣＨ２）ｎ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎ－、チオフェン、－ＳＯ２（ＣＨ２）ｎ－、およびエステルから選択され、ｎ＝１～４であり、ａ＝１～４であり、ｂ＝１～４であり、ｃ＝１～４であり、Ｚは対イオンである、
で表される化合物である。
　前記常時荷電カチオン性脂質の非限定例としては、例えば、以下のものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　前記ＰＥＧ－脂質の非限定例としては、例えば１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＭＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＯＰＥ）、ＰＥＧセラミドなどが挙げられる。ＰＥＧの分子量は特に限定されず、例えば、約２００～約５０００、約５００～約３０００、約５５０～約２０００、より具体的には、約５５０、約７５０、約１０００、約１２５０、約２０００等であってよい。ＰＥＧの非限定例としては、例えば、ＰＥＧ５５０、ＰＥＧ７５０、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１２５０、ＰＥＧ２０００等が挙げられる。
　前記イオン化可能カチオン性脂質は、式ＩＩ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 　
式中、ｎおよびｍは、独立して、１、２、３または４であり、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｃ１０～Ｃ１８アルキルまたはＣ１２～Ｃ１８アルケニルであり、Ｘは、－ＣＨ２－、Ｓ、Ｏ、Ｎまたは不在であり、Ｌは、Ｃ１～４アルキレン、－Ｓ－Ｃ１～４アルキレン、－Ｏ－Ｃ１～４アルキレン、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ１～４アルキレン、－Ｓ（Ｏ）２－Ｃ１～４アルキレン、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 であるか、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 と一緒になって
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 である、
で表される化合物またはその薬学的に許容し得る塩である。
　前記イオン化可能カチオン性脂質の非限定例としては、例えば、以下のものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　上記脂質の製法はWO 2012/170952およびWO 2013/185116に記載されており、当業者であれば、これらの文献の記載に依拠して上記脂質を製造することができる。
　担体は、１種または２種以上の脂質を含んでいてもよい。一部の態様において、担体は、常時荷電カチオン性脂質とイオン化可能カチオン性脂質とを含む。イオン化可能カチオン性脂質を配合することにより、常時荷電カチオン性脂質による悪影響を低減することができる。特定の態様において、担体は、常時荷電カチオン性脂質、イオン化可能カチオン性脂質に加え、ヘルパー脂質、ＰＥＧ－脂質およびステロールからなる群から選択される脂質を含む。担体に含まれる脂質の組合せの非限定例としては、例えば、脂質Ｐ２および脂質Ｉ８の組合せ、脂質Ｐ２、脂質Ｉ８、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＰＥＧ－ＤＭＰＥの組合せ、ＤＯＤＣ、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＰＥＧ－脂質の組合せ、脂質Ｐ９、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＰＥＧ－脂質の組合せ、ＤＣ－６－１４、ＤＯＰＥおよびコレステロールの組合せなどが挙げられる。担体に含まれる脂質の組合せの特定の非限定例としては、例えば、脂質Ｐ２：脂質Ｉ８（１：１のモル比）、脂質Ｐ２：脂質Ｉ８：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＰＥＧ－ＤＭＰＥ（４：４：６：５：１のモル比）、ＤＯＤＣ：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＰＥＧ－脂質（２５：５：１９：１のモル比）、脂質Ｐ９：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＰＥＧ－脂質（２５：５：１９：１のモル比）、ＤＣ－６－１４：ＤＯＰＥ：コレステロール（４：３：３のモル比）などが挙げられる。
　一態様において、レチノイドまたはレチノイド結合体以外の担体構成成分はポリマーを含む。かかるポリマーの非限定例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）やポリリジン（例えば、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ））などのカチオン性ポリマー（ポリカチオン）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸－グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）などの非カチオン性ポリマーおよび／またはこれらの誘導体をベースとするものが挙げられる。
　本開示における担体は、特定の３次元構造を有してもよい。かかる構造としては、限定されずに、直鎖状または分枝状の線状構造、フィルム状構造、球状構造などが挙げられる。したがって、担体は、限定されずに、デンドリマー、デンドロン、ミセル、リポソーム、エマルジョン、微小球、ナノ小球などの任意の３次元形態を有してもよい。かかる担体の非限定例は、Marcucci and Lefoulon, Drug Discov Today. 2004 Mar 1;9(5):219-28、Torchilin, Eur J Pharm Sci. 2000 Oct;11 Suppl 2:S81-91等から知られている。
　本開示の担体は、カチオン性であっても、非カチオン性（例えば、アニオン性、ノニオン性、電気的に中性）であってもよい。一態様において、担体はカチオン性である。別の態様において、担体は、生理的条件下では電気的に中性（例えば、ゼータ電位が－１０ｍＶ～＋１０ｍＶの範囲）であるが、エンドソーム内などの酸性条件下ではカチオン性となる。本開示の担体は、アルブミンおよび／または低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に対する結合性を有していてもよい。また、担体は、担持する物質とリポプレックスまたはポリプレックスを形成し得るものであってもよい。リポプレックスは、例えば、カチオン性脂質と陰性電荷を有する物質（例えば、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸）との間で、ポリプレックスは、例えば、ポリカチオンと陰性電荷を有する物質との間で、それぞれ形成され得る。
　担体は脂質構造体であってもよい。脂質構造体とは、任意の３次元構造、例えば、線状、フィルム状、球状などの形状を有する、脂質を構成成分として含む構造体を意味し、限定されずに、リポソーム、ミセル、脂質微小球、脂質ナノ小球、脂質エマルジョンなどを包含する。脂質構造体は、例えば、塩や、ショ糖、ブドウ糖、マルトース等の糖類、グリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコールなど、好ましくはショ糖やブドウ糖などの浸透圧調整剤を用いて浸透圧を調整することで、安定化させることができる。また、適度の塩や緩衝液などのｐＨ調整剤を加えることによりｐＨを調整してもよい。したがって、脂質構造体の製造、保存などを、これらの物質を含む媒体中で行うことができる。この場合、浸透圧調整剤の濃度は、血液と等張になるように調整することが好ましい。例えば、ショ糖の場合、媒体中の濃度は、限定されずに、３～１５重量％、好ましくは５～１２重量％、より好ましくは８～１０重量％、特に９重量％であってもよく、ブドウ糖の場合は、媒体中の濃度は、限定されずに、１～１０重量％、好ましくは３～８重量％、より好ましくは４～６重量％、特に５重量％であってもよい。
　本開示の担体へのレチノイドおよび／またはレチノイド結合体の結合または包含は、化学的および／または物理的な方法によってレチノイドおよび／またはレチノイド結合体を担体の他の構成成分に結合させるかまたは包含させることによっても可能となる。または、本開示の担体へのレチノイドおよび／またはレチノイド結合体の結合または包含は、該担体の作製時に、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体と、それ以外の担体構成成分とを混合することによっても可能となる。本開示の担体におけるレチノイドおよび／またはレチノイド結合体の量は、例えば、０．０１～１０００ｎｍｏｌ／μｌ、好ましくは０．１～１００ｎｍｏｌ／μｌとすることが可能である。また、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体と、レチノイドおよびレチノイド結合体以外の担体構成成分とを含む本開示の担体において、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体と、レチノイドおよびレチノイド結合体以外の担体構成成分とのモル比は、限定されずに、例えば、８：１～１：４、または４：１～１：２であってもよい。担体へのレチノイドおよび／またはレチノイド結合体の結合または包含は、該担体に送達物を担持させる前に行ってもよいし、担体、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体、および送達物を同時に混合することなどによって行ってもよいし、または、送達物を既に担持した状態の担体と、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体とを混合することなどによって行ってもよい。したがって、本開示はまた、既存の任意の薬物結合担体や薬物封入担体、例えば、DaunoXome(R)、Doxil、Caelyx(R)、Myocet(R)などのリポソーム製剤にレチノイドおよび／またはレチノイド結合体を結合させる工程を含む、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞に特異的な製剤の製造方法にも関する。
　レチノイドおよび／またはレチノイド結合体の、本開示の担体との結合または包含はまた、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体を、担体の他の成分と、化学的および／または物理的方法によって結合または包含することによっても実現できる。代替的に、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体の、本開示の担体との結合または包含はまた、形成親和性を有するレチノイドおよび／またはレチノイド結合体と担体の基本成分を、担体の調製の間に担体成分中に混合することにより行ってもよい。本開示の担体中に結合または包含されるレチノイドおよび／またはレチノイド結合体の量は、担体成分に対する重量比として、０．０１％～１００％、好ましくは０．２％～２０％、より好ましくは１％～５％であってよい。
　本開示の担体は、例えば、水性および非水性ゲル、クリーム、多重エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性および非水性溶液、ローション、エアゾール、炭化水素基剤および粉末を含んでよく、また可溶化剤、浸透促進剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコールおよびアミノ酸）、および親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）などの賦形剤を含有することができる。一態様において、薬学的に許容し得る担体は、リポソームまたは経皮吸収促進剤である。既知のリポソームの例としては、以下が挙げられる：
・CellFectin、すなわち、カチオン性脂質Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ－テトラメチル－Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ－テトラパルミチル－スペルミンとジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）との、１：１．５（Ｍ／Ｍ）のリポソーム製剤（GIBCO BRL）、
・Cytofectin GSV、すなわち、カチオン性脂質とＤＯＰＥとの２：１（Ｍ／Ｍ）のリポソーム製剤（Glen Research）、
・ＤＯＴＡＰ（Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－アンモニウムメチルスルフェート）（Boehringer Manheim）、
・Lipofectamine、すなわち、ポリカチオン性脂質ＤＯＳＰＡ、中性脂質ＤＯＰＥおよびジアルキル化アミノ酸（ＤｉＬＡ２）の３：１（Ｍ／Ｍ）のリポソーム製剤（GIBCO BRL）、
・Lipotrust、すなわち、Ｏ，Ｏ’－ジテトラデカノイル－Ｎ－（α－トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド（ＤＣ－６－１４、コレステロールおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンの４：３：３（Ｍ／Ｍ）のリポソーム製剤（Hokkaido System Science）。
　本開示はまた、レチノイドを皮膚における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達促進成分として配合する工程を含む、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達用担体の製造方法に関する。レチノイドの配合手法としては、例えば、本明細書に記載の種々の手法を用いることができる。したがって、レチノイドの配合は、化学的および／または物理的な方法によってレチノイドおよび／またはレチノイド結合体を担体の他の構成成分に結合させるかまたは包含させることや、担体の作製時に、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体と、それ以外の担体構成成分とを混合することなどによって行うことができる。レチノイドおよび／またはレチノイド結合体の配合量等は、本開示の担体について既に述べたとおりである。
　本開示の担体の送達物は特に制限されないが、投与部位から標的細胞が存在する病変部位へ、生物の体内を物理的に移動できるような大きさであることが好ましい。したがって、本開示の担体は、原子、分子、化合物、タンパク質、核酸等の物質はもとより、ベクター、ウイルス粒子、細胞、１以上の要素で構成された薬物放出システム、マイクロマシン等の物体をも運搬することができる。前記送達物は、好ましくは標的細胞に何らかの影響を与える性質を有し、例えば、標的細胞を標識するものや、標的細胞の活性または増殖を制御する（例えば、これを増強または抑制する）ものを含む。
　したがって、本開示の一態様において、担体の送達物は「皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物」を含む。ここで、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性とは、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞が示す分泌、取り込み、遊走等の種々の活性を指すが、本開示においては、典型的に、これらのうち特に皮膚線維症の発症、進行および／または再発などに関与する活性を意味する。かかる活性としては、例えば、限定することなく、コラーゲン、プロテオグリカン、テネイシン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、オステオポンチン、オステオネクチン、エラスチン等の細胞外マトリックス成分などの産生・分泌、および、これらの細胞外マトリックス成分の分解活性の抑制などが挙げられる。
　したがって、本開示において、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物とは、皮膚線維症の発症、進行および／または再発に関係する同細胞の物理的、化学的および／または生理的な作用等を直接または間接に抑制するいずれの薬物であってもよく、限定されずに、上記細胞外マトリックス成分などの産生・分泌を阻害する物質、細胞増殖抑制物質、アポトーシス誘導物質、ＴＩＭＰ(Tissue inhibitor of metalloproteinase)阻害物質等を包含する。
　細胞外マトリックス成分などの産生・分泌を阻害する物質としては、限定されずに、例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、テネイシン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、オステオポンチン、オステオネクチン、エラスチン等の細胞外マトリックス成分の発現を抑制する、干渉核酸、リボザイム、アンチセンス核酸などの物質、もしくはドミナントネガティブ変異体等のドミナントネガティブ効果を有する物質、これらを発現するベクター、およびこれらで形質転換された細胞等が挙げられる。上記細胞外マトリックス成分のうち、コラーゲンの産生・分泌を阻害する薬物としてはさらに、限定することなく、例えば、様々なタイプのコラーゲンの合成過程で共通する細胞内輸送および分子成熟化に必須のコラーゲン特異的分子シャペロンであるＨＳＰ４７の阻害物質、例えば、ＨＳＰ４７に対する干渉核酸、リボザイム、アンチセンス核酸などのＨＳＰ４７発現阻害物質、もしくはＨＳＰ４７のドミナントネガティブ変異体等のドミナントネガティブ効果を有する物質、これらを発現するベクター、およびこれらで形質転換された細胞等などが挙げられる。
　細胞増殖抑制物質としては、限定されずに、例えば、イホスファミド、ニムスチン（例えば、塩酸ニムスチン）、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、ラニムスチン等のアルキル化剤、ゲムシタビン（例えば、塩酸ゲムシタビン）、エノシタビン、シタラビン・オクホスファート、シタラビン製剤、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤（例えば、ＴＳ－１）、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン等の代謝拮抗剤、イダルビシン（例えば、塩酸イダルビシン）、エピルビシン（例えば、塩酸エピルビシン）、ダウノルビシン（例えば、塩酸ダウノルビシン、クエン酸ダウノルビシン）、ドキソルビシン（例えば、塩酸ドキソルビシン）、ピラルビシン（例えば、塩酸ピラルビシン）、ブレオマイシン（例えば、塩酸ブレオマイシン）、ペプロマイシン（例えば、硫酸ペプロマイシン）、ミトキサントロン（例えば、塩酸ミトキサントロン）、マイトマイシンＣ等の抗腫瘍性抗生物質、エトポシド、イリノテカン（例えば、塩酸イリノテカン）、ビノレルビン（例えば、酒石酸ビノレルビン）、ドセタキセル（例えば、ドセタキセル水和物）、パクリタキセル、ビンクリスチン（例えば、硫酸ビンクリスチン）、ビンデシン（例えば、硫酸ビンデシン）、ビンブラスチン（例えば、硫酸ビンブラスチン）等のアルカロイド、アナストロゾール、タモキシフェン（例えば、クエン酸タモキシフェン）、トレミフェン（例えば、クエン酸トレミフェン）、ビカルタミド、フルタミド、エストラムスチン（例えば、リン酸エストラムスチン）等のホルモン療法剤、カルボプラチン、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、ネダプラチン等の白金錯体、サリドマイド、ネオバスタット、ベバシズマブ等の血管新生阻害剤、Ｌ－アスパラギナーゼなどが挙げられる。
　アポトーシス誘導物質としては、限定することなく、例えば、compound 861、グリオトキシン、アトルバスタチンなどが挙げられる。
　ＴＩＭＰ（例えば、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３など）の阻害物質としては、限定することなく、例えば、ＴＩＭＰに対する抗体などのＴＩＭＰ活性阻害物質、ＴＩＭＰに対する干渉核酸、リボザイム、アンチセンス核酸などのＴＩＭＰ産生阻害物質、これらを発現するベクター、およびこれらで形質転換された細胞等が挙げられる。
　また、本開示における「皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物」は、皮膚線維症の発症、進行および／または再発の抑制に直接または間接に関係する皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の物理的、化学的および／または生理的な作用等を直接または間接に促進する何れの薬物であってもよい。
　本開示の担体は、上記薬物の１種または２種以上を送達することができる。
　本開示における干渉核酸は、ｓｉＲＮＡ(small interfering RNA)、ｍｉＲＮＡ(micro RNA)、ｓｈＲＮＡ(short hairpin RNA)、ｐｉＲＮＡ(Piwi-interacting RNA)、ｒａｓｉＲＮＡ(repeat associated siRNA)などの二重鎖ＲＮＡおよびこれらの改変体を含む。本開示における核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの複合物を含む。
　核酸は、既知の種々の修飾を有してもよい。修飾により、核酸の安定性の向上といった有益な特性を提供ことができる。修飾は、核酸の種々の部分、例えば、糖、核酸塩基、リン酸基およびホスホジエステル骨格などの１または２以上の部分におけるものであってよい。修飾糖部分の非限定例としては、２’－Ｏ－メチル、２’－メトキシエトキシ、２’－デオキシ、２’－フルオロ、２’－アリル、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］、４’チオ、４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’架橋、２’ロックド核酸、および２’－Ｏ－（Ｎ－メチルカルバメート）などが挙げられる。修飾核酸塩基の非限定例としては、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、５－ハロウラシルおよび５－ハロシトシン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシンおよび６－アゾチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよびアシクロヌクレオチドなどが挙げられる。ホスホジエステル骨格への修飾の非限定例としては、ホスホジエステル結合の、ホスホロチオエート、３’－（または－５’）デオキシ－３’－（または－５’）チオ－ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、３’－（または－５’）デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、３’－（または－５’）デオキシ－３’－（または５’－）アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノリン酸エステル、ホスホルアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルまたはリン結合などによる置換が挙げられる。
　本開示の担体の送達物としてはまた、限定されずに、皮膚線維症の発症、進行および／または再発を抑制する上記以外の薬物、例えば、限定することなく、ＴＧＦ－β１阻害剤（抗ＴＧＦ－β１抗体、ＴＧＦ－β１ワクチンなどを包含する）、ペントキシフィリンおよびその代謝物、カルシウムチャネルブロッカー（ニフェジピンなど）、プロスタノイド受容体アゴニスト（イロプロストなど）、ＡＣＥ阻害剤（カプトプリル、エナラプリルなど）、エンドセリン受容体阻害剤（ボセンタンなど）、ＰＤＥ－５阻害剤（シルデナフィルなど）、インターフェロンγ、ＣＤ２０阻害剤（抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブなど）、抗ＴＮＦα抗体（インフリキシマブなど）、ｍＴＯＲ阻害剤（シロリムス、エベロリムスなど）、サリドマイド、ヒドロキシクロロキン、タクロリムス、免疫抑制剤（ステロイド、アザチオプリン、シクロホスファミド、メトトレキサート、シクロスポリン、Ｄ－ペニシラミンなど）などを挙げることができる。これらの薬物はまた、後述の本開示の組成物と併用することもできる。ここで、「併用」とは、本開示の組成物と、上記薬物とを実質的に同時に投与すること、および、同じ処置期間内で時間的に間隔を空けて投与することを含む。前者の場合、本開示の組成物は上記薬物と混合して投与しても、混合せずに連続的に投与してもよい。後者の場合、本開示の組成物は上記薬物の前に投与しても後に投与してもよい。
　本開示の一態様において、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物としては、ＨＳＰ４７の阻害剤、例えば、ＨＳＰ４７に対する干渉核酸などが挙げられる。ＨＳＰ４７に対する干渉核酸の非限定例は、WO 2011/072082等に記載されている。
　一部の態様において、ＨＳＰ４７に対する干渉核酸は、構造（Ａ１）：
　５’　　　　（Ｎ）ｘ－Ｚ　　　　３’（アンチセンス鎖）
　３’　Ｚ’－（Ｎ’）ｙ－ｚ’’　５’（センス鎖）
ここで、各々のＮおよびＮ’は非修飾であっても、修飾されていてもよいヌクレオチドであるか、非定型部分であり、
各々の（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、各々の連続するＮまたはＮ’が次のＮまたはＮ’に共有結合的に連結されたオリゴヌクレオチドであり、
各々のＺおよびＺ’は、独立して、存在するか、不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した１～５個の連続したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分またはその組合せを含み、
ｚ’’は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分であり、
ｘおよびｙの各々は、独立して１８～４０の間の整数であり、
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に相補性を有し、（Ｎ）ｘは、ＨＳＰ４７をコードするｍＲＮＡに対するアンチセンス配列を含む、
を有する二本鎖核酸である。
　特定の態様において、ＨＳＰ４７に対する干渉核酸は、構造（Ａ２）：
　５’　　　Ｎ１－（Ｎ）ｘ－Ｚ　　　３’（アンチセンス鎖）
　３’　Ｚ’－Ｎ２－（Ｎ’）ｙ－ｚ’’　５’（センス鎖）
ここで、Ｎ２、ＮおよびＮ’の各々は、非修飾リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドまたは非定型部分であり、
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの各々は、各々の連続するＮまたはＮ’が隣接するＮまたはＮ’に共有結合によって連結したオリゴヌクレオチドであり、
ｘとｙの各々は、独立して１７～３９の間の整数であり、
（Ｎ’）ｙの配列は（Ｎ）ｘの配列に相補性を有し、（Ｎ）ｘは、ＨＳＰ４７をコードするｍＲＮＡの連続する配列に相補性を有し、
Ｎ１は（Ｎ）ｘに共有結合的に結合しており、ＨＳＰ４７をコードするｍＲＮＡに対してミスマッチであるか、または、標的ＲＮＡに対する相補的ＤＮＡ部分であり、
Ｎ１は、天然または修飾ウリジン、デオキシリボウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシンまたはデオキシアデノシンからなる群から選択される部分であり、
ｚ’’は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合はＮ２－（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分であり、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した、１～５個の連続するヌクレオチド、連続する非ヌクレオチド部分またはその組合せである
を有する二本鎖核酸である。
　上記の構造（Ａ１）および（Ａ２）における非定型部分は、限定されずに、例えば、非ヌクレオチド部分（例えば、無塩基部分、逆位無塩基部分（逆位無塩基デオキシリボース部分、逆位無塩基リボース部分など）、炭化水素（アルキル）部分（非ヌクレオチドＣ３、Ｃ４またはＣ５部分など）、これらの誘導体など）、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ミラーヌクレオチド（Ｌ－ＤＮＡ、Ｌ－ＲＮＡなど）、非塩基対ヌクレオチドアナログ、２’５’ヌクレオチド間リン酸結合で隣接するヌクレオチドと連結したヌクレオチド、架橋核酸（ＬＮＡ、エチレン架橋核酸など）、結合修飾ヌクレオチド（ＰＡＣＥなど）および塩基修飾ヌクレオチドからなる群から選択される部分を含む。
　上記の構造（Ａ１）および（Ａ２）におけるキャッピング部分は、（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に連結できる部分を含み、限定されずに、例えば、無塩基リボース部分、無塩基デオキシリボース部分、無塩基リボースおよび無塩基デオキシリボース部分の修飾体（２’Ｏアルキル修飾体を含む）、逆位無塩基リボースおよび無塩基デオキシリボース部分およびその修飾体、Ｃ６－イミノ－Ｐｉ、Ｃ６－アミノ－Ｐｉ、ミラーヌクレオチド（Ｌ－ＤＮＡ、Ｌ－ＲＮＡなど）、５’ＯＭｅヌクレオチド、および、ヌクレオチドアナログ、例えば、４’，５’－メチレンヌクレオチド、１－（β－Ｄ－エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、５’－アミノ－アルキルホスフェート、１，３－ジアミノ－２－プロピルホスフェート、３－アミノプロピルホスフェート、６－アミノヘキシルホスフェート、１２－アミノドデシルホスフェート、ヒドロキシプロピルホスフェート、１，５－アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、アルファ－ヌクレオチド、トレオ－ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’－セコヌクレオチド、３，４－ジヒドロキシブチルヌクレオチド、３，５－ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’５’－逆位無塩基部分、１，４－ブチレングリコールホスフェート、５’－アミノおよび架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’－メルカプト部分を含む。
　上記の構造（Ａ１）および（Ａ２）における非ヌクレオチド部分は、限定されずに、例えば、無塩基部分、例えばデオキシリボ無塩基部分（本明細書において「ｄＡｂ」と称することがある）またはリボ無塩基部分（本明細書において「ｒＡｂ」と称することがある）、２個の共有結合的に（好ましくはリン酸ベースの結合を介して）連結した無塩基部分（例えば、ｄＡｂ－ｄＡｂまたはｒＡｂ－ｒＡｂまたはｄＡｂ－ｒＡｂまたはｒＡｂ－ｄＡｂ）、アルキル部分（任意にプロパン［（ＣＨ２）３］部分（Ｃ３）、または、プロパノール（Ｃ３ＯＨ）およびプロパンジオール（「Ｃ３Ｐｉ」）を含むその誘導体）が挙げられる。いくつかの態様において、リン酸ベースの結合は、ホスホロチオエート、ホスホノアセテートまたはホスホジエステル結合を含む。いくつかの態様において、非ヌクレオチド部分は、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５またはＣ６アルキル部分、任意に、Ｃ３［プロパン、－（ＣＨ２）３－］部分、または、プロパノール（Ｃ３ＯＨ）、プロパンジオール、およびプロパンジオールのホスホジエステル誘導体（「Ｃ３Ｐｉ」）を含むその誘導体を含む。
　種々の態様において、アルキル部分は、末端ヒドロキシル基、末端アミノ基または末端リン酸基を含む、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキルまたはＣ６アルキル部分を含むアルキル誘導体を含む。いくつかの態様において、アルキル部分は、Ｃ３アルキルまたはＣ３アルキル誘導体部分である。いくつかの態様において、Ｃ３アルキル部分は、プロパノール、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエートまたはこれらの組合せを含む。いくつかの態様において、非ヌクレオチド部分は、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエート、プロピルホスホ－プロパノール、プロピルホスホ－プロピルホスホロチオエート、プロピルホスホ－プロピルホスフェート、（プロピルホスフェート）３、（プロピルホスフェート）２－プロパノール、（プロピルホスフェート）２－プロピルホスホロチオエートから選択される。
　一態様において、上記の構造（Ａ１）および（Ａ２）におけるＨＳＰ４７をコードするｍＲＮＡは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有する。
　構造（Ａ１）におけるアンチセンス鎖とセンス鎖との組合せの非限定例を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　構造（Ａ２）におけるアンチセンス鎖とセンス鎖との組合せの非限定例を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　より具体的な態様において、構造（Ａ１）および／または（Ａ２）を有する核酸（構造（Ａ１）においてｘ＝ｙ＝１９、構造（Ａ２）においてｘ＝ｙ＝１８）は、以下の修飾の組合せを含む。
　組合せ１：センス鎖が、３’末端の１５、１６、１７、１８および１９位（５’＞３’）における５個の連続する２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ部分および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基部分を含み、アンチセンス鎖が、１、３、５、９、１１、１３、１５、１７および１９位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ－Ｃ３ＯＨ部分を含む。
　組合せ２：センス鎖が、２、１４および１８位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖が、１、３、５、９、１２、１３および１７位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’５’リボヌクレオチドおよび３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ－Ｃ３ＯＨ部分を含む。
　組合せ３：センス鎖が、１５、１６、１７、１８および１９位（５’＞３’）における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖が、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’５’リボヌクレオチドおよび３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ－Ｃ３ＯＨ部分を含む。
　組合せ４：センス鎖が、４、１１、１３および１７位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、９位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖が、１、４、８、１１および１５位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６位における２’５’リボヌクレオチドおよび３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ－Ｃ３ＯＨ部分を含む。
　組合せ５：センス鎖が、７、１３、１６および１８位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、９位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基部分を含み、アンチセンス鎖が、１、３、５、９、１１、１３、１５、１７および１９位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ－Ｃ３ＯＨ部分を含む。
　組合せ６：センス鎖が、１５、１６、１７、１８および１９位（５’＞３’）における５個の連続する２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ部分および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基部分を含み、アンチセンス鎖が、１、３、５、９、１１、１３、１５、１７および１９位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ－Ｃ３ＯＨ部分を含む。
　組合せ７：センス鎖が、２、１４および１８位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖が、１、３、５、９、１１、１３および１７位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’５’リボヌクレオチドおよび３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ－Ｃ３ＯＨ部分を含む。
　組合せ８：センス鎖が、４、１１、１３および１７位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖が、１、４、８、１３および１５位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６位における２’５’リボヌクレオチドおよび３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ－Ｃ３ＯＨ部分を含む。
　組合せ９：センス鎖が、２、４、１１、１３および１７位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖が、１、４、８、１１および１５位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６位における２’５’リボヌクレオチドおよび３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ－Ｃ３ＯＨ部分を含む。
　上記組合せにおいて、Ｃ３Ｐｉ部分はプロピルホスフェート、Ｃ３ＯＨ部分はプロパノール、Ｃ３Ｐｉ－Ｃ３ＯＨ部分はプロピルホスホプロパノールを表す。特定の態様において、上記各部分は以下の構造を有する。左端のリン酸基は、核酸の３’末端に結合したリン酸基を表す。また、本開示において、核酸の「３’末端」は、５’末端とは反対側の末端を意味する。したがって、例えば、５’末端とは反対側の末端のヌクレオチドが、さらなる化学的部分との結合を可能にするリン酸基を３’位ではなく２’位に有する場合、かかる化学的部分は実際には核酸の２’末端に結合することになるが、本開示においてはこのような場合であっても便宜的に３’末端に結合すると表現することとする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　特定の態様において、ＨＳＰ４７に対する干渉核酸は、以下の構造を有する。
　構造１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 上記構造中、アンチセンス鎖（配列番号１７）は、１、３、５、９、１１、１５、１７および１９位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’５’リボヌクレオチドを含み、ＺはＣ３Ｐｉ－Ｃ３ＯＨ部分であり、センス鎖（配列番号１６）は、１５、１６、１７、１８および１９位（５’＞３’）における２’５’リボヌクレオチドを含み、Ｚ’はＣ３Ｐｉ部分であり、ｚ’’は逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分である。
　構造２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 上記構造中、アンチセンス鎖（配列番号２５）は、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’５’リボヌクレオチドを含み、ＺはＣ３Ｐｉ－Ｃ３ＯＨであり、センス鎖（配列番号２４）は、１５、１６、１７、１８および１９位（５’＞３’）における２’５’リボヌクレオチドを含み、Ｚ’はＣ３ＯＨ部分であり、ｚ’’は逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分である。
　構造３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 上記構造中、アンチセンス鎖（配列番号２７）は、１、４、８、１１および１５位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６位における２’５’リボヌクレオチドを含み、ＺはＣ３Ｐｉ－Ｃ３ＯＨ部分であり、センス鎖（配列番号２６）は、４、１１、１３および１７位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、９位における２’５’リボヌクレオチドを含み、Ｚ’はＣ３ＯＨ部分であり、ｚ’’は逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分である。
　本開示の担体が送達する物質や物体は、標識されていてもいなくてもよい。標識化により、標的細胞への送達の成否や、標的細胞の増減などをモニタリングすることが可能となり、特に試験・研究レベルのみならず、臨床レベルにおいても有用である。標識は、当業者に公知な任意のもの、例えば、任意の放射性同位体、磁性体、気体もしくは生理条件下で気体を発生する物質、核磁気共鳴する元素（例えば、水素、リン、ナトリウム、フッ素等）、核磁気共鳴する元素の緩和時間に影響を与える物質（例えば、金属原子もしくはこれを含む化合物）、標識化物質に結合する物質（例えば抗体など）、蛍光物質、フルオロフォア、化学発光物質、ビオチンもしくはその誘導体、アビジンもしくはその誘導体、酵素などから選択することができる。標識はまた、担体構成成分に付してもよいし、独立した送達物として担体に担持させてもよい。
　本開示において「皮膚における細胞外マトリックス産生細胞用」または「皮膚における細胞外マトリックス産生細胞送達用」とは、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞を標的細胞として使用するのに適することを意味し、これは例えば、同細胞に、他の細胞、例えば正常細胞よりも迅速、高効率かつ／または大量に物質を送達できることを含む。例えば、本開示の担体は、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞に、他の細胞に比べ、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．５倍以上、２倍以上、さらには３倍以上の速度および／または効率で物質を送達することができる。本開示において「送達」は、送達物を目的の細胞に取り込ませるステップ、および、細胞に取り込まれた送達物を細胞の作用部位に到達させるステップを含む一連の過程を包含し、送達の促進は、これらのステップのいずれか１つ以上の促進を意味する。送達物を目的の細胞に取り込ませるステップは、限定されずに、送達物のエンドサイトーシス、ピノサイトーシスなどによる取り込みを含む。細胞に取り込まれた送達物を細胞の作用部位に到達させるステップは、限定されずに、エンドソーム脱出、細胞内の特定の部位（例えば、細胞核、細胞質、細胞膜、ミトコンドリアなど）への移行などを含む。
　送達の促進は、送達の個々のステップにおける送達物の挙動や、送達の最終的な結果としての送達物の作用を、送達促進成分を含まない同様の担体によるものと比較することなどにより評価することができる。例えば、細胞内への取り込みは、検出可能な標識を付した送達物の経時的な位置の変化を観察することなどにより、エンドソーム脱出は、エンドソームを特異的に染色した細胞における、検出可能な標識を付した送達物とエンドソームとの経時的な位置関係の変化を観察することなどにより、それぞれ評価することができる。また、送達物の作用は、送達物に応じた手法で評価することができる。例えば、送達物が特定の遺伝子に対する阻害性核酸である場合は、その遺伝子の発現レベルを決定することで、その作用を評価することができる。促進の程度は特に限定されず、送達促進成分を含まない同様の担体より例えば、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上の促進であってよい。
　本開示はまた、前記担体と、前記皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物とを含む、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御するための、皮膚線維症またはＧＶＤＨによる線維化を処置するための、または線維化皮膚組織から正常皮膚組織を再生するための組成物、ならびに、前記担体の、これらの組成物の製造への使用に関する。本開示の組成物の一態様は、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達を促進するための有効量のレチノイドを含む。また、本開示の組成物の一態様は、レチノイドによって皮膚における細胞外マトリックス産生細胞に対する物質送達が促進される。
　本開示における皮膚線維症は、皮膚における細胞外マトリックス（例えば、コラーゲンなど）の過剰な蓄積を特徴とする病態を指し、限定されずに、例えば、偶発的および医原性（手術）の全ての可能な種類の皮膚損傷（外傷、術創、熱傷（化学熱傷、熱による熱傷または放射線熱傷を含む）、皮膚移植など）に関連する異常な瘢痕形成（肥厚性瘢痕、ケロイドなど）、強皮症（全身性強皮症、斑状強皮症など）、皮膚ＧＶＨＤ、デュピュイトラン拘縮、表皮水疱症、薬物（例えば、タキサン、ブレオマイシンなど）誘導性皮膚線維症、拘束性皮膚障害などの皮膚疾患や、晩発性皮膚ポルフィリン症、腎性全身性線維症、好酸球増加筋痛症候群、毒性油症候群などの疾患に伴う皮膚線維化などを含む。本開示におけるＧＶＨＤによる線維化は、皮膚のみならず、各種臓器（肺、肝臓など）における線維化を包含する。
　皮膚ＧＶＨＤは、ＧＶＨＤに伴う皮膚症状であり、ｃＧＶＨＤを有する対象で発症することが多い。ＧＶＨＤは、造血器腫瘍（例えば、急性骨髄性白血病、急性前骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病などの白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫、多発性骨髄腫等）や固形腫瘍（特に転移性の固形腫瘍）などの腫瘍性疾患、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、再生不良性貧血などの処置の一環として行われる同種造血幹細胞移植後に、ドナーの白血球等がレシピエントの組織（特に正常組織）を攻撃することにより生じることのある病態であり、重篤化すると致死的となり得る。一方で、ＧＶＨＤは、移植されたドナーの細胞が定着に成功したことを示す現象でもある。造血幹細胞移植を伴う腫瘍の治療には、移植の前に通常、放射線および／または化学療法剤などによる腫瘍の処置（移植前処置）が行われる。移植前処置は、対象とする腫瘍を可能な限り根絶することが望ましいといえるが、高齢対象（例えば、５５歳以上、６０歳以上、６５歳以上、７０歳以上、７５歳以上などのヒト対象）や、他の合併症（例えば、糖尿病、腎疾患、心疾患など）を患っている対象などにおいては、骨髄破壊的前処置などの強力な前処置は負担が大きいため、骨髄非破壊的前処置（ＮＭＡＣ）や強度減弱型前処置（ＲＩＣ）などの、より強度の低い前処置が適用されることがある。
　これらの低強度前処置を腫瘍性疾患に適用する場合、腫瘍細胞が根絶されない可能性が高いため、移植したドナーの細胞が残存する腫瘍細胞を攻撃し、これを排除する、移植片対白血病（ＧＶＬ）効果や移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果が重要となる。したがって、ＧＶＬ／ＧＶＴ効果を可能な限り損なわずに、ＧＶＨＤの悪影響を抑制することが、低強度前処置の適応となる対象にとっては特に有益である。本開示の組成物は、ＧＶＬ／ＧＶＴ効果の源泉であるドナー由来の免疫細胞に有意な影響を与えないことが示されているため、低強度前処置後のＧＶＨＤ（特に皮膚ＧＶＨＤ）の処置や、低強度前処置後のＧＶＨＤ（特に皮膚ＧＶＨＤ）を発症した対象の処置などに、特に有用である。本開示の一態様において、皮膚線維症は、低強度前処置後のＧＶＨＤ、特に低強度前処置後の皮膚ＧＶＨＤである。より特定の態様において、皮膚線維症は、腫瘍性疾患に対する低強度前処置後のＧＶＨＤ、特に腫瘍性疾患に対する低強度前処置後の皮膚ＧＶＨＤである。
　一態様において、本開示は、前記担体と、前記皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物とを含む、皮膚ＧＶＨＤを処置するための組成物に関する。一部の態様において、前記組成物は低強度前処置後の同種造血幹細胞移植により生じた皮膚ＧＶＨＤを処置するための組成物である。特定の態様において、前記組成物は、高齢者または合併症罹患者において低強度前処置後の同種造血幹細胞移植により生じた皮膚ＧＶＨＤを処置するための組成物である。別の特定の態様において、前記組成物は、低強度前処置後の同種造血幹細胞移植により生じた皮膚ＧＶＨＤを、ドナー由来の免疫細胞に有意な影響を与えずに処置するための組成物である。別の特定の態様において、前記組成物は、腫瘍性疾患に対する低強度前処置後の同種造血幹細胞移植により生じた皮膚ＧＶＨＤを処置するための組成物である。より特定の態様において、前記組成物は、（ｉ）高齢者または合併症罹患者において低強度前処置後の同種造血幹細胞移植により生じた皮膚ＧＶＨＤを、ドナー由来の免疫細胞に有意な影響を与えずに処置するための、（ｉｉ）高齢者または合併症罹患者において、腫瘍性疾患に対する低強度前処置後の同種造血幹細胞移植により生じた皮膚ＧＶＨＤを処置するための、（ｉｉｉ）腫瘍性疾患に対する低強度前処置後の同種造血幹細胞移植により生じた皮膚ＧＶＨＤを、ドナー由来の免疫細胞に有意な影響を与えずに処置するための、または（ｖｉ）高齢者または合併症罹患者において、腫瘍性疾患に対する低強度前処置後の同種造血幹細胞移植により生じた皮膚ＧＶＨＤを、ドナー由来の免疫細胞に有意な影響を与えずに処置するための組成物である。
　別の態様において、本開示は、前記担体と、前記皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物とを含む、ＧＶＨＤに伴う線維化を処置するための組成物に関する。一部の態様において、前記組成物は、低強度前処置後の同種造血幹細胞移植により生じたＧＶＨＤに伴う線維化を処置するための組成物である。特定の態様において、前記組成物は、高齢者または合併症罹患者において低強度前処置後の同種造血幹細胞移植により生じたＧＶＨＤに伴う線維化を処置するための組成物である。別の特定の態様において、前記組成物は、低強度前処置後の同種造血幹細胞移植により生じたＧＶＨＤに伴う線維化を、ドナー由来の免疫細胞に有意な影響を与えずに処置するための組成物である。別の特定の態様において、前記組成物は、腫瘍性疾患に対する低強度前処置後の同種造血幹細胞移植により生じたＧＶＨＤに伴う線維化を処置するための組成物である。より特定の態様において、前記組成物は、（ｉ）高齢者または合併症罹患者において低強度前処置後の同種造血幹細胞移植により生じたＧＶＨＤに伴う線維化を、ドナー由来の免疫細胞に有意な影響を与えずに処置するための、（ｉｉ）高齢者または合併症罹患者において、腫瘍性疾患に対する低強度前処置後の同種造血幹細胞移植により生じたＧＶＨＤに伴う線維化を処置するための、（ｉｉｉ）腫瘍性疾患に対する低強度前処置後の同種造血幹細胞移植により生じたＧＶＨＤに伴う線維化を、ドナー由来の免疫細胞に有意な影響を与えずに処置するための、または（ｖｉ）高齢者または合併症罹患者において、腫瘍性疾患に対する低強度前処置後の同種造血幹細胞移植により生じたＧＶＨＤに伴う線維化を、ドナー由来の免疫細胞に有意な影響を与えずに処置するための組成物である。これらの態様において、ＧＶＨＤに伴う線維化は、皮膚以外の組織、例えば肝臓、肺などにも生じ得る。また、ＧＶＨＤに伴う線維化を処置するための組成物は、全身投与製剤（例えば、静脈内投与製剤など）であってよい。
　本開示において、「線維化皮膚組織から正常皮膚組織を再生する」とは、線維化によって変質した皮膚組織を、少なくとも線維化がより軽度であった状態、より好ましくは線維化が生じる前の状態に回復させることを意味する。すなわち、皮膚線維化が進むにつれ、皮膚組織は細胞外マトリックスを中心とした線維組織に置換されていくが、この流れを逆転させ、増生した線維組織を本来の正常組織に置換していくことが、本開示における線維化皮膚組織からの正常皮膚組織の再生である。したがって、本開示における線維化皮膚組織からの正常皮膚組織の再生は、線維化皮膚組織を完全に元の状態に回復させることばかりでなく、線維化皮膚組織を部分的に元の状態に回復させることも含む。正常皮膚組織の再生の程度は、生検試料などの組織学的検査により、組織構造の正常化、線維組織が占める領域の縮小、正常組織が占める領域の拡大などに基づいて評価してもよいし、本組成物による処置の前に線維化に起因する生化学的指標等の異常が認められている場合には、当該指標等の改善などによって評価してもよい。
　本開示の組成物においては、担体は、送達物をその内部に含んでも、送達物の外部に付着して存在しても、また、送達物と混合されていてもよい。したがって、投与経路や薬物放出様式などに応じて、上記組成物を、適切な材料、例えば、腸溶性のコーティングや、時限崩壊性の材料で被覆してもよく、また、適切な薬物放出システムに組み込んでもよい。さらに、本開示の組成物は、レチノイドを含む脂質担体と送達物との複合体、すなわちリポプレックスの形態をとってもよい。また、担体がレチノイドおよび／またはレチノイド結合体のみで構成される場合には、本開示の組成物は、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物とレチノイドおよび／またはレチノイド結合体との複合体の形態をとってもよい。
　本開示の組成物は医薬として使用することができ（すなわち医薬組成物）、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、肺内、気道内、気管内、気管支内、経鼻、経胃、経腸、直腸内、動脈内、門脈内、心室内、骨髄内、リンパ節内、リンパ管内、脳内、髄液腔内、脳室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる。
　例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。経皮投与に適した剤形としては、軟膏、クリーム、乳剤、貼付剤、パップ剤などが挙げられる。経皮投与製剤は、経皮吸収促進剤などの、経皮投与に有用な成分を含んでいてもよい。
　本開示はまた、レチノイドを皮膚における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達促進成分として、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物を有効成分としてそれぞれ配合する工程を含む、皮膚線維症もしくはＧＶＨＤによる線維化を処置するための医薬組成物または線維化皮膚組織から正常皮膚組織を再生するための組成物の製造方法に関する。レチノイドおよび／またはレチノイド結合体の配合手法は、配合された組成物においてレチノイドおよび／またはレチノイド結合体が皮膚における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達促進成分として機能できれば特に限定されないが、例えば、本明細書に記載の種々の手法を用いることができる。また、有効成分の配合手法も、有効成分が所定の効果を奏することができれば特に限定されず、任意の公知の手法を用いることができる。有効成分の配合は、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体と同時に行ってもよいし、レチノイドを配合する前、または配合した後に行ってもよい。例えば、組成物がレチノイドおよびレチノイド結合体以外の担体構成成分を含む場合、有効成分の配合は、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体が物質送達促進成分として既に配合された担体と有効成分とを混合することなどによって行ってもよいし、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体、レチノイドおよびレチノイド結合体以外の担体構成成分および有効成分を同時に混合することなどによって行ってもよいし、または、有効成分をレチノイドおよびレチノイド結合体以外の担体構成成分に配合した後に、これとレチノイドおよび／またはレチノイド結合体とを混合することなどによって行ってもよい。
　レチノイドの配合量等は、本開示の担体について既に述べたとおりである。また、有効成分の配合量は、組成物として投与された場合に、皮膚線維症もしくはＧＶＨＤによる線維化の発症や再発を抑制し、病態を改善し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止し得る量、好ましくは、皮膚線維症もしくはＧＶＨＤによる線維化の発症および再発を予防し、またはこれを治癒し得る量、あるいは、線維化皮膚組織から正常皮膚組織を再生し得る量であってもよい。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は公知であるか、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。皮膚線維症のモデル動物としては、例えば強皮症モデルとしての、Asano et al., Curr Rheumatol Rep. (2013) 15:382に記載のもの（例えば、ＲＯＳ（reactive oxygen species）誘発ＳＳ（systemic sclerosis）モデル、ＴｏｐｏＩ（DNA topoisomerase I）およびＣＦＡ（complete Freund's adjuvant）誘発ＳＳモデル、Ａｎｇ　ＩＩ（angiotensin II）誘発ＳＳモデルやＦｒａ－２（Fos-related antigen 2）トランスジェニックマウス、Ｆｌｉ１（Friend leukemia virus integration 1)ΔＣＴＡ(c-terminal activation domain)／ΔＣＴＡモデルなど）が挙げられる。皮膚ＧＶＨＤを伴うＧＶＨＤのモデル動物としては、限定されずに、マイナー組織適合抗原ミスマッチ移植モデル（Ｂ１０.Ｄ２マウスからＢＡＬＢ／ｃマウスへの、骨髄細胞、脾臓細胞などの移植）などが挙げられる。有効成分の配合量は、組成物の投薬態様によって変化し得る。例えば、１回の投与に複数の単位の組成物を用いる場合、組成物１単位に配合する有効成分の量は、１回の投与に必要な有効成分の量の複数分の１とすることができる。かかる配合量の調整は当業者が適宜行うことができる。例えば、１日あたり体重１キログラムにつき約０．１ｍｇ～約１４０ｍｇ程度の投与量レベルは、上記状態の処置に有用である（１日あたり１対象につき約０．５ｍｇ～約７ｇ）。単一の投薬形態を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される宿主と、具体的な投与方法によって異なる。投薬単位形態は、一般的に、約１ｍｇ～約５００ｍｇの活性成分を含む。
　任意の特定の対象のための具体的な用量レベルは、使用する具体的な化合物の活性、年齢、体重、一般健康状態、性別、食事、投与、投与時間、投与経路、および排出速度、併用薬剤および治療を受けている特定の疾患の重篤度を含む種々の要因に依存することが理解される。
　本開示に係る医薬組成物は、１日１回、ｑｉｄ、ｔｉｄ、ｂｉｄ、または、医学的に適切な任意の間隔で、任意の期間投与することができる。しかし、治療剤はまた、１日を通して適切な間隔で投与される、２、３、４、５、６または７以上の下位用量を含む投薬単位で投薬することもできる。その場合、各々の下位用量に含まれる有効成分は、１日の合計投薬単位を達成するために、対応してより少なくてもよい。投薬単位はまた、例えば、数日間にわたって有効成分の持続的な一定の放出をもたらす従来の徐放製剤を用いて、数日にわたる単一の用量のために組み合わせることができる。徐放製剤は当該技術分野において周知である。投薬単位は、対応する複数の一日量を含んでもよい。組成物は、有効成分の複数の単位の合計が一緒になって十分な用量を含むように、組み合わせることができる。
　本開示の担体または組成物は、凍結乾燥された状態で提供されてもよい。本開示の担体または組成物を凍結乾燥する際には、凍結乾燥保護剤を利用してもよい。凍結乾燥保護剤の非限定例としては、スクロース、ラクチュロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、ツラノース、マルツロース、パラチノース、ゲンチオビウロース、マンノビオース、メリビオース、メリビウロース、ルチノース、ルチヌロース、キシロビオースなどの多糖類が挙げられる。
　本開示の担体または組成物はまた、用時調製可能な形態、例えば、医療の現場あるいはその近傍において、医師および／または薬剤師、看護士、もしくはその他のパラメディカルなどによって調製され得る形態で提供することができる。凍結乾燥形態は、用時調製可能な形態の一例である。この場合、本開示の担体または組成物は、これらに必須の構成要素の少なくとも１つを含む１個または２個以上の容器として提供され、使用の前、例えば、２４時間前以内、好ましくは３時間前以内、そしてより好ましくは使用の直前に調製される。調製に際しては、調製する場所において通常入手可能な試薬、溶媒、調剤器具などを適宜使用することができる。
　したがって、本開示はまた、レチノイドおよび／もしくはレチノイド結合体、および／または送達物、および／またはレチノイドおよびレチノイド結合体以外の担体構成物質を、単独でもしくは組み合わせて含む１個または２個以上の容器を含む前記担体もしくは前記組成物の調製キット、ならびに、そのようなキットの形で提供される前記担体または前記組成物の必要構成要素にも関する。本開示のキットは、上記のほか、本開示の担体および組成物の調製方法や投与方法、皮膚線維症もしくはＧＶＨＤによる線維化の処置などに関する指示、例えば説明書や、ＣＤ、ＤＶＤ等の電子記録媒体などを含んでいてもよい。また、本開示のキットは、本開示の担体または組成物を完成するための構成要素の全てを含んでいてもよいが、必ずしも全ての構成要素を含んでいなくてもよい。したがって、本開示のキットは、医療現場や、実験施設などで通常入手可能な試薬や溶媒、例えば、無菌水や、生理食塩水、ブドウ糖溶液などを含んでいなくてもよい。
　本開示はさらに、前記組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御するための、皮膚線維症もしくはＧＶＨＤによる線維化を処置するための、または線維化皮膚組織から正常皮膚組織を再生するための方法に関する。ここで、有効量とは、例えば、後者については、皮膚線維症もしくはＧＶＨＤによる線維化の発症や再発を抑制し、病態を改善し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止する量であり、好ましくは、皮膚線維症もしくはＧＶＨＤによる線維化の発症および再発を予防し、またはこれを治癒する量、あるいは、線維化皮膚組織から正常皮膚組織を再生し得る量であってもよい。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、担体に含まれるレチノイド、および本開示の方法に用いる薬物の用量は当業者に公知であるか、または、上記の試験等により適宜決定することができる。皮膚線維症またはＧＶＨＤのモデル動物については、上述のとおりである。
　本開示の方法において投与する組成物の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与経路、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
　投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、肺内、気道内、気管内、気管支内、経鼻、経胃、経腸、直腸内、動脈内、門脈内、心室内、骨髄内、リンパ節内、リンパ管内、脳内、髄液腔内、脳室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内および子宮内等の経路が含まれる。
　投与頻度は、用いる組成物の性状や、上記のような対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間に数回（例えば、１週間に２、３、４回など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。
　本開示の方法において、用語「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本開示において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、例えば、皮膚線維症の処置が企図される場合には、典型的には皮膚線維症に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。例えば、皮膚線維症の予防が意図される場合は、限定することなく、ＧＶＨＤ、晩発性皮膚ポルフィリン症、腎性全身性線維症、好酸球増加筋痛症候群、毒性油症候群などの皮膚線維症の原因となる疾患に罹患した対象が典型例となる。
　用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、皮膚線維症の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、皮膚線維症発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
　一態様において、本開示の方法における対象は、低強度前処置と、これに続く同種骨髄幹細胞移植を受けたか、受ける可能性のある対象である。特定の態様において、かかる対象は、高齢対象（例えば、５５歳以上、６０歳以上、６５歳以上、７０歳以上、７５歳以上などのヒト対象）、および／または、他の合併症（例えば、糖尿病、腎疾患、心疾患など）を患っている対象である。別の特定の態様において、かかる対象は、腫瘍性疾患（例えば、造血器腫瘍など）に罹患している。より特定の態様において、かかる対象は、腫瘍性疾患に罹患している高齢対象、および／または、腫瘍性疾患とこれ以外の合併症とを患っている対象である。
　一部の態様において、本開示の方法は、皮膚線維症またはＧＶＨＤを有するか、これを発症するリスクのある対象を同定するステップをさらに含む。一態様において、本開示の方法は、対象に対して同種造血幹細胞移植を行うステップをさらに含む。特定の態様において、本開示の方法は、対象に対して低強度前処置を行うステップ、および、前記対象に対して同種造血幹細胞移植を行うステップをさらに含む。
　本開示はまた、上記担体を利用した、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達方法に関する。この方法は、限定されずに、例えば、上記担体に送達物を担持させる工程と、送達物を担持した担体を皮膚における細胞外マトリックス産生細胞を含む生物や媒体、例えば培養培地などに投与または添加する工程とを含む。これらの工程は、公知の任意の方法や、本明細書中に記載された方法などに従って適宜達成することができる。上記送達方法はまた、別の送達方法、例えば、皮膚を標的とする他の送達方法などと組み合わせることもできる。また、上記方法は、in vitroでなされる態様も、体内の皮膚における細胞外マトリックス産生細胞を標的とする態様も含む。本開示の担体によって輸送し得る物質については、上述のとおりである。
例１　ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームの調製
　ｓｉＲＮＡとレチノイド結合体ＸＲ３とを含む、ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームをWO 2012/170952に記載されたとおりに調製した。まず、無水エタノールに、脂質Ｐ２、脂質Ｉ８、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＰＥＧ－ＤＭＰＥおよびＸＲ３を２０：２０：３０：２５：５：２のモル比で可溶化し、エタノール／脂質混合物を得た。ｓｉＲＮＡを、５０ｍＭクエン酸緩衝液中に可溶化し、温度を３５～４０℃に調整した。次に、エタノール／脂質混合物をｓｉＲＮＡ含有緩衝液に撹拌しながら加え、ｓｉＲＮＡ含有リポソームを形成させた。エタノール／脂質混合物の添加は、最終的な全脂質：ｓｉＲＮＡ比率が１５：１（ｗ：ｗ）となるまで続けた。次いで、形成されたｓｉＲＮＡ含有リポソームを、１０倍の体積のＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対して透析ろ過し、エタノールを除去した。得られたリポソーム（「ＸＲ３（＋）リポソーム」または「ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソーム」と略すことがある）は、平均粒径５０～１００ｎｍ、ＰＤＩ＜０．２、およびｓｉＲＮＡ封入効率＞８５％を示した。また、ゼータ電位を測定したところ、中性領域のｐＨで電気的に中性であった。
　使用したｓｉＲＮＡの配列を以下に示す：
　ｓｉＲＮＡ１
　センス鎖：5'-GAGACACAUGGGUGCUAUA-3'（配列番号１６）
　アンチセンス鎖：5'-UAUAGCACCCAUGUGUCUC-3'（配列番号１７）
　ｓｉＲＮＡ２
　センス鎖：5'-UCCUGAGACACAUGGGUGA-3'（配列番号２６）
　アンチセンス鎖：5'-UCACCCAUGUGUCUCAGGA-3'（配列番号２７）
　Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ　ｓｉＲＮＡ
　センス鎖：5'-CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG-3'（配列番号３２）
　アンチセンス鎖：5'-GCAAUGAAGCCGGUCUAGCGAAUCGAU-3'（配列番号３３）
例２　皮膚筋線維芽細胞におけるＨＳＰ４７の発現阻害
　ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームが、皮膚線維化に関与すると考えられる皮膚筋線維芽細胞におけるＨＳＰ４７の発現を阻害できることを確認するために、in vitroで調製した皮膚筋線維芽細胞に例１で作製したｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームを作用させ、ＨＳＰ４７の発現を測定した。皮膚筋線維芽細胞は皮膚線維芽細胞をＴＧＦ－β１で誘導して調製した。まず、未処置のＢＡＬＢ／ｃマウスの皮膚片を、５ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼ（Sigma-Aldrich）を含むＤＭＥＭで１時間消化し、１０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭ中で２～３日培養した。こうして得られた初代皮膚線維芽細胞を、１０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭ中２４時間培養した後、ＦＣＳフリー培地中に１２時間置き、組換えヒトＴＧＦ－β１（R&D Systems）を、ｓｉＲＮＡの濃度として５０ｎＭのｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームの存在下または非存在下で加えた。２４時間後、細胞をISOGEN II（Nippon Gene）中に回収し、ＲＮＡを抽出した。ReverTra Ace(R) qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（Toyobo）を用いて、ｃＤＮＡライブラリを作製した。TaqMan(R) Fast Universal PCR Master Mix（Life Technologies）を用いて、ＨＳＰ４７の定量ＰＣＲ（蛍光プローブ法）を行った。使用した蛍光プローブ（P）、プライマー（F/R）の各配列は以下のとおりであった。なお、蛍光プローブの５’末端はＦＡＭで標識されている。
　serpinh1-P：5'-AGCCACACTGGGATGAGAAGTTTCACCA-3'（配列番号３４）
　serpinh1-F：5'-CTGCTTGTGAACGCCATGTTC-3'（配列番号３５）
　serpinh1-R：5'-TCACCATGAAGCCACGGTTG-3'（配列番号３６）
　図１に示す結果から、ｓｉＲＮＡ１およびｓｉＲＮＡ２とも、皮膚筋線維芽細胞におけるＨＳＰ４７の発現を有意に抑制することが分かる。
例３　ブレオマイシン誘発皮膚線維化の処置
　図２に示すレジメンに従い、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背部を剃毛し、同一部位にブレオマイシン（ＢＬＭ）２ｍｇ／ｋｇを２１日間にわたり連日皮下注射した。治療群には、ブレオマイシン投与開始の１日後より、４．５ｍｇ／ｋｇ・ＢＷのｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームを週３回静脈注射した（BLM+siRNA群）。ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＲＮＡ１を使用した。コントロール群には、ビヒクル（ＰＢＳ）を投与した（BLM+PBS群）。
　実験開始から２２日目に、皮膚線維化の程度を、以下の（１）～（６）に従い評価した。
（１）皮膚線維化による真皮肥厚の評価：
　マウスの背部から皮膚を採取し、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した後にパラフィン包埋および切片の作製を行った。Masson's-Trichrome（ＭＴ）染色によって線維化の程度を評価した。真皮厚を１標本あたり５カ所計測してその平均を取り、線維化による真皮肥厚(skin thickness)の評価を行った。
（２）Collagen Dot density：
　ＭＴ染色標本のうち長さ３ｍｍ分の画像を、画像解析ソフトImage Scopeに取り込んだ。Image Scopeの解析プログラムを用いて、線維化部位の色彩ベクトル値の総和を計算した。
（３）コラーゲンアッセイ：
　皮膚穿孔器（デルマパンチ５ｍｍ、マルホ株式会社）を用いて皮膚を直径５ｍｍの円形（面積：１９．６ｍｍ２）にくり抜いた皮膚サンプルを各個体につき２カ所から採取したものを併せて解析した。皮膚サンプルを２ｍｌの０．５Ｍ酢酸＋０．１ｍｇ／ｍｌペプシン中でTissueRuptor（Qiagen）を用いてホモジェナイズし、４℃で４８時間反応させた後、Sircol Collagen Assay Kit（Biocolor）およびGloMax(R)-Multi Luminescence System（Promega）を用いてコラーゲン量を定量した。
（４）ヒドロキシプロリンアッセイ
　皮膚サンプルを６ＮのＨＣｌに入れ、１１０℃で２４時間反応させた後、６ＮのＮａＯＨで中和した。Chloramin T溶液と２０分反応させ、Ehrlich溶液で発色させ、吸光度を測定した。
（５）ｍＲＮＡ抽出からのｑＰＣＲ法：
　皮膚サンプルを液体窒素にて急速凍結させた。ＲＮＡの抽出およびｑＰＣＲは例１と同様に行った。なお、ＨＳＰ４７に加え、Ｃｏｌ１ａ１の発現も調査した。Ｃｏｌ１ａ１に対する蛍光プローブ（P）、プライマー（F/R）の各配列は以下のとおりであった。なお、蛍光プローブの５’末端はＦＡＭで標識されている。
　col1a1-P：5'-CGGGGTCGGAGCCCTCGCTTCC-3'（配列番号３７）
　col1a1-F：5'-ACCGATGGATTCCCGTTCGA-3'（配列番号３８）
　col1a1-R：5'-CATTAGGCGCAGGAAGGTCAG-3'（配列番号３９）
（６）免疫蛍光染色：
　パラフィン切片を作製し、抗ＨＳＰ４７抗体（abcam）と二次抗体である抗ウサギＩｇＧ抗体Alexa Fluor 594を用いて染色した。
　ブレオマイシンを２１日間皮下注射したマウスでは、投与局所に著明な線維化を生じ（図３）、真皮の肥厚やコラーゲン沈着（collagen dot densityにより測定）の増加が見られた（図４）。しかしながら、図４に示すとおり、ＢＬＭとともにｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームを投与したBLM+siRNA群では、BLM+PBS群と比較して真皮の肥厚が有意に抑制され、コラーゲン沈着も抑制される傾向にあった（ｐ＝０．０５７）。
　また、ｑＰＣＲ法によってＨＳＰ４７の発現を見たところ、ブレオマイシン投与によって上昇し、BLM+siRNA群では著明に低下していることがわかった（図５Ｂ）。一方、Ｃｏｌ１ａ１の発現に有意な変化は見られなかった（図５Ａ）。
　皮膚のヒドロキシプロリン量を定量したところ、これもブレオマイシン投与で増加するが、ｓｉＲＮＡ投与で正常化することがわかった（図５Ｃ）。
　これらの結果により、皮膚線維化において、筋線維芽細胞が、ＨＳＰ４７依存性にコラーゲンを産生していることが判明した。またｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームは皮膚線維症において有効な線維化阻害剤であることが示された。
例４　皮膚ＧＶＨＤの処置１
　図６に示すように、レシピエントマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に全身放射線照射（６Ｇｙ）を行った後、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）が適合し、マイナー組織適合抗原のみが不一致であるドナーマウス（Ｂ１０．Ｄ２）から採取した骨髄細胞８×１０６個と脾細胞２．５×１０７個とを輸注することによって同種移植群（Ａｌｌｏ群）とした。コントロールとして、同様に全身放射線照射を行ったＢＡＬＢ／ｃマウスに、同じＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した骨髄細胞と脾細胞とを移植し、同系移植群（Ｓｙｎ群）とした。
　図９に示すレジメンに従い、Ａｌｌｏ群のレシピエントのうち半数に、移植後８日目（ｄａｙ８）からｄａｙ２６まで、４．５ｍｇ／ｋｇ・ＢＷのｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームを週３回静脈注射することによって、治療群（Allo+siRNA群）とした。ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＲＮＡ１を使用した。残りのＡｌｌｏ群のレシピエントには、コントロールとしてＰＢＳのみを投与した（Allo+PBS群）。
　ｄａｙ４２に生存しているマウスの皮膚線維化の重症度を、上記（１）～（６）に従い評価した。
　レシピエントマウスであるＢＡＬＢ／ｃに放射線照射後、ドナーであるＢ１０．Ｄ２マウスから骨髄細胞および脾細胞の移植を行った（図６）。６週間後（ｄａｙ４２）に皮膚の線維化を評価したところ、コントロールとして同系移植を行ったＳｙｎ群と比較して、有意に真皮の肥厚やコラーゲン沈着が増加していた（図７）。
　また、皮膚切片の免疫蛍光染色により、Ｓｙｎ群とは対照的にＡｌｌｏ群ではＨＳＰ４７陽性細胞が著明に増加していることが判明した（図８）。
　移植後ｄａｙ８～ｄａｙ２６まで週３回のｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームの投与を行ったところ（図９）、ｄａｙ４２の皮膚で、コントロールであるAllo+PBS群に比較して真皮の肥厚やコラーゲン沈着が減少していた（図１１）。コラーゲンアッセイによる、コラーゲンの定量においても、ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソーム投与群（Allo+siRNA群）では、Allo+PBS群に比較して有意に皮膚のコラーゲン量が減少していた（図１３）。
　ＨＳＰ４７のｑＰＣＲを行ったが、ＨＳＰ４７の発現は、ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソーム投与群で抑制されていなかった（図１２）。これは、解析前にｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームを１６日間休薬（図９）していたためと考えられる。
例５　皮膚ＧＶＨＤの処置２
　ｓｉＲＮＡとしてｓｉＲＮＡ２を用い、ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームまたはビヒクル（ＰＢＳ）の投与をｄａｙ１からｄａｙ４１まで続けた以外は例４と同様の実験を行った。また、皮膚線維化の評価に加え、脾臓および胸腺に含まれる細胞の種類、比率等をフローサイトメトリーにて分析した。より具体的には、ｄａｙ４２に胸腺および脾臓を採取して細胞懸濁液を調製した後、RBC lysis buffer（Biolegend）を用いて赤血球を溶解し、生細胞数をトリパンブルー染色後にカウントした。胸腺からの細胞懸濁液は抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ８抗体で染色し、フローサイトメトリー法でダブルボジティブ細胞を定量した。脾臓からの細胞懸濁液は、フローサイトメトリー法で、ＣＤ１１ｂ－ＴＣＲｂ＋ＣＤ４＋細胞をＣＤ４＋Ｔ細胞として、ＣＤ１１ｂ－ＴＣＲｂ＋ＣＤ８＋細胞をＣＤ８＋Ｔ細胞としてそれぞれ定量した。キメリズム解析は、脾臓からの細胞懸濁液を抗Ｌｙ９．１抗体で染色し、レシピエント細胞（Ｌｙ９．１陽性）の比率をフローサイトメトリー法で決定することにより行った。なお、免疫蛍光染色については、ｄａｙ４２に背部の皮膚を採取してパラフィン切片を作製し、抗Ｈｓｐ４７抗体（Abcam）および／または抗α-ＳＭＡ抗体（Abcam）で免疫染色し、ＤＡＰＩで核染色した。
　Ａｌｌｏ群においては、ｄａｙ２０頃からｃＧＶＨＤの発症が認められた。図１４に示す結果から、ｄａｙ４２において、Ａｌｌｏ群の真皮において、Ｓｙｎ群に比べ、α－ＳＭＡ陽性の筋線維芽細胞の数が増大しており、主に真皮の非血管部分に集積していることが分かる。なお、α-ＳＭＡ陽性の周皮細胞は、常に血管壁と並んで存在していた。また、筋線維芽細胞はＨＳＰ４７も発現していた。また、図１５に示す皮膚線維化の評価結果から、例３と同様、ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソーム投与群（Allo+siRNA）において、真皮肥厚およびコラーゲン量とも、ビヒクル投与群（Allo+PBS）に比べ有意に低減していることが、図１６に示す結果から、ＨＳＰ４７の発現もビヒクル投与群（Allo）に比べ有意に低減していることが、それぞれ分かる。さらに、図１７～１８に示す胸腺細胞または脾細胞の分析結果から、ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームによる処置が、胸腺におけるＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞の数（図１７Ａ）、脾臓におけるＴ細胞の数（図１７Ｂ、Ｃ）、および、ドナーＴ細胞および造血細胞の定着率（図１８）に有意な影響を与えないことが分かる。
例６　ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームのin vivo分布
　背部に１００μgのＢＬＭをｄａｙ１～ｄａｙ２１の２１日間連日投与して皮膚線維化を誘発させたＣ５７ＢＬ／６マウスに対し、ｄａｙ２２に蛍光色素Ｄｙ６４７で標識したレチノイド結合リポソーム（Ｄｙ６４７で標識したｓｉＲＮＡ１（４０％）と未標識のｓｉＲＮＡ２（６０％）との混合物を含む）を、４．５ｍｇ／ｋｇ・ＢＷの用量で２時間毎に３回静脈注射した。最後の注射から２時間後に、皮膚線維化を誘発させた部位および正常な部位の皮膚サンプルを採取し、４％パラホルムアルデヒドで一晩インキュベート後、３０％ショ糖で２４時間インキュベートした。凍結切片を調製し、ＤＡＰＩで染色後、蛍光顕微鏡で観察した。図１９に示すとおり、皮膚線維化を誘発させた部位の皮膚組織（Fibrotic）にはＤｙ６４７による蛍光が観察され、リポソームにより病変部位に標識が送達されたことが確認される一方、正常な部位の皮膚組織（Normal）にはＤｙ６４７による蛍光は認められなかった。また、図２０に示すとおり、ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームは、線維化誘発部位の真皮厚をコントロールに比べて有意に低減したが（「Fibrotic」対「Fibrotic + siRNA」）、正常部位の真皮厚には有意な影響を与えなかった（「Normal」対「Normal + siRNA」）。
例７　確立した皮膚ＧＶＨＤの改善
　ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームまたはビヒクルの投与を、皮膚ＧＶＨＤが確立した後のｄａｙ２１からｄａｙ４１まで行った以外は、例５と同様の処置を行った。図２１に示す結果から、ｓｉＲＮＡ含有レチノイド結合リポソームにより、確立した皮膚ＧＶＨＤであっても改善が可能であることが分かる。
　上記結果が示すとおり、本開示の組成物は、ブレオマイシン誘発皮膚線維化および皮膚ＧＶＨＤという異なる機序での皮膚線維化を抑制したことから、様々な疾患による皮膚線維化、皮膚の外傷性や手術による瘢痕の治療、ケロイド治療等に広く使用できると考えられる。
　また、上記結果から、本開示の組成物が、全身投与により奏功し得ることが明らかとなった。ｃＧＶＨＤなどにおいては、皮膚に限らず全身の臓器の線維化が著明となり，このような広い範囲の臓器の線維化に対処するためには、本開示の組成物のような全身投与可能な薬物が好ましい。
　さらに、上記結果から、本開示の組成物が、同種骨髄幹細胞移植によるドナー由来の免疫細胞の数や組成に有意な影響を与えないことが明らかとなった。このことは、本開示の組成物がＧＶＬ／ＧＶＴに有意な影響を与えないことを示唆しており、低強度前処置による腫瘍治療などの、ＧＶＬ／ＧＶＴを利用した治療に対する本開示の組成物の有用性を示している。
　なお、ｃＧＶＨＤのモデルでの実験では、ｃＧＶＨＤによる腸管の炎症のため下痢が生じ、マウスの衰弱や死亡がみられた（図９）。このことは、ＨＳＰ４７に対するｓｉＲＮＡを含む本開示の組成物が、このような線維化に関与しない症状に関して影響しないことを示唆している。しかしながら、こうした線維化以外の症状については、他の治療法の併用により対応が可能と考えられる。また、このような重篤で致死性の疾患を持つモデル動物に上記の組成物を投与したにもかかわらず、コントロールであるＰＢＳ投与群に比較して、何ら有害な作用を示さなかったことは、本開示の組成物の高い安全性を示唆するものである。

Claims (11)

  1. 　レチノイドを、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達を促進する成分として含む、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達用担体。
  2. 　レチノイドが、レチノイド結合体として含まれる、請求項１に記載の担体。
  3. 　脂質をさらに含む、請求項１または２に記載の担体。
  4. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の担体と、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物とを含む、皮膚線維症を処置するための医薬組成物。
  5. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の担体と、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物とを含む、線維化皮膚組織から正常皮膚組織を再生するための医薬組成物。
  6. 　皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物が、細胞外マトリックス成分の産生・分泌を阻害する物質、細胞増殖抑制物質、アポトーシス誘導物質およびＴＩＭＰ阻害物質からなる群から選択される、請求項４または５に記載の医薬組成物。
  7. 　細胞外マトリックス成分の産生・分泌を阻害する物質が、ＨＳＰ４７の阻害剤である、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 　用時調製形態である、請求項４～７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  9. 　皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体、ならびに、必要に応じてレチノイド以外の担体構成物質を、単独でまたは組み合わせて含む１つまたはそれ以上の容器を含む、請求項４～８のいずれか一項に記載の医薬組成物の調製キット。
  10. 　レチノイドおよび／またはレチノイド結合体を皮膚における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達促進成分として配合する工程を含む、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達をするための担体の製造方法。
  11. 　レチノイドを皮膚における細胞外マトリックス産生細胞への物質送達促進成分として、皮膚における細胞外マトリックス産生細胞の活性または増殖を制御する薬物を有効成分としてそれぞれ配合する工程を含む、皮膚線維症を処置するための医薬組成物または線維化皮膚組織から正常皮膚組織を再生するための医薬組成物の製造方法。
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