KR102362962B1 - 신규한 화합물 및 이를 함유하는 신경 손상, 신경 질환, 또는 발달 장애에 대한 신경세포의 증식 촉진, 분화, 및/또는 재생을 통한 치료 또는 예방용 약제학적 조성물 - Google Patents

신규한 화합물 및 이를 함유하는 신경 손상, 신경 질환, 또는 발달 장애에 대한 신경세포의 증식 촉진, 분화, 및/또는 재생을 통한 치료 또는 예방용 약제학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 화합물, 및 이를 함유하는 신경 세포의 증식 촉진, 분화 및/또는 신경 재생을 통한 신경 손상, 신경 질환, 또는 발달 장애의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 치매를 비롯한 퇴행성 뇌질환 또는 신경 세포 손상에 따른 뇌신경 질환과 발달 장애 및 다양한 종류의 퇴행성 신경 질환, 허혈성 신경질환 또는 신경손상 질환의 치료제와 학습능력 향상제 및 인지기능 개선제로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112020060696171-pat00019

상기 화학식 1 에서, R1 내지 R3 은 각각 독립적으로, 수소, 선형 또는 분지형의 (C1-C10)알킬이거나, 임의 결합을 형성하기 위한 전자쌍을 나타내고, A 는 *-(CH2)n-A1-*를 나타내고, n 은 0 내지 5 중 임의 정수를 나타내고, A1 은 *-COO-*, *-CO-*, *-NR4-*, *-CH2-*, *-CONH-*, 또는 *-O-*를 나타내고, Linker는 *-L1-NHCO-L2-*, *-L1-O-R-O-L2-*, *-L1-CH2-L2-*, *-L1-NR5-L2-*, 또는 *-L1-COO-L2-* 를 나타내고, L1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C30)알킬을 나타내고, L2 는 단일 결합, 또는 선형 또는 분지형의 (C1-C30)알킬을 나타내고, R 은 선형 또는 분지형의 (C1-C20)알킬을 나타내고, R4 및 R5는, 각각 독립적으로, 수소 또는 선형 또는 분지형의 (C1-C10)알킬을 나타내고, B 는 레티노산(retinoic acid)에서 유래된 부분을 나타낸다.

Description

신규한 화합물 및 이를 함유하는 신경 손상, 신경 질환, 또는 발달 장애에 대한 신경세포의 증식 촉진, 분화, 및/또는 재생을 통한 치료 또는 예방용 약제학적 조성물 {NOVEL COMPOUND AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OR PREVENTION OF NERUAL DAMAGE, NEURO DISEASE, OR DEVELOPMENTAL DISABILITY BY PROLIFERATION, DIFFERENCIATION, AND/OR REGENERATION OF NEURAL CELLS}
본 발명은 신규한 화합물 및 이를 함유하는 신경 손상, 신경 질환, 또는 발달 장애에 대한 신경세포의 증식 촉진, 분화, 및/또는 재생을 통한 치료 또는 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
신경 세포는 뇌를 비롯하여 몸의 수많은 곳에 분포되어 있으며, 신체는 신경 세포들 간의 신호 전달에 의해 외부 상황을 느끼고, 생각하고, 반응하고, 운동할 수 있다. 따라서, 어떠한 요인으로 인해 신경 세포가 사멸하게 되면 인지 장애 증상, 마비 증상, 감각 장애 증상, 운동 이상 증상 등과 같은 다양한 증상이 나타날 수 있다. 알츠하이머병은 뇌 안의 기억을 담당하는 곳에 존재하는 신경 세포의 사멸로 인해 발생하며, 파킨슨병은 신체의 운동을 조절하는 곳에 존재하는 신경 세포가 사멸되어 증상이 나타나는 것이다.
신경 세포는 사멸되면 다시 재생하기가 매우 어렵다. 피부와 같은 다른 세포의 경우 손상에 의해 세포가 파괴되어도 주위의 다른 세포들이 세포 분열을 하여 그 세포를 대체할 새로운 세포를 만들지만, 신경 세포는 다른 세포와는 달리 세포분열이 일어나지 않기 때문에 신경 세포의 사멸과 관련된 질환을 치료하는 것은 매우 어렵다. 이에 따라, 현재까지 신경 세포의 사멸로 인한 많은 병의 치료는 증상을 완화시키는 방법에 그치고 있는 수준이다. 신경 세포의 재생을 통해 신경 손상이나 신경 질환, 발달 장애를 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있는 물질의 개발이 여전히 요구되고 있다.
본 발명의 일 목적은 신경 손상, 신경 질환, 또는 발달 장애를 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있는 신규한 화합물 및 이를 함유하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 전술한 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이를 함유하는 약제학적 조성물을 제공함으로써 달성될 수 있었다.
[화학식 1]
Figure 112020060696171-pat00001
상기 화학식 1 에서,
R1 내지 R3 은 각각 독립적으로, 수소, 선형 또는 분지형의 (C1-C10)알킬이거나, 임의 결합을 형성하기 위한 전자쌍을 나타내고,
A 는 *-(CH2)n-A1-*를 나타내고,
n 은 0 내지 5 중 임의 정수를 나타내고,
A1 은 *-COO-*, *-CO-*, *-NR4-*, *-CH2-*, *-CONH-*, 또는 *-O-*를 나타내고,
Linker는 *-L1-NHCO-L2-*, *-L1-O-R-O-L2-*, *-L1-CH2-L2-*, *-L1-NR5-L2-*, 또는 *-L1-COO-L2-* 를 나타내고,
L1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C30)알킬을 나타내고,
L2 는 단일 결합, 또는 선형 또는 분지형의 (C1-C30)알킬을 나타내고,
R 은 선형 또는 분지형의 (C1-C20)알킬을 나타내고,
R4 및 R5는, 각각 독립적으로, 수소, 또는 선형 또는 분지형의 (C1-C10)알킬을 나타내고,
B 는 레티노산(retinoic acid)에서 유래된 부분을 나타낸다.
현재까지 신경 손상 또는 신경 퇴화 및 이와 관련된 각종 질병의 치료는 질병의 진행을 완화하는 수준이었으며, 이들의 완전한 치료제는 전무한 상황이었다. 본 발명에 따른 화합물은 직접적으로 신경 돌기의 생성, 신경 돌기의 성장, 신경 세포의 분화, 신경 세포의 재생, 및/또는 신경 세포의 증식을 유발 또는 촉진시킬 수 있는 바, 각종 신경계 질환에 대한 근본적인 치료를 제공할 수 있다. 아울러, 세포 독성이 낮아서 약물 독성에 따른 부작용이 적다. 또한, 물에 대한 용해도 및 용해 안정성이 높아서 제제의 제형 유연성이 높고 체내 흡수율이 증가하게 되므로 신경 재생, 분화, 보호 효과가 더욱 증대될 수 있다.
도 1는 본 발명의 화합물(MMB-11903B)과 ATRA (비교용 화합물, all-trans retinoic acid)를 물에 용해한 직후의 상태 및 상기 화합물들을 20분 동안 정치시킨 후의 용해 상태를 보여주는 사진이다.
도 2a는 ATRA의 농도 및 경과 시간에 따른 신경 세포 생존율을 보여주는 그래프이며, 도 2b는 MMB-11903B의 화합물의 농도 및 경과 시간에 따른 신경 세포 생존율을 보여주는 그래프이다.
도 3a는 ATRA의 농도 및 경과 시간에 따른 신경 세포 독성을 보여주는 그래프이며, 도 3b는 MMB-11903B의 화합물의 농도 및 경과 시간에 따른 신경 세포 독성을 보여주는 그래프이다.
도 4는 DO3A 또는 MMB-11903B 화합물의 농도 및 처리 시간에 따른 신경 세포 형태의 이미지이다.
도 5a는 DO3A 또는 MMB-11903B 화합물로 처리한 신경 세포주를 신경세포분화에 대한 표지자로 염색한 후 형광현미경으로 촬영하여 획득한 이미지이고, 도 5b는 DO3A 또는 MMB-11903B 화합물로 처리한 후 변화되는 신경 세포의 신경 돌기의 길이를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6a는 ATRA 또는 MMB-11903B 화합물로 처리한 신경 세포주를 신경세포 분화에 대한 표지자로 염색한 후 형광현미경으로 촬영하여 획득한 이미지이고, 도 6b는 ATRA 또는 본 발명의 화합물 MMB-11903B로 처리한 신경 세포의 분화를 알아보기 위해 신경세포 분화에 대한 표지자의 항체를 이용하여 발현 정도를 컬러 히스토그램으로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7a는 DO3A, ATRA, 또는 본 발명의 화합물 MMB-11903B로 처리한 신경 세포주를 세포증식에 대한 표지자로 염색한 후 형광 현미경으로 촬영하여 획득한 이미지이고, 도 7b는 DO3A, ATRA, 또는 본 발명의 화합물 MMB-11903B로 처리한 신경 세포의 증식을 알아보기 위해 Ki-67 항체를 사용하여 양성 세포 개수에 대한 비율을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명의 일 양태에 따르면 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이 제공된다.
[화학식 1]
Figure 112020060696171-pat00002
상기 화학식 1에서, R1 내지 R3 은 각각 독립적으로, 수소, 선형 또는 분지형의 (C1-C10)알킬이거나, 임의 결합을 형성하기 위한 전자쌍을 나타낸다. 구체적으로는, 상기 화학식 1에서, 상기 R1 내지 R3은 각각 독립적으로, 수소, 선형 또는 분지형의 (C1-C3)알킬이거나, 임의 결합을 형성하기 위한 전자쌍을 나타낼 수 있으며, 더 구체적으로는 수소 또는 임의 결합을 형성하기 위한 전자쌍을 나타낼 수 있고, 더더욱 구체적으로는 수소일 수 있다.
또한, 상기 화학식 1에서, A 는 *-(CH2)n-A1-*를 나타낸다.
또한, 상기 화학식 1에서, n 은 0 내지 5 중 임의 정수를 나타낸다. 구체적으로는, 상기 화학식 1에서, n은 1 내지 5 중 임의 정수를 나타낼 수 있고, 더 구체적으로는 1 내지 3 중 임의 정수일 수 있다.
또한, 상기 화학식 1에서, A1 은 *-COO-*, *-CO-*, *-NR4-*, *-CH2-*, *-CONH-*, 또는 *-O-*를 나타낸다. 구체적으로는, A1 은 *-COO-*, *-CO-*, *-NR4-*, 또는 *-CONH-*을 나타낼 수 있고, 더 구체적으로는 *-CONH-*을 나타낼 수 있다.
또한, 상기 화학식 1에서, Linker는 *-L1-NHCO-L2-*, *-L1-O-R-O-L2-*, *-L1-CH2-L2-*, *-L1-NR5-L2-*, 또는 *-L1-COO-L2-* 를 나타낸다. 구체적으로는, 상기 Linker는 *-L1-NHCO-L2-*, 또는 *-L1-NR5-L2-*를 나타낼 수 있고, 더 구체적으로는 *-L1-NH-L2-*를 나타낼 수 있다.
또한, 상기 화학식 1에서, L1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C30)알킬을 나타낸다. 구체적으로는, 상기 L1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C10)알킬, 더욱 구체적으로는 선형 또는 분지형의 (C1-C5)알킬을 나타낼 수 있다.
또한, 상기 화학식 1에서, L2 는 단일 결합, 또는 선형 또는 분지형의 (C1-C30)알킬을 나타낸다. 구체적으로는, L2 는 단일 결합, 또는 선형 또는 분지형의 (C1-C10)알킬일 수 있고, 더 구체적으로는 단일 결합, 또는 선형 또는 분지형의 (C1-C5)알킬을 나타낼 수 있으며, 더더욱 구체적으로는 단일 결합일 수 있다.
또한, 상기 화학식 1에서, R 은 선형 또는 분지형의 (C1-C20)알킬을 나타낸다. 구체적으로는, R 은 선형 또는 분지형의 (C1-C10)알킬, 더 구체적으로는 선형 또는 분지형의 (C1-C5)알킬을 나타낼 수 있다.
또한, 상기 화학식 1에서, R4 및 R5는, 각각 독립적으로, 수소 또는 선형 또는 분지형의 (C1-C10)알킬을 나타낸다. 구체적으로는, R4 및 R5는, 각각 독립적으로, 수소 또는 선형 또는 분지형의 (C1-C5)알킬일 수 있다. 더 구체적으로는, R4 는 수소일 수 있다. 또한, 더 구체적으로는, R5는 수소일 수 있다.
또한, 상기 화학식 1에서, B 는 레티노산(retinoic acid)에서 유래된 부분을 나타낸다. 상기 레티노산은 전-트랜스 레티노산(all-trans retinoic acid)(이하, ATRA 라고도 칭함), 13-시스 레티노산, 9-시스 레티노산 등과 같은 레티노산의 이성질체들을 포함할 수 있다. 구체적으로는, 상기 B는 하기 화학식 2a, 2b, 또는 2c를 나타내는 것일 수 있다:
[화학식 2a]
Figure 112020060696171-pat00003
[화학식 2b]
Figure 112020060696171-pat00004
[화학식 2c]
Figure 112020060696171-pat00005
상기 화학식 2a는 ATRA에서 유래된 부분이며, 상기 화학식 2b는 13-시스 레티노산에서 유래된 부분이고, 상기 화학식 2c는 9-시스 레티노산에서 유래된 부분이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1에서 상기 B는 화학식 2a를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물은 상기 화학식 1에서 n은 1 내지 5 중 임의 정수를 나타내고, A1은 *-CONH-*을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물은 상기 화학식 1에서 상기 Linker는 *-L1-NR5-L2-*를 나타내고, R5 는 수소인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물은 상기 화학식 1에서 L1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C10)알킬을 나타내고, L2 는 단일 결합을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물은 상기 화학식 1에서 상기 R1 내지 R3은 각각 독립적으로, 수소, 선형 또는 분지형의 (C1-C3)알킬이거나, 임의 결합을 형성하기 위한 전자쌍을 나타내고, A 는 *-(CH2)n-A1-*를 나타내고, n은 1 내지 5 중 임의 정수를 나타내고, A1 은 *-COO-*, *-CO-*, *-NR4-*, 또는 *-CONH-*을 나타내고, Linker는 *-L1-NHCO-L2-* 또는 *-L1-NR5-L2-*를 나타내고, L1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C10)알킬을 나타내고, L2 는 단일 결합, 또는 선형 또는 분지형의 (C1-C10)알킬을 나타내고, R 은 선형 또는 분지형의 (C1-C10)알킬을 나타내고, R4 및 R5는, 각각 독립적으로, 수소 또는 선형 또는 분지형의 (C1-C5)알킬을 나타내고, B는 상기 화학식 2a, 2b, 또는 2c로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물은 상기 화학식 1에서 상기 R1 내지 R3은 각각 독립적으로, 수소이거나, 임의 결합을 형성하기 위한 전자쌍을 나타내고, A 는 *-(CH2)n-A1-*를 나타내고, n은 1 내지 3 중 임의 정수를 나타내고, A1 은 *-CONH-*을 나타내고, Linker는 *-L1-NR5-L2-*를 나타내고, L1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C10)알킬을 나타내고, L2 는 단일 결합을 나타내고, R 은 선형 또는 분지형의 (C1-C10)알킬을 나타내고, R5는 수소이고, B는 상기 화학식 2a, 2b, 또는 2c로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 예를 들어, 하기 화학식 1-1의 화합물을 레티노산 유도체와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 여기서 상기 레티노산 유도체는, 화학식 1에서 정의한 L2의 전구체, 예를 들어 숙신이미드가 레티노산에 결합한 형태일 수 있다.
[화학식 1-1]
Figure 112020060696171-pat00006
상기 화학식 1-1에서 A 및 L1은 화학식 1에서 정의한 바와 같다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 전술한 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 신경 손상, 신경 질환, 또는 발달 장애에 대해 신경 돌기의 생성, 신경 돌기의 성장, 신경 세포의 분화, 신경 세포의 재생, 및/또는 신경 세포의 증식을 유발 또는 촉진하는데 유용하다.
용어 "신경 돌기"는 신경 세포의 세포체로부터의 돌출부를 의미하며, 예를 들어 축삭 및 수상돌기를 포함한다.
이에, 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 신경 돌기의 생성, 신경 돌기의 성장, 신경 세포의 분화, 신경 세포의 재생, 및/또는 신경 세포의 증식을 유발 또는 촉진하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 신경 돌기의 생성, 신경 돌기의 성장, 신경 세포의 분화, 신경 세포의 재생, 또는 신경 세포의 증식이 필요한 대상체 또는 신경 세포에 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는, 신경 돌기의 생성, 신경 돌기의 성장, 신경 세포의 분화, 신경 세포의 재생, 또는 신경 세포의 증식을 유발 또는 촉진하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 신경 손상, 신경 질환, 또는 발달 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 대상체에게 바람직한 치료 효과가 구현되는 것이며, 진행 속도의 감소, 진행 속도의 중단, 증상의 경감, 병태의 개선, 및 병태의 치유를 포함한다. 본 발명에 따른 화합물은 손상된 세포의 형태적 및 기능적 회복을 통해 질환의 근본적인 치유를 제공할 수 있으며, 이에, 상기 치료는 구체적으로는 신경 세포의 형태적 및 기능적 회복에 의한 질환의 치료를 의미한다. 또한, 용어 "예방"은 아직 병이 발병되지 않았으나 발병 위험이 있는 대상체에 대한 사용을 의미할 수 있다.
용어 "신경 손상"은 척수 손상이나 시신경 손상과 같은 신경계의 임의 손상을 지칭하는 것으로서, 이는 예를 들어 외상에 의해 유발되거나, 화학적으로 유발되거나 (예를 들어, 신경독에 의해 또는 면역억제 효과를 가지는 치료 요법에 의해 유발), 또는 질환이나 장애에 의해 유발된 신경계의 손상을 포함한다. 또한, 상기 신경 손상은 중추 신경계(CNS)의 손상 및 말초 신경계(PNS)의 손상, 더 구체적으로는 뇌 신경 손상, 척수 손상, 시신경 손상, 말초 신경 손상 등을 포함한다.
용어 "신경 질환"은 퇴행성 신경 질환, 허혈성 신경 질환, 및 말초 신경 질환을 포함한다. 상기 "퇴행성 신경 질환"은 구체적으로는 퇴행성 뇌질환 (예를 들어, 기억력 감퇴, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 등), 근위축성 축색 경화증, 운동 실조, 간질 등을 포함한다. 상기 "허혈성 신경 질환"은 구체적으로 허혈성 뇌질환 (예를 들어, 허혈성 뇌졸중)을 포함한다. 상기 "말초 신경 질환"은 구체적으로는 다발신경병증, 단일신경병증, 다발성 단일신경염, 및 자율 신경병증을 포함한다.
용어 "발달 장애"는 뇌 신경 발달 장애를 포함한다.
본 발명의 화합물은, 후술하는 실시예에서도 알 수 있듯이 본 발명의 화합물은 신경 세포의 신경 돌기를 생성, 성장시키고 신경 세포를 분화, 재생, 증식시킬 수 있으므로, 이에 따라 본 발명의 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 약제학적 조성물은 신경 손상, 신경 질환, 또는 발달 장애를 치료 또는 예방하는 용도로 사용될 수 있다. 아울러, 본 발명의 화합물은 학습능력 향상제 또는 인지기능 개선제로서도 매우 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 신경 손상, 신경 질환, 또는 발달 장애의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는, 신경 손상, 신경 질환, 또는 발달 장애의 치료 또는 예방 방법이 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 뇌 신경 손상, 퇴행성 뇌질환, 또는 허혈성 뇌질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 간질, 기억력 감퇴, 또는 허혈성 뇌졸중을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 또다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 말초 신경 손상, 척수 손상, 시신경 손상, 근위축성 축색 경화증, 운동 실조, 또는 말초 신경 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 또다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 뇌 신경 발달 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 약제학적 조성물에서, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 "약학적으로 허용 가능한 염"은 모 화합물의 약물학적 활성을 유지하는 화합물 염을 의미하는 것으로서, 예를 들어 (i) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 및 인산과 같은 무기산과 형성된 염; (ii) 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 석신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르빈산, 팔미트산, 말레인산, 하이드록시말레인산, 벤조산, 하이드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산 및 톨루엔설폰산과 같은 유기산과 형성되는 염; (iii) 모 화합물에 존재하는 산성 프로톤이 금속 이온, 예를 들어 알칼리 금속 이온, 알칼리 토금속 이온, 또는 알루미늄 이온에 의해 교체될 때 형성되는 염; (iv) 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, N-메틸글루카민과 같은 유기 염기와의 배위체; 또는 (v) 알기네이트와 같은 아미노산의 염일 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 상기 화학식 1의 화합물의 이성질체, 용매화물, 또는 프로드러그(prodrug)을 함유할 수 있다. 여기서 "이성질체"는 디아스테레오머 및 에난티오머를 비롯한 모든 가능한 입체화학적 이성질체를 포함한다. 본 발명의 화합물은 모든 가능한 입체화학적 이성질체 형태의 혼합물을 지칭하는 것으로 이해하여야 한다. 또한, 용어 "용매화물"은 용질 (예를 들어 화학식 1의 화합물)과 용매의 복합체를 가리키는 것으로서, 용매가 물인 경우 상기 용매화물은 수화물로 지칭될 수 있다. 용어 "프로드러그"는 생체내에 투여된 후에 생체 흡수 및 대사에 의하여 약효를 갖는 활성 화합물로 변환되는 화합물을 가리킨다. 상기 프로드러그는 그 자체로 비활성이거나 활성 화합물보다 활성이 덜한 화합물이며, 다만, 취급, 투여, 또는 대사에 유리한 특성을 제공할 수 있다. 상기 프로드러그는 활성 화합물의 에스테르 형태 (예를 들어, 생리학적으로 허용 가능한 대사적으로 불안정한 에스테르)이거나 당 유도체의 형태, 또는 아미노산 에스테르 유도체의 형태일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 단독으로 포함할 수 있으나, 그에 추가하여 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 더 포함할 수도 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 약제학 분야에서 통상적으로 사용되는 것일 수 있으며, 부형제 (예를 들어, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스, 락토스, 소르비톨, 만니톨, 셀룰로오스 등) 또는 희석제 (예를 들어, 생리식염수, 정제수 등)일 수 있다.
또한, 필요에 따라, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 이외의 약학적으로 허용 가능한 첨가제, 예를 들어, 결합제, 붕해제, 활택제, 제피제, 필름 코팅 기제, 장용성 필름 코팅 기제, 연질 캡슐 기제, 용해보조제, 유화제, 현탁화제, 안정화제, 완충제, 항산화제, 계면활성제, 감미제, 교미제, 보존제, 점증제, 방향제, 또는 착색제를 더 포함할 수도 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구의 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비강내 투여, 폐내 투여, 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 본 발명의 약제학적 조성물은 고체 또는 액제 제형의 형태로 제형화될 수 있다. 고체 제형은 예를 들어, 정제, 캡슐제(연질 & 경질 캡슐제), 산제, 과립제, 환제, 트로키제 등일 수 있으며, 액체 제형은 예를 들어, 엘릭서, 현탁액제, 유액제, 용액제, 시럽제, 리모나아데제 등의 형태일 수 있다. 정제의 경우, 활성 성분 이외에도, 락토스, 옥수수 전분 등과 같은 담체, 마그네슘 스테아레이트 등과 같은 활택제, 메틸셀룰로오스, 미결정 셀룰로오스, 폴리비닐알코올 등과 같은 결합제, 벤토나이트, 알긴산나트륨 등과 같은 붕해제 등이 통상적으로 추가될 수 있다. 액제의 경우, 활성 성분을 정제수, 생리식염수 등과 같은 담체, 및 필요에 따라 모노스테아린산수크로스 등과 같은 용해보조제, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 안정화제 등과 함께 제제화할 수 있으며, 경구용 수성 현탁액제의 경우, 활성 성분을 현탁화제, 및 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정화제 등과 함께 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 환자의 중증도, 상태, 불활성율, 및 병용되는 약물을 고려하여 결정할 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.
이하, 본 발명의 상세한 이해를 위하여 본 발명의 대표 화합물을 들어, 본 발명에 따른 화합물, 이의 제조 방법, 및 이를 함유하는 약제학적 조성물의 특성에 대해서 설명하기로 한다. 단, 본 발명이 다음의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
1. 본 발명에 따른 화합물의 제조예
Figure 112020060696171-pat00007
1) 화합물 a의 합성
Figure 112020060696171-pat00008
All trans retinoic acid (4 g, 13.31 mmol)를 90 ml의 THF에 녹인 후 DCC (4.12 g, 19.97 mmol)를 첨가하여 30분간 교반하였다. 30 ml의 THF에 녹인 N-하이드록시숙신이미드(NHS)(2.30 g, 19.97 mmol) 용액을 4℃에서 적가한 후 상온에서 18시간 반응시켰다. 생성된 고체를 여과한 후 용매를 제거하고, 디클로로메탄(DCM)에 다시 녹여 실리카겔 칼럼에 통과시켜 화합물 a를 정제하여 얻었다. 수율: 4.6 g (87.0 %)
2) 화합물 A의 합성
Figure 112020060696171-pat00009
DO3A(tBuO)3 (10 g, 19.43 mmol)을 320 ml의 아세토니트릴(ACN)에 녹인 후 KHCO3(5.93 g, 59.26 mmol)를 첨가하여 상온에서 30분 교반하였다. 에틸 브로모아세테이트(2.36 ml, 21.37 mmol)를 상기 혼합물에 적가하여 70℃에서 24시간 교반 후, 무기염을 여과하고 반응물의 용매를 제거하였다. 진공건조하여 노란색의 고체로서 화합물 A 를 얻었다. 수율: 11.5 g (99 %)
3) 화합물 B의 합성
Figure 112020060696171-pat00010
화합물 A (25.4 g. 42.30 mmol)에 에틸렌디아민 (60 ml, 846.1 mmol)을 첨가한 후 상온에서 4일간 교반하였다. 반응 종결 후 150 ml의 brine 용액을 첨가하고 150 ml의 DCM 용액으로 3회 반복 추출하여 유기용매 층을 얻었다. Na2SO4를 이용하여 탈수 후 용매를 제거하고 DCM/MeOH 전개액 조건에서 칼럼 크로마토그래피 하여 정제하였다. 얻어진 화합물에 Hexane을 첨가 후 상온 교반하여 흰색의 고체로서 화합물 B 를 얻었다. 수율: 10.43 g (40.2 %).
4) 화합물 C 의 합성
Figure 112020060696171-pat00011
화합물 B (3g, 4.88 mmol)를 20%의 트리플루오로아세트산(TFA)이 함유된 DCM(12 ml/48 ml, v/v)에 녹인 후 40℃에서 가열환류하여 24시간 반응시켰다. MeOH를 넣어가며 용매를 3회가량 반복적으로 감압증발 시킨 후 MeOH에 다시 녹여, 에틸 에테르에 침전시켰다. 얻어진 흰색의 고체를 증류수에 녹여, 아세톤에 재침전하여 정제된 화합물 C 를 흰색의 고체로서 얻었다. 수율: 1.37 g (62.9 %)
5) 화합물 MMB-11903B 의 합성
Figure 112020060696171-pat00012
화합물 C (0.2 g, 0.36 mmol)를 MeOH에 녹이고 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)(0.62 ml, 3.57 mmol)를 첨가한 후 3시간 동안 상온에서 교반하였다. 화합물 a (0.17 g, 0.43 mmol)을 첨가하여 60℃에서 24시간 가열환류 한 후, 에틸 에테르에 침전하여 옅은 노란색의 고체를 얻었다. 상기의 화합물에 이소프로필 알콜(IPA)을 첨가하여 가열한 후 냉각하여 생성되는 화합물을 여과하여 화합물 MMB-11903B을 얻었다. 수율: 0.09 g (34.3 %)
2. 용해도 시험
본 발명에 따른 화합물의 용해도를 알아보기 위하여, 상기 제조예에서 제조한 본 발명의 화합물 MMB-11903B 및 ATRA를 탈이온수(Deionized water) 1 mL에 각각 100 mM의 농도로 첨가하고 (본 발명의 화합물 MMB-11903B: 72.8 mg/mL, ATRA: 30.0 mg/mL), 가볍게 vortex 하여 용해시켰다. 상기 용해 직후의 상태를 사진으로 촬영하여 도 1에 나타낸다. 상기 제조한 본 발명의 화합물 MMB-11903B의 용액과 ATRA 용액을 상온에서 20분 방치한 후에 사진을 재촬영하여 각 용액에서 상기 화합물들의 용해 상태를 관찰하였다 (도 1).
도 1에서 알 수 있듯이, 본 발명의 화합물 MMB-11903B 및 ATRA 는 초기에는 용액 중에 균일하게 용해되어 있었으나, 시간의 경과에 따라 ATRA는 용매와 분리, 침전되는 반면, 본 발명의 화합물 MMB-11903B은 ATRA와 동일한 시간 동안 정치되어 있음에도 불구하고 용매와 분리되지 않고 균일한 용해 상태를 유지할 수 있었다. 이로부터, 본 발명의 화합물MMB-11903B는 물과 같은 용매에 쉽게 용해될 수 있어 용해도가 높을 뿐만 아니라, 용해 안정성이 있어서 장시간 정치하더라도 용해 상태를 유지할 수 있었으며, 이러한 본 발명의 화합물 MMB-11903B의 용해도 및 용해 안정성은 ATRA 에 비교했을 때 매우 탁월하다는 것을 알 수 있다.
3. 세포 독성 시험
3-1) 세포 생존율 시험
미분화된 신경세포주인 인간신경아세포종 (Neuroblastoma) SH-SY5Y를 대상으로 CCK-8을 이용한 신경세포주 세포의 생존률 (cell viability) 분석을 수행하였다. 참고로, 상기 CCK-8 (Cell counting kit-8)는 고수용성 테트라졸륨 염-SST-8을 이용하여 분석이 진행되는데, 상기 분석은 [2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐) (2,4-디설포페닐)-2H-테트라졸륨, 모노나트륨 염]은 전자 매개체의 존재 하에 환원될 때 수용성 포르마잔 주황색 염료를 생성하며, 세포에서 탈수소 효소에 의해 생성되는 포르마잔 염료의 양은 살아있는 세포의 수에 직접 비례한다는 점을 기반으로 하는 것이다. 구체적인 실험 방법은 다음과 같다.
SH-SY5Y는 10% Fetal bovine serum (FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic (AA), 2mM L-Glutamine 가 추가된 Minimum Essential Medium (MEM) 배지에서 성장되었고, 안정화된 세포는 세포 생존률 분석을 위해 1 ×104 개/well의 밀도로 200 μL의 배지에 부유되어 96-well plate의 각 well에 심어졌다. 14시간 이상, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 부착되고 안정화되기를 기다렸다. 다음 날 성장 배지를 제거하고, 분화 유도를 위해 1% FBS, 1% AA, 2mM L-Glutamine가 추가된 Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12=1:1) 배지 100 μL 에 상기 제조예에서 합성된 본 발명의 화합물 MMB-11903B 및 비교용 화합물로서 all-trans-Retinoic acid (이하, ATRA)을 각각 다양한 농도(0, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 50 μM)로 희석하여 24, 48, 72시간 동안 37℃, 5% CO2 상태에서 배양하였다. 수확 시간 2시간 전에 CCK-8 용액 10 μL를 각 well에 첨가하고 2시간 추가 배양하였다. 배양이 완료된 플레이트는 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
[세포 생존율 계산식]
Figure 112020060696171-pat00013
(상기 식에서, A는 대조군 웰에서 측정된 흡광도 값이고, B는 약물이 들어간 웰에서 측정된 흡광도 값이다.)
계산된 값은 GraphPad Prism 응용 프로그램을 이용하여 그래프를 그렸다. 나온 수치의 통계적 유의성은 일원 분산 분석(One-way ANOVA with Dunnett’multiple comparison test)을 통해 확인하였다. *p < 0.5, ***p < 0.01 vs. 24h control, #p<0.5, ### p<0.01 vs. 48h control, †††p<0.01 vs. 72h control에 대해 유의성을 가짐을 나타낸다. ATRA와 본 발명의 화합물 MMB-11903B에 대한 결과를 각각 도 2a와 도 2b에 나타낸다.
도 2a와 2b에서 ATRA 또는 화합물 MMB-11903B의 농도가 0 μM 인 경우 (즉, ATRA 및 화합물 MMB-11903B을 전혀 투여하지 않은 경우)의 24시간 생존율, 48시간 생존율, 72시간 생존율을 100%로 하였을 때, ATRA는 농도가 높아질수록 및 시간이 길어질수록 세포 생존율이 낮아졌다 (도 2a 참조). 이에 반해, 본 발명의 화합물 MMB-11903B를 투여하지 않은 경우에 비해 이를 투여한 경우의 72시간 생존율이 항상 더 높다는 것을 알 수 있는 바, 본 발명의 화합물 MMB-11903B은 투여 시간이 경과함에 따라 세포 생존율을 더 높여줄 수 있다는 것을 알 수 있다. 특히, 50 μM 의 농도에서 72시간 생존율은 ATRA에 비해 본 발명의 화합물 MMB-11903B이 대략 2배 넘게 더 높았다. 이는 MMB-11903B의 장시간 노출에도 신경세포에 대한 독성이 감소하였음을 확인하였다.
3-2) 젖산 탈수소효소(Lactate dehydrogenase, LDH) 분석을 이용한 세포 독성 시험
세포독성(Cytotoxicity)(세포 사멸)은 세포 생존율 시험을 통하여 간접적으로 측정할 수 있지만, 더 sensitive하고, 정확한 측정을 위해서는 세포 사멸 또는 세포 손상과 관련된 효소를 이용한 방법으로 검증한다. 젖산 탈수소효소(Lactate dehydrogenase, LDH)는 세포질에 존재하는 안정한 효소이며, 통상적으로는 세포막을 통과하지 못하여 세포 밖으로 배출되지 않으나, 세포막이 손상되거나 세포가 죽는 경우 배지 중으로 방출된다. 그렇기 때문에 배지 중의 LDH양은 죽거나 혹은 상해를 입은 세포의 수와 비례하므로 이를 측정한다.
SH-SY5Y는 10 % Fetal bovine serum (FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic (AA), 2mM L-Glutamine 가 추가된 Minimum Essential Medium (MEM) 배지에서 성장되었고, 안정화된 세포는 세포 생존률 분석을 위해 2.5 ×104개/well의 밀도로 200 μL의 배지에 부유되어 96-well plate의 각 well에 심어졌다. 14시간 이상 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 부착되고 안정화 되기를 기다렸다. 다음 날 성장 배지를 제거하고, 분화 유도를 위해 1% FBS, 1% AA, 2mM L-Glutamine가 추가된 Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12=1:1) 배지 100 μL에 본 발명의 상기 제조예에서 제조한 화합물 MMB-11903B 및 all-trans-Retinoic acid (ATRA)을 각각, 다양한 농도(0, 1, 5, 10, 20, 30, 50, 100, 200 μM)로 희석하여 24, 48, 72시간 동안 37℃, 5% CO2 상태에서 배양하였다. 배양액의 상층 부분을 새로운 96-well plate에 10 μL 분주하고, LDH reaction mixture (D-Plus™ LDH kit, Cat. No. LDH-500)를 각 100 μL 씩 첨가하여 30분간 암 상태로 반응시켰다. 반응이 완료된 플레이트는 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
[세포 독성 계산식]
세포 독성 (%) = (A-B)/(C-B) × 100 (%)
(상기 식에서, A는 약물이 들어간 군의 흡광도 값이고, B는 약물 처리하지 않은 군의 흡광도 값이며, C는 실험에 사용된 세포에 Lysis 용액 10 μL를 첨가시켜 세포에서 방출 가능한 최대의 LDH 양을 측정한 흡광도 값이다.)
계산된 값은 GraphPad Prism 응용 프로그램을 이용하여 그래프를 그렸다. 나온 수치의 통계적 유의성은 일원 분산 분석(One-way ANOVA with Dunnett’multiple comparison test)을 통해 확인하였다. ***p<0.01 vs. 24h control, ### p<0.01 vs. 48h control, †p<0.5, †††p<0.01 vs. 72h control에 대해 유의성을 가진다. ATRA와 본 발명의 화합물 MMB-11903B에 대한 결과를 각각 도 3a와 도 3b에 나타낸다.
도 3a에서 ATRA는 대략 30 μM 부근의 농도부터 세포독성이 나타나기 시작하여 200 μM의 농도에서 24시간 배양시 세포독성이 대략 55%였다. 이에 반해 도 3b에서 본 발명의 화합물 MMB-11903B은 대략 100 μM 부근의 농도부터 세포독성이 나타나기 시작하여 200 μM의 농도에서 24시간 배양시 세포독성이 대략 5% 였다. 이를 통해 본 발명의 화합물 MMB-11903B은 ATRA에 비하여 세포독성이 현저히 낮다는 점 (예를 들어 200 μM의 농도에서 24시간 배양시 세포독성이 ATRA에 비해 본 발명의 화합물 MMB-11903B가 10배 이상 더 낮음)을 알 수 있다.
4. 신경 세포에 대한 효과 확인
4-1) 신경 세포의 형태(morphology) 변화
SH-SY5Y는 10% Fetal bovine serum (FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic (AA), 2mM L-Glutamine가 추가된 Minimum Essential Medium (MEM) 배지에서 성장되었고, 안정화된 세포는 세포 생존률 분석을 위해 4 ×105 개/dish의 밀도로 60 mm dish에 심어졌다. 14시간 이상 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 부착되고 안정화되기를 기다렸다. 다음 날 성장 배지를 제거하고, 분화 유도를 위해 1% FBS, 1% AA, 2mM L-Glutamine가 추가된 Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12=1:1) 배지에 본 발명의 상기 제조예에서 제조한 화합물 MMB-11903B 및 하기 화학식의 DO3A 를 다양한 농도 (0, 5, 10, 20 μM)로 희석하여 1, 3, 5일 동안 37℃, 5% CO2 상태에서 배양하였다. 세포의 형태는 Nikon inverted microscope로 이미지를 획득하였다 (Nikon, ECLIPSE Ts2, Nikon Corporation, Tokyo, Japan). DO3A 또는 본 발명의 화합물 MMB-11903B로 처리한 신경세포주의 이미지를 도 4에 나타내었다.
[DO3A의 화학식]
Figure 112020060696171-pat00014
본 발명의 화합물 MMB-11903B로 처리하였을 때, 낮은 농도부터 세포 형태 변화의 관찰이 가능하였다. 신경세포로의 분화가 유도되어 세포체 (cell body)가 작아지고, 신경축색 (axon)과 수상돌기 (dendrite)의 전구체인 신경 돌기가 신장 (neurite outgrowth)하여 그 길이가 세포체의 2배 이상이 되었다. 날이 지나갈수록 신경 돌기의 신장은 더 확장되고, 신경 돌기 네트워크의 형성이 뚜렷해졌다. 본 발명의 화합물 MMB-11903B에 비교하여, DO3A를 처리하였을 경우, 신경 돌기의 신장이 관찰되지 않았으며, 오히려 10 μM, 5 일째와 20 μM, 3 일째부터 세포 독성으로 인한 세포 사멸이 관찰되었다. DO3A는 신경 세포 분화능을 가지고 있지 않으며, 오히려 독성을 유발하여 신경세포 사멸에 관여하는 것에 비해 DO3A의 backbone을 가지는 본 발명의 화합물 MMB-11903B는 세포 독성이 개선되었음은 물론, 신경 세포로의 분화가 유도됨을 확인하였다.
4-2) 면역형광염색법(immunofluorescence staining)을 이용한 신경 돌기 신장 촉진 효과의 시험
SH-SY5Y는 10% Fetal bovine serum (FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic (AA), 2mM L-Glutamine 가 추가된 Minimum Essential Medium (MEM) 배지에서 성장되었고, 안정화된 세포는 세포 생존률 분석을 위해 4 ×105개/dish의 밀도로 60 mm dish에 심어졌다. 14시간 이상 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 부착되고 안정화되기를 기다렸다. 다음 날 성장 배지를 제거하고, 분화 유도를 위해 1% FBS, 1% AA, 2mM L-Glutamine가 추가된 Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12=1:1) 배지에 본 발명의 제조예에서 제조한 화합물 MMB-11903B 및 DO3A를 10 μM 의 농도로 처리하여 37℃, 5% CO2 상태에서 배양하였다. 배양 후 1, 3, 5일째 수확된 세포는 DPBS로 수세하여 10% Neutral Buffered Formalin에 10분간 고정하고 Tris-buffered saline (TBS)에 3번 수세 후, 0.3% Triton X-100 (in TBS)에 15분간 반응시켰다. TBS에 3번 수세하고, 5%의 Bovine serum albumin (BSA)과 Normal Goat Serum (NGS) in TBS의 용액을 넣고 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. Neuron specific marker로써 β-III tubulin 1차 항체, newborn immature neuron marker로 doublecortin의 1차 항체를 이용하여 신경세포의 분화 및 신경 돌기의 유도를 확인하였다. 1차 항체를 4℃에서 24시간 동안 반응 후, TBS에 3번 수세하고 2차 항체는 Alexa Fluor®488 fluorescent (green)와 Alexa Fluor®555 fluorescent (red)를 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. TBS에 3번 수세하고 마운트 (VECTASHIELD®Mounting Medium with DAPI; Vector Laboratories, Bur- lingame, CA, USA)하였고 형광현미경으로 이미지를 획득하였다. 이렇게 획득된 이미지를 도 5a에 나타내었다. 도 5a에서 알 수 있듯이, 본 발명의 화합물 MMB-11903B로 처리한 경우에는 신경 돌기의 신장 및 신경 돌기 네트워크의 형성이 뚜렷해지는 반면, DO3A를 처리하였을 경우, 신경 돌기의 신장이 관찰되지 않는다.
ImageJ 프로그램을 이용하여 신장 돌기의 길이를 측정하였다. 세포체 길이의 2배 이상이 된 신경 돌기의 길이만 측정하였다. 계산된 값은 GraphPad Prism 응용 프로그램을 이용하여 그래프를 그렸다. 해당 그래프를 도 5b에 나타내었다. 나온 수치의 통계적 유의성은 일원 분산 분석(One-way ANOVA with Dunnett’multiple comparison test)을 통해 확인하였다. *p<0.5, ***p<0.01 vs. control, ##p<0.1, ### p<0.01 vs. DO3A에 대해 유의성을 가진다. 신경 세포 표지자를 이용한 형광 염색 후, 신경 돌기의 길이를 측정한 결과, MMB-11903B의 backbone에 대당하는 DO3A는 대조군과 마찬가지로 신경돌기의 신장을 나타내지 않았으며, 대조군과 DO3A처리군에 비해 본 발명의 화합물 MMB-11903B에 의한 신경세포의 신경돌기 신장은 1일째 평균 1.7배, 3일째 평균 2.6배, 5일째 평균 2.5배의 증가를 유도하였다.
4-3) 면역형광염색법(immunofluorescence staining)을 이용한 신경 돌기 신장 및 신생 뉴런의 생성과 성장 효과의 시험
추가로, 전술한 방법과 동일한 방법에 따르되, DO3A가 아니라 ATRA를 비교 화합물로 하여 면역형광염색법에 따른 신경 세포 분화를 관찰하였다. 형광 현미경으로 획득한 이미지를 도 6a에 나타내었다.
ImageJ 프로그램을 이용하여 컬러 히스토그램을 측정하였다. 계산된 값은 GraphPad Prism 응용 프로그램을 이용하여 그래프를 그렸다. 상기 그래프를 도 6b에 나타내었다. 대조군(무처리군)과 양성 대조군인 ATRA 처리군에 비해, 본 발명의 화합물 MMB-11903B의 처리에 의해 3일째부터 신경세포의 분화 및 발현이 증가하였고, 이는 5일째까지도 높은 발현을 유지함을 확인하였다. 신생 뉴런의 발현 또한 대조군과 양성 대조군 ATRA처리 군이 낮게 유지되는 것에 비해, 3일째부터 현저히 증가함을 확인하였다. 나온 수치의 통계적 유의성은 일원 분산 분석(One-way ANOVA with Dunnett' multiple comparison test)을 통해 확인하였다. *p<0.5, ***p<0.01 vs. control, #p<0.5, ##p<0.1, ### p<0.01 vs. ATRA에 대해 유의성을 가진다.
4-4) 면역형광염색법(immunofluorescence staining)을 이용한 세포 증식 효과의 시험
신경 세포 증식에 대한 표지자인 Ki-67에 대한 양성 개수를 비교하였다. ImageJ 프로그램을 이용하여 자동으로 positive cell number를 획득하였다. 형광현미경으로 획득한 사진은 도 7a에 나타내었다.
[Ki-67 positive cell number의 계산식]
Ki-67 positive cells (%) = (ki-67 positive cell number/DAPI positive cell number)×100
계산된 값은 GraphPad Prism 응용 프로그램을 이용하여 그래프를 그렸다. 해당 그래프를 도 7b에 나타내었다. 노출 1일째에는 대조군(무처리군)에 비해, DO3A 및 본 발명의 화합물 MMB-11903B 처리군에서 2배에 가까운 세포 증식을 나타냈으며, ATRA는 대조군과 유의한 차이를 나타내지 않았다. 노출 3일째에는 ATRA 처리군을 제외하고는 모든 군에서 신경세포 증식을 나타냈으며, 본 발명의 화합물 MMB-11903B의 경우 5일째까지 높은 신경세포 증식률을 나타냈었다. 본 발명의 화합물 MMB-11903B에 의해 신경 세포로의 분화를 촉진함과 동시에 새로운 신경 세포의 증식 또한 유도함을 확인하였다. 나온 수치의 통계적 유의성은 일원 분산 분석(One-way ANOVA with Dunnett’multiple comparison test)을 통해 확인하였다. *p<0.5, **p<0.1, ***p<0.01 vs. control, #p<0.5, ## p<0.1 vs. DO3A, †p<0.5, †††p<0.01 vs. ATRA에 대해 유의성을 가진다.
전술한 실시예 4-1 내지 4-4로부터 본 발명의 화합물 MMB-11903B는 신경세포주에서 대조군인 DO3A나 ATRA에 비해, 신경 세포의 증식을 유발하고 이러한 증식을 유지시킬 수 있다는 것을 알 수 있는 동시에, 신경 돌기의 생성 및 신장을 유도하여 신경세포로의 분화를 촉진한다는 것을 알 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (12)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure 112021108929264-pat00015

    상기 화학식 1 에서,
    R1 내지 R3 은 각각 독립적으로, 수소, 선형 또는 분지형의 (C1-C10)알킬이거나, 임의 결합을 형성하기 위한 전자쌍을 나타내고,
    A 는 *-(CH2)n-A1-*를 나타내고,
    n 은 0 내지 5 중 임의 정수를 나타내고,
    A1 은 *-COO-*, *-CO-*, *-NR4-*, *-CH2-*, *-CONH-*, 또는 *-O-*를 나타내고,
    Linker는 *-L1-NHCO-L2-*, *-L1-O-R-O-L2-*, *-L1-CH2-L2-*, *-L1-NR5-L2-*, 또는 *-L1-COO-L2-* 를 나타내고,
    L1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C30)알킬을 나타내고,
    L2 는 단일 결합, 또는 선형 또는 분지형의 (C1-C30)알킬을 나타내고,
    R 은 선형 또는 분지형의 (C1-C20)알킬을 나타내고,
    R4 및 R5는, 각각 독립적으로, 수소 또는 선형 또는 분지형의 (C1-C10)알킬을 나타내고,
    B 는 하기 화학식 2a, 2b, 또는 2c를 나타내는 것을 특징으로 하는 화합물이다:
    [화학식 2a]
    Figure 112021108929264-pat00016

    [화학식 2b]
    Figure 112021108929264-pat00017

    [화학식 2c]
    Figure 112021108929264-pat00018
    .
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 B는 화학식 2a를 나타내는 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 R1 내지 R3은 수소 또는 임의 결합을 형성하기 위한 전자쌍을 나타내는 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 n은 1 내지 5 중 임의 정수를 나타내고, 상기 A1은 *-CONH-*을 나타내는 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 Linker는 *-L1-NR5-L2-*를 나타내고, R5 는 수소인 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 L1 은 선형 또는 분지형의 (C1-C10)알킬을 나타내고, 상기 L2 는 단일 결합을 나타내는 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 제1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 뇌 신경 손상, 퇴행성 뇌질환, 허혈성 뇌질환, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 간질, 기억력 감퇴, 또는 허혈성 뇌졸중, 말초 신경 손상, 척수 손상, 시신경 손상, 근위축성 축색 경화증, 운동 실조, 또는 말초 신경 질환 또는, 뇌 신경 발달 장애를 치료 또는 예방하기 위한, 약제학적 조성물.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
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