WO2023106883A1 - 신규한 화합물, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 신경 손상, 신경 질환, 또는 발달 장애에 대한 신경세포의 증식 촉진, 분화, 및/또는 재생을 통한 치료 또는 예방용 약제학적 조성물 - Google Patents
신규한 화합물, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 신경 손상, 신경 질환, 또는 발달 장애에 대한 신경세포의 증식 촉진, 분화, 및/또는 재생을 통한 치료 또는 예방용 약제학적 조성물 Download PDFInfo
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F3/00—Compounds containing elements of Groups 2 or 12 of the Periodic Table
- C07F3/04—Calcium compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
Definitions
- the present invention relates to a novel compound, a method for preparing the same, and a pharmaceutical composition for treating or preventing nerve damage, neurological disease, or developmental disorder by promoting proliferation, differentiation, and/or regeneration of nerve cells containing the same.
- Nerve cells are distributed in many parts of the body, including the brain, and the body can feel, think, respond to, and exercise external situations by transmitting signals between nerve cells. Therefore, when nerve cells die due to certain factors, various symptoms such as cognitive impairment symptoms, paralysis symptoms, sensory disorder symptoms, and motor abnormalities symptoms may appear.
- Alzheimer's disease is caused by the death of nerve cells that exist in areas responsible for memory in the brain
- Parkinson's disease is caused by the death of nerve cells that exist in areas that control movement of the body.
- nerve cells When nerve cells die, they are very difficult to regenerate. In the case of other cells such as the skin, even if a cell is destroyed by damage, other cells around it divide and create new cells to replace the cell, but unlike other cells, nerve cells do not undergo cell division. It is very difficult to treat diseases associated with the death of Accordingly, the treatment of many diseases caused by the death of nerve cells has been limited to relieving symptoms. There is still a need for the development of materials that can effectively treat or prevent nerve damage, neurological diseases, and developmental disorders through regeneration of nerve cells.
- One object of the present invention is to provide a novel compound that can effectively treat or prevent nerve damage, neurological disease, or developmental disorder, a method for preparing the same, and a pharmaceutical composition containing the same.
- a compound for one purpose of the present invention is represented by Formula 1 below.
- M is any one selected from Gd 3+ , Mg 2+ and Ca 2+
- A represents *-(CH 2 ) n -NH-* (where n is an integer from 0 to 5).
- B represents a part derived from retinoic acid.
- a in Chemical Formula 1 may be *-(CH 2 ) 2 -NH-* ethylamine.
- the B in Formula 1 may represent the following Formula 2a, 2b, or 2c.
- the compound may be represented by Formula 3 below.
- M is any one selected from Gd 3+ , Mg 2+ and Ca 2+ .
- a pharmaceutical composition for another purpose of the present invention comprises the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof, characterized in that it contains cranial nerve damage, degenerative brain disease, ischemic brain disease, dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Epilepsy, memory loss, or ischemic stroke, peripheral nerve injury, spinal cord injury, optic nerve injury, amyotrophic axonal sclerosis, ataxia, or peripheral nerve disease or, for treating or preventing cranial nerve development disorders.
- a method for preparing a compound for another object of the present invention is to combine a compound represented by Chemical Formula 4-1 with a compound represented by Chemical Formula 4-2 to obtain a compound represented by Chemical Formula 4-3 It is characterized in that it comprises a first step of manufacturing.
- the present invention is characterized by using a compound represented by Formula 4-1 using ethylamine (*-(CH 2 ) 2 -NH 2 ) as a linker.
- the present invention is characterized by providing a manufacturing method suitable for mass production by providing a higher yield by using -(CH 2 ) n -NH- as a linker.
- A represents *-(CH 2 ) n -NH 2 (where n is an integer from 0 to 5).
- B represents a moiety derived from retinoic acid.
- A represents *-(CH 2 ) n -NH-* (where n is an integer from 0 to 5), and B represents a moiety derived from retinoic acid.
- a second step of preparing a compound represented by the following Chemical Formula 1 by coordinating a metal element with the compound represented by Chemical Formula 4-3 may be further included.
- M is any one selected from Gd 3+ , Mg 2+ and Ca 2+
- A represents *-(CH 2 ) n -NH-* (where n is an integer from 0 to 5).
- B represents a part derived from retinoic acid.
- B may represent Chemical Formulas 2a, 2b, or 2c below.
- the compound according to the present invention can directly induce or promote the generation of neurites, the growth of neurites, the differentiation of nerve cells, the regeneration of nerve cells, and/or the proliferation of nerve cells, which is fundamental for various nervous system diseases. treatment can be provided.
- the cytotoxicity is low, there are few side effects due to drug toxicity.
- the solubility and dissolution stability in water are high, the formulation flexibility of the formulation is high and the absorption rate in the body is increased, the nerve regeneration, differentiation, and protective effects can be further increased.
- the production rate of by-products in the manufacturing process is very low, and a high compound synthesis yield can be provided, and mass production is easy, so there is an advantage that it can be applied to various fields.
- a metal atom there is an effect of providing low toxicity and high stability.
- FIG. 1 is a view showing the novel compound of the present invention and its preparation method.
- Figure 2 is a diagram showing the results of high-resolution mass spectrometry of the compounds of the present invention according to an embodiment of the present invention.
- Figure 3 is a diagram for comparing cell viability results of the compound of the present invention and ATRA according to an embodiment of the present invention.
- Figure 4 is a diagram for comparative analysis of cell morphological changes between the compound of the present invention and ATRA according to an embodiment of the present invention.
- 5 and 6 are diagrams for comparative analysis of the results of neurite elongation promotion of the compound of the present invention and ATRA according to an embodiment of the present invention.
- FIG 7 and 8 are diagrams for comparative analysis of the results of the generation and growth of new neurons of the compound of the present invention and ATRA according to an embodiment of the present invention.
- 9 and 10 are views for comparative analysis of cell proliferation results of the compound of the present invention and ATRA according to an embodiment of the present invention.
- a pharmaceutical composition containing the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is provided.
- the compound of Formula 1 according to the present invention induces generation of neurite, growth of neurite, differentiation of nerve cell, regeneration of nerve cell, and/or proliferation of nerve cell for nerve damage, neurological disease, or developmental disorder. useful to promote
- nerve refers to projections from the cell body of a nerve cell and includes, for example, axons and dendrites.
- the production of neurites, the growth of neurites, the differentiation of nerve cells, the regeneration of nerve cells, and/or the nerve cells containing the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof A pharmaceutical composition for inducing or promoting the proliferation of is provided.
- the compound of the present invention or a pharmaceutical thereof is administered to a subject or nerve cell in need of generation of neurite, growth of neurite, differentiation of nerve cell, regeneration of nerve cell, or proliferation of nerve cell.
- a method of inducing or promoting neurite production, neurite growth, neuronal differentiation, neuronal regeneration, or neuronal proliferation, comprising administering an acceptable salt thereto, is provided.
- a pharmaceutical composition for treating or preventing nerve damage, neurological disease, or developmental disorder characterized by containing the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof is provided. .
- the term “treatment” is one in which a desired therapeutic effect is achieved in a subject, and includes reduction of the rate of progression, cessation of the rate of progression, alleviation of symptoms, improvement of the condition, and cure of the condition.
- the compounds according to the present invention can provide fundamental healing of diseases through morphological and functional recovery of damaged cells, and thus, the treatment specifically refers to the treatment of diseases by morphological and functional recovery of nerve cells.
- prevention may refer to use for a subject who has not yet developed a disease but is at risk of developing the disease.
- nerve injury refers to any damage to the nervous system, such as spinal cord injury or optic nerve injury, which is eg trauma-induced, chemically induced (eg by neurotoxins or having an immunosuppressive effect). therapy), or damage to the nervous system caused by a disease or disorder.
- nerve damage includes damage to the central nervous system (CNS) and damage to the peripheral nervous system (PNS), more specifically cranial nerve damage, spinal cord damage, optic nerve damage, peripheral nerve damage, and the like.
- neurodegenerative diseases includes neurodegenerative diseases, ischemic neurological diseases, and peripheral nerve diseases.
- the "degenerative neurological disease” specifically includes degenerative brain diseases (eg, memory loss, dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, etc.), amyotrophic axonal sclerosis, ataxia, epilepsy, and the like.
- the "ischemic neurological disease” specifically includes ischemic brain disease (eg, ischemic stroke).
- peripheral nerve disease specifically includes polyneuropathy, mononeuropathy, mononeuritis multiplex, and autonomic neuropathy.
- developmental disorder includes cranial neurodevelopmental disorders.
- the compounds of the present invention can generate and grow neurites of nerve cells and differentiate, regenerate, and proliferate nerve cells. Accordingly, the compounds of the present invention or their A pharmaceutical composition containing a pharmaceutically acceptable salt may be used for treating or preventing nerve damage, neurological disease, or developmental disorder. In addition, the compound of the present invention can be very usefully used as an agent for improving learning ability or cognitive function.
- nerve damage including the step of administering the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject in need of treatment or prevention of nerve damage, neurological disease, or developmental disorder , a neurological disease, or a method for treating or preventing a developmental disorder is provided.
- a pharmaceutical composition for treating or preventing cranial nerve damage, degenerative brain disease, or ischemic brain disease comprising the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof Provided.
- treatment or treatment of dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, epilepsy, memory loss, or ischemic stroke characterized by containing the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
- a pharmaceutical composition for preventing is provided.
- peripheral nerve damage spinal cord injury, optic nerve damage, amyotrophic axonal sclerosis, ataxia, or peripheral nerve damage characterized by containing the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
- a pharmaceutical composition for treating or preventing a neurological disorder is provided.
- a pharmaceutical composition for treating or preventing brain neurodevelopmental disorders comprising the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
- the compound of Formula 1 according to the present invention may be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt.
- the "pharmaceutically acceptable salt” refers to a compound salt that retains the pharmacological activity of the parent compound, and includes, for example, (i) salts formed with inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, and phosphoric acid; (ii) acetic acid, propionic acid, isobutyric acid, glycolic acid, lactic acid, pyruvic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, fumaric acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, ascorbic acid, palmitic acid, maleic acid, hydroxymaleic acid, benzoic acid , salts formed with organic acids such as hydroxybenzoic acid, phenylacetic acid, cinnamic acid, salicylic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid
- the pharmaceutical composition of the present invention may contain an isomer, solvate, or prodrug of the compound represented by Formula 1 of the present invention.
- “Isomer” herein includes all possible stereochemical isomers, including diastereomers and enantiomers. It is to be understood that the compounds of the present invention refer to mixtures of all possible stereochemically isomeric forms.
- solvate refers to a complex of a solute (eg, a compound of Formula 1) and a solvent, and when the solvent is water, the solvate may be referred to as a hydrate.
- prodrug refers to a compound that is converted into an active compound having a medicinal effect by absorption and metabolism after being administered in vivo.
- the prodrug is a compound that is itself inactive or less active than the active compound, but may provide properties that are advantageous for handling, administration, or metabolism.
- the prodrug may be in the form of an ester of the active compound (eg, a physiologically acceptable metabolically labile ester) or a form of a sugar derivative or an amino acid ester derivative.
- the pharmaceutical composition of the present invention may include the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof alone, but may further include a pharmaceutically acceptable carrier in addition thereto.
- the pharmaceutically acceptable carrier may be one commonly used in the pharmaceutical field, and may include an excipient (eg, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, sorbitol, mannitol, cellulose, etc.) or a diluent (eg, physiological saline, purified water, etc.).
- the pharmaceutical composition of the present invention pharmaceutically acceptable additives other than the above pharmaceutically acceptable carrier, for example, binders, disintegrants, lubricants, peeling agents, film coating bases, enteric films It may further contain a coating agent, a soft capsule agent, a dissolution aid, an emulsifier, a suspending agent, a stabilizer, a buffer, an antioxidant, a surfactant, a sweetening agent, a flavoring agent, a preservative, a thickening agent, a flavoring agent, or a coloring agent.
- binders for example, binders, disintegrants, lubricants, peeling agents, film coating bases, enteric films It may further contain a coating agent, a soft capsule agent, a dissolution aid, an emulsifier, a suspending agent, a stabilizer, a buffer, an antioxidant, a surfactant, a sweetening agent, a flavoring agent, a preservative, a thickening agent, a flavoring agent,
- the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally.
- parenteral administration intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, intradermal administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, and intrarectal administration may be used.
- the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in the form of a solid or liquid dosage form.
- Solid formulations may be, for example, tablets, capsules (soft & hard capsules), powders, granules, pills, troches, etc.
- liquid formulations may be, for example, elixirs, suspensions, emulsions, solutions, syrups , rimona dese, etc. may be in the form.
- the active ingredient in addition to the active ingredient, carriers such as lactose and corn starch, lubricants such as magnesium stearate, binders such as methylcellulose, microcrystalline cellulose, and polyvinyl alcohol, and disintegrants such as bentonite and sodium alginate are usually added. It can be.
- the active ingredient may be formulated with a carrier such as purified water, physiological saline, and the like, and, if necessary, a solubilizing agent such as sucrose monostearate, a stabilizer such as polyvinylpyrrolidone, and the like.
- the active ingredient may be formulated with a suspending agent and, if necessary, a surfactant, a preservative, a stabilizer, and the like.
- the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be determined in consideration of the administration method, the age and sex of the user, the severity of the patient, the condition, inactivity rate, and concomitant drugs, and can be administered once or divided into several times.
- Figure 2 is a diagram showing the results of high-resolution mass spectrometry of the compounds of the present invention according to an embodiment of the present invention.
- the mass-to-charge ratio (m/z) of the compound of the present invention developed in one embodiment of the present invention is observed to be 834.1912 , which is the theoretical m/ This is a result corresponding to a z value of 834.1909.
- CCK-8 Cell viability analysis using CCK-8 was performed on an undifferentiated neuroblastoma, SH-SY5Y, a human neuroblastoma cell line.
- CCK-8 Cell counting kit-8 is analyzed using highly water-soluble tetrazolium salt-SST-8, [2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl )(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt] yields a water-soluble formazan orange dye when reduced in the presence of an electron mediator.
- the amount of formazan dye produced by dehydrogenase in cells is directly proportional to the number of living cells.
- SH-SY5Y was grown in Minimal Essential Medium (MEM) supplemented with 10% FBS (Fetal bovine serum), 1% AA (Antibiotic-Antimycotic), and 2 mM L-Glutamine.
- MEM Minimal Essential Medium
- FBS Fetal bovine serum
- AA Antibiotic-Antimycotic
- 2 mM L-Glutamine 2 mM L-Glutamine.
- Cells were suspended in 200 ⁇ L of medium at a density of 1 ⁇ 10 4 cells/well and planted in each well of a 96-well plate for cell viability analysis. At 37° C., 5% CO 2 for more than 14 hours, the cells were attached and stabilized in an incubator.
- A The absorbance value measured in the control well
- B The absorbance value measured in the well containing the drug.
- Figure 3 is a view showing the cell viability results of the compound according to an embodiment of the present invention.
- ATRA exhibited lower cell viability as the concentration increased, whereas the compound of the present invention exhibited higher cell viability regardless of the concentration. That is, it can be seen that the survival rate is always higher than that of the case where the compound of the present invention is not administered. That is, it can be seen that cell viability can be further increased by using the compound of the present invention, and it shows that there is no toxicity to nerve cells even at high concentrations.
- SH-SY5Y was grown in MEM medium supplemented with 10% FBS, 1% AA, and 2 mM L-glutamine, and the stabilized cells were plated in 60 mm dishes at a density of 4 ⁇ 10 5 /dish for cell viability analysis. planted in At 37° C., 5% CO 2 for more than 14 hours, the cells were attached and stabilized in an incubator. The next day, the growth medium was removed, and DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture, 1:1) medium supplemented with 1% FBS, 1% AA, and 2mM L-glutamine for differentiation induction of the present invention was added.
- DMEM/F-12 Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture, 1:1
- Compounds and ATRA were diluted at various concentrations (0, 1, 5, 10 ⁇ M) and cultured for 1 day and 3 days, respectively, at 37° C. in a 5% CO 2 atmosphere.
- the cell morphology was obtained using a microscope (Nikon, ECLIPSE Ts2, Nikon Corporation, Tokyo, Japan). The results are shown in FIG. 4 .
- SH-SY5Y was grown in MEM medium supplemented with 10% FBS, 1% AA, and 2 mM L-glutamine, and the stabilized cells were plated in 60 mm dishes at a density of 4 ⁇ 10 5 /dish for cell viability analysis. planted in At 37° C., 5% CO 2 for more than 14 hours, the cells were attached and stabilized in an incubator. The next day, the growth medium was removed, and DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture, 1:1) medium supplemented with 1% FBS, 1% AA, and 2mM L-glutamine for differentiation induction of the present invention was added.
- DMEM/F-12 Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture, 1:1
- the compound and ATRA were treated at concentrations of 0, 1, 5, and 10 ⁇ M, respectively, and cultured at 37° C. under 5% CO 2 conditions.
- Cells harvested on the 1st and 3rd day after culture were washed with DPBS, fixed in 10% formalin (Neutral Buffered Formalin) for 10 minutes, washed 3 times in buffer (Tris-buffered saline), and 0.3% Triton X-100 (in TBS) for 15 minutes. After washing with water three times in TBS, the mixture was reacted with 5% bovine serum albumin (BSA) and normal goat serum (NGS) (in TBS) at 4°C for 24 hours.
- BSA bovine serum albumin
- NGS normal goat serum
- ⁇ -III tubulin primary antibody as a neuron specific marker
- doublecortin primary antibody as a newborn immature neuron marker
- Ki-67 as a cell proliferation marker
- Neuronal differentiation and neurite induction were confirmed using the primary antibody.
- 5 and 6 are diagrams for comparative analysis of neurite promotion of the compound of the present invention and ATRA.
- green color which means ⁇ -III tubulin, which is a neuron-specific marker
- the length of the neurites increased from day 1 to day 3 compared to the control group.
- the length of the kidney process was measured using the ImageJ program. At this time, only the length of neurites more than twice the length of the cell body was measured. The calculated values were graphed using the GraphPad Prism application. The results are shown in Figure 6a.
- FIG. 6B quantifies the density of ⁇ -III tubulin in green color compared to the number of cell nuclei in blue color in FIG. 5 . As a result, from day 1 to day 3, it was confirmed that the increase in neuron-specific markers by the compound of the present invention was greater than that by ATRA. Statistical significance of the numbers was confirmed through One-way ANOVA with Dunnett's multiple comparison test. *p ⁇ 0.05 Inventive vs. It has significance for the number of differentiation days.
- FIG 7 and 8 are diagrams for comparative analysis of the generation and growth of new neurons of the compound of the present invention and ATRA.
- green color which means double cortin, which is an immature neuron marker
- ⁇ -III tubulin it was confirmed that the length of neurites increased from day 1 to day 3 compared to the control group, and the density of double cortin in green was quantified compared to the number of cell nuclei in blue. It was confirmed that, from day 1 to day 3, the increase in immature neuron markers by the compound of the present invention was greater than that by ATRA.
- FIG 9 and 10 are diagrams for comparative analysis of the cell proliferation results of the compound of the present invention and ATRA.
- the number of positives for Ki-67 was compared.
- the number of positive cells was automatically obtained using the ImageJ program.
- the number of Ki-67 positive cells was calculated as follows.
- the present invention promotes differentiation into neurons by inducing and maintaining the proliferation of neurons, and at the same time inducing generation and elongation of neurites, compared to ATRA, which is a control group, in a neuronal cell line.
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Abstract
발명은 신규한 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약제학적 조성물을 개시한다. 본 발명의 화합물은 하기 화학식 1으로 표시된다. 상기 화학식 1에서, M은 Gd3+, Mg2+ 및 Ca2+ 중에서 선택된 어느 하나이며, A는 *-(CH2)n-NH-*(여기서, n은 0 내지 5인 정수)를 나타내고, B는 레티노산(retinoic acid)에서 유래된 부분을 나타낸다.
Description
본 발명은 신규한 화합물, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 신경 손상, 신경 질환, 또는 발달 장애에 대한 신경세포의 증식 촉진, 분화, 및/또는 재생을 통한 치료 또는 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
신경 세포는 뇌를 비롯하여 몸의 수많은 곳에 분포되어 있으며, 신체는 신경 세포들 간의 신호 전달에 의해 외부 상황을 느끼고, 생각하고, 반응하고, 운동할 수 있다. 따라서, 어떠한 요인으로 인해 신경 세포가 사멸하게 되면 인지 장애 증상, 마비 증상, 감각 장애 증상, 운동 이상 증상 등과 같은 다양한 증상이 나타날 수 있다. 알츠하이머병은 뇌 안의 기억을 담당하는 곳에 존재하는 신경 세포의 사멸로 인해 발생하며, 파킨슨병은 신체의 운동을 조절하는 곳에 존재하는 신경 세포가 사멸되어 증상이 나타나는 것이다.
신경 세포는 사멸되면 다시 재생하기가 매우 어렵다. 피부와 같은 다른 세포의 경우 손상에 의해 세포가 파괴되어도 주위의 다른 세포들이 세포 분열을 하여 그 세포를 대체할 새로운 세포를 만들지만, 신경 세포는 다른 세포와는 달리 세포분열이 일어나지 않기 때문에 신경 세포의 사멸과 관련된 질환을 치료하는 것은 매우 어렵다. 이에 따라, 현재까지 신경 세포의 사멸로 인한 많은 병의 치료는 증상을 완화시키는 방법에 그치고 있는 수준이다. 신경 세포의 재생을 통해 신경 손상이나 신경 질환, 발달 장애를 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있는 물질의 개발이 여전히 요구되고 있다.
본 발명의 일 목적은 신경 손상, 신경 질환, 또는 발달 장애를 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있는 신규한 화합물, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적을 위한 화합물은 하기 화학식 1으로 표시된다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서, M은 Gd3+, Mg2+ 및 Ca2+ 중에서 선택된 어느 하나이며, A는 *-(CH2)n-NH-*(여기서, n은 0 내지 5인 정수)를 나타내고, B는 레티노산(retinoic acid)에서 유래된 부분을 나타낸다.
일 실시예에서, 상기 화학식 1에서 A는 *-(CH2)2-NH-* 에틸아민일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 화학식 1에서 상기 B는 하기 화학식 2a, 2b, 또는 2c를 나타낼 수 있다.
[화학식 2a]
[화학식 2b]
[화학식 2c]
일 실시예에서, 상기 화합물은 하기 화학식 3으로 표시될 수 있다.
[화학식 3]
상기 화학식 3에서, M은 Gd3+, Mg2+ 및 Ca2+ 중에서 선택된 어느 하나이다.
본 발명의 다른 목적을 위한 약제학적 조성물은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 뇌 신경 손상, 퇴행성 뇌질환, 허혈성 뇌질환, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 간질, 기억력 감퇴, 또는 허혈성 뇌졸중, 말초 신경 손상, 척수 손상, 시신경 손상, 근위축성 축색 경화증, 운동 실조, 또는 말초 신경 질환 또 는, 뇌 신경 발달 장애를 치료 또는 예방하기 위한 것이다.
일 실시예에서, 본 발명의 또 다른 목적을 위한 화합물의 제조방법은 하기 화학식 4-1으로 표시되는 화합물과 하기 화학식 4-2로 표시되는 화합물을 결합시켜 하기 화학식 4-3으로 표시되는 화합물을 제조하는 제1 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 에틸아민(*-(CH2)2-NH2)을 링커로 하는 하기 화학식 4-1으로 표시되는 화합물을 이용하는 것을 특징으로 한다. DO3A 화합물에 RA(Retinoic acid, 레티노산)을 결합하는 종래 기술에서는 DO3A에 aminde bond(CONH)-(CH2)n-NH-를 링커로 붙인 후 RA를 결합하는 방법을 사용하고 있으나, 이는 제조과정에서 많은 양의 부산물이 생성되어 수율이 낮은 문제점이 있었다. 본 발명에서는 링커로 -(CH2)n-NH-를 사용함으로써 보다 높은 수율을 제공하여 대량생산에 적합한 제조 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
[화학식 4-1]
화학식 4-1에서,
A는 *-(CH2)n-NH2 (여기서, n은 0 내지 5인 정수)를 나타낸다.
[화학식 4-2]
화학식 4-2에서, B는 레티노산(retinoic acid)에서 유래된 부분을 나타낸다.
[화학식 4-3]
화학식 4-3에서, A는 *-(CH2)n-NH-*(여기서, n은 0 내지 5인 정수)를 나타내고, B는 레티노산(retinoic acid)에서 유래된 부분을 나타낸다.
일 실시예에서, 상기 제1 단계 이후, 화학식 4-3으로 표시되는 화합물에 금속원소를 배위결합시켜 하기 화학식 1으로 표시되는 화합물을 제조하는 제2 단계를 추가로 더 포함할 수 있다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서, M은 Gd3+, Mg2+ 및 Ca2+ 중에서 선택된 어느 하나이며, A는 *-(CH2)n-NH-*(여기서, n은 0 내지 5인 정수)를 나타내고, B는 레티노산(retinoic acid)에서 유래된 부분을 나타낸다.
일 실시예에서, 상기 화학식 4-2에서, 상기 B는 하기 화학식 2a, 2b, 또는 2c를 나타낼 수 있다.
[화학식 2a]
[화학식 2b]
[화학식 2c]
현재까지 신경 손상 또는 신경 퇴화 및 이와 관련된 각종 질병의 치료는 질병의 진행을 완화하는 수준이었으며, 이들의 완전한 치료제는 전무한 상황이었다. 본 발명에 따른 화합물은 직접적으로 신경 돌기의 생성, 신경 돌기의 성장, 신경 세포의 분화, 신경 세포의 재생, 및/또는 신경 세포의 증식을 유발 또는 촉진시킬 수 있는 바, 각종 신경계 질환에 대한 근본적인 치료를 제공할 수 있다. 아울러, 세포 독성이 낮아서 약물 독성에 따른 부작용이 적다. 또한, 물에 대한 용해도 및 용해 안정성이 높아서 제제의 제형 유연성이 높고 체내 흡수율이 증가하게 되므로 신경 재생, 분화, 보호 효과가 더욱 증대될 수 있다.
또한 본 발명에 따르면, 제조 공정에서 부산물의 생성율이 매우 낮아 높은 화합물 합성 수율을 제공할 수 있고, 대량생산이 용이하여 다양한 분야에 응용할 수 있는 장점이 있다. 또한, 금속원자를 포함함으로써 독성이 낮고 높은 안정성을 제공할 수 있는 효과가 있다.
도 1는 본 발명의 신규한 화합물 및 이의 제조방법을 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명 화합물의 고분해능 질량분석 결과를 보여주는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명 화합물과 ATRA의 세포 생존율 결과를 비교하기 위한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명 화합물과 ATRA의 세포 형태 변화를 비교 분석하기 위한 도면이다.
도 5 및 6은 본 발명의 일 실시예의 따른 본 발명 화합물과 ATRA의 신경 돌기 신장 촉진에 대한 결과를 비교 분석하기 위한 도면이다.
도 7 및 8은 본 발명의 일 실시예의 따른 본 발명 화합물과 ATRA의 신생 뉴런의 생성 및 성장에 대한 결과를 비교 분석하기 위한 도면이다.
도 9 및 10은 본 발명의 일 실시예의 따른 본 발명 화합물과 ATRA의 세포 증식에 대한 결과를 비교 분석하기 위한 도면이다.
이하, 본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 전술한 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 신경 손상, 신경 질환, 또는 발달 장애에 대해 신경 돌기의 생성, 신경 돌기의 성장, 신경 세포의 분화, 신경 세포의 재생, 및/또는 신경 세포의 증식을 유발 또는 촉진하는데 유용하다.
용어 "신경 돌기"는 신경 세포의 세포체로부터의 돌출부를 의미하며, 예를 들어 축삭 및 수상돌기를 포함한다.
이에, 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 신경 돌기의 생성, 신경 돌기의 성장, 신경 세포의 분화, 신경 세포의 재생, 및/또는 신경 세포의 증식을 유발 또는 촉진하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 신경 돌기의 생성, 신경 돌기의 성장, 신경 세포의 분화, 신경 세포의 재생, 또는 신경 세포의 증식이 필요한 대상체 또는 신경 세포에 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는, 신경 돌기의 생성, 신경 돌기의 성장, 신경 세포의 분화, 신경 세포의 재생, 또는 신경 세포의 증식을 유발 또는 촉진하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 신경 손상, 신경 질환, 또는 발달 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 대상체에게 바람직한 치료 효과가 구현되는 것이며, 진행 속도의 감소, 진행 속도의 중단, 증상의 경감, 병태의 개선, 및 병태의 치유를 포함한다. 본 발명에 따른 화합물은 손상된 세포의 형태적 및 기능적 회복을 통해 질환의 근본적인 치유를 제공할 수 있으며, 이에, 상기 치료는 구체적으로는 신경 세포의 형태적 및 기능적 회복에 의한 질환의 치료를 의미한다. 또한, 용어 "예방"은 아직 병이 발병되지 않았으나 발병 위험이 있는 대상체에 대한 사용을 의미할 수 있다.
용어 "신경 손상"은 척수 손상이나 시신경 손상과 같은 신경계의 임의 손상을 지칭하는 것으로서, 이는 예를 들어 외상에 의해 유발되거나, 화학적으로 유발되거나 (예를 들어, 신경독에 의해 또는 면역억제 효과를 가지는 치료 요법에 의해 유발), 또는 질환이나 장애에 의해 유발된 신경계의 손상을 포함한다. 또한, 상기 신경 손상은 중추 신경계(CNS)의 손상 및 말초 신경계(PNS)의 손상, 더 구체적으로는 뇌 신경 손상, 척수 손상, 시신경 손상, 말초 신경 손상 등을 포함한다.
용어 "신경 질환"은 퇴행성 신경 질환, 허혈성 신경 질환, 및 말초 신경 질환을 포함한다. 상기 "퇴행성 신경 질환"은 구체적으로는 퇴행성 뇌질환 (예를 들어, 기억력 감퇴, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 등), 근위축성 축색 경화증, 운동 실조, 간질 등을 포함한다. 상기 "허혈성 신경 질환"은 구체적으로 허혈성 뇌질환 (예를 들어, 허혈성 뇌졸중)을 포함한다. 상기 "말초 신경 질환"은 구체적으로는 다발신경병증, 단일신경병증, 다발성 단일신경염, 및 자율 신경병증을 포함한다.
용어 "발달 장애"는 뇌 신경 발달 장애를 포함한다.
본 발명의 화합물은, 후술하는 실시예에서도 알 수 있듯이 본 발명의 화합물은 신경 세포의 신경 돌기를 생성, 성장시키고 신경 세포를 분화, 재생, 증식시킬 수 있으므로, 이에 따라 본 발명의 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 약제학적 조성물은 신경 손상, 신경 질환, 또는 발달 장애를 치료 또는 예방하는 용도로 사용될 수 있다. 아울러, 본 발명의 화합물은 학습능력 향상제 또는 인지기능 개선제로서도 매우 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 신경 손상, 신경 질환, 또는 발달 장애의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는, 신경 손상, 신경 질환, 또는 발달 장애의 치료 또는 예방 방법이 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 뇌 신경 손상, 퇴행성 뇌질환, 또는 허혈성 뇌질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 간질, 기억력 감퇴, 또는 허혈성 뇌졸중을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 말초 신경 손상, 척수 손상, 시신경 손상, 근위축성 축색 경화증, 운동 실조, 또는 말초 신경 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 뇌 신경 발달 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 약제학적 조성물에서, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 "약학적으로 허용 가능한 염"은 모 화합물의 약물학적 활성을 유지하는 화합물 염을 의미하는 것으로서, 예를 들어 (i) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 및 인산과 같은 무기산과 형성된 염; (ii) 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 석신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르빈산, 팔미트산, 말레인산, 하이드록시말레인산, 벤조산, 하이드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산 및 톨루엔설폰산과 같은 유기산과 형성되는 염; (iii) 모 화합물에 존재하는 산성 프로톤이 금속 이온, 예를 들어 알칼리 금속 이온, 알칼리 토금속 이온, 또는 알루미늄 이온에 의해 교체될 때 형성되는 염; (iv) 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, N-메틸글루카민과 같은 유기 염기와의 배위체; 또는 (v) 알기네이트와 같은 아미노산의 염일 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 상기 화학식 1의 화합물의 이성질체, 용매화물, 또는 프로드러그(prodrug)을 함유할 수 있다. 여기서 "이성질체"는 디아스테레오머 및 에난티오머를 비롯한 모든 가능한 입체화학적 이성질체를 포함한다. 본 발명의 화합물은 모든 가능한 입체화학적 이성질체 형태의 혼합물을 지칭하는 것으로 이해하여야 한다. 또한, 용어 "용매화물"은 용질 (예를 들어 화학식 1의 화합물)과 용매의 복합체를 가리키는 것으로서, 용매가 물인 경우 상기 용매화물은 수화물로 지칭될 수 있다. 용어 "프로드러그"는 생체내에 투여된 후에 생체 흡수 및 대사에 의하여 약효를 갖는 활성 화합물로 변환되는 화합물을 가리킨다. 상기 프로드러그는 그 자체로 비활성이거나 활성 화합물보다 활성이 덜한 화합물이며, 다만, 취급, 투여, 또는 대사에 유리한 특성을 제공할 수 있다. 상기 프로드러그는 활성 화합물의 에스테르 형태 (예를 들어, 생리학적으로 허용 가능한 대사적으로 불안정한 에스테르)이거나 당 유도체의 형태, 또는 아미노산 에스테르 유도체의 형태일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 단독으로 포함할 수 있으나, 그에 추가하여 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 더 포함할 수도 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 약제학 분야에서 통상적으로 사용되는 것일 수 있으며, 부형제 (예를 들어, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스, 락토스, 소르비톨, 만니톨, 셀룰로오스 등) 또는 희석제 (예를 들어, 생리식염수, 정제수 등)일 수 있다.
또한, 필요에 따라, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 이외의 약학적으로 허용 가능한 첨가제, 예를 들어, 결합제, 붕해제, 활택제, 제피제, 필름 코팅 기제, 장용성 필름 코팅 기제, 연질 캡슐 기제, 용해보조제, 유화제, 현탁화제, 안정화제, 완충제, 항산화제, 계면활성제, 감미제, 교미제, 보존제, 점증제, 방향제, 또는 착색제를 더 포함할 수도 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구의 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비강내 투여, 폐내 투여, 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 본 발명의 약제학적 조성물은 고체 또는 액체 제형의 형태로 제형화될 수 있다. 고체 제형은 예를 들어, 정제, 캡슐제(연질 & 경질 캡슐제), 산제, 과립제, 환제, 트로키제 등일 수 있으며, 액체 제형은 예를 들어, 엘릭서, 현탁액제, 유액제, 용액제, 시럽제, 리모나아데제 등의 형태일 수 있다. 정제의 경우, 활성 성분 이외에도, 락토스, 옥수수 전분 등과 같은 담체, 마그네슘 스테아레이트 등과 같은 활택제, 메틸셀룰로오스, 미결정 셀룰로오스, 폴리비닐알코올 등과 같은 결합제, 벤토나이트, 알긴산나트륨 등과 같은 붕해제 등이 통상적으로 추가될 수 있다. 액제의 경우, 활성 성분을 정제수, 생리식염수 등과 같은 담체, 및 필요에 따라 모노스테아린산수크로스 등과 같은 용해보조제, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 안정화제 등과 함께 제제화할 수 있으며, 경구용 수성 현탁액제의 경우, 활성 성분을 현탁화제, 및 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정화제 등과 함께 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 환자의 중증도, 상태, 불활성율, 및 병용되는 약물을 고려하여 결정할 수 있으며, 1회 또는 수 회로 나누어 투여할 수 있다.
이하, 본 발명의 상세한 이해를 위하여 본 발명의 대표 화합물을 들어, 본 발명에 따른 화합물, 이의 제조 방법, 및 이를 함유하는 약제학적 조성물의 특성에 대해서 설명하기로 한다. 단, 본 발명이 다음의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
1. 실시예
도 1을 참조하여, 본 발명의 실시예를 상세하게 설명하기로 한다.
① 화합물 A의 합성
화합물 a 및 화합물 b, K2CO3 및 아세토니트릴(acetonitrile)을 혼합하여 교반하여 화합물 c를 수득하였다. 그런 다음, 수득된 화합물 c를 TFA(trifluoroacetic acid) 및 클로로포름(chloroform, CHCHl3)을 혼합하여 화합물 d를 수득하였다. 상기 수득된 화합물 d에 하이드라진(hydrazine)과 반응시켜, 아민기를 포함하는 화합물 A를 수득하였다.
② 화합물 B의 합성
All trans retinoic acid (4 g, 13.31 mmol)를 90 ml의 THF에 녹인 후 DCC(4.12 g, 19.97 mmol)를 첨가하여 30분간 교반하였다. 30 ml의 THF에 녹인 N-하이드록시숙신이미드(NHS)(2.30 g, 19.97 mmol) 용액을 4℃에서 적가한 후 상온에서 18시간 반응시켰다. 생성된 고체를 여과한 후 용매를 제거하고, 디클로로메탄(DCM)에 다시 녹여 실리카겔 칼럼에 통과시켜 화합물 B를 정제하여 얻었다. 수율은 4.6 g (87.0 %)이다.
③ 본 발명 화합물의 합성
화합물A(2g, 5.14 mmol)를 MeOH 20ml에 녹인 후 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA, 4.47 ml, 25.68 mmol)를 첨가하여 30분간 교반하였다. 화합물 B(2.25g, 5.649 mmol)를 CHCl3 20 ml에 녹인 후 반응액에 적가하고 60℃에서 18시간 반응시킨다. 반응액의 용매를 제거한 후 소량의 MeOH에 녹여 IPE에 투입하고, 1시간 가량 교반하여 노란빛의 고체를 획득하였다. 진공 건조 후, 얻어진 중간체(1.3g, 1.94 mmol)를 DI water 15 ml에 녹인 후 GdCl3·6H2O를 투입하고 30분간 교반한다. 1N NaOH 수용액을 이용하여 pH7.5±0.3으로 조절 후 상온에서 2시간 가량 교반한다. 레진(Resin)에 반응액을 흡착시켜 잔여 Gd3+ 이온을 세척한 후, MeOH로 추출하여 용매를 제거한다. 얻어진 반응물을 탈이온수(DI water)에 다시 녹여 아세톤(Acetone)을 투입하고 2시간 가량 교반하여 노란빛의 본발명 화합물을 획득하였다. 수율은 0.45g, 10.5 %이다. HR-FAB-MS: observed m/z;[M+H]+ 834.1912, theoritical m/z;[M+H]+ 834.1909
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명 화합물의 고분해능 질량분석 결과를 보여주는 도면이다.
도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에서 개발된 본 발명 화합물의 질량-대-전하비는(m/z) 834.1912로 관찰되며, 이는 [M+H]+값에 해당하는 이론적 m/z값 834.1909에 상응하는 결과이다.
2. 세포 독성 시험
미분화된 신경세포주인 인간신경아세포종 (Neuroblastoma) SH-SY5Y를 대상으로 CCK-8을 이용한 신경세포주 세포의 생존률(cell viability) 분석을 수행하였다. CCK-8(Cell counting kit-8)는 고 수용성 테트라 졸륨 염-SST-8을 이용하여 분석이 진행되는데, [2-(2-메톡시-4-니트로 페닐)-3-(4-니트로 페닐)(2,4-디 설포 페닐)-2H-테트라 졸륨, 모노 나트륨 염]은 전자 매개체의 존재 하에 환원 될 때 수용성 포르마잔 주황색 염료를 생성한다. 세포에서 탈수소 효소에 의해 생성되는 포르마잔 염료의 양은 살아있는 세포의 수에 직접 비례한다.
SH-SY5Y는 10% FBS(Fetal bovine serum), 1% AA(Antibiotic-Antimycotic), 2mM L-글루타민(L-Glutamine)이 추가된 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium, MEM)에서 성장되었고, 안정화된 세포는 세포 생존률 분석을 위해 1 × 104개/well의 밀도로 200 μL의 배지에 부유 되어 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각 웰(well)에 심어졌다. 14시간 이상 37℃, 5% CO2 조건 하에서 인큐베이터에서 부착되고 안정화 되기를 기다렸다. 다음 날 성장 배지를 제거하고, MEM 배지 100 μL에 본 발명의 화합물과 비교용 화합물로서 올-트랜스-레티노익산(all-trans-Retinoic acid, ATRA)을 다양한 농도(0, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100 μM)로 희석하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2상태에서 배양하였다. 수확 시간 2시간 전에 CCK-8 용액 10 μL를 각 웰에 첨가하고 2시간 추가 배양하였다. 그럼 다음, 배양이 완료된 플레이트는 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율(Cell viability %) 계산식은 다음과 같다.
세포 생존율 (%)=B/A Х 100 (%)
여기서, A : 대조군 웰에서 측정된 흡광도 값, B : 약물이 들어간 웰에서 측정된 흡광도 값이다.
세포 생존율 식에 의해 계산된 값은 GraphPad Prism 응용 프로그램을 이용하여 그래프를 그렸다. 나온 수치의 통계적 유의성은 일원 분산 분석(One-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparison test)을 통해 확인하였고, ***p<0.01 vs. 24h control에 대해 유의성을 갖는다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물의 세포 생존율 결과를 나타내는 도면이다.
도 3을 참조하면, ATRA는 농도가 높아질수록 세포 생존율이 낮은 반면, 본 발명 화합물은 농도에 상관없이 세포 생존율이 높게 나타났다. 즉, 본 발명의 화합물은 투여하지 않은 경우에 비해 생존율이 항상 더 높다는 것을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 화합물을 사용함에 따라 세포 생존율을 더 높여줄 수 있다는 것을 알 수 있으며, 고농도에서도 신경세포에 대한 독성이 전혀 없음을 나타낸다.
3. 신경 세포 분화 효과 시험
세포 형태 변화(Cell morphology change)
SH-SY5Y는 10% FBS, 1% AA, 2mM L-글루타민이 추가된 MEM 배지에서 성장되었고, 안정화된 세포는 세포 생존률 분석을 위해 4 × 105개/dish의 밀도로 60 mm 디쉬(dish)에 심어졌다. 14시간 이상 37℃, 5% CO2 조건 하에서 인큐베이터에서 부착되고 안정화 되기를 기다렸다. 다음 날 성장 배지를 제거하고, 분화 유도를 위해 1% FBS, 1% AA, 2mM L-글루타민이 추가된 DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture, 1:1) 배지에 본 발명의 화합물 및 ATRA를 다양한 농도(0, 1, 5, 10 μM)로 희석하여 각각 1일 및 3일 동안 37℃, 5% CO2 분위기 하에서 배양하였다. 세포의 형태는 현미경(Nikon, ECLIPSE Ts2, Nikon Corporation, Tokyo, Japan)으로 이미지를 획득하였다. 그 결과를 도 4에 나타냈다.
도 4를 참조하면, 본 발명 화합물을 처리하였을 때, 낮은 농도부터 세포 형태 변화 관찰이 가능한 것을 확인할 수 있다. 신경세포로의 분화가 유도되어 세포체(cell body)가 작아지고, 신경축색(axon)과 수상돌기(dendrite)의 전구체인 신경 돌기가 신장(neurite outgrowth)하여 그 길이가 세포체의 2배 이상이 되는 것을 확인할 수 있다. 1일에서 3일(1D->3D)로 시간이 지나갈수록 신경 돌기의 신장은 더 확장되고, 신경 돌기 네트워크의 형성이 뚜렷해지는 것이 관찰되었다.
신경세포분화를 위한 면역형광염색(Immunofluorescence staining for Neuronal differentiation)
SH-SY5Y는 10% FBS, 1% AA, 2mM L-글루타민이 추가된 MEM 배지에서 성장되었고, 안정화된 세포는 세포 생존률 분석을 위해 4 × 105개/dish의 밀도로 60 mm 디쉬(dish)에 심어졌다. 14시간 이상 37℃, 5% CO2 조건 하에서 인큐베이터에서 부착되고 안정화 되기를 기다렸다. 다음 날 성장 배지를 제거하고, 분화 유도를 위해 1% FBS, 1% AA, 2mM L-글루타민이 추가된 DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture, 1:1) 배지에 본 발명의 화합물 및 ATRA를 0, 1, 5, 10 μM 농도로 각각 처리하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 배양 후 각각 1일과 3일째에 수확된 세포는 DPBS로 수세하여 10% 포르말린(Neutral Buffered Formalin)에 10분간 고정하고 버퍼(Tris-buffered saline)에 3번 수세 후, 0.3% Triton X-100(in TBS)에 15분간 반응시켰다. TBS에 3번 수세하고, 5%의 BSA(Bovine serum albumin)과 NGS(Normal Goat Serum)(in TBS)에 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 뉴런 특이 마커(Neuron specific marker)로써 β-III 튜불린(tubulin) 1차 항체, 미성숙 뉴런 마커(newborn immature neuron marker)로 더블코르틴(doublecortin)의 1차 항체, 세포 증식 마커로써 Ki-67의 1차 항체를 이용하여 신경세포의 분화 및 신경 돌기 유도를 확인하였다. 1차 항체를 4℃에서 24시간 동안 반응 후, TBS에 3번 수세하고 2차 항체는 Alexa Fluor® 488 fluorescent(green)와 Alexa Fluor® 555 fluorescent(red)를 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. TBS에 3번 수세하고 마운트(VECTASHIELD® Mounting Medium with DAPI; Vector Laboratories, Bur- lingame, CA, USA)하였고 형광현미경으로 이미지를 획득하였다. 그 결과를 각각 도 5 및 7에 나타냈다.
도 5 및 6은 본 발명의 화합물과 ATRA의 신경 돌기 촉진을 비교 분석하기 위한 도면이다.
먼저, 도 5를 참조하면, 뉴런 특이 마커인 β-III 튜불린을 의미하는 녹색(Green color)가 ATRA와 본발명의 화합물을 처리하였을 때 대조군에 비해 더 많이 발현하는 것을 확인하였다. 특히, 1일에서 3일이 되면서 신경돌기의 길이가 대조군에 비해 더 길어지는 것을 확인하였다.
ImageJ 프로그램을 이용하여 신장돌기의 길이를 측정하였다. 이때, 세포체 길이의 2배 이상된 신경 돌기의 길이만 측정하였다. 계산된 값은 GraphPad Prism 응용 프로그램을 이용하여 그래프를 도출했다. 그 결과를 도 6a에 나타냈다.
도 6a를 참조하면, 세포체 길이의 2배 이상된 신경 돌기의 길이를 측정하여 대조군 기준으로 배율을 계산하였을 때, ATRA와 본발명의 화합물 모두 대조군보다 신경돌기의 길어진 것을 확인하였다. 특히 본발명의 화합물의 경우 농도 의존적으로 신경돌기의 길이가 길어졌다. 그리고 같은 농도로 ATRA와 본발명의 화합물을 세포에 처리하였을 때, 본발명의 화합물에 의해서 세포의 신경돌기가 더 길어진 것을 확인하였다. 나온 수치의 통계적 유의성은 일원 분산 분석(One-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparison test)을 통해 확인하였다. ***p<0.001 본발명 vs. control, #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 본발명 vs. ATRA에 대하여 유의성을 가진다. 도 6b는 도 5의 파란색(Blue color)의 세포핵의 개수 대비 초록색(Green color)의 β-III 튜불린 밀도을 수치화 한 것이다. 그 결과 1일에서 3일이 되면서 본발명의 화합물에 의한 뉴런 특이 마커의 증가폭이 ATRA에 의한 증가폭보다 더 큰 것을 확인하였다. 수치의 통계적 유의성은 일원 분산 분석(One-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparison test)을 통해 확인하였다. *p<0.05 본발명 vs. 분화일수별에 대해 유의성을 갖는다.
이어서, 신경 세포 분화에 대한 마커 항체의 발현 정도를 비교하였다. ImageJ 프로그램을 이용하여 컬러 히스토그램을 측정하였고, 계산된 값은 GraphPad Prism 응용 프로그램을 이용하여 그래프를 도출했다. 그 결과를 도 8에 나타냈다. 나온 수치의 통계적 유의성은 일원 분산 분석(One-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparison test)을 통해 확인하였다. 신생 뉴런의 생성 및 성장에 대한 분석은 *p<0.05 본발명 vs. 분화일수별에 대해 유의성을 갖는다.
도 7 및 8은 본 발명의 화합물과 ATRA의 신생 뉴런의 생성 및 성장을 비교 분석하기 위한 도면이다.
도 7 및 8을 참조하면, 미성숙 뉴런 마커인 더블코르틴을 의미하는 초록색(Green color)이 ATRA와 본발명의 화합물을 처리하였을 때 대조군에 비해 더 많이 발현하는 것을 확인하였다. β-III 튜불린과 마찬가지로 1일에서 3일이 되면서 신경돌기의 길이가 대조군에 비해 더 길어지는 것을 확인하였고, 파란색(Blue color)의 세포핵의 개수 대비 초록색(Green color)의 더블코르틴 밀도을 수치화 하였을 때, 1일에서 3일이 되면서 본발명의 화합물에 의한 미성숙 뉴런 마커의 증가폭이 ATRA에 의한 증가폭보다 더 큰 것을 확인하였다.
도 9 및 10은 본 발명의 화합물과 ATRA의 세포 증식에 대한 결과를 비교 분석하기 위한 도면이다.
도 9 및 10을 참조하면, 증식마커를 나타내는 빨간색(Red color)의 개수가 ATRA에 비해 본발명의 화합물을 처리한 경우 더 많음을 확인하였고, 3일이 되었을 때 파란색(Blue color)의 세포핵의 개수 대비 빨간색(Red color)의 Ki-67의 개수를 백분율로 계산하면 ATRA보다 본발명의 화합물이 더 많은 비율의 증식 마커를 발현함을 확인하였다.
신경 세포 증식에 대한 마커 항체인 Ki-67에 대한 양성 개수를 비교하였다. ImageJ 프로그램을 이용하여 자동으로 양성 세포 개수(positive cell number)를 획득하였다. Ki-67 양성 세포 개수는 계산식은 다음과 같다.
Ki-67 양성 세포 개수 (%) = (Ki-67 양성 세포 개수/DAPI 양성 세포 개수)×100
계산된 값은 GraphPad Prism 응용 프로그램을 이용하여 그래프를 그림 나온 수치의 통계적 유의성은 일원 분산 분석(One-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparison test)을 통해 확인하였다. ***p<0.001 본발명 vs. control, ### p<0.001 본발명 vs. 10μM ATRA, ††† p<0.001 본발명 vs. 5μM ATRA, ‡‡‡ p<0.001 본발명 vs. 1μM. ATRA에 대해 유의성을 가진다.
정리하면, 본 발명은 신경세포주에서 대조군인 ATRA에 비해 상대적으로 신경 세포의 증식 유발 및 증식을 유지함과 동시에, 신경 돌기의 생성 및 신장을 유도하여 신경세포로의 분화를 촉진하는 것을 알 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
Claims (7)
- 제1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 뇌 신경 손상, 퇴행성 뇌질환, 허혈성 뇌질환, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 간질, 기억력 감퇴, 또는 허혈성 뇌졸중, 말초 신경 손상, 척 수 손상, 시신경 손상, 근위축성 축색 경화증, 운동 실조, 또는 말초 신경 질환 또 는, 뇌 신경 발달 장애를 치료 또는 예방하기 위한, 약제학적 조성물.
- 하기 화학식 4-1으로 표시되는 화합물과 하기 화학식 4-2로 표시되는 화합물을 결합시켜 하기 화학식 4-3으로 표시되는 화합물을 제조하는 제1 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 화합물의 제조방법:[화학식 4-1]화학식 4-1에서,A는 *-(CH2)n-NH2 (여기서, n은 0 내지 5인 정수)를 나타낸다.[화학식 4-2]화학식 4-2에서, B는 레티노산(retinoic acid)에서 유래된 부분을 나타낸다.[화학식 4-3]화학식 4-3에서,A는 *-(CH2)n-NH-*(여기서, n은 0 내지 5인 정수)를 나타내고,B는 레티노산(retinoic acid)에서 유래된 부분을 나타낸다.
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