KR102311658B1 - 양친매성 독소루비신 및 엑소좀을 이용한 항암 하이브리드 엑소좀 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 양친매성 독소루비신 및 엑소좀을 이용한 항암 하이브리드 엑소좀 조성물에 관한 것으로, 본 발명에서는 지질이 접합된 독소루비신과 엑소좀을 혼합하여 하이브리드 엑소좀 제제 (Lexobrid A)를 제조하였다. 상기 Lexobrid A는 암세포에 체류 시간 및 반감기를 증가시키고, 생체이용률을 개선시키며, 체내 암세포 주변부 환경 (pH 5.5)에서 독소루비신을 천천히 방출시켜 항암 효과를 증진시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 하이브리드 엑소좀은 지속적인 항암 효과를 나타낼 수 있어 약물 전달용 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

양친매성 독소루비신 및 엑소좀을 이용한 항암 하이브리드 엑소좀 조성물{Anti-cancer hybrid exosome composition having amphiphilic doxorubicin and exosome}
본 발명은 양친매성 독소루비신 및 엑소좀을 이용한 항암 하이브리드 엑소좀 조성물에 관한 것이다.
1974년 FDA 승인을 받은 독소루비신 (Doxorubicin; Dox)은 안트라사이클린 (anthracycline) 항암제로 난소, 백혈병, 골수종암과 같은 다양한 암 치료제로 사용되고 있다. 그러나 독소루비신은 누적 용량에 따라 심각한 심장독성을 나타내며, 다른 부작용으로는 생체 내 체류 시간 (retention time)이 짧다는 점과 친수성 특성으로 인해 체내에서 쉽게 용출된다는 점이 있다. 이전 연구 (Bioorg Med Chem Lett, 27 (2017) 723-728.)에서 콜레스테롤로 변형된 양친매성 독소루비신 유도체(L-Dox A-D)를 합성하고 항암 활성 및 친유성 특성을 시험한 결과, 상기 유도체 화합물이 HeLa 및 MDAMB 231 세포주에서 독소루비신에 비해 체류 시간을 증가시키는 것을 확인한 바 있다.
단핵식세포계 (mononuclear phagocyte system; MPS)에 의한 포획 및 제거를 회피하기 위해, 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylen glycol; PEG)을 리포좀 표면에 코팅하였다. PEG는 낮은 면역원성 (immunogenicity), 낮은 세포 독성 및 우수한 배출 역학을 나타낸다. 페길화 (PEGylation)는 생체 내 순환 반감기를 연장시킬 뿐만 아니라 입자를 입체적으로 안정하게 만드는 역할을 한다. DOXIL은 안트라사이클린 약물군에 속하는 약물로 면역계에 의한 검출 및 제거를 회피하기 위해, 수용성 코어에 독소루비신이 포획된 PEGylated STEALTH 리포좀으로 개발되었으며, 이는 신체에서 DOXIL의 체류 시간을 증가시킬 수 있다. 리포좀은 종양 조직에 도달하는 데에 더 많은 시간을 허용하고 리포좀으로부터 독소루비신을 천천히 방출시킨다. 페길화된 리포좀은 체액으로부터 보호되지만, 표적 종양 세포와의 상호 작용을 하기가 어렵고, 방출된 독소루비신은 암세포에 의해 쉽게 유출될 수 있어 결과적으로 항암 효과가 떨어지게 된다. 따라서, 지질이 접합된 양친매성 독소루비신의 사용은 암세포에서 체류 시간을 증가시켜 상기 문제점을 해결할 수 있다.
1964년 Bangham 등이 리포좀을 처음 언급한 이래, 약물 전달 및 이의 단점을 해결하기 위한 많은 연구가 수행되어 왔다. 리포좀은 생체적합성, 생분해성이며, 불용성 소수성 약물을 전달할 수 있다. 리포좀은 인지질 및 콜레스테롤과 같은 양친매성 지질로 구성되어 있으며, 그 형태는 0.03 ~ 10 μm의 직경을 지닌다. 리포좀의 장점 중 하나는 지질 부분 및 이의 조성비를 변형시킬 수 있다는 것이다. 리포좀의 물리화학적 성질, 크기, 제타 전위, 약물 봉입 효능 및 방출 역학은 지질 변형에 의해 변화될 수 있다. 또한, 리포좀 (활성-표적 리포좀) 표면에 리간드 또는 펩타이드의 제시 (presenting)는 리간드 및 수용체 사이의 친화력을 통해 양호한 호밍 효과 (homing effect)를 나타낸다. 현재 암세포에서 과발현 된 엽산 수용체 (folate receptors; FRs), 표피성장인자 수용체 (epidermal growth factor receptors; EGFR), 트랜스페린 수용체 (transferrin receptors; TfR)들을 표적으로 하기 위한 다양한 리포좀 연구가 수행되고 있다.
한편, 엑소좀은 후기 엔도좀의 출아 (budding)에서 생산되고 세포 외 공간으로 방출되기 전에 원형질막과 융합되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 포스포콜린, 콜레스테롤 및 세라마이드가 풍부한 지질 이중층 막으로 구성된 40-200 nm 크기의 소낭이며, 거의 모든 종류의 세포에서 분비되고, 혈액, 림프 및 땀과 같은 모든 종류의 체액에서 안정하게 존재한다. 또한, 엑소좀은 작은 크기와 약한 음전하로 인해 오랜 체내 순환 시간과 기관의 내부까지 도달하는 이점을 가지고 있다. 엑소좀은 또한 식균 작용 (phagocytosis)에서 회피하여 친수성 또는 소수성 약물을 전달할 수 있으며, 표적 세포로 혈관 내피를 통과할 수 있다. 엑소좀은 테트라스파닌 (tetraspanin)과 같은 특정 표면 단백질로 인해 특정 세포에 표적 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 엑소좀의 캡슐화는 in vitro 및 in vivo에서 커큐민 (curcumin)의 안정성과 생체 이용률을 증가시키고, 항염증 활성을 증가시키는 것으로 보고된 바 있으며, 다른 연구에서, 엑소좀은 혈액-뇌 장벽을 넘어 뇌로 독소루비신을 전달하고, siRNA를 세포에 전달하며, 암 치료에 강력한 표적인 RAD 51 단백질의 수준을 효과적으로 감소시키는 것으로 보고된 바 있다.
이에, 본 발명에서는 리포좀에 양친매성 독소루비신 유도체를 가지는 리포좀과 엑소좀을 혼합하여 효과적인 하이브리드 엑소좀을 개발하고자 한다.
대한민국 공개특허 제10-2011-0085318호 (2011.07.27. 공개)
본 발명의 목적은 항암 하이브리드 엑소좀, 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항암 하이브리드 엑소좀, 및 상기 하이브리드 엑소좀 내에 봉입된 약물 또는 생리활성물질을 포함하는, 약물 또는 생리활성물질 전달용 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지질이 결합된 독소루비신, 지질이 결합된 수용성 고분자, 및 제1인지질로 이루어진 리포좀;과 엑소좀 막 단백질 및 제2인지질로 이루어진 엑소좀이 결합한 하이브리드 엑소좀으로서, 상기 하이브리드 엑소좀에서 독소루비신은 제1인지질 이중막 내부 수상과 외부 수상으로 노출되고, 수용성 고분자는 제1인지질 이중막 외부 수상으로 노출되며, 엑소좀 막 단백질은 제2인지질 이중막 외부 수상으로 노출된 것을 특징으로 하는 하이브리드 엑소좀을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 하이브리드 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 하이브리드 엑소좀, 및 상기 하이브리드 엑소좀 내에 봉입된 약물 또는 생리활성물질을 포함하는, 약물 또는 생리활성물질 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 지질이 접합된 독소루비신과 엑소좀을 혼합하여 하이브리드 엑소좀 제제 (Lexobrid A)를 제조하였다. 상기 Lexobrid A는 암세포에 체류 시간 및 반감기를 증가시키고, 생체이용률을 개선시키며, 체내 암세포 주변부 환경 (pH 5.5)에서 독소루비신을 천천히 방출시켜 항암 효과를 증진시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 하이브리드 엑소좀은 지속적인 항암 효과를 나타낼 수 있어 약물 전달용 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 지질이 접합된 양친매성 독소루비신 유도체 (L-Dox A-D)의 화학적 구조를 나타낸 것이다 (Chol: 콜레스테롤 구조).
도 2는 L-Dox의 리포좀성 제제의 물리화학적 특성 (입자 크기, Pdi, 제타전위)을 확인한 결과이다.
도 3(a) 내지 도 3(c)는 Lipodoxome A (L-Dox A의 리포좀성 제제)의 조성, 안전성 및 물리화학적 특성을 확인한 결과이며, 도 3(d)는 Lipodoxome A로부터의 L-Dox의 방출을 확인한 결과이다.
도 4는 리포좀-엑소좀 하이브리드(Lexobrid A)의 구성을 도시하여 나타낸 것이다.
도 5는 리포좀-엑소좀 하이브리드에 관한 것으로, (a) 전체 몰비 1% NBD-cholesterol 및 1% Rho-cholesterol 형광 리피드가 포함된 리포좀을 사용하여 형광 공명 에너지 전이 (FRET) 분석을 수행한 결과이며 (FT 0; 동결과 해동 없이 혼합된 엑소좀과 리포좀, FT 5; 5번의 동결 및 해동, FT 10; 10번의 동결 및 해동), (b) 입자의 크기 및 이미지를 동적 레이저 산란법 (DLS) 및 투과 전자 현미경 (TEM)으로 확인한 결과이다.
도 6은 A549 세포주 및 MDA MB 231 세포주를 이용하여 Dox, Lipodoxome A 및 Lexobrid A의 세포 독성을 MTT 분석으로 확인한 결과이다.
도 7은 Dox, Lipodoxome A 및 Lexobrid A의 세포 섭취를 유세포분석으로 확인한 결과이다 (Control; 회색, Dox; 빨간색, Lipodoxome A; 검은색, Lexobrid A; 파란색, 실선; 처리 직후 측정, 점선; 24시간 배양 후 측정).
도 8은 Dox, Lipodoxome A 및 Lexobrid A의 국소화를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
본 발명의 발명자들은 지질이 접합된 독소루비신과 엑소좀을 혼합하여 제조된 하이브리드 엑소좀 제제 (Lexobrid A)가 암세포에 체류 시간 및 세포 독성을 증가시켜 항암 효과를 나타내는 것을 확인하며 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 지질이 결합된 독소루비신, 지질이 결합된 수용성 고분자, 및 제1인지질로 이루어진 리포좀;과 엑소좀 막 단백질 및 제2인지질로 이루어진 엑소좀이 결합한 하이브리드 엑소좀으로서, 상기 하이브리드 엑소좀에서 독소루비신은 제1인지질 이중막 내부 수상과 외부 수상으로 노출되고, 수용성 고분자는 제1인지질 이중막 외부 수상으로 노출되며, 엑소좀 막 단백질은 제2인지질 이중막 외부 수상으로 노출된 것을 특징으로 하는 하이브리드 엑소좀을 제공한다.
상기 지질은 콜레스테롤, 콜릭산 (cholic acid), 글리코콜릭산 (glycocholic acid), 타우로콜릭산 (taurocholic acid), 데옥시콜릭산 (deoxycholic acid), 케노데옥시콜릭산 (chenodeoxycholic acid), 글리코케노디옥시콜릭산 (glycochenodeoxycholic acid), 타우로케노데옥시콜릭산 (taurochenodeoxycholic acid) 및 리토콜릭산 (lithocholic acid)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 수용성 고분자는 폴리에틸렌 글리콜 (poly(ethylene glycol); PEG), 폴리락티드-코-글리콜라이드 (poly(lactide-co-glycolide); PLGA), 폴리글리콜라이드 (polyglicolide; PGA) 및 폴리락트산 (poly(lactic acid); PLA)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 고분자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 제1인지질 또는 제2인지질은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine; DSPE), 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine), 디라우로일 포스파티딜콜린 (dilauroyl phosphatidylcholine; DLPC), 디미리스토일 포스파티딜콜린 (dimyristoyl phosphatidylcholine; DMPC), 디팔미토일 포스파티딜콜린 (dipalmitoyl phosphatidylcholine; DPPC), 디스테아로일 포스파티딜콜린 (distearoyl Phosphatidylcholine; DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DOPC), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜콜린 (1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylcholine; POPC), 디에틸 포스포로시아나데이트 (diethyl phosphorocyanidate; DEPC), 포스파티딜글리세롤 (phosphatidylglycerol), 디미리스토일 포스파티딜클리세롤 (dimyristoyl phosphatidylglycerol; DMPG), 디팔미토일 포스파티딜글리세롤 (dipalmitoylphosphatidylglycerol; DPPG), 더마탄 설페이트 프로테오글리칸 (dermatan sulfate proteoglycan; DSPG), 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜글리세롤 (1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylglycerol; POPG), 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine), 비스(1.2-디메틸포스피노)에탄 (bis(1,2-dimethylphosphino)ethane; DMPE), 1,2-비스(디페닐포스피노)에탄 (1,2-Bis(diphenylphosphino)ethane; DPPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (dioleoylphosphatidylethanolamine; DOPE), 포스파티딜세린 (phosphatidylserine) 및 디올레오일 포스파티딜세린 (dioleoyl phosphatidylserine; DOPS)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 리포좀과 엑소좀은 (20 ~ 50) : (50 ~ 80)의 부피비로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 리포좀은, 지질이 결합된 독소루비신, 지질이 결합된 수용성 고분자, 및 제1인지질이 (25 ~ 35) : (10 ~ 20) : (50 ~ 60)의 중량비로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 지질이 결합된 독소루비신은 지질 및 독소루비신이 (40 ~ 60) : (40 ~ 60)의 중량비로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다. 상기 지질과 독소루비신은 에테르 결합으로 결합될 수 있다. 지질이 결합된 독소루비신은 일반 독소루비신과는 달리 양친매성 특성을 가져 더 오랜 시간 암세포에 머무르며 항암 효과를 증가시킬 수 있다.
상기 지질이 결합된 수용성 고분자는, 지질 및 수용성 고분자가 (3 ~ 43) : (57 ~ 97)의 중량비로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 하이브리드 엑소좀의 평균 직경은 80 내지 150 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 엑소좀 막 단백질은 CD9, CD63, CD81 및 CD90으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
또한, 본 발명은 상기 하이브리드 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 리포좀은 pH 7 내지 pH 7.7의 세포 외 조건에서는 독소루비신을 방출하지 않으며, pH 5.2 내지 pH 5.8의 암세포 환경에서 독소루비신을 방출하여 암세포의 사멸을 유도할 수 있다.
상기 암 질환은 폐암, 피부암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호킨스씨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 하이브리드 엑소좀, 및 상기 하이브리드 엑소좀 내에 봉입된 약물 또는 생리활성물질을 포함하는, 약물 또는 생리활성물질 전달용 조성물을 제공한다.
상기 생리활성물질은 펩타이드, 단백질, 항암제, 소염진통제, 항생제, 항균제, 호르몬제, 유전자 및 백신으로 이루어진 군에서 선택될 수 잇으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 세포주 및 물질
A549 세포주 (인간 폐암 세포주), MDA MB 231 세포주 (인간 유방암 세포주)는 한국 세포주 은행으로부터 제공 받았으며, 지방 유래 줄기세포 (Adipose derived stem cell; ADSC)는 Remybio Inc (Dongtan, Korea)에서 제공 받았다. 세포는 10% 우태아혈청, 2 mM L-글루타민, 100 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 함유된 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. ADSC 세포는 DMEM/F12 배지를 사용하였으며, 그 외 다른 세포주는 RPMI 1640 배지를 사용하였다. 우태아혈청을 포함한 세포 배양 시약은 WelGENE (Korea)에서 구입하였으며, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; MTT) 및 다른 모든 화학 물질은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
실시예 2: 지질이 접합된 독소루비신 (L-Dox) 합성
이전 논문 (Bioorg Med Chem Lett, 27 (2017) 723-728.)을 참조하여, 도 1에 나타낸 바와 같이, 에테르 (A 및 C) 또는 아미드 (B 및 D) 링커를 가지는 콜레스테롤이 접합된 독소루비신으로서 L-Dox 유도체 (L-Dox A-D)를 합성하였다.
실시예 3: 양친매성 독소루비신 리포좀 제조 및 이의 물리화학적 성질 분석
Lipodoxome A 리포좀 제제를 제조하기 위해, L-Dox 유도체들은 무수 유기 용매 (디클로로메탄/메탄올=9:1의 혼합용매)를 이용하여 가지형 플라스크에서 인지질(DPPC) 및 Chol-PEG2000과 혼합하였다. 이후 증발기를 사용하여 유기 용매를 제거하고 진공 하에 잔류 흔적을 하룻밤 동안 완전히 제거하여 혼합 지질 필름을 제조하였다. L-Dox 유도체의 농도가 1 mg/mL가 되도록 혼합 지질 필름을 인산완충식염수 (PBS, pH 7.4)에 재현탁시켰다. 상기 혼합물은 리포좀 형성을 위해 60℃에서 20분간 초음파 처리하였으며, 제조된 Lipodoxome A 리포좀은 실험에 사용하기 전까지 4℃에 보관하였다.
Lipodoxome A 리포좀의 크기 및 제타 전위를 측정하기 위해, 증류수를 이용하여 100 μg/mL 농도로 Lipodoxome A 리포좀을 희석한 후, Nano-ZS Zetasizer (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, DPPC, L-Dox A 및 Chol-PEG2000이 54:31:15 중량비일 때, Lipodoxome A 리포좀이 잘 형성되었으며, 도 2에 나타낸 바와 같이, L-Dox B 내지 L-Dox D 리포좀과 달리 L-Dox A 리포좀이 낮은 Pdi 값과 100 nm 크기의 입자를 형성하는 것을 확인하였다. 따라서 다른 언급이 없는 한, 상기 중량비를 가진 Lipodoxome A 리포좀을 모든 실험에 사용하였다.
실시예 4: 엑소좀 추출
엑소좀은 exoEasy Maxi Kit (Quiagen, Germany)를 사용하여 추출하였다. ADSC가 약 80-90% 정도의 밀도를 가질 때까지 배양한 다음 우태아혈청이 포함되지 않은 신선한 배지로 교체하여 3일간 추가 배양하였다. 엑소좀의 추출 공정은 제공된 프로토콜에 따라 수행하였다. exoEasy Maxi Kit를 사용하기 전, 배지는 0.8 ㎛ 시린지 필터로 정제하였다. 추출된 엑소좀은 시험에 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.
실시예 5: 리포솜-엑소좀 하이브리드의 제조
리포솜-엑소좀 하이브리드의 제조를 위해, ADSC로부터 추출된 엑소좀 및 Lipodoxome A를 50:50의 부피비로 실온에서 5분간 혼합하였다. 혼합물은 -80℃에서 급속 냉동시키고 4℃에서 천천히 해동시켰다. 이 과정을 10회 반복하여 하이브리드 입자인 Lexobrid A를 제조하였다.
실시예 6: 형광 공명 에너지 전이 (fluorescence resonance energy transfer; FRET) 분석
FRET 분석은 이전 논문(Bioorg Med Chem Lett 2015, 25 (18), 3893-3896)에 따라 합성된 Chol-NBD 및 Chol-Rho 쌍을 이용하여 수행하였다. 1% Chol-NBD 및 1% Chol-Rho를 포함하는 Lipodoxome A를 ADSC 엑소좀과 혼합하여 스펙트럼의 차이를 분석하였다. 여러 번의 동결 및 해동 (freeze & thaw; FT) 과정 전과 후에, 형광 광도계 (Germini EM, Molecular Devices, USA)를 이용하여 혼합물의 형광 스펙트럼을 분석하였다. 형성된 입자는 450 nm에서 여기되고, 500 nm 내지 650 nm에서 방출되는 것을 확인하였다.
실시예 7: 동적 레이저 산란법 (dynamic laser scattering; DLS)에 의한 입자 크기 측정
입자의 크기를 분석하기 위해, 시료를 증류수로 10배 희석한 후, Nano-ZS Zetasizer (Malvern Inc, UK)를 사용하여 측정하였다. 입자 크기는 일회용 큐벳 (DTS1070, Malvern Inc, UK)을 사용하여 15회 반복으로 3회 측정하였다.
실시예 8: 투과 전자 현미경 (transmission electron microscopy; TEM)
입자는 2% 포름알데하이드와 4℃에서 밤새 교반하였다. 5 μL의 입자 현탁액 방울을 Para 필름 위에 놓고 Formva-carbon coated grid (200 mesh, TED PELLA, USA)를 방울 위에 얹어 상온에서 흡착시켰다. 20분 후, grid를 PBS로 세척하고 조명 아래에서 건조시켰다. 입자의 단면은 70 kV에서 작동하는 전자 현미경 (Hitachi Ltd. H-7000B, Japan)으로 관찰하였다.
실시예 9: 세포 생존율 분석
A549 세포주 및 MDA MB 231 세포주에 Lipodoxome A 및 Lexobrid A를 처리한 후 MTT 분석을 수행하여 약물의 세포 독성 여부를 확인하였다. 간략하게, 96-웰 플레이트에 세포를 웰 당 4,000 세포의 밀도로 접종하고 밤새 배양하였다. 이후 세포에 다양한 농도의 약물을 처리하고 2시간 동안 배양한 다음 신선한 배지로 교체하고 72시간 동안 추가 배양하였다. MTT 분석을 위해, 각 웰에 80 μL의 새로운 배지와 20 μL의 MTT 용액 (5 mg/ml)을 첨가하고 3시간 동안 배양하였다. 포르마잔 결정을 100 μL의 DMSO에 완전히 용해시켰다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더기 (Tecan, Tecan AG, Switzerland)를 사용하여 550 nm에서 측정하였고, 세포 독성은 비 처리 대조군 세포의 흡광도로 정규화 하였다.
실시예 10: 유세포 분석 및 공초점 현미경 분석을 이용한 세포 섭취 관찰
독소루비신, 리포좀 및 리포좀-엑소좀 하이브리드의 세포 이입을 비교하기 위해, 24-웰 플레이트에 A549 및 MDA MB 231 세포주를 웰 당 50,000 세포의 밀도로 접종하였다. 하룻밤 배양한 후 세포를 회수하여 1% 파라포름알데하이드로 고정시킨 다음 분석할 때까지 얼음에 넣어 암실에서 보관하였다. 고정된 세포는 BD FACSAriaTMIII (BD Biosciences, Germany)로 분석하였고, 총 10,000개의 게이트된 세포를 FlowJo V10 (Ashland, OR)을 사용하여 분석하였다.
공초점 현미경 분석을 위해, 24-웰 플레이트에 A549 및 MDA MB 231 세포주를 웰 당 50,000 세포의 밀도로 접종하였다. 하룻밤 배양한 후, 세포를 Lipodoxome A와 Lexobrid A로 2시간 동안 처리하였다. lyso-tracker green (Invitrogen, USA)을 사용하여 리소좀을 염색하고, TO-PRO III (Invitrogen, USA)를 사용하여 핵을 염색하여 약물의 국소화를 비교하였다. 각 염료 시약은 제공된 프로토콜에 따라 수행하였으며, 준비된 시료는 40X 배율의 대물 렌즈가 장착된 공초점 현미경 (TCS SP2 AOBS, Leika, Germany)으로 관찰하였다. 병합된 사진이 포함된 모든 이미지는 LAS AF lite 소프트웨어 (Leica, Germany)를 사용하여 획득하였다.
실험예 1: 지질 접합 양친매성 독소루비신의 구조
도 1에 나타낸 바와 같이, 에테르 (A 및 C) 또는 아미드 (B 및 D) 링커를 가지는 콜레스테롤 접합 독소루비신으로 새롭게 합성된 L-Dox 유도체들은 수용성 일반 독소루비신과는 달리 접합된 지질로 인하여 양친매성 특성을 가진다. L-Dox A 및 B 유도체는 독소루비신과 유사한 in vitro 세포 독성을 가지며, 접합된 콜레스테롤의 지질 특성 때문에 수용성 독소루비신보다 더 오랜 시간 암세포에 머무른다는 것이 본 발명자들에 의해 보고된 바 있다 (Bioorg Med Chem Lett, 27 (2017) 723-728). 양친매성 특성은 종래의 수용성 독소루비신이 다약재 내성 (multi-drug resistance; MDR) 세포들에 의해 쉽게 유출되고, 생체 순환에서 짧은 반감기를 가지는 문제점을 해결할 수 있다. 그러나 이러한 양친매성 특성은 특정 유기 용매에만 용해되므로 생체 내의 수용성 조건에서 낮은 용해도를 가지는 문제점으로 인해 생체 내 낮은 생체이용률을 나타낸다. 따라서 양친매성 독소루비신의 리포좀성 제제는 생체 주입을 가능하게 하여 낮은 생체이용률을 개선시킬 수 있다.
실험예 2: 양친매성 독소루비신 리포좀의 물리화학적 성질
DOXIL은 수용성 코어에 독소루비신이 포획된 STEALTH 리포좀으로 면역계로부터의 검출 및 파괴를 회피하기 위해 개발되었으며, 이로 인하여 생체 내 DOXIL의 체류 시간이 증가되었다.
결과적으로 이러한 리포좀성의 분산체는 암 조직에 도달하는 데에 더 많은 시간을 허용하고, 이후 리포좀으로부터 독소루비신이 천천히 방출되어 암 조직에 효과적으로 작용하게 된다. 독소루비신은 페길화된 리포좀성 분산체에 의해 생체 내에서의 소실을 효과적으로 방지할 수 있지만, STEALTH 리포좀의 특성상 표적 암세포와의 작용 또한 방해할 수 있으며, 방출된 독소루비신은 암세포에 의해 쉽게 유출될 수 있어 결국 그 효과가 줄어들 수 있다. 따라서, 지질이 접합된 양친매성 독소루비신의 사용은 종래 리포좀성 분산체의 장점을 최대화하면서 암세포에서 체류 시간을 증가시킴으로써 종래 DOXIL의 단점 또한 극복할 수 있다.
이에, 암세포에서 독소루비신의 생체이용률 및 체류 시간을 증가시키기 위해, L-Dox 유도체들을 리포좀 제제로 만들고자 다양한 농도의 DPPC 및 Chol-PEG2000과 같은 인지질을 사용하였다. 각 L-Dox 유도체들의 농도가 1 mg/mL가 되도록 PBS에 재현탁하고 60℃에서 20분간 초음파 처리하여 분산시켰을 때, 도 2에 나타낸 바와 같이, L-Dox A 유도체가 가장 작고 고른 입자 크기로 리포좀 생성이 용이하였으며, L-Dox C 및 L-Dox D 유도체의 경우 리포좀화 되지 않고 침전물이 발생하는 것을 확인할 수 있었다. 암 표적 치료를 위한 양친매성 리포좀화 독소루비신을 제조하고자 가장 리포좀화가 용이한 L-Dox A를 이용하였으며, L-Dox A가 31% 함유된 리포좀을 Lipodoxome A라 명명하고 이에 대한 추가 연구를 수행하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 새로운 Lipodoxome A 리포좀은 종래 시판 중인 DOXIL 리포좀에 봉입된 독소루비신보다 더 많은 독소루비신을 포함하고 있으며, 독소루비신이 콜레스테롤과 유기적으로 결합되어 있어 리포좀 내에서 독소루비신이 자연 방출될 염려가 없다. Lipodoxome A 리포좀 입자의 크기와 제타 전위는 93.9±1.4 nm와 -12.7±0.7 mV로 측정되었으며, PBS 내 4℃에서 5주간 안정적으로 입자의 형태가 유지되는 것을 확인하였다.
Lipodoxome A 리포좀으로부터 L-Dox A의 방출 실험을 pH 7.4 및 pH 5.5 용액을 이용하여 두 가지 조건에서 기계교반법을 실험을 수행하였다. 상기 두 가지 용액의 조건은 세포 외 및 세포 내 pH 조건과 유사하여 입자 크기와 제타 전위 데이터보다 더 정확한 입자의 안정성을 확인할 수 있다. 총 7일간 Lipodoxome A 리포좀으로부터 L-Dox A의 방출 실험을 수행한 결과, pH 7.4의 조건에서 L-Dox A의 방출은 관찰되지 않았으며, 초기 농도와 비교하였을 때 pH 5.5에서 44.1%의 L-Dox A의 방출이 형광 분석법으로 관찰되었다. 따라서 Lipodoxome A 리포좀은 세포 외 pH 조건인 pH 7.4에서는 안정하며 암세포 내 조건인 pH 5.5에서 Lipodoxome A 리포좀으로부터 L-Dox A를 서서히 방출시켜 독소루비신의 소실 없이 효과적으로 암세포를 사멸시킬 수 있음을 확인하였다.
실험예 3: 하이브리드 엑소좀의 물리화학적 특성
ADSC를 약 90% 정도의 밀도가 될 때까지 배양하고 우태아혈청이 포함되지 않은 신선한 배지로 교체하여 3일간 추가 배양하였다. 이후, 배양 배지를 회수하여 엑소좀을 추출하였다. 1% Chol-NBD와 1% Chol-Rho를 포함하는 엑소좀과 Lipodoxome A를 혼합한 후 하이브리드 엑소좀을 제조하기 위해 여러 번의 동결 및 해동 과정을 수행하였다. 제조된 Lexobrid A의 입자 특성은 FRET 분석으로 측정하였다.
그 결과, 460 nm에서 Chol-NBD의 여기 (excitation)는 Chol-NBD 및 Chol-Rho에 각각 대응하는 530 nm 및 588 nm에서 형광 방출을 유도하는 것을 확인하였다. 또한, 동결 및 해동 과정을 5회 수행한 결과, NBD 형광이 증가하고 (530 nm), Rho 형광이 감소하는 것을 확인하였다 (580 nm). 즉, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 리포좀과 엑소좀이 잘 융합되어 Lexobrid A를 형성하는 것을 확인하였다.
Lexobrid A의 하이브리드 형성 전후의 물리화학적 특성을 비교하기 위해 세 가지 방법으로 입자의 크기 분포 및 형태학을 분석하였다. 그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, DLS로 측정한 Lexobrid A의 크기는 141.9 ± 3.2 nm로, 이는 리포좀 (93.9 ± 1.4 nm)과 엑소좀 (227.7 ± 2.7 nm) 사이의 값을 나타내는 것을 확인하였다. 상기 입자들을 TEM으로 측정한 결과, 리포좀이 87.0 ± 21.8 nm, 엑소좀이 110.9 ± 19.2 nm, 리포좀-엑소좀 하이브리드가 99.6 ± 17.5 nm의 입자 크기를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 엑소좀의 형태는 TEM 그리드에서 건조되었을 때 구형을 나타내었다.
Figure 112019063479957-pat00001
실험예 4: 리포좀-엑소좀 하이브리드의 세포 독성 및 세포 섭취
Dox, Lipodoxome A, Lexobrid A의 총 3가지 약물에 함유되어 있는 독소루비신의 양은 0.5, 1, 2 μM이었으며, 이를 이용하여 A549 및 MDA MB 231 세포주에서의 세포 독성 여부를 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, Loxobrid A가 Dox 및 Lipodoxome A에 비해 모든 농도에서 향상된 세포 독성을 나타내었다. A549 세포주에서 Lexobrid A는 모든 농도에서 Dox 및 Lipodoxome A 보다 암 세포주의 성장을 약 30% 이상 억제하였다. MDA MB 231 세포주에서 0.5 μM의 독소루비신이 함유된 Lexobrid A는 Dox 및 Lipodoxome A보다 약 25% 이상의 세포 독성을 나타내었다. Lexobrid A는 또한 MDA MB 231 세포에서 Dox와 Lipodoxome A보다 암 세포주의 성장을 약 10% 이상 억제하였다.
세포 독성의 원인을 분석하기 위해, 세포주에 2시간 약물 처리 후 0시간 또는 24시간 추가 배양한 다음 유세포분석으로 세포 섭취를 측정하였다. 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, A549 및 MDA MB 231 세포주 모두에서 24시간 후 Dox와 Lipodoxome A 형광 신호가 감소된 반면, Lexobrid A의 형광 신호는 모든 조건에서 증가되어 있는 것을 확인하였다. 두 세포 모두에서 Lexobrid A와 24시간 동안 배양하였을 때가 처리 직후 보다 높은 형광을 나타내었다. 상기 결과로부터 Lexobrid A는 Dox 및 Lipodoxome A보다 효과를 오래 유지할 수 있으며 항암제로서 지속적으로 작용할 수 있음을 확인하였다.
실험예 5: 독소루비신, 리포좀 및 리포좀-엑소좀 하이브리드의 현미경 관찰
도 8에 나타낸 바와 같이, Dox는 A549 세포주에 처리된 후 2시간 만에 국소화되어 핵에 집중되어 있고, Lipodoxome A와 Lexobrid A는 2시간 만에 세포질과 핵에서 발견되었다. 세포질에서 Lipodoxome A와 Lexobrid A의 적색 신호는 주로 입자로 발견되었고, Lexobrid A는 Lipodoxome A보다 높은 신호를 나타내었다. 상기 결과는 유세포분석 결과와 일치하였다. 즉, 핵에서의 독소루비신은 Lipodoxome A와 Lexobrid A 입자에서 방출된 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (16)

  1. 지질인 콜레스테롤이 결합된 독소루비신, 지질인 콜레스테롤이 결합된 폴리에틸렌 글리콜 (poly(ethylene glycol); PEG) 수용성 고분자, 및 제1인지질로서 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DPPC)로 이루어진 리포좀;과 지방 유래줄기세포로부터 얻어진 엑소좀;을 혼합하여 이루어진 하이브리드 엑소좀으로서, 상기 하이브리드 엑소좀에서 독소루비신은 제1인지질 이중막 내부 수상과 외부 수상으로 노출된 것을 특징으로 하는 하이브리드 엑소좀.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 상기 리포좀과 엑소좀은 (20 ~ 50) : (50 ~80)의 부피비로 포함되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 엑소좀.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 리포좀은, 지질이 결합된 독소루비신, 지질이 결합된 수용성 고분자, 및 제1인지질이 (25 ~ 35) : (10 ~ 20) : (50 ~ 60)의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 엑소좀.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 지질이 결합된 독소루비신은 지질 및 독소루비신이 (40 ~ 60) : (40 ~ 60)의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 엑소좀.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 지질이 결합된 독소루비신은 지질과 독소루비신이 에테르 결합으로 결합되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 엑소좀.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 지질이 결합된 수용성 고분자는, 지질 및 수용성 고분자가 (3 ~ 43) : (57 ~ 97)의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 엑소좀.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 하이브리드 엑소좀의 평균 직경은 80 내지 150 nm인 것을 특징으로 하는 하이브리드 엑소좀.
  11. 삭제
  12. 제 1항, 및 제 5항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 하이브리드 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 하이브리드 엑소좀은 pH 5.2 내지 pH 5.8의 암세포 환경에서 독소루비신을 방출하는 것을 특징으로 하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 암 질환은 폐암, 피부암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호킨스씨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제 1항, 및 제 5항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 하이브리드 엑소좀, 및 상기 하이브리드 엑소좀 내에 봉입된 약물 또는 생리활성물질을 포함하는, 약물 또는 생리활성물질 전달용 조성물.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 생리활성물질은 펩타이드, 단백질, 항암제, 소염진통제, 항생제, 항균제, 호르몬제, 유전자 및 백신으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 약물 또는 생리활성물질 전달용 조성물.
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