KR102056143B1 - 히알루론산 및 도세탁셀을 이용한 pH 반응성 항암 리포좀 조성물 - Google Patents

히알루론산 및 도세탁셀을 이용한 pH 반응성 항암 리포좀 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히알루론산 및 도세탁셀을 이용한 pH 반응성 항암 리포좀 조성물에 관한 것으로, 본 발명에서는 하이드로제네이티드 소이 포스파티딜콜린(HSPC); 3-(디에틸아미노)프로필아민(DEAP)이 히알루론산(hyaluronic acid; HA)에 결합된 pH 반응성 고분자(HA-g-DEAP); 및 도세탁셀(DTX);을 이용하여 pH 반응성 리포좀을 제조하였으며, 리포좀 외부 표면에 결합된 히알루론산은 암세포 표면에 과발현 되어있는 CD44 수용체와 상호작용하여 리포좀의 내포작용을 유도하고, 리포좀 인지질 이중층에 도입된 3-(디에틸아미노)프로필아민은 약산성을 나타내는 엔도좀 pH(~ pH 6.5)에서 양성자화를 통해 리포좀의 불안정화를 초래하여 내부에 봉입된 약물을 효과적으로 방출시키는 바, 암세포의 사멸을 증가시켜 항암 효과를 증대시킬 수 있다. 따라서, 상기와 같은 효과를 가지는 본 발명의 리포좀은 약물 전달용 조성물로서 암 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

히알루론산 및 도세탁셀을 이용한 pH 반응성 항암 리포좀 조성물{pH responsive anti-cancer liposome composition using hyaluronic acid and docetaxel}
본 발명은 히알루론산 및 도세탁셀을 이용한 pH 반응성 항암 리포좀 조성물에 관한 것이다.
1964년 Bangham 등이 리포좀을 처음 언급한 이래, 약물 전달 및 이의 단점을 해결하기 위한 많은 연구가 수행되어 왔다. 리포좀은 생체적합성, 생분해성이며, 불용성 소수성 약물을 전달할 수 있는 이점을 가지고 있다. 리포좀은 인지질 및 콜레스테롤과 같은 양친매성 지질로 구성되어 있으며, 그 형태는 0.03 ~ 10 μm의 직경을 지니는 것이 일반적이다. 리포좀의 장점 중 하나는 지질 부분 및 이의 조성비를 변형시킬 수 있다는 점이다. 리포좀의 물리화학적 성질, 크기, 제타 전위, 약물 봉입 효능 및 방출 역학은 지질 변형에 의해 변화될 수 있다. 또한, 리포좀(활성-표적 리포좀) 표면에 리간드 또는 펩타이드의 제시(presenting)는 리간드 및 수용체와의 친화력을 통해 호밍 효과 (homing effect)를 나타내며, 뿐만 아니라 생체 고분자가 접합된 다양한 리포좀 연구가 수행되고 있다.
pH 반응성 고분자가 결합된 리포좀을 이용하여 세포질로 항암제를 전달하는 방법은 종양 치료를 위한 유망한 방법 중 하나이다. 종래의 스텔스(stealth) 리포좀은 약물 방출이 느리다는 단점이 있는 바, 이를 해결하고자 소포로 이루어진 인지질 이중층에 양친매성(amphiphilic) 기능 고분자를 도입하여 자극을 통한 약물 방출의 기능을 제공하는 pH 반응성 리포좀 기반 나노 전달체가 개발되고 있다. 그러나, 적절한 기능성 고분자를 선택하는데 제한적인 점과 고분자의 기능성을 미세하게 조정하기 어려운 점에서 리포좀의 상업적 적용은 낮은 평가를 받고 있다. 새롭게 설계된 양친매성 고분자를 개발하려는 최근의 시도에도 불구하고, 정확하게 제조된 리포좀의 예는 거의 찾아볼 수 없으며, 이를 극복하기 위해, 신규한 생체 고분자 접합체 및 기능성을 조절할 수 있는 진보된 리포좀을 사용하여 pH 반응성 리포좀을 개발 및 설계하려는 관심이 높아지고 있다.
대한민국 등록특허 제10-1270878호 (2013.05.28 등록)
본 발명의 목적은 pH 반응성 항암 리포좀, 이를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 약물 또는 생리활성물질 전달용 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 pH 감응성 기능성기가 결합된 히알루론산 및 인지질로 이루어진 리포좀으로서, 상기 히알루론산은 리포좀 외부 표면에 결합되고, 상기 pH 감응성 기능성기는 리포좀 인지질 이중층에 고정되며, 상기 리포좀 내부에 항암제가 봉입된 것을 특징으로 하는 pH 반응성 항암 리포좀을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 pH 반응성 항암 리포좀을 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 pH 감응성 기능성기가 결합된 히알루론산 및 인지질로 이루어진 리포좀으로서, 상기 히알루론산은 리포좀 외부 표면에 결합되고, 상기 pH 감응성 기능성기는 리포좀 인지질 이중층에 고정되며, 상기 리포좀 내부에 약물 또는 생리활성물질이 봉입된 것을 특징으로 하는 약물 또는 생리활성물질 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 하이드로제네이티드 소이 포스파티딜콜린(HSPC); 3-(디에틸아미노)프로필아민(DEAP)이 히알루론산(hyaluronic acid; HA)에 결합된 pH 반응성 고분자(HA-g-DEAP); 및 도세탁셀(DTX);을 이용하여 pH 반응성 리포좀을 제조하였으며, 리포좀 외부 표면에 결합된 히알루론산은 암세포 표면에 과발현 되어있는 CD44 수용체와 상호작용하여 리포좀의 내포작용을 유도하고, 리포좀 인지질 이중층에 도입된 3-(디에틸아미노)프로필아민은 약산성을 나타내는 엔도좀 pH(~ pH 6.5)에서 양성자화를 통해 리포좀의 불안정화를 초래하여 내부에 봉입된 약물을 효과적으로 방출시키는 바, 암세포의 사멸을 증가시켜 항암 효과를 증대시킬 수 있다. 따라서, 상기와 같은 효과를 가지는 본 발명의 리포좀은 약물 전달용 조성물로서 암 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 하이드로제네이티드 소이 포스파티딜콜린(hydrogenated soy phosphatidylcholine; HSPC); 3-(디에틸아미노)프로필아민(3-(diethylamino)propylamine; DEAP)이 히알루론산(hyaluronic acid; HA)에 결합된 pH 반응성 고분자(이하, HA-g-DEAP); 및 도세탁셀;로 제조되는 본 발명의 pH 반응성 리포좀을 도시하여 나타낸 것이다.
도 2는 pH 7.4에서 각 리포좀(0.1 mg/mL)의 (a) 입자 크기 분포, 서로 다른 pH 값(pH 7.4, 7.0, 6.5)에서 각 리포좀의 (b) 입자 크기 변화 및 (c) 제타 전위의 변화(HA-g-DOCA0.35@Lipo에 비교)를 나타낸 것이다.
도 3은 (a) pH 7.4 또는 6.5에서 HA-g-DEAP0.40@Lipo 및 HA-g-DOCA0.35@Lipo의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지, (b) pH 7.4 또는 6.5에서 HA-g-DEAP0.40@Lipo(HA-g-DEAP0.40에 형광 Ce6 dye로 표지함) 또는 HA-g-DOCA0.35@Lipo(HA-g-DOCA0.35에 형광 Ce6 dye로 표지함)의 공초점 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는 (a) pH 7.4 또는 6.5에서 HA-g-DEAP0.40@Lipo(HA-g-DEAP0.40과 HSPC 리포좀의 0.2:1 중량비로 제조) 또는 HA-g-DOCA0.35@Lipo의 DTX 누적 방출량, (b) pH 7.4 또는 6.5에서 (HA-g-DEAP0.40)x@(Lipo)y[HA-g-DEAP0.40과 HSPC 리포좀의(x:y=0.5:1, 0.1:1, 0.05:1)로 서로 다른 중량비로 제조]의 DTX 누적 방출량을 나타낸 것이다.
도 5는 pH 7.4에서 12시간 동안 리포좀(형광 Ce6 dye로 표지)으로 처리된 (a) HCT-116 세포 또는 (b) KB 세포의 공초점 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은 (a) pH 7.4에서 4시간 동안 리포좀(형광 Ce6 dye 표지)으로 처리된 HCT-116 세포의 유세포 분석 결과, (b) pH 7.4에서 24시간 동안 리포좀(equivalent DTX 10 μg/mL) 또는 free DTX(10 μg/mL)로 처리된 HCT-116 세포 또는 KB 세포의 생존율(free DTX에 비교), (c) pH 7.4에서 24시간 동안 리포좀(equivalent DTX 10 μg/mL) 또는 free DTX(10 μg/mL)로 처리된 HCT-116 세포 또는 KB 세포의 공초점 현미경 이미지, (d) pH 7.4 또는 6.5에 노출된 리포좀(1 mg/mL)의 용혈 효과(HSPC 리포좀에 비교)를 나타낸 것이다.
도 7은 일반적인 방법으로 제조된 리포좀(HSPC/HA-g-DEAP0.40@cLipo)의 공초점 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 8은 HA-g-DEAPs의 1H-NMR 피크를 나타낸 것이다.
도 9는 HA-g-DOCA0.35의 1H-NMR 피크를 나타낸 것이다.
도 10은 pH 6.5에서 일반적인 방법으로 제조된 리포좀(HSPC/HA-g-DEAP0.40@cLipo)의 DTX 누적 방출 경향을 나타낸 것이다.
도 11은 리포좀(1-100 μg/mL)으로 24시간 동안 처리된 HCT-116 세포의 생존율을 나타낸 것이다.
도 12는 리포좀(1-100 μg/mL)으로 24시간 동안 처리된 KB 세포의 생존율을 나타낸 것이다.
본 발명의 발명자들은 하이드로제네이티드 소이 포스파티딜콜린(hydrogenated soy phosphatidylcholine; HSPC, as a backbone lipid); 기능성 물질인 3-(디에틸아미노)프로필아민(3-(diethylamino)propylamine; DEAP)이 히알루론산(hyaluronic acid; HA)에 결합된 pH 반응성 고분자(이하, HA-g-DEAP); 및 도세탁셀(docetaxel; DTX, 항암제);을 이용하여 pH 반응성 리포좀을 제조하였다.
먼저, 콩 기름(soybean oil) 및 Tween 80을 이용하여 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS) 상에서 DTX를 나노-에멀젼화한 후, HSPC 리포좀 제조 과정에 첨가해 리포좀 내부의 비어 있는 공간에 DTX를 봉입하였다. 다음으로, HA-g-DEAP를 리포좀 외부 표면에 도입하였다. 수용액 상(pH 7.4)에서 DTX가 봉입된 HSPC 리포좀 및 HA-g-DEAP의 혼합물을 초음파 처리하면, HSPC 리포좀의 외부 표면에 HA-g-DEAP(HA에 결합된 DEAP의 몰비에 따라 HA-g-DEAP0.15, HA-g-DEAP0.25, HA-g-DEAP0.40)가 자발적으로 결합하여 된다. 초음파 처리 시, 첨가되는 HA-g-DEAP 양에 따라 리포좀의 pH 민감도를 쉽게 조절할 수 있다. 리포좀 인지질 이중층에 고정된 DEAP 부분은 pH 7.0 이하에서 양성자화(즉, 이온화)되어 리포좀의 불안정화를 초래하고, 엔도좀 내의 pH 자극을 통해 리포좀 내 봉입된 약물을 방출한다. 또한, 리포좀의 HA 부분은 CD44 수용체와 특이적으로 상호작용하여 리포좀이 종양 세포와 적극적으로 결합하게 하고, 이후 내포 작용을 초래하며, 엔도좀 pH(~ pH 6.5)에서 pH 자극을 통해 약물의 방출을 야기한다.
실험 결과, HA-g-DEAP0.40이 결합된 리포좀은 pH가 6.5(엔도좀 pH)로 감소함에 따라 리포좀 내부에 봉입되어 있는 DTX를 효율적으로 방출시키는 것을 확인하였다. 특히, 리포좀 외부에 결합된 히알루론산은 결장암 세포(HCT-116)에 과발현되어 있는 CD44 수용체와 상호작용하여 내포작용을 통해 결장암 세포 내부로 들어가고, 엔도좀 pH에 따른 DTX 방출을 통해 종양 세포의 사멸을 현저하게 증가시키는 것을 확인하였으며, 이에, 본 발명의 항암 리포좀이 종양 치료에 있어서 약제학적 잠재성을 나타내는 것을 확인하였다.
이에, 본 발명은 pH 감응성 기능성기가 결합된 히알루론산 및 인지질로 이루어진 리포좀으로서, 상기 히알루론산은 리포좀 외부 표면에 결합되고, 상기 pH 감응성 기능성기는 리포좀 인지질 이중층에 고정되며, 상기 리포좀 내부에 항암제가 봉입된 것을 특징으로 하는 pH 반응성 항암 리포좀을 제공한다.
상기 pH 감응성 기능성기는 3-(디에틸아미노)프로필아민(3-(diethylamino)propylamine; DEAP)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 인지질은 하이드로제네이티드 소이 포스파티딜콜린(hydrogenated soy phosphatidylcholine; HSPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine; DSPE), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 디라우로일 포스파티딜콜린(dilauroyl phosphatidylcholine; DLPC), 디미리스토일 포스파티딜콜린(dimyristoyl phosphatidylcholine; DMPC), 디팔미토일 포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine; DPPC), 디스테아로일 포스파티딜콜린(distearoyl Phosphatidylcholine; DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DOPC), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylcholine; POPC), 디에틸 포스포로시아나데이트(diethyl phosphorocyanidate; DEPC), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol), 디미리스토일 포스파티딜클리세롤(dimyristoyl phosphatidylglycerol; DMPG), 디팔미토일 포스파티딜글리세롤(dipalmitoyl-phosphatidylglycerol; DPPG), 더마탄 설페이트 프로테오글리칸(dermatan sulfate proteoglycan; DSPG), 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜글리세롤(1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylglycerol; POPG), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 비스(1.2-디메틸포스피노)에탄(bis(1,2-dimethylphosphino)ethane; DMPE), 1,2-비스(디페닐포스피노)에탄(1,2-Bis(diphenylphosphino)ethane; DPPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine; DOPE), 포스파티딜세린(phosphatidylserine) 및 디올레오일 포스파티딜세린(dioleoyl phosphatidylserine; DOPS)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 pH 감응성 기능성기가 결합된 히알루론산은 pH 감응성 기능성기 및 히알루론산이 (0.1 ~ 0.4) : 1의 몰비로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 항암 리포좀은 pH 감응성 기능성기가 결합된 히알루론산 및 인지질 이루어진 리포좀이 (0.1 ~ 0.5) : 1의 중량비로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 히알루론산은 암세포 표면에 발현되어 있는 CD44 수용체와 상호작용하여 항암 리포좀의 내포작용을 유도하며, 상기 항암 리포좀은 pH 6.2 내지 pH 6.8의 약산성에서 내부에 봉입된 항암제를 방출하여 암세포의 사멸을 유도할 수 있다.
상기 리포좀 내부에 봉입된 항암제는 도세탁셀, 파클리탁셀, 5-FU(5-fluorouracil), 타목신, 아나스테로졸, 카보플라틴, 토포테칸, 벨로테칸, 이마티닙, 이리노테칸, 플록수리딘, 비노렐빈, 겜시타빈, 루프롤리드 (leuprolide), 플루타미드, 졸레드로네이트, 메토트렉세이트, 캄토테신, 시스플라틴, 빈크리스틴, 히드록시우레아, 스트렙토조신, 독소루비신 및 발루비신으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 항암 리포좀의 평균 직경은 30 내지 200 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
또한, 본 발명은 상기 pH 반응성 항암 리포좀을 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 항암 리포좀은 pH 6.2 내지 pH 6.8의 약산성에서 내부에 봉입된 항암제를 방출하여 암세포의 사멸을 유도할 수 있다.
상기 암 질환은 결장암, 폐암, 피부암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호킨스씨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 암 질환의 암세포는 표면에 CD44 수용체를 발현하는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 pH 감응성 기능성기가 결합된 히알루론산 및 인지질로 이루어진 리포좀으로서, 상기 히알루론산은 리포좀 외부 표면에 결합되고, 상기 pH 감응성 기능성기는 리포좀 인지질 이중층에 고정되며, 상기 리포좀 내부에 약물 또는 생리활성물질이 봉입된 것을 특징으로 하는 약물 또는 생리활성물질 전달용 조성물을 제공한다.
상기 약물은 공지된 어떠한 약물이라도 사용이 가능하며, 상기 생리활성물질은 펩타이드, 단백질, 항암제, 소염진통제, 항생제, 항균제, 호르몬제, 유전자 및 백신으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 실험 재료
히알루론산(Hyaluronic acid; HA, Mn= 4.8 kDa), 3-(디에틸아미노)프로필아민(3-(diethylamino)propylamine; DEAP), N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(N,N′-dicyclohexylcarbodiimide; DCC), N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS), 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO), 트리에틸아민(triethylamine; TEA), 붕사(sodium tetraborate; Na2B4O7), 디옥시콜산(deoxycholic acid; DOCA), 4-디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine; DMAP), 피리딘(pyridine), 클로로포름(chloroform), 도세탁셀(docetaxel; DTX), 콩 기름(soybean oil), 트윈 80(tween 80), 아지드화 나트륨(sodium azide), 메틸 삼차 뷰틸 에터(tert-butyl methyl ether; TBME), 탈이온수(deionized water, HPLC 등급), 아세토니트릴(acetonitrile, HPLC 등급), 헤파린(heparin), DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) 및 Triton X-100는 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하였다. Chlorin e6(Ce6)는 Frontier Scientific Inc(USA)에서 구입하였으며, 하이드로제네이티드 소이 포스파티딜콜린(Hydrogenated soy phosphatidylcholine; HSPC)은 Avanti Polar Inc(USA)에서 구입하였다. RPMI-1640, 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS), 페니실린(penicillin), 트립신(trypsin), 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 및 스트렙토마이신(streptomycin)은 Welgene Inc(Korea)에서 구입하였다. LysoTrackerⓡ 및 Annexin-V FITC 형광 현미경 키트는 BD PharmingenTM(USA)에서 구입하였으며, Cell Counting Kit-8(CCK-8)은 Dojindo Molecular Technologies Inc(Japan)에서 구입하였다.
실시예 2: HA-g-DEAP 합성
각각 다른 양의 반응물을 이용하여 DEAP가 결합된 세 가지 유형의 HA를 제조하였다. DEAP(각각 30, 50, 65 mg)를 HA[200 mg, DMSO(15 mL) 상에서 DCC(각각 85, 130, 170 mg), NHS(각각 45, 70, 95 mg) 및 TEA(1 mL)로 하루 동안 반응시켜 전처리함]에 결합하기 위해, DMSO(15 mL) 상에서 25℃의 온도 조건으로 2일 동안 반응시켰다.
반응 후, 생성된 용액에서 반응하지 않은 물질들을 제거하기 위해 여과 후, DMSO(2일 동안)로 투석한 다음 붕사 용액(5 mM) (2일 동안)으로 투석[투석막(Spectra/Por® MWCO 3.5 kDa; Spectrum Lab., USA)]하였다. 최종적으로, HA-g-DEAP0.15, HA-g-DEAP0.25 및 HA-g-DEAP0.40을 합성하였으며, 상기 숫자는 HA의 반복 단위 당 결합된 DEAP의 수를 나타낸다.
DOCA가 결합된 HA(DEAP에 대한 pH 비민감성 대조군)는 HA(200 mg)와 DOCA[580 mg, DMSO(15 mL) 상에서 DCC(300 mg), DMAP(180 mg) 및 피리딘(1 mL)으로 2일 동안 반응시켜 전처리함]를 DMSO(20 mL) 상에서 25℃의 온도 조건으로 2일 동안 반응시켜 제조하였다.
생성된 용액에서 반응하지 않은 물질들을 제거하기 위해, DMSO(2일 동안)로 투석[투석 막(Spectra/Por® MWCO 3.5 kDa)을 이용함]한 다음 증류수(2일 동안)로 투석하였다. 최종적으로, HA-g-DOCA0.35를 합성하였으며, 상기 숫자는 HA의 반복 단위 당 결합된 DOCA의 수를 나타낸다.
형광 분석을 위해, 형광 Ce6 dye가 표지된 HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA를 제조하였다. HA-g-DEAP(20 mg) 또는 HA-g-DOCA(20 mg)를 Ce6[2 mg, DMSO(1 mL) 상에서 DCC(0.5 mg), DMAP(0.5 mg) 및 피리딘(0.1 mL)으로 하루 동안 반응시켜 전처리함]와 DMSO(2 mL) 상에서 하루 동안 반응시켰다.
Ce6 dye가 표지된 HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA를 정제하기 위해, 반응물을 DMSO로 투석(Spectra/Por® MWCO 1 kDa)하여 반응하지 않은 물질들을 제거하고, 투석한 용액을 동결 건조하여 최종 생성물을 획득하였다.
실시예 3: pH 반응성 리포좀의 제조
HSPC(20 mg)을 클로로포름(15 mL)에 용해한 후, 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 둥근 바닥 플라스크에 있는 용매는 회전 증발기(EYELA, N-1000, Fisher Scientific Inc., USA)를 이용하여 제거하였다. 획득한 얇은 HSPC 막에 DTX 나노 에멀젼[2 mg의 DTX를 2 mL의 콩 기름/트윈 80/5 mM 붕사 용액(3.75/3.75/92.50, vol.%)에 넣고 4000 rpm으로 격렬히 혼합하여 나노 에멀젼을 제조함]을 포함하는 9 mL의 붕사 용액(5 mM)을 넣고 프로브 타입(probe type)의 초음파 장치(VCX 130, Sonics & Materials Inc., USA)를 이용해 25 W 세기로 5분 동안 처리하여 재수화하였다. 제조된 리포좀은 압출기(LF-50, Avestin Inc., Canada)를 이용하여 여과하였다.
다음으로, 5 mM 붕사 용액(2 mL) 상에서 HA-g-DEAP(1-10 mg) 또는 HA-g-DOCA(4 mg)를 리포좀(20 mg)과 혼합하였다. 그 다음 인지질 이중층에 HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA를 고정시키기 위해, 10분 동안 초음파(60 kHz)를 처리하였다. 제조된 리포좀은 다음과 같이 명명하였다: HA-g-DEAP0.15@Lipo, HA-g-DEAP0.25@Lipo, HA-g-DEAP0.40@Lipo, HA-g-DOCA0.35@Lipo 및 HSPC 리포좀(HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA가 없음).
리포좀에 봉입된 DTX 함량은 CAPCELL PAK C18 컬럼(250 x 4.6 mm, 5 μm, Shiseido Co. Ltd., Japan)이 장착된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, Alliance e2695, Waters, USA)를 사용하여 25℃에서 측정하였다. DTX 시료[TBME와 5분 동안 격렬히 혼합하여 추출함]를 이동상(증류수/아세토니트릴: 45/55, vol.%)으로 옮긴 다음 HPLC를 사용하여 230 nm 파장에서 분석하였다.
DTX의 봉입 효율(%)은 초기에 넣어준 약물의 양에 대해 리포좀 내로 실제 봉입된 약물의 양을 중량 백분율 비로 계산하였다. DTX 봉입 함량(%)은 리포좀에 봉입된 DTX의 중량 백분율로 계산하였다. 각 리포좀에 봉입된 DTX의 봉입 효율(%) 및 봉입 함량(%)은 각각 70~84 및 6~7 질량%임을 확인하였다.
각 리포좀의 HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA의 농도는 25,000 rpm으로 10분 동안 초원심분리한 후, 상층 액에 남아있는 형광 Ce6 dye로 표지된 HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA의 형광 강도를 측정하여 계산하였으며, HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA의 봉입 효율(%)과 봉입 함량(%)은 각각 25~34 및 7~9 질량%임을 확인하였다.
대조군 약물 전달체로서 HSPC, DTX 및 HA-g-DEAP(이하, HSPC/HA-g-DEAP0.40@cLipo, cLipo는 일반적인 리포좀을 나타냄)를 포함하는 일반적인 리포좀은 종래 리포좀 제조방법에 따라 제조하였다(도 7). 간략하게, 얇은 HSPC(20 mg) 막을 상기에 기재된 방법으로 동일하게 제조하고, 상기 HSPC 막에 DTX 에멀젼(2 mg/2 mL) 및 HA-g-DEAP0.40(4 mg)을 포함하는 9 mL의 붕사 용액(5 mM)을 넣고 추가적인 초음파 처리 단계 없이 프로브 타입 초음파 장치를 이용해 25 W 세기로 5분 동안 처리하여 재수화하였다.
실시예 4: 리포좀 분석
pH 7.4, 7.0, 6.5의 다른 pH 값을 갖는 PBS/붕사 완충액(145/5 mM)에 리포좀(0.1 mg/mL)을 분산시키고, 리포좀의 입자 크기 및 제타 전위를 Zetasizer 3000(Malvern Instruments, USA)을 이용하여 측정하였다. 리포좀의 형태는 pH 7.4 또는 pH 6.5(37℃에서 30분 동안)에서 안정화시킨 후, JEM1010 투과 전자 현미경(transmission electron microscope; TEM, JEOL, Japan)을 이용하여 확인하였다. 리포좀에 형광 Ce6 dye로 표지된 HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA의 분포는 레이저 스캐닝 현미경(Carl Zeiss LSM710, Germany)을 사용하여 시각화하였다.
실시예 5: In vitro DTX 방출 분석
1 mL의 PBS/붕사 완충액(145/5 mM, pH 7.4 또는 6.5)에 리포좀(equivalent DTX 1 mg/mL)을 분산시키고, 투석막 튜브(Spectra/Por® MWCO 10 kDa)에 넣었다. 0.5 중량%의 트윈 80 및 0.1 중량%의 아지드화 나트륨을 함유하는 15 mL의 PBS(150 mM, pH 7.4 또는 6.5)에 상기 투석막 튜브를 담그고, 37℃, 기계적 교반(100 rev./min) 하에서 DTX 방출 시험을 수행하였다. 지정된 시간 간격에서, 투석막 튜브의 외부 수용액 상을 추출하고 DTX의 방출 조건을 유지시켜 주기 위해 신선한 완충액으로 교체해 주었다. 리포좀으로부터 방출된 DTX의 양은 상기에 설명한 바와 같이 HPLC를 이용하여 측정하였다.
실시예 6: In vitro 세포 내 흡수 및 공초점 현미경 분석
인간 결장암 세포 HCT-116 및 인간 표피세포암종 KB 세포(Korean Cell Line Bank)는 1% 페니실린-스트렙토마이신, 10% FBS가 첨가된 RPMI-1640 배지를 이용하여 5% CO2 농도, 37℃ 조건에서 배양하였다. 실험에 앞서, 세포(106/mL)를 단층 상태로 배양하고, 0.25%(wt./vol.) 트립신 및 0.03%(wt./vol.) EDTA 수용액을 처리하여 세포를 수집한 다음 RPMI-1640 배지를 이용하여 플레이트 웰에 각각 분주하였다.
In vitro 상에서 세포 흡수 실험을 수행하기 위해, HCT-116(CD44 수용체 있음) 또는 KB 세포(CD44 수용체 없음)에 형광 Ce6 dye가 표지된 리포좀(10 mg/mL)을 처리하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이후 신선한 PBS(pH 7.4)로 3회 세척한 다음 유세포 분석기(BD, FACS Canto II, BD Biosciences, USA)를 이용하여 세포 흡수를 정량화하였다.
또한, 세포는 형광 Ce6 dye로 표지된 리포좀(10 mg/mL)과 함께 pH 7.4, 37℃ 조건에서 12시간 동안 배양하였다. 이후 DAPI와 LysoTrackerⓡ를 이용하여 세포의 핵과 엔도좀을 염색하고, PBS(pH 7.4)로 3회 세척한 다음 공초점 현미경을 이용하여 분석하였다.
실시예 7: In vitro 세포 독성 및 용혈 시험 분석
HCT-116 및 KB 세포는 리포좀(equivalent DTX 10 μg/mL) 또는 free DTX(10 μg/mL)와 함께 pH 7.4, 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 세포를 신선한 세포 배지(리포좀 또는 DTX가 없음)로 3회 세척한 다음 12시간 동안 추가 배양하였다. 세포 생존율은 CCK-8을 이용해 측정하였으며, 초기 자가세포사멸을 확인하기 위해 Annexin-V FITC로 염색하여 공초점 현미경으로 분석하였다.
리포좀의 용혈 활성(hemolytic activity)은 BALB/c 마우스(7주령, 암컷)로부터 얻은 적혈구(RBCs)를 이용하여 평가하였다. BALB/c 마우스로부터 얻은 혈액은 헤파린/EDTA가 함유된 튜브에 넣고, 1500 g에서 10분 동안 원심분리하여 펠릿(pellet)을 획득하였으며, 상기 펠릿은 차가운 PBS(pH 7.4)로 3번 세척한 후 깨끗한 PBS(pH 7.4)에 분산시켰다. 서로 다른 pH 값(pH 7.4 또는 6.5)으로 제조된 적혈구 용액을 리포좀(1 mg/mL)과 함께 37℃의 항온 수조에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 1500 g에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 획득하였으며, 적혈구로부터 방출된 헤모글로빈의 양은 광도계(light absorbance: LA)를 이용하여 541 nm 파장에서 측정하였다. 0% control value(LA)는 PBS를 처리한 적혈구 용액이며, 모든 시료의 LA 보정에 사용하였다. 100% control은 2% Triton X-100을 이용하여 적혈구를 완전히 용혈시킨 용액이다. 각 시료의 용혈(%)은 2%(중량 %) Triton X-100을 처리한 적혈구의 LA 대비 각 시료를 처리한 적혈구의 LA로 계산하였다.
리포좀의 독성을 평가하기 위해, HCT-116 또는 KB 세포에 리포좀(1-100 μg/mL, DTX 없음)을 처리하고 24시간 동안 배양한 후 CCK-8을 이용하여 세포의 생존율을 측정하였다.
실험예 1: HA가 코팅된 pH 반응성 리포좀의 제조 및 특징
HA에 DEAP가 결합된 세 종류의 HA-g-DEAP0.15, HA-g-DEAP0.25, HA-g-DEAP0.40은 pH 반응성 리포좀을 제조하기 위해 첨가제로서 합성하였다. 상기 0.15, 0.25, 0.40의 첨자는 HA에 결합된 DEAP의 몰 비를 나타내며, 1H-NMR 분석으로 결정하였다(도 8). 결합비는 δ 4.10 ppm(-CH, HA) 및 δ 0.90 ppm(-CH3, DEAP)에서 각 피크의 적분비를 이용하여 결정하였다.
HA에 결합된 pH 비반응성 물질인 DOCA 또한 HA의 반복 단위 당 결합된 DOCA의 수를 측정하기 위해 분석하였으며, 그 결과, δ 0.60 ppm(-CH3, DOCA) 및 δ 4.50 ppm(-CH, HA)에서 피크가 관찰되었고, 결합비는 0.35임을 확인하였다(도 9).
다음으로, HA-g-DEAPs 또는 HA-g-DOCA(HA-g-DEAP0.15@Lipo, HA-g-DEAP0.25@Lipo, HA-g-DEAP0.40@Lipo 또는 HA-g-DOCA0.35@Lipo)가 결합된 리포좀을 제조하고, pH 민감도를 분석하였다. HA-g-DEAP0.15@Lipo, HA-g-DEAP0.25@Lipo, HA-g-DEAP0.40@Lipo는 HA-g-DEAP(즉, HA-g-DEAP0.15, HA-g-DEAP0.25, HA-g-DEAP0.40)와 HSPC 리포좀을 0.2:1의 중량비로 사용하여 제조하였다.
도 2(a)를 참조하여 보면, 본 발명에서 제조된 모든 리포좀들은 pH 7.4에서 80~120 nm 범위의 입자 크기를 가지는 것을 확인할 수 있었다. pH 7.0에서 리포좀 간 입자 크기의 현저한 차이는 관찰되지 않았으나, 엔도좀 pH 6.5에서는 HA-g-DEAP0.40@Lipo가 리포좀의 불안정화로 인해 가장 극적인 입자 크기의 변화를 나타내었다(도 2b). 또한, HA-g-DEAP0.40@Lipo의 표면 전하는 생리적 pH 7.4부터 엔도좀 pH 6.5까지 가장 큰 제타 전위 값의 변화를 나타내었다(도 2c). 이는 HA-g-DEAP0.40@Lipo에 DEAP 부분이 가장 많이 존재하기 때문이다. 엔도좀 pH 6.5에서 DEAP 부분의 양성자화로 인해 HA-g-DEAP0.40@Lipo의 제타 전위 값의 증가가 일어난 것으로 보이며, 비슷하게, HA-g-DEAP0.25@Lipo와 HA-g-DEAP0.15@Lipo의 제타 전위도 pH 6.5에서 DEAP 부분의 양성자화로 인해 각각 양전하를 나타내거나 0에 가깝게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 반면, HSPC 리포좀은 DEAP 부분이 존재하지 않기 때문에 다른 pH 값들에서 일정한 입자 크기와 표면 전하를 나타내었다. 또한, HA 부분의 존재로 인해 pH 7.4와 pH 7.0에서 HA-g-DOCA0.35@Lipo의 제타 전위는 음의 값을 나타내었다. 즉, 엔도좀 pH 값에서 HA-g-DEAP0.40@Lipo는 DEAP 부분의 광범위한 양성자화로 인해 불안정해지고, pH 반응성 약물 전달 수단으로서 추가 실험의 강력한 후보 물질로 평가되었다.
HA-g-DEAP0.40@Lipo의 pH 반응성을 확인하기 위해, pH 7.4와 pH 6.5에서 TEM 이미지를 분석하였다. 그 결과, 도 3(a)를 참조하여 보면, 낮은 pH에서 양성자화될 수 있는 DEAP를 많이 가진 HA-g-DEAP0.40@Lipo가 엔도좀 pH 6.5에서 리포좀의 구조가 불안정해진 반면, HA-g-DOCA0.35@Lipo는 pH 6.5에서 원형의 구조를 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 형광 Ce6 dye를 이용한 공초점 현미경 분석 결과와 일치한다(도 3b). HA-g-DOCA0.35@Lipo는 pH 6.5에서 형태가 변하지 않았지만, HA-g-DEAP0.40@Lipo는 엔도좀 pH에서 리포좀 구조가 붕괴되었다. 또한, HA-g-DEAP0.40에 표지된 Ce6 dye의 붉은색 형광이 리포좀의 표면에서 나타나는 것을 공초점 현미경을 통해 확인할 수 있었다. 이는 초음파 처리를 통해 HA-g-DEAP0.40이 리포좀 내부에 봉입되는 것을 방지하고, HSPC 리포좀 표면에 HA-g-DEAP가 결합되도록 유도했기 때문이다.
실험예 2: pH 반응성 약물 방출 및 in vitro 상에서 리포좀의 세포 내재화
서로 다른 pH에서 HA-g-DEAP0.40@Lipo의 약물 방출 경향을 분석하기 위해, DTX를 리포좀 내에 봉입하였다. 도 4(a)를 참조하여 보면, HA-g-DEAP0.40@Lipo와 HA-g-DOCA0.35@Lipo는 pH 7.4 또는 pH 6.5에서 12시간 후 안정기에 도달하였고, HA-g-DOCA0.35@Lipo의 DTX 누적 방출량은 pH 비의존적이었으나, HA-g-DEAP0.40@Lipo는 pH 7.4보다 pH 6.5에서 훨씬 높은 DTX 누적 방출량을 나타내었다. 이는 HA-g-DEAP0.40@Lipo가 높은 pH 반응성을 가지며, 약물을 세포질로 전달하기에 더욱 효과적인 약물 전달체라는 것을 시사한다.
도 4(b)를 참조하여 보면, DTX 누적 방출 경향은 리포좀 표면에 부착된 HA-g-DEAP0.40의 양에 의존적인 것을 확인하였다. pH 7.4에서 리포좀에 HA-g-DEAP0.40의 부착 정도가 DTX 방출량에 영향을 미치지 않았으나, pH 6.5에서는 많은 양의 HA-g-DEAP0.40이 리포좀에 결합될수록 많은 양의 DTX 방출량을 나타내는 것을 확인하였다. 이는 양성자화될 수 있는 HA-g-DEAP0.40의 첨가량에 따라 pH 민감도가 쉽게 조절될 수 있음을 의미한다.
또한, 일반적인 제조방법을 통해 만들어진 리포좀인 HSPC/HA-g-DEAP0.40@cLipo(도 7)는 리포좀 내 HA-g-DEAP0.40의 무작위적인 분포로 인해 효율적인 DTX 방출이 일어나지 않았다(도 10). 따라서, 잘 만들어진 HA-g-DEAP0.40@Lipo는 강력한 pH 반응성 약물 전달 제제일 수 있음을 시사한다.
다음으로 HA-g-DEAP0.40@Lipo가 내포 작용을 통해 세포 내로 들어가는지 여부를 공초점 현미경으로 확인하였다. 추가로 pH에 반응하여 엔도좀 탈출을 야기하고 약물을 방출하는지 여부를 확인하였다. 또한, 형광 Ce6 dye를 HA-g-DEAP0.40에 표지하여 리포좀의 엔도좀 붕괴 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 5(a)를 참조하여 보면, HCT-116 종양 세포 표면에 과발현 되어 있는 CD44 수용체 및 HA의 상호작용으로 인해 HA가 포함된 HA-g-DEAP0.40@Lipo와 HA-g-DOCA0.35@Lipo에서 Ce6 적색 형광이 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 또한, HA-g-DEAP0.40@Lipo는 세포질로 확산되어 세포질에서 Ce6 dye가 검출되었다. HA-g-DOCA0.35@Lipo 또는 HSPC 리포좀의 형태와 달리, 이는 pH 반응성인 HA-g-DEAP0.40에 유발된 엔도좀 분해 활성에 의한 결과이다.
한편, 도 5(b)를 참조하여 보면, HA-g-DEAP0.40@lipo, HA-g-DOCA0.35@Lipo 및 HSPC 리포좀 모두 KB 세포에서 약한 Ce6 형광을 나타내었다. CD44 수용체가 결핍된 KB 세포의 경우, 세포 내재화 및 리포좀의 엔도좀 탈출에 있어서 미미한 영향을 나타내었으며, 이는 HA-g-DEAP0.40@Lipo가 CD44 수용체를 과발현하는 종양 세포를 표적으로 하여 새로운 종양 치료 방법을 제시할 수 있음을 시사한다.
실험예 3: In vitro 상에서 종양 세포의 성장 억제 및 엔도좀 분해 활성 시험
다음으로 유세포 분석기를 이용하여 리포좀의 세포 내 흡수 여부를 정량적으로 분석한 결과, 도 6(a)와 같이, HA-g-DEAP0.40@Lipo 및 HA-g-DOCA0.35@Lipo가 효과적으로 HCT-116 세포 내로 흡수되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 리포좀의 종양 세포 독성을 평가하기 위해, free DTX 또는 DTX가 봉입된 HA 결합 리포좀을 HCT-116 세포 또는 KB 세포에 처리한 결과, DTX가 봉입된 HA-g-DEAP0.40@Lipo는 HCT-116 세포의 세포 생존율을 현저하게 감소시키는 것을 확인하였고(도 6b), 이는 HA-g-DEAP0.40@Lipo가 세포 내부로 DTX를 전달하고, 엔도좀을 탈출하여 효과적으로 DTX의 방출을 야기함을 시사한다. 반면, HA-g-DEAP0.40@Lipo는 CD44 수용체가 없는 KB 세포는 낮은 종양 세포 사멸 효과를 나타내었다. 상기 결과와 일치하게, HA-g-DEAP0.40@Lipo는 Annexin V-FITC를 이용한 실험에서 가장 강한 녹색 형광을 나타내었으며, 상기 리포좀이 프로그램된 세포 사멸을 유도하는 것을 확인할 수 있었다(도 6c).
또한, 도 11 및 도 12를 참조하여 보면, HA-g-DEAP0.40@Lipo, HA-g-DOCA0.35@Lipo 및 HSPC 리포좀을 고농도(~100 μg/mL)로 HCT-116 세포 또는 KB 세포에 처리하였을 때, 세포 생존율에 큰 변화가 관찰되지 않았으며, 이는 리포좀이 암세포에 대한 약물 전달 수단으로서 생체 적합성이 높음을 시사한다.
다음으로 엔도좀 탈출(endosomal escape) 효과를 확인하기 위해, BALB/c 마우스로부터 얻은 적혈구를 사용하였다(도 6d). HA-g-DEAP0.40@Lipo는 강력한 엔도좀 분해 성질을 가지고 있는 바(도 5), 엔도좀 pH 6.5에서 적혈구에 대해 높은 용혈 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, pH 7.0에서 HA-g-DEAP0.40@Lipo의 용혈 효과가 HA-g-DOCA0.35@Lipo 및 HSPC 리포좀 보다 높게 나타났다. 이는 HA-g-DEAP0.40@Lipo에 있는 DEAP가 양성자화되어 pH 7.0에서도 어느 정도 용혈 현상을 일으키는 것으로 사료된다. 즉, HA-g-DEAP0.40@Lipo는 CD44 수용체를 가지고 있는 종양 세포에 대해 엔도좀 탈출이 가능한 약물 전달체임을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

  1. 3-(디에틸아미노)프로필아민(3-(diethylamino)propylamine; DEAP)이 결합된 히알루론산 및 인지질로 이루어진 리포좀으로서,
    상기 히알루론산은 리포좀 외부 표면에 결합되고,
    상기 3-(디에틸아미노)프로필아민은 리포좀 인지질 이중층에 고정되며,
    상기 리포좀 내부에 항암제가 봉입되며,
    상기 3-(디에틸아미노)프로필아민이 결합된 히알루론산은 3-(디에틸아미노)프로필아민 및 히알루론산이 0.4 : 1의 몰비로 포함된 것을 특징으로 하는 pH 반응성 항암 리포좀.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 인지질은 하이드로제네이티드 소이 포스파티딜콜린(hydrogenated soy phosphatidylcholine; HSPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine; DSPE), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 디라우로일 포스파티딜콜린(dilauroyl phosphatidylcholine; DLPC), 디미리스토일 포스파티딜콜린(dimyristoyl phosphatidylcholine; DMPC), 디팔미토일 포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine; DPPC), 디스테아로일 포스파티딜콜린(distearoyl Phosphatidylcholine; DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; DOPC), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylcholine; POPC), 디에틸 포스포로시아나데이트(diethyl phosphorocyanidate; DEPC), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol), 디미리스토일 포스파티딜클리세롤(dimyristoyl phosphatidylglycerol; DMPG), 디팔미토일 포스파티딜글리세롤(dipalmitoyl-phosphatidylglycerol; DPPG), 더마탄 설페이트 프로테오글리칸(dermatan sulfate proteoglycan; DSPG), 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜글리세롤(1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylglycerol; POPG), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 비스(1.2-디메틸포스피노)에탄(bis(1,2-dimethylphosphino)ethane; DMPE), 1,2-비스(디페닐포스피노)에탄(1,2-Bis(diphenylphosphino)ethane; DPPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine; DOPE), 포스파티딜세린(phosphatidylserine) 및 디올레오일 포스파티딜세린(dioleoyl phosphatidylserine; DOPS)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 pH 반응성 항암 리포좀.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 상기 항암 리포좀은 3-(디에틸아미노)프로필아민이 결합된 히알루론산 및 인지질 이루어진 리포좀이 (0.1 ~ 0.5) : 1의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 pH 반응성 항암 리포좀.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 히알루론산은 암세포 표면에 발현되어 있는 CD44 수용체와 상호작용하여 항암 리포좀의 내포작용을 유도하는 것을 특징으로 하는 pH 반응성 항암 리포좀.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 항암 리포좀은 pH 6.2 내지 pH 6.8의 약산성에서 내부에 봉입된 항암제를 방출하는 것을 특징으로 하는 pH 반응성 항암 리포좀.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 항암제는 도세탁셀, 파클리탁셀, 5-FU(5-fluorouracil), 타목신, 아나스테로졸, 카보플라틴, 토포테칸, 벨로테칸, 이마티닙, 이리노테칸, 플록수리딘, 비노렐빈, 겜시타빈, 루프롤리드 (leuprolide), 플루타미드, 졸레드로네이트, 메토트렉세이트, 캄토테신, 시스플라틴, 빈크리스틴, 히드록시우레아, 스트렙토조신, 독소루비신 및 발루비신으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 pH 반응성 항암 리포좀.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 항암 리포좀의 평균 직경은 30 내지 200 nm인 것을 특징으로 하는 pH 반응성 항암 리포좀.
  10. 제 1항의 pH 반응성 항암 리포좀을 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 항암 리포좀은 pH 6.2 내지 pH 6.8의 약산성에서 내부에 봉입된 항암제를 방출하는 것을 특징으로 하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 암 질환은 결장암, 폐암, 피부암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호킨스씨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제 10항에 있어서, 상기 암 질환의 암세포는 표면에 CD44 수용체를 발현하는 것을 특징으로 하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 3-(디에틸아미노)프로필아민(3-(diethylamino)propylamine; DEAP)이 결합된 히알루론산 및 인지질로 이루어진 리포좀으로서,
    상기 히알루론산은 리포좀 외부 표면에 결합되고,
    상기 3-(디에틸아미노)프로필아민은 리포좀 인지질 이중층에 고정되며,
    상기 리포좀 내부에 약물 또는 생리활성물질이 봉입되며,
    상기 3-(디에틸아미노)프로필아민이 결합된 히알루론산은 3-(디에틸아미노)프로필아민 및 히알루론산이 0.4 : 1의 몰비로 포함된 것을 특징으로 하는 약물 또는 생리활성물질 전달용 조성물.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 생리활성물질은 펩타이드, 단백질, 항암제, 소염진통제, 항생제, 항균제, 호르몬제, 유전자 및 백신으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 약물 또는 생리활성물질 전달용 조성물.
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