KR102560135B1

KR102560135B1 - 표적 치료제의 효과적인 전달을 위한 다기능성 리포좀 조성물

Info

Publication number: KR102560135B1
Application number: KR1020200168595A
Authority: KR
Inventors: 이은성; 김윤영
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2020-12-04
Filing date: 2020-12-04
Publication date: 2023-07-27
Also published as: KR20220079134A

Abstract

본 발명은 표적 치료제의 효과적인 전달을 위한 다기능성 리포좀 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 지질 이중층에 하나 이상의 개방부를 가지는 부분 개방 리포좀; 및 상기 개방부에 삽입되는 3-(디에틸아미노)프로필아민[3-(diethylamino)propylamine, DEAP]이 그라프팅(grafting)된 히알루론산(hyaluronic acid, HA);을 포함하며, 상기 리포좀 내부에 항암제가 봉입되고, 상기 개방부를 통해 상기 항암제가 방출되는 것을 특징으로 하는 pH 반응성 항암 리포좀을 제공한다.
상기 리포좀은 약물의 변성 없이 상기 리포좀 내부에 약물을 안정하게 봉입할 수 있고, 상기 약물의 방출을 효과적으로 제어할 수 있으며, 방출된 약물은 종양 부위를 특이적으로 표적하여 종양 세포 사멸을 증진시키고, 종양을 억제함으로써, 보다 안전하고 효과적으로 암 질환을 치료할 수 있다.

Description

표적 치료제의 효과적인 전달을 위한 다기능성 리포좀 조성물{MULTIFUNCTIONAL LIPOSOMAL COMPOSITION FOR EFFECTIVE DELIVERY OF TARGETED THERAPEUTIC AGENTS}

본 발명은 표적 치료제의 효과적인 전달을 위한 다기능성 리포좀 조성물에 관한 것이다.

표적 면역 치료제인 단클론 항체(monoclonal antibody)는 다양한 혈액 악성종양 및 고형 종양에 대한 치료 전략으로 사용된다. 단클론 항체는 특정한 항원을 정확하게 인지하여 체내의 면역 체계를 이용해 암세포를 사멸하는 기작을 가지고 있어, 기존의 종양 특이성이 없는 화학 항암제를 대체할 치료제로 대두되었다.

하지만, 이런 단클론 항체는 고형 암으로의 전달 능력이 낮아 표적 부위에서 약물의 국소 농도를 높이기 위해 고농도의 약물을 투여해야 하며, 이러한 고농도의 항체는 혈중 사이토카인의 농도를 상승시켜 중증 사이토카인 분비 증후군을 초래할 수 있는 문제점이 있다. 또한, 종양 세포에 과 발현된 일부 표적 항원은 다른 건강한 조직 세포에도 존재해 표적 조직 이외에도 체액성 또는 세포성의 면역 활성이 일어나 건강한 조직의 손상이 일어날 수 있다.

이러한 문제점을 극복하기 위해 유전자 클로닝(gene cloning)을 이용한 재조합 단클론 항체와 화학 항암제가 결합한 항체 약물 접합체(antibody drug conjugate, ADC) 형태의 항체를 개발하는 시도가 이루어지고 있지만, 제조과정과 정제과정에 있어 시간과 비용이 많이 소비되는 제약이 있다.

이에 항체를 효율적으로 운반할 수 있는 담체 개발 시도가 지속해서 이루어지고 있다. 항체를 운반하는 플랫폼을 개발하는 연구 분야는 단백질의 크기가 큰 성질과 pH, 온도, 압력, 사용하는 용매 성분 등의 환경 조건에 민감한 성질을 고려해, 봉입된 항체의 안정성에 초점을 두고 연구하는 분야이다. 또한, 생체 내에 주입 시 주입된 단백질을 둘러싸는 생체 분자의 포위가 단백질의 화학적, 물리적 성질에 중대한 영향을 미치기에, 이러한 문제점들을 보완할 수 있는 플랫폼이 지속해서 개발되고 있다. 대표적인 예로 고분자 마이크로스피어(polymeric microspheres)와 고분자 나노입자(polymeric nanoparticles), 리포좀(liposomes) 등이 사용되고 있으나, 이러한 플랫폼들에 단백질을 봉입하는 과정에서도 단백질이 변성될 수 있는 환경 요건에 노출될 가능성으로 인해 개발에 있어 제한이 있다.

상기 리포좀의 경우, 인지질로 형성된 이중막 소포체로서 리포좀의 내부에 친수성 약물을 봉입하거나 지질 이중 막에 소수성 약물을 봉입할 수 있다. 이러한 구조의 리포좀은 생체적합성과 생분해성 및 체내 안정성이 뛰어나기에 항체와 같은 단백질 약물을 봉입할 수 있지만, 기존의 봉입 방법인 얇은 막 수화(thin film hydration) 방법을 이용한 봉입의 경우 높은 온도 및 초음파 펄스, 고압에 의해 변성이 야기될 수 있는 문제가 있다.

대한민국 공개특허 제10-2014-0097215호 (2014.08.06. 공개)

본 발명의 목적은 표적 항암제를 안정하게 봉입하고 이를 종양 부위에 효과적으로 전달할 수 있는 항암 리포좀을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항암 리포좀을 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 약물 또는 생리활성물질을 효과적으로 전달하는 약물 또는 생리활성물질 전달용 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지질 이중층에 하나 이상의 개방부를 가지는 부분 개방 리포좀; 및 상기 개방부에 삽입되는 3-(디에틸아미노)프로필아민[3-(diethylamino)propylamine, DEAP]이 그라프팅(grafting)된 히알루론산(hyaluronic acid, HA);을 포함하며, 상기 리포좀 내부에 항암제가 봉입되고, 상기 개방부를 통해 상기 항암제가 방출되는 것을 특징으로 하는 pH 반응성 항암 리포좀을 제공한다.

본 발명은 상기의 리포좀을 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 지질 이중층에 하나 이상의 개방부를 가지는 부분 개방 리포좀; 및 상기 개방부에 삽입되는 3-(디에틸아미노)프로필아민[3-(diethylamino)propylamine, DEAP]이 그라프팅(grafting)된 히알루론산(hyaluronic acid, HA);을 포함하며, 상기 리포좀 내부에 약물 또는 생리활성물질이 봉입되고, 상기 개방부를 통해 상기 약물 또는 생리활성물질이 방출되는 것을 특징으로 하는 약물 또는 생리활성물질 전달용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 리포좀은 외부 자극에 노출이 없는 부분 개방 리포좀을 이용하여 항암제 등과 같은 약물을 변성 없이 상기 리포좀 내부에 안정하게 봉입할 수 있고, 상기 리포좀의 개방부에 pH 감응성 고분자를 삽입하여 상기 약물의 방출을 효과적으로 제어할 수 있다.

상기 리포좀은 기존 리포좀에 봉입되기 어려운 크기의 항암 항체 등의 약물을 쉽고 안전하게 봉입할 수 있는 이점이 있다.

또한, 상기 리포좀은 약산성 조건에서 우수한 약물 방출 성능을 보이고, 상기 방출된 약물은 종양 부위를 특이적으로 표적하여 종양을 억제함으로써, 보다 안전하고 효과적으로 암 질환을 치료할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 전달 리포좀의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 리포좀의 형태를 확인한 이미지로, (a)는 투과전자현미경(TEM) 이미지, (b)는 초분광 화상 이미지이다.
도 3은 상기 리포좀의 pH에 따른 형태를 분석한 것으로, (a)는 pH에 따른 각 리포좀의 입자 크기, (b)는 제타 전위 및 (c)는 TEM 이미지이다.
도 4는 상기 리포좀의 항체 방출 경향 및 상기 항체의 안정성을 분석한 것으로, (a) 및 (b)는 pH에 따른 항체 리툭시맙(rituximab) 또는 IgG의 방출 경향을 나타낸 그래프이고, (c)는 상기 항체의 안정성을 분석한 스펙트럼으로, Free rituximab과 free IgG는 대조군으로 사용하였다.
도 5는 상기 리포좀 처리에 따른 유세포 분석 결과로, (a)는 Ramos 세포, (b)는 MDA-MB-231 종양 세포에 대한 분석 결과 그래프이다.
도 6은 상기 리포좀 처리 후 세포 표면에 항체 부착 정도를 확인한 결과로, (a)는 Ramos 세포, (b)는 MDA-MB-231 종양 세포에 대한 공초점 이미지이며, (c)는 각 리포좀에서 방출된 rituximab의 시간에 따른 세포 결합 활성을 확인한 공초점 타입-랩스 이미지이다.
도 7은 상기 리포좀 처리에 따른 세포 독성를 확인한 것으로, (a)는 rituximab이 없는 리포좀을 처리한 경우의 세포 독성 그래프, (b)는 rituximab을 봉입한 리포좀 처리에 따른 Ramos 세포에서의 보체 의존성 세포 독성(CDC) 그래프, 및 (c)는 rituximab을 봉입한 리포좀 처리에 따른 Ramos 세포에서의 막공격복합체 C5b-9 발현 변화 그래프를 나타낸다.
도 8은 상기 리포좀 처리에 따른 세포자멸사 효과를 확인한 것으로, (a)는 Ramos 세포에서의 Bcl-2 발현 변화 그래프이고 (b)는 cleaved caspase-3의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 9는 동물 실험을 통해 상기 리포좀에서 방출된 rituximab의 종양 흡수를 확인한 것으로, (a)는 Ramos 종양 세포가 이식된 누드 마우스에 정맥 주사된 샘플의 비침습적 형광 종양 이미지(형광 종양 이미지는 주사 후 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간 이후에 확인)이고, (b)는 정맥 주사 후 24시간 경과 시 적출한 장기에서 나타난 각 샘플의 형광 이미지이다.
도 10은 동물 실험을 통해 상기 리포좀의 종양 치료 효능을 확인한 것으로, (a)는 Ramos 종양 세포가 이식된 누드 마우스의 상대적인 종양 크기 변화(V_t/V₀)를 나타낸 그래프, (b)는 상기 마우스의 상대적인 체중 변화(W_t/W₀)를 나타낸 그래프, (c)는 상기 마우스에 각 샘플 주사 7일 후의 디지털 이미지로 종양 부위는 빨간색 원으로 표시하였으며, (d)는 각 샘플을 상기 마우스에 주사 후 7일 뒤 적출한 종양의 광학 이미지이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명의 발명자들은 봉입 과정에서 외부 자극에 노출이 없는 마그네토포레이션(magnetoporation) 방법을 이용하여 방출 제어가 가능하며, 비호지킨성 림프종의 치료용 단클론 항체인 리툭시맙(rituximab)을 안정하게 봉입할 수 있는 다기능성 리포좀을 제조하였다. in vitro/in vivo 실험을 통해, 상기 리포좀이 리툭시맙의 종양 특이적 방출 경향성을 가지고, 이로 인해 생체 내 종양을 효과적으로 억제함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 지질 이중층에 하나 이상의 개방부를 가지는 부분 개방 리포좀; 및 상기 개방부에 삽입되는 pH 감응성 고분자;를 포함하며, 상기 리포좀 내부에 항암제가 봉입되고, 상기 개방부를 통해 상기 항암제가 방출되는 것을 특징으로 하는 pH 반응성 항암 리포좀을 제공한다.

본 발명에 따른 리포좀에 있어서, 상기 부분 개방 리포좀은 (a) 초상자성 산화철(Fe₃O₄) 나노입자를 봉입한 리포좀 용액을 제조하는 단계; (b) 자성 임펠러에 자석을 부착시킨 후, 격렬하게 교반시켜 초상자성 산화철(Fe₃O₄) 나노입자의 이동에 의해 지질 이중층이 부분 개방된 리포좀을 제조하는 단계; 및 (c) 누출된 산화철(Fe₃O₄)을 리포좀에서 분리시켜 침전시키는 단계;를 포함하며, 상기 리포좀이 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)으로 형성되는 것을 특징으로 하는 부분 개방 리포좀 제조방법으로 제조된 것일 수 있다.

바람직하게는, 상기 산화철 나노입자는 평균 직경이 10 내지 15 nm 이고, 상기 산화철 나노입자를 봉입한 리포좀은 평균 직경이 100 내지 200 nm 일 수 있으며, 이에 따라 제조된 본 발명의 리포좀은 개방부의 평균 직경이 20 내지 50 nm, 바람직하게는 30 내지 40 nm 일 수 있다.

상기 부분 개방 리포좀은 본 발명자의 기존 한국등록특허 제10-1919650호 (2018.11.16 공고)의 방법과 유사하게 제조된 것으로, 이에 상응하는 내용은 상기 특허문헌에 기재된 내용으로 대신할 수 있다.

상기 리포좀은 내부에 항암제 등의 약물을 변성 없이 안정하게 봉입할 수 있다.

하지만, 본 발명에 따른 리포좀은 상기 등록특허에 기재된 리포좀과 달리, 일정 시간 후에 개방부가 자연적으로 닫히는 것이 아니라, 상기 리포좀의 개방부에 pH 감응성 고분자를 삽입함으로써 리포좀 내부에 항암제를 안정적으로 봉입하고 이의 방출을 제어할 수 있는 차이점이 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 리포좀은 기존 등록특허의 리포좀(60 nm) 및 산화철 나노입자(7 nm) 보다 평균 직경이 큰 리포좀(150-200 nm)과 산화철 나노입자(0.5 mg, 10-12 nm)를 사용하여 제조함으로써, 개방부 평균 직경이 22 nm 였던 기존 리포좀과 달리, 개방부의 직경이 약 35 ± 5 nm인 리포좀을 제조할 수 있다.

이렇게 제조된 본 발명의 리포좀은 인슐린(6 KDa), 소혈청 알부민 단백질(66 KDa) 외에도 기존에 크기가 커서 리포좀 내부에 봉입이 불가했던 항암 항체(140 KDa) 등을 쉽고 안전하게 내부에 봉입할 수 있는 이점이 있다.

본 발명에 따른 리포좀에 있어서, 상기 pH 감응성 고분자는 pH 감응성 기능기가 생체 고분자에 결합된 것으로, 바람직하게는 pH 감응성 기능기인 3-(디에틸아미노)프로필아민[3-(diethylamino)propylamine, DEAP]이 생체 고분자 히알루론산(hyaluronic acid, HA)에 결합된, 3-(디에틸아미노)프로필아민(DEAP)이 그라프팅(grafting)된 히알루론산(HA)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 pH 감응성 고분자는 상기 부분 개방 리포좀의 개방부에 삽입되어 상기 리포좀 내부에 봉입된 항암제의 방출을 제어할 수 있다.

바람직하게는 pH 7.0 이하, 보다 바람직하게는 pH 6.2 내지 pH 6.8의 약산성 환경에서 상기 pH 감응성 고분자가 양성자화로 붕괴됨으로써, 상기 리포좀 내부에 봉입된 항암제가 방출될 수 있다.

본 발명에 따른 리포좀에 있어서, 상기 항암제는 종양 부위를 특이적으로 표적하는 표적 치료제로서, 리툭시맙(rituximab), 면역글로불린 G(immunoglobulin G, IgG), 이브리투모맙(ibritumomab), 세툭시맙(cetuximab), 트라스투주맙(trastuzumab), 브렌툭시맙(brentuximab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 및 베바시주맙(bevacizumab)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 리툭시맙일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항암제는 CD20, CD30, CD52, HER(human epidermal growth factor receptor)1, HER2 등을 표적할 수 있고, 바람직하게는 CD20을 표적할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 상기의 pH 반응성 항암 리포좀을 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 pH 반응성 항암 리포좀은 pH 6.2 내지 pH 6.8의 약산성에서 상기 리포좀 내부에 봉입된 항암제를 방출시킬 수 있고, 상기 방출된 항암제는 종양 부위를 특이적으로 표적하여, 상기 종양 세포의 사멸을 증진시키고 종양을 효과적으로 억제할 수 있는 바, 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로 활용할 수 있다.

상기 암 질환은 림프구 림프종, 결장암, 폐암, 피부암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호킨스씨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물은 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 적절한 담체와 배합될 수 있고, 필요에 따라, 부형제, 희석제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 결합제, 붕해제, 용제 등을 더 포함하여 제조될 수 있다. 상기 적절한 담체 등은 본 발명에 따른 항암제, 리포좀 등의 활성 및 특성을 저해하지 않는 것으로, 투여 형태 및 제형에 따라 달리 선택될 수 있다.

상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제 등으로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 어떠한 제형으로도 적용될 수 있고, 상세하게는 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

보다 상세하게는, 상기 경구형 제형 중 고형 제형은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 형태로, 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 솔비톨, 만니톨, 셀룰로오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있고, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 포함될 수 있다. 또한, 캡술제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 경구형 제형 중 액상 제형은 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 비경구 제형은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 주사제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 이에 제한되지 않고, 당업계에 널리 공지된 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.

본 명세서에서, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.

상기 약학 조성물의 유효 용량 수준은 사용 목적, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 달리 결정될 수 있다. 예를 들어, 일정하지는 않지만 일반적으로 0.001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 암이 발생할 수 있는 임의의 동물에 투여될 수 있고, 상기 동물은 예를 들어, 인간 및 영장류뿐만 아니라 소, 돼지, 말, 개 등의 가축 등을 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여될 수 있고, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 특히 한정할 필요 없이, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피부 도포, 호흡기내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracere-broventricular) 주사 등의 통상적인 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 암 치료를 위하여 단독으로 사용될 수 있고, 수술 또는 다른 약물 치료 등과 병용하여 사용될 수 있으며, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

상기 약물 또는 생리활성물질은 펩타이드, 단백질, 항암제, 소염진통제, 항생제, 항균제, 호르몬제, 유전자 및 백신으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 공지의 약물 또는 생리활성물질을 모두 포함할 수 있다.

이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실험준비>

1. 실험재료

리툭시맙(rituximab)은 Selleckchem (USA)에서 구입하였고, 히알루론산(hyaluronic acid, HA, Mn= 4.8 kDa), 3-(디에틸아미노)프로필아민[3-(diethylamino)propylamine, DEAP], 데옥시콜산(deoxycholic acid, DOCA), 면역글로불린 G(immunoglobulin G, IgG, from human serum), triton® X-100, 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide, DMSO), 우라닐 아세테이트(uranyl acetate), 플루오레세인-5-이소티오시아네이트 접합된 면역글로불린 G(fluorescein-5-isothiocyanate conjugated immunoglobulin G, IgG-FITC, from human serum), 포름알데하이드(formaldehyde), 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA), 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드(4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI), 및 인간 혈청 보체(human serum complement)는 Sigma-Aldrich (USA)에서 구매하였으며, 하이드로제네티드 소이 포스파티딜콜린(hydrogenated soy phosphatidylcholine, HSPC)은 Avanti Polar Inc.(USA)에서 구매하였다.

마이크로 BCATM 단백질 분석 키트(micro BCATM protein assay kit)와 FITC-conjugated F(ab')2-goat anti-human IgG Fc 2차 항체(secondary antibody), FITC-conjugated F(ab')2-goat anti-mouse IgG(H+L) cross-adsorbed secondary antibody 및 FITC-conjugated F(ab')2-goat anti-rabbit IgG(H+L) secondary antibody는 Thermo Fisher Scientific, Inc.(USA)에서 구입하였으며, 포스파티딜콜린 분석 키트(phosphatidylcholine assay kit)는 Cell Biolabs, Inc.(USA)에서, FITC-conjugated 리툭시맙은 MyBioSource, Inc.(USA)에서, RPMI-1640와 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 트립신(trypsin), 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)은 Welgene Inc.(Korea)에서 구입하였다.

세포 카운팅 키트-8(Cell counting kit-8, CCK-8)과 세포독성 락트산 탈수소효소 분석 키트[cytotoxicity lactate dehydrogenase(LDH) assay kit]는 Dojindo Molecular Technologies, Inc.(Japan)에서 구입하였고, monoclonal murine anti-human sC5b-9 antibody는 Quidel Inc.(USA)에서 구입하였으며, Anti-cleaved-caspase-3와 anti-Bcl-2 antibody는 Cell Signaling Technology, Inc.(USA)에서 구입하였다.

3-(디에틸아미노)프로필아민(DEAP) 그라프트(graft)된 히알루론산(HA-g-DEAP, Mn=5.4kDa)과 데옥시콜산(DOCA) 그라프트된 히알루론산(HA-g-DOCA, Mn= 6.9 kDa), Ce6 염료 라벨링된 HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA는 이전에 발표한 본 발명자의 논문(Ref., Int. J. Pharm. 547, 2018 377-384)의 방법대로 준비하였다. 연결된 DEAP 또는 DOCA의 몰 수는 0.39 또는 0.43이다 (HA 반복 단위당 DEAP 또는 DOCA의 몰수로 정의하였다).

2. 세포 배양

인간 B 림프종 Ramos 세포와 인간 유방암 MDA-MB-231 세포 (한국세포주은행)를 1% penicillin-streptomycin과 10% FBS를 첨가한 RPMI 배지에서 배양하였다. 모든 세포 실험은 37℃ 및 5% CO₂ 대기 조건에서 진행하였다.

세포 실험에 앞서, MDA-MB-231 세포는 trypsin/EDTA 용액 [0.25%(w/v) trypsin/0.03%(w/v)]을 이용하여 세포를 모은 후, RPMI-1640 배지를 이용해 1×10⁶ cells/mL 농도로 희석하고 plate well에 분주하였다. Ramos 세포는 원심분리를 통해 세포를 모은 후 RPMI-1640 배지에 1×10⁶ cells/mL 농도로 희석하고 plate well에 분주하였다.

3. 동물 사육

동물 실험은 6-8주령 암컷 누드 마우스 (BALB/c, Orient Bio Inc., Korea)를 이용하여 진행하였다. 마우스들은 가톨릭대학교 동물실험윤리위원회로부터 승인된 기준에 따라 사육되었다.

4. 통계 분석

모든 실험 결과는 t-test 또는 analysis of variance (ANOVA)를 이용해 유의수준 p < 0.01(**)에서 분석하였다.

<실시예 1> 리포좀 리툭시맙(liposomal rituximab)의 제조

본 발명자의 기존 한국등록특허 제10-1919650호 (2018.11.16 공고)의 방법 (magnetoporation 방법)대로 준비한 부분 개방 리포좀은 본 발명에 의해 그 구멍으로 간단하고 안전하게 항체 (rituximab 또는 IgG)를 봉입할 수 있는 환경을 제공한다.

간략하게, 상기 부분 개방 리포좀은 먼저, 하이드로제네이티드 소이포스파티딜콜린(HSPC, 20 mg)을 클로로포름 (5 mL)에 녹인 용액을 둥근-바닥 플라스크에 넣어, 용매를 회전 증발기(EYELA N1000, Fisher Scientific™, USA)를 이용해 증발시키고 얇은 막을 얻어내었다. 얻어진 막을 150 mM 포스페이트 버퍼(PBS, pH 7.4, 5 mL) 및 산화철 나노입자 (0.5 mg, 10-12 nm)와 함께 25℃에서 초음파 (60 Hz, 5분) 처리로 재수화하여 최종적으로 산화철 나노입자가 봉입된 리포좀(직경 150-200 nm)을 얻어내었다. 얻어낸 리포좀의 크기를 균일하게 만들기 위해 200 nm 폴리카보네이트 여과막을 이용하여 Avanti® 사출기 (Avanti® Polar Lipids, USA)로 60℃에서 사출성형을 하였다. 이후, 산화철 나노입자가 봉입된 리포좀을 자석 임펠러 (반경 30 mm, 두께 2 mm)를 이용하여 1500 rpm에서 1분 동안 격렬하게 교반시킨 후, 자기 전단 응력 하에 리포좀에 봉입된 산화철 나노입자는 특정 위치로 이동하여 지질 이중층에 구멍을 형성하였다. 부분 개방된 리포좀에서 누출된 산화철 나노입자는 플라스크 외부 바닥에 네오디뮴 희토류 자석 (반경 10 mm, 두께 10 mm)을 부착하여 제거하였다.

또한, pH 민감성 고분자 HA-g-DEAP는 히알루론산 (200 mg)과 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드 (85 mg), N-하이드록시석신이미드 (45 mg)를 다이메틸설폭사이드 (10 mL)에 완전히 녹인 용액에 트리에틸아민 (500 μl)을 첨가하여 하루 동안 반응시켰다. 이후 3-디에틸아미노 프로필아민 (55 mg)을 다이메틸설폭사이드 (5 mL)에 녹인 용액을 상기 반응물에 첨가하여 3일간 상온에서 반응시켰다. 반응 후, 생성된 용액에서 반응하지 않은 물질들을 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por® MWCO 2 kDa)을 이용하여 다이메틸설폭사이드상에서 2일 동안 투석한 다음, 이를 다시 붕사 용액 (5 mM)에서 2일 동안 투석 후 동결 건조하여 최종적으로 pH 민감성 고분자 HA-g-DEAP를 제조하였다.

상기 제조된 부분 개방 리포좀 (1 mg/mL)과 리툭시맙(rituximab) 또는 IgG (0.5 mg)를 섞은 용액을 10분 동안 30 rpm으로 150 mM PBS (pH 7.4, 5 mL)에서 교반하였다. 이어, 상기 용액에 pH 민감성 고분자인 HA-g-DEAP (0.5 mg) 또는 pH 비 민감성 고분자인 HA-g-DOCA (0.5 mg)를 추가로 섞은 용액을 2시간 동안 30 rpm으로 교반하였다. 교반이 완료된 용액을 30000 g, 4℃ 조건에서 20분간 초원심분리하여 봉입되지 않은 폴리머 (HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA)를 제거하였다. 제조된 각 리포좀을 rituximab loaded HA-g-DEAP capped liposomes (RTX@HA-g-DEAP CLs)과 rituximab loaded HA-g-DOCA capped liposomes (RTX@HA-g-DOCA CLs), IgG loaded HA-g-DEAP capped liposomes (IgG@HA-g-DEAP CLs), IgG loaded HA-g-DOCA capped liposomes (IgG@HA-g-DOCA CLs)로 명명하였다. 대조군으로 HSPC 리포좀을 얇은 막 수화 방법으로 제조하였다.

BCA protein assay kit를 통해 항체 (rituximab 또는 IgG)의 양을 측정하였다. 봉입된 rituximab 또는 IgG의 함량(%)은 리포좀과 폴리머 (HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA)의 함량 대비 rituximab 또는 IgG의 중량퍼센트 비율로 계산하였고, rituximab 또는 IgG의 봉입 효율(%)은 rituximab 또는 IgG의 초기 투여량에 대한 봉입량의 중량 백분율로 계산하였다.

RF-5301 형광 분광 광도계(Shimadzu, Japan)로 λex 450 nm와 λem 670 nm에서 형광 세기를 측정하여 봉입된 HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA의 함량을 계산하였고, 봉입된 HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA의 봉입 함량(%)은 리포좀 함량 대비 HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA의 중량퍼센트 비율로 계산하였으며, HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA의 봉입 효율(%)은 HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA의 초기 투여량에 대한 봉입량의 중량 백분율로 계산하였다. 이후, 남은 용액을 취해 Phosphatidylcholine assay kit를 통해 HSPC의 함량(mg)을 측정하였다.

그 결과, 고분자 삽입 리포좀에 봉입된 항체 (rituximab 및 IgG)의 봉입 효율은 약 21-23%, 봉입 함량은 약 8-9%였으며, 리포좀에 봉입된 고분자 (HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA)의 봉입 효율은 약 22-30%, 봉입 함량은 약 10-13%였다. HSPC 함량은 약 80-83% 인 것으로 확인되었다.

RTX@HA-g-DEAP CLs는 rituximab을 변성 없이 봉입하여 종양 환경으로 전달할 것으로 기대된다 (도 1). RTX@HA-g-DEAP CLs의 DEAP는 낮은 pH 환경에 노출 시 양성자화(protonation)가 일어나고, 이로 인해 불안정해진 리포좀에서 ritxuiamb이 방출되며, 결과적으로 방출된 rituximab은 보체 시스템에 대한 활성화를 통한 MAC 형성을 유도하며, CD20 수용체에 결합해 Bcl-2 신호전달 억제를 통한 세포자멸사를 유도할 것으로 예상되었다.

<실시예 2> 리포좀 분석

상기 실시예 1에 따라 제조된 각 리포좀의 형태적 특성을 분석하였다.

1) 150 mM PBS (pH 7.4)에서 부분 개방 리포좀 (0.1 mg/mL) 및 pH 민감성 고분자인 HA-g-DEAP를 삽입한 리포좀의 형태적 특성을 확인하기 위해, 1% uranyl acetate로 음성 염색 후 투과전자현미경(TEM, Thermo Scientific Inc., USA)으로 관찰하였다.

그 결과, 도 2(a)에 나타난 바와 같이, 부분 개방 리포좀 막에 개방된 구멍의 직경이 약 35 ± 5 nm인 것을 확인할 수 있었으며, 이어 pH 민감성 HA-g-DEAP가 삽입된 리포좀은 개방된 구멍이 없으며, 원형의 형태임을 확인하였다.

2) 리포좀에 봉입한 Ce6 염료(dye)로 표지된 HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA의 분포를 확인하기 위하여 Nikon 현미경이 장착된 가시광선 및 근적외선(NIR) hyperspectral 카메라 (CytoViva, USA)(초분광 화상 이미지)를 사용하여 관찰하였다. Ce6 염료 스펙트럼 신호와 리포좀 스펙트럼 신호를 측정하였고, Ce6 dye-labeled 고분자 (HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA) 부분은 붉은색, 리포좀은 하얀색으로 설정하였다.

그 결과, 도 2(b)에 나타난 바와 같이, 하얀색(리포좀)에 부분적으로 빨간색(HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA)이 나타남을 확인할 수 있었고, HA-g-DEAP 또는 HA-g-DOCA가 삽입된 리포좀의 구조를 확인할 수 있었다.

3) HA-g-DEAP CLs, HA-g-DOCA CLs 및 HSPC 리포좀의 pH 민감 특성을 확인하기 위해, pH 7.4, 7.0 및 6.5의 다른 pH 값을 갖는 150 mM PBS에서 각 리포좀 제형 (0.1 mg/mL)의 입자 크기 및 제타 전위를 Zetasizer 3000 instrument (Malvern Instruments, USA)를 이용해 측정하였다.

그 결과, 도 3(a) 및 3(b)에 나타난 바와 같이, HA-g-DEAP CLs는 pH가 낮아질수록 제타 전위 값이 상승하는 경향성을 보이며 그 입자 크기는 작아지는 경향성을 나타내었다. 이는 산성의 pH인 pH (7.0, 6.5)에서, 리포좀에 삽입된 HA-g-DEAP의 양성자화에 의해 제타 전위가 상승하고 이로 인해 리포좀이 붕괴함을 의미한다.

반면, 그 대조군인 HA-g-DOCA CLs 및 HSPC 리포좀의 경우, pH에 따른 입자 크기 및 제타 전위의 측정 결과의 차이가 거의 없는 것으로 나타났다.

4) 각 리포좀 제형의 형태는 pH 7.4 또는 6.5의 150 mM PBS에서 2시간 동안 안정화 후 1% uranyl acetate로 음성 염색 뒤 투과전자현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 3(c)에 나타난 바와 같이, pH 7.4에서 HA-g-DEAP CLs는 온전한 구형의 리포좀을 형성하지만, pH 6.5에서는 크기가 작아지며 구형의 리포좀이 파괴되는 형태를 확인할 수 있었다. 반면, 대조군인 HA-g-DOCA CLs는 pH 7.4 및 6.5에서 형태적 변화 없이 온전한 구형의 형태를 유지하는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 3> in vitro 항체 방출 및 안정성 분석

1) pH 7.4 또는 6.5에서 상기 실시예 1에 따라 제조된 리포좀 제형에 봉입된 rituximab과 IgG의 방출 동향을 관찰하기 위해, 먼저 리포좀 (1 mg/mL)을 11 mL의 150 mM PBS (pH 7.4 또는 6.5)에 분산 후, 항온진탕수조(shaking water bath, 100 rpm, 37℃)에 넣었다. 이후 측정 시간마다 30000 g 조건에서 20분간 초원심분리하여 펠렛(pallets)과 상층액을 수득하였다. 펠렛은 150 mM PBS (11 mL, pH 7.4 또는 6.5)에 재분산하여 shaking water bath (100 rpm, 37℃)에 넣었고, 상층액에 존재하는 FITC dye로 표지한 rituximab과 IgG의 양은 RF-5301 형광 분광 광도계 (Shimadzu, Japan)로 λex 490 nm와 λem 520 nm에서 형광 세기를 측정하여 계산하였다.

그 결과, 도 4(a) 및 4(b)에 나타난 바와 같이, pH 7.4에서 rituximab 또는 IgG가 봉입된 각 리포좀 제형은 모두 처음 한 시간 동안 약 1%의 약물 방출 경향성을 보이며, 24시간 이후 약 9-13%의 약물 방출 경향성을 보였으며, pH 6.5에서 HA-g-DOCA CLs 또한 pH 7.4와 같은 약물 방출 동향을 보였다.

반면, HA-g-DEAP CLs는 pH 6.5에서 처음 한 시간 동안 약 20% 이상의 약물 방출 동향을 보이며, 24시간 이후 약 51-55%로 증가된 약물 방출 동향을 나타내었다. 이는 산성의 pH인 pH 6.5에서, 리포좀에 삽입된 HA-g-DEAP에 양성자화가 일어나 리포좀이 붕괴되고, 이로 인해 안에 봉입되어 있던 Rituximab 또는 IgG가 방출되기 때문이다.

2) 상기 리포좀에 봉입된 항체의 2차 구조 변성 여부를 확인하기 위하여, 150 mM PBS, pH 6.5에 분산된 리포좀 (RTX@HA-g-DEAP CLs or IgG@HA-g-DEAP CLs)을 shaking water bath (100 rpm, 37℃)에서 24시간 동안 배양 후, 추출한 rituximab과 IgG를 사용하여 리포좀에 봉입한 항체의 변성 여부를 J-815 원편광 이색성 측정장치 (Jasco International, England)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 4(c)에 나타난 바와 같이, far-UV 파장(200-260 nm)에서 CD 스팩트럼 분석 결과, 방출된 rituximab 또는 IgG 모두 free rituximab 및 IgG와 동일한 원이색성을 가지는 것으로 확인되었다. 이를 통해 HA-g-DEAP CLs에 봉입한 항체의 구조가 변성 없이 보존됨을 증명할 수 있다.

<실시예 4> in vitro 세포 부착 능력 확인

1) 서로 다른 pH (pH 7.4 또는 6.5) 조건으로 배양한 Ramos (CD20 수용체 있음, CD20+) 또는 MDA-MB-231 (CD20 수용체 없음, CD20-) 세포에 각 리포좀 (equivalent to rituximab 10 μg/mL)과 free rituximab (10 μg/mL)을 처리하고 37℃에 4시간 동안 배양하였다. 이후 세포를 3.7%의 formaldehyde 고정한 뒤 1% BSA가 포함된 PBS (pH 7.4, 150 mM)로 3회 세척 후 FITC-conjugated human IgG (Fc) specific 이차 항체를 이용해서 염색하였다. 세포는 150 mM PBS (pH 7.4)로 세 번 세척하고 FACSCalibur™ 유세포분석기 (Becton Dickinson, USA)를 사용하여 세포의 형광 세기를 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, pH 6.5에서는 Ramos 세포에 RTX@HA-g-DEAP CLs를 처리한 군의 형광 세기가 free rituximab 처리군과 비슷하고 대조군인 RTX@HA-g-DOCA CLs 처리군보다 18.9배 높은 것으로 나타났다. pH 7.4에서는 RTX@HA-g-DEAP CLs 처리군과 RTX@HA-g-DOCA CLs 처리군이 비슷한 형광 세기를 나타냈으며, free rituximab 처리군에 비해서는 낮은 형광 세기를 나타내었다 (도 5a).

반면, MDA-MB-231 세포는 CD20 수용체를 발현하고 있지 않기에 모든 처리군의 형광의 세기가 처리하지 않은 군과 같음을 확인하였다 (도 5b).

이를 통해, 산성 pH인 pH 6.5 환경에서, 리포좀에 삽입된 HA-g-DEAP에 양성자화가 일어나 리포좀이 붕괴되고, 그 결과 방출된 rituximab이 종양 세포 표면 CD20 수용체에 특이적으로 부착함을 확인할 수 있다.

2) 서로 다른 pH (pH 7.4 또는 6.5) 조건에서 poly-D-lysine 코팅 커버 글라스 위에 배양한 Ramos (CD20+) 세포와 무 코팅 커버 글라스에 배양한 MDA-MB-231 (CD20-) 세포에 각 리포좀 (equivalent to rituximab 10 μg/mL)과 free rituximab (10 μg/mL)을 처리하고 37℃에 4시간 동안 배양하였다. CD20에 부착된 rituximab과 세포핵을 관찰하기 위해 세포를 3.7%의 formaldehyde 고정한 뒤 1% BSA가 포함된 PBS (pH 7.4, 150 mM)로 3회 세척 후 FITC-conjugated human IgG (Fc) specific 이차항체와 DAPI를 이용해서 염색하였다. 세포를 150 mM PBS (pH 7.4)로 세 번 세척하고 CarlZeiss Meta 공초점 레이저 현미경 (oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.

그 결과, 도 6(a) 및 6(b)에 나타난 바와 같이, pH 7.4 및 6.5에서 RTX@HA-g-DEAP CLs 및 RTX@HA-g-DOCA CLs, free rituximab을 Ramos 세포에 처리하여, 세포 표면에 rituximab이 부착됨을 가시적으로 확인할 수 있었다. 또한, pH 6.5에서 Ramos 세포 표면의 형광이 RTX@HA-g-DEAP CLs 처리군 및 free rituximab 처리군이 비슷하고, 대조군인 RTX@HA-g-DOCA CLs 처리군보다 높게 나타남을 확인할 수 있었다. 반면, pH 7.4에서는 RTX@HA-g-DEAP CLs 처리군 및 RTX@HA-g-DOCA CLs 처리군은 세포 표면에서 형광의 세기가 매우 낮은 것으로 나타났다 (도 6a)

MDA-MB-231 세포는 모든 샘플 처리군에서 세포 표면에 형광이 나타나지 않았다 (도 6b).

3) 살아있는 세포에서 각 리포좀에서 방출된 rituximab의 시간에 따른 세포 결합 활성을 확인하기 위해, 서로 다른 pH (pH 7.4 또는 6.5) 조건에서 RPMI 배지에 배양한 Ramos 세포를 5-mm covered glass bottom sterile culture dish에 접종하였다. 세포에 각 리포좀 (equivalent to rituximab 10 μg/mL)을 처리하고 1시간 동안 각 리포좀과 같이 배양하였다. rituximab의 세포 결합 거동은 FITC dye-labeled rituximab을 이용하여 표지하였고, 이를 CarlZeiss Meta 공초점 레이저 현미경 (oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.

그 결과, 도 6(c)에 나타난 바와 같이, pH 6.5에서 공 배양 시간이 증가함에 따라 RTX@HA-g-DEAP CLs에서 방출된 rituximab의 세포 결합 활성이 증가하는 것으로 나타났다.

<실시예 5> in vitro 리포좀 리툭시맙 매개 세포 독성 및 세포자멸사 확인

1) Rituximab이 없는 리포좀의 독성을 평가하기 위해 각 리포좀 샘플을 (1-200 μg/mL, rituximab 없음) Ramos 세포가 배양된 96 well plate에 처리한 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 세포의 생존율은 Cell Counting Kit-8을 이용해 측정하였다.

그 결과, 도 7(a)에 나타난 바와 같이, 약물을 봉입하지 않은 모든 리포좀 (5-200 μg/mL) 제형들은 Ramos 세포에 처리시 암세포의 성장을 억제하지 못하는 것으로 나타났다. 이는 순수한 리포좀 또는 약물 없이 고분자만 삽입된 리포좀 제형은 세포 독성이 없음을 의미한다.

2) Rituximab이 봉입된 각 리포좀 (equivalent to rituximab 10 μg/mL)과 free rituximab (10 μg/mL)을 서로 다른 pH (pH 7.4 또는 6.5) 조건으로 Ramos 세포가 배양된 96 well plate에 처리하였다. 보체 의존성 세포독성(CDC)을 확인하기 위해 추가로 보체 serum을 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. 이후 Cytotoxicity LDH assay kit를 이용해 세포 독성을 측정하였다.

3) Rituximab이 봉입된 각 리포좀 (equivalent to rituximab 10 μg/mL)과 free rituximab (10 μg/mL)을 서로 다른 pH (pH 7.4 또는 6.5) 조건으로 Ramos 세포가 배양된 6 well plate에 처리하였다. 보체 활성에 의해 생성된 막 공격 복합체(membrane attack complex)인 C5b-9의 활성을 측정하기 위해 추가로 보체 serum을 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. 이후 monoclonal antibody to Human sC5b-9 (Neoantigen) 1차 염색 후 F(ab')2- Goat anti- Mouse IgG (H+L) Cross- Adsorbed 이용해 2차 염색하여 FACSCalibur™ 유세포분석기 (Becton Dickinson, USA)를 사용하여 세포의 형광 세기를 측정하였다.

그 결과, 도 7(b) 및 7(c)에 나타난 바와 같이, pH 7.4에서 RTX@HA-g-DEAP CLs 및 RTX@HA-g-DOCA CLs 처리군 모두 세포 괴사가 일어나지 않았으나, pH 6.5에서는 RTX@HA-g-DEAP CLs를 처리한 군이 free rituximab 처리군과 비슷하게 세포 괴사가 높게 나타남을 확인할 수 있었다.

4) 세포자멸사와 연관된 신호전달 물질인 Bcl-2와 caspase-3의 활성을 측정하기 위해, Rituximab이 봉입된 각 리포좀 (equivalent to rituximab 10 μg/mL)과 free rituximab (10 μg/mL)을 서로 다른 pH (pH 7.4 또는 6.5) 조건으로 Ramos 세포가 배양된 6 well plate에 처리하였다. 이후 세포를 anti-Bcl-2 항체로 1차 염색 후 FITC-conjugated rabbit IgG (heavy and light chain) 2차 항체를 이용해 2차 염색하였다. 또한, 세포를 anti-cleaved caspase-3 항체로 1차 염색 후 FITC-conjugated mouse IgG (heavy and light chain) 2차 항체를 이용해 2차 염색하여 FACSCalibur™ 유세포분석기 (Becton Dickinson, USA)를 사용하여 세포의 형광 세기를 측정하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, pH 6.5에서 RTX@HA-g-DEAP CLs 또는 free rixuimab은 Bcl-2의 발현이 낮으며, 동시에 caspase-3의 활성이 높음을 확인할 수 있었다. 반면, RTX@HA-g-DOCA CLs의 경우, Bcl-2 또는 caspase-3의 발현 정도가 pH에 따라 변화가 없는 것으로 나타났다. 이는 RTX@HA-g-DEAP CLs가 Bcl-2 발현 억제를 통한 세포자멸사에 효과가 있음을 의미한다.

<실시예 6> In vivo/ex vivo 흡수 실험

In vivo 동물 실험을 위해, Ramos 종양 세포 (pH 7.4인 PBS에 1×10⁶ cells/mL의 농도로 주사)를 암컷 누드 마우스에 왼쪽 허벅지 피하에 주사하였다. 종양 크기가 대략 100 mm³까지 커지면, 각 리포좀 (equivalent to FITC dye-labeled rituximab 2.5 mg/kg) 또는 FITC dye-labeled rituximab (2.5 mg/kg)을 Ramos 종양 세포가 이식된 누드 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 이후 Fluorescence-labeled Organism Bioimaging Instrument (FOBI, NeoScience, Korea)를 이용하여 24시간 동안 관찰하였다.

그 결과, 도 9(a)에 나타난 바와 같이, RTX@HA-g-DEAP CLs는 RTX@HA-g-DOCA CLs 및 free rituximab에 비해 Ramos 종양 부위(주사 후 8시간 경과)에서 높은 FITC 형광을 나타내었다. 반면에, RTX@HA-g-DOCA CLs 또는 free rituximab은 Ramos 종양 부위에서 낮은 형광을 나타내었으며, 아무것도 처리하지 않은 군에서는 어떠한 형광 세기도 발견되지 않았다. 이는 RTX@HA-g-DEAP CLs의 종양 특이적 rituximab 방출 능력 때문인 것으로 판단된다.

추가로, 각 리포좀과 free rituximab의 종양 선택적인 축적을 확인하기 위해, 주사 24시간 후 CO₂ 가스를 이용해 누드 마우스를 안락사 시킨 후 장기(간 및 심장, 폐, 신장, 비장)를 적출하여 FOBI를 이용하여 분석하였으며, NEOimage 소프트웨어 (NeoScience, Korea)를 사용하여 종양 및 장기의 형광 세기를 정량화하였다.

그 결과, 도 9(b)에 나타난 바와 같이, RTX@HA-g-DEAP CLs는 RTX@HA-g-DOCA CLs 또는 free rituximab과 비교하여 종양에서 높은 형광을 나타내었다.

<실시예 7> In vivo 항암 치료

상기 리포좀의 항암 치료 능력을 평가하기 위해, 각 리포좀 (equivalent to FITC dye-labeled rituximab 2.5 mg/kg), FITC dye-labeled rituximab (2.5 mg/kg) 또는 대조군(식염수)을 Ramos 종양 세포가 이식된 누드 마우스의 꼬리 정맥에 주사하고, 시간의 경과에 따라 종양 크기의 변화를 관찰하였다. 종양 크기는 다음과 같은 식을 통해 계산하였다:

종양 크기 = length × (width)²/2.

상대적인 종양 크기 변화(V_t/V₀)에서 V_t는 해당 시간에서의 종양 크기, V₀는 초기 종양 크기를 의미하며, 이를 통해 리포좀의 항암 치료 능력을 평가하였다.

Ramos 종양이 이식된 누드 마우스의 상대적인 체중 변화(W_t/W₀, W_t는 해당 시간에서의 체중, W₀은 초기 체중)를 관찰하여, 전신에서 각 리포좀 샘플이 체내에 미치는 잠재적인 독성을 평가하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 7일 경과 후 RTX@HA-g-DEAP CLs는 Ramos 종양의 성장을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다. RTX@HA-g-DEAP CLs를 처리한 마우스에서 상대적인 Ramos 종양 크기는 RTX@HA-g-DOCA CLs, free rituximab, 대조군(식염수)을 처리한 마우스보다 7.5배, 7.9배, 8.1배 감소하는 것으로 확인되었다 (도 10a)

또한, 각 샘플을 처리한 누드 마우스의 체중 변화는 거의 보이지 않은 바 (도 10b), 이는 모든 샘플이 체내에 독성이 없음을 나타낸다.

추가적으로, 식염수를 투여한 대조군과 RTX@HA-g-DEAP CLs를 투여한 종양 이식 마우스의 종양 크기 비교를 통해, RTX@HA-g-DEAP CLs가 효과적인 종양 치료를 유도함을 확인할 수 있다 (도 10c 및 10d).

이러한 결과는 RTX@HA-g-DEAP CLs가 Ramos 종양에 대해 우수한 치료 효과를 가짐을 증명하며, RTX@HA-g-DEAP CLs가 종양 치료를 위한 다양한 항암 항체의 담체로서 잠재적인 플랫폼이 될 것으로 예상할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims

지질 이중층에 하나 이상의 개방부를 가지는 부분 개방 리포좀; 및
상기 개방부에 삽입되는 3-(디에틸아미노)프로필아민[3-(diethylamino)propylamine, DEAP]이 그라프팅(grafting)된 히알루론산(hyaluronic acid, HA);을 포함하며,
상기 부분 개방 리포좀은,
(a) 초상자성 산화철(Fe₃O₄) 나노입자를 봉입한 리포좀 용액을 제조하는 단계;
(b) 자성 임펠러에 자석을 부착시킨 후, 격렬하게 교반시켜 초상자성 산화철(Fe₃O₄) 나노입자의 이동에 의해 지질 이중층이 부분 개방된 리포좀을 제조하는 단계; 및
(c) 누출된 산화철(Fe₃O₄)을 리포좀에서 분리시켜 침전시키는 단계;를 포함하며, 상기 리포좀이 포스파티딜콜린으로 형성되는 것을 특징으로 하는 부분 개방 리포좀 제조방법으로 제조되어,
상기 리포좀 내부에 항암제가 봉입되고, 상기 개방부를 통해 상기 항암제가 방출되는 것을 특징으로 하는 pH 반응성 항암 리포좀.
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제 1 항에 있어서,
상기 산화철 나노입자는 평균 직경이 10 내지 15 nm이고,
상기 산화철 나노입자를 봉입한 리포좀은 평균 직경이 100 내지 200 nm인 것을 특징으로 하는 pH 반응성 항암 리포좀.
제 1 항에 있어서,
상기 개방부는,
평균 직경이 20 내지 50 nm인 것을 특징으로 하는 pH 반응성 항암 리포좀.
제 1 항에 있어서,
상기 3-(디에틸아미노)프로필아민(DEAP)이 그라프팅된 히알루론산(HA)은,
상기 부분 개방 리포좀의 개방부에 삽입되어 상기 리포좀 내부에 봉입된 항암제의 방출을 제어하는 것을 특징으로 하는 pH 반응성 항암 리포좀.
제 1 항에 있어서,
상기 리포좀은,
pH 6.2 내지 pH 6.8의 약산성에서 상기 3-(디에틸아미노)프로필아민(DEAP)이 그라프팅된 히알루론산(HA)의 양성자화에 의해 붕괴되어, 상기 리포좀 내부에 봉입된 항암제를 방출시키는 것을 특징으로 하는 pH 반응성 항암 리포좀.
제 1 항에 있어서,
상기 항암제는,
리툭시맙(rituximab), 면역글로불린 G(immunoglobulin G, IgG), 이브리투모맙(ibritumomab), 세툭시맙(cetuximab), 트라스투주맙(trastuzumab), 브렌툭시맙(brentuximab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 및 베바시주맙(bevacizumab)으로 이루어진 군에서 선택되는 표적 치료제인 것을 특징으로 하는 pH 반응성 항암 리포좀.
제 1 항, 제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 리포좀을 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 8 항에 있어서,
상기 리포좀은,
pH 6.2 내지 pH 6.8의 약산성에서 상기 리포좀 내부에 봉입된 항암제를 방출시키는 것을 특징으로 하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 8 항에 있어서,
상기 암 질환은,
림프구 림프종, 결장암, 폐암, 피부암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호킨스씨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 8 항에 있어서,
상기 약학 조성물은,
종양 부위를 특이적으로 표적하여, 상기 종양을 억제하는 것을 특징으로 하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
지질 이중층에 하나 이상의 개방부를 가지는 부분 개방 리포좀; 및
상기 개방부에 삽입되는 3-(디에틸아미노)프로필아민[3-(diethylamino)propylamine, DEAP]이 그라프팅(grafting)된 히알루론산(hyaluronic acid, HA);을 포함하며,
상기 부분 개방 리포좀은,
(a) 초상자성 산화철(Fe₃O₄) 나노입자를 봉입한 리포좀 용액을 제조하는 단계;
(b) 자성 임펠러에 자석을 부착시킨 후, 격렬하게 교반시켜 초상자성 산화철(Fe₃O₄) 나노입자의 이동에 의해 지질 이중층이 부분 개방된 리포좀을 제조하는 단계; 및
(c) 누출된 산화철(Fe₃O₄)을 리포좀에서 분리시켜 침전시키는 단계;를 포함하며, 상기 리포좀이 포스파티딜콜린으로 형성되는 것을 특징으로 하는 부분 개방 리포좀 제조방법으로 제조되어,
상기 리포좀 내부에 약물 또는 생리활성물질이 봉입되고, 상기 개방부를 통해 상기 약물 또는 생리활성물질이 방출되는 것을 특징으로 하는 약물 또는 생리활성물질 전달용 조성물.
제 12 항에 있어서,
상기 약물 또는 생리활성물질은,
펩타이드, 단백질, 항암제, 소염진통제, 항생제, 항균제, 호르몬제, 유전자 및 백신으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 약물 또는 생리활성물질 전달용 조성물.