KR102267519B1 - 뇌암세포 표적용 펩타이드로 표면 개질된 약물 전달용 나노입자, 이의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 뇌암세포 표적용 펩타이드로 표면 개질된 뇌암세포 표적 약물 전달용 나노입자, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 항암 약물이 봉입된 다공성 실리콘 나노입자 및 상기 나노입자의 표면에 결합된 뇌암세포 표적능을 갖는 펩타이드를 포함하는 뇌암세포 표적 약물 전달용 나노입자, 이의 제조방법 및 상기 나노입자의 뇌암 치료용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 나노입자는 종래 낮은 조직 특이성 및 용해도를 보이는 항암제를 카베올린 수용체가 과발현된 교모세포종에 뇌-혈관장벽을 통과하여 특이적으로 전달하여 보다 효율적인 교모세포종 치료효과를 유도함으로써 교모세포종 치료를 위한 효과적인 약물 전달체로 이용될 수 있는바, 생체 내 분포도가 취약한 항암제의 효율을 향상시키고 카베올린이 과발현된 암세포의 치료에 적용이 가능하여 임상의 항암연구 분야에서 유용하게 활용될 것으로 기대된다.

Description

뇌암세포 표적용 펩타이드로 표면 개질된 약물 전달용 나노입자, 이의 제조방법 및 이의 용도{Nanoparticles for drug delivery surface-modified with brain tumor cell targeting peptide, preparation method thereof and use thereof}
본 발명은 뇌암세포 표적용 펩타이드로 표면 개질된 뇌암세포 표적 약물 전달용 나노입자, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 항암 약물이 봉입된 다공성 실리콘 나노입자 및 상기 나노입자의 표면에 결합된 뇌암세포 표적능을 갖는 펩타이드를 포함하는 뇌암세포 표적 약물 전달용 나노입자, 이의 제조방법 및 상기 나노입자의 뇌암 치료용도에 관한 것이다.
세포 투과 펩타이드(Cell penetrating peptides; CPPs)는 약 10-30개 정도의 아미노산으로 구성된 짧은 세포막 투과성 펩타이드로, 작은/큰 유기 분자, 무기 물질 및 나노입자와 같은 다양한 물질들을 효율적으로 세포 내로 수송하는 능력이 밝혀진 후 이를 이용한 다양한 응용연구가 이루어지고 있다. 일반적으로 바이러스, 인공 합성 서열, 또는 파지 디스플레이 선별(phage display selection)에서 확인되는 세포 투과 펩타이드는 기초 연구의 도구로써 널리 사용되며, 개발 중인 다수의 약물 전달 시스템(Drug Delivery System)의 구성 요소로서 많이 활용되고 있다. 그러나 현재까지 보고된 세포 투과 펩타이드는 (i) 낮은 조직 선택성 (ⅱ) 비특이적인 세포 투과 (ⅲ) 내재적 양이온성 특성으로 인한 신장, 비장, 그리고 간에서의 빠른 제거(예를 들어 TAT, AntpR8)와 같은 일반적인 한계점을 가지고 있다. 연구자들은 이러한 한계점을 극복하기 위하여 특정한 세포에 과발현 되어 있는 세포막 수용체와 높은 친화성을 갖는 소수성과 비이온성 세포 투과 펩타이드에 주목하였다. 예를 들어, 항-HER2/neu 펩타이드는 HER2/neu 양성인 유방암세포를 표적 할 수 있고, DV3는 다양한 암세포에서 과발현 되어 있는 CXC 케모카인 수용체 4(CXCR4)를 표적할 수 있다. 이와 같은 특정 세포를 표적하는 특이성은 그들 표적세포의 수용체에 결합하는 특이성을 갖는 비-CPP 표적화 아미노산 서열(예컨대, MMP)을 연결함으로써 추가로 증가시킬 수 있다.
일반적으로 세포 투과 펩타이드는 세포막에 발현되는 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 클라트린(clathrin), 카베올린(caveolin) 및 인지질(phospholipid)과 같은 특정 분자를 사용한 투과 경로를 통해 세포로 유입된다. 세포 투과 펩타이드의 효율은 이러한 요인들에 의해 변하며, 소수성 세포 투과 펩타이드의 효과가 더욱 크게 나타난다. 이러한 측면에서, 새로운 세포 투과 펩타이드의 설계 전략은 표적 세포 및 조직에 따라 확립되어야 한다.
한편, 교모세포종(glioblastoma)은 뇌에서 발생하는 가장 대표적인 암종으로, 진단 후 평균 생존 기간은 12-15개월이고 5년 생존율은 5% 미만인 악성종양이다. 교모세포종의 치료법으로 화학 요법과 같은 완화 요법이 입증되어 있으나, 약물의 낮은 조직 선택성과 낮은 뇌-혈관장벽 침투율은 많은 부작용을 유발한다.
이와 같은 맥락에서 나노입자 기반의 약물 전달 시스템(drug delivery system)은 이러한 문제점을 해결하기 위한 방법으로써 주목되어 왔다. 해당 기술분야에서 공지된 나노 물질 중에서 다공성 실리콘 나노입자는 독성이 낮고, 내재된 광발광 특성, 높은 탑재효율 및 방출 시스템을 쉽게 제어할 수 있는 장점으로 인해 전임상 연구에 널리 적용되어 왔다(Nat Mater. 2009 Apr;8(4):331-6.).
이에, 본 발명자들은 교모세포종에 대한 치료 전략으로 다공성 실리콘 나노입자 내부에 항암 약물인 7-에틸(ethyl)-10-히드록시(hydroxy)-캠토테신(camptothecin)을 탑재하고 교모세포종 표적화 능력을 갖는 세포 투과 펩타이드를 상기 나노입자의 표면에 결합시킴으로써 새로운 다공성 실리콘 나노입자 기반의 나노 약물 전달체를 제작하였다.
전술한 바와 같이, 본 발명자들은 나노입자 기반의 약물 전달 시스템을 이용해 항암 약물을 탑재하고 교모세포종 표적화 능력을 갖는 펩타이드를 부착한 교모세포종 세포를 표적하는 약물 전달용 나노입자를 개발하였으며, 이의 우수한 표적 기능 및 치료 효과를 확인하였는바, 이로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 (i) 항암 약물이 봉입된 다공성 실리콘 나노입자 및 (ii) 상기 나노입자의 표면에 결합된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는, 뇌암세포 표적 약물 전달용 나노입자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 뇌암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자의 제조방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 항암 약물이 봉입된 다공성 실리콘 나노입자 및 (ⅱ) 상기 나노입자의 표면에 결합된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는, 뇌암세포 표적 약물 전달용 나노입자를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 뇌암은 교모세포종일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 약물은 7-에틸-10-히드록시-캠토테신(7-Ethyl-10-hydroxy-camptothecin)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 나노입자는 카베올린(Caveolin) 수용체를 통해 세포 내로 섭취되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 나노입자는 뇌-혈관장벽(Blood-Brain Barrier; BBB)을 통과할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 나노입자의 평균 입자 크기는 100 내지 500 nm일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 펩타이드는 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol)) 링커를 통해 나노입자의 표면에 결합될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 뇌암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 상기 나노입자의 제조방법을 제공한다.
(a) 실리콘 웨이퍼(Silicon wafer)를 이용하여 다공성 실리콘 나노입자를 제조하는 단계;
(b) 상기 제조된 나노입자에 항암 약물을 봉입시키는 단계; 및
(c) 상기 항암 약물이 봉입된 나노입자의 표면에 뇌암세포를 표적하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 링커를 통해 결합시키는 단계.
본 발명의 일구현예로, 상기 단계 (a)에서, 나노입자는 실리콘 웨이퍼를 이용해 다공성 실리콘 필름을 제조한 후 초음파 수조에서 파쇄한 다음 시린지 필터를 이용해 여과시켜 제조하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 단계 (a)에서, 나노입자는 평균 입자 크기가 100 내지 200 nm일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 링커는 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol))일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 뇌암 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의, 뇌암 치료용도를 제공한다.
본 발명에서는 항암 약물이 탑재되고 교모세포종 세포를 표적하는 펩타이드가 표면에 결합된 다공성 실리콘 나노입자가 카베올린 수용체를 통해 교모세포종 세포에 흡수되고 특이적 약물 전달을 통한 우수한 항암효과 나타내는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명에 따른 상기 나노입자는 종래 낮은 조직 특이성 및 용해도를 보이는 항암제를 카베올린 수용체가 과발현된 교모세포종에 뇌-혈관장벽을 통과하여 특이적으로 전달하여 보다 효율적인 교모세포종 치료효과를 유도함으로써 교모세포종 치료를 위한 효과적인 약물 전달체로 이용될 수 있는바, 생체 내 분포도가 취약한 항암제의 효율을 향상시키고 카베올린이 과발현된 암세포의 치료에 적용이 가능하여 임상의 항암연구 분야에서 유용하게 활용될 것으로 기대된다.
도 1은 조직 기원이 다른 4가지 암세포주에서 SIWV 펩타이드의 세포 내 섭취 경로를 분석한 결과로서, 도 1a는 상기 각 세포주에서 공지된 세포 내 섭취 경로를 특이적으로 저해하는 물질을 각각 처리한 후 SIWV 펩타이드를 처리하고 세포 내 섭취율을 측정한 결과이고, 도 1b는 상기 각 세포주에서 카베올린-1(Caveolin-1) 단백질의 발현수준을 분석한 결과이다.
도 2는 SIWV 펩타이드의 생체 내 분포를 분석한 결과로서, 도 2a는 건강한 마우스의 꼬리 정맥으로 형광 표지자인 TAMRA가 표지된 SIWV 펩타이드(SIWV-TAMRA), 형광 표지(TAMRA) 및 PBS 완충액(PBS)을 각각 주사한 후 형광신호를 통해 체내 분포를 관찰한 결과이고, 도 2b는 각 군의 마우스에서 뇌(Brain), 폐(Lung), 심장(Heart), 비장(Spleen), 신장(Kidney) 및 간(Liver)을 적출한 후 형광 강도를 분석한 결과이다.
도 3은 SIWV 펩타이드의 뇌-혈관장벽 투과능을 알아보기 위해 마우스의 꼬리 정맥으로 TAMRA가 표지된 SIWV 펩타이드(SIWV-TAMRA) 및 형광 표지(TAMRA)를 각각 주사한 후 뇌를 적출하고 조직절편을 제작한 다음 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 4는 SIWV 펩타이드의 교모세포종 특이 표적화 능력을 알아보기 위해 교모세포종 마우스의 꼬리 정맥으로 TAMRA가 표지된 SIWV 펩타이드를 주사하고 뇌(Brain; B), 폐(Lung; Lu), 심장(Heart; H), 비장(Spleen; S), 신장(Kidney; Ki) 및 간(Liver; Li)을 적출한 후 형광 강도를 분석한 결과이다.
도 5는 본원발명에 따른 다공성 실리콘 나노입자를 제작하는 방법을 모식도로 나타낸 것이다.
도 6은 제조된 다공성 실리콘 나노입자에 대한 SN-38 약물의 탑재 효율을 측정하여 나타낸 결과이다.
도 7은 SIWV 펩타이드를 부착하기 위한 다공성 실리콘 나노입자의 표면 개질 방법을 모식도로 나타낸 것으로, 도 7a는 다공성 실리콘 나노입자의 표면에 SIWV 펩타이드를 부착하기 위한 방법 및 SIWV 펩타이드의 서열을 나타낸 것이며, 도 7b는 SIWV 펩타이드로 표면이 개질되고 SN-38 약물이 탑재된 다공성 실리콘 나노입자(SIWV-pSiNP(SN-38))의 제작방법을 나타낸 것이다.
도 8은 다공성 실리콘 나노입자(pSiNP), SN-38 약물이 탑재된 다공성 실리콘 나노입자(pSiNP(SN-38)) 및 SIWV 펩타이드로 표면이 개질되고 SN-38 약물이 탑재된 다공성 실리콘 나노입자(SIWV-pSiNP(SN-38))의 수동역학적 크기(도 8a) 및 제타전위(도 8b)를 측정한 결과이다.
도 9는 pSiNP, pSiNP(SN-38) 및 SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자 각각에 대한 투과전자현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 10은 pSiNP, pSiNP(SN-38) 및 SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자 각각에 대하여 FT-IR을 이용해 표면 작용기를 분석한 결과이다.
도 11은 PBS 상에서 SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자 내부에 탑재된 SN-38 약물의 방출 거동을 측정한 결과이다.
도 12는 pSiNP, SN-38 약물, pSiNP(SN-38) 및 SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자의 세포 내 섭취효율을 분석하기 위해 U87MG 세포에 상기 각 물질을 처리하고 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 13은 pSiNP, SN-38 약물, pSiNP(SN-38) 및 SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자 각각을 U87MG 세포에 다양한 농도로 처리하고 세포 생존율을 측정하여 세포독성 정도를 분석한 결과이다.
도 14는 교모세포종 마우스 모델에서 SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자의 생체 내 분포를 확인한 결과로서, 도 14a는 상기 마우스의 꼬리 정맥으로 PBS, pSiNP, pSiNP(SN-38) 및 SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자 각각을 주입하고 2시간 후 뇌, 폐, 심장, 비장, 신장 및 간을 적출하여 형광 강도를 측정하여 각 나노입자의 생체 내 분포를 관찰한 결과이며, 도 14b는 상기 도 14a의 형광 강도 값을 정량화한 후 비교하여 나타낸 결과이다.
도 15는 교모세포종 마우스 모델에서 SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자의 치료효과를 확인한 결과로서, 도 15a 및 도 15b는 마우스에 U87MG 세포를 이식하고 14, 15, 16 및 18일째에 상기 마우스의 꼬리 정맥으로 PBS, pSiNP, SN-38 약물, pSiNP(SN-38) 및 SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자 각각을 주입한 후 20일째까지 마우스의 생존율(도 15a) 및 체중(도 15b)을 측정하여 나타낸 결과이고, 도 15c 및 도 15d는 20일째에 각 군의 마우스로부터 교모세포종 종양을 적출한 후 종양의 크기(도 15c) 및 부피(도 15d)를 측정하여 나타낸 결과이다.
도 16은 본 발명에 따른 SN-38 약물이 탑재되고 SIWV 펩타이드가 표면에 결합된 다공성 실리콘 나노입자(SIWV-pSiNP(SN-38))의 제조방법 및 이의 교모세포종 특이적 항암효과를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 나노입자 기반의 약물 전달 시스템을 이용해 항암 약물을 탑재하고 교모세포종 표적화 능력을 갖는 펩타이드를 결합시킨 교모세포종 표적 약물 전달용 나노입자를 개발하였으며, 이의 우수한 표적 기능 및 치료 효과를 확인하였는바, 이로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 (i) 항암 약물이 봉입된 다공성 실리콘 나노입자 및 (ⅱ) 상기 나노입자의 표면에 결합된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는, 뇌암세포 표적 약물 전달용 나노입자를 제공한다.
본 발명에 있어서, 표적 질환인 뇌암은 두개골 내에 생기는 모든 암을 의미하는 것으로, 발생부위에 따라 원발성과 전이성으로 구분되며 원발성은 다시 주변의 신경조직을 침윤하는 신경교종 및 뇌조직을 침윤하지 않고 압박하는 비교종성 종양으로 분류된다. 악성도에 따라서는 악성 뇌종양(악성 신경교종, 뇌전이암)과 양성 뇌종양(뇌수막종, 청신경초종, 뇌하수체종양, 양성 신경교종)으로 분류되며, 악성 신경교종은 종양을 구성하는 세포에 따라 성상세포종, 핍지교세포종, 상의세포종 등으로 구분된다. 본 발명에서 뇌암은 바람직하게 교모세포종을 의미하는 것이나, 본 발명에 따른 펩타이드가 표면에 결합된 나노입자를 통해 약물이 전달될 수 있는 뇌암의 종류라면 구체적으로 한정되지 않는다.
상기 교모세포종(glioblastoma)은 성상세포종(별세포종)에서 4등급으로 가장 악성이며 조직학적으로는 역형성 성상세포종에 괴사소견이 추가된 것을 말한다. 교모세포종은 가장 흔한 원발성 뇌종양으로 신경교종의 1/2, 소아 신경교종의 15%의 발생비율을 차지하며, 2000년에 개정된 WHO의 분류표에 따라 거대세포 교모세포종(Giant cell glioblastoma)과 신경교육종(gliosarcoma) 등도 포함된다. 교모세포종은 수술로 최대한 종양을 제거하고 방사선치료 및 항암화학요법을 병행하는 방법으로 치료가 이루어지나, 다른 종양에 비하여 예후가 상당히 나쁘며, 교모세포종에 대한 치료는 대체적으로 종양의 성장을 늦추는 것이며 약물을 종양에 투입하는 것이 어려운 바 이러한 한계점을 극복하기 위한 다양한 연구가 이루어지고 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항암 약물은 뇌암, 바람직하게는 교모세포종을 치료하기 위한 약물이며 더욱 바람직하게는 7-에틸-10-히드록시-캠토테신(7-Ethyl-10-hydroxy-camptothecin)일 수 있으나, 교모세포종 또는 상기 나노입자가 표적할 수 있는 뇌암을 치료하기 위한 다른 약물이 봉입될 수도 있다.
본 발명자들은 실시예를 통해 전술된 바와 같은 뇌암세포 표적 약물 전달용 나노입자를 제조하였으며, 상기 나노입자를 구성하는 펩타이드 및 다공성 실리콘 나노입자의 특성을 확인하였으며, 제조된 나노입자의 물리화학적 특성 및 뇌암 치료효과를 확인하였다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일실시예에서는, 본 발명에 따른 나노입자의 표면에 결합된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 다양한 특성을 분석하였다. 그 결과, 상기 펩타이드는 카베올린 수용체를 통해 세포 내로 섭취되고 여러 세포주 중에서 카베올린이 과발현된 U87MG 세포에 대해서 특이적으로 섭취되는 결과를 확인하였으며(실시예 1 참조), 마우스를 이용한 체내 분포양상을 관찰한 결과 약 24시간 후에 체외로 배출되며 여러 기관 중 뇌에 특이적으로 흡수되는 양상을 확인하였다(실시예 2 참조). 또한, 마우스에 상기 펩타이드를 주사하고 뇌를 적출하여 조직분석을 실시함으로써 상기 펩타이드는 뇌 표면에만 머무는 것이 아닌 뇌-혈관장벽을 통과하여 뇌로 섭취되는 것을 확인하였으며(실시예 3 참조), 교모세포종 마우스 모델에 상기 펩타이드를 주사하고 각 장기로의 표적화 여부를 분석한 결과 교모세포종이 있는 뇌 부위에서의 펩타이드 분포가 대조군에 비해 2배 이상 높은 것을 통해 상기 펩타이드가 교모세포종 표적화 능력이 있음을 알 수 있었다(실시예 4 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 나노입자의 기반이 되는 다공성 실리콘 입자를 제작하고(실시예 5 참조), 상기 제작된 실리콘 나노입자에 교모세포종 치료 약물인 7-에틸(ethyl)-10-히드록시(hydroxy)-캠토테신(camptothecin)(이하, SN-38)을 탑재하여 SN-38 약물이 탑재된 다공성 실리콘 나노입자를 제조하고 상기 약물의 탑재 효율을 분석한 결과 28.7 ± 4.5%인 것을 확인하였다(실시예 6 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 약물이 탑재된 다공성 실리콘 나노입자의 표면에 상기 교모세포종을 표적하는 세포 투과 펩타이드를 결합시켜 본 발명에 따른 뇌암 표적 약물 전달용 나노입자를 제조하였다. 이후 상기 제조된 나노입자의 특성을 분석하기 위하여 입자의 수동역학적 크기 및 제타전위를 측정하였고, 투과전자현미경 관찰 및 푸리에 변환 적외분광법(FT-IR)을 통한 나노입자 표면의 작용기를 분석하여 펩타이드가 나노입자의 표면에 부착되어 있는 것을 확인하였다(실시예 8 참조).
본 발명에 따른 나노입자의 평균 입자 크기는 100 내지 500 nm일 수 있고, 바람직하게는 200 내지 400 nm일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 250 내지 350 nm일 수 있고, 가장 바람직하게는 306.2 ± 32.7 nm일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 나노입자의 약물 방출 거동을 분석한 결과, SN-38 약물이 대부분 2시간 이내에 방출되고 나머지는 24시간 동안 천천히 방출되는 것을 확인하였고(실시예 9 참조), 나노입자의 세포 내 섭취와 세포독성을 검증한 결과 상기 펩타이드 부착에 의해 교모세포종 세포주인 U87MG로의 섭취가 효과적으로 이루어지는 것을 확인하였고, 나노입자의 처리 농도에 따른 세포독성 정도를 확인함으로써 교모세포종 세포에 대해 효과적인 치료효과를 나타내는 농도범위를 조사하였다. (실시예 10 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 교모세포종 마우스 모델을 이용하여 본 발명에 따른 나노입자의 생체 내 분포를 조사한 결과 교모세포종 표적 능력으로 인해 뇌에 특이적으로 분포하는 것을 확인하였으며(실시예 11 참조), 실질적인 교모세포종의 치료효과를 검증하기 위해 교모세포종 마우스 모델에서 실험 프로토콜에 따라 상기 나노입자를 주입하고 결과를 분석한 결과, 교모세포종 종양의 크기 및 부피가 현저하게 감소한 결과를 확인하였다(실시예 12 참조).
상기 실시예 결과들은 본 발명에 따른 나노입자가 우수한 뇌암 표적화 능력을 가지며 이를 통해 우수한 치료효과를 유도하는 것을 입증하는 것이다.
이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 (i) 항암 약물이 봉입된 다공성 실리콘 나노입자 및 (ⅱ) 상기 나노입자의 표면에 결합된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는 뇌암세포 표적 약물 전달용 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 뇌암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 뇌암은 바람직하게는 교모세포종일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 뇌암에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 상기 뇌암세포 표적 약물 전달용 나노입자를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌암의 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 뇌암 치료용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 상기 나노입자의 제조방법을 제공한다.
(a) 실리콘 웨이퍼(Silicon wafer)를 이용하여 다공성 실리콘 나노입자를 제조하는 단계;
(b) 상기 제조된 나노입자에 항암 약물을 봉입시키는 단계; 및
(c) 상기 항암 약물이 봉입된 나노입자의 표면에 뇌암세포를 표적하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 링커를 통해 결합시키는 단계.
이하, 본 발명에 따른 나노입자의 제조방법에 대하여 각 단계별로 상세히 설명하고자 한다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (a)는 본 발명에 따른 뇌암세포 표적 약물 전달용 나노입자의 기반이 되는 다공성 실리콘 나노입자를 제조하는 단계이다.
상기 단계 (a)의 다공성 실리콘 나노입자는 실리콘 웨이퍼를 이용해 다공성 실리콘 필름을 제조한 후 초음파 수조에서 파쇄한 다음 시린지 필터를 이용해 여과시켜 제조될 수 있으며, 보다 상세한 제조과정은 실시예 5 및 도 5를 참조할 수 있다.
상기 제조된 다공성 실리콘 나노입자의 평균 입자 크기는 100 내지 200 nm일 수 있고, 바람직하게는 110 내지 170 nm일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 139.7 ± 18.8 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (b)는 단계 (a)에서 제조된 다공성 실리콘 나노입자에 항암 약물을 봉입시키는 단계이다.
상기 항암 약물은 바람직하게는 7-에틸-10-히드록시-캠토테신(7-Ethyl-10-hydroxy-camptothecin)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 나노입자를 통해 표적된 뇌암, 특히 교모세포종을 치료할 수 있는 다른 약물을 이용할 수 있다.
상기 다공성 실리콘 나노입자에 항암 약물을 봉입시키는 단계는, 상기 나노입자를 초음파 수조를 이용하여 에탄올에 고르게 분산시킨 후 약물을 용해시킨 용액을 분산시킨 나노입자에 넣어준 후 일정시간 동안 교반하고, 봉입되지 않은 약물을 제거함으로써 이루어질 수 있다. 상기 교반은 볼텍스 믹서를 이용하여 24시간 동안 이루어질 수 있으나, 이것으로 제한되지 않으며, 교반 및 약물제거 과정은 당업자가 적절히 조절하여 실시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (c)는 단계(b)에서 제조된 항암 약물이 탑재된 나노입자의 표면에 뇌암세포를 표적하는 세포 투과 펩타이드를 결합시키는 단계이다.
상기 펩타이드를 나노입자의 표면에 결합시키는 단계는 다공성 실리콘 나노입자와 머캅토프로필-트리에톡시실란을 분산시키고 혼합하여 나노입자의 표면 말단이 티올화 되도록 만들고, 상기 말단이 티올화된 나노입자를 다시 에탄올에 분산시키고 말레이미드-폴리에틸렌글라이콜-N-하이드록시숙신이미드를 첨가하여 혼합한 후 상기 펩타이드가 용해된 증류수를 첨가하고 배양함으로써 교모세포종 표적능을 갖는 펩타이드로 표면개질된 다공성 실리콘 나노입자를 제조할 수 있으며, 보다 구체적인 방법은 실시예 7, 도 7a 및 도 7b를 참조하여 실시할 수 있다.
상기 펩타이드와 다공성 실리콘 나노입자 간의 결합은 링커를 통해 이루어질 수 있으며, 상기 링커는 폴리에틸렌글라이콜일 수 있고, 바람직하게는 말레이미드-폴리에틸렌글라이콜-N-하이드록시숙신이미드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. SIWV 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 신경교종 세포 특이적 섭취 확인
본 발명자들은 세포투과능을 갖는 SIWV(Serine-Isoleucine-Tryptophan-Valine) 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 세포 내 섭취 경로를 알아보기 위하여, 세포 내 섭취 경로로 알려진 클라트린(Clathrin), 카베올라(caveolae), 매크로-피노사이토시스(macro-pinocytosis) 및 다이나민(dynamin)에 대하여 경쟁적 처리를 통해 경로를 조사하고자 하였다.
이를 위해. HeLa(인간 자궁암 세포), U87MG(인간 1차 교모세포종 세포), A549 (인간 폐암 세포), Huh7(인간 간암 세포) 세포에 대하여 각각 SIWV 펩타이드를 처리한 군, 클라트린을 억제하는 클로프로마진(chlorpromazine; CPZ) 50 μM을 30분 동안 처리하고 SIWV 펩타이드를 처리한 군, 카베올라를 억제하는 메틸(methyl)-베타(beta)-씨클로덱스트린(cyclodextrin)(MβCD) 1 mM을 30분 동안 처리하고 SIWV 펩타이드를 처리한 군, 매크로-피노사이토시트(macro-pinocytosis)를 억제하는 에틸 이소프로필 아밀로라이드(ethyl isopropyl amiloride; EIPA) 50 μM을 30분 동안 처리하고 SIWV 펩타이드를 처리한 군, 및 다이나민을 억제하는 다이나소르(dynasore) 30 μg을 30분 동안 처리하고 SIWV 펩타이드를 처리한 군으로 분류하여 각 물질 및 펩타이드를 처리한 후 SIWV의 세포 내 섭취 경로를 확인하였다.
그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이 카베올라를 억제하는 MβCD을 처리하고 SIWV 펩타이드를 처리한 군에서 특이적으로 SIWV 펩타이드의 세포 내 섭취가 감소한 것을 확인하였다. 나아가 웨스턴 블롯을 실시하여 상기 4개 세포주의 카베올린-1 단백질 발현수준을 측정한 결과 도 1b에서 볼 수 있는 바와 같이 U87MG 세포가 현저히 높은 수준으로 카베올린-1 단백질을 발현하는 것을 확인하였다. 이를 통해서 SIWV 펩타이드는 카베올린 수용체를 이용하여서 카베올린이 과발현된 U87MG 세포에 대해서 특이적인 세포 내 섭취를 하는 것을 확인하였다.
실시예 2. SIWV 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 생체 내( in vivo ) 분포 확인
본 발명자들은 SIWV 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 생체 내 분포를 확인하기 위하여, SIWV 펩타이드에 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine; TAMRA)을 표지하여 영상화가 가능하게 한 다음, 상기 SIWV-TAMRA 펩타이드를 건강한 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주사하고 형광신호를 통해 SIWV 펩타이드의 생체 내 분포를 관찰하였다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 뇌를 포함한 대부분의 조직에서 1시간 내에 강한 형광 신호가 관찰되었고, 24시간 이후에는 체외로 배출되는 것을 확인하였다. 반면 TAMRA만을 주사한 대조군의 경우에는 1분 이내에 마우스 전체에 TAMRA가 퍼지고 2시간 이내에 배출되는 것을 확인하였다.
이에 더하여, SIWV 펩타이드의 생체 내 조직 분포를 확인하기 위하여 각 펩타이드를 주사하고 3시간 후에 각 기관의 형광 강도를 분석하였다. 그 결과, 도 2b에서 볼 수 있는 바와 같이 SIWV-TAMRA 펩타이드를 주사한 경우에는 뇌, 폐, 심장 및 간에서 형광 신호가 검출되었고, 특히 뇌에서 TAMRA만을 주사한 경우에 비해 현저히 강한 신호가 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 3. SIWV 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 뇌-혈관장벽 통과 확인
본 발명자들은 SIWV 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 단지 뇌 표면에만 머무는 것이 아니라 뇌-혈관장벽을 통과하는지 여부를 알아보기 위하여, 상기 실시예 2의 방법과 동일하게 SIWV-TAMRA 펩타이드를 마우스에 주사하고 3시간 후 뇌를 적출한 다음 냉동하고 냉동 조직의 절편을 이용해 샘플을 제작하여 공초점 현미경으로 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 SIWV 펩타이드가 뇌-혈관장벽을 통과하여 뇌로 섭취된다는 것을 확인하였다.
실시예 4. SIWV 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 교모세포종 특이적 표적화 능력 확인
본 발명자들은 상기 실시예 3의 결과에 근거하여 SIWV 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 뇌-혈관장벽을 통과하여 교모세포종을 특이적으로 표적화 하는지 여부를 알아보고자 하였다. 이를 위해, 교모세포종 마우스 모델의 꼬리 정맥을 통해 SIWV-TAMRA를 주사하고 1시간 후 뇌, 폐, 심장, 비장, 신장, 간장을 회수하여 각 장기에서의 형광신호를 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 SIWV-TAMRA의 형광 강도는 뇌, 폐, 심장, 신장, 간에서 모두 PBS를 주사한 대조군 보다 높게 나타났으며, 특히 교모세포종이 있는 뇌 부위에서의 형광 신호가 대조군에 비해서 2배 이상 높은 것을 확인하였다.
실시예 5. 다공성 실리콘 나노입자의 제작
본 발명자들은 약 140 nm의 입자 크기를 가지는 다공성 실리콘 나노입자를 하기의 방법에 따라 제작하였으며, 도 5에 제작방법에 대한 모식도를 나타내었다.
구체적으로, 붕소가 도핑된 p형 단결정 실리콘 웨이퍼(Silicon wafer)와, 48% 불산과 에탄올이 3:1의 비율로 혼합된 전해질 용액을 사용하여 전기화학적 에칭(electochemical etching) 방법으로 제작하였다. 다공성 실리콘 층을 제작하기 전에 실리콘 웨이퍼를 양극처리 하여 불산이 함유된 전해질에서 일반적으로 “희생 층(sacrificial layer)”으로 불리는 얇은 다공성 층을 생성시킨 다음, 생성된 다공성 층을 2 M의 수산화칼륨(KOH) 용액을 처리하여 용해시켰다. 다공성 실리콘 층을 제작하기 위하여 에칭 파형은 1.8초 동안 46 mA/cm의 전류밀도와 그 후 0.4초 동안 334 mA/cm의 전류밀도를 1 사이클로 하는 펄스(pulse)로 구성하였다. 이 파형을 150 사이클 동안 반복하여 약 200 nm마다 “천공(perforation)”을 가지는 다공성 실리콘 필름을 제작하였다. 이후 48% 불산과 에탄올이 1:12의 비율로 혼합된 용액에서 3.1 mA/cm의 전류밀도를 300초 동안 가하여 다공성 실리콘 필름을 실리콘 기판으로부터 수집하였다. 수집한 다공성 실리콘 필름과 증류수 6 mL을 밀봉된 바이알에 넣고 초음파 수조(ultrasonic bath)를 이용하여 24시간 동안 파쇄한 다음 0.22 μm 시린지 필터를 이용하여 큰 입자를 제거하였다. 시린지 필터를 통과한 다공성 실리콘 나노입자를 실온(25℃)에서 10일 동안 추가적으로 배양하여서 나노입자의 표면을 산화실리콘(Si-OH)으로 형성시켰다. 그 후 에펜도르프 튜브(e-tube 1.5 mL)에 나누어 옮기고 원심분리기를 이용하여서 14000 rpm으로 30분 동안 작동시켰다. 이어서 가라앉은 나노입자 위 상층액을 제거하고, 에탄올 1 mL을 추가로 넣어주고 원심분리 및 상층액 제거 과정을 3차례 반복하였다. 상기 과정으로 제작된 다공성 실리콘 나노입자를 pSiNPs라고 명명하였다.
실시예 6. 7-에틸(ethyl)-10-히드록시(hydroxy)-캠토테신(camptothecin) 약물이 탑재된 다공성 실리콘 나노입자의 제작 및 탑재효율 분석
본 발명자들은 상기 실시예 5에서 제작된 다공성 실리콘 나노입자에 교모세포종 치료약물을 탑재하고 탑재효율을 분석하고자 하였다. 이를 위해, 1 mg의 다공성 실리콘 나노입자를 1.45 mL 에탄올에 초음파 수조를 이용하여서 고르게 분산시킨 후 다이메틸설폭사이드(DMSO) 50 μL에 용해시킨 1 mg의 7-에틸(ethyl)-10-히드록시(hydroxy)-캠토테신(camptothecin) 약물(이하: SN-38)을 상기 분산시킨 다공성 실리콘 나노입자에 넣어준 후 볼텍스 믹서(vortex mixer)를 이용하여 24시간 동안 교반시켰다. 24시간 후, 탑재되지 않은 SN-38을 제거하기 위하여 14000 rpm으로 15분 동안 원심분리를 실시하고 가라앉은 나노입자 위 상층액을 제거한 다음, 에탄올 1 mL을 추가로 넣어주고 원심분리 및 상층액 제거 과정을 3차례 반복하였다.
이후 다공성 실리콘 나노입자에 대한 SN-38의 탑재 효율을 측정하기 위하여 각각의 원심 분리 단계로부터 상층액을 수집하고 SHIMADZU사의 spectro-fluorophotometer를 사용하여 SN-38에서 측정되는 형광 세기를 측정한 후 표준 곡선과 비교하여 탑재 효율을 분석하였다. 이때 측정에 사용한 셀(cell)로는 1 cm 두께의 standard quartz cell을 이용하였다.
분석 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 SN-38의 탑재효율은 28.7 ± 4.5%인 것으로 나타났으며, 본 발명자들은 상기 SN-38 약물이 탑재된 다공성 실리콘 나노입자를 pSiNP(SN-38)이라고 명명하였다.
실시예 7. pSiNP(SN-38)의 표면에 SIWV 펩타이드 부착
본 발명자들은 상기 실시예 6에서 제작한 SN-38 약물이 탑재된 다공성 실리콘 나노입자(pSiNP(SN-38))에 상기 실시예 3 및 4를 통해 뇌-혈관장벽 통과 및 교모세포종 특이적 표적화 능력이 확인된 SIWV 펩타이드를 부착하고자 하였다.
표면에 SIWV 펩타이드를 부착하기 위한 다공성 실리콘 나노입자의 표면 개질 방법과 모식도를 도 7a 및 도 7b에 나타내었다. 구체적으로, pSiNP(SN-38) 1 mg과 3-머캅토프로필-트리에톡시실란(3-mercaptopropyl-triethoxysilane)을 에탄올 1 mL에 분산시킨 다음, 볼텍스 믹서를 사용하여 실온(25℃)에서 4시간 동안 혼합하였다. 남아있는 3-머캅토프로필-트리에톡시실란을 제거하기 위하여 에탄올을 넣고 14000 rpm, 15분 동안 원심분리하여 세척하는 과정을 3회 반복하였다. 다음으로, 3-머캅토프로필-트리에톡시실란에 의해 표면말단이 티올(thiol)화된 나노입자를 에탄올 800 μL에 분산시킨 뒤 200 μL의 에탄올에 용해시킨 1 mg의 말레이미드(maleimide; MAL)-폴리에틸렌글라이콜(poly(ethyleneglycol); PEG)-N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS)를 첨가하고, 볼텍스 믹서를 사용하여 상온에서 2시간 동안 혼합하였다. 이후 에탄올을 넣고 14,000 rpm, 15분 동안 원심분리하는 과정을 3회 반복하여 남아있는 MAL-PEG-NHS를 제거하였다. 이어서 남아 있는 입자를 에탄올 100 μL에 재분산 시킨 뒤, SIWV 펩타이드를 부착하기 위하여 100 μL 에탄올에 용해시킨 SIWV 펩타이드 0.2 mg을 넣고, 4℃ 냉장고에서 4시간 동안 배양하였다. 4시간 후 증류수를 넣고 14000 rpm, 15분 동안 원심분리하는 과정을 3회 반복하여 세척한 후 남아 있는 입자를 10 μL 증류수에 분산시키고 4℃에 보관하였다.
본 발명자들은 상기 과정에 따라 제조한 표면이 SIWV 펩타이드로 개질되고 SN-38 약물이 탑재된 다공성 실리콘 나노입자를 SIWV-pSiNP(SN-38)이라고 명명하였다.
실시예 8. 제조된 나노입자의 특성 분석
8-1. 각 나노입자의 크기 및 제타전위 확인
본 발명자들은 각각 상기 실시예 5 내지 7에서 제조한 pSiNPs, pSiNP(SN-38), 및 SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자의 수동역학적(hydrodynamic) 크기 및 제타전위를 측정하기 위하여, Malvern 사의 Zetasizer Nano ZS90을 사용하였다.
각 나노입자의 수동역학적 크기 및 제타전위를 측정한 결과, 도 8a 및 도 8b에 나타낸 바와 같이 pSiNPs 나노입자는 직경 139.7 ± 18.8 nm의 수동역학적 직경과 -44.5 ± 8.39 mV의 제타전위를 가지는 것으로 나타났고, pSiNP(SN-38) 나노입자는 음의 표면 전하가 -24.3 ± 6.73 mV로 낮아지고 직경은 196.3 ± 32.2 nm로 약간의 증가된 것으로 나타났다. SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자의 경우에는 세포 투과 펩타이드의 부착으로 인해 크기가 306.2 ± 32.7 nm로 더 증가하였고, 제타전위는 -34.8 ± 5.91 mV로 측정되었다.
8-2. 각 나노입자의 투과전자현미경 관찰
다음으로, 본 발명자들은 투과전자현미경을 이용하여 pSiNPs, pSiNP(SN-38) 및 SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자의 형태를 관찰하기 위해, FEI 사의 Tecnai 투과전자현미경으로 각 나노입자를 촬영하고 그 결과를 도 9에 나타내었다.
관찰 결과, pSiNPs 나노입자는 비교적 균일한 입자 크기와 다공성 구조를 가지고 있으며, 이러한 성질은 SN-38 약물을 탑재한 후(pSiNP(SN-38))와 그 후 세포 투과 펩타이드를 부착(SIWV-pSiNP(SN-38))한 후에도 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
8-3. 각 나노입자의 표면 확인
본 발명자들은 다공성 실리콘 나노입자 내부로의 SN-38 약물 탑재 결과와 SIWV 펩타이드가 부착된 것을 확인하기 위하여 pSiNPs, pSiNP(SN-38) 및 SIWV-pSiNP(SN-38) 각 나노입자를 Thermo Fisher사의 Attenuated total reflection Fourier transform infrared(FT-IR) spectroscopy를 사용하여 표면의 작용기(functional group)를 확인하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이 pSiNPs는 3550 ~ 3200 cm-1에서 u(O-H) 작용기와 1065 cm-1에서 u(Si-O) 스트레칭(stretching)을 보이는 것을 확인하였다. SN-38 약물이 탑재된 pSiNP(SN-38)의 경우에는 2950 ~ 2860 cm-1 와 1480 ~ 1350 cm-1에서 SN-38 약물의 (C-H) 스트레칭, 벤딩(bending) 진동을 확인함으로써 pSiNP(SN-38) 나노입자 안에 SN-38 약물이 탑재된 것을 알 수 있었다. SIWV 펩타이드가 부착 된 후에는 1650 cm-1에서 u(amide) 작용기를 확인하여서 SIWV 펩타이드가 부착되었음을 확인하였다.
실시예 9. SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자의 방출 거동 확인
본 발명자들은 인산완충생리식염수(phosphate-buffered saline; PBS)상에서 SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자에 탑재된 SN-38 약물의 방출 거동을 확인하고자 하였다. 이를 위해, SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자 0.1 mg을 PBS 1 mL에 분산 시킨 후 37℃에서 배양하였다. 일정한 시간이 지난 후, 15분 동안 14,000 rpm에서 원심 분리하여 나노입자와 상층액을 분리한 다음, 분리된 상층액에 367 nm의 여기 파장을 조사하고 561 nm에서의 방출 파장을 측정하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이 SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자 안에 탑재된 SN-38 약물은 대부분 2시간 이내에 방출되었고, 나머지 약물은 24시간 동안 서서히 방출되는 것을 확인하였다.
실시예 10. SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자의 세포 내 섭취 및 세포독성 검증
본 발명자들은 SIWV-pSiNP(SN-38)의 세포 내 섭취 효율 및 세포독성 여부를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 진행하였다. 구체적으로, U87MG 세포를 96-웰 플레이트(96-well plate)에 10,000 cells/well 밀도로 분주하고 5% CO2 및 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 SN-38 약물 단독, pSiNPs, pSiNP(SN-38), 및 SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자 각각을 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μM의 농도로 100 μL씩 세포에 각각 처리하고 6시간 동안 배양하였다. 6시간 후, 세포 내 섭취 효율을 확인하기 위하여 세포에 4‘,6,-다이아미노-2-페닐인돌(4’,6-diamino-2-phenylindole; DAPI) 시약을 10분 동안 처리하여 세포핵을 염색하였고, CellMask ™ Deep Red Plasma membrane Stain 시약을 1시간 동안 처리하여 세포막을 염색하였다. 염색이 끝난 후 PBS로 3회 세척하고 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 20분 동안 처리하여 세포를 고정시킨 다음, 공초점 현미경으로 세포를 관찰하였다. 청색 파장 영상은 405 nm의 여기 파장과 410-450 nm의 방출 파장을 통해 관찰되었고, 녹색 파장 영상은 405 nm의 여기 파장과 505-545 nm의 방출 파장을 통해 관찰되었으며, 적색 파장 영상은 640 nm의 여기 파장과 650-690 nm의 방출 파장을 통해 관찰되었다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이 SIWV 펩타이드가 부착되지 않은 pSiNPs, SN-38, pSiNP(SN-38) 처리군의 경우 6시간의 배양 후에도 세포 내 섭취가 일어나지 않은 반면, SIWV 펩타이드가 부착된 SIWV-pSiNP(SN-38) 군의 경우 주어진 조건 하에서 U87MG 세포 내에 효과적으로 섭취되어서 SN-38 약물을 전달 및 방출한 것을 확인할 수 있었다.
한편, 상기와 같이 SN-38 및 각 나노입자를 세포에 처리하고 6시간 동안 배양한 후 10% WST-1시약 10 μL을 각 웰에 첨가하고 2시간 동안 배양하였다. 이후 마이크로 플레이트 리더기(microplate reader)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하여 세포생존율을 분석하였으며, 세포 생존율은 나노입자가 처리되지 않은 U87MG 세포에 대한 상대적 백분율을 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이 pSiNP을 세포에 처리한 군은 6시간을 배양 후에도 독성을 나타내지 않는 반면, SN-38, pSiNPs, pSiNP(SN-38) 및 SIWV-pSiNP(SN-38)을 처리한 군은 처리 농도가 증가함에 따라 독성도 증가하는 것으로 나타났다. 낮은 농도인 6.5 μM에서, SIWV-pSiNP(SN-38)를 처리한 경우 U87MG 세포의 독성은 31.2%로 SN-38(12.4%) 및 pSiNP(SN-38)(16.2%)를 처리한 군에 비하여 유의미하게 높은 세포독성을 나타내었다. 또한 높은 농도인 100 μM에서도 SIWV-pSiNP(SN-38)를 처리한 군의 세포독성은 84.4%로 나타나 SN-38(55.4%) 및 pSiNP(SN-38)(58.8%) 군에 비해 더 높은 세포 독성을 유발하는 것을 알 수 있었다.
실시예 11. 교모세포종 마우스 모델에서 SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자의 생체 내 분포 확인
본 발명자들은 교모세포종 마우스 모델에서 SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자의 생체 내 분포를 확인하기 위해, 상기 마우스의 꼬리 정맥에 pSiNP, pSiNP(SN-38) 및 SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자를 각각 주입한 후 IVIS를 이용하여 상기 나노입자들의 생체 분포를 관찰하였다.
보다 구체적으로, 생후 7주의 암컷 ICR 마우스를 이용하였으며, 상기 마우스를 주위 온도 23±1℃ 및 상대 습도 60±10%인 조건하에 12시간의 명/암주기에서 사육하였다. 이후 교모세포종 모델 마우스를 제작하기 위해 마우스를 트리브로모에탄올(tribromoethanol)로 마취시키고 정위 장치(stereotaxic apparatus)에 위치시킨 후 각각의 마우스에 하기 좌표에 따라 1,000,000개의 U87MG 세포를 주입하여 교모세포종 모델을 제작하였다(앞뒤(anteroposterior): 브레그마(bregma)에서 -3.0mm; 중간면(mediolateral): 브레그마에서 1.8mm; 배복방향: 두개골 브레그마(skull bregma)에서 -3.0mm). U87MG 세포를 이식하고 2주 뒤, 마우스를 다음과 같이 4개의 군으로 무작위로 분류하였다. (1) 대조군(PBS 정맥주사), (2) pSiNP 군(20 mg/kg pSiNP 정맥주사), (3) pSiNP (SN-38) 군(20 mg/kg pSiNP(SN-38) 정맥 주사), 및 (4) SIWV-pSiNP(SN-38) 군 (20mg/kg SIWV-pSiNP(SN-38) 정맥 주사). 각 군의 마우스에 해당 나노입자를 꼬리 정맥을 통해 주사하고 2시간 후, 마우스를 트리브로모에탄올로 마취시키고 PBS로 관류시킨 다음 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 이어서 마우스에서 뇌, 폐, 심장, 비장, 신장 및 간을 적출하여 각 장기를 pH 12의 완충액에서 1시간 동안 침지시킨 다음, IVIS 200 발광 및 형광 동물 이미징 시스템(xenogen IVIS 200 luminescence and fluorescence animal imaging system)을 이용하여 각 장기에서의 형광 강도를 측정함으로써 나노입자의 생체 내 분포를 확인하였다. 여기 파장은 445-490 nm을 사용하였고, 형광 방출 파장은 530-590 nm을 사용하였다.
그 결과, 도 14a 및 도 14b에 나타낸 바와 같이 SIWV-pSiNP(SN-38)을 주사한 군의 경우 뇌에서 강한 형광 신호를 확인할 수 있었다.
실시예 12. 교모세포종 마우스 모델에서 SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자의 치료효과 확인
본 발명자들은 교모세포종 마우스 모델에서 SIWV-pSiNP(SN-38) 나노입자의 실질적인 치료효과를 확인하고자 하였다.
이를 위해, 교모세포종 마우스를 하기와 같은 5개의 그룹(그룹 당 마리 수 = 6)으로 분류하고, 2~3일 간격으로 마우스의 체중 및 마리 수를 측정하였다. (1) 대조군(PBS 정맥주사), (2) pSiNP 군(20 mg/kg pSiNP 정맥주사), (3) SN-38 군(SN-38 약물 정맥주사), (4) pSiNP(SN-38) 군(20 mg/kg pSiNP(SN-38) 정맥 주사) (5) SIWV-pSiNP(SN-38) 군 (20mg/kg SIWV-pSiNP(SN-38) 정맥 주사). 상기 각 군에 해당 나노입자를 U87MG 세포가 이식된지 14일, 15일, 16일, 18일째에 꼬리 정맥을 통해 주입하였으며, 최종적으로 20일째에 남아 있는 교모세포종 마우스들을 안락사 시키고, 캘리퍼를 사용하여 종양의 크기 및 부피를 측정하였다.
그 결과, 도 15a 내지 도 15d에 나타낸 바와 같이 다른 군과 비교하여 SIWV-pSiNP(SN-38) 군의 경우, 마우스의 생존율이 높고 체중감소가 나타나지 않았으며 종양의 크기와 부피가 현저히 감소한 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 SIWV-pSiNP(SN-38)이 교모세포종에 대한 우수한 치료효과가 있음을 알 수 있었다.
종합적으로, 상기 SN-38 약물이 탑재되고 SIWV 펩타이드가 표면에 결합된 다공성 실리콘 나노입자(SIWV-pSiNP(SN-38))의 제조방법 및 이의 교모세포종 특이적 항암효과를 도 16에 도시하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Nanoparticles for drug delivery surface-modified with brain tumor cell targeting peptide, preparation method thereof and use thereof <130> PD19-296 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> glioblastoma targeting peptide <400> 1 Ser Ile Trp Val 1

Claims (15)

  1. (i) 항암 약물이 봉입된 다공성 실리콘 나노입자 및 (ⅱ) 상기 나노입자의 표면에 결합된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는, 뇌암세포 표적 약물 전달용 나노입자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 뇌암은 교모세포종인 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 약물은 7-에틸-10-히드록시-캠토테신(7-Ethyl-10-hydroxy-camptothecin)인 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 카베올린(Caveolin) 수용체를 통해 세포 내로 섭취되는 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 뇌-혈관장벽(Blood-Brain Barrier; BBB)을 통과하는 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자의 평균 입자 크기는 100 내지 500 nm인 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol)) 링커를 통해 나노입자의 표면에 결합된 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 뇌암 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 뇌암은 교모세포종인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  10. 하기의 단계를 포함하는, 제1항의 나노입자 제조방법:
    (a) 실리콘 웨이퍼(Silicon wafer)를 이용하여 다공성 실리콘 나노입자를 제조하는 단계;
    (b) 상기 제조된 나노입자에 항암 약물을 봉입시키는 단계; 및
    (c) 상기 항암 약물이 봉입된 나노입자의 표면에 뇌암세포를 표적하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 링커를 통해 결합시키는 단계.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 단계 (a)에서, 나노입자는 실리콘 웨이퍼를 이용해 다공성 실리콘 필름을 제조한 후 초음파 수조에서 파쇄한 다음 시린지 필터를 이용해 여과시켜 제조하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 단계 (a)에서, 나노입자는 평균 입자 크기가 100 내지 200 nm인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 단계 (b)에서, 약물은 7-에틸-10-히드록시-캠토테신(7-Ethyl-10-hydroxy-camptothecin)인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 뇌암은 교모세포종인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 단계 (c)에서, 링커는 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol))인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
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