KR20230059296A - 금속-유기골격체, 포도당 산화효소, 및 과산화효소 모방 효소를 포함하는 나노 구조체 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 포도당 산화효소 (glucose oxidase) 및 과산화효소 모방 효소 (peroxidase mimetic)를 포함하는 금속-유기골격체 (metal organic framework)를 포함하는 나노구조체와 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것이다. 상기 나노구조체는 포도당의 공급을 차단하면서 활성산소종을 생성함으로써 정상 세포에서는 매우 안정하면서도 암세포를 특이적으로 사멸할 수 있으며, 종양 미세 환경 (TME)이 가지는 특이적인 조건 (과량의 포도당, 약산성 환경) 하에 촉매 반응이 개시된다는 특징을 가지므로, 레이저, 초음파, 전자기, 방사선 등의 외부 자극 없이도 연속 반응을 통한 암세포의 사멸 유도가 가능하다. 또한, 상기 나노구조체는 유기 합성 과정이나 장시간의 추출 공정을 필요로 하지 않고 물을 용매로 하여 제조할 수 있으므로, 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 효율적, 경제적으로 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 금속-유기골격체, 포도당 산화효소, 및 과산화효소 모방 효소를 포함하는 나노구조체, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 등에 관한 것이다.
암은 국내 사망원인 1위, 전 세계 사망원인 2위에 달하는 질병으로, 암을 치료하기 위한 일반적인 방법으로 크게 외과적 수술, 방사선 치료, 항암 화학요법 등이 행해지고 있다. 하지만 기존의 단일 항암 치료 요법은 심각한 약물 부작용 우려에도 불구하고 항암 효능이 상대적으로 낮다는 단점이 있어 왔다. 때문에 두 가지 혹은 그 이상의 치료법을 결합시켜 다수의 단점을 극복하고 안전성 및 효능 면에서 우월한 복합 요법 (multimodal therapy)을 개발하여 여러 치료적 접근법 간에 시너지 효과를 내도록 하는 연구가 계속되고 있다.
그 중 하나로, 특정 물질의 처리를 통해 암세포 내부에서 해로운 활성산소종 (ROS)를 유발하고 세포 내부의 불균형을 초래하여 결국에는 사멸에 이르게 하는 치료법인 화학역학 치료법 (chemodynamic therapy; CDT) 와 포도당 산화효소를 이용한 단식 치료법 (starvation therapy)를 함께 결합시켜 연속 효소/촉매 반응을 통한 시너지 효과를 낼 수 있다.
구체적으로, 암세포 내외부에 암세포의 에너지원인 포도당이 많이 분포해 있다는 점과 암세포는 항상 약산성 환경을 유지한다는 특성을 이용하여, 포도당 산화효소를 통해 포도당과 산소를 소비함으로써 암세포의 에너지 공급을 차단함으로써 사멸시킬 수 있다.
이처럼 펜톤 반응 (fenton reaction), 저산소증 활성 치료법, pH-반응성 약물 방출 치료법 등의 화학역학 치료법을 단식 치료법과 결합시킨 치료법들이 많은 관심을 끌어오고 있지만, 나노 물질의 독성, 부작용, 유효성에 관한 우려 등 고려해야 할 사항은 여전히 많기 때문에, 암 치료를 목적으로 하는 나노 물질의 도입에는 아직까지 한계가 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 과산화효소 모방 효소 (peroxidase mimetic)와 포도당 산화효소 (glucose oxidase; GOx)를 각각 화학역학 치료법과 단식 치료법의 제제로 활용하고, 이를 아연 (Zn) 기반의 금속-유기골격체 (metal organic framework; MOF)로 포집하여 나노구조체를 제조하였으며, 상기 나노구조체를 항암 치료에 응용함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 포도당 산화효소 (glucose oxidase) 및 과산화효소 모방 효소 (peroxidase mimetic)를 포함하는 금속-유기골격체 (metal organic framework)를 포함하는 나노구조체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 기술적 과제는 상기 나노구조체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 기술적 과제는 상기 나노구조체의 제조방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 포도당 산화효소 (glucose oxidase; GOx) 및 과산화효소 모방 효소 (peroxidase mimetic)를 포함하는 금속-유기골격체 (metal organic framework; MOF)를 포함하는 나노구조체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 과산화효소 모방 효소는 프루시안 블루 나노효소 (Prussian blue nanoparticle; PB)일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 금속-유기골격체는 제올라이트형 이미다졸레이트 골격체 (zeolitic imidazole framework; ZIF)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 나노구조체는 포도당의 공급을 차단하면서 활성산소종 (reactive oxygen species)을 생성하여 암세포를 특이적으로 사멸시키는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 나노구조체는 pH 3 내지 7에서 분해되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 pH 5 내지 6에서 분해되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 나노구조체의 크기는 200 내지 400 nm일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 나노구조체의 제타 전위는 -10 내지 -30 mV일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 나노구조체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 암 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 나노구조체의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 나노구조체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 암은 피부암, 유방암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌 종양, 결장암, 직장암, 대장암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 외음부암, 신장암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 고환암, 후두암, 두경부암, 갑상선암, 간암, 방광암, 골육종, 림프종, 백혈병, 흉선암, 요도암, 및 기관지암으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 나노구조체의 제조방법을 제공한다.
(1) 질산아연 헥사수화물 (zinc nitrate hexahydrate)에 포도당 산화효소 (glucose oxidase) 및 과산화효소 모방 효소 (peroxidase mimetic)를 첨가하는 단계;
(2) 상기 (1) 단계에서 생성된 용액에 2-메틸이미다졸 (2-methylimidazole)을 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(3) 상기 포도당 산화효소 및 과산화효소 모방 효소를 포함하는 금속-유기골격체 (metal organic framework)를 포함하는 나노구조체를 제조하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 과산화효소 모방 효소는 프루시안 블루 나노효소 (Prussian blue nanoparticle)일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 프루시안 블루 나노효소는 FeCl3·6H2O와 citric acid가 담긴 수용액 및 K4[Fe(CN)6]와 citric acid가 담긴 수용액을 반응시키고, 아세톤을 추가로 첨가한 후, 원심분리를 진행하여 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 나노구조체는 나노구조체 100 중량부 기준으로, 포도당 산화효소 0.01 내지 0.1 중량부와 과산화효소 모방 효소 0.001 내지 0.01 중량부를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (1) 단계에서 질산아연 헥사수화물의 농도는 10 내지 50 mM, 바람직하게는 40 mM일 수 있고, 상기 (2) 단계에서 2-메틸이미다졸의 농도는 2.5 내지 5 M, 바람직하게는 2.8 M일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (2) 단계는 상온에서 1 내지 10 분 동안 반응시키는 것일 수 있다.
본 발명은 포도당 산화효소 (glucose oxidase) 및 과산화효소 모방 효소 (peroxidase mimetic)를 포함하는 금속-유기골격체 (metal organic framework)를 포함하는 나노구조체와 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것이다. 상기 나노구조체는 포도당의 공급을 차단하면서 활성산소종을 생성함으로써 정상 세포에서는 매우 안정하면서도 암세포를 특이적으로 사멸할 수 있으며, 종양 미세 환경 (TME)이 가지는 특이적인 조건 (과량의 포도당, 약산성 환경) 하에 촉매 반응이 개시된다는 특징을 가지므로, 레이저, 초음파, 전자기, 방사선 등의 외부 자극 없이도 연속 반응을 통한 암세포의 사멸 유도가 가능하다. 또한, 상기 나노구조체는 유기 합성 과정이나 장시간의 추출 공정을 필요로 하지 않고 물을 용매로 하여 제조할 수 있으므로, 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 효율적, 경제적으로 제공할 수 있다.
도 1A는 프루시안 블루 나노효소 (PB)의 합성 과정, 및 상기 합성된 프루시안 블루 나노효소와 포도당 산화효소를 동시에 포집하는 금속-유기골격체를 포함하는 나노구조체 (ZIF@GOx@PB)를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다. 도 1B는 암세포 환경에서 포도당 산화효소와 프루시안 블루 나노효소가 점차적으로 방출되는 과정의 메커니즘을 나타낸 모식도이다.
도 2는 균일한 크기로 합성된 ZIF-8 입자의 (A), (B) 주사 전자 현미경 (SEM) 사진과 (C) 투과 전자 현미경 (TEM) 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 최적화 조건이 아닌 경우 합성된 ZIF-8 입자의 주사 전자 현미경 (SEM) 사진으로, 왼쪽은 아세트산 아연과 2-메틸이미다졸을 상온에서 5 분간 반응시켜 제조한 것이고, 오른쪽은 질산 아연과 2-메틸이미다졸을 80℃에서 5 분간 반응시켜 제조한 것이다.
도 4는 다양한 농도의 포도당 산화효소 (GOx)와 프루시안 블루 나노효소 (PB)를 이용하여 합성한 ZIF@GOx@PB 나노구조체의 크기를 나타내는 DLS 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 다양한 농도의 포도당 산화효소 (GOx)와 프루시안 블루 나노효소 (PB)를 이용하여 합성한 ZIF@GOx@PB 나노구조체의 촉매 활성 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 나노구조체 제조를 위해 필요한 금속 및 유기물의 농도와 부피, 합성 조건과 과정을 나타낸 모식도이다.
도 7은 제조예 1에서 합성한 4종의 나노구조체 (ZIF-8, ZIF@GOx, ZIF@PB, 및 ZIF@GOx@PB)의 주사 전자 현미경 (SEM) 사진을 나타낸 것이다.
도 8은 제조예 1에서 합성한 4종의 나노구조체 (ZIF-8, ZIF@GOx, ZIF@PB, 및 ZIF@GOx@PB)의 입자 크기를 나타내는 동적 광산란(DLS) 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 제조예 1에서 합성한 4종의 나노구조체 (ZIF-8, ZIF@GOx, ZIF@PB, 및 ZIF@GOx@PB)의 표면 전하를 나타내는 제타 전위 (zeta potential) 값을 나타낸 것이다.
도 10은 제조예 1에서 합성한 4종의 나노구조체 (ZIF-8, ZIF@GOx, ZIF@PB, 및 ZIF@GOx@PB)의 열중량분석 (thermogravity analysis) 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 프루시안 블루 나노효소와 포도당 산화효소를 포함하는 금속-유기골격체를 포함하는 나노구조체 (ZIF@GOx@PB)의 주사 투과 전자 현미경 (STEM) 사진 및 원소 맵핑 (elemental mapping) 사진을 나타낸 것이다.
도 12는 ZIF@GOx@PB 나노구조체의 pH 7.4, 6.0, 5.0 버퍼에서의 투과 전자 현미경 (TEM) 사진을 나타낸 것이다.
도 13은 다양한 농도의 포도당 수용액 내에 ZIF@GOx@PB 나노구조체를 분산시켰을 때에, 시간에 따른 pH 변화를 측정한 결과이다.
도 14는 다양한 농도의 포도당 수용액 내에 분산된 ZIF@GOx@PB 나노구조체가 시간이 지남에 따라 점차적으로 분해되면서 누적되는 Zn 이온의 방출량을 유도 결합 플라즈마 (ICP) 로 측정한 결과이다.
도 15A는 pH에 따라 프루시안 블루 나노효소에 의해 과산화수소가 환원, TMB가 산화되면서 일으키는 색 변화 (O.D.652 nm)를 UV-Vis 흡광도 스펙트럼으로 측정한 결과이고, 도 15B는 상기 반응에 대한 반응식을 나타낸 것이다.
도 16은 과산화수소의 농도에 따라 프루시안 블루 나노효소에 의해 과산화수소가 환원, TMB가 산화되면서 일으키는 색 변화를 (O.D.652 nm)를 UV-Vis 흡광도 값으로 측정한 결과이다.
도 17A는 ZIF@GOx@PB 나노구조체에 포함된 포도당 산화효소에 의해 포도당이 산화되면서 과산화수소가 발생하고, 프루시안 블루 나노효소에 의해 발생한 과산화수소가 환원, TMB가 산화되면서 일으키는 색 변화 (O.D.652 nm)를 UV-Vis 흡광도 스펙트럼으로 측정한 결과이며, 이 때, ZGP는 ZIF@GOx@PB 나노구조체를 가리킨다. 도 17B는 상기 연속 반응에 대한 반응식을 나타낸다.
도 18은 포도당의 농도에 따라 ZIF@GOx@PB 나노구조체에 포함된 포도당 산화효소에 의해 발생한 과산화수소가 프루시안 블루 나노효소에 의해 환원, TMB가 산화되면서 일으키는 색 변화 (O.D.652 nm)를 시간에 따른 UV-Vis 흡광도 값으로 측정한 결과이다.
도 19는 ZIF@GOx@PB 나노구조체의 포도당의 산화로 인해 개시된 연속 반응의 결과로 생성된 활성산소종 (ROS)을 형광 신호로 측정 가능하도록 정량화한 terephthalic acid (TA) assay 결과를 나타낸 것이다. 이 때, Z는 ZIF-8 나노구조체, ZG는 ZIF@GOx 나노구조체, ZP는 ZIF@PB 나노구조체, ZGP는 ZIF@GOx@PB 나노구조체를 가리킨다.
도 20A는 정상세포인 섬유아세포 (3T3-L1)에, 도 20B는 피부암세포 (SK-MEL28)에 제조예 1에서 합성한 4종의 나노구조체 (ZIF-8, ZIF@GOx, ZIF@PB, 및 ZIF@GOx@PB)를 처리한 경우, 세포 생존율을 나타낸 것이다. 이 때, Z는 ZIF-8 나노구조체, ZG는 ZIF@GOx 나노구조체, ZP는 ZIF@PB 나노구조체, ZGP는 ZIF@GOx@PB 나노구조체를 가리킨다.
도 21은 제조예 1에서 합성한 4종의 나노구조체 (ZIF-8, ZIF@GOx, ZIF@PB, 및 ZIF@GOx@PB)가 피부암세포에 미치는 영향을 생존/사멸세포 염색법 (Live/dead staining)을 통해 정성적으로 나타낸 형광 현미경 사진이다.
도 22는 제조예 1에서 합성한 4종의 나노구조체 (ZIF-8, ZIF@GOx, ZIF@PB, 및 ZIF@GOx@PB)를 피부암세포에 처리한 후, 암세포 내부에 형성된 활성산소종을 DCFH-DA staining을 통해 정성적으로 나타낸 형광 현미경 사진이다.
도 23은 피부암세포에 제조예 1에서 합성한 (i) ZIF@GOx@PB 나노구조체를 처리한 경우 (ii) ZIF@PB 나노구조체와 포도당 산화효소 (GOx)를 병용 투여한 경우, (iii) ZIF@GOx 나노구조체와 프루시안 블루 나노효소 (PB)를 병용 투여한 경우, 세포 생존율을 나타낸 것이다. 이 때, ZG는 ZIF@GOx 나노구조체, ZP는 ZIF@PB 나노구조체, ZGP는 ZIF@GOx@PB 나노구조체를 가리킨다.
도 2는 균일한 크기로 합성된 ZIF-8 입자의 (A), (B) 주사 전자 현미경 (SEM) 사진과 (C) 투과 전자 현미경 (TEM) 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 최적화 조건이 아닌 경우 합성된 ZIF-8 입자의 주사 전자 현미경 (SEM) 사진으로, 왼쪽은 아세트산 아연과 2-메틸이미다졸을 상온에서 5 분간 반응시켜 제조한 것이고, 오른쪽은 질산 아연과 2-메틸이미다졸을 80℃에서 5 분간 반응시켜 제조한 것이다.
도 4는 다양한 농도의 포도당 산화효소 (GOx)와 프루시안 블루 나노효소 (PB)를 이용하여 합성한 ZIF@GOx@PB 나노구조체의 크기를 나타내는 DLS 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 다양한 농도의 포도당 산화효소 (GOx)와 프루시안 블루 나노효소 (PB)를 이용하여 합성한 ZIF@GOx@PB 나노구조체의 촉매 활성 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 나노구조체 제조를 위해 필요한 금속 및 유기물의 농도와 부피, 합성 조건과 과정을 나타낸 모식도이다.
도 7은 제조예 1에서 합성한 4종의 나노구조체 (ZIF-8, ZIF@GOx, ZIF@PB, 및 ZIF@GOx@PB)의 주사 전자 현미경 (SEM) 사진을 나타낸 것이다.
도 8은 제조예 1에서 합성한 4종의 나노구조체 (ZIF-8, ZIF@GOx, ZIF@PB, 및 ZIF@GOx@PB)의 입자 크기를 나타내는 동적 광산란(DLS) 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 제조예 1에서 합성한 4종의 나노구조체 (ZIF-8, ZIF@GOx, ZIF@PB, 및 ZIF@GOx@PB)의 표면 전하를 나타내는 제타 전위 (zeta potential) 값을 나타낸 것이다.
도 10은 제조예 1에서 합성한 4종의 나노구조체 (ZIF-8, ZIF@GOx, ZIF@PB, 및 ZIF@GOx@PB)의 열중량분석 (thermogravity analysis) 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 프루시안 블루 나노효소와 포도당 산화효소를 포함하는 금속-유기골격체를 포함하는 나노구조체 (ZIF@GOx@PB)의 주사 투과 전자 현미경 (STEM) 사진 및 원소 맵핑 (elemental mapping) 사진을 나타낸 것이다.
도 12는 ZIF@GOx@PB 나노구조체의 pH 7.4, 6.0, 5.0 버퍼에서의 투과 전자 현미경 (TEM) 사진을 나타낸 것이다.
도 13은 다양한 농도의 포도당 수용액 내에 ZIF@GOx@PB 나노구조체를 분산시켰을 때에, 시간에 따른 pH 변화를 측정한 결과이다.
도 14는 다양한 농도의 포도당 수용액 내에 분산된 ZIF@GOx@PB 나노구조체가 시간이 지남에 따라 점차적으로 분해되면서 누적되는 Zn 이온의 방출량을 유도 결합 플라즈마 (ICP) 로 측정한 결과이다.
도 15A는 pH에 따라 프루시안 블루 나노효소에 의해 과산화수소가 환원, TMB가 산화되면서 일으키는 색 변화 (O.D.652 nm)를 UV-Vis 흡광도 스펙트럼으로 측정한 결과이고, 도 15B는 상기 반응에 대한 반응식을 나타낸 것이다.
도 16은 과산화수소의 농도에 따라 프루시안 블루 나노효소에 의해 과산화수소가 환원, TMB가 산화되면서 일으키는 색 변화를 (O.D.652 nm)를 UV-Vis 흡광도 값으로 측정한 결과이다.
도 17A는 ZIF@GOx@PB 나노구조체에 포함된 포도당 산화효소에 의해 포도당이 산화되면서 과산화수소가 발생하고, 프루시안 블루 나노효소에 의해 발생한 과산화수소가 환원, TMB가 산화되면서 일으키는 색 변화 (O.D.652 nm)를 UV-Vis 흡광도 스펙트럼으로 측정한 결과이며, 이 때, ZGP는 ZIF@GOx@PB 나노구조체를 가리킨다. 도 17B는 상기 연속 반응에 대한 반응식을 나타낸다.
도 18은 포도당의 농도에 따라 ZIF@GOx@PB 나노구조체에 포함된 포도당 산화효소에 의해 발생한 과산화수소가 프루시안 블루 나노효소에 의해 환원, TMB가 산화되면서 일으키는 색 변화 (O.D.652 nm)를 시간에 따른 UV-Vis 흡광도 값으로 측정한 결과이다.
도 19는 ZIF@GOx@PB 나노구조체의 포도당의 산화로 인해 개시된 연속 반응의 결과로 생성된 활성산소종 (ROS)을 형광 신호로 측정 가능하도록 정량화한 terephthalic acid (TA) assay 결과를 나타낸 것이다. 이 때, Z는 ZIF-8 나노구조체, ZG는 ZIF@GOx 나노구조체, ZP는 ZIF@PB 나노구조체, ZGP는 ZIF@GOx@PB 나노구조체를 가리킨다.
도 20A는 정상세포인 섬유아세포 (3T3-L1)에, 도 20B는 피부암세포 (SK-MEL28)에 제조예 1에서 합성한 4종의 나노구조체 (ZIF-8, ZIF@GOx, ZIF@PB, 및 ZIF@GOx@PB)를 처리한 경우, 세포 생존율을 나타낸 것이다. 이 때, Z는 ZIF-8 나노구조체, ZG는 ZIF@GOx 나노구조체, ZP는 ZIF@PB 나노구조체, ZGP는 ZIF@GOx@PB 나노구조체를 가리킨다.
도 21은 제조예 1에서 합성한 4종의 나노구조체 (ZIF-8, ZIF@GOx, ZIF@PB, 및 ZIF@GOx@PB)가 피부암세포에 미치는 영향을 생존/사멸세포 염색법 (Live/dead staining)을 통해 정성적으로 나타낸 형광 현미경 사진이다.
도 22는 제조예 1에서 합성한 4종의 나노구조체 (ZIF-8, ZIF@GOx, ZIF@PB, 및 ZIF@GOx@PB)를 피부암세포에 처리한 후, 암세포 내부에 형성된 활성산소종을 DCFH-DA staining을 통해 정성적으로 나타낸 형광 현미경 사진이다.
도 23은 피부암세포에 제조예 1에서 합성한 (i) ZIF@GOx@PB 나노구조체를 처리한 경우 (ii) ZIF@PB 나노구조체와 포도당 산화효소 (GOx)를 병용 투여한 경우, (iii) ZIF@GOx 나노구조체와 프루시안 블루 나노효소 (PB)를 병용 투여한 경우, 세포 생존율을 나타낸 것이다. 이 때, ZG는 ZIF@GOx 나노구조체, ZP는 ZIF@PB 나노구조체, ZGP는 ZIF@GOx@PB 나노구조체를 가리킨다.
본 발명자들은 과산화효소 모방 효소 중 프루시안 블루 나노효소 (prussian blue nanoparticle; PB)와 포도당 산화 효소 (glucose oxidase; GOx)를 함께 포집하는 금속-유기 골격체 (MOF)의 일종인 제올라이트형 이미다졸레이트 골격체 (ZIF-8)를 포함하는 나노구조체를 개발하였으며, 상기 나노구조체가 상기 나노구조체가 프루시안 블루 나노효소에 의한 화학역학 치료법과 포도당 산화 효소에 의한 단식 치료법의 시너지 효과로 암세포 내에서 pH 감소에 따라 붕괴되고, 일련의 연속적인 효소 반응을 통해 암세포를 사멸한다는 점을 확인하였다.
보다 구체적으로, 상기 나노구조체는 금속-유기 골격체를 포함하여 정상 세포에서 프루시안 블루 나노효소와 포도당 산화 효소를 안정적으로 저장하고 전달할 수 있으며, 생체 적합성을 향상시킬 수 있다. 한편, 상기 나노구조체는 암세포에서 포도당 산화 효소가 암세포의 에너지원인 포도당의 공급을 차단하면서, 글루콘산 (gluconic acid)과 과산화수소 (H2O2)를 생성하고, 글루콘산은 pH를 감소시키고, 과산화수소는 프루시안 블루 나노효소에 의해 암세포 내부에 해로운 활성산소를 생성함으로써 암세포에 대해서 특이적으로 독성을 나타낸다.
이에, 본 발명은 포도당 산화효소 및 과산화효소 모방 효소를 포함하는 금속-유기골격체를 포함하는 나노구조체를 제공한다.
본 발명에서, 용어 “포도당 산화효소 (glucose oxidase; GOx)”는 포도당을 글루콘산으로 산화시키는 효소를 의미하며, "프루시안 블루 나노효소 (Prussian blue nanoparticle; PB)”는 철 기반의 나노물질로 산성 조건에서 활성산소종 (ROS)를 효과적으로 유발하는 과산화효소 (peroxidase) 활성을 가진 효소를 의미한다.
본 발명에서, 용어 “나노구조체”는 적어도 하나의 영역 또는 특성 치수(예컨대, 높이, 길이, 두께, 직경 등)가 1 μm 미만인 구조체를 의미하고, 일부 실시형태들에 있어서, 나노구조체는 약 500 nm 미만, 약 200 nm 미만, 약 100 nm 미만, 약 50 nm 미만, 약 20 nm 미만, 또는 약 10 nm 미만의 치수를 갖는다. 통상적으로, 영역 또는 특성 치수는 구조체의 가장 작은 축을 따라 있을 것이다. 그러한 구조체들의 예들은, 나노와이어들, 나노로드들, 나노튜브들, 분기된 나노구조체들, 나노테트라포드들, 트리포드들, 바이포드들, 나노결정들, 나노도트들, QD들, 나노입자들 등을 포함한다. 나노구조체들은, 예를 들면, 실질적으로 결정질, 실질적으로 단결정질, 다결정질, 비정질, 또는 이들의 조합일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 나노구조체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 암의 발생, 확산 또는 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, 용어 "유효성분으로 포함"은 원하는 생물학적 효과를 실현하는데 필요하거나 또는 충분한 양으로 해당 성분이 포함되는 것을 의미한다. 실제 적용에 있어서 유효 성분으로 포함되는 양의 결정은 대상 질병을 치료하기 위한 양으로서, 다른 독성을 야기하지 않는 사항을 고려해서 결정될 수 있으며, 예를 들어 치료되는 질병 또는 병태, 투여되는 조성물의 형태, 피험체의 크기, 또는 질병 또는 병태의 심각도 등과 같은 다양한 인자에 따라서 변화될 수 있다. 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 지닌 기술자라면 과도한 실험을 동반하지 않고 개별적 조성물의 유효량을 경험적으로 결정할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "약학적 조성물 (pharmaceutical composition)"은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 “개체”는 유방암의 예방 또는 치료가 필요한 가축, 인간 등의 포유류라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 인간일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개체에 투여하기 위해 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에서, "담체 (carrier)"란 비이클 (vehicle)이라고도 불리며, 세포 또는 조직 내로의 단백질 또는 펩타이드의 부가를 용이하게 하는 화합물을 의미하는 것으로서, 예를 들어 디메틸술폭사이드 (DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기물의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다. 상기 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상의 혼합물일 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수도 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수도 있다. 더 나아가, 당분야의 적정한 방법으로, 또는 Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수도 있다.
본 발명에서, "희석제 (diluent)"란 대상 단백질 또는 펩타이드의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 단백질 또는 펩타이드를 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다. 여기에 사용된 아젤라산을 함유하는 화합물들은 인간 환자에게 그 자체로서, 또는 결합 요법에서와 같이 다른 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 약학적 조성물로서, 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 약학적으로 유효한 양으로 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 본 발명의 용어 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지는 않으며, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 나노구조체 이외에 공지된 항암제를 추가로 포함할 수 있고, 이들 질환의 치료를 위해 공지된 다른 치료와 병용될 수 있다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안 된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
제조예 1. 프루시안 블루 나노효소와 포도당 산화효소를 포집하는 금속-유기골격체를 포함하는 나노구조체 (ZIF@GOx@PB)의 제조
1.1.
프루시안 블루 나노효소 (PB) 합성
먼저, 10 mM의 FeCl3·6H2O와 5 mmol의 citric acid가 담긴 (1) 수용액 20 mL와 10 mM의 K4[Fe(CN)6]와 5 mmol의 citric acid가 담긴 (2) 수용액 20 mL를 60℃로 충분히 가열하였다. (1) 수용액이 담긴 플라스크에 (2) 수용액을 한꺼번에 가하여 1 분을 반응시킨 후, 5 분간 상온에서 냉각하였다. 동량의 아세톤을 가하여 침전시킨 후, 13000 rpm에 25 분간 넉넉히 원심분리를 진행하였다. 상층액은 버리고 에탄올, 물을 차례로 가하여 2번 더 세척을 진행하였고, 마지막 단계에서 일정량의 3차 증류수를 가한 후 충분한 초음파 세척기 처리를 통하여 합성된 프루시안 블루 나노효소 (PB)를 고르게 분포시켰다(도 1A). 합성된 PB의 농도는 유도 결합 플라즈마 (ICP) 분석을 통해 측정하였다.
1.2.
금속-유기골격체로서 제올라이트형 이미다졸레이트 골격체 (ZIF-8) 합성
2-메틸이미다졸 500 (2-methylimidazole 500)과 질산아연 헥사수화물 500 (zinc nitrate hexahydrate 500)을 이용하여 금속-유기골격체 중 하나인 제올라이트형 이미다졸레이트 골격체 (ZIF-8)을 제조하였다.
하기 표 1과 같이 금속의 종류와 농도, 유기체의 종류와 농도, 합성 온도, 합성 시간에 대한 최적화를 진행하였다.
| Metal | Organic | Temperature | Time | ||
| Zinc acetate (ZA) | 40 mM | 2-Methylimidazole (2-Mim.) |
640 mM | RT | 5 min |
| 80 mM | 2.363 M | ||||
| 120 mM | 2.8 M | ||||
| Zinc nitrate (ZN) | 40 mM | Methyl-2-imidazolecarboxaldehyde | 640 mM | 80 ℃ | 20 min |
| 80 mM | 2.363 M | ||||
| 120 mM | 2.8 M | ||||
그 결과, 주사 전자 현미경 (SEM) 및 투과 전자 현미경 (TEM) 이미징을 통해, 1:70의 몰 비율로 맞춰진 질산아연 40 mM과 2-메틸이미다졸 2.8 mM을 상온 조건에서 5 분간 반응시킬 때에, 가장 균일하고 작은 사이즈의 안정적인 ZIF-8 입자가 합성된다는 점을 확인하였다 (도 2).
반면, 아세트산아연 (zinc acetate)와 2-메틸이미다졸을 이용하여 상온에서 5 분간 반응시킨 경우, ZIF-8 입자의 크기가 균일하지 않았으며, 질산아연과 2-메틸이미다졸을 이용하여 80℃에서 20 분간 반응시킨 경우, ZIF-8 입자가 안정적으로 형성되지 않았다.
1.3.
ZIF@GOx@PB 나노구조체 합성을 위한 GOx 및 PB 함량 최적화
작고 균일한 크기를 가지는 ZIF@GOx@PB 나노구조체의 효율적인 합성을 위하여 포도당 산화효소 (GOx) 및 프루시안 블루 나노효소 (PB)의 함량을 세분화하여 농도 조건을 최적화하였다.
각 농도 조건에서 동적 광산란 (DLS)을 이용하여 크기를 측정한 결과, 포도당 산화효소가 0,5 mg, 프루시안 블루 나노효소가 30 μg인 경우, 제조된 ZIF@GOx@PB 나노구조체의 크기는 298 nm (PDI 0.123)이었으며, 포도당 산화효소가 0,75 mg, 프루시안 블루 나노효소가 30 μg인 경우, 제조된 ZIF@GOx@PB 나노구조체의 크기는 296 nm (PDI 0.129)로 가장 작은 크기가 측정되었다 (도 4).
한편, 각 농도 조건에서 포도당 산화효소의 촉매 활성을 평가한 결과, 포도당 산화효소가 0,5 mg, 프루시안 블루 나노효소가 30 μg인 경우, 제조된 ZIF@GOx@PB 나노구조체의 흡광도는 O.D. 652 nm에서 2.212였으며, 포도당 산화효소가 0,75 mg, 프루시안 블루 나노효소가 30 μg인 경우, 제조된 ZIF@GOx@PB 나노구조체의 흡광도는 O.D. 652 nm에서 2.140으로 가장 높은 활성을 나타냈다 (도 5).
즉, 크기가 가장 작고 균일하여 세포 내의 함입 (cell internalization)이 용이하며 촉매 활성 효율이 가장 높게 평가된 0.5 mg의 포도당 산화효소와 30 μg의 프루시안 블루 나노효소를 이용하여 ZIF@GOx@PB 나노구조체 합성하는 것으로 최적화하였다.
1.4.
본 발명의 ZIF@GOx@PB 나노구조체 합성
유효물질로서 제조예 1.1에서 합성한 프루시안 블루 나노효소 (PB)와 포도당 산화효소 (GOx)를 각각 0.002% (30 μg), 0.05% (0.5 mg) 내외 함량으로 40 mM의 질산아연 헥사수화물 500 (zinc nitrate hexahydrate 500) (B 수용액) 500 μL에 첨가하고 초음파 세척기 처리를 한다. 상기 B 수용액을 2.8 M의 2-메틸이미다졸 500 (2-methylimidazole 500) (A 수용액) 500 μL에 첨가하고 균일하게 혼합한 후, magnetic bar를 이용한 stirring 과정을 통해 상온에서 5분간 반응시켰다. 3회의 원심분리와 세척 과정을 거쳐 3차 증류수에 고르게 분포시켰고(도 6), 최종적으로 프루시안 블루 나노효소와 포도당 산화효소를 포함하는 ZIF@GOx@PB 나노구조체를 합성하였다.
비교군으로 제조예 1.2에서 최적화하여 합성한 ZIF-8 나노구조체와, 포도당 산화효소를 포집한 ZIF-8 금속-유기골격체를 포함하는 ZIF@GOx 나노구조체, 프루시안 블루 나노효소를 포집한 ZIF-8 금속-유기골격체를 포함하는 ZIF@PB 나노구조체를 제조하였다.
실험예 1. ZIF@GOx@PB 나노구조체의 물리적 특성 확인
상기 제조예 1에서 합성된 ZIF@GOx@PB 나노구조체가 잘 형성되었는지 확인하고, 물리적 특성을 평가하기 위하여 주사 전자 현미경 (SEM), 동적 광산란 (dynamic light scattering; DLS), 제타 전위 (Zeta potential), 열중량분석 (Thermogravity analysis; TGA) 및 주사 투과 전자 현미경 (STEM) 분석을 수행하였다.
4종의 나노구조체(ZIF-8, ZIF@GOx, ZIF@PB, 및 ZIF@GOx@PB)를 주사 전자 현미경 (SEM)으로 관찰한 결과, 유효물질과 금속-유기골격체를 5분간 반응시킨 경우 약 200 ~ 400 nm 크기의 결정형 구조가 만들어졌고, 입자 크기는 함유된 유효물질의 구성에 따라 조금씩 달라졌다 (도 7).
상기 4종의 나노구조체를 동적 광산란 (DLS)으로 측정한 결과, ZIF-8 나노구조체의 입자 크기는 284 nm, ZIF@GOx 나노구조체의 입자 크기는 316 nm, ZIF@PB 나노구조체의 입자 크기는 320 nm, ZIF@GOx@PB 나노구조체의 입자 크기는 367 nm로 (도 8), SEM 관찰 결과와 일치하였다.
상기 4종의 나노구조체의 표면 전하를 알아보기 위해 제타 전위 (zeta potential)를 측정한 결과, ZIF-8 나노구조체의 표면 전하값은 +13 mV, ZIF@GOx 나노구조체의 표면 전하값은 -31 mV, ZIF@PB 나노구조체의 표면 전하값은 +15 mV, ZIF@GOx@PB 나노구조체의 표면 전하값은 -26 mV였으며, ZIF-8 나노구조체와 ZIF@PB 나노구조체는 (+)의 표면 전하값을, ZIF@GOx 나노구조체와 ZIF@GOx@PB 나노구조체는 (-)의 표면 전하값을 가짐을 확인하였다 (도 9).
상기 4종의 나노구조체의 열적 안정성 및 금속-유기골격체에 포집된 유효물질의 포집 비율을 확인하기 위해, 열중량분석(TGA)을 수행한 결과, 금속-유기골격체를 포함하는 경우, 열이 가해져도 유효물질을 안정적으로 저장할 수 있다는 점을 확인하였다 (도 10).
프루시안 블루 나노효소 (PB)와 포도당 산화효소 (GOx)를 포함하는 금속-유기골격체 (MOF)를 포함하는 나노구조체 (ZIF@GOx@PB)의 주사 투과 전자 현미경 (STEM) 및 원소 맵핑 (elemental mapping)을 관찰한 결과, 목적하는 유효 물질 두 가지(PB, GOx)가 금속-유기골격체인 제올라이트형 이미다졸레이트 골격체 (ZIF)에 잘 포집되었음을 확인하였다 (도 11).
실험예 2. ZIF@GOx@PB 나노구조체의 pH-반응성 분해 및 약물 방출
상기 제조예 1에서 합성된 ZIF@GOx@PB 나노구조체가 암세포의 산성 환경 및 과량의 당이 존재하는 환경에서 분해되며 유효물질을 방출하는지 확인하기 위하여, 즉 충분한 pH-반응성을 가지는지 평가하기 위해 투과 전자 현미경 (TEM) 이미징, pH 측정 및 유도 결합 플라즈마 (ICP) 분석을 수행하였다.
pH 7.4, 6.0, 5.0 버퍼에서 ZIF@GOx@PB 나노구조체를 1 시간씩 담지한 후, 샘플을 채취하여 TEM 이미징을 수행한 결과, pH 값이 감소할수록 나노구조체가 붕괴하는 것을 확인하였다(도 12).
다양한 농도의 포도당 수용액 내에 ZIF@GOx@PB 나노구조체를 분산시킨 결과, ZIF@GOx@PB 나노구조체에 포함된 포도당 산화효소와 수용액 속 포도당 간의 반응에 의해 글루콘산 (gluconic acid)이 생성되어 pH가 감소하는 결과를 나타냈으며, 특히 포도당 수용액의 농도가 높을수록 pH가 더 큰 폭으로 급격하게 감소한다는 점을 관찰할 수 있었다(도 13).
다양한 농도의 포도당 수용액 내에 분산된 ZIF@GOx@PB 나노구조체가 분해되면서 누적되는 Zn 이온의 방출량을 유도 결합 플라즈마 (ICP) 로 측정하였다. 상술한 바와 같이 시간이 지날수록 포도당 산화효소와 포도당이 반응하여 글루콘산을 생성함으로써 pH가 감소했으며, ZIF@GOx@PB 나노구조체의 금속-유기골격체는 아연 (Zn)과 메틸 이미다졸로 구성되므로, 상기 나노구조체가 분해되면서 Zn 이온을 방출하였다(도 14).
실험예 3. 프루시안 블루 나노효소 및 ZIF@GOx@PB 나노구조체의 촉매 활성 평가
프루시안 블루 나노효소 (PB)와 이를 포함하는 상기 제조예 1에서 합성된 ZIF@GOx@PB 나노구조체의 촉매 활성을 평가하기 위하여 UV-Vis 흡광도 측정 및 TA 분석법을 수행하였다.
먼저, 프루시안 블루 나노효소를 이용한 과산화수소의 비색 측정을 위해, 0.5 mM TMB, 100 ng/ml PB를 포함하는 1 mM의 과산화수소 수용액을 pH 5.0, 6.0, 7.0 버퍼 바탕으로 준비하였다. 최종 부피 1mL가 되도록 상온에서 5분간 반응시킨 후, 파란색 (O.D. 652 nm)으로 변한 산화 TMB의 흡광도를 측정하였다. 그 결과, pH 5.0에서 1.9627, pH 6.0에서 1.1961, pH 7.0에서 0.4167으로 나타났으며, 과산화수소가 없는 경우에는 아무런 흡광도 변화를 보이지 않았다 (도 15). 이는 프루시안 블루 나노효소가 pH 5.0에서 과산화수소를 가장 잘 환원시킨다는 점을 시사한다.
한편, pH 5.0에서 다양한 농도의 과산화수소 조건에서 프루시안 블루 나노효소의 비색 측정 결과, 과산화수소의 농도에 비례해 산화된 TMB가 띠는 O.D.652 nm에서 흡광도 세기가 증가함을 알 수 있다 (도 16).
다음으로, 상기 프루시안 블루 나노효소를 포함하는 ZIF@GOx@PB 나노구조체의 비색 측정을 위해, 1.0 mM TMB, 100 ng/ml ZIF@GOx@PB 나노구조체를 포함하는 20 mM의 포도당 수용액을 pH 5.0 버퍼 바탕으로 준비하였다. 최종 부피 1mL가 되도록 상온에서 5분간 반응시킨 후, 파란색 (O.D. 652 nm)으로 변한 산화 TMB의 흡광도를 측정하였다. 그 결과, pH 5.0에서 0.7774으로 나타났으며, 포도당이 없는 경우에는 아무런 흡광도 변화를 보이지 않았다 (도 17).
한편, pH 5.0에서 다양한 농도의 포도당 조건에서 ZIF@GOx@PB 나노구조체의 비색 측정 결과, 포도당의 농도에 비례해 산화된 TMB가 띠는 O.D.652 nm에서 흡광도 세기가 증가함을 알 수 있다 (도 18). 이는 포도당이 존재하는 환경에서 ZIF@GOx@PB 나노구조체에 포함된 포도당 산화효소 (GOx)가 포도당을 산화하며 과산화수소를 생성하는 반응, 상기 나노구조체에 포함된 프루시안 블루 나노효소 (PB)가 생성된 과산화수소를 환원하면서 TMB를 산화시키는 반응이 순차적으로 일어난다는 점을 시사한다.
ZIF@GOx@PB 나노구조체에 포함된 포도당 산화효소가 촉매한 포도당의 산화로 인한 연속 반응의 결과, 생성된 활성산소종 (ROS)을 형광신호로 측정 가능하도록 terephthalic acid (TA) assay을 수행하였다. 그 결과, ZIF@GOx@PB 나노구조체를 함유한 경우 압도적으로 가장 커다란 세기의 형광이 방출되었고, ZIF@GOx@PB 나노구조체에서 가장 많은 양의 활성산소종을 방출함을 확인하였다 (도 19).
실험예 4. ZIF@GOx@PB 나노구조체의
in vitro
세포 독성 평가
ZIF@GOx@PB 나노구조체의 독성 및 항암 효과를 확인하기 위하여 섬유아세포 3T3-L1과 피부암 세포 SK-MEL28을 사용하여 MTT로 세포 독성을 평가하였다.
상기 제조예 1에서 합성한 4종의 나노구조체 (ZIF-8, ZIF@GOx, ZIF@PB, 및 ZIF@GOx@PB)를 정상세포인 섬유아세포 (3T3-L1)에 처리한 결과 0 ~ 12.5 μg/mL의 농도에서 아무런 세포 독성을 나타내지 않았다 (도 20A).
한편, 피부암세포 (SK-MEL28)에 처리한 결과, ZIF-8 나노구조체는 모든 농도에서 암세포 사멸을 유발하지 않았으며, ZIF@PB 나노구조체는 12.5 μg/mL의 농도에서 세포 생존율이 20% 정도 감소하였다. ZIF@GOx 나노구조체는 10.0 μg/mL 이상의 농도에서부터 세포 생존율이 감소하였으며, ZIF@GOx@PB 나노구조체는 5.0 μg/mL의 농도에서부터 세포 생존율이 30% 정도 감소해서 6.25 μg/mL에서 약 50%의 세포 생존율을 나타내었다 (도 20B).
상기 결과는 금속-유기골격체를 포함하는 4종의 나노구조체 모두 정상세포에 영향을 주지 않는 높은 생체 적합성을 가지나, 프루시안 블루 나노효소 (PB)와 포도당 산화효소(GOx)를 모두 포함하는 경우, 시너지효과에 의해 향상된 촉매 활성으로 훨씬 큰 암세포 사멸 효과를 나타낸다는 점을 시사한다.
상기 4종의 나노구조체가 피부암세포에 미치는 영향을 생존/사멸세포 염색법 (Live/dead staining)을 통해 정성적으로 분석한 결과, 피부암세포에 낮은 독성을 나타내는 ZIF-8 나노구조체와 ZIF@PB 나노구조체와 달리 ZIF@GOx 나노구조체와 ZIF@GOx@PB 나노구조체는 사멸세포의 형광 염색을 나타냈으며, 특히 ZIF@GOx@PB 나노구조체에서 가장 큰 암세포 사멸 효과를 보였다 (도 21).
상기 4종의 나노구조체를 처리한 후 피부암세포 내부에 형성된 활성산소종 (ROS)을 DCFH-DA staining을 통해 정성적으로 분석한 결과, ZIF-8 나노구조체, SIF@PB 나노구조체, ZIF@GOx 나노구조체와 비교하여 ZIF@GOx@PB 나노구조체에서 가장 많은 활성산소종이 형성되었음을 형광 염색을 통해 확인하였다 (도 22).
실험예 5. ZIF@GOx@PB 나노구조체와 병용투여의
in vitro
세포 독성 평가 비교
ZIF@GOx@PB 나노구조체의 항암 활성을 확인하기 위해, ZIF@GOx 나노구조체에 프루시안 블루 나노효소를 함께 투여한 비교군 1, ZIF@PB 나노구조체에 포도당 산화효소를 함께 투여한 비교군 2를 피부암 세포 SK-MEL28에 처리한 후, MTT로 세포 독성을 평가하였다. 이 때, 상기 실험군에서 모두 동일한 농도의 금속-유기골격체, 포도당 산화효소, 및 프루시안 블루 나노효소가 투여되도록 하였다.
그 결과, 포도당 산화효소와 프루시안 블루 나노효소를 모두 포집하는 금속-유기골격체를 포함하는 본 발명의 나노구조체가 가장 낮은 세포 생존율을 나타내었으며 (도 23), 이는 병용투여보다 포도당 산화효소와 프루시안 블루 나노효소를 하나의 나노구조체 내에 포함하는 경우, 화학역학 치료법과 단식 치료법의 시너지 효과가 가장 크게 나타난다는 점을 시사한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 ZIF@GOx@PB 나노구조체는 포도당 산화효소와 프루시안 블루 나노효소가 금속-유기골격체에 포집되어 있어 기질 간 물리적 거리가 단축되기 때문에 연속적인 촉매 반응 (cascade enzymatic reaction)에 유리하고, 포도당의 산화 결과 생성된 과산화수소가 인접한 프루시안 블루 나노효소와 바로 2차 효소 반응을 진행하기 때문에, 과산화수소가 확산하거나 자기분해하는 것을 최소화할 수 있기 때문에 가장 우수한 세포 독성 효과를 나타낸다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.
Claims (15)
- 포도당 산화효소 (glucose oxidase) 및 과산화효소 모방 효소 (peroxidase mimetic)를 포함하는 금속-유기골격체 (metal organic framework)를 포함하는 나노구조체.
- 제1항에 있어서,
상기 과산화효소 모방 효소는 프루시안 블루 나노효소 (Prussian blue nanoparticle)인 것을 특징으로 하는, 나노구조체.
- 제1항에 있어서,
상기 금속-유기골격체는 제올라이트형 이미다졸레이트 골격체 (zeolitic imidazole framework)인 것을 특징으로 하는, 나노구조체.
- 제1항에 있어서,
상기 나노구조체는 포도당의 공급을 차단하면서 활성산소종 (reactive oxygen species)을 생성하여 암세포를 특이적으로 사멸시키는 것을 특징으로 하는, 나노구조체.
- 제1항에 있어서,
상기 나노구조체는 pH 3 내지 7에서 분해되는 것을 특징으로 하는, 나노구조체.
- 제1항에 있어서,
상기 나노구조체의 크기는 200 내지 400 nm인 것을 특징으로 하는, 나노구조체.
- 제1항에 있어서,
상기 나노구조체의 제타 전위는 -10 내지 -30 mV인 것을 특징으로 하는, 나노구조체.
- 제1항의 나노구조체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제8항에 있어서,
상기 암은 피부암, 유방암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌 종양, 결장암, 직장암, 대장암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 외음부암, 신장암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 고환암, 후두암, 두경부암, 갑상선암, 간암, 방광암, 골육종, 림프종, 백혈병, 흉선암, 요도암, 및 기관지암으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인, 약학적 조성물.
- (1) 질산아연 헥사수화물 (zinc nitrate hexahydrate)에 포도당 산화효소 (glucose oxidase) 및 과산화효소 모방 효소 (peroxidase mimetic)를 첨가하는 단계;
(2) 상기 (1) 단계에서 생성된 용액에 2-메틸이미다졸 (2-methylimidazole)을 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(3) 상기 포도당 산화효소 및 과산화효소 모방 효소를 포함하는 금속-유기골격체 (metal organic framework)를 포함하는 나노구조체를 제조하는 단계;
를 포함하는 암세포를 특이적으로 사멸시키는 나노구조체의 제조방법.
- 제10항에 있어서,
상기 과산화효소 모방 효소는 프루시안 블루 나노효소인 것을 특징으로 하는, 나노구조체의 제조방법.
- 제11항에 있어서,
상기 프루시안 블루 나노효소는 FeCl3·6H2O와 citric acid가 담긴 수용액 및 K4[Fe(CN)6]와 citric acid가 담긴 수용액을 반응시키고, 아세톤을 추가로 첨가한 후, 원심분리를 진행하여 제조된 것을 특징으로 하는, 나노구조체의 제조방법.
- 제10항에 있어서,
상기 나노구조체는 나노구조체 100 중량부 기준으로,
포도당 산화효소 0.01 내지 0.1 중량부와 과산화효소 모방 효소 0.001 내지 0.01 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 나노구조체의 제조방법.
- 제10항에 있어서,
상기 (1) 단계에서 질산아연 헥사수화물의 농도는 10 내지 50 mM이고,
상기 (2) 단계에서 2-메틸이미다졸의 농도는 2.5 내지 5 M인 것을 특징으로 하는, 나노구조체의 제조방법.
- 제10항에 있어서,
상기 (2) 단계는 상온에서 1 내지 10 분 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는, 나노구조체의 제조방법.
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| KR102267519B1 (ko) | 2020-01-08 | 2021-06-21 | 경희대학교 산학협력단 | 뇌암세포 표적용 펩타이드로 표면 개질된 약물 전달용 나노입자, 이의 제조방법 및 이의 용도 |
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