CN107072951A - 用于递送生物活性物质或蛋白质的组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于递送蛋白质的组合物及利用其的生物活性物质或蛋白质的递送方法。

Description

用于递送生物活性物质或蛋白质的组合物及其用途
技术领域
本公开涉及一种用于递送生物活性物质或蛋白质的组合物及其用途。
背景技术
药物递送系统是指使以往医药品的副作用最小化且使效能和效果极大化来能够有效地递送所需量的药物，例如，蛋白质、核酸或其他低分子等的医药技术。最近，减少开发新药所需的费用和时间的所述技术与纳米技术相结合，以在医药界成为创造新的附加值的尖端技术的一个领域，而在如美国和日本等技术发达国家从过去80年代后半起，以制药公司等企业为中心，为开发新药和药物递送系统而竭尽全力。
到目前为止，病毒基因、重组蛋白、脂质体、阳离子聚合物及各种形状的纳米粒子和纳米物质被用来将药物递送到动物细胞中。然而，许多阳离子脂质体和阳离子聚合物被证明为由于强细胞毒性而在临床应用方面不适合。并且，为了稳定的核酸的细胞膜透过而对核酸的主链进行化学变形的方法也被试图。但是，上述方法成本高，花费很长时间，需要劳动密集的工序，因此不适合临床应用。作为有意义的试图，利用包括量子点、磁性粒子或金纳米粒子的各种形式的纳米粒子的药物递送系统(drug delivery system，DDS)被开发了。例如，“利用多孔硅粒子的图像诊断药物载体及其制备方法(韩国公开专利第2010-0117433号)”等相关研究被公开。然而，上述粒子具有细胞毒性和难以导入核酸等生物聚合物的结构，且细胞内导入效率也较低。
为了细胞中的蛋白质功能研究或蛋白质的细胞递送，需要有效的蛋白质递送系统。但是，与共同带负电荷的DNA和RNA等核酸不同地，蛋白质不具有共同的电荷，不稳定，从而容易变性。因此，尚未开发可普遍适用的蛋白质递送系统。目前开发的蛋白质递送系统难以保持蛋白质的活性，且难以共同适用于各种蛋白质，因此使用受到限制。
发明内容
发明要解决的问题
本公开的一实施方式涉及一种用于递送生物活性物质或蛋白质的组合物及其用途。
本公开的一实施方式将提供包括多孔二氧化硅纳米粒子的用于递送蛋白质的组合物、利用所述用于递送蛋白质的组合物的用途(例如，药学上可接受的用途)及蛋白质递送方法，其可以通过将蛋白质导入到多孔二氧化硅纳米粒子的气孔中来递送给目标细胞中，在所述递送过程中能够抑制由于体内分解酶的所述蛋白质的分解，通过在其表面上结合抗体、配体、细胞渗透性肽或适体而可以促进所述生物聚合物导入到细胞中，或能够选择性地诱导对特定细胞的导入。
然而，本公开的技术问题并不限定于以上所述的技术问题，通过下述的记载，从业者可以明确地理解到未提及或者其他的技术问题。
用于解决问题的方案
本公开的一实施方式涉及一种用于递送生物活性物质或蛋白质的组合物及其用途。
本公开的一实施方式将提供包括多孔二氧化硅纳米粒子的用于递送蛋白质的组合物、利用所述用于递送蛋白质的组合物的用途(例如，药学上可接受的用途)及蛋白质递送方法，其可以通过将蛋白质导入到多孔二氧化硅纳米粒子的气孔中来递送给目标细胞中，在所述递送过程中能够抑制由于体内分解酶的所述蛋白质的分解，通过在其表面上结合抗体、配体、细胞渗透性肽或适体而可以促进所述生物聚合物导入到细胞中，或能够选择性地诱导对特定细胞的导入。
然而，本公开的技术问题并不限定于以上所述的技术问题，通过下述的记载，从业者可以明确地理解到未提及或者其他的技术问题。
发明的效果
根据本公开的一实施方式，可以提供高效的用于递送蛋白质的组合物或用于递送生物活性物质的组合物。根据本公开的一实施例的用于递送蛋白质的组合物或用于递送生物活性物质的组合物能够将蛋白质或生物活性物质导入到多孔二氧化硅纳米粒子的气孔内部或外部，因此，在将蛋白质或生物活性物质导入到细胞中时少受外部环境的影响，可以稳定地保持所述蛋白质或生物活性物质的结构，从而递送效率较高。并且，通过还包括结合于所述多孔二氧化硅纳米粒子的表面(作为非限制性实例，所述粒子的外部表面)上的抗体、配体、细胞渗透性肽或适体来得到细胞内导入效率也显著提高的效果，或具有仅向目标细胞选择性地导入的效果。
在本公开的一实施方式中，仅通过简单混合包含多孔二氧化硅纳米粒子的溶液和所述蛋白质或生物活性物质来可以将所述蛋白质或生物活性物质导入到所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔中，且无需化学结合、交联结合或复杂的纯化分离过程，因此简单且成本低。
在本公开的一实施方式中，所述二氧化硅纳米粒子具有高单分散性，生物相容性卓越，不呈现细胞毒性，因此，在临床上可用来治疗疾病。
附图说明
图1为示出根据本公开的一实施例的表面改性的二氧化硅纳米粒子的实例。
图2为根据本公开的一实施例的用于递送药物的组合物及其细胞内作用的示意图。
图3为根据本公开的一实施例的导入有包括蛋白质的多孔二氧化硅纳米粒子的细胞的荧光显微镜图像。
图4为根据本公开的一实施例的导入有包括蛋白质的多孔二氧化硅纳米粒子的细胞的荧光显微镜图像。
图5为根据本公开的一实施例的导入有包括蛋白质的多孔二氧化硅纳米粒子的细胞的染色图像。
图6为根据本公开的一实施例的导入有包括蛋白质的多孔二氧化硅纳米粒子的细胞的ONPG分析图表。
图7为根据本公开的一实施例的导入有包括蛋白质的多孔二氧化硅纳米粒子的细胞中蛋白质分解酶的影响的分析图表。
图8为根据本公开的一实施例的导入有包括蛋白质的多孔二氧化硅纳米粒子的细胞中关于是否蛋白质正常起作用的分析图表。
图9为根据本公开的一实施例的导入有包括蛋白质的多孔二氧化硅纳米粒子的细胞中关于是否蛋白质正常起作用的分析图表。
图10a和图10b分别为示出根据本公开的一实施例的MSNPN的合成和TAMRA-标记MSNPN的合成的示意图。
图11示出根据本公开的一实施例的蛋白酶体-MSNPN的相互作用和SDS-PAGE图像。
图12a、图12b及图12c分别示出根据本公开的一实施例的经过纯化的蛋白酶体的(a)一维SDS-PAGE和CBB染色、(b)通过suc-LLVY-AMC可视化的非变性凝胶分析及(c)利用针对CP和RP亚基的各种抗体的免疫印迹分析结果。
图13为示出根据本公开的一实施例的使用MSNPN、蛋白酶体及MSNPN-蛋白酶体复合物的suc-LLVY-AMC水解分析的图表(RFU：相对荧光单位)。
图14为示出根据本公开的一实施例的蛋白酶体和蛋白酶体-MSNPN的(a)免疫印迹和(b)咪唑洗脱测定结果的图像。
图15为示出根据本公开的一实施例的MSNPN及蛋白酶体-MSNPN的(a)透射电子显微镜(TEM)图像和(b)动态光散射(dynamic light scattering；DLS)分析结果的图表。
图16为示出根据本公开的一实施例的蛋白酶体及蛋白酶体-MSNPN的体外蛋白酶体分解分析结果的SDS-PAGE/IB图像。
图17a和图17b分别为示出用根据本公开的一实施例的TAMRA-标记的MSNPN或蛋白酶体-MSNPN进行处理的HeLa细胞的(a)荧光显微镜图像和(b)TEM图像。箭头表示在细胞质局部化的MSNPN。
图18为示出本公开的一实施例的根据(a)MSNPN和(b)蛋白酶体-MSNPN的浓度的细胞毒性的图表。
图19为示出在根据本公开的一实施例的蛋白酶体-MSNPN的在各种pH条件下的suc-LLVY-AMC分析结果的图表。
图20为示出本公开的一实施例的根据(a)Dox的处理期间和(b)处理浓度的可诱导的tau细胞系的结果的图像。
图21为示出根据本公开的一实施例的在用Dox、MSNPN及蛋白酶体-MSNPN对可诱导的tau细胞系进行处理时的SDS-PAGE/IB图像和定量分析结果的图表。
图22为示出根据本公开的一实施例的在Dox、MSNPN及蛋白酶体-MSNPN的细胞处理时(a)通过外部蛋白酶体进行翻译后tau调节的图表和(b)MG132处理细胞的SDS-PAGE/IB图像。
图23为根据本公开的一实施例的利用tau免疫染色和DAPI复染色的荧光显微镜分析图像。
图24为根据本公开的一实施例的表面改性的多孔二氧化硅纳米粒子的合成示意图。
图25为示出根据本公开的一实施例的用于递送蛋白质的组合物被导入到细胞中的状态的图像。
图26示出针对通过根据本公开的一实施例的用于递送蛋白质的组合物的RNase递送和功能有效性的分析结果。
图27为示出通过根据本公开的一实施例的用于递送蛋白质的组合物的RNase递送和据此的肿瘤大小减少的图表。
图28a和图28b为用于评价通过根据本公开的一实施例的用于递送蛋白质的组合物的抗体递送的(a)小鼠模型和(b)荧光图像。
具体实施方式
以下，参照附图说明本公开的实施例，以便本领域普通技术人员能够易于实施本公开。
然而，要注意的是，本公开并不限于该些说明性的实施方式和实施例，而是可以以各种其他方式来实现。在附图中，为简化说明，省略与描述无关的部件，并且整个文档使用类似的参考标号表示类似的部件。
在本公开的整个文件中，术语“上(on)”被用于指定一个元件相对于另一个元件的位置，包括两种情况：所述一个元件靠近所述另一个元件；这两个元件之间存在任意其它元件。
在本公开的整个文件中，除非上下文另有规定，否则，文档中使用的术语“包含或包括”和/或“含有或包括有”意指除了所述的组件、步骤、操作和/或元件以外，并不排除一个或多个其它组件、步骤、操作和/或元件的存在或添加。在本公开的整个文件中，程度的术语“约或大致”或“基本”意指具有接近指定的具有容许误差的数值或范围的含义，并旨在防止用于理解本发明所公开的准确的或绝对的数值被任何不合情理的第三方不正当或非法地使用。在本公开的整个文件中，术语“…的步骤(step of)”并不意指“用于…的步骤(stepfor)”。
在本公开的整个文件中，马库什型描述中包含的术语“……的组合”是指从马库什型描述的组件、步骤、操作和/或元件组成的组中选择的一个或多个组件、步骤、操作与/或元件的混合或组合，从而意味着本公开包括从马库什组中选择的一个或多个组件、步骤、操作和/或元件。
在本公开的整个文件中，“A和/或B”形式的措辞意指“A或B，或A和B”。
在本公开的整个文件中，“生物活性物质(bioactive agent)”是指包括在给药之后可在物理、生理、精神、生物化学、生物学上影响到授予人(动物对象)或可以积极或消极的方式影响到授予人(动物对象)的其他身体功能的任何药剂的物质。
例如，所述“生物活性物质”可包括药物、蛋白质、肽、miRNA、siRNA、DNA、质粒DNA、小分子、抗体、病毒、微生物、体细胞核、细胞器、线粒体、酶、辅助营养剂、维生素、天然产物、提取物或其他活性药剂，但不限于此。所述生物活性物质选自由蛋白质、肽、核苷、核苷酸、内源性配体、神经递质、激素、自体有效物质、细胞因子、抗病毒剂、抗癌剂、抗生素、氧增强剂、含氧剂、抗癫痫剂及抗炎药物组成的组。例如，所述生物活性物质可以选自由降钙素、环孢菌素、胰岛素、催产素、酪氨酸、脑啡肽、促甲状腺激素释放激素、促卵泡激素、黄体生成激素、生长激素、花生四烯酸、血小板活化因子(PAF)、血管紧张素、奎宁、前列腺素、白细胞三烯、血栓素，类花生酸、加压素和加压素类似物、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、白细胞介素、干扰素、TGF-β、BMP、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子抑制剂及黑素细胞-刺激激素组成的组。生物活性物质可以包括阿尔茨海默氏症拮抗剂或疫苗。用于治疗阿耳茨海默氏病的生物活性物质可以包括盐酸美金刚(Merz Pharmaceuticals的)、盐酸多奈哌齐(Eisai Co.Ltd的)、酒石酸卡巴拉汀(Novatis的)、盐酸加兰他敏(Johnson&Johnson的)或盐酸他克林(Parke Davis的)。生物活性物质选自由药学有效量的硫酸软骨素、透明质酸、生长因子及蛋白质组成的组。
例如，所述生物活性物质包括胰岛素或胰岛素类似物。其选自由胰岛素增敏剂、胰岛素促分泌素、GLP-1类似物、GLP-2、GLP-2类似物、二肽基肽酶4抑制剂(DPP-4抑制剂)、艾塞那肽、利拉鲁肽、albiglutide或他司鲁泰、α-葡萄糖苷酶抑制剂、淀粉不溶素类似物、2型钠葡萄糖共转运蛋白(SGLT2)抑制剂、苯氟雷司及托瑞司他组成的组。在另一实施例中，含胰岛素纳米粒子包括微量的锌或钙或进行肠溶片处理。在一实施例中，生物活性药剂可以包括选自由非胰岛素艾塞那肽、非胰岛素普兰林肽、胰岛素、胰岛素类似物及其组合组成的组中的物质，但不限于此。
例如，所述生物活性物质也可以选自由催产素、加压素、促性腺激素释放激素、促甲状腺激素释放激素、促甲状腺激素、促肾上腺皮质激素、催乳素、促黄体素释放素或促黄体激素释放激素、生长激素、生长激素促分泌因子、生长抑素、胰高血糖素、干扰素、胃泌素、四肽胃泌素、五肽胃泌素、尿抑胃素、分泌素、降钙素、脑啡肽、内啡肽、血管紧张素、肾素、缓激肽、杆菌肽、多粘菌素、粘菌素、短杆菌酪肽、短杆菌肽、醛固酮、氢化可的松、可的松、雌二醇、雌激素、孕酮、睾酮、甲状腺素及其合成类似物、变体和药理学活性片段、单克隆抗体及可溶性疫苗组成的组。生长激素(GH)为在人或其它动物中刺激生长和细胞繁殖的肽类激素。这是在垂体前叶的侧翼部中由生长刺激细胞合成、存储及分泌的191-氨基酸的单链多肽激素。
例如，所述生物活性物质选自由细胞毒性药物、抗病毒药、抗肿瘤药、抗炎药、抗生素、镇痛药物、作用于CNS的药物、质子泵抑制剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂、钙拮抗剂、组胺受体拮抗剂、胆固醇生物合成抑制剂、糖尿病剂、阿尔茨海默病剂、免疫抑制剂、合成抗微生物剂、抗肿瘤剂或其任意组合组成的组。活性药物部分可以包括如嘌呤等抗代谢物伪装(masquerade)、顺铂、卡铂、奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、鬼臼毒素、依托泊苷、替尼泊苷、多西紫杉醇或紫杉醇。
在本公开的整个文件中，“蛋白质”应被理解为不仅包括目标特异性蛋白质，还包括免疫球蛋白、糖蛋白、抗体、多肽、酶或肽。目标蛋白质、多肽及肽包括血红蛋白、血清蛋白、例如，包含因子Ⅶ、Ⅷ及Ⅸ的血液因子；免疫球蛋白、如白介素即IL-1至IL-13等细胞因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、凝集素、糖结合蛋白、糖蛋白、SUMO糖蛋白、优选为干扰素，如将在下面更详细地描述的凝集素、包括粒细胞集落刺激因子的集落刺激因子、血小板衍生的生长因子及磷脂酶激活蛋白(PLAP)，但不限于此。一般的生物学或治疗对象的其它蛋白质包括胰岛素、如VEGF等新血管生成诱导因子、促红细胞生成素、如凝集素和蓖麻毒素等植物蛋白质、肿瘤坏死因子和相关蛋白、生长因子，例如，转化生长因子，例如，TGFα或TGFβ和表皮生长因子、激素、生长调节素、促红细胞生成素、色素性激素、下丘脑释放因子、抗利尿激素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、促卵泡激素、促甲状腺激素、组织纤溶酶原激活剂等。蛋白质部分选自由免疫球蛋白、糖蛋白、抗体、多肽、酶、肽、干扰素(INF)、白细胞介素、激素、生长调节素、红细胞生成素、色素性激素、下丘脑释放因子、抗利尿激素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、促卵泡激素、促甲状腺激素及组织纤溶酶原激活剂组成的组。
蛋白质的实例可以包括荧光蛋白、辣根过氧化物酶(HRP)、胱天蛋白酶-3、脂肪酶、光解酶、超氧化物歧化酶(SOD)、肉毒杆菌毒素、来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶(thyamidinekinase from herpes simplex virus，HSV-TK)、胱天蛋白酶、血管内皮生长因子(VEGF)、尿酸氧化物、β-葡糖苷酶、β-己糖胺酶或鼠抗CD3抗体等。
在下文中，将详细描述本公开的实施方式。然而，本公开可以不限于以下实施方式。
本公开的一个方面可以提供用于递送蛋白质的组合物，所述用于递送蛋白质的组合物包括含有平均孔径为1nm以上至100nm以下的气孔的多孔二氧化硅纳米粒子、和结合于所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的内表面或外表面且赋予表面负电荷或正电荷的官能团或与蛋白质特异性结合的配体。
现有多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的平均直径仅为数纳米，因此具有如蛋白质等生物聚合物无法充分进入到所述气孔内部的缺点。然而，与用于递送药物的现有多孔二氧化硅纳米粒子相比，根据本公开的一实施例的多孔二氧化硅纳米粒子不仅气孔的平均直径显著扩大，而且蛋白质通过气孔的内表面或外表面的表面负电荷、正电荷或与蛋白质特异性结合的配体吸附或装载，因此，可以使生物活性物质或蛋白质更容易包含在所述气孔内部或外部。并且，根据本公开的一实施例的多孔二氧化硅纳米粒子不仅具有扩大大小的气孔，而且扩大的气孔形成在所述粒子的整个外面和内面，所述扩大的气孔还形成在所述粒子内部深处，从而，可以将生物活性物质或蛋白质更容易地包含在所述粒子的外面和内面的气孔。
在本公开的一实施例中，所述与蛋白质特异性结合的配体可以包括镍、镍-NTA(次氮基三乙酸nitrilotriacetic acid)、谷胱甘肽、糊精、生物素或链霉亲和素，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述用于递送蛋白质的组合物还可包括通过结合于所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔表面上的配体与所述蛋白质的标签(tag)相结合来吸附或装载在所述多孔二氧化硅纳米粒子中的所述蛋白质，但不限于此。
在本公开的一实施例中，还可包括所述蛋白质通过赋予所述表面负电荷或正电荷的配体与蛋白质之间的静电相互作用来吸附或装载在所述二氧化硅纳米粒子的气孔中的所述用于递送蛋白质的组合物，但不限于此。
在本公开的一实施例中，对所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的内表面或外表面可以进行表面改性以便带阴离子及/或阳离子，但不限于此。由此，所述蛋白质可以通过与带阴离子及/或阳离子的所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的内表面或外表面之间的静电相互作用吸附或装载在所述气孔中，但不限于此。根据将要吸附或装载的蛋白质的pI值而可以调节为了使得带阴离子及/或阳离子而对所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的内表面或外表面进行表面改性，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述用于递送蛋白质的组合物还可包括结合于所述多孔二氧化硅纳米粒子的表面上的抗体、配体、细胞渗透性肽或适体，但不限于此。例如，所述抗体、配体、细胞渗透性肽或适体可以结合于所述多孔二氧化硅纳米粒子的外部表面，但不限于此。所述抗体、配体、细胞渗透性肽或适体使吸附或装载有所述蛋白质的所述组合物能够递送到目标细胞中。
在本公开的一实施例中，所述蛋白质可以包括选自由如蛋白酶体等蛋白质复合物、如胱天蛋白酶、核糖核酸酶、激酶、磷酸酶等各种酶、各种抗体等组成的组中的物质，但不限于此。例如，所述蛋白质可以包括辣根过氧化物酶(HRP)、胱天蛋白酶-3、脂肪酶、光解酶、超氧化物歧化酶(SOD)、肉毒杆菌毒素、来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶(thyamidinekinase from herpes simplex virus，HSV-TK)、胱天蛋白酶、血管内皮生长因子(VEGF)、尿酸氧化物、β-葡糖苷酶、β-己糖胺酶或鼠抗CD3抗体等，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述蛋白质可以包括内源性配体、全身激素、细胞因子、趋化因子、神经递质物质、自体有效物质，膜蛋白质、细胞质中蛋白质、细胞核中蛋白质、受体、酶、血液中蛋白质、合成蛋白质、合成肽、生长因子及如调节细胞的分化和增殖的另一种蛋白质等参与正常愈合过程的调控因子和报告为具有可治疗伤口能力的生长因子，而神经递质物质可以包括选自由如多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、乙酰胆碱、GABA、血清素、组胺、脑啡肽、生长抑素或物质P等胺类递质、肽类递质等组成的组中的物质，但不限于此。细胞因子和激素可以包括选自由肽类激素、氨基酸类激素、类固醇类激素、如转化生长因子-β超家族(TGF-β)蛋白质、巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)及蛋白酶体等蛋白质复合物、如胱天蛋白酶、核糖核酸酶、激酶、磷酸酶等各种酶、各种抗体等组成的组中的物质，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述蛋白质可以来源于原生动物、微生物、病毒、鱼、深海生物、两栖动物、爬行动物、哺乳动物、外来植物和动物的细胞，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述组合物包含药剂学上接受的载体。包含于本公开的组合物中的药剂学上接受的载体作为制剂时通常所使用的物质，包含乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不限于此。本公开的药剂学组合物除了上述成分之外还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂及保鲜剂等。药剂学上接受的适合的载体和制剂详细地记载于Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed.，1995)。
在本公开的一实施例中，所述药剂学组合物可经口服或肠胃外施用。当肠胃外施用时，可通过静脉内、皮下、肌肉内、腹腔及经皮等施用。
根据本公开的一实施例的药剂学组合物的适合的给药量可根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病状、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应感应性等因素开多种处方。例如，本公开的药剂学组合物以约0.0001至约100mg/kg的日剂量施用。
在本公开的一实施例中，根据本领域技术人员已知的常规技术，所述药剂学组合物可利用上述药学可接受载质和/或赋形剂来制成制剂，从而提供包括单元剂型和多剂型的多种剂型。此时，制剂可为油或水介质中的溶液、悬浮液、糖浆剂或乳液的形态、或还可以为浸膏剂、散剂、粉剂、颗粒剂、片剂及胶囊剂形态，且还可包括分散剂或稳定剂。
本公开的另一方面可以提供用于递送生物活性物质的组合物，所述用于递送生物活性物质的组合物包括：含有平均孔径为1nm以上至100nm以下的气孔的多孔二氧化硅纳米粒子；结合于所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的内表面或外表面且赋予表面负电荷或正电荷的官能团(配体)或与蛋白质特异性结合的配体；及结合于所述配体的生物活性物质。
在本公开的一实施例中，与所述生物活性物质特异性结合的配体可以包括镍、镍-NTA、谷胱甘肽、糊精、生物素或链霉亲和素，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述生物活性物质可以通过静电相互作用吸附或装载在所述气孔中，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述生物活性物质可以包括药物、蛋白质、肽、miRNA、siRNA、酶、辅助营养剂、维生素、天然产物或提取物，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述用于递送生物活性物质的组合物还可包括结合于所述多孔二氧化硅纳米粒子的表面上的抗体、配体、细胞渗透性肽或适体，但不限于此。
在本公开的一实施例中，提供包括将所述用于递送生物活性物质的组合物导入到目标细胞中的步骤的生物活性物质递送方法，从而可以用作药剂学用途。
在本公开的一实施例中，提供利用本公开的图1的多孔二氧化硅粒子或用于递送生物活性物质的组合物的用于预防或改善疾病或症状的食物组合物。
在本公开的一实施例中，对所述食物组合物没有特别限制，可以包括所有形式，例如功能健康食品、营养补充品、营养品、药用食品、健康食品、营养制品、设计食品或食品添加剂等，例如，肉、香肠、面包、巧克力、糖果、点心、甜品、比萨、拉面、其他面条类、口香糖、包括冰激凌类的乳制品、各种汤、饮料、茶、饮品、酒精饮料以及多种维生素制剂等。
在本公开的一实施例中，所述食物组合物包括在制造食品时通常添加的成分，例如，包括蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养素、调味剂及香味剂。作为所述碳水化合物，例如有作为单糖的葡萄糖、果糖等、作为二糖的麦芽糖、蔗糖、寡糖等以及作为多糖的糊精、环糊精等的普通的糖及木糖醇、山梨糖醇及赤藓糖醇等的糖醇。作为香味剂，可使用天然香味剂(索马甜、甜叶菊提取物(例如，莱鲍迪苷A、甘草甜素等))及合成香味剂(糖精、阿斯巴甜等)。
在本公开的一实施例中，所述食物组合物可以包括多种营养剂、维生素、矿物(电解质)、膳食成分、合成风味剂以及天然风味剂等的风味剂、着色剂以及增进剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸以及其盐，褐藻算以及其盐，有机酸、保护性胶体增调剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、用于碳酸饮料的碳酸剂等。例如，在本公开的一实施例中，在食物组合物制备成提神饮料的情况下，除了本公开的有效成分之外，还可包含柠檬酸、液态果糖、食糖、葡萄糖、醋酸、苹果酸、果汁或各种植物提取液等。
在本公开的一实施例中，提供利用本公开的图1的多孔二氧化硅粒子或用于递送生物活性物质的组合物的用于预防或改善相关疾病的化妆品组合物(功能性化妆品组合物)。
在本公开的一实施例中，所述化妆品组合物可以制造成所属技术领域通常制造的任意剂型形式，除了有效成分之外，还可包括通常用于制造化妆品的各种成分，比如，抗氧化剂、稳定剂、溶解剂、维生素、颜料及香料等常用辅助剂。
现有多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的平均直径仅为几纳米，因此具有如蛋白质等生物聚合物无法充分进入到所述气孔内部的缺点。然而，与用于递送药物的现有多孔二氧化硅纳米粒子相比，根据本公开的一实施例的多孔二氧化硅纳米粒子不仅气孔的平均直径显著扩大，而且蛋白质通过气孔的内表面或外表面的表面负电荷、正电荷或与蛋白质特异性结合的配体吸附或装载，因此，可以使生物活性物质或蛋白质更容易包含在所述气孔内部或外部。并且，根据本公开的一实施例的多孔二氧化硅纳米粒子不仅具有扩大大小的气孔，而且扩大的气孔形成在所述粒子的整个外面和内面，所述扩大的气孔还形成在所述粒子内部深处，从而，可以将生物活性物质或蛋白质更容易地包含在所述粒子的外面和内面的气孔。
根据本公开的一实施例，在所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔内部或外部可以包括生物活性物质或蛋白质，但不限于此。
根据本公开的一实施例，对所述多孔二氧化硅纳米粒子可以进行表面改性，但不限于此。
根据本公开的一实施例，对所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的内表面或外表面可以进行表面改性以便带阴离子及/或阳离子，但不限于此。由此，所述生物活性物质可以通过与带阴离子及/或阳离子的所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的内表面或外表面之间的静电相互作用吸附或装载在所述气孔中，但不限于此。根据将要吸附或装载的生物活性物质的pI值而可以调节为了使得带阴离子及/或阳离子对所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的内表面或外表面进行表面改性，但不限于此。
在本公开的一实施例中，在对所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的内部表面进行改性而带阴离子的情况下(例如，由硅烷醇、磷酸盐、羧酸盐等进行表面改性的情况)，可以用来吸附或装载带阳离子的生物功能物质。
在本公开的一实施例中，在对所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的内部表面进行改性而带阳离子的情况下(例如，胺基、阳离子性聚合物等进行表面改性的情况)，可以用来吸附或装载带阴离子的生物功能物质。
在本公开的一实施例中，在通过与特定标签结合的物质或配体对所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的内部表面进行改性的情况下(例如，由镍-NTA、谷胱甘肽、糊精、链霉亲和素或亲和素等进行表面改性的情况:其分别可以与his-标签、GST、MBP、生物素或生物素标签相结合)，可以用来吸附或装载包含特定标签的生物活性物质，但不限于此。
在本公开的一实施例中，可以利用用于上述气孔的内部表面改性的物质或配体对所述多孔二氧化硅纳米粒子的外部表面进行改性，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述多孔二氧化硅纳米粒子的外部表面可以由细胞渗透性肽(细胞内递送效率提高)、聚乙二醇(防止对粒子外部表面的非选择性生物分子吸附或装载，且防止粒子的凝聚现象)、磷脂酰乙基胺、抗体、适体或配体等进行改性，但不限于此。例如，所述抗体、适体或配体等可以将所述用于递送生物活性物质或蛋白质的组合物选择性地递送到特定细胞或特定器官。
根据本公开的一实施例，如本公开的图1所示，所述多孔二氧化硅纳米粒子可以由镍、镍-NTA、谷胱甘肽或生物素进行表面改性，但不限于此。所述生物活性物质中的标签与所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔结合来能够有效地支持在所述气孔中。例如，通过镍或镍-NTA进行表面改性的多孔二氧化硅纳米粒子的镍与生物活性物质的His-标签产生非共价相互作用，从而所述生物活性物质可以被吸附或装载在所述气孔中。为了吸附或装载具有GST-标签的生物活性物质，可以通过谷胱甘肽对多孔二氧化硅纳米粒子进行表面改性，但不限于此。
根据本公开的一实施例，可以提供包括吸附或装载在具有扩大的气孔的多孔二氧化硅纳米粒子的生物活性物质的用于递送生物活性物质的组合物，但不限于此。
根据本公开的一实施例的多孔二氧化硅纳米粒子可以使纳米粒子表面及/或气孔内部带正电荷或负电荷，因此，将带正电荷的蛋白质和带负电荷的生物活性物质都可以附着于所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔内部。并且，由于本公开的多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的平均直径较大，因而可以容纳较大的生物活性物质。即，不受生物活性物质的表面电荷和生物活性物质的大小的限制，也可以将所述蛋白质容易导入到细胞内部。
例如，所述多孔二氧化硅纳米粒子可以具有单分散性，但不限于此。上述单分散性为分子量的分布范围或粒子大小范围很窄的特性，尤其，纳米物质的单分散性对于与纳米粒子的大小有关的系统性药物递送系统设计不可缺少的。在用于递送的组合物的细胞内吸收及/或药效的决定方面，除了纳米物质的形状及/或表面的化学特性之外，所述单分散性也可以成为一个要素。
例如，所述多孔二氧化硅纳米粒子具有可调节的气孔和粒子大小、宽表面积、大气孔体积、表面官能化的容易性或少有细胞毒性或没有细胞毒性，因此具有高生物相容性，但不限于此。
例如，所述多孔二氧化硅纳米粒子具有对刺激产生反应的门开闭系统，从而可以适用于可调节的控释系统，但不限于此。例如，所述多孔二氧化硅纳米粒子可以在其气孔具有可开闭的门，而通过外部的刺激调节所述门的开闭，因此，可以调节是否释放包含在所述气孔上的药物、释放时期或释放量等，但不限于此。
例如，所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔可以通过石蜡盖等从外部遮断，而若受一定温度以上的刺激，例如，若受石蜡熔融温度以上的刺激，则所述石蜡盖可被熔融，以使气孔露出，但不限于此。或者，例如，所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔旁边平时结合有高分子，从而防止气孔中的药物等向外部泄漏，但若受到酶等的刺激，则所述高分子可被切断，以使所述气孔露出，但不限于此。
例如，所述功能性蛋白质或蛋白质药物可以被包含在所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔中，但不限于此。通过将所述蛋白质包含在所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔中来可以从包括外部的蛋白质分解酶或血清蛋白质的细胞内外的环境保护所述蛋白质，但不限于此。从上述外部分解酶保护生物分子的功能是作为药物载体或功能性高分子载体具有临床意义的重要因素之一。并且，为了从包括各种所述分解酶或所述血清蛋白质的细胞内外的环境保护所述蛋白质，无需如锁核酸(LNA)、O-甲基化或硫代磷酸酯核酸等需要花费劳动和时间、成本高的化学变形，因此，制造简易且成本低。
例如，所述多孔二氧化硅纳米粒子可以包括用于跟踪其位置的荧光染料，但不限于此。例如，所述多孔二氧化硅纳米粒子可以在其表面上包括荧光染料，但不限于此。
例如，将蛋白质吸附或装载在所述多孔二氧化硅纳米粒子的过程可以包括通过在溶液中简单混合所述多孔二氧化硅纳米粒子和所述蛋白质来吸附或装载所述蛋白质，但不限于此。例如，将蛋白质吸附或装载在所述多孔二氧化硅纳米粒子的过程可以包括在包含磷酸盐缓冲液(PBS)的溶液中混合表面改性的多孔二氧化硅纳米粒子和所述蛋白质来进行培养，但不限于此。由于上述过程不要求化学结合、交联结合或复杂的纯化分离过程，因而能够通过简单、低成本、高效的模块方式进行过程。
例如，所述多孔二氧化硅纳米粒子可以不呈现细胞毒性且具有高生物相容性，但不限于此。此外，所述多孔二氧化硅纳米粒子还可以为药物递送效率提高及/或细胞中导入而无需额外的表面处理，但不限于此。
根据本公开的一实施例，所述多孔二氧化硅纳米粒子的表面或所述气孔中可以形成有正电荷或负电荷，而所述蛋白质可以通过所述正电荷或负电荷之间的静电相互作用吸附或装载在所述气孔中，但不限于此。
根据本公开的一实施例，所述抗体、配体、细胞渗透性肽或适体都包括促进通过细胞膜将外部物质导入到细胞中的肽，但不限于此。所述细胞渗透性肽可以为通过所述肽序列本身来促进向细胞内导入的细胞渗透性肽，或也可以为通过其他物质，例如，在蛋白质的帮助下促进向细胞内导入的细胞渗透性肽，但不限于此。
例如，所述细胞渗透性肽可以为在存在于细胞膜的蛋白质的帮助下促进向细胞内导入外部物质的细胞渗透性肽，但不限于此。细胞的细胞膜是为了防止外部物质进入到细胞中而存在的。然而，为了使得药物或报告(reporter)分子在细胞中发挥活性，需要将药物或报告分子有效地导入到细胞中。因此，通过将作为短链分子的阳离子肽结合到药物载体来可以应用于如小分子、核酸、抗体及/或纳米粒子等药物向细胞中的递送。
尽管未明确证实上述细胞渗透性肽的细胞导入机制，但据报告，通过各种机制实现细胞渗透。例如，所述机制包括能源依赖性内吞作用(energy dependent endocytosis)、能源独立性直接移位(energy independent direct translocation)等。在本公开中可使用的细胞渗透性肽可以通过所述两种机制中任一种机制将所述多孔二氧化硅纳米粒子导入到细胞中，但不限于此。
例如，虽然下表1和表2中列出作为所述细胞渗透性肽可使用的肽的种类，但不限于此。
[表1]
[表2]
对于上面列出的所述细胞渗透性肽的氨基酸序列，只要可以保持所述细胞渗透性肽的活性，就可以对其序列部分进行变形，但不限于此。
例如，所述细胞渗透性肽可以包括MPAP、TAT或多精氨酸，但不限于此。例如，所述MPAP可以具有肉豆蔻酸-ARRRRRRRC的氨基酸序列，所述TAT可以具有RKKRRQRRR的氨基酸序列，所述多精氨酸可以具有RRRRRRRRR(9个精氨酸)的氨基酸序列，但不限于此。
图2为根据本公开的一实施例的用于递送蛋白质药物的组合物的示意图。
参照图2，在本公开的一实施例中，由于小尺寸和粒子特性，所述多孔二氧化硅纳米粒子可以被细胞吸收(endocytosis)，因此，其可以与吸附或装载的蛋白质药物同时导入到细胞中。
在本公开的一实施例中，所述多孔二氧化硅纳米粒子可以通过胺、羧基、磷脂酰乙胺或聚乙二醇(PEG)被官能化，但不限于此。聚乙二醇可以通过所述磷脂酰乙胺或聚乙二醇结合到所述多孔二氧化硅纳米粒子的表面上，但不限于此。通过所述磷脂酰乙胺或聚乙二醇化可以防止所述多孔二氧化硅纳米粒子的凝聚，或使与另外生物分子之间的非特异性结合最小化，或减少除了气孔之外的RNA吸附或装载，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述多孔二氧化硅纳米粒子的平均大小可以为约0.1μm至约100μm，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的平均大小可以为约1nm以上至约100nm以下，但不限于此。例如，所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的平均大小可以为约1nm至约100nm、约10nm至约100nm、约20nm至约100nm、约30nm至约100nm、约40nm至约100nm、约50nm至约100nm、约60nm至约100nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约1nm至约90nm、约10nm至约90nm、或约20nm至约90nm、约30nm至约90nm、约40nm至约90nm、或约50nm至约90nm、约60nm至约90nm、约70nm至约90nm、或约80nm至约90nm、约1nm至约80nm、约10nm至约80nm、或约20nm至约80nm、约30nm至约80nm、约40nm至约80nm、或约50nm至约80nm、约60nm至约80nm、约70nm至约80nm、或约1nm至约70nm、约10nm至约70nm、约20nm至约70nm、或约30nm至约70nm、约40nm至约70nm、约50nm至约70nm、或约60nm至约70nm、约1nm至约60nm、约10nm至约60nm、或约20nm至约60nm、约30nm至约60nm、约40nm至约60nm、或约50nm至约60nm、约1nm至约50nm、约20nm至约50nm、或约30nm至约50nm、约40nm至约50nm、约1nm至约40nm、或约10nm至约40nm、约20nm至约40nm、约30nm至约40nm、或约1nm至约30nm、约10nm至约30nm、约20nm至约30nm、或约1nm至约20nm、约10nm至约20nm、约1nm至约10nm，但不限于此。
现有多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的平均直径仅为数纳米，因此具有如蛋白质等生物聚合物无法充分进入所述气孔内部的缺点。然而，与用于递送药物的现有多孔二氧化硅纳米粒子相比，根据本公开的一实施例的多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的平均直径显著扩大，因此，可以使生物活性物质或蛋白质更容易包含在所述气孔内部。并且，根据本公开的一实施例的多孔二氧化硅纳米粒子不仅具有扩大大小的气孔，而且扩大的气孔形成在所述粒子的整个外面和内面，所述扩大的气孔还形成在所述粒子内部深处，从而，可以将生物活性物质或蛋白质更容易地包含在所述粒子的外面和内面的气孔。
在本公开的一实施例中，所述多孔二氧化硅纳米粒子可以通过包括形成多孔二氧化硅纳米粒子的步骤和扩大所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的步骤的方法来制备，但不限于此。
例如，形成所述多孔二氧化硅纳米粒子的步骤可以包括从二氧化硅前体形成多孔二氧化硅纳米粒子，但不限于此。例如，从所述二氧化硅前体形成多孔二氧化硅纳米粒子还可包括使所述二氧化硅前体和包含表面活性剂的溶液相混合，但不限于此。例如，包含所述表面活性剂的溶液可以为还包括醇、水及氢氧化钠的溶液，但不限于此。例如，所述表面活性剂可以包括十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基三甲基溴化铵(TMABr)、十六烷基三甲基氯化吡啶(TMPrCl)或四甲基氯化铵(TMACl)，但不限于此。
例如，扩大所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的步骤可以包括利用膨胀剂进行扩大的过程，但不限于此。例如，所述膨胀剂可以包括三甲基苯(TMB)或N，N-二甲基十六烷基胺(DMHA)，但不限于此。
所述多孔二氧化硅纳米粒子的制备方法可以包括简单且易于大量合成的方法，但不限于此。例如，在利用实验室设备的情况下，通过所述制备方法可以每1次制备出至少约1g以上的所述多孔二氧化硅纳米粒子，但不限于此。
在本公开的一实施例中，扩大所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的步骤可以包括对所述多孔二氧化硅纳米粒子用三(C1-6烷基)苯进行处理来扩大气孔，但不限于此。例如，所述三(C1-6烷基)苯可以包括三甲基苯、三乙基苯、三丙基苯、三丁基苯、三戊基苯或三己基苯，但不限于此。例如，对所述多孔二氧化硅纳米粒子用三(C1-6烷基)苯进行处理来扩大气孔的步骤可以包括在约80℃至约200℃的温度下对包括所述多孔二氧化硅纳米粒子和三(C1-6烷基)苯的混合物进行加压处理，但不限于此。例如，对所述多孔二氧化硅纳米粒子用三(C1-6烷基)苯进行处理来扩大气孔的步骤可以包括在约80℃至约200℃、约80℃至约160℃、约80℃至约120℃、约120℃至约200℃、约160℃至约200℃、或约120℃至约160℃的温度下对包括所述多孔二氧化硅纳米粒子和三(C1-6烷基)苯的混合物进行加压处理的过程，但不限于此。
例如，通过扩大所述气孔的步骤可以将大小小于约5nm的气孔扩大到具有为约5nm至约100nm或约10nm至约100nm的大小的气孔，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述用于递送生物活性物质或蛋白质的组合物可以适用于血管注射用药物、口服给药用药物、经皮给药用药物或贴片、局部给药用药物、化妆品、软膏、食品、饮料、洗发水、洗涤剂、白血病、透析、血液移植、血管移植、牙科植入、牙种植、血管成形术、毛发移植、组织移植、器官移植、骨移植、核移植、细胞移植、生殖细胞移植、胚胎移植、动物克隆、转基因胚胎生产、转基因动物生产、干细胞生产、品质改良植物生产、异种核移植、异种器官移植、IPS细胞生产，例如，胚胎发生技术(显微注射、孤雌生殖、合子形成、核移植、卵裂球转移、卵裂球融合、IVF、ICSI等)、细胞分化诱导技术、干细胞疗法、细胞疗法、激素剂、治疗性抗体、胶囊、糖浆、研究用试剂、环境污染物净化、生化武器、减肥产品、成形术(颅面整形、下巴整形、乳房整形)等，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述用于递送生物活性物质或蛋白质的组合物可以适用于自体免疫疾病(湿疹、皮肤瘙痒症、哮喘、类风湿性关节炎)、固体肿瘤、血液肿瘤、脑疾病、心血管疾病、循环系统疾病、呼吸系统疾病、胃肠道疾病(胃肠道障碍、胃食管反流病、消化性溃疡病、胃溃疡)、炎性疾病、神经系统疾病、慢性疾病、急性疾病、老年性疾病、顽固性疾病、牙周病、口腔疾病、颅面疾病、缺血性疾病、肝脏疾病、肺疾病、皮肤疾病、细菌性疾病、病毒性疾病、传染性疾病、骨疾病(骨质疏松症、骨折等)、关节炎疾病、脊髓疾病、过敏性疾病、环境疾病、酒精性疾病、代谢紊乱、过敏性疾病、肾脏疾病、甲状腺疾病、生殖疾病、肿瘤性疾病、GERD、自身免疫性症状、糖尿病、遗传症状、病毒/细菌/寄生虫感染、寄生虫症状、躯体症状、朊病毒疾病、营养缺乏症、维生素/矿物质缺乏症、线粒体疾病、事故、性传播疾病、怀孕症状、哺乳症状、先天畸形、男/女/婴儿/儿童/青少年的症状、免疫功能紊乱、平衡失调、疼痛、全身残疾、血液症状、血管症状、神经症状、肌肉症状、心脏症状、背部/颈部/脊髓症状、眼部症状、脑症状、精神症状、鼻症状、口腔症状、牙齿症状、脚/腿/膝盖症状、上肢症状、肩部症状、耳部症状、肺症状、肝症状、肾虚症状、胆囊症状、胰腺症状、消化道症状、前列腺症状、男性生殖器症状、产科症状、妇科症状、甲状腺疾病、听力障碍、美容应用、色素沉着、脱发、生发、剃毛等，但不限于此。
本公开的另一方面可以提供一种蛋白质的递送方法，所述蛋白质的递送方法包括将用于递送蛋白质的组合物导入到目标细胞中的步骤，所述用于递送蛋白质的组合物包括：含有平均孔径为1nm以上至100nm以下的气孔的多孔二氧化硅纳米粒子；结合于所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的表面且赋予表面负电荷或正电荷的官能团或与蛋白质特异性结合的配体；及吸附或装载在所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔中的蛋白质。
在本公开的一实施例中，所述多孔二氧化硅纳米粒子的平均大小可以为约0.1μm至约100μm，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的平均大小可以为约1nm以上至约100nm以下，但不限于此。例如，所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的平均大小可以为约1nm至约100nm、约10nm至约100nm、约20nm至约100nm、约30nm至约100nm、约40nm至约100nm、约50nm至约100nm、约60nm至约100nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约1nm至约90nm、约10nm至约90nm、或约20nm至约90nm、约30nm至约90nm、约40nm至约90nm、或约50nm至约90nm、约60nm至约90nm、约70nm至约90nm、或约80nm至约90nm、约1nm至约80nm、约10nm至约80nm、或约20nm至约80nm、约30nm至约80nm、约40nm至约80nm、或约50nm至约80nm、约60nm至约80nm、约70nm至约80nm、或约1nm至约70nm、约10nm至约70nm、约20nm至约70nm、或约30nm至约70nm、约40nm至约70nm、约50nm至约70nm、或约60nm至约70nm、约1nm至约60nm、约10nm至约60nm、或约20nm至约60nm、约30nm至约60nm、约40nm至约60nm、或约50nm至约60nm、约1nm至约50nm、约20nm至约50nm、或约30nm至约50nm、约40nm至约50nm、约1nm至约40nm、或约10nm至约40nm、约20nm至约40nm、约30nm至约40nm、或约1nm至约30nm、约10nm至约30nm、约20nm至约30nm、或约1nm至约20nm、约10nm至约20nm、约1nm至约10nm，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述蛋白质可以包括选自由如蛋白酶体等蛋白质复合物、胱天蛋白酶、核糖核酸酶、激酶、磷酸酶等各种酶、各种抗体等组成的组中的物质，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述蛋白质可以包括选自由全身激素、细胞因子、生长因子及如调节细胞的分化和增殖的另一种蛋白质等参与正常愈合过程的调控因子和报告为具有可治疗伤口能力的生长因子、包括转化生长因子-β超家族(TGF-β)蛋白质、巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)的细胞因子和激素、如蛋白酶体等蛋白质复合物、如括胱天蛋白酶、核糖核酸酶、激酶、磷酸酶等各种酶、各种抗体等组成的组中的物质，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述将用于递送蛋白质的组合物导入到目标细胞中的步骤包括通过将所述用于递送蛋白质的组合物添加到细胞培养液中来导入到所述目标细胞中的步骤，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述将用于递送蛋白质的组合物导入到目标细胞中的步骤包括通过血管内给药、口服给药、经皮给药或注射局部给药方式将所述用于递送蛋白质的组合物导入到所述目标细胞中的步骤，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述多孔二氧化硅纳米粒子还可包括结合于所述多孔二氧化硅纳米粒子的表面上的抗体、配体、细胞渗透性肽或适体，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述多孔二氧化硅纳米粒子可以由镍、镍-NTA、谷胱甘肽、生物素或链霉亲和素进行表面改性，但不限于此。所述蛋白质中的标签与所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔结合来能够有效地支持在所述气孔中。例如，通过镍或镍-NTA进行表面改性的多孔二氧化硅纳米粒子的镍与蛋白质的His-标签产生非共价相互作用，从而所述蛋白质可以被吸附或装载在所述气孔中。为了吸附或装载具有GST-标签的蛋白质而可以通过谷胱甘肽对多孔二氧化硅纳米粒子进行表面改性，为了吸附或装载具有MBP-标签的蛋白质而可以通过糊精对多孔二氧化硅纳米粒子进行表面改性，为了吸附或装载具有生物素-标签的蛋白质而可以通过链霉亲和素对多孔二氧化硅纳米粒子进行表面改性，但不限于此。
根据本公开的一实施例的多孔二氧化硅纳米粒子可以使纳米粒子表面及/或气孔内部带正电荷或负电荷，因此，将带正电荷的蛋白质和带负电荷的蛋白质都可以附着于所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔内部。并且，由于本公开的多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的平均直径较大，因而可以容纳较大的蛋白质。即，不受蛋白质的表面电荷和蛋白质的大小的限制，也可以将所述蛋白质容易导入到细胞内部。
在本公开的一实施例中，将包括所述生物活性物质或蛋白质等的用于递送药物的组合物导入目标细胞中的过程可以通过细胞的吸收作用实现，但不限于此(图2)。例如，所述用于递送药物的组合物可以被导入细胞质中或核中，但不限于此。
例如，所述目标细胞可以为来自原核动物或真核动物的细胞，例如，可以为哺乳动物细胞，例如，可以为人源细胞，但不限于此。例如，所述细胞可以包括癌症、器官组织细胞、尤其，包括癌细胞、骨细胞、胃细胞、肠细胞、肺细胞、肝细胞、脑细胞、血管细胞、免疫细胞、红血细胞、白血细胞或淋巴细胞，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述蛋白质药物可以包括选自由如蛋白酶体等蛋白质复合物，如胱天蛋白酶、核糖核酸酶、激酶、磷酸酶等各种酶、各种抗体等组成的组中的物质，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述将用于递送蛋白质的组合物导入到目标细胞中的步骤包括通过将所述用于递送蛋白质的组合物添加到细胞培养液中来导入到所述目标细胞中的步骤，但不限于此。
在本公开的一实施例中，所述将用于递送蛋白质的组合物导入到目标细胞中的步骤包括通过血管内给药、口服给药、经皮给药或注射局部给药方式将所述用于递送蛋白质的组合物导入到所述目标细胞中的步骤，但不限于此。
例如，根据所述血管内给药，可以通过循环系统对全身递送蛋白质，但不限于此。例如，根据所述口服给药，主要向消化系统可容易递送蛋白质，但不限于此。
例如，根据所述经皮给药，可以通过皮肤递送蛋白质，但不限于此。例如，需要所述经皮给药的疾病包括特应性皮炎、脱发、色素沉着或皮肤病，但不限于此。
例如，所述注射局部给药方式可以适用于如眼睛、皮肤、粘膜或局部肿瘤组织等局部性组织，但不限于此。例如，当进行所述局部给药时，可以得到高生物可行性、对目标组织的接近性及/或降低在全身适用时通常伴随的副作用。例如，需要所述局部给药的疾病包括视力减退、特应性皮炎、亨廷顿氏病、慢性疼痛或多形性成胶质细胞瘤等，但不限于此。
下文中，本公开将参考以下实施例进行详细说明。然而，以下实施例仅出于解释说明的目的提供并且不旨在限制本公开的范围。
[实施例]
制备例1:气孔扩大的多孔二氧化硅纳米粒子(mesoporous silicananoparticle，MSN)的合成
将3.94g的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和2.28mL的1M氢氧化钠(NaOH)溶液溶解于800g的甲醇和水的混合溶液(甲醇:水＝0.4:0.6，w/w)中。然后，在剧烈搅拌所获得的溶液的同时，在大气条件下将1.3mL的四甲氧基硅烷(TMOS)添加到所述溶液中。在搅拌所述反应混合物8小时后，老化过夜。对所获得的白色沉淀物进行离心分离，清除剩下的表面活性剂来进行纯化，利用乙醇和水分别清洗5次。将如上所述制得的多孔二氧化硅纳米粒子混悬到20mL的乙醇中，添加4mL的盐酸。随后，将所述混悬液回流过夜，获得白色粉末。用滤波器对所产生的白色粉末进行滤波而分离，用乙醇清洗，从而制得具有2nm的气孔大小的多孔二氧化硅纳米粒子。
为了准备具有所扩大的气孔的多孔二氧化硅纳米粒子，在乙醇中对通过所述制备例所制得的多孔二氧化硅纳米粒子进行超声处理30分钟来分散，添加水和三甲苯(TMB)(以1:1混合比(v/v)总20mL)。然后，将所述混合物放入加压处理器(autoclave)，在160℃下保持48小时。利用乙醇和水分别清洗所产生的白色粉末5次。然后，将如上所述制得的多孔二氧化硅纳米粒子混悬到2M乙醇性HCl中，在加压器在120℃下加热20小时，从而清除有机表面活性剂(CTAB)。此后，对所获得的混合物进行过滤，用乙醇和水清洗10次，从而气孔扩大的MSN(图11a和图11b之1)。
制备例2:用Ni-NTA进行改性的二氧化硅纳米粒子(MSNPN)
在将100mg的所述制备例1中制备的气孔扩大的MSN混悬到10mL的甲苯中之后，为了胺官能化，添加1mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)。对所述混悬液进行回流过夜，然后利用过滤器进行过滤，用乙醇残留物清洗10次，从而获得由胺官能化的MSN(图10a和图10b之2)。在室温下使30mg的所述胺官能化的MSN和100mg的DMSO中的3，3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(DTSP)进行反应过夜。在用DMSO清洗反应混合物3次之后，添加10mL的DMSO中的Nα，Nα-双(羧甲基)-L-赖氨酸水合物(氨基丁基NTA，65mg)。在室温下进行所述反应24小时。然后，用乙醇和水分别清洗10次，从而获得NTA-改性的MSN。为了将Ni2+结合到NTA-改性的MSN，在1M水性NiSO4中分散所述纳米粒子，然后在室温下搅拌24小时，用乙醇和水分别清洗5次。在真空下对所产生的粉末(MSNPN)(图10a之3)进行干燥，分散在不含核酸酶的水中。直到使用前，在4℃下保管所述混悬液。
制备例3:结合有荧光物质的二氧化硅纳米粒子
将30mg的制备例2中制得的胺官能化的MSN(图10a和图10b之2)混悬到1mL的DMSO，向混悬液添加10μL的由以2.5mg/mL浓度包含在DMSO中的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯活化的羧基四甲基罗丹明(TAMRA-NHS)溶液。在室温下搅拌所述溶液3小时，然后进行离心分离，从而获得粉末(图10b之4)形式的TAMRA-结合MSN。与所述制备例2相同的工序将Ni-NTA导入到所述TAMRA-结合MSN，从而获得TAMRA-结合MSNPN(图10b之5)。
实施例1:气孔扩大的MSN的表面特性分析
为了分析MSN的表面积、气孔大小及气孔体积的物理特性而进行氮吸附或装载实验。氮吸附或装载等温线由NOVA吸附仪测定。
表面积由Brunauer-Emmett-Teller(BET)方法进行计算，而气孔大小的分布由Barrett-Joyner-Halenda(BJH)方法进行计算。结果如下表3所示。
[表3]
通过使用气孔扩大战略对具有镍部分(moiety)的新的多孔二氧化硅纳米粒子(MSNPN)进行合成，以便具有25nm至30nm的气孔大小，从而通过与蛋白酶体的His标签之间的非共价相互作用可以隐藏蛋
白酶体全酶分子(图11)。MSNPN的相对较宽的表面积(388m2/g)和气孔体积(1.47mL/g)也有利于将蛋白酶体吸附或装载、递送到其原状。
制备例4:表面带阴离子的MSN
利用水和乙醇对制备例1中制得的气孔扩大的多孔二氧化硅纳米粒子进行清洗数次，从而获得表面带阴离子的多孔二氧化硅纳米粒子。
制备例5:表面带阳离子的MSN
在将制备例1中制得的多孔二氧化硅纳米粒子混悬到甲苯中之后，为了胺官能化，添加1mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)。在清洗后，获得带阳离子的多孔二氧化硅纳米粒子。
实施例2:在气孔中包含蛋白质的多孔二氧化硅纳米粒子的细胞导入实验
在本实施例中，将蛋白质吸附或装载在表面带阴离子及/或表面带阳离子的在制备例4或制备例5中制得的多孔二氧化硅纳米粒子的气孔中，且将所述多孔二氧化硅粒子导入到细胞中，从而将所述蛋白质导入到细胞中。具体地，在1xPBS条件下，以1:10的重量比混合荧光(FITC)标记的牛血清白蛋白(BSA)蛋白质和多孔二氧化硅纳米粒子，然后在室温下培养30分钟。然后，通过将所述混合物混合到细胞培养液中来进行处理，从而将吸附或装载有所述蛋白质的所述多孔二氧化硅纳米粒子导入到细胞中。在改变所述处理时间的状态下进行观察后，更换结束处理的细胞的细胞培养液。图3中根据处理时间示出用包括荧光标记的牛血清白蛋白的多孔二氧化硅纳米粒子进行处理的细胞的荧光显微镜图像。
其次，通过相同的方法将荧光标记的IgG蛋白质吸附或装载在多孔二氧化硅纳米粒子的气孔中，将其导入到细胞中。导入的细胞的荧光显微镜图像如图4所示。
如图3和图4所示，可以确定荧光标记的BSA和IgG有效地导入到细胞中。
实施例3:β-半乳糖苷酶的细胞导入和蛋白质分解酶的影响分析
在本实施例中，通过将β-半乳糖苷酶(pI＝4.88)吸附或装载在带阳离子的多孔二氧化硅纳米粒子的气孔中来将其导入到细胞中，对细胞导入效率和蛋白质分解酶的影响进行分析。
首先，采用与所述实施例2相同的方法将不同浓度的β-半乳糖苷酶吸附或装载在多孔二氧化硅纳米粒子，在用其处理细胞4小时后，更换新的培养基。然后，培养4小时，固定细胞，用X-gal进行处理后，利用显微镜进行观察。
图5为示出利用显微镜观察的用所述X-gal染色的细胞的图像，从最上端向下分别导入吸附或装载2.5nM、5nM、10nM及20nM的β-半乳糖苷酶的多孔二氧化硅纳米粒子的细胞的图像。根据如图6所示，X-gal染色效率以依赖于β-半乳糖苷酶的浓度的方式提高，从而确定吸附或装载在所述多孔二氧化硅纳米粒子的β-半乳糖苷酶正常导入到细胞中。
其次，用单独β-半乳糖苷酶、单独多孔二氧化硅纳米粒子及吸附或装载有β-半乳糖苷酶的多孔二氧化硅纳米粒子分别处理细胞4小时，更换新的培养基，再培养4小时。然后，用邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)处理所述细胞，分别测定吸光度，用图表表示结果(参照图6)。根据如图6所示，在单独处理β-半乳糖苷酶或单独处理多孔二氧化硅纳米粒子的细胞的情况下，在ONPG分析中未出现吸光，但在用吸附或装载有β-半乳糖苷酶的多孔二氧化硅纳米粒子处理的细胞的情况下，观察到通过β-半乳糖苷酶产生的硝基酚(nitrophenol)的吸光。并且，吸光度以依赖于β-半乳糖苷酶的浓度的形式增加。从而确定吸附或装载有β-半乳糖苷酶的多孔二氧化硅纳米粒子正常导入到细胞中，而单独β-半乳糖苷酶无法导入到细胞中，且吸光度通过吸附或装载在多孔二氧化硅纳米粒子的状态下导入到细胞中的β-半乳糖苷酶而出现。
其次，将β-半乳糖苷酶分别吸附或装载在本公开的气孔扩大的多孔二氧化硅纳米粒子(Ex-MSNP)和气孔未扩大的具有2nm的平均气孔大小的多孔纳米粒子(NE-MSNP)，对所述Ex-MSNP、NE-MSNP及单独β-半乳糖苷酶分别进行糜蛋白酶处理(在37℃下12小时)，然后进行ONPG分析(参照图7)。根据如图7所示，在将β-半乳糖苷酶吸附或装载在气孔未扩大的多孔二氧化硅纳米粒子的情况下，β-半乳糖苷酶由所述糜蛋白酶进行分解，但在将β-半乳糖苷酶吸附或装载在气孔扩大的本公开的多孔二氧化硅纳米粒子的情况下，所述β-半乳糖苷酶从所述糜蛋白酶受保护，从而正常进行吸光。从而确定吸附或装载在本公开的多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的物质从外部环境受保护，以能够稳定地导入到细胞中。
实施例4:导入到细胞中的蛋白质功能分析
在本实施例中，图表示出关于在吸附或装载在多孔二氧化硅纳米粒子的气孔中的状态下导入到细胞中的蛋白质是否正常起作用的分析结果。为导入蛋白质而所使用的细胞系为HeLa细胞和MDA-MB-231细胞。
首先，在根据上面记载的实施例2将辣根过氧化物酶(HRP)蛋白质吸附或装载在带阳离子的多孔二氧化硅纳米粒子之后，用其和细胞培养液对HeLa细胞和MDA-MB-231细胞进行处理4小时。然后，利用PBS清洗所述细胞2次，用吲哚乙酸(IAA)进行处理。随后，通过进行毒性测验来调查HRP-IAA组合对各个细胞系带来的影响。根据图8的图表，在单独处理HRP蛋白质或单独处理多孔二氧化硅纳米粒子的细胞的情况下，未呈现细胞毒性，但在用吸附或装载有HRP蛋白质的多孔二氧化硅纳米粒子进行处理的细胞的情况下，可见通过HRP蛋白质的活性发生酶反应而将IAA转换成活性种，从而呈现细胞毒性，以降低细胞存活率。
其次，在根据上面记载的实施例2将不同浓度的RNase蛋白质吸附或装载在表面带阴离子的多孔二氧化硅纳米粒子之后，用其和细胞培养液对细胞进行处理，进行毒性测验。结果确定以依赖于吸附或装载在多孔二氧化硅纳米粒子的RNase蛋白质的浓度的形式呈现细胞毒性(参照图9)。
制备例6:蛋白酶体-多孔二氧化硅纳米粒子复合物的制备
在以各种摩尔比将经过纯化的蛋白酶体和制备例2中制得的MSNPN混悬到PBS中之后，在室温下以200rpm水平抖动2小时。对所产生的蛋白酶体-MSNPN复合物以3000rpm进行离心分离，清洗3次。为了向细胞中递送而将所述复合物再混悬到培养基中。
制备例7:26S人体蛋白酶的亲和纯化
从具有HTBH-标签的β4亚基的稳定的HEK293T细胞系亲和纯化出人体蛋白酶。在含有蛋白酶抑制剂、5mM ATP及1mM DTT的裂解缓冲液(50mM NaH2PO4、pH 7.5、100mM NaCl、10％甘油、5mM MgCl2、0.5％NP-40)中使用杜恩斯组织匀浆器(Wheaton)来对所述细胞进行同质化。将溶解物以10,000×g离心分离，将清澈的上清液与链霉亲和琼脂糖树脂(Millipore)在4℃下培养5小时。此后，在TEV蛋白酶-含有洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl、pH7.5、1mM MgCl2、10％甘油及1mM ATP)中培养所述树脂珠。在所述纯化条件下，从蛋白酶体上发现到内源性Usp14(图12)。通过His-标签的β4亚基进行亲和纯化的人体蛋白酶由SDS-PAGE/考马斯亮蓝(CBB)染色进行分析(图12a)。
从同时稳定表达His-标签和生物素-标签的β4亚基的HEK293-诱导细胞系有效地亲和纯化出活性人体26S蛋白酶体(图12)。与通过一般的方法经过纯化的蛋白酶体不同地，这种蛋白酶体具有松弛地结合于显著量的USP14、RP上的去泛素化酶和内部蛋白酶体抑制剂。
实施例5:透射电子显微镜(TEM)
以120kV通过LIBRA 120EF-TEM(Carl Zeiss，Germany)获得TEM图像。将各个MSN混悬液位于Formvar涂层的铜载网上，利用所蒸发的碳膜(Electron Microscopy Sciences，PA，USA)进行稳定化。在观察之前，在室温下干燥所述载网数小时。为了对MSNPN和吸附或装载有蛋白酶体的MSNPN的TEM图像进行比较，将各个样本位于所述载网上，利用0.5％醋酸铀进行染色。
实施例6:MSNPN上的蛋白酶体活性测定
为了测定吸附或装载在MSNPN上的蛋白酶体的活性，在PBS中，在4℃下培养12μg的纳米粒子溶液(10mg/mL)和2.4μg的蛋白酶体30分钟，从而制备出蛋白酶体-MSNPN复合物。然后，使用测定缓冲液(50mM Tris、pH7.5、1mM EDTA、1mg/mL白蛋白、1mM新鲜的ATP、1mM新鲜的DTT)进行稀释，使得最终体积成为100μL。然后，向含有测定缓冲液中的荧光基质suc-LLVY-AMC的96孔板添加在测定缓冲液中的10μg的蛋白酶体和蛋白酶体-MSNPN。结果，测定出AMC(ex 355/em 460)的荧光。
蛋白酶体-多孔二氧化硅纳米粒子复合物具有与未结合的蛋白酶体近似的蛋白质分解活性，这提议了即使它们结合于MSNPN气孔，也完全可以接近到基于小肽的报告(reporter)基质(图13)。
实施例7:蛋白酶体-多孔二氧化硅纳米粒子复合物的分析
与实施例6相同的方法制备蛋白酶体-多孔二氧化硅纳米粒子复合物，并同时培养蛋白酶体和多孔二氧化硅纳米粒子。然后，使培养样本旋转减慢，通过SDS-PAGE及免疫印迹(IB)对颗粒级分进行分析。为了比较，单独投入与蛋白酶体-MSNPN复合物相同量的蛋白酶体。
在咪唑(0.5M)的存在下进行较短的离心分离后，通过免疫印迹评价从蛋白酶体-MSNPN复合物的经过纯化的蛋白酶体的分离。以各种质量比将经过纯化的蛋白酶体结合于MSNPN，对该混合物进行离心分离(以1,000×g5分钟)。废弃上清液中未结合的蛋白酶体，将颗粒与含有2％β-巯基乙醇的2×SDS样品缓冲液进行混合，或与0.5M咪唑培养1小时。免疫印迹通过使用抗-His抗体来进行。
可见，经过纯化的蛋白酶体以各种质量比被容易吸附或装载在MSNPN，且以1:50的质量比(蛋白酶体/纳米粒子)，或者当在单一纳米粒子～37蛋白酶体全酶被带电时，实现饱和(图14之(a))。代替简单的吸收或电连接，主要通过非共价His-镍相互作用进行媒介来形成蛋白酶体-MSNPN复合物。当与0.5M咪唑进行培养时，由于过度咪唑而结合于MSNPN的所述蛋白酶体被有效地释放到上清液(图14之(b))。
使用Zetasizer NanoS(Malvern instruments，UK)通过动态光散射(DLS)分析测定MSNPN和吸附或装载有蛋白酶体的MSNP的ζ电位和流体动力学大小。在吸附或装载蛋白酶体之后，纳米粒子的表面ζ电位从-12.60mV顺利增加到-6.38mV，其表明在粒子之间减少的静电斥力、和在蛋白酶体与MSNPN之间稳定形成复合物(下表4)。虽然复合物大小和气孔大小稍微降低，但在使蛋白酶体带电之前的纳米粒子的显微特征与在使蛋白酶体带电之后的纳米粒子的显微特征相似(图15之(a)、(b)及下表5)。因此，经过纯化的蛋白酶体通过非共价相互作用有效地吸附或装载在新的多孔二氧化硅纳米粒子上。
[表4]
ζ电位(mV)
MSNPN -12.60±0.79
蛋白酶体-MSNPN -6.38±0.42
[表5]
流体动力学大小
MSNPN 267±46
蛋白酶体-MSNPN 239±27
实施例8:suc-LLVY-AMC水解分析
通过suc-LLVY-AMC水解分析测定蛋白酶体、多孔二氧化硅纳米粒子及蛋白酶体-多孔二氧化硅纳米粒子复合物。
实施例9:体外蛋白酶体的分解
为了对由蛋白酶体-MSNPN复合物的分解进行测验，使用作为更生理相关的蛋白酶体基质的聚泛素化的Sic1PY(Ub-Sic1)来进行体内(体外)Ub-Sic1分解分析。在不同时间内，使用抗-T17和抗-USP14抗体通过SDS-PAGE/IB对与蛋白酶体或MSNPN-蛋白酶体复合物之间的反应进行分析。在蛋白酶体测定缓冲液(50mM Tris-HCl、pH7.5、100mM NaCl、10％甘油、2mM ATP)中对经过纯化的人体蛋白酶或蛋白酶体-MSNPN复合物(5nM)和聚泛素化的Sic1PY(Ub-Sic1PY；20nM)进行培养不同时间。使样本和2×SDS样本缓冲液混合，在75℃下沸腾10分钟之后，使用抗-T7抗原来进行免疫印迹。当将保持USP14的所述经过纯化的蛋白酶体使用于Ub-Sic1时，Ub-Sic1在培养后30分钟内被完全分解(图16)。在本实施例中，虽然结合于MSNPN的所述蛋白酶体分解Ub-Sic1，但发现与单独使用蛋白酶体的情况相比以很有区别的模式进行分解。尤其，在初始时间，蛋白酶体-MSNPN复合物比单独的蛋白酶体更快速分解Ub-Sic1，而观察到Ub-链的修剪效果较少。可以预测，在形成所述复合物的过程中，反映来自蛋白酶体的内部USP14的电位(图16)。由于所述复合物中的USP14不足而所增加的蛋白酶体活性可以有利于直接蛋白酶体递送战略。
实施例10:MSNPN处理细胞的透射电子显微镜分析
在0.05M二甲胂酸钠缓冲液(pH7.2)中使用2％多聚甲醛和2％戊二醛来在4℃下固定用MSNPN(80μg/mL)进行处理的细胞4小时。用0.05M二甲胂酸钠缓冲液(pH7.2)清洗所述样本3次，然后通过在0.05M二甲胂酸钠缓冲液(pH7.2)中的1％四氧化锇(OsO4)在4℃下进行后固定2小时。此后，用水清洗，通过蒸馏水中的0.5％醋酸铀一律进行染色。然后，通过30％至100％的一系列的等位乙醇对样本进行脱水，使用100％环氧丙烷在室温下15分钟的时间内进行脱水2次。使用Spurr树脂(与ERL 4221、736环氧树脂、NSA及DMAE混合)系列来进行参透。最终，将样本位于模具中的新的100％Spurr树脂中，在70℃下进行聚合过夜。通过ultramicrotome MTX(RMC，USA)准备超薄切片(ultrathin section)。将切片吸附或装载在Formvar-涂层的铜载网，以80kV通过TEM(JEM 1010，JEOL，Japan)进行观察。
实施例11:细胞培养
在包含4.5g/L D-葡萄糖、作为补充剂的10％牛血清培养基(FBS)、100units/mL青霉素及100g/mL链霉素的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)中培养包括HELA、HEK293-pre1-HTBH、HEK293-trex-htau40及tau-BiFC的在实施例中所使用的细胞。在37℃、5％CO2条件下加湿培养箱中保持细胞。在用蛋白酶体-MSNPN复合物进行处理的一天之前，将细胞接种到圆形盖玻片(φ25mm，No.1，Deckglaser，Germany)上。在实验之前，将所述复合物或其对照添加到盖玻片上的附着细胞，经过培养时间，清除培养基。用PBS集中清除细胞3次，以清除未结合的纳米粒子，从而获得荧光图像。
实施例12:蛋白酶体的细胞内内化评价
为了测定MSNPN是否可使蛋白酶体在细胞内内化，将TAMRA-标记的MSNPN-蛋白酶体复合物(图10b之5)添加到血清含有培养基。然后，单独使用TAMRA-标记的MSNPN或使用蛋白酶体-MSNPN复合物(1:50)来进行处理24小时，激烈清洗，通过荧光、共焦和透射电子显微镜检查HeLa细胞(图17a和图17b)。复合物主要在细胞质中被发现，这表明积累于内吞小泡。所述复合物以不同浓度和摩尔比在培养后2小时内进入细胞中，在胞质溶胶中保持96小时以上(未记载数据)。在小于300μg/mL的浓度下稍微观察到MSNPN或蛋白酶体-MSNPN复合物的细胞存活率的效果(图18)。
实施例13:在内吞(endocytosis)抑制剂的存在下的MSNPN的细胞吸收
在如染料木素、氯丙嗪及诺考达唑等各种内吞抑制剂的存在下用蛋白酶体-MSNPN复合物对细胞进行处理之后，通过荧光显微镜和流式细胞仪进行测定。将HeLa细胞接种到12-孔板，在细菌培养器中进行培养。在24小时后，在37℃下或在无血清培养基中在4℃下培养细胞1小时，并通过用氯丙嗪(10g/mL)进行处理来抑制网格蛋白依赖性内吞，通过用染料木素(200M)进行处理来抑制胞膜窖依赖性内吞，或通过用阿米洛利(50μM)和诺考达唑(20μM)进行处理来抑制巨胞饮作用。然后，在与20g/mL的MSNPN相同的条件下培养细胞1小时，用2mL的PBS清洗细胞3次。为了对纳米粒子吸收进行计量，将细胞胰蛋白酶化而收集，在4℃下进行离心分离之后，用冷PBS进行清洗。将细胞再混悬到含有1％FBS的PBS中后进行过滤。使用安装有氩激光的AriaⅢ流式细胞仪(Becton Dickinson，USA)对荧光强度进行测定。进行测验3次，以平均±SD表示数据。
复合物的细胞吸收被确定为能源依赖性，通过胞膜窖-媒介的内吞和网格蛋白-媒介的内吞的两种进行处理。然而，与染料木素(与胞膜窖有关的酪氨酸激酶)或阿米洛利和诺考达唑(巨胞饮作用抑制剂)相比，氯丙嗪(网格蛋白分解抑制剂)更延迟纳米粒子内化，这提出富含胆固醇的脂筏可以用于包围相对大的MSNPN。
所述结果表明蛋白酶体-MSNPN复合物通过内吞运输进行内化。在运输之后，为了测试外部蛋白酶体是否活化且结构是否完整，在酸性pH类似(mimicking)核内体条件下培养蛋白酶体，对其蛋白质分解活性进行监测。与pH7.5相比，蛋白酶体的活性在pH5.5下更低约4倍(图19)。然而，随着pH增加，将pH降到pH 5.5就导致蛋白酶体活性的快速减少，与此相反，蛋白质分解活性恢复到正常水平。
在pH变化之前后，通过非变性PAGE测定组合物和蛋白酶体的活性。以850volt-hours将经过纯化的蛋白酶体或整个细胞溶解物样本溶解于3.5％非变性PAGE中，通过荧光基质suc-LLVY-AMC(Bachem)使蛋白酶体可视化。在pH变化之后，不见蛋白酶体组合物或门控(gating)的显著变化。
实施例14:细胞内蛋白酶体的活性
关于MSNPN-媒介的蛋白酶体递送是否可以影响到细胞内总蛋白酶体活性进行测验。用制备例6中制得的蛋白酶体-MSNPN复合物对HeLa细胞进行处理24小时，将细胞溶解于含有100mM NaCl、5mM MgCl2、10％甘油、0.2％NP40、1mM ATP、1mM DTT及蛋白酶抑制剂的50mM NaH2PO4(pH7.5)中。使用26G 3/8”注射器对溶解物进行同质化，以12,000rpm离心分离10分钟。将从而产生的不含纳米粒子的上清液使用于测定LLVY-AMC水解活性。将包括蛋白酶体-MSNPN复合物的颗粒再混悬到测定缓冲液(50mM Tris，pH 7.5，1mM EDTA，1mg/mL白蛋白，1mM fresh ATP，1mM新鲜的DTT)，使用40μM的LLVY-AMC来测定蛋白酶体活性。所述测定每隔2分钟进行37个循环。从所述溶解物的LLVY-AMC水解活性确定由于10μM的MG132而蛋白酶体活性降低。
用蛋白酶体-MSNPN复合物-进行处理的细胞的上清液中LLVY-AMC水解活性与未处理的细胞的活性实际上相同，反而从保持内化的人体蛋白酶的蛋白酶体-递送的细胞的颗粒级分观察到显著增加的活性。如现有研究报告，通过MSNPN-媒介的蛋白酶体递送所强化的蛋白酶体活性对细胞可接受(图18之(b))，多泛素和自由泛素或RP和CP亚基的细胞水平没有显著变化。
实施例15:通过蛋白酶体的tau蛋白质分解
为了研究外部蛋白酶体递送是否影响到活细胞中的蛋白质分解，使用在强力霉素诱导(可诱导的tau细胞系)上表达人tau的最长异构体(htau40)的HEK293-诱导的细胞系。在还原剂和β-巯基乙醇(βME)的存在和不存在下制备蛋白质样本，在表示的时间内进行Dox处理(0.5μg/mL)后，从可诱导的细胞系检测到所凝聚的tau蛋白质和其切断形状。该细胞以高剂量依赖性方式表达htau40，在与SDS-抗性tau凝聚体的形成一致的培养2天之后，逐渐移动tau种(图20a和图20b)。尤其，tau被视为在tau病症和阿尔茨海默氏病(AD)的进展早期通过泛素-蛋白酶体系统进行分解。
通过SDS-PAGE/IB分析用Dox(0.5μg/mL，24小时)、MSNPN(5μg/mL)及蛋白酶体-MSNPN复合物(50μg/mL，1:50摩尔比，24小时)对可诱导的tau细胞系进行处理而得到的样本。His IB是用于外部蛋白酶体的β4亚基。在用不同浓度的Dox(0、0.5、1，5及10ng/mL)、MSNPN及/或人体蛋白酶进行处理之后，从3次的独立实验(n＝3)使用胶片图像的密度计来对tau水平进行计量。在单独处理纳米粒子的情况下似乎没有效果，与此相反，当通过MSNPN递送经过纯化的蛋白酶体时，过表达的tau水平显著降低(图21a和图21b)。被已知为具有毒性且凝聚性的切断的tau水平通过蛋白酶体-MSNPN处理也显著降低。Tau的促进的分解依赖于递送的蛋白酶体量(0、5、10、25及50μg/mL，1:50比)。
在由外部蛋白酶体的翻译之后，为了确定tau调节。使用用于tau和GAPDH(用于正规化的调节)的引物来进行定量RT-PCR。在使用TRIzoll试剂(Invitrogen)来准备培养的细胞的总RNA，通过柱上DNA酶I处理和RNeasy mini-column(Qiagen)还进行纯化。通过使用RT-pre mix(Bioneer)的逆转录制备cDNA样本。然后，通过使用稀释的cDNA、作为报告染料的SYBR qPCR主混合物(KAPA biosystem)及10pmole的基因特异性引物和Rotor-Gene RG 3000(Corbett Research，Sydney，AU)来进行实时PCR反应。为了酶活化，加热循环条件包括在95℃下3分钟40个循环、在95℃下10秒40个循环、在53℃下15秒及在72℃下30秒。将各个mRNA水平正规化为GAPDH水平之后，作为3次的独立实验的平均±SD对数值进行测绘。所使用的引物序列如下：对Tau的正向引物(5'-aaggtgacctccaagtgtgg-3')和反向引物(5'-gggacgtgggtgatattgtc-3')；对GAPDH的正向引物(5'-gagtcaacggatttggtcgt-3')和对GAPDH的反向引物(5'-gacaagcttcccgttctcag-3')。
在所述条件下，tau mRNA水平相似，这强烈建议外部蛋白酶体直接加速过表达的tau的分解(图22a)。递送的蛋白酶体没有影响到自噬流动或如Nrf2和p53等外部蛋白酶体基质的水平。因此，递送到细胞的所述外部蛋白酶体更有效地分解向如过表达的tau等UPS非正常地赋予吸附或装载的蛋白质基质，代替参与有害的非特异性蛋白质分解。今后的课题将要求确定形成其对蛋白酶体分解的不同灵敏度的基低的目标蛋白质的有区别的特征，例如，tau的过磷酸化频率和Ub连接特异性。
使用MSNPN的蛋白酶体的递送有效地延迟作为AD病理特征的tau凝聚体的形成(图22b)。所述效果依赖于自噬，且可溶性tau蛋白质的加速化的蛋白酶体的分解有可能先行(图21a和图23)。然而，通过用作为蛋白酶体抑制剂的10μg MG132处理细胞来清除所述效果，这导致可溶性tau和tau凝聚体两者的显著积累(图22b)。尤其，蛋白酶体-MSNPN处理没有改变凝聚的亨廷顿蛋白质的水平，这无法由蛋白酶体进行处理。因此，在蛋白质水平上的外部蛋白酶体的所述效果通过UPS基质受到限制。
实施例16:tau寡聚化计量
为了在活细胞中使tau寡聚化可视化和计量化，使用具有生物分子的荧光互补性(BiFC)的tau细胞。根据现有技术制备本质上同时表达独立融合于htau40的金星(Venus)蛋白质的N-未端和C-未端的HEK293-诱导的稳定的细胞系(Tau-BiFC)[Zhang，X.，et al.Theproteasome:A target of oxidative damage in cultured human retina pigmentepithelial cells.IOVS 49，3622-3630(2008)]。以105cells/well的密度将Tau-BiFC细胞接种到96-孔板，用DMSO或30nM的冈田酸(OA)进行培养24小时，以促进tau寡聚化过程。获得荧光图像，通过Operetta(PerkinElmer)进行计量和分析。
金星蛋白质的N-未端和C-未端独立融合于htau40，这在正常条件下仅表示基本荧光信号。然而，所述荧光通过tau过磷酸化的化学诱导，例如，通过冈田酸强烈“打开(turned-on)”，结果，进行tau寡聚化。
在仅用50μg/mL的MSNPN和蛋白酶体-MSNPN处理tau-BiFC细胞系之后，对计量化的tau寡聚物水平进行比较，数值表示包括整体～10,000细胞的3次的独立培养的平均(±SD)。与可诱导的tau细胞一致的用蛋白酶体-MSNPN复合物处理的tau-BiFC细胞与单独处理MSNPN的细胞相比，tau凝聚显著少。所述结果表明使用MSNPN的外部蛋白酶体的直接递送在蛋白质毒性的条件中可以延迟tau蛋白质的凝聚过程。
实施例17:细胞存活和还原压力评价
为了在通过Dox的tau诱导下测定细胞存活和通过作为ROS的诱导剂的para R(百草枯)的还原压力，通过250pg/mL的Dox和1mM的para R对可诱导的tau细胞系进行预先培养3小时，然后用MSNPN或蛋白酶体-MSNPN复合物进行处理12小时。
通过CCK-8(cell counting kit-8)分析(Dojindo Laboratory，Japan)对细胞存活率进行测定。在纳米粒子处理的24小时之前，以每孔1x104细胞的密度将HeLa细胞接种到96孔细胞培养板。在培养24小时之后，用不同浓度的MSNPN或蛋白酶体-MSNPN复合物对细胞进行处理。用相同体积的PBS对对照细胞进行处理。在24小时后，清除培养基，将100mL的无血清培养基和10mL的CCK-8溶液添加到各孔。对所述细胞进行培养2小时。在450nm波长处通过使用酶标仪(Molecular Devices，Inc.，USA)测定甲腊盐的光学密度，排除培养基的背景吸收。测验反复3次，以平均±SD表示数据。
以平均±SD(n＝5)表示数值(**表示，p<0.01)。蛋白酶体递送显著缓解通过过表达的tau和作为ROS的诱导剂的para R诱导的细胞毒性，这表明上述方法可以用来减轻来自细胞的蛋白质毒性和氧化压力。
在本实施例中，报告通过使用化学改性的多孔纳米粒子来可以将如人体蛋白酶等高分子量蛋白质复合物直接递送到细胞。在所述外部蛋白酶体与MSNPN结合时，通过其内吞作用在细胞内内化之后，保持其活性和功能性。使用上述方法的增加的细胞的蛋白酶体对细胞可接受，且没有导致非特异性蛋白质分解。重要的是，具有外部蛋白酶体的细胞呈现可溶性tau的促进的分解、tau凝聚体的延迟的累积及对通过tau和ROS媒介的蛋白质毒性压力的强化的抗性。考虑到为了使二氧化硅纳米粒子成为血脑屏障通透性的非活性、非抗原性及可改性且蛋白酶体生物合成或蛋白酶体活性的原位(in situ)调节尚未开发，上述目前的战略有可能成为对在神经元中蓄积的毒性的凝聚性蛋白质的一个有趣的对策。许多疾病由毒性的错误折叠的(misfolded)凝聚性蛋白质引起，因此蛋白酶体递送的范围不限于神经退行性疾病。从而，直接蛋白酶体递送在蛋白质毒性或氧化压力下可以对细胞成为潜在的有益的介入。
制备例8.通过谷胱甘肽(GSH)表面改性的多孔二氧化硅纳米粒子的合成
通过谷胱甘肽表面改性的多孔二氧化硅纳米粒子(GSH-MSN)的合成如图24所示进行。首先，使用ep-tube将扩大气孔而以正电荷表面改性的50mg多孔二氧化硅粒子溶解于1mL的二甲亚砜(DMSO)中来充分进行分散。然后，将平均分子量为312.37、间隔臂长度为0.68nm的20mg的琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)接头放入到ep-tube中并在常温下利用轨道振动器充分进行反应24小时，使得两种物质均匀混合以产生反应。当结束反应时，利用离心分离机将生成物质沉没，为了清除未反应而剩下的SPDP而利用DMSO和乙醇进行清洗，这过程用各个溶液反复3次，最后用乙醇清洗，然后在1mL的3次蒸馏水中分散通过运行离心分离机来获得的沉没的产物。然后，放入平均分子量为307.33的谷胱甘肽，在常温下利用轨道振动器进行反应24小时后，利用离心分离机将生成物质沉没，用蒸馏水和乙醇分别清洗5次，利用真空泵全部清除残余溶剂。谷胱甘肽的计量通过用紫外线-可见线分光光度分析仪测定溶解于上清液中的吡啶-2-硫酮的吸光度(A343nm)来可以确定。为了适用于随后的实施例，将所合成的粒子分散于蒸馏水中来在4℃下进行保管。
实施例18.向通过合成的谷胱甘肽表面改性的多孔二氧化硅纳米粒子的蛋白质装载和细胞导入分析
为了分析所合成的纳米粒子的有效成分是否有效递送并起作用，装载谷胱甘肽s-转移酶(GST)标签的蛋白质。为此，使用GST标签的核糖核酸酶(RNase)并利用如制备例8所示通过谷胱甘肽表面改性的多孔二氧化硅纳米粒子内部的GSH与RNase的GST之间的GSH-GST相互作用来试图装载，且通过装载之前后的紫外线-可见线吸收光谱法对粒子进行分析。在装载GST标签的RNase的粒子的情况下，利用在进行离心分离后溶解于上清液中的未装载的GST标签的RNase的吸光度来测定蛋白质的装载率，以所测定的吸光强度为准，利用在278nm处的吸光值和以往报告的吸光系数(ε＝9,800M-1cm-1)的Beer-Lambert数式来进行计算。
A＝εbc
[A:测定的吸光强度，ε:吸光系数，b:测量容器的路径长度(1cm)，c:物质的摩尔浓度]
从紫外线-可见线吸收光谱法的结果可以确定每10μg的GSH-MSN可以装载4μg的GST标签的RNase。本发明人判断通过将符合目的的有效成分成功地装载于多孔二氧化硅纳米粒子来以后能够起适合于细胞、动物及人体水平的制药学有效物质递送和治疗研究的水平的载体作用，而为了验证，将GST标签的RNase装载于通过谷胱甘肽表面改性的多孔二氧化硅纳米粒子来进行细胞导入效率性验证。为了利用特定荧光过滤器的荧光显微镜观察人体细胞水平的细胞导入，向RNase导入荧光染料来将RNase装载于纳米粒子。将50,000个THP-1细胞系分配到12-孔培养板，在24小时后，放入佛波醇(PMA)来进行分化，将4μg的GST标签的FAM-RNase装载于GSH-MSN来与不含血清的细胞培养基同时处理4小时。然后，通过1XPBS清洗残余物质2次，更换为包含血清的新的培养基，在5％CO2、37℃环境下还进行细胞生长12小时，在358nm和492nm处利用具有荧光过滤器的共聚焦荧光显微镜来观察细胞，各个荧光表示细胞核的荧光(358nm，蓝色)、GST标签的RNase荧光(492nm，绿色)。如图25所示，可以观察到蛋白质的强绿色荧光均匀分布在细胞核旁边的细胞质，尤其，当以1μm分割Z轴来观察时，通过细胞荧光图像可以明确确定荧光不是分布在细胞外部表面而是分布在细胞质内，从而确定本发明的研究人员合成的纳米粒子针对被已知为难以将外部物质导入到细胞中的细胞系也能够起到适合于包括蛋白质的制药学有效物质递送和治疗研究的水平的载体作用。
实施例19.利用通过人体细胞水平的谷胱甘肽表面改性的多孔二氧化硅纳米粒子的蛋白质递送的有效性验证
通过合成的GSH-MSN正确地装载作为有效物质的蛋白质的状态下导入到细胞中后向细胞质释放来验证如DNA或RNA等核酸的表达量调节。当装载的RNase可有效地装载且稳定释放时，通过分解目标单链核酸来可以实现核酸具有的抑制潜在的疾病的治疗目的应用。为了验证上述效能，将在THP-1细胞系表达的特定RNA作为目标，将其分解的RNase被定为候选蛋白质，在1X PBS缓冲溶液和10mM MgCl2的存在下进行体外实验。在Ep-tube准备RNase@MSN，放入单链RNA(ssRNA)后，在37℃环境下进行反应30分钟，然后通过凝胶电泳确定是否分解RNA。如图26所示，确定装载于纳米粒子的RNase有效地起到作用，且试图验证在细胞水平上的作为治疗功能的潜在力，将50,000个THP-1细胞系分配到12-孔培养板，在24小时后，放入佛波醇(PMA)进行分化，将4μg的GST标签的RNase装载在GSH-MSN，与不含血清的细胞培养基同时处理4小时。然后，以1X PBS清洗残余物质2次，更换为包含血清的新的培养基，在5％CO2、37℃环境下还进行细胞生长12小时，通过qRT-PCR并借助通过凝胶电泳对特定RNA的表达量进行比较。图26是将本公开的多孔二氧化硅纳米粒子用作蛋白质载体来示出关于抑制特定RNA的表达的RNase递送和功能有效性的分析结果，(a)是在ep-tube步骤的体外RNase活性分析即示出通过凝胶电泳分析是否分解RNA的结果的图像，(b)是通过qRT-PCR分析THP-1细胞系的特定RNA表达量的图表。如图26所示，在利用MSN递送RNase的情况下，可以得到约5～60％的RNA表达抑制效率，从而确定本发明的研究人员合成的纳米粒子针对被已知为难以将外部物质导入到细胞中的细胞系也能够起到适合于包括蛋白质的制药学有效物质递送和治疗研究的水平的载体作用。
实施例20.在体内动物模型的利用MSN的蛋白质递送评价
为了基于所述细胞水平的有效的蛋白质递送结果而验证是否可以起到动物水平的制药学有效物质递送和治疗研究的水平的载体作用，将小鼠(大鼠)作为实验对象，从(株)东方生物购买Balb/c nude雄性小鼠，在1x PBS(pH 7.4)条件下通过静电引力将RNase(Sigma Aldrich Korea)装载在带阴离子的MSN，以注入到小鼠。对5周龄小鼠植入HeLa细胞来使异种移植肿瘤生长，以观察根据RNase递送的肿瘤治疗效果。向灭菌的1x PBS分散3,000,000个HeLa来皮下注射到小鼠，在肿瘤生长直到肿瘤达到70mm3大小时，将装载有PBS、MSN及RNase的MSN分别进行肿瘤内注射给药。如图27所示，仅注入PBS或MSN的小鼠未显现肿瘤生长抑制效果，但当注入装载RNase的MSN时，可确定肿瘤的大小减少了约3倍至约4倍。通过所述动物实验结果确定根据本公开的MSN可以起到适合于制药学有效物质递送和治疗研究的水平的载体作用。
实施例21.在体内动物模型的利用MSN的蛋白质递送评价
为了基于所述细胞水平的有效的蛋白质递送结果而验证是否可以起到动物水平的稳定并有效的蛋白质载体作用，将小鼠(大鼠)作为实验对象，从(株)东方生物购买Balb/c nude雄性小鼠，准备接合有Cy5荧光的带阳离子的MSN(Cy5-MSN)，在1xPBS(pH7.4)条件下通过静电引力装载接合有FITC荧光染料的免疫球蛋白G(FITC-IgG，Sigma AldrichKorea)，以注入到小鼠。对5周龄小鼠植入HeLa细胞来使异种移植肿瘤生长，然后通过OptixMx3(GE Healthcare，USA)机器观察根据FITC-IgG和Cy5-MSN递送的荧光强度和分布。向灭菌的1xPBS分散3,000,000个HeLa来皮下注射到小鼠，在肿瘤生长直到肿瘤达到70mm3大小时，将装载有PBS、Cy5-MSN、FITC-IgG及FITC-IgG的Cy5-MSN进行小鼠肿瘤内注射给药。如图28a和28b所示，可以确定MSN和IgG正常递送到肿瘤组织，未装载在MSN的状态的IgG与装载在MSN的IgG相比，在向肿瘤注入后，可以确定荧光信号相对快速地消失。通过所述动物实验结果确定根据本公开的MSN有效地保持制药学有效物质的高稳定性和其功能来能够起到适合于治疗研究的水平的载体作用。
上述的本公开的说明只是例示性的，只要是本公开所属技术领域的普通技术人员，就能理解在不变更本公开的技术思想或必要特征的情况下，也能轻易变形为其他具体形态。因此，以上所述的实施例在各方面仅是例示性的，但并不限于此。例如，作为单一型进行说明的各结构部件也能分散进行实施，同样，使用分散的进行说明的结构部件也能以结合的形态进行实施。
本公开的范围是通过所附权利要求书来表示，而并非通过上述详细的说明，而由权利要求书的意义、范围及其均等概念导出的所有变更或变形的形态应解释为包括在本公开的范围内。

Claims (19)

1.一种用于递送蛋白质的组合物，其特征在于，包括含有平均孔径为1nm以上至100nm以下的气孔的多孔二氧化硅纳米粒子、和结合于所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的内表面或外表面且赋予表面负电荷或正电荷的官能团或与蛋白质特异性结合的配体。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，
所述配体包括镍、镍-NTA、谷胱甘肽、糊精、生物素或链霉亲和素。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包括：
结合于所述多孔二氧化硅纳米粒子的表面上的抗体、配体、细胞渗透性肽或适体。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包括：
通过与结合于所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔表面上的所述配体相结合来吸附或装载在所述多孔二氧化硅纳米粒子中的蛋白质。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，
所述蛋白质通过所述赋予表面负电荷或正电荷的官能团与蛋白质之间的静电相互作用吸附或装载在所述二氧化硅粒子的气孔中。
6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，
所述蛋白质包括选自由包含蛋白酶体的蛋白质复合物；选自由胱天蛋白酶、核糖核酸酶、激酶及磷酸酶组成的组中的酶；及抗体组成的组中的物质。
7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，
所述蛋白质包括选自由全身激素、细胞因子、生长因子及调节细胞的分化和增殖的另一种蛋白质；参与正常愈合过程的调控因子和报告为具有可治疗伤口能力的生长因子；包括转化生长因子-β超家族(TGF-β)蛋白质、巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)的细胞因子和激素；包含蛋白酶体的蛋白质复合物；包括胱天蛋白酶、核糖核酸酶及激酶或磷酸酶的酶；及抗体组成的组中的物质。
8.一种蛋白质的递送方法，其特征在于，包括将用于递送蛋白质的组合物导入到目标细胞中的步骤，所述用于递送蛋白质的组合物包括：含有平均孔径为1nm以上至100nm以下的气孔的多孔二氧化硅纳米粒子；结合于所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的内表面或外表面且赋予表面负电荷或正电荷的官能团或与蛋白质特异性结合的配体；及吸附或装载在所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔中的蛋白质。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述蛋白质包括选自由包含蛋白酶体的蛋白质复合物；选自由胱天蛋白酶、核糖核酸酶、激酶及磷酸酶组成的组中的酶；及抗体组成的组中的物质。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述多孔二氧化硅纳米粒子还包括结合于所述多孔二氧化硅纳米粒子的表面上的抗体、配体、细胞渗透性肽或适体。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述蛋白质包括选自由全身激素、细胞因子、生长因子及调节细胞的分化和增殖的另一种蛋白质；参与正常愈合过程的调控因子和报告为具有可治疗伤口能力的生长因子；包括转化生长因子-β超家族(TGF-β)蛋白质、巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)的细胞因子和激素；包含蛋白酶体的蛋白质复合物；包括胱天蛋白酶、核糖核酸酶、激酶或磷酸酶的酶；及抗体组成的组中的物质。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述将用于递送蛋白质的组合物导入到目标细胞中的步骤包括通过将所述用于递送蛋白质的组合物添加到细胞培养液中来导入到所述目标细胞中的步骤。
13.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述将用于递送蛋白质的组合物导入到目标细胞中的步骤包括通过血管内给药、口服给药、经皮给药或注射局部给药方式将所述用于递送蛋白质的组合物导入到所述目标细胞中的步骤。
14.一种用于递送生物活性物质的组合物，其特征在于，包括：含有平均孔径为1nm以上至100nm以下的气孔的多孔二氧化硅纳米粒子；结合于所述多孔二氧化硅纳米粒子的气孔的内表面或外表面且赋予表面负电荷或正电荷的官能团或与蛋白质特异性结合的配体；及结合于所述官能团或配体的生物活性物质。
15.根据权利要求14所述的组合物，其特征在于，
与所述生物活性物质特异性结合的官能团或配体包括镍、镍-NTA、谷胱甘肽、糊精、生物素或链霉亲和素。
16.根据权利要求14所述的组合物，其特征在于，
所述生物活性物质通过静电相互作用吸附或装载在所述气孔中。
17.根据权利要求14所述的组合物，其特征在于，
所述生物活性物质包括药物、蛋白质、肽、miRNA、siRNA、酶、辅助营养剂、维生素、天然产物或提取物。
18.根据权利要求14所述的组合物，其特征在于，还包括结合于所述多孔二氧化硅纳米粒子的表面上的抗体、配体、细胞渗透性肽或适体。
19.一种生物活性物质的递送方法，其特征在于，包括将根据权利要求14至18中任一项所述的用于递送生物活性物质的组合物导入到目标细胞中的步骤。
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