CN111077251B - 一种基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱及其在筛选天然产物中活性组分的应用 - Google Patents

一种基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱及其在筛选天然产物中活性组分的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱及其在筛选天然产物中活性组分的应用。所述的基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱的制备方法为：将介孔氧化硅材料与α‑葡萄糖苷酶溶液，谷胱甘肽溶液，乙酸钠缓冲液混合，冰浴下搅拌反应，得到负载α‑葡萄糖苷酶受体的介孔氧化硅材料；将大豆卵磷脂与胆固醇充分溶于氯仿中得到混合液；将所得负载α‑葡萄糖苷酶受体的介孔氧化硅材料浸渍于所得混合液中，减压蒸除有机溶剂，负载α‑葡萄糖苷酶受体的介孔氧化硅材料表面即形成一层磷脂膜，然后洗涤、干燥得到覆盖有磷脂膜的介孔固定相湿法装柱，得到基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱。本发明所述的基于靶点蛋白的受体生物膜色谱柱应用于筛选天然产物活性组分。

Description

一种基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱及其在筛选天然产物 中活性组分的应用
技术领域
本发明涉及一种用于筛选天然产物中活性成分的方法，尤其涉及一种基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱从而筛选天然产物中活性成分的方法。
背景技术
药物筛选是指利用适当的筛选方法和技术，建立合适的筛选模型，从可能作为药物使用的天然或合成化合物中得到高效的先导化合物，对其进行药理及药效活性的检测，药用价值的评估，评价某一化合物的药用前景的方法，是新药研发中缩短时间、减少成本、降低风险的关键步骤。
如今的药物筛选方法主要包括整体动物水平筛选、细胞水平药物筛选、分子水平药物筛选，而由于动物水平筛选价格昂贵，病理部位和药物作用机制不明，细胞水平筛选技术要求较高，细胞易失活的缺点，分子水平药物筛选模型逐渐成为使用范围最广，技术最成熟的筛选方法之一。
基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱筛选方法即为分子水平药物筛选的一种。色谱方法应用于α-葡萄糖苷酶活性成分筛选主要还包括细胞膜色谱法，脂质体色谱法，受体色谱法。受体色谱的受体蛋白固定化存在活性损失及蛋白流失的问题，细胞膜色谱的色谱柱寿命较短，其细胞膜蛋白易脱落或失去活性，稳定性和重现性差。普通的脂质体膜中缺少必要的受体，既无法全面模拟药物在膜上的保留行为，也无法特异性筛选与受体结合的先导化合物。
现有的筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的色谱方法中，细胞膜色谱法细胞膜剥除困难，并且活性随时间衰减极快，无法重复利用。脂质体色谱法脂质体表面缺少受体，无法研究药物与膜及受体之间的作用研究药物与膜及受体之间的作用。细胞和动物水平筛选周期长、价格昂贵。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱，将生物膜色谱法与受体色谱法结合，以介孔材料冰浴搅拌负载受体，磷脂膜包覆使其不易脱落，再结合HPLC，结合了两者的优势，既可以研究药物与膜及受体之间的作用，排除非作用杂质成分的干扰，又可以多次重复利用，且制备工艺简单。
本发明采用的技术方案是：
一种基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱按照如下方法进行制备：
(1)将介孔氧化硅材料与浓度为6.5～10万U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，1mg/mL谷胱甘肽溶液，2.5mmol/L的乙酸钠缓冲液混合，冰浴下搅拌反应为2～7h，得到反应混合物过滤，室温下真空干燥，得到负载α-葡萄糖苷酶受体的介孔氧化硅材料；所述的α-葡萄糖苷酶溶液与谷胱甘肽溶液、乙酸钠缓冲液的体积比为1:1:20～30；所述的乙酸钠缓冲液的pH值为3～5；
(2)将大豆卵磷脂与胆固醇充分溶于氯仿中得到混合液；所述的大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为1～5:1；
(3)将步骤(1)所得负载α-葡萄糖苷酶受体的介孔氧化硅材料浸渍于步骤(2)所得混合液中，常温下减压旋转缓慢蒸发除去有机溶剂，负载α-葡萄糖苷酶受体的介孔氧化硅材料表面即形成一层磷脂膜；
(4)将步骤(3)得到的覆盖有磷脂膜的负载α-葡萄糖苷酶受体的介孔氧化硅材料用纯水洗涤，除去未固定的磷脂膜和酶，真空干燥箱内常温干燥除去水分和剩余有机溶剂，得到覆盖有磷脂膜的介孔固定相；
(5)以纯水为匀浆液，以覆盖有磷脂膜的介孔固定相为填料湿法装柱，即得目标产物基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱。
进一步，步骤(1)中，所述的干燥时间为2～3h。
进一步，步骤(2)中，所述的氯仿的加入量以所述的大豆卵磷脂的质量计为85.7～428.6mL/g。
进一步，步骤(4)中，所述的干燥时间为2～3h。
进一步，本发明所述的介孔氧化硅材料的制备方法为：
1)将P123和氯化钾溶于体积浓度为5.0％～5.5％的盐酸溶液中，室温下搅拌至溶液变为透明；所述的P123和氯化钾的质量比为1：4～4.616；所述的盐酸溶液的加入量以所述的P123的质量计为35ml/g；
2)在搅拌下向步骤1)所得溶液中加入TMB，搅拌6h～12h，后滴加TEOS，剧烈搅拌10～15min，得到混合物；所加的P123与TMB的质量比为4：1.5～3.5；所述的TEOS的加入量以所述的P123的质量比计为2.25～2.3mL/g；
3)将步骤2)得到的混合物在35℃～40℃水浴锅中恒温24～28h，转移到高压釜中80～120℃加热18～36h，冷却洗涤抽滤后干燥，马弗炉540℃煅烧8～10h，可得介孔氧化硅材料。
本发明所述的基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱应用于筛选天然产物中的α-葡萄糖苷酶抑制剂。
再进一步，所述的天然产物优选为五味子或西青果。
本发明选择米格列醇和阿卡波糖为研究对象，考察基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱对这两种α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选性能。米格列醇和阿卡波糖可以竞争性抑制小肠上皮细胞表面的α-葡萄糖苷酶，降低淀粉等多糖分解为葡萄糖的速度并延缓细胞对葡萄糖的吸收，具有短时间内降低餐后血糖水平的作用，对比米格列醇和阿卡波糖在基于靶点蛋白的脂质体生物膜色谱柱和不加α-葡萄糖苷酶溶液和谷胱甘肽溶液的空白硅胶色谱柱上的保留行为的差异，实验结果表明：α-葡萄糖苷酶抑制剂在基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱和空白色谱柱上的保留时间有明显差别，说明基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱对α-葡萄糖苷酶抑制剂类化合物有选择作用。
本发明以中药五味子和西青果为研究对象，通过所述的基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱来筛选中药组分中的活性成分，并通过质谱分析得出所述的基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱可应用于筛选天然产物或中药中活性组分。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明利用介孔材料负载α-葡萄糖苷酶受体，并用磷脂膜包封作为色谱固定相，结合HPLC建立了α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选新平台，以α-葡萄糖苷酶抑制剂米格列醇、阿卡波糖作为对象，对该色谱模型的有效性进行了研究，并优化了色谱筛选条件，并从中药五味子、西青果中筛选得到了有α-葡萄糖苷酶抑制效果的成分。这种基于靶点蛋白的受体生物膜色谱柱运用在药物筛选中，既可以研究药物与膜及受体之间的相互作用，又可以利用受体与目标成分的结合从复杂化合物中筛选有效成分，该活性成分筛选平台具有应用范围广，重现性较好，色谱柱上有机大分子不易脱落等优点。
附图说明
图1是本发明实施例1中制备的基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱及其在筛选天然产物活性组分的应用所制备的空白介孔固定相的SEM图；
图2是本发明实施例1中制备的基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱及其在筛选天然产物活性组分的应用所制备的酶蛋白介孔材料固定相的SEM图；
图3是本发明实施例1中制备的基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱及其在筛选天然产物活性组分的应用所制备的生物膜包覆的酶蛋白介孔材料固定相的SEM图；
图4是本发明实施例1中制备的基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱及其在筛选天然产物活性组分的应用所制备的空白介孔材料(上)、酶蛋白介孔材料(中)、生物膜包覆的酶蛋白介孔材料(下)的FTIR图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明一种基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱及其在筛选天然产物活性组分的应用作进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
本发明所述的α-葡萄糖苷酶购自上海源叶生物科技有限公司，CAS号：9001-42-7，MDL：MFCD00081321。
本发明所述的五味子产自东北，西青果产自广西。
实施例1
(1)将4g P123和4.616g氯化钾(KCl)溶于盐酸溶液中(120ml H2O和20ml 37％wt浓HCl)，室温下搅拌至溶液变为透明。(2)搅拌下加入3ml TMB，搅拌10h，后滴加9.2mlTEOS，剧烈搅拌10min。(3)混合物在35℃水浴锅中恒温24h，转移到高压釜中100℃加热24h，冷却洗涤抽滤后干燥，马弗炉540℃煅烧10h，可得介孔氧化硅材料。SEM图如图1所示。(4)将介孔氧化硅材料与1ml 10万U/mlα-葡萄糖苷酶溶液，1ml 1mg/mL谷胱甘肽溶液，28ml pH为4.0的2.5mmol/L的乙酸钠缓冲液混合，冰浴下搅拌吸附6h，过滤，室温下真空干燥2h，得到负载α-葡萄糖苷酶受体的介孔材料。SEM图如图2所示。(5)将0.21g大豆卵磷脂与0.07g胆固醇充分溶于30ml氯仿中得到混合液；(6)将步骤走(4)所得材料与(5)中混合液混合，常温下减压旋转缓慢蒸发除去有机溶剂，介孔材料表面即形成一层将α-葡萄糖苷酶包裹其中的磷脂膜。(7)将步骤(6)得到的介孔材料用纯水洗涤，除去未固定的磷脂膜和酶，真空干燥箱内常温干燥3h除去水分和剩余有机溶剂，得到覆盖有磷脂膜的介孔固定相。SEM图如图3所示。(8)以纯水为匀浆液，以覆盖有磷脂膜的介孔固定相为填料湿法装柱，即得目标产物基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱。
图1可以看出介孔材料表面的孔结构，图2与图3中，介孔材料的孔状结构，有利于酶蛋白进入，图上的白色小点为负载的酶蛋白。通过图4可以看到，生物膜包覆的酶蛋白介孔材料固定相在2800-3000cm-1处有明显的吸收峰而空白介孔材料和酶蛋白介孔材料中没有，对应的是脂质体的-C-H-震动，说明固定相中有脂质体存在。此外，从表一，材料的表面能谱分析中可以看出，磷脂中的特有元素磷元素(P)在空白介孔材料和酶蛋白介孔材料中完全没有，在膜包覆的酶蛋白介孔材料固定相中则明显增加。进一步证实了膜包覆的酶蛋白介孔材料固定相中已有磷脂膜覆盖在部分介孔材料表面。
表1空白介孔材料、酶蛋白介孔材料和膜包覆的酶蛋白介孔材料的表面能谱分析
Figure BDA0002344552180000071
Figure BDA0002344552180000081
实施例2
分别将0.1g米格列醇和阿卡波糖标准品置于10ml容量瓶中，纯水定容，得10mg/ml米格列醇溶液和10mg/ml阿卡波糖溶液，分别取20μl米格列醇溶液和阿卡波糖溶液在空白介孔色谱柱和膜包覆的酶蛋白介孔材料色谱柱上进行分离，色谱条件：流动相0.01mMpH7.5Na2HPO4·12H2O缓冲液，流速v＝0.2ml/min，柱温T＝40℃，波长λ＝210nm；
米格列醇在空白介孔色谱柱上的保留时间是8.03min，在膜包覆的酶蛋白介孔材料色谱柱上的保留时间是15.16min。阿卡波糖在空白介孔色谱柱上的保留时间是7.57min，在膜包覆的酶蛋白介孔材料色谱柱上的保留时间是13.77min。证明对α-葡萄糖苷酶有抑制作用的成分在介孔生物膜色谱柱上的保留时间会延长。
实施例3
(1)取五味子10g，加入150ml甲醇，70℃下回流2h后过滤，滤液置于茄形瓶中，55℃下真空旋转干燥除去甲醇，剩余部分溶于10ml纯水，得五味子醇提液。(2)取5μl五味子醇提液，利用介孔生物膜色谱柱进行分离，色谱条件如下：流动相：0.01mM pH 7.5Na2HPO4·12H2O-柠檬酸缓冲液，流速v＝0.2ml/min,柱温T＝40℃，波长λ＝250nm。(3)将五味子醇提液、收集的五味子洗脱液、五味子醇甲标准品作为样品进行反相色谱分离，色谱条件如下，色谱柱：XDB-C18(4.6×250mm)反相色谱柱，流动相，甲醇：水＝70:30(v/v)，流速v＝0.8ml/min,柱温T＝25℃，波长λ＝250nm。(4)对收集的五味子洗脱液进行质谱分析。
五味子在空白介孔色谱柱和介孔生物膜色谱柱上都有3个峰，其中第二和第三个峰的保留时间有所延长，因此第2个和第3个峰为α-葡萄糖苷酶抑制剂。
将收集的五味子洗脱液(第二个，第三个峰)进行反相色谱分离，发现t＝6.8min处含有分离出的α-葡萄糖苷酶抑制剂，通过质谱分析和将五味子醇甲标准品作为样品进行反相色谱鉴定，在相同位置出峰，则认为该有效成分为五味子醇甲。
实施例4
(1)取西青果2g，加入50ml甲醇，70℃下回流2h后过滤，滤液置于茄形瓶中，55℃下真空旋转干燥除去甲醇，剩余部分溶于40ml纯水，得西青果醇提液。(2)取5μl西青果醇提液，利用介孔生物膜色谱柱进行分离，色谱条件如下：流动相：0.01mM pH 7.5Na2HPO4·12H2O-柠檬酸缓冲液，流速v＝0.2ml/min,柱温T＝40℃，波长λ＝270nm。(3)将西青果醇提液、收集的西青果洗脱液、鞣花酸标准品作为样品进行反相色谱分离，色谱条件如下，色谱柱：XDB-C18(4.6×250mm)反相色谱柱，初始流动相：甲醇：0.2％甲酸＝6:94(v/v)，梯度洗脱，0～16min：甲醇：0.2％甲酸＝6：94～55：45(v/v)
16～25min：甲醇：0.2％甲酸＝55：45～6：94(v/v)
25～30min：甲醇：0.2％甲酸＝6：94(v/v)
流速v＝1.0ml/min,柱温T＝25℃，波长λ＝270nm。(4)对收集的西青果洗脱液进行质谱分析。
西青果醇提液在空白介孔色谱柱只有一个峰，在介孔生物膜色谱柱上有2个峰，因此第2个峰为α-葡萄糖苷酶抑制剂。
将收集的西青果洗脱液(第二个峰)进行反相色谱分离，发现t＝16.84min处含有分离出的α-葡萄糖苷酶抑制剂，通过质谱分析，得m/z为301(去H峰)的位置和鞣花酸分子量相同，将鞣花酸标准品作为样品进行反相色谱鉴定，在相同位置出峰，则认为该有效成分为鞣花酸。

Claims (6)

1.一种基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱，其特征在于：所述的基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱按照如下方法进行制备：
（1）将介孔氧化硅材料与浓度为6.5~10万U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，1mg/mL谷胱甘肽溶液，2.5mmol/L的乙酸钠缓冲液混合，冰浴下搅拌反应为2~7h，得到反应混合物过滤，室温下真空干燥，得到负载α-葡萄糖苷酶受体的介孔氧化硅材料；所述的α-葡萄糖苷酶溶液与谷胱甘肽溶液、乙酸钠缓冲液的体积比为1:1:20~30；所述的乙酸钠缓冲液的pH值为3~5；
（2）将大豆卵磷脂与胆固醇充分溶于氯仿中得到混合液；所述的大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为1~5:1；
（3）将步骤（1）所得负载α-葡萄糖苷酶受体的介孔氧化硅材料浸渍于步骤（2）所得混合液中，常温下减压旋转缓慢蒸发除去有机溶剂，负载α-葡萄糖苷酶受体的介孔氧化硅材料表面即形成一层磷脂膜；
（4）将步骤（3）得到的覆盖有磷脂膜的负载α-葡萄糖苷酶受体的介孔氧化硅材料用纯水洗涤，除去未固定的磷脂膜和酶，真空干燥箱内常温干燥除去水分和剩余有机溶剂，得到覆盖有磷脂膜的介孔固定相；
（5）以纯水为匀浆液，以覆盖有磷脂膜的介孔固定相为填料湿法装柱，即得目标产物基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱。
2.如权利要求1所述的基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱，其特征在于：步骤（1）中，干燥时间为2~3h。
3.如权利要求1所述的基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱，其特征在于：步骤（2）中，所述的氯仿的加入量以所述的大豆卵磷脂的质量计为85.7～428.6 mL/g。
4.如权利要求1所述的基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱，其特征在于：步骤（4）中，干燥时间为2~3h。
5.一种如权利要求1～4任一项所述的基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱在筛选天然产物中的α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的天然产物为五味子或西青果。
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