CN101659693B - 制备纽莫康定b0的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种制备纽莫康定B0的方法，该方法包括下列步骤：a)离心纽莫康定B0的发酵液，取菌丝体，用第一种溶剂浸取菌丝体中纽莫康定B0，过滤除去菌丝体；b)将纽莫康定B0第一种溶剂浸取液中的溶剂蒸干，用第二种溶剂浸泡，过滤除去不溶物；c)将纽莫康定B0第二种溶剂浸泡液蒸干后溶于第一种溶剂中，过酸性氧化铝柱，收集流出液；d)将纽莫康定B0收集液蒸干后溶于第一种溶剂中，上吸附树脂，用第一种溶剂进行洗脱，收集纯度较高的部分；e)将纽莫康定B0收集液蒸干溶于第一种溶剂中，上反相树脂，用第一种溶剂进行洗脱，收集纯度较高的部分；f)将纽莫康定B0收集液蒸干后用第一种溶剂溶解，滴加少量水使其过饱和后结晶析出，制得纽莫康定B0。本发明的制备纽莫康定B0的方法不仅能够很好的去除色素，且能将其纯度提高到96％以上。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种制备卡帕芬净的前体纽莫康定B0的方法。
背景技术
自20世纪70年代以来，在临床治疗过程中，真菌感染疾病和由于无法控制真菌感染而造成的死亡率逐渐提高，这与广泛使用对人体免疫系统有损害的药物和大量使用广谱抗菌药物有直接的关系。另外，与临床使用体内植入物和像艾滋病这样的慢性免疫抑制病毒的感染有关。因此，研究开发安全、新型和有效的抗真菌药物显得非常重要。众所周知，真菌细胞是具有细胞壁的，哺乳动物细胞没有细胞壁。因此，应将真菌的细胞壁作为新型抗真菌药物的作用靶点。纽莫康定类即是作用于真菌细胞壁的药物。
纽莫康定(Pneumocandins)是由Zalerion arboricola产生的一类天然抗真菌药物，由于它对多种念珠菌、地方性真菌、曲霉及卡氏肺囊虫均有效，因而越来越受到人们的关注。其主要作用机理是能够非竞争性的抑制真菌细胞壁中β-1，3葡聚糖合成酶的活性，进而引起真菌细胞壁的裂解以及细胞内外渗透压的改变从而将真菌细胞彻底杀死。按照其结构中脯氨酸上取代基的不同主要分为三大类：A0(32羟基242甲基脯氨酸)、B0(32羟基脯氨酸)和C0(42羟基脯氨酸)，此外，根据环状多肽上取代基的不同纽莫康定A0又可以分为A0、A1、A2、A3、A4五小类，B0又可以分为B0、B2两小类。其中纽莫康定B0的衍生物已经在临床上得到应用，商品名为卡帕芬净。
国内对于纽莫康定B0制备工艺的研究几乎没有报道，国外主要是默克公司的科研人员对其进行过系统的研究，但在分离工艺方面尚未有成熟的能够直接应用于大规模制备的方法。
发表于1992年6月15号的the journal of antibiotics杂志上的一篇题为纽莫康定from Zalerion arboricola详细介绍了纽莫康定B0的分离提取工艺，此工艺运用多种分离手段对其进行纯化，并最终用结晶的方法制备纽莫康定B0。
此工艺的大致流程如下：
a用1.5倍甲醇浸泡发酵液，高速离心后取菌丝体，再用两倍体积的甲醇泡，继续离心后用80％的甲醇浸泡纽莫康定B0；
b选用HP-207树脂，用40％-50％的甲醇上柱，先用65∶35的甲醇水洗柱子，再用100％的甲醇将纽莫康定B0洗下来；
c在25度时，纽莫康定B0溶液中缓慢加入醋酸异丙酯沉淀，在通过过滤和离心蒸干后纯度为67％，收率为84％；
d硅胶层析，用85∶10∶5的EtOAC-MEOH-5％AcOH洗柱子，收集后在用50％的甲醇水溶解上HP-20，先用50％洗，再用100％的甲醇水冲洗，50％的回收再用；
e加己腈沉淀纽莫康定B0，再过滤，最终纯度为85％，含有部分色素；
f在正丙醇中，50mg/ml浓度，60度加热，加水后冷却到室温结晶。
此工艺的主要缺点是分离步骤烦琐，且上游发酵液中的色素很难彻底除去，最大的缺点是很多步骤难以实现大规模的工业化生产，如硅胶层析。
发明内容
为解决现有技术中制备纽莫康定B0的工艺难以除去发酵液中的色素，且整个流程较为繁琐的技术问题，本发明提供一种制备纽莫康定B0的简单方法，该方法不仅能够很好的去除纽莫康定B0中的色素，且能将其纯度提高到96％以上。
因此，本发明提供一种制备纽莫康定B0的方法，该方法包括下列步骤：
a)离心纽莫康定B0的发酵液，取菌丝体，用第一种溶剂浸取菌丝体中纽莫康定B0，过滤除去菌丝体；
b)将纽莫康定B0第一种溶剂浸取液中的溶剂蒸干，用第二种溶剂浸泡，过滤除去不溶物；
c)将纽莫康定B0第二种溶剂浸泡液蒸干后溶于第一种溶剂中，过酸性氧化铝柱，收集流出液；
d)将纽莫康定B0收集液蒸干后溶于第一种溶剂中，上吸附树脂，用第一种溶剂进行洗脱，收集洗脱液；
e)将纽莫康定B0收集液蒸干溶于第一种溶剂中，上反相树脂，用第一种溶剂进行洗脱，收集洗脱液；
f)将纽莫康定B0收集液蒸干后用第一种溶剂溶解，滴加少量水使其过饱和后结晶析出，制得纽莫康定B0。
本发明方法中的第一种溶剂可以选自甲醇或乙醇，优选为甲醇；第二种溶剂为正丁醇。
本发明方法中用草酸将a)步骤中纽莫康定B0发酵液的pH值调至2～4，优选pH值调至3。
本发明方法a)步骤中第一种溶剂和b)步骤中第二种溶剂所用的体积优选为菌丝体的1.5～2.5倍，优选1.5倍。
本发明方法a)步骤和b)步骤中的第一种溶剂的浓度优选大于90％。
本发明方法b)步骤中的第二种溶剂的浓度优选为100％。
本发明方法c)步骤中的第一种溶剂的浓度为70％～80％，优选浓度为75％。
本发明方法d)步骤中的上柱时第一种溶剂的浓度为60％～70％，优选浓度为65％，洗脱时第一种溶剂浓度为85％～95％，优选浓度为90％。
本发明方法e)步骤中的上柱时第一种溶剂的浓度为60％～70％，优选浓度为65％，洗脱时第一种溶剂浓度为85％～95％，优选浓度为90％。
本发明方法d)步骤中的洗脱液为纯度大于50％的部分；e)步骤中的洗脱液为纯度大于90％的部分。
本发明方法d)步骤中的吸附树脂优选为HP20树脂。
优选地，本发明方法e)步骤中的反相树脂优选为YPR-II树脂。
本申请人通过对比例证明，本发明方法的c)步骤能明显去除溶液中的色素，使得纽莫康定B0溶液的颜色由红棕色变为无色，如果没有这一步，最终的成品会有部分色素。
而在d)步骤中，由于所述的吸附树脂对极性较大的物质没有吸附作用，因此可以将溶液中的极性杂质去掉，使得纽莫康定B0的液相纯度得以提高。
本发明的e)步骤能够将氧化铝没有完全去除的杂质深深地吸附在树脂上不下来，且能够去除HPLC上保留时间在纽莫康定B0附近的杂质，因此其纯度有很大的提高。另外，由于此树脂对纽莫康定B0有很好的富集作用，洗脱时大量的纽莫康定B0被集中洗脱下来。
相对于现有技术，本发明的优点在于：整个工艺流程简单，成本较低，易于实现工业化生产。而且此工艺能够将发酵液中的色素和杂质基本去除，使得目标产物的纯度达到理想的水平。
具体实施方式
本发明纽莫康定B0HPLC检测条件如下：
色谱柱：ODS-C18(5μ)；
检测波长：210nm；
流动相：水∶甲醇∶己腈(20∶70∶10)；
流速：0.800ml/min
柱温：40℃。
本发明纽莫康定B0发酵条件如下：
菌种：ATCC 20957
斜面培养
培养基：PDA
条件：25℃，10天
种子培养
培养基：葡萄糖1.0％、甘露醇0.5％、甘油1.0％、棉籽粉2.5％、KH2PO4 0.5％，消前pH为6.8-7.0
条件：25℃，5天，摇床转速：250rpm
发酵培养
培养基：甘露醇8.0％、棉籽粉3.0％、酵母粉1.0％、KH2PO40.5％，消前pH7.0
121℃灭菌20min，接种量10％，摇瓶装量100ml/750ml，置于25℃恒温室中旋转式摇床250rpm摇瓶发酵9天后，得到纽莫康定B0发酵液。
实施例1～3考察了发酵液pH对分离工艺的影响。
实施例1
取纽莫康定B0发酵液500ml，其纯度为8％，单位为683ug/ml，将发酵液pH调为2.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定B0，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定B0，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为14.7％。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B0正丁醇浸取液蒸干后配成4∶1的甲醇水后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用两倍柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定B0纯度为34.9％，色素基本除去。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于3∶1的甲醇水中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用9∶1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为48.9％。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于3∶1的甲醇水中，以14ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用9∶1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为90.4％。最后再将纽莫康定B0蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为93.4％，以上几步的总收率约为36％。
实施例2
取纽莫康定B0发酵液500ml，其纯度为13％，单位为596ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定B0，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定B0，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为16.9％。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B0正丁醇浸取液蒸干后配成4∶1的甲醇水后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用两倍柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定B0纯度为42.7％，色素基本除去。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于3∶1的甲醇水中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用9∶1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为58.2％。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于3∶1的甲醇水中，以14ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用9∶1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为94％。最后再将纽莫康定B0蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为96.1％，以上几步的总收率约为34％。
实施例3
取纽莫康定B0发酵液500ml，其纯度为13％，单位为596ug/ml，将发酵液pH调为4.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定B0，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定B0，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为14.8％。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B0正丁醇浸取液蒸干后配成4∶1的甲醇水后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用两倍柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定B0纯度为39.4％，色素基本除去。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于3∶1的甲醇水中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用9∶1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为54.7％。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于3∶1的甲醇水中，以14ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用9∶1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为89％。最后再将纽莫康定B0蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为92.4％，以上几步的总收率约为35％。
实施例4～6考察不同浓度配比的溶剂对树脂吸附洗脱的影响
实施例4：
取纽莫康定B0发酵液500ml，其纯度为12.5％，单位为595ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定B0，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定B0，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为15.9％。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B0正丁醇浸取液蒸干后配成4∶1的甲醇水后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用两倍柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定B0纯度为43.5％，色素基本除去。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于含30％水的甲醇溶液中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用含5％水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为57.2％。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于含30％水的甲醇溶液中，以14ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用含5％水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为91.2％。最后再将纽莫康定B0蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为94.3％，以上几步的总收率约为34％。
实施例5：最佳配比例
取纽莫康定B0发酵液500ml，其纯度为12.5％，单位为595ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定B0，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定B0，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为15.9％。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B0正丁醇浸取液蒸干后配成4∶1的甲醇水后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用两倍柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定B0纯度为43.5％，色素基本除去。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于含35％水的甲醇溶液中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用含10％水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为62.4％。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于含35％水的甲醇溶液中，以14ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用含10％水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为95.4％。最后再将纽莫康定B0蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为97.2％，以上几步的总收率约为41％。
实施例6：
取纽莫康定B0发酵液500ml，其纯度为12.5％，单位为595ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定B0，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定B0，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为15.9％。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B0正丁醇浸取液蒸干后配成4∶1的甲醇水后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用两倍柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定B0纯度为43.5％，色素基本除去。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于含40％水的甲醇溶液中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用含15％水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为57.3％。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于含40％水的甲醇溶液中，以14ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用含15％水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为85.0％。最后再将纽莫康定B0蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为91.5％，以上几步的总收率约为37％。
实施例7，8，9考察不同浓度配比的溶剂对氧化铝洗脱的影响
实施例7
取纽莫康定B0发酵液500ml，其纯度为11.9％，单位为623ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定B0，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定B0，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为15.2％。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B0正丁醇浸取液蒸干后配成70％的甲醇后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用两倍柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定B0纯度为47.2％，色素基本除去，此步收率约为70％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于含35％水的甲醇溶液中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用含10％水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为63.2％。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于含35％水的甲醇溶液中，以14ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用含10％水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为95.6％。最后再将纽莫康定B0蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为97.3％，以上几步的总收率约为35％。
实施例8
取纽莫康定B0发酵液500ml，其纯度为11.9％，单位为623ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定B0，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定B0，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为15.2％。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B0正丁醇浸取液蒸干后配成75％的甲醇后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用两倍柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定B0纯度为45.2％，色素基本除去，此步收率约为85％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于含35％水的甲醇溶液中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用含10％水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为61.3％。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于含35％水的甲醇溶液中，以14ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用含10％水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为95.2％。最后再将纽莫康定B0蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为97.1％，以上几步的总收率约为40％。
实施例9
取纽莫康定B0发酵液500ml，其纯度为11.9％，单位为623ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定B0，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定B0，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为15.2％。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B0正丁醇浸取液蒸干后配成80％的甲醇后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用两倍柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定B0纯度为42％，大部分色素被除去，此步收率约为90％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于含35％水的甲醇溶液中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用含10％水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为59.2％。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于含35％水的甲醇溶液中，以14ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用含10％水的甲醇溶液洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为92.6％。最后再将纽莫康定B0蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为95.2％，以上几步的总收率约为40％。
实施例10，11，12考察不同体积的溶剂浸泡菌丝体对分离工艺的影响
实施例10
取纽莫康定B0发酵液500ml，其纯度为12.8％，单位为664ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体用1倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定B0，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定B0，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为15.6％，收率为65％。
实施例11
取纽莫康定B0发酵液500ml，其纯度为12.8％，单位为664ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定B0，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定B0，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为14.9％，收率为85％。
实施例12
取纽莫康定B0发酵液500ml，其纯度为12.8％，单位为664ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体用1倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定B0，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定B0，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为16.0％，收率为90％。
结论：用不同体积的甲醇和正丁醇浸泡发酵液对发酵液纯度的影响不大，但对其收率影响很大，两倍体积的溶剂和一倍体积相比提高不是很多，本着节约的原则，选用1.5倍。
实施例13考察乙醇作为第一种溶剂对分离工艺的影响
取纽莫康定B0发酵液500ml，其纯度为12.7％，单位为596ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体用1.5倍的乙醇浸泡提取其中的纽莫康定B0，过滤除去菌丝体，再将乙醇蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定B0，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为15.2％。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B0正丁醇浸取液蒸干后配成75％的乙醇后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用两倍柱体积同样配比的乙醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定B0纯度为46.2％，色素基本除去，此步收率约为80％
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于含35％水的乙醇溶液中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定B0没有完全被吸附在柱上，有10％左右的漏液，再用含10％水的乙醇溶液洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为60.4％。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于含35％水的乙醇溶液中，以14ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用含10％水的乙醇溶液洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为91.4％。最后再将纽莫康定B0蒸干用乙醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为92.1％，以上几步的总收率约为40％。
对比例1：考察步骤b)中不用正丁醇浸取对分离工艺的影响
取纽莫康定B0发酵液500ml，其纯度为9.3％，单位为667ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定B0，过滤除去菌丝体，检测其纯度为11.2％，且发酵液中含有很多水溶性的杂质。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B0甲醇溶液蒸干后配成4∶1的甲醇水后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用两倍柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定B0纯度为30.1％，大部分色素除去。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于3∶1的甲醇水中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用9∶1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为42.6％。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于3∶1的甲醇水中，以14ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用9∶1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为87％。最后再将纽莫康定B0蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为92.4％，以上几步的总收率约为42％。
结论：工艺中如果没有正丁醇浸泡这一步，发酵液中很多水溶性的杂质难以除去，使得最终成品的纯度有所降低。
对比例2：考察缺少步骤c)对分离工艺的影响
取纽莫康定B0发酵液500ml，其纯度为12.5％，单位为586ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定B0，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定B0，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为15.9％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定B0正丁醇溶液蒸干后溶解于3∶1的甲醇水中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用9∶1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为42.2％，收集液中有少量色素，溶液呈淡黄色。
同样装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于3∶1的甲醇水中，以14ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用9∶1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为91％。收集液中含有少量色素。最后再将纽莫康定B0蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后结晶析出，此时纯度为94.6％，晶体含有少量色素。以上几步的总收率约为42％。
对比例3：考察缺少步骤d)对分离工艺的影响
取纽莫康定B0发酵液500ml，其纯度为12.5％，单位为586ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定B0，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定B0，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为15.9％。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B0正丁醇浸取液蒸干后配成4∶1的甲醇水后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用两倍柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定B0纯度为42.7％，色素基本除去。
装一根高约20cm，直径约为4cm的YPR-II树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于3∶1的甲醇水中，以14ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用9∶1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为61.8％。
最后再将纽莫康定B0蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后放入结晶设备中，发现无法结晶，最终只能得到纯度为61.8％的白色无定形物。
对比例4：考察缺少步骤e)对分离工艺的影响
取纽莫康定B0发酵液500ml，其纯度为12.5％，单位为586ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的纽莫康定B0，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸干后用同样体积的正丁醇浸取纽莫康定B0，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为15.9％。
装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将纽莫康定B0正丁醇浸取液蒸干后配成4∶1的甲醇水后以较快的流速通过氧化铝柱，过完再用两倍柱体积同样配比的甲醇水过柱，收集所有流出液，此时纽莫康定B0纯度为42.7％，色素基本除去。
装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将纽莫康定B0蒸干后溶解于3∶1的甲醇水中，以12ml/min的流速过柱，纽莫康定B0完全被吸附在柱上，再用9∶1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为58.2％。
最后再将纽莫康定B0蒸干用甲醇溶解，加入少量水使其过饱和后放入结晶设备中，发现无法结晶，最终只能得到纯度为58.2％的白色无定形物。
附：本发明所用树脂型号
1DIAION HP20
生产厂家：日本三菱公司
比表面积(m2/g)：600
孔半径(
)：＞200
表观密度(g/L-R)：680
水含量(％)：55-65
2YPR II
生产厂家：安徽三星树脂科技有限公司
交换当量相对红霉素u/ml：≥8万
水份％：45-55
粒度(0.315-1.25mm)：≥95
机械强度％：≥90
Claims (13)
1.制备纽莫康定B0的方法，该方法包括下列步骤：
a)离心纽莫康定B0的发酵液，取菌丝体，用第一种溶剂浸取菌丝体中纽莫康定B0，过滤除去菌丝体，其中所述第一种溶剂的浓度为大于90％；
b)将纽莫康定B0第一种溶剂浸取液中的溶剂蒸干，用正丁醇浸泡，过滤除去不溶物，其中所述第一种溶剂的浓度为大于90％；
c)将纽莫康定B0正丁醇浸泡液蒸干后溶于第一种溶剂中，过酸性氧化铝柱，收集流出液，其中所述第一种溶剂的浓度为70％～80％；
d)将纽莫康定B0收集液蒸干后溶于第一种溶剂中，上吸附树脂，用第一种溶剂进行洗脱，收集洗脱液，其中作为溶剂的第一种溶剂的浓度为60％～70％，作为洗脱剂的第一种溶剂的浓度为85％～95％；
e)将纽莫康定B0收集液蒸干溶于第一种溶剂中，上反相树脂，用第一种溶剂进行洗脱，收集洗脱液，其中作为溶剂的第一种溶剂的浓度为60％～70％，作为洗脱剂的第一种溶剂的浓度为85％～95％；
f)将纽莫康定B0收集液蒸干后用第一种溶剂溶解，滴加少量水使其过饱和后结晶析出，制得纽莫康定B0；
其中所述第一种溶剂为甲醇或乙醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将a)步骤中纽莫康定B0发酵液的pH值调为2～4。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将a)步骤中纽莫康定B0发酵液的pH值调为3。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，a)步骤中第一种溶剂和b)步骤中正丁醇所用的体积为菌丝体的1.5～2.5倍。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，a)步骤中第一种溶剂和b)步骤中正丁醇所用的体积为菌丝体的1.5倍。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，b)步骤中的正丁醇的浓度为100％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，c)步骤中的第一种溶剂的浓度为75％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，d)步骤和e)步骤中的作为溶剂的第一种溶剂的浓度为65％。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，d)步骤和e)步骤中的作为洗脱剂的第一种溶剂的浓度为90％。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，d)步骤中的洗脱液为纯度大于50％的部分。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，e)步骤中的洗脱液为纯度大于90％的部分。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，d)步骤中的吸附树脂为HP20树脂。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，e)步骤中的反相树脂为YPR-II树脂。
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