CN1858061A - 一种万古霉素柱层析纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种万古霉素柱层析纯化方法,其采用以Sephadex C系列为填料的柱进行柱层析,用一定浓度的盐溶液梯度洗脱,其特征在于该盐溶液选用C1-3有机羧酸的铵盐溶液。本发明方法克服了现有过柱过程中碳酸盐分解起泡的现象,从而提高了塔板数,分辨率提高,上样量增加;且万古霉素的含量提高,杂质量减少。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗生素万古霉素的提取纯化方法,特别是一种万古霉素柱层析纯化方法。
背景技术
万古霉素是一种糖肽类的抗生素,用于治疗由革兰氏阳性菌引起的感染疾病。特别对由β-内酰胺类抗生素引起的耐药金黄色葡萄球菌以及难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)有较好的疗效。本申请人的专利申请(公开号CN1616651A)公开了用盐酸调节发酵产生的发酵液pH,过滤后过D1300大孔树脂,用酸性乙醇水溶液洗脱,洗脱液浓缩,采用以Sephadex C系列为填料的柱进行柱层析,用一定浓度的盐溶液梯度洗脱,收集有效部分,活性炭脱色微孔滤膜过滤除去热源后,冷冻干燥得到万古霉素盐酸盐无菌原料干粉。其中有一步采用以Sephadex C系列树脂为填料的柱进行柱层析,用0.01-1M的NH4HCO3、(NH4)2CO3水溶液洗脱的方法纯化,过柱过程中碳酸盐会分解起泡,从而影响了分离效率;制得干粉中万古霉素的含量为94.4%,杂质含量为1%。
发明内容
本发明要解决的技术问题即为克服上述现有技术中的缺陷,提供一种能提高塔板数、分辨率和/或上样量,且能保证纯化质量的万古霉素柱层析纯化方法。
为解决上述问题,本发明人拟采用在过柱过程中不会分解起泡的盐溶液来替代碳酸铵或碳酸氢铵溶液。但在研发过程中发现,许多常用的盐溶液,如硫酸、盐酸、磷酸等形成的可溶性无机盐(如其碱金属盐、铵盐等),诸如硫酸、盐酸、磷酸等酸的钠/钾/铵盐等,虽然在过柱过程中不会分解起泡,但可能带来新的问题,如容易被氧化,会产生新的色素等杂质,从而影响万古霉素的纯化质量。
本发明人通过尝试不同的盐溶液,筛选出符合本发明要求的盐溶液,由此得出能解决本发明技术问题的如下技术方案。
一种万古霉素柱层析纯化方法,其采用以Sephadex C系列为填料的柱进行柱层析,用一定浓度的盐溶液梯度洗脱,其特征在于该盐溶液选用C1-3有机羧酸的铵盐溶液。
其中,该C1-3有机羧酸的铵盐优选C1-3一元羧酸的铵盐,更优选自甲酸铵、乙酸铵、丙酸铵和乳酸铵。
而本发明万古霉素柱层析纯化方法中的其他步骤、条件,如柱填料(Sephadex C-15/C-25/C-50)、洗脱液盐溶液浓度(0.01~1M)等均同上述CN1616651A专利申请公开的内容一样。
采用上述有机羧酸铵盐替换碳酸盐作为洗脱液,克服了过柱过程中碳酸盐分解起泡的现象,从而提高了塔板数,分辨率提高,上样量增加;并且保证纯化质量,使万古霉素的含量提高,杂质量减少。
具体实施方式
实施例1
选用经过D1300大孔树脂,用pH2.0的80%酸性乙醇水溶液洗脱,并浓缩的含有万古霉素的洗脱液,采用以Sephadex C-15系列树脂为填料的柱进行柱层析,用0.05M浓度的甲酸铵(NH4COOH)水溶液梯度洗脱,收集HPLC检测面积比95%以上的部分,活性炭脱色,0.22um微孔滤膜过滤除去热源后,冷冻干燥得到万古霉素盐酸盐无菌原料干粉。上液量为8%;最终产品中万古霉素含量为95.5%,单个杂质为0.6%。
实施例2
采用以Sephadex C-25系列树脂为填料的柱进行柱层析,用0.1M浓度的乙酸铵(CH3COONH4)作为柱层析洗脱液,余同实施例1,制得到万古霉素盐酸盐无菌原料干粉。上液量为8%;最终产品中万古霉素含量为95.3%,单个杂质为0.7。
实施例3
采用以Sephadex C-50系列树脂为填料的柱进行柱层析,用1M浓度的丙酸铵(CH3CH2COONH4)水溶液梯度洗脱,余同实施例1,制得到万古霉素盐酸盐无菌原料干粉。上液量为8%;最终产品中万古霉素含量为95.1%,单个杂质为0.8%。
实施例4
换用1M浓度的乳酸铵[CH3CH(OH)COONH4]水溶液梯度洗脱,余同实施例1,制得到万古霉素盐酸盐无菌原料干粉。上液量为8%;最终产品中万古霉素含量为95.0%,单个杂质为0.8%。
Claims (3)
1、一种万古霉素柱层析纯化方法,其采用以Sephadex C系列为填料的柱进行柱层析,用一定浓度的盐溶液梯度洗脱,其特征在于该盐溶液选用C1-3有机羧酸的铵盐溶液。
2、如权利要求1所述的万古霉素柱层析纯化方法,其特征在于该C1-3有机羧酸的铵盐为C1-3一元羧酸的铵盐。
3、如权利要求2所述的万古霉素柱层析纯化方法,其特征在于该C1-3一元羧酸的铵盐选自甲酸铵、乙酸铵、丙酸铵和乳酸铵。
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2006
- 2006-01-06 CN CNB200610023150XA patent/CN100549026C/zh not_active Expired - Fee Related
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