CN102050866B - 一种糖肽类化合物的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种糖肽类化合物的纯化方法，该方法包括以下步骤：A)将糖肽类化合物水溶液上样至反相聚合物填料Uni PS；B)使用预洗溶液预洗；C)以洗脱溶液洗脱。使用本发明提供的方法，可有效提高糖肽类化合物目的组分的品质，缩短纯化周期，减少收率损失，且该方法不仅可以用于糖肽类化合物在实验室进行少量样品的制备，还能应用于糖肽类化合物的工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于糖肽类化合物领域，具体地说，涉及一种糖肽类化合物的纯化方法。
背景技术
现有糖肽类化合物一般采用反相硅胶或者葡聚糖凝胶作为介质进行纯化制备，其中，应用最广的反相硅胶是C18，即将样品粗分后，溶于水溶液(或者含有机溶剂的水溶液)中，以能与水互溶的有机溶剂水溶液(或含缓冲盐的水溶液)作为洗脱剂，解吸液经脱盐等后处理、干燥得到纯品。这种方法由于存在成本较高、收率低、不可逆吸附严重、介质耐受性差等缺陷，一般只能用于实验室少量样品的制备。
工业化生产中应用较多的是采用葡聚糖凝胶作为介质进行纯化制备，如专利号为200310109688.9的中国发明专利中使用G-15纯化去甲万古霉素，就是先将样品浓缩至20000～30000μg/ml，再过G-15，以磷酸水溶液解吸，解吸液pH值调至7.0～7.4，过滤，滤饼以盐酸水溶液溶解后加丙酮结晶、过滤、洗涤、脱盐、干燥等步骤，得到纯品。不过葡聚糖凝胶存在在不同溶剂中溶胀系数相差较大，分辨率不高，且在解吸时拖尾严重，解吸速度过慢等缺陷，也不是一种理想的制备工艺。
因此，有必要提供一种新的糖肽类化合物的纯化方法，以用于糖肽类化合物的实验室少量样品制备和工业化生产。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有糖肽类化合物纯化工艺所存在的缺点和不足，从而提供一种糖肽类化合物的纯化方法，以有效提高目的组分的品质，缩短纯化周期，减少收率损失。
本发明的糖肽类化合物的纯化方法包括以下步骤：
A)将所述糖肽类化合物水溶液上样至反相聚合物填料Uni PS；
B)使用体积百分比为1-10％的甲醇水溶液作为预洗溶液进行预洗；
C)使用体积百分比为5-20％的甲醇水溶液作为洗脱溶液进行洗脱。
根据本发明的一个优选实施例，使用的反相聚合物填料Uni PS为Uni PS25-300或Uni PS40-300。
根据本发明的一个优选实施例，使用的洗脱溶液中含0-0.01％HCl。
根据本发明的一个优选实施例，使用的糖肽类化合物为经过粗纯的糖肽类化合物。
根据本发明的一个优选实施例，还包括将获得的洗脱液浓缩干燥的步骤。
本发明还有一个目的在于，提供反相聚合物填料Uni PS用于纯化糖肽类化合物的应用。
根据本发明的一个优选实施例，使用的反相聚合物填料Uni PS为Uni PS25-300或Uni PS40-300。
使用本发明的纯化方法，可有效提高糖肽类化合物目的组分的品质，缩短纯化周期，减少收率损失，而且该方法不仅可以用于糖肽类化合物在实验室进行少量样品的制备，还能应用于糖肽类化合物的工业化生产。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
在本发明的下述实施例中，使用的凝胶型阳离子交换树脂001×4购自上海华震科技有限公司，大孔吸附树脂XAD-1600购自Rohm&Haas，反相聚合物填料Uni PS25-300购自苏州纳微科技有限公司。
在本发明的下述实施例中，使用的洗脱溶液和预洗溶液的浓度百分比均为体积百分比。
在本发明的下述实施例中，使用的化合物1-8的主体结构如结构式(I)所示，其相应的取代基R1-R6分别如表1所示：
表1、化合物1-8的取代基列表
| 编号 | 化合物 | R1 | R2 | R3 | R4 | R5 | R6 |
| 1 | 万古霉素 | Cl | Cl | H | Me | A | H |
| 2 | N-去甲万古霉素 | Cl | Cl | H | H | A | H |
| 3 | 6位万古糖胺三糖万古霉素 | Cl | Cl | H | Me | A | C |
| 4 | 6位万古糖胺单糖万古霉素 | Cl | Cl | H | Me | H | C |
| 5 | 无氯万古霉素 | H | H | H | Me | A | H |
| 6 | N-甲基万古霉素 | Cl | Cl | Me | Me | A | H |
| 7 | 4位葡萄糖单糖万古霉素 | Cl | Cl | H | Me | B | H |
| 8 | 无糖万古霉素 | Cl | Cl | H | Me | H | H |
表1中，使用的基团A-C分别如下(II)-(IV)所示：
实施例1、化合物3制备及粗纯
1.1、制备
参照申请号为200910053906.9的中国发明专利申请中的发酵方法，制备化合物3的发酵液，经检测，其效价为0.3mg/ml。
1.2、粗纯
取步骤1.1中制备的发酵液20L，调pH至9.0后过滤，将获得的澄清滤液上样至500ml大孔吸附树脂XAD-1600(Rohm&Haas)，然后以8％的乙醇水溶液洗涤树脂。
接着用2L 0.05％的HCl水溶液洗脱，收集洗脱液，以300Da孔径的纳滤膜浓缩至500ml后，再加入100g凝胶型阳离子交换树脂001×4，静态脱色6小时。
滤去树脂，将脱色液冻干，得到化合物3的粗品4.3g。
经检测，获得的化合物3的粗品的色谱纯度为70％。
实施例2-10、化合物1，2，4-8精纯
取表2所示的化合物1，2，4-8的粗品各0.20g，分别溶于10ml纯水中后，上样至装有10ml反相聚合物填料Uni PS的10mm×20cm玻璃层析柱中，上样流速为10ml/h。待上样结束后，以10ml甲醇水溶液预洗1h，再以含或不含HCl的甲醇水溶液洗脱，洗脱流速20ml/h。洗脱6ml后开始收集洗脱液，共收集获得洗脱液15ml，将洗脱液浓缩干燥，分别得到化合物1，2，4-8的精纯产品，粗品的色谱纯度、精纯步骤的中使用的预洗溶液和洗脱溶液分别如表2所示，对获得的上述化合物的精纯产品进行检测并计算上述化合物的收率，结果如表3所示。
表2、粗品色谱纯度、预洗溶液和洗脱溶液
| 实施例 | 化合物 | 粗品色谱纯度 | Uni PS | 预洗溶液 | 洗脱溶液 |
| 2 | 1 | 81％ | 25-300 | 5％甲醇水溶液 | 12％甲醇+0.005％HCl水溶液 |
| 3 | 2 | 78％ | 25-300 | 5％甲醇水溶液 | 10％甲醇+0.005％HCl水溶液 |
| 4 | 4 | 63％ | 25-300 | 10％甲醇水溶液 | 20％甲醇+0.01％HCl水溶液 |
| 5 | 5 | 75％ | 25-300 | 3％甲醇水溶液 | 9％甲醇+0.005％HCl水溶液 |
| 6 | 6 | 84％ | 25-300 | 8％甲醇水溶液 | 15％甲醇 |
| 7 | 7 | 79％ | 25-300 | 5％甲醇水溶液 | 15％甲醇+0.003％HCl水溶液 |
| 8 | 8 | 65％ | 25-300 | 10％甲醇水溶液 | 20％甲醇+0.01％HCl水溶液 |
| 9 | 2 | 78％ | 40-300 | 5％甲醇水溶液 | 10％甲醇+0.005％HCl水溶液 |
| 10 | 7 | 79％ | 40-300 | 8％甲醇水溶液 | 15％甲醇+0.003％HCl水溶液 |
表3、精纯产物的检测结果
| 实施例 | 产量 | 颜色 | 色谱纯度 | 收率 |
| 2 | 0.14g | 白色 | 98.1％ | 84.8％ |
| 3 | 0.12g | 白色 | 97.5％ | 75.0％ |
| 4 | 0.1g | 类白色 | 95.8％ | 76.0％ |
| 5 | 0.11g | 白色 | 97.0％ | 71.1％ |
| 6 | 0.15g | 白色 | 98.5％ | 87.9％ |
| 7 | 0.12g | 白色 | 97.3％ | 73.9％ |
| 8 | 0.1g | 白色 | 95.8％ | 73.7％ |
| 9 | 0.12g | 白色 | 97.0％ | 74.6％ |
| 10 | 0.12g | 白色 | 96.9％ | 73.6％ |
根据表2和表3的结果，采用上述方法和条件对糖肽类化合物进行精纯，获得的纯品的色谱纯度＞95％，收率＞70％，因此能获得色谱纯度和收率均达到精纯要求的产品。
实施例11-19、化合物3精纯
取实施例1得到的化合物3的粗品6份，每份0.20g，分别溶于10ml纯水中，然后分别上样至装有10ml反相聚合物填料Uni PS的10mm×20cm玻璃层析柱中，上样结束后，以10ml甲醇水溶液预洗1h，再以含或不含HCl的甲醇水溶液洗脱，洗脱6ml后开始收集洗脱液，共收集获得洗脱液15ml，然后将洗脱液浓缩干燥，得到化合物3的精纯产品，纯化步骤参数如表4所示，并对获得的化合物3的精纯产品进行检测，检测结果如表5所示。
表4、精纯参数
| 实施例 | UniPS | 上样流速 | 预洗溶液 | 洗脱溶液 | 洗脱流速 |
| 11 | 25-300 | 10ml/h | 0.5％甲醇水溶液 | 8％甲醇+0.005％HCl | 10ml/h |
| 12 | 25-300 | 10ml/h | 1％甲醇水溶液 | 5％甲醇+0.001％HCl | 20ml/h |
| 13 | 25-300 | 20ml/h | 2％甲醇水溶液 | 8％甲醇 | 20ml/h |
| 14 | 25-300 | 20ml/h | 2％甲醇水溶液 | 8％甲醇+0.005％HCl | 20ml/h |
| 15 | 25-300 | 20ml/h | 2％甲醇水溶液 | 10％甲醇+0.005％HCl | 20ml/h |
| 16 | 25-300 | 30ml/h | 2％甲醇水溶液 | 12％甲醇+0.01％HCl | 20ml/h |
| 17 | 25-300 | 10ml/h | 5％甲醇水溶液 | 10％甲醇+0.01％HCl | 30ml/h |
| 18 | 40-300 | 10ml/h | 2％甲醇水溶液 | 8％甲醇+0.005％HCl | 10ml/h |
| 19 | 40-300 | 20ml/h | 5％甲醇水溶液 | 10％甲醇+0.005％HCl | 20ml/h |
表5、精纯产物的检测结果
| 实施例 | 产量 | 颜色 | 纯度 | 收率 |
| 11 | 0.14 | 类白色 | 88.4％ | 88.4％ |
| 12 | 0.08g | 类白色 | 96.7％ | 55.3％ |
| 13 | 0.07g | 类白色 | 97.1％ | 48.6％ |
| 14 | 0.13g | 类白色 | 98.4％ | 91.4％ |
| 15 | 0.14g | 类白色略偏红 | 94.4％ | 94.4％ |
| 16 | 0.14g | 类白色略偏红 | 89.1％ | 89.1％ |
| 17 | 0.1g | 类白色略偏红 | 92.6％ | 66.1％ |
| 18 | 0.13 | 类白色 | 97.9％ | 90.9％ |
| 19 | 0.09 | 类白色略偏红 | 93.0％ | 59.8％ |
根据表4和表5的结果，上样流速和洗脱流速对精纯后的产品的纯度和收率影响不大；而不同的预洗溶液和洗脱溶液组合，对精纯后的产品的纯度和收率均会产生一定影响，其中对纯度影响较小，而收率受到的影响相对较大，但由于上述实施例中获得的精纯后的产品的最低收率也接近50％，因此，该方法可用于精纯糖肽类化合物。
上述结果显示，将糖肽类化合物水溶液上样至反相聚合物填料，然后使用1-10％的甲醇水溶液预洗，再以含有0-0.01％HCl和5-20％甲醇的溶液洗脱，将收集获得的洗脱液浓缩干燥处理，获得的糖肽类化合物的色谱纯度大多达到90％以上；收率为48.6％-94.4％。
综上所述，使用本发明提供的方法，可有效提高糖肽类化合物目的组分的品质，该方法操作简单，洗脱过程中未使用缓冲液，因此，不需要对洗脱液进行脱盐处理，从而，缩短了纯化周期，减少了收率损失，而且该方法不仅可以用于糖肽类化合物在实验室进行少量样品的制备，还能应用于糖肽类化合物的工业化生产。
Claims (7)
1.一种糖肽类化合物的纯化方法，所述糖肽类化合物为万古霉素类化合物，所述万古霉素类化合物为万古霉素、N-去甲万古霉素、6位万古糖胺三糖万古霉素、6位万古糖胺单糖万古霉素、无氯万古霉素、N-甲基万古霉素、4位葡萄糖单糖万古霉素、无糖万古霉素，其特征在于包括以下步骤：
A)将所述糖肽类化合物水溶液上样至反相聚合物填料Uni PS，所述反相聚合物填料Uni PS为Uni PS25-300或Uni PS40-300；
B)使用预洗溶液进行预洗；
C)使用洗脱溶液进行洗脱；
其中，所述万古霉素使用体积百分比为5％的甲醇水溶液作为预洗溶液进行预洗，使用体积百分比为12％的甲醇水溶液和0.005％的HCl水溶液作为洗脱溶液进行洗脱；
所述N-去甲万古霉素使用体积百分比为5％的甲醇水溶液作为预洗溶液进行预洗，使用体积百分比为10％的甲醇水溶液和0.005％的HCl水溶液作为洗脱溶液进行洗脱；
所述6位万古糖胺三糖万古霉素使用体积百分比为0.5-5％的甲醇水溶液作为预洗溶液进行预洗，使用体积百分比为8-12％的甲醇水溶液和0.005-0.01％的HCl水溶液作为洗脱溶液进行洗脱；
所述6位万古糖胺单糖万古霉素使用体积百分比为10％的甲醇水溶液作为预洗溶液进行预洗，使用体积百分比为20％的甲醇水溶液和0.01％的HCl水溶液作为洗脱溶液进行洗脱；
所述无氯万古霉素使用体积百分比为3％的甲醇水溶液作为预洗溶液进行预洗，使用体积百分比为9％的甲醇水溶液和0.005％的HCl水溶液作为洗脱溶液进行洗脱；
所述N-甲基万古霉素使用体积百分比为8％的甲醇水溶液作为预洗溶液进行预洗，使用体积百分比为15％的甲醇水溶液作为洗脱溶液进行洗脱；
所述4位葡萄糖单糖万古霉素使用体积百分比为5-8％的甲醇水溶液作为预洗溶液进行预洗，使用体积百分比为15％的甲醇水溶液和0.003％的HCl水溶液作为洗脱溶液进行洗脱；
所述无糖万古霉素使用体积百分比为10％甲醇水溶液作为预洗溶液进行预洗，使用体积百分比为20％的甲醇水溶液和0.01％的HCl水溶液作为洗脱溶液进行洗脱。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预洗溶液的流速为1-3倍柱体积/小时。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱溶液的流速为2-3倍柱体积/小时。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖肽类化合物为经过粗纯的糖肽类化合物。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括收集洗脱液和将洗脱液浓缩干燥的步骤。
6.反相聚合物填料Uni PS用于纯化糖肽类化合物的应用，所述糖肽类化合物为万古霉素类化合物，所述万古霉素类化合物为万古霉素、N-去甲万古霉素、6位万古糖胺三糖万古霉素、6位万古糖胺单糖万古霉素、无氯万古霉素、N-甲基万古霉素、4位葡萄糖单糖万古霉素、无糖万古霉素，所述反相聚合物填料Uni PS为Uni PS25-300或Uni PS40-300。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述糖肽类化合物为经过粗纯的糖肽类化合物。
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