CN102295686A - 一种纽莫康定b0的提取纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纽莫康定B₀的提取纯化方法，包括：a)将含有纽莫康定B₀的发酵液pH值调至2.0~4.0，过滤，菌渣用低分子醇浸提，得浸提液；b)调整浸提液的醇浓度及pH；c)用吸附树脂吸附浸提液后，依次用水、丙酮-水溶液冲洗树脂，然后用丙酮-酸溶液洗脱树脂，收集富含纽莫康定B₀的洗脱液；d)纽莫康定B₀洗脱液加水稀释后，用吸附树脂吸附，用水冲洗树脂后用低分子醇洗脱，收集富含纽莫康定B₀的洗脱液；e)以常规方法结晶得纽莫康定B₀。通过提取纯化方法的改进，使得纽莫康定B₀的提取纯化的生产成本低，工艺步骤简单，易于工业化生产，同时在提取纯化过程中脱色效果明显，产物纯度高。

Description

一种纽莫康定B₀的提取纯化方法

技术领域

本发明属药物化学领域，具体涉及一种纽莫康定B₀的提取纯化方法。

背景技术

纽莫康定B₀（Pneumocandin B₀）是由真菌产生的次级代谢产物，是合成抗真菌药物卡泊芬净（Caspofungin）的中间体。纽莫康定B₀由真菌发酵产生，发酵过程中会产生与纽莫康定B₀结构相近似的副产物及大量的色素，因此纽莫康定B₀的提取纯化方法较复杂。

在Pneumocandins From Zalerion Arboricola I. Discovery And Isolation（The Journal Of Antibiotics 45(12):1853-66）一文中描述了纽莫康定B₀的提取纯化方法：采用甲醇对发酵液提取，离心后的菌渣加入甲醇再提取2次，得到的甲醇提取液合并；甲醇提取液加水稀释后用SP207树脂吸附，先用65%甲醇洗，再用100%甲醇洗脱，收集纽莫康定B₀；加水稀释后用HP20树脂吸附，先用50%甲醇洗，再用100%甲醇洗脱，收集纽莫康定B₀；加水稀释后再次用SP207树脂吸附，先用65%甲醇洗，再用100%甲醇洗脱，收集纽莫康定B₀；浓缩，用醋酸异丙酯沉淀，离心过滤得到纽莫康定B₀固体，纯度为67%；最后用硅胶层析和HP20树脂吸附进行再次纯化，浓缩，用乙腈沉淀，最终纽莫康定B₀产品纯度约85%。

美国专利申请Purification Process（US6610822）提供的纽莫康定B₀的提取纯化方法，采用萃取和反萃取法，这一方法要使用大量的异丁醇、甲醇和庚烷等有机溶媒，反复萃取和洗涤，操作较复杂，最终沉淀得到的纽莫康定B₀固体，含量80%左右。

以上两种纽莫康定B₀的提取纯化方法都存在操作步骤复杂，发酵液色素和杂质难去除，最终产品色泽深和纯度不高等问题。

中国发明专利《制备纽莫康定B₀的方法》（专利申请号200910133118.0）描述了一种新的纽莫康定B₀纯化方法，主要步骤是：a）离心纽莫康定B₀发酵液，取菌丝体，用甲醇浸提纽莫康定B₀；b）将甲醇浸提液蒸干，再用正丁醇浸提纽莫康定B₀；c）将正丁醇浸提液蒸干，再用70-80%甲醇浸提纽莫康定B₀，过酸性氧化铝柱，收集流出液；d）将纽莫康定B₀收集液蒸干后，用60-70%甲醇溶解，上HP20吸附树脂，用85-95%甲醇洗脱，收集洗脱液纽莫康定B₀纯度在50-65%间；e）将纽莫康定B₀收集液蒸干，溶于60-70%甲醇中，上反相树脂YPR-Ⅱ，用85-95%甲醇洗脱，收集的纽莫康定B₀纯度大于90%；f）将纽莫康定B₀收集液蒸干后，用甲醇溶解，滴加少量水使之过饱和结晶析出，制得纽莫康定B₀，纯度可达到96%。这个纯化方法虽然能够改善纽莫康定B₀产品质量，脱除了大量色素和提高了产品纯度，但整个工艺步骤复杂，几乎每一步骤都要将纽莫康定B₀溶液蒸干，在实验室规模的小试中容易做到，但在工业化生产中是很难将纽莫康定B₀溶液蒸干，而且纽莫康定B₀在长时间加热下容易破坏，因此，该方法并不适合纽莫康定B₀的工业化生产。

因此寻找更有效的脱色方法和更简便的提取纯化方法，才有可能实现纽莫康定B₀的工业化生产。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的纽莫康定B₀的提取纯化难以产业化，提纯工艺复杂的缺陷，提供有效方法去除纽莫康定B₀中的色素，提高纽莫康定B₀的含量，并使其工业化生产变得更简便。

本发明提供了一种纽莫康定B₀的提取纯化方法，包括以下步骤：

a) 将含有纽莫康定B₀的发酵液pH值调至2.0~4.0，过滤，菌渣用低分子醇浸提，得浸提液；

b) 调整浸提液的醇浓度至30-50%(V/V)， pH为6.0-8.0；

c) 用吸附树脂吸附浸提液后，依次用水、30-50%（V/V）丙酮-水溶液冲洗树脂，然后用pH 值为3.0-5.0的50%-80%（V/V）丙酮-酸溶液洗脱树脂，收集富含纽莫康定B₀的洗脱液；

d) 纽莫康定B₀洗脱液加水稀释至丙酮浓度为30-50%（V/V），用吸附树脂吸附，用水冲洗树脂后用低分子醇洗脱，收集富含纽莫康定B₀的洗脱液；

e) 以常规方法结晶得纽莫康定B₀。

具体地说，

其中所述的步骤a)中调含有纽莫康定B₀的发酵液pH值的为盐酸、硫酸、磷酸、丙酸、草酸、柠檬酸或乙酸中的任一种或一种以上，优选盐酸、硫酸、磷酸或乙酸中的任一种或一种以上，更优选磷酸。pH值优选调至3.0~3.5。调好pH后静置一段时间，经离心或板框过滤，得到富含纽莫康定B₀的菌渣，滤液中纽莫康定B₀含量几乎为零。菌渣用低分子醇类浸提，低分子醇类为甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中的任一种，优选毒性最低的乙醇。

其中所述的步骤b)中，浸提液可经过减压浓缩后加水或添加醇类稀释，或者直接添加水稀释，使浸提液中醇浓度控制为40–50 % ( V/V)。优选减压浓缩方法，这种方法更适合工业化生产，可回收醇类溶剂，降低成本，浓缩时温度不高于60℃，优选不高于55℃。浸提液的pH值调整到6.5-7.5。

其中所述的步骤c)中的丙酮-水溶液中丙酮浓度优选为40-45%（V/V）。丙酮-酸溶液，是用磷酸、盐酸、甲酸或乙酸将pH值优选为调为 3.5-4.5，丙酮-酸溶液中丙酮浓度为优选为60-65%（V/V）的。

同样的道理，步骤d）中的低分子醇类选自甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中的任一种，优选毒性最低的乙醇。

其中所述的步骤c)和d)采用的吸附树脂为PAD900、 HP20、SP207、XAD1600及XAD系列、X-5中的任一种，优选为PAD900。

纽莫康定B₀的醇类洗脱液可通过常规方法进行浓缩、结晶。比如可采用减压浓缩，浓缩至干得到的纽莫康定B₀固体为浅黄色或类白色，纯度在85%以上；纽莫康定B₀固体用低分子醇类，如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇等溶解，加入少量水并使之过饱和后结晶析出，或采用其他已知的结晶方法，可制备得到纯度90%以上的纽莫康定B₀。

实际上，纯度90%以上的纽莫康定B₀即可用于合成卡泊芬净，若要将纽莫康定B₀纯度进一步提高到95%以上，只需采用已知的硅胶层析技术或反相层析技术即可达到，如文献The Journal Of Antibiotics 45(12):1853-66中的硅胶层析技术和专利CN101659693A所用反相树脂YPR-Ⅱ的层析技术。

本发明所公开的提取纯化方法之所以使提纯物的纯度高且提纯工艺可以产业化，其主要的技术诀窍在于：

1、在步骤a)中，通过将发酵液pH值调至2.0~4.0，使存在于发酵液和菌渣中的纽莫康定B₀一起沉淀下来，滤液中基本没有纽莫康定B_0。这一工艺与发酵液全浸提工艺相比，本发明只是将富含纽莫康定B₀的滤渣用低分子醇类浸提，可以减少醇的用量，还可以减少杂质的浸出。这一方面大大减少了醇的用量，简便了工艺，又方便了后续的纯化工艺，使获得高纯度纽莫康定B₀的更为方便；

2、在步骤b)中，将浸提液的pH值调整到6.5-7.5，这可改善浸提液的溶解性能，有利于吸附树脂的快速吸附和选择性吸附，使大量的色素类杂质不被树脂吸附而除去，从而保证纽莫康定B₀的纯度；

3、在步骤c)中，采用丙酮进行洗脱。与甲醇、乙醇等相比，丙酮洗脱的脱除杂质能力更强，加上采用丙酮-酸溶液的洗脱，可使最终收集到的纽莫康定B₀洗脱液颜色很浅，接近无色，大大提高了纽莫康定B₀的纯度；

4、在步骤c)中，采用丙酮-酸溶液进行洗脱，用磷酸、盐酸、甲酸或乙酸将pH值调为 3.5-4.5，偏酸性pH值的洗脱液可以减少杂质从树脂上洗脱下来，并有利于提高纽莫康定B₀的纯度和稳定性。

    本发明提供的技术方案的技术效果主要体现在：成本低，工艺步骤简单，易于工业化生产，同时纽莫康定B₀提取纯化过程中脱色效果明显，产物纯度高。

 

具体实施方式

以下实施例中所采用的HPLC方法说明：

检测条件：

色谱柱：Hypersil ODS 2 (5μm，4.6×250mm)

流动相：水：乙腈=57：43

流速：1mL/min

柱温：40℃

检测波长：210nm

实施例1 

取纽莫康定B₀发酵液1000ml，用盐酸溶液将pH调至2.0，离心，上清液用HPLC检测无纽莫康定B₀检出，取菌丝体，加入1000ml甲醇浸提，过滤得到甲醇浸提液950ml。

950ml甲醇浸提液中加入水稀释到2000ml，甲醇浓度约50%（V/V），pH 5.0，溶液呈浑浊状，用氢氧化钠将pH值调节到pH7.5，溶液重新变清。

将上述稀释过的2000ml纽莫康定B₀甲醇浸提液，通过树脂柱（Φ30×400mm）装入约200ml HP20树脂（日本三菱化学(Mitsubishi Chemical Holdings)公司生产），进行吸附，流出液颜色深，经HPLC检测无纽莫康定B₀检出；吸附完后再泵入500ml升水，冲洗树脂柱，流出的层析液呈浑浊，颜色由深变浅；水洗完后用40%（V/V）丙酮-水溶液冲洗树脂柱，流出的层析液颜色由深变浅，洗脱体积接近1200ml时，流出液颜色很浅，接近无色，经HPLC检测无纽莫康定B₀检出。用甲酸将水调pH 3.0，再配制为丙酮浓度50%（V/V）的丙酮-酸溶液，对树脂柱进行洗脱，收集洗脱液25ml/瓶，用HPLC检测，收集到富含纽莫康定B₀的丙酮洗脱液共250ml，颜色为淡黄色。

收集到的250ml富含纽莫康定B₀的丙酮洗脱液加125ml水稀释，至丙酮浓度为30%，通过另一根树脂柱（Φ30×400mm），装入约200ml HP20树脂，进行吸附，吸附完后再泵入400ml水，冲洗树脂柱，流出无颜色，再用乙醇对树脂柱进行洗脱，接25ml/瓶，用HPLC检测，收集到富含纽莫康定B₀的乙醇洗脱液共150ml，颜色很浅，接近无色。

将收集到富含纽莫康定B₀的乙醇洗脱液150ml在50℃下减压浓缩至干，得到浅黄色的纽莫康定B₀固体，HPLC检测纯度为85.2%。浓缩干的固体用甲醇溶解，加入少量水，使之在过饱和浓度条件下结晶，得到类白色的纽莫康定B₀晶体，HPLC检测纯度为90.5%。

 

实施例2 

取纽莫康定B₀发酵液1000ml，用盐酸溶液将pH调至3.5，离心，上清液用HPLC检测无纽莫康定B₀检出，取菌丝体，加入1000ml乙醇浸提，过滤得到乙醇浸提液970ml。

970ml乙醇浸提液中加入水稀释到2000ml，乙醇浓度约45%（V/V），pH 5.5，溶液呈浑浊状，用氢氧化钠将pH值调节到pH8.0，溶液重新变清。

将上述稀释过的2000ml纽莫康定B₀乙醇浸提液，通过树脂柱（Φ30×400mm），装入约200ml PAD900树脂（漂莱特（中国）有限公司生产），进行吸附，流出液颜色深，经HPLC检测无纽莫康定B₀检出；吸附完后再泵入500ml升水，冲洗树脂柱，流出的层析液呈浑浊，颜色由深变浅；水洗完后用45%（V/V）丙酮-水溶液冲洗树脂柱，流出的层析液颜色由深变浅，洗脱体积接近1000ml时，流出液颜色很浅，接近无色，经HPLC检测无纽莫康定B₀检出。用磷酸将水调pH 4.5，再配制为丙酮浓度60%（V/V）的丙酮-酸溶液，对树脂柱进行洗脱，洗脱液接25ml/瓶，用HPLC检测，收集到富含纽莫康定B₀的丙酮洗脱液共250ml，颜色为淡黄色。

收集到的250ml富含纽莫康定B₀的丙酮洗脱液加125ml水稀释，至丙酮浓度为40%，通过另一根树脂柱（Φ30×400mm），装入约200ml PAD900，树脂进行吸附，吸附完后再泵入500ml水，冲洗树脂柱，流出无颜色，再用乙醇对树脂柱进行洗脱，洗脱液用HPLC检测，收集到富含纽莫康定B₀的乙醇洗脱液共140ml，颜色很浅，接近无色。

将收集到富含纽莫康定B₀的乙醇洗脱液150ml在55℃下减压浓缩至干，得到浅黄色的纽莫康定B₀固体，HPLC检测纯度为87.0%。浓缩干的固体用正丙醇溶解，加入少量水，使之在过饱和浓度条件下结晶，得到类白色的纽莫康定B₀晶体，HPLC检测纯度为91.5%。

 

实施例3 

取纽莫康定B₀发酵液1000ml，用乙酸将pH调至4.0，离心，上清液用HPLC检测无纽莫康定B₀检出，取菌丝体，加入1000ml正丁醇浸提，过滤得到正丁醇浸提液980ml。

980ml正丁醇浸提液中加入2000ml水，稀释后正丁醇浓度约30%（V/V），并用氢氧化钠将pH值调节到pH6.0。

将上述稀释过的纽莫康定B₀正丁醇浸提液，通过树脂柱（Φ30×400mm），装入约200ml XAD1600树脂（罗门哈斯（Rohm & Haas）公司）进行吸附，流出液颜色深，经HPLC检测无纽莫康定B₀检出；吸附完后用500ml升水冲洗树脂柱，水洗完后用50%（V/V）丙酮-水溶液冲洗树脂柱，洗脱体积接近750ml时，流出液颜色很浅，经HPLC检测有微量纽莫康定B₀检出。用乙酸将水调pH 5.0，再配制为丙酮浓度80%（V/V）的丙酮-酸溶液，对树脂柱进行洗脱，用HPLC检测，收集到富含纽莫康定B₀的丙酮洗脱液共150ml，颜色为淡黄色。

收集到的150ml富含纽莫康定B₀的丙酮洗脱液加水稀释至丙酮浓度为50%，通过另一根树脂柱（Φ30×400mm），装入约200ml XAD1600树脂，进行吸附，吸附完后再水冲洗树脂柱直到流出无颜色，再用乙醇对树脂柱进行洗脱，洗脱液用HPLC检测，收集到富含纽莫康定B₀的乙醇洗脱液共120ml，颜色浅黄。

将收集到富含纽莫康定B₀的乙醇洗脱液120ml在60℃下减压浓缩至干，得到浅黄色的纽莫康定B₀固体，HPLC检测纯度为85.0%。浓缩干的固体用正丁醇溶解，加入少量水，使之在过饱和浓度条件下结晶，得到类白色的纽莫康定B₀晶体，HPLC检测纯度为90.1%。

 

实施例4 

纽莫康定B₀发酵液500L，用磷酸溶液将pH值调至3.5，静置2h后用板框过滤，滤液中无纽莫康定B₀检出。取菌渣，加入200升乙醇浸提，离心过滤，菌渣再加入200升乙醇浸提，离心过滤，两次滤液合并。

滤液合并液共400升，55℃减压浓缩到100升，浓缩液中乙醇浓度约75%(V/V)，pH值4.5，浓缩液为浑浊状，有悬浮状不溶物；用氢氧化钠将浓缩液pH值调到7.0，加入乙醇20升，浓缩液变清，再加入水100升，总体积共约220升，乙醇浓度约40%（V/V），pH值6.5。

将220升纽莫康定B₀乙醇浸提浓缩液泵入1#层析柱（Φ200×2500mm），装PAD900树脂（漂莱特（中国）有限公司）约70L，进行吸附，流出液颜色深，经HPLC检测无纽莫康定B₀检出；吸附完后再泵入450升水，冲洗树脂柱，流出的液颜色由深变浅，直至无明显色素洗出；水洗完后用45%（V/V）丙酮-水溶液冲洗树脂柱，流出的层析液颜色先由浅变深，再由深变浅，洗脱体积接近400升时，流出液颜色变得很浅，洗脱体积接近500升时接近无色，HPLC检测，有少量纽莫康定B₀检出，停止洗脱。配制65%（V/V）丙酮-酸溶液（pH 4.0）：用盐酸将水pH 值调到4.0，再配制为丙酮浓度65%的丙酮-酸溶液。用65%（V/V）丙酮-酸溶液（pH 4.0）对1#层析柱进行洗脱，洗脱液接桶收集，15-20升/桶，用HPLC检测，收集到富含纽莫康定B₀的丙酮洗脱液共120升，颜色为淡黄色。

120升纽莫康定B₀的丙酮洗脱液中加入60升水稀释，稀释后丙酮浓度约40%（V/V），泵入2#层析柱（Φ200×2000mm），装PAD900树脂约50L，进行吸附，吸附完后再泵入100升水，冲洗树脂柱，最后用乙醇对树脂柱进行洗脱，洗脱液经用HPLC检测，收集到富含纽莫康定B₀的乙醇洗脱液共80升，颜色浅黄色。

将收集到富含纽莫康定B₀的乙醇洗脱液在50℃下减压浓缩至干，得到浅黄色的纽莫康定B₀固体，HPLC检测纯度为86%。浓缩干的固体用正丙醇溶解，加入少量水，使之在过饱和浓度条件下结晶，得到类白色的纽莫康定B₀晶体，HPLC检测纯度为92.0%。

 

实施例5 

纽莫康定B₀发酵液1000L，用磷酸溶液将pH值调至3.0，静置2h后用板框过滤，滤液中无纽莫康定B₀检出。取菌渣，加入500升乙醇浸提，离心过滤，菌渣再加入300升乙醇浸提，离心过滤，两次滤液合并。

滤液合并液共800升，55℃减压浓缩到150升，浓缩液为浑浊状，有悬浮状不溶物；用氢氧化钠将浓缩液pH值调到7.5，加入适量乙醇和水使浓缩液充分溶解并调节乙醇浓度约45%（V/V），稀释后浓缩液总体积共约350升，pH值7.2。

将350升纽莫康定B₀乙醇浸提浓缩液泵入3#层析柱（Φ300×2500mm），装PAD900树脂（漂莱特（中国）有限公司）约150L，进行吸附，流出液颜色深，经HPLC检测无纽莫康定B₀检出；吸附完后再泵入600升水，冲洗树脂柱，水洗完后用45%（V/V）丙酮-水溶液冲洗树脂柱，洗脱体积接近800升时，流出液颜色变得很浅，停止洗脱。用磷酸将水pH 值调到3.5，再配制为丙酮浓度60%的丙酮-酸溶液。用60%（V/V）丙酮-酸溶液（pH 3.5）对3#层析柱进行洗脱，洗脱液接桶收集，15-20升/桶，用HPLC检测，收集到富含纽莫康定B₀的丙酮洗脱液共220升，颜色为淡黄色。

220升纽莫康定B₀的丙酮洗脱液中加入80升水稀释，稀释后丙酮浓度约44%（V/V），泵入2#层析柱（Φ200×2000mm），装PAD900树脂约50L，进行吸附，吸附完后再泵入100升水，冲洗树脂柱，最后用乙醇对树脂柱进行洗脱，洗脱液经用HPLC检测，收集到富含纽莫康定B₀的乙醇洗脱液共100升，颜色浅黄色。

将收集到富含纽莫康定B₀的乙醇洗脱液在50℃下减压浓缩至干，得到浅黄色的纽莫康定B₀固体，HPLC检测纯度为86.5%。浓缩干的固体用正丙醇溶解，加入少量水，使之在过饱和浓度条件下结晶，得到类白色的纽莫康定B₀晶体，HPLC检测纯度为92.5%。

Claims (9)

1.一种纽莫康定B₀的提取纯化方法，包括以下步骤：

a) 将含有纽莫康定B₀的发酵液pH值调至2.0~4.0，过滤，菌渣用低分子醇浸提，得浸提液；

b) 调整浸提液的醇浓度至30-50%(V/V)， pH为6.0-8.0；

c) 用吸附树脂吸附浸提液后，依次用水、30-50%（V/V）丙酮-水溶液冲洗树脂，然后用pH 值为3.0-5.0的50%-80%（V/V）丙酮-酸溶液洗脱树脂，收集富含纽莫康定B₀的洗脱液；

d) 纽莫康定B₀洗脱液加水稀释至丙酮浓度为30-50%（V/V），用吸附树脂吸附，用水冲洗树脂后用低分子醇洗脱，收集富含纽莫康定B₀的洗脱液；

e) 以常规方法结晶得纽莫康定B₀。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤a)中调含有纽莫康定B₀的发酵液pH值的为盐酸、硫酸、磷酸、丙酸、草酸、柠檬酸或乙酸中的任一种或一种以上。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤a)中含有纽莫康定B₀的发酵液pH值调至3.0~3.5。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤b)中，浸提液可经过减压浓缩后加水或添加醇类稀释，或者直接添加水稀释，使浸提液中醇浓度控制为40–50 % ( V/V)。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤b)中浸提液的pH值调整到6.5-7.5。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于所述的步骤c)中的丙酮-水溶液中丙酮浓度为40-45%（V/V）。

7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤c)中的丙酮-酸溶液，是用磷酸、盐酸、甲酸或乙酸将pH调为 3.5-4.5。

8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤c)中的丙酮-酸溶液中丙酮浓度为60-65%（V/V）的。

9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤c)和d)采用的吸附树脂为PAD900、 HP20、SP207、XAD1600及XAD系列、X-5中的任一种。