CN102010462A - 应用纳滤浓缩纯化技术从发酵液中制取雷莫拉宁 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种利用纳滤浓缩纯化技术从发酵液中分离提取高纯度雷莫拉宁的方法。本发明采用纳滤浓缩纯化技术处理了发酵粗提液、离子交换洗脱液和柱层析洗脱液，延长了离子交换树脂的使用寿命，大大减少了溶剂及硅胶的用量，降低了蒸发能耗，产品收率最高可达90％，产品纯度最高可达90％。本发明所提供的工艺步骤简单，成本低，适合工业生产。

Description

应用纳滤浓缩纯化技术从发酵液中制取雷莫拉宁

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及抗生素雷莫拉宁的分离提取方法，尤其涉及一种利用纳滤浓缩纯化技术从发酵液中分离提取高纯度雷莫拉宁的方法。

背景技术

雷莫拉宁((Ramoplanin，A-16686，MDL6)属于新型广谱抗革兰氏阳性菌抗生素，对葡萄球菌、链球菌、放线菌、棒状杆菌、梭菌、乳杆菌等多种菌属都具有很强的抗菌活性。对于甲氧西林耐受株或是敏感株，雷莫拉宁的MIC90均小于甲氧西林、万古霉素和替考拉宁.显示了雷莫拉宁良好的抗菌活性。雷莫拉宁的作用机制在于能特异地抑制细胞壁上肽聚糖的生物合成，但这种抑制方式与万古霉素及替考拉宁的抑菌机制不同。

雷莫拉宁于2004年由Genome Therapeutics(Oscinet Pharmaceuticals)公司向美国FDA提出申请并获得快速审批，其适应证为用于治疗梭状芽胞杆菌引起的痢疾。除了该适应症外，雷莫拉宁还正在进行其他项目的临床研究，如用于口服治疗癌症病人VRE引起的血液感染的III期临床实验。另外，一些开发公司还在考虑考雷莫拉宁的局部应用适应症，包括革兰阳性菌引起的皮肤感染或防止易感人群由鼻腔吸人金黄色葡萄球菌感染。

1981年意大利的Burno等从ATCC33076的培养物中分离得到一抗菌活性物质A-16686，并申请了专利US 4303646。1983年，Burno等又对A-16686进行进一步分离纯化得到三个组分，分别称作雷莫拉宁A₁、雷莫拉宁A₂、雷莫拉宁A₃，其中雷莫拉宁A₂为主要组分，申请专利US 4427656。

雷莫拉宁提纯的传统方法是通过常规前处理步骤用盐酸将产生雷莫拉宁的菌株，如Actinoplanes sp.ATCC33076的发酵产物调pH至3.5，分离得到菌丝体和发酵液。其中菌丝体用有机溶剂，如甲醇等低级醇或氯仿等提取，得到含有目的物的粗提液，真空浓缩得到浆状物，即雷莫拉宁的粗提液浓缩物，再用正丁醇萃取多次，合并萃取液后，再反复用石油醚析出沉淀并分离其，真空干燥得到的粗品；而发酵液也用正丁醇萃取，然后用同样方法制得粗品。该粗品反复用混合溶剂氯仿∶乙醇∶水(体积比为4∶7∶2)处理，得到油状物，加水结晶并固液分离，得到的固体和液体还需不同溶剂多步处理后，得到较纯的粗品再湿法上硅胶柱纯化；例如上述的固体用不同的有机溶剂(如甲醇、正丁醇、乙醚等)反复处理，得到较纯的粗品后再溶于乙腈与水的混合物，然后湿法上硅胶柱，用不同溶剂(乙腈与水混合物，以及乙腈与0.1N盐酸混合物)作为流动相洗柱子，用薄层色谱法检测，收集目的洗脱液(US 4328316)。可见其过程复杂，有机溶剂使用量很大，污染严重，且由于萃取次数多，造成损失而收率低。

专利CN 101024662A为了克服上述技术的缺陷，提供了一种步骤简化、明显减少有机溶剂使用量的雷莫拉宁的纯化方法。该法包括将雷莫拉宁粗提液浓缩物先与部分硅胶混合，挥干溶剂，在将得到的固体混合物置于以硅胶为填充物的柱子上端进行柱层析，其中依次用丙酮、甲醇水溶液、以及甲醇与酸水的混合物作为流动相。虽然该法简化了工艺步骤、减少了有机溶剂的使用量，但是仍然存在一些问题。例如，该工艺仍采用传统的减压浓缩的方法获得粗体液浓缩物，需要的蒸发能耗较高，且产品可能由于在蒸发过程中温度的升高而变性；该工艺直接将粗提液浓缩干法上硅胶柱，由于粗体液浓缩物中含有大量的无机盐、色素、糖类和蛋白质，因此有效上样量少，硅胶及洗脱剂用量大，不利于工业化生产。

膜分离技术是一项新兴的分离技术，自从60年代开始大规模工业化应用以来，发展十分迅速，其产品日益丰富，被认为是20世纪末到21世纪初最有发展前途的高技术之一。它是用天然或人工合成的高分子膜以外界能量或化学位差为推动力，对双组分或多组分的溶质和溶剂进行分离、分级、提纯和富集的方法。此技术具有分离效率高、分离条件温和、流程简单及能耗较低，及它的规模和处理能力可在很大范围内变化，而它的效率、设备单价、运行费用等都变化不大的优点，因此在发酵产品的分离和精制等方面应用广泛。常用的膜分离技术包括微滤、超滤、电渗析、反渗透、纳滤等。

纳滤是膜分离过程的一个新兴领域，其分离性能介于反渗透和超滤之间，是近年来国际上发展较快的膜品种之一。纳滤膜的孔径范围在几个纳米左右，其截留相对分子量通常为200～3000道尔顿，在压力驱动下允许一些无机盐和小分子有机物透过膜，既能是大分子有机物和小分子有机物分离，也能使用有机物和无机盐分离兼使有机物浓缩。纳滤膜特有的功能是反渗透和超滤膜无法取代的。目前纳滤浓缩纯化技术已成功地在水处理和生化分离领域实现了工业化应用，还可望在生物、纺织等行业得到应用。在国内，应用纳滤技术进行雷莫拉宁的分离纯化还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用纳滤浓缩纯化技术从发酵液中分离纯化雷莫拉宁的方法，该方法具有条件温和，操作简单，分离步骤少，选择性好的特点，克服了现有技术中操作步骤复杂、有机溶剂及硅胶用量大、浓缩步骤能耗较高的缺点，并且使雷莫拉宁收率和质量显著提高。

本发明提供的利用纳滤浓缩纯化技术从发酵液中分离雷莫拉宁的基本步骤是：1)发酵粗提液经过滤后，采用纳滤分离技术进行浓缩纯化得浓缩液；2)用离子交换树脂处理浓缩液，再用去离子水冲洗树脂，用碱液解析得洗脱液；3)采用纳滤分离技术进行浓缩纯化洗脱液，得离子交换浓缩洗脱液；4)离子交换浓缩洗脱液湿法上硅胶柱，依次采用丙酮、甲醇水溶液、以及甲醇与酸水的混合物作为流动相进行柱色谱分离纯化，得柱层析洗脱液；5)采用纳滤分离技术浓缩纯化柱层析洗脱液，得到浓缩所洗脱液；6)浓缩液静置，产品结晶，过滤，得到雷莫拉宁产品。

其中所使用的纳滤膜为聚酰胺膜、聚醚砜膜、醋酸纤维素膜、磺化聚醚砜膜、磺化聚砜膜或聚乙烯醇膜。纳滤膜分子截留在500～2400，优选1500～2400，更优选2000；

应用纳滤浓缩纯化技术从发酵粗提液中制取雷莫拉宁的操作压力在0.1～1MPa，操作温度20～45℃；优选操作压力0.8MPa，优选操作温度为常温；

与现有工艺技术相比，利用本发明的方法所具有的优越性如下：

1)本发明采用纳滤浓缩纯化技术使发酵液中的离子性杂质和色素大量去除，减少了对离子交换树脂的污染，大大延长了离子交换树脂的使用寿命，减少了排污量。

2)本发明采用纳滤浓缩纯化技术使发酵液中的离子性杂质和色素大量去除，强化了柱层析的分离效果，并大大减少了柱层析中硅胶及有机溶剂的使用量，减少了环境污染。

3)本发明工艺采用纳滤浓缩纯化技术处理发酵液、离子交换洗脱液、柱层析洗脱液，大大减少了蒸发能耗，降低了生产成本。

4)本发明工艺最突出的优越性体现在精制后的雷莫拉宁质量显著提高，经纳滤浓缩纯化、离子交换、柱层析、溶媒结晶等工艺得到的雷莫拉宁经高效液相色谱(HPLC)分析纯度可高达90％以上。

附图说明

附图为采用纳滤浓缩纯化技术从发酵粗提液中制取雷莫拉宁的流程示意图。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

下面实施例中所用的雷莫拉宁的粗提液选用下列步骤制得：参照现有技术，如上述美国专利文献(US 4328316)的例1发酵培养ATCC33076，然后发酵产物用草酸调pH值至3.5，离心分离得到菌丝体，再用极性有机溶剂甲醇或乙醇(1L/kg菌丝体)浸泡菌丝体半个小时以上，然后离心得到上清液，即为雷莫拉宁粗提液。

实施例1

步骤1：纳滤浓缩

雷莫拉宁粗提液过滤滤除较大颗粒杂质和部分菌体，然后利用截流分子量为800的聚酰胺纳滤膜除去滤液中的色素及核苷酸、氨基酸、短肽低聚糖，单价及多价阴阳离子等小分子，在20℃，操作压力1MPa条件下进行纳滤浓缩，浓缩体积达到20％。

步骤2：离子交换

然后采用聚苯乙烯二乙烯苯磺酸盐DOW[XFS.43278.002]强酸钠型树脂纯化雷莫拉宁发酵浓缩液，将树脂加入发酵液浓缩液中，室温搅拌6h，去离子水冲洗树脂，用pH为10.5的氢氧化钠溶液解吸。

步骤3：纳滤浓缩离子交换洗脱液

利用截流分子量为800聚酰胺纳滤膜在20℃，操作压力1MPa条件下进行纳滤浓缩，浓缩体积至10％

步骤4：柱层析

将纳滤浓缩得到的浓缩液湿法上硅胶柱，依次用丙酮、甲醇∶水＝1∶1.3(V/V)、甲醇∶0.2M HCl溶液＝1∶1(V/V)的洗脱剂洗脱硅胶柱得到雷莫拉宁三组分的混合物。

步骤5：纳滤浓缩柱层析洗脱液

利用截流分子量为800聚酰胺纳滤膜在20℃，操作压力1MPa条件下进行纳滤浓缩，浓缩体积至10％

步骤6：静置过夜，结晶，过滤，干燥得雷莫拉宁纯品，收率可达92％，经高效液相色谱检测产品纯度可达85％。

实施例2

利用截流分子量为1500聚乙烯醇纳滤膜在常温下，操作压力1MPa条件下依次进行发酵粗提液、离子交换洗脱液和柱层析洗脱液的浓缩纯化。其余操作均如实施例1所示，得到的雷莫拉宁产品纯度经高效液相色谱检测可达87.1％，收率为92％。

实施例3

利用截流分子量为2000醋酸纤维素纳滤膜在常温下，操作压力0.8MPa条件下依次进行发酵粗提液、离子交换洗脱液和柱层析洗脱液的浓缩纯化。其余操作均如实施例1所示，得到的雷莫拉宁产品纯度经高效液相色谱检测可达90.4％，收率为90％。

实施例4

利用截流分子量为2300聚醚砜纳滤膜在45℃，操作压力0.1MPa条件下依次进行发酵粗提液、离子交换洗脱液和柱层析洗脱液的浓缩纯化。其余操作均如实施例1所示，得到的雷莫拉宁产品纯度经高效液相色谱检测可达90.1％，收率为85％。

Claims (4)

1.采用纳滤浓缩纯化技术从发酵粗提液中制取雷莫拉宁的方法，其特征在于通过纳滤浓缩纯化技术处理发酵粗提液、离子交换洗脱液和柱层析洗脱液，制备高纯度雷莫拉宁产品，具体步骤为：

1)发酵粗提液经过滤后，采用纳滤分离技术进行浓缩纯化得浓缩液；

2)用离子交换树脂处理浓缩液，再用去离子水冲洗树脂，用碱液解析得洗脱液；

3)采用纳滤分离技术进行浓缩纯化洗脱液，得离子交换洗脱液浓缩液；

4)离子交换洗脱液浓缩液湿法上硅胶柱，依次采用丙酮、甲醇水溶液、以及甲醇与酸水的混合物作为流动相进行柱色谱分离纯化，得柱层析洗脱液；

5)采用纳滤分离技术浓缩纯化柱层析洗脱液，得到浓缩所洗脱液；

6)浓缩液静置，产品结晶，过滤，得到雷莫拉宁产品。

2.如权利要求1所述的应用纳滤浓缩纯化技术从发酵粗提液中制取雷莫拉宁的方法，其特征在于所使用的纳滤膜为聚酰胺膜、聚醚砜膜、醋酸纤维素膜、磺化聚醚砜膜、磺化聚砜膜或聚乙烯醇膜。

3.如权利要求1所述的应用纳滤浓缩纯化技术从发酵粗提液中制取雷莫拉宁的方法，其特征在于所使用的纳滤膜分子截留在500～2400，优选1500～2400，更优选2000。

4.如权利要求1所述的应用纳滤浓缩纯化技术从发酵粗提液中制取雷莫拉宁的方法，其特征在于操作压力在0.1～1MPa，操作温度20～45℃，优选操作压力在0.8MPa，操作温度为常温。