CN108440624A - 一种环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,本发明属于生化分离技术领域,包括如下步骤:(1)胞苷发酵液加热后经陶瓷膜固液分离、超滤连续式处理得到预处理液;(2)将预处理液浓缩、调酸,醇洗,过滤得到胞苷盐酸盐粗品;(3)胞苷盐酸盐粗品经复溶、调碱、活性炭脱色、过滤得到脱色液,经电渗析除盐、减压浓缩、醇沉结晶、过滤、淋洗、真空干燥得到含量98%以上的胞苷成品。
Description
技术领域
本发明属于生物化学分离技术领域,具体地,涉及一种环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法。
背景技术
胞苷(图1)是人体和动植物体内RNA的重要组成部分,在生物体内生理生化过程中起着重要的调节作用,具有多方面的生理活性。胞苷是胞磷胆碱的中间体,同时胞苷又是很多抗病毒、抗肿瘤、抗艾滋病等药物的原材料。随着其在应用范围上的不断扩大,对胞苷的需求也越来越大,自然对胞苷的制备研究也越来越深入。
目前国内外,关于胞苷的生产,主要有化学合成法、酶法合成法、微生物发酵合成法。虽然对于胞苷合成的方法报道有很多,但是对于胞苷分离纯化的方法却鲜有提及。
本发明中的胞苷来源于微生物,例如特定大肠杆菌发酵所得发酵液。通过基因工程手段改造大肠杆菌获得以葡萄糖或甘油为碳源合成胞苷的工业菌株,通过增殖,诱导,产物浓度中控等发酵、反应得到胞苷发酵液。此发酵液中,存在着大量的菌体与色素,以及没有被转化完的葡萄糖或甘油、无机盐等,乳清酸、尿苷、尿嘧啶等已知副产物和其他未知副产物,另外还有细胞自溶产生的杂质:蛋白和核酸等化合物。分离难度较大。本发明不仅成功实现了杂质多分离难的问题,还具备环保压力小、步骤少、成本低、品质好、收率高等优点。
发明内容
发明目的:本发明所要解决的是提供一种从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法。此方法前期将陶瓷膜微滤、超滤、电渗析等膜分离前沿技术结合起来,具有一定的优异性。此工艺将胞苷转化成胞苷盐酸盐,区别于离子交换传统工艺步骤,不再产生含有大量氨氮的废水、废气,符合环保理念。
技术方案:本发明提供了一种环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,包括以下步骤:
(1)胞苷发酵液加热后经陶瓷膜固液分离、超滤膜超滤连续式预处理得到预处理液;
(2)将预处理液调酸后经过强酸性阳离子交换树脂吸附,再经氨水溶液洗脱得到洗脱液;
(3)洗脱液经加热减压除氨、活性炭脱色、过滤得到脱色液;
(4)脱色液经减压浓缩、醇沉结晶、过滤、淋洗、真空干燥得到胞苷成品。
本发明所述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,方法合理,采用加热,陶瓷膜与超滤相结合的方式,除去菌体固渣、大部分色素与蛋白,得到了性状良好的预处理液,将胞苷转化成胞苷盐酸盐,再经电渗析除盐、减压浓缩、醇沉结晶、过滤、淋洗、真空干燥等步骤可得到高纯度、高收率的胞苷成品,同时避开了离子交换传统工艺步骤,不再产生含有大量氨氮的废水、废气,符合环保理念。
进一步的,上述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,将所述步骤(2)中的胞苷盐酸盐粗品的过滤液以及步骤(3)中的过滤液和淋洗液再重复步骤(2)、(3)进行胞苷精制。通过对胞苷盐酸盐粗制母液和精制母液的回收来进一步提高胞苷总收率。
进一步的,上述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,所述的微生物发酵液为大肠杆菌发酵液。除了可以分离大肠杆菌发酵液,还能用于其他生物发酵液的处理,适应性好,应用范围广。
进一步的,上述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,所述步骤(1)中胞苷发酵液加热温度为70-90℃,加热时间30-60min。条件温和,易于实现。
进一步的,上述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,所述步骤(1)中陶瓷膜过滤精度为0.05μm-0.8μm,其中,0.2μm作为优选孔径。
进一步的,上述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,所述步骤(2)中预处理液浓缩至胞苷浓度为300-500g/L,用盐酸调节pH至0.5-1.5,优选的是400g/L,pH1.0。
进一步的,上述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,所述步骤(2)中用胞苷盐酸盐体积0.5-2倍的甲醇或乙醇醇沉结晶,优选的是1倍体积。
进一步的,上述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,所述步骤(3)中胞苷盐酸盐粗品复溶浓度为50-150g/L,优选的是100g/L,用氢氧化钠溶液调节pH7.0-7.5,优选的是pH7.3。
进一步的,上述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,所述步骤(3)中活性炭为723、727、767药用活性炭、303糖用活性炭中的一种或几种,用量为0.05-0.2%,脱色温度为40-80℃,脱色时间为30-60min。优选的是303糖用活性炭,用量为0.1%,脱色温度为60℃,脱色时间为60min。
进一步的,上述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,所述步骤(3)中胞苷脱色液电导率小于1ms/cm为电渗析终点。
进一步的,上述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,所述步骤(3)中胞苷醇沉结晶浓度为300-500g/L;结晶条件是:加入料液体积1-3倍的甲醇或者乙醇,于4-15℃、120-250rpm的条件下搅拌6-24h;晶体过滤后用80-90%甲醇或者乙醇按体积比1:1淋洗。通过步骤(3),可将少量残留盐类及其他杂质留于母液中,从而得到HPLC纯度99.8%以上,含量98%以上的胞苷成品。
进一步的,上述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,所述真空干燥温度为45-60℃。
进一步的,上述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,超滤膜优选中空纤维超滤膜,膜材料为聚醚砜,孔径为800-2000道尔顿,800-1000道尔顿作为优选。超滤温度控制在30-45℃,通过上述预处理可将发酵液中大分子蛋白质、大分子色素等进行去除。
有益效果:本发明具有以下优点:
1)本发明充分利用膜分离的前沿技术来预处理发酵液,依靠连续膜分离来预处理发酵液,均可套用至下一批,减低了产品损失率,提高了分离效率和产物收率。
2)本发明省略了离子交换工序,避免了大量氨氮废水的产生,而且只使用了极少量活性炭脱色,整个工艺产生固废很少,符合环保理念。
3)本发明总收率在80-85%之间,收率较高。
附图说明
附图1:胞苷的结构示意图;
附图2:胞苷与副产物检测谱图。
具体实施方式
下面将通过几个具体实施例,进一步阐明本发明,这些实施例只是为了说明问题,并不是一种限制。
实施例1 胞苷发酵液的预处理
50L胞苷发酵结束后,用蒸汽加热至80℃,保温45min后放罐得37L胞苷发酵液,其中胞苷浓度为37.4g/L,共计1383.8g。发酵液过0.2μm的陶瓷膜进行微滤并收集清液,工作压力为0.3-0.5MPa,工作温度为50-60℃,当截留液体积为15L时,开始往截留液中补去离子水,补水速度与清液流出速度相当,尽量维持截留液体积为15L左右,待截留液中胞苷浓度为3.7g/L时,结束陶瓷膜微滤,将68.2L陶瓷膜清液(胞苷浓度为19.7g/L)过800道尔顿的聚醚砜膜进行超滤并收集清液,超滤工作压力为0.7-1.0MPa,工作温度为35-40℃,当超滤截留液体积为8L时开始往截留液中补去离子水,补水速度与清液流出速度相当,尽量维持截留液体积为8L左右,待截留液中胞苷浓度为2.6g/L时,停止超滤,得到80.9L预处理液,其中胞苷浓度为16.2g/L,总量为1310.6g,预处理收率为94.7%。
实施例2 胞苷盐酸盐的粗制
将实例1所得80.9L预处理液浓缩至3.3L,用35%盐酸调节pH1.0,加入无水乙醇3.3L搅拌4h后布氏漏斗过滤,并用0.5L 90%乙醇淋洗固体并减压抽干,烘干后得到1483g胞苷盐酸盐粗品,胞苷含量80.1%。
胞苷盐酸盐粗制母液6L,其中胞苷浓度为20.4g/L。留作备用。
实施例3 胞苷的精制
将实施例2所得1483g胞苷含量80.1%的胞苷盐酸盐粗品重新用12L去离子水溶解,加热至60℃,用20%氢氧化钠溶液调节pH至7.5,加入767药用活性炭24g,60℃搅拌脱色60min,布氏漏斗抽滤得脱色液,少量热水淋洗炭饼,得到13.5L脱色液,检测其电导率为27ms/cm,用电渗析除盐,直至脱色液电导率为800μs/cm时停止。除盐脱色液经60℃真空旋蒸至4.0L,此时胞苷浓度在300g/L左右,加入料液3倍体积的无水乙醇12.0L,于10℃、200rpm的条件下搅拌析晶12h;析出晶体减压抽滤并用1L 80%乙醇淋洗,淋洗后减压抽干得固体胞苷。将结晶母液与淋洗母液合并得16.0L,胞苷浓度为17.1g/L,留作备用。所得固体胞苷经60℃真空干燥5h后得到胞苷成品927.4g,经检测含水量为0.06%,HPLC纯度为99.92%,含量为98.6%。胞苷一次收率为66.1%。
实施例4 胞苷盐酸盐粗制母液的回收与胞苷精制母液的回收
通过对实施例2中6L胞苷盐酸盐粗制母液和实施例3中16L精制母液的回收来提高胞苷总收率。
将实施例2中,6L胞苷浓度为20.4g/L的母液60℃减压旋蒸, 直至300mL时停止浓缩,加入600mL无水乙醇,搅拌4h后布氏漏斗过滤,并用50ml90%乙醇淋洗固体并减压抽干,所得胞苷盐酸盐粗品,重复实施例3步骤,进行胞苷精制,得到胞苷成品84.2g,HPLC纯度99.84%,含量98.1%,母液回收收率为67.5%。
将实施例3中,16L胞苷浓度为17.1g/L的精制母液用35%盐酸调节pH1.0,浓缩至600ml,加入无水乙醇1.2L搅拌4h后布氏漏斗过滤,并用100mL90%乙醇淋洗固体并减压抽干,得到胞苷盐酸盐粗品,重复实施例3步骤,进行胞苷精制,得到胞苷成品191.6g,HPLC纯度99.94%,含量98.8%,母液回收收率为69.2%。胞苷总收率为85.0%。
实施例5 胞苷发酵液的预处理
50L胞苷发酵结束后,用蒸汽加热至90℃,保温30min后放罐得36.6L胞苷发酵液,其中胞苷浓度为38.1g/L,共计1394.5g。发酵液过0.05μm的陶瓷膜进行微滤并收集清液,工作压力为0.3-0.5MPa,工作温度为50-60℃,当截留液体积为14L时,开始往截留液中补去离子水,补水速度与清液流出速度相当,尽量维持截留液体积为14L左右,待截留液中胞苷浓度为3.8g/L时,结束陶瓷膜微滤,将70L陶瓷膜清液(胞苷浓度为19.3g/L)过1000道尔顿的聚醚砜膜进行超滤并收集清液,超滤工作压力为0.7-1.0MPa,工作温度为40-45℃,当超滤截留液体积为9L时开始往截留液中补去离子水,补水速度与清液流出速度相当,尽量维持截留液体积为9L左右,待截留液中胞苷浓度为2.8g/L时,停止超滤,得到83.3L预处理液,其中胞苷浓度为15.8g/L,总量为1316.4g,预处理收率为94.4%。
实施例6 胞苷盐酸盐的粗制
将实例5所得83.3L预处理液浓缩至4.0L,用35%盐酸调节pH1.5,加入甲醇2L搅拌4h后布氏漏斗过滤,并用0.5L90%甲醇淋洗固体并减压抽干,烘干后得到1424.3g胞苷盐酸盐粗品,胞苷含量80.9%。
胞苷盐酸盐粗制母液5.4L,其中胞苷浓度为30.4g/L。留作备用。
实施例7 胞苷的精制
将实施例6所得1424.3g胞苷含量80.9%的胞苷盐酸盐粗品重新用23L去离子水溶解,加热至60℃,用20%氢氧化钠溶液调节pH至7.0,加入303活性炭23g,40℃搅拌脱色45min,布氏漏斗抽滤得脱色液,少量热水淋洗炭饼,得到24L脱色液,检测其电导率为29ms/cm,用电渗析除盐,直至脱色液电导率为950μs/cm时停止。除盐脱色液经60℃真空旋蒸至2.9L,此时胞苷浓度在400g/L左右,加入料液2倍体积的无水乙醇5.8L,于4℃、120rpm的条件下搅拌析晶24h;析出晶体减压抽滤并用1L 90%乙醇淋洗,淋洗后减压抽干得固体胞苷。将结晶母液与淋洗母液合并得7.5L,胞苷浓度为24.5g/L,留作备用。所得固体胞苷经50℃真空干燥6h后得到胞苷成品962.4g,经检测含水量为0.04%,HPLC纯度为99.94%,含量为98.8%。胞苷一次收率为68.2%。
实施例8 胞苷盐酸盐粗制母液的回收与胞苷精制母液的回收
通过对实施例6中5.4L胞苷盐酸盐粗制母液和实施例7中7.5L精制母液的回收来提高胞苷总收率。
将实施例6中,5.4L胞苷浓度为30.4g/L的母液60℃减压旋蒸, 直至300mL时停止浓缩,加入600mL无水乙醇,搅拌4h后布氏漏斗过滤,并用50ml90%乙醇淋洗固体并减压抽干,所得胞苷盐酸盐粗品,重复实施例7步骤,进行胞苷精制,得到胞苷成品109.5g,HPLC纯度99.86%,含量98.2%,母液回收收率为65.5%。
将实施例7中,7.5L胞苷浓度为24.5g/L的精制母液用35%盐酸调节pH0.5,浓缩至400ml,加入无水乙醇0.8L搅拌4h后布氏漏斗过滤,并用100L90%乙醇淋洗固体并减压抽干,得到胞苷盐酸盐粗品,重复实施例7步骤,进行胞苷精制,得到胞苷成品112.0g,HPLC纯度99.94%,含量98.8%,母液回收收率为60.2%。
胞苷总收率为83.8%。
实施例9 胞苷发酵液的预处理
50L胞苷发酵结束后,用蒸汽加热至70℃,保温60min后放罐得36.2L胞苷发酵液,其中胞苷浓度为38.3g/L,共计1386.5g。发酵液过0.8μm的陶瓷膜进行微滤并收集清液,工作压力为0.3-0.5MPa,工作温度为50-60℃,当截留液体积为14L时,开始往截留液中补去离子水,补水速度与清液流出速度相当,尽量维持截留液体积为14L左右,待截留液中胞苷浓度为3.8g/L时,结束陶瓷膜微滤,将71L陶瓷膜清液(胞苷浓度为18.8g/L)过2000道尔顿的聚醚砜膜进行超滤并收集清液,超滤工作压力为1.0-1.2MPa,工作温度为30-35℃,当超滤截留液体积为9L时开始往截留液中补去离子水,补水速度与清液流出速度相当,尽量维持截留液体积为9L左右,待截留液中胞苷浓度为2.8g/L时,停止超滤,得到81.3L预处理液,其中胞苷浓度为16.1g/L,总量为1308.1g,预处理收率为94.3%。
实施例10 胞苷盐酸盐的粗制
将实例9所得81.3L预处理液浓缩至2.8L,用35%盐酸调节pH 0.5,加入甲醇5.6L搅拌4h后布氏漏斗过滤,并用0.5L90%甲醇淋洗固体并减压抽干,烘干后得到1505.3g胞苷盐酸盐粗品,胞苷含量78.9%。
胞苷盐酸盐粗制母液7.8L,其中胞苷浓度为15.1g/L。留作备用。
实施例11 胞苷的精制
将实施例10所得1505.3g胞苷含量78.9%的胞苷盐酸盐粗品重新用8L去离子水溶解,加热至60℃,用20%氢氧化钠溶液调节pH至7.3,加入723活性炭4g,80℃搅拌脱色30min,布氏漏斗抽滤得脱色液,少量热水淋洗炭饼,得到9.5L脱色液,检测其电导率为31.4ms/cm,用电渗析除盐,直至脱色液电导率为980μs/cm时停止。除盐脱色液经60℃真空旋蒸至2.5L,此时胞苷浓度在500g/L左右,加入料液1倍体积的无水乙醇2.5L,于15℃、250rpm的条件下搅拌析晶16h;析出晶体减压抽滤并用500mL 85%乙醇淋洗,淋洗后减压抽干得固体胞苷。将结晶母液与淋洗母液合并得4.6L,胞苷浓度为24.7g/L,留作备用。所得固体胞苷经45℃真空干燥8h后得到胞苷成品1065.2g,经检测含水量为0.05%,HPLC纯度为99.94%,含量为98.8%。胞苷一次收率为75.9%。
实施例12 胞苷盐酸盐粗制母液的回收与胞苷精制母液的回收
通过对实施例10中7.8L胞苷盐酸盐粗制母液和实施例11中4.6L精制母液的回收来提高胞苷总收率。
将实施例10中,7.8L胞苷浓度为15.1g/L的母液60℃减压旋蒸, 直至250mL时停止浓缩,加入500mL无水乙醇,搅拌4h后布氏漏斗过滤,并用50ml90%乙醇淋洗固体并减压抽干,所得胞苷盐酸盐粗品,重复实施例11步骤,进行胞苷精制,得到胞苷成品67.5g,HPLC纯度99.86%,含量98.0%,母液回收收率为57.3%。
将实施例11中,4.6L胞苷浓度为24.7g/L的精制母液用35%盐酸调节pH1.0,浓缩至300ml,加入无水乙醇600mL搅拌4h后布氏漏斗过滤,并用50L 90%乙醇淋洗固体并减压抽干,得到胞苷盐酸盐粗品,重复实施例11步骤,进行胞苷精制,得到胞苷成品70.0g,HPLC纯度99.94%,含量98.8%,母液回收收率为60.9%。
胞苷总收率为85.6%。
实施例13 HPLC测定胞苷
样品用去离子水稀释一定的倍数,离心过0.22μm的滤膜,用高效液相色谱(HPLC)检测,HPLC的参数如下:采用Agilent SB Aq 4.6*150mm 5μm,流动相为乙腈和10mM 乙酸铵(pH4.0),流动相比例0.01-3.50分钟乙腈比例为5%,3.50-4.50分钟乙腈比例由5%上升到15%,4.50-4.60分钟乙腈比例由15%降至5%,4.60-10.0分钟乙腈比例为2%,利用紫外检测器检,测波长260 nm;初始流动相的流速为0.8 mL/min,发酵液的上样量5μL,柱温30℃。胞苷出峰时间为 2.746分钟,HPLC图谱如图2所示。
以上所述仅是发明的几个实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离发明原理的前提下,还可以做出若干改进,这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)胞苷发酵液加热后经陶瓷膜固液分离、超滤膜超滤连续式预处理得到预处理液;
(2)将预处理液调酸后经过浓缩、调酸、醇沉结晶、过滤得到胞苷盐酸盐粗品;
(3)胞苷盐酸盐粗品经复溶、调碱、活性炭脱色、过滤得到脱色液;脱色液经电渗析除盐、减压浓缩、醇沉结晶、过滤、淋洗、真空干燥得到胞苷成品。
2.根据权利要求1所述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,其特征在于:将所述步骤(2)中的胞苷盐酸盐粗品的过滤液以及步骤(3)中的过滤液和淋洗液再重复步骤(2)、(3)进行胞苷精制。
3.根据权利要求1或2所述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,其特征在于:所述的微生物发酵液为大肠杆菌发酵液。
4.根据权利要求1所述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,其特征在于:所述步骤(1)中胞苷发酵液加热温度为70-90℃,加热时间30-60min。
5.根据权利要求1所述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,其特征在于:所述步骤(1)中陶瓷膜过滤精度为0.05μm-0.8μm;超滤膜过滤精度为800-2000道尔顿。
6.根据权利要求1所述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,其特征在于:所述步骤(2)中预处理液浓缩至胞苷浓度为300-500g/L,用盐酸调节pH至0.5-1.5;所述步骤(3)中胞苷盐酸盐粗品复溶浓度为50-150g/L,用氢氧化钠溶液调节pH7.0-7.5。
7.根据权利要求1所述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,其特征在于:所述活性炭为723、727、767药用活性炭、303糖用活性炭中的一种或几种,用量为0.05-0.2%,脱色温度为40-80℃,脱色时间为30-60min。
8.根据权利要求1所述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,其特征在于:所述步骤(3)中胞苷脱色液电导率小于1ms/cm为电渗析终点。
9.根据权利要求1所述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,其特征在于:所述步骤(3)中胞苷醇沉结晶浓度为300-500g/L;结晶条件是:加入料液体积1-3倍的甲醇或者乙醇,于4-15℃、120-250rpm的条件下搅拌6-24h;晶体过滤后用80-90%甲醇或者乙醇按体积比1:1淋洗;所述真空干燥温度为45-60℃。
10.根据权利要求1或5所述的环保型从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,其特征在于:所述超滤膜为中空纤维超滤膜,膜材料为聚醚砜;超滤温度为30-45℃,超滤压力为0.7-1.2MPa。
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