CN103911336A - 产无糖雷莫拉宁的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种产无糖雷莫拉宁的基因工程菌，其是一种抑制或敲除了产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株中糖基转移酶基因的基因工程菌。本发明也公开所述基因工程菌的制备方法和所用的重组穿梭载体和转化体，以及这种产无糖雷莫拉宁的基因工程菌在生产无糖雷莫拉宁或雷莫拉宁衍生物上的应用。

Description

产无糖雷莫拉宁的基因工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及一种生产无糖雷莫拉宁的游动放线菌的基因工程菌及其制备方法和所用的重组穿梭载体和转化体，以及这种产无糖雷莫拉宁工程菌在生产无糖雷莫拉宁和雷莫拉宁衍生物上的应用。 

背景技术

随着抗生素在抗感染治疗上的大量应用，临床耐药问题日益突出，雷莫拉宁(RAMOPLANIN)作为一类新型广谱抗革兰氏阳性菌抗生素，目前主要是作为外用和治疗胃肠道粘膜表面感染性疾病药物进行研究开发。 

雷莫拉宁由一种游动放线菌属菌种(美国标准菌库保存，保藏号ATCC33076)发酵制得，其发酵液中主要含有三种结构类似物，雷莫拉宁A1、A2和A3，其制备工艺及用途由US4427656公开，结构上，雷莫拉宁在Hpg¹¹上连接有D-甘露糖基二糖，如图1所示，其中主要产物为雷莫拉宁A2。 

无糖雷莫拉宁A1、A2、A3(以下称为A1a、A2a和A3a)是一组在结构上缺失了D-甘露糖基二糖的雷莫拉宁衍生物。US5491128公开了无糖雷莫拉宁A1a、A2a和A3a的制备方法，并显示其针对特定耐药病原菌的抗菌活性类似或稍强于雷莫拉宁A1、A2和A3；同时，无糖雷莫拉宁A1a、A2a和A3a也可作为雷莫拉宁结构改造的先导化合物；Jiang等报道了一种全合成A2a的方法，Total synthesis of the ramoplanin A2 andramoplanose aglycon.″Journal of the American Chemical Society 124.19(2002)：5288-5290.；Shin等人报道了全合成A1a和A3a的方法，Totalsynthesis and structure of the ramoplanin A1 and A3 aglycons：Two minorcomponents of the ramoplanin complex.″Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101.33(2004)：11977-11979.；Palo等人提到了一种酶法制备A1a、A2a和A3a的方法Anew bacterial mannosidase for the selective modification of ramoplanin andits derivatives.Enzyme and Microbial Technology 41.6(2007)：806-811。如果能够抑制或者敲除雷莫拉宁生物合成途径中的糖基转移酶，则所获的突变株可以通过常规的发酵分离手段直接制备无糖雷莫拉宁，从而避免了水解法和酶法制备工艺中需先制得雷莫拉宁后再对其进行相应化学处理或酶法处理以及随后的目标产物的分离纯化的重复工艺，也可以避免化学合成法的繁琐工艺。 

发明内容

本发明通过阻断产雷莫拉宁菌株中的糖基转移酶基因，达到在其发酵过程中产生无糖雷莫拉宁的目的。 

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的水解法、酶法和化学全合成制备雷莫拉宁A1a、A2a和A3a的较为繁琐的工艺提供一种敲除糖基转移酶的产无糖雷莫拉宁的基因工程菌，该菌能够经由常规的发酵、分离工艺制备雷莫拉宁A1a、A2a和A3a，且传代非常稳定。本发明还提供了该生产雷莫拉宁A1a、A2a和A3a的基因工程菌的制备方法和所用的重组穿梭载体和转化体。 

本发明人经过仔细的研究和反复的对比发现，雷莫拉宁生物合成基因簇中的ramo-orf29所编码的OFR29的氨基酸序列与替考拉宁、A40926生物合成途径中的甘露糖基转移酶TCP15、DBV20类似，均含有甘露糖基转移酶的保守区域arnT，且RAMO-ORF29与TCP15和DBV20的一致性分别达到63％和50％，是雷莫拉宁生物合成途径中负责加载D-甘露糖基二糖的甘露糖基转移酶。因此，本发明人利用同源重组双交换将雷莫拉宁生物合成基因簇中的ramo-orf29进行同框敲除操作，经由抗性筛选，所获得的突变株不再产生雷莫拉宁A1、A2和A3，转而产生雷莫拉宁A1a、A2a和A3a，从而完成了本发明。 

因此，本发明的第一个目的是提供一种产无糖雷莫拉宁的基因工程菌，其是一种抑制或敲除了产雷莫拉宁野生菌株中糖基转移酶基因的基 因工程菌。 

根据本发明一个优选的实施方式，所述的糖基转移酶基因为产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株的ramo-orf29基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1的2727-4586位所示。 

其中，产雷莫拉宁野生菌株是指游动放线菌属菌种(美国标准菌库保存，保藏号ATCC33076)，或其突变菌株等。 

根据本发明，所述抑制或敲除产雷莫拉宁野生菌株中糖基转移酶基因ramo-orf29是指将外来DNA片段插入ramo-orf29基因中，或与ramo-orf29基因中的DNA片段置换，从而使ramo-orf29被阻断而不能表达。所述的产雷莫拉宁野生型菌株的ramo-orf29基因序列被敲除的部分最大长度可以是整个ramo-orf29基因，较佳的是敲除ramo-orf29基因的第322位-723位之间的核苷酸片段；或敲除ramo-orf29基因的第457-1365位之间的核苷酸片段；或敲除ramo-orf29基因的第937-1788位之间的核苷酸片段。因此，ramo-orf29基因被阻断而不能表达，从而使该被改造了的产雷莫拉宁野生型菌株失去产雷莫拉宁的能力转而产生无糖雷莫拉宁。 

根据本发明，所述的游动放线菌属菌种较佳的选用国内工业用菌株——Actinoplanes sp.ATCC 33076。 

本发明的第二个目的是提供一种重组穿梭载体，其含有在产雷莫拉宁野生型菌株中与ramo-orf29基因连锁的上游基因或其片段、ramo-orf29基因5’端片段、ramo-orf29基因3’端片段以及ramo-orf29基因连锁的下游基因或其片段依次连锁组成的DNA片段。 

雷莫拉宁生物合成基因簇的核苷酸序列已经由US 7635765公开。在野生型产雷莫拉宁菌株中，基因ramo-orf29上游的ramo-orf28、ramo-orf27、ramo-orf26依次连锁表达，ramo-orf29、ramo-orf30、ramo-orf31依次连锁表达。核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。其中第1-1764位核苷酸序列是所述的ramo-orf26基因片段；第1822-2049位核苷酸序列是所述的ramo-orf27基因片段；第2202-2486位核苷酸序列是所述的ramo-orf28基因，第2727-4586位核苷酸序列是所述的ramo-orf29基因，第4621-5688位核苷酸序列是所述的ramo-orf30基因，第5695-6984位 核苷酸为所述的ramo-orf31基因。ramo-orf29基因中被敲除部分的长度最大可以是整个ramo-orf29，较佳的是ramo-orf29基因中间的核苷酸序列，更佳的是ramo-orf29中编码甘露糖基转移酶保守区域arnT的核苷酸序列。也就是说，本发明的重组穿梭载体含有的DNA序列较佳的是由ramo-orf29上游DNA片段、ramo-orf29基因5’端片段、ramo-orf29基因3’端片段和ramo-orf29下游DNA片段依次连锁组成的DNA片段。 

该重组穿梭载体可用于与ATCC 33076基因组发生同源双交换，从而得到产无糖雷莫拉宁的ATCC 33076糖基转移酶基因阻断突变的工程菌。其中，在该重组穿梭载体中，所述的ramo-orf29上游DNA片段与连锁的ramo-orf29基因5’端片段部分是发生同源重组双交换的左臂；与ramo-orf29基因的3’端片段和与其连锁的下游DNA片段是发生同源重组双交换的右臂。所述的ramo-orf29基因中被敲除部分为与重组DNA片段中ramo-orf29基因5’端片段与重组DNA片段中ramo-orf29基因3’端片段之间对应于ramo-orf29基因核苷酸序列所缺失的部分；或为整段ramo-orf29基因。所述的左臂的长度可以是0.5-2.0kb，较佳的约为1.5kb，即序列表中SEQ ID NO.1第1549～3047位所示的序列。所述的右臂的长度可以是0.5-2.0kb，较佳的是1.5kb，即序列表中SEQ ID NO.1第3450～4851位所示的序列。 

根据本发明一个优选的实施方式，所述的重组穿梭载体的骨架较佳的是质粒pKC1139。 

本发明的第三个目的是提供一种转化子，其含有所述的重组穿梭载体。 

根据本发明一个优选的实施方式，所述的转化子的宿主细胞较佳的是大肠杆菌ET12567。 

本发明的第四个目的是提供一种制备产无糖雷莫拉宁的糖基转移酶基因阻断的基因工程菌的方法，其中，包括将如上所述的转化子与产雷莫拉宁的游动放线菌接合，挑选同源双交换接合子。 

本发明所述的游动放线菌属的基因工程菌可用于生产无糖雷莫拉宁。因此，本发明的第五个目的是提供一种制备无糖雷莫拉宁或其衍生物的方法，包括培养本发明上述产无糖雷莫拉宁的基因工程菌，从培养 物中获得无糖雷莫拉宁或其衍生物。 

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。 

相比于现有技术，本发明的有益效果如下： 

1.本发明将产雷莫拉宁的游动放线菌属菌种进行改造，主要是通过同源重组双交换敲除了其中的部分ramo-orf29基因，得到了生产无糖雷莫拉宁的工程菌； 

2.本发明所构建的工程菌，不含有任何抗性标记，便于进一步的基因工程改造； 

3.本发明所构建的工程菌不再产生雷莫拉宁，转而产生无糖雷莫拉宁，通过连续传代，无糖雷莫拉宁产量非常稳定重复性好； 

4.本发明采用PCR来筛选突变株，解决了插入抗性基因作为筛选标记(例如阿伯拉霉素抗性基因)，插入外来基因片段过大所带来的影响上下游基因的转录的问题，从而保持剩下的ramo-orf29基因的两端的碱基和编码氨基酸不变，最大限度的减少中断ramo-orf29对上下游的基因的影响，大大增加了菌株的稳定性； 

相对于须先通过微生物发酵制备雷莫拉宁之后再用化学水解法或酶法制备无糖雷莫拉宁的方法，以及相对于化学全合成制备无糖雷莫拉宁的方法，本发明所构建的产无糖雷莫拉宁基因工程菌能够利用现有的产雷莫拉宁野生型菌株的生产雷莫拉宁的工艺直接制备无糖雷莫拉宁，具有很好的工业化前景。 

附图说明

图1是雷莫拉宁A2以及无糖雷莫拉宁的结构示意图。 

图2是同框敲除ramo-orf29质粒的构建示意图。 

图3是敲除糖基转移酶产无糖雷莫拉宁基因工程菌的构建策略示意图。 

图4是PCR验证产无糖雷莫拉宁基因工程菌基因型的电泳图。M，marker；1，双交换基因型；2，野生型基因型。 

图5是产无糖雷莫拉宁基因工程菌发酵产物的HPLC检测图。 

图6是产无糖雷莫拉宁基因工程菌发酵产物的LC-MS检测图。 

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

所使用的工具酶和DNA分子量标记均购自宝生物公司(Takara)，具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书 

所使用的胶回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，使用方法参考商品说明书。 

大肠杆菌E.coli DH5α、ET12567，购自上海鼎国生物技术有限责任公司。 

游动放线菌Actinoplanes sp.ATCC 33076可从美国菌种保藏中心(ATCC)取得。 

实施例1：双交换左右臂的克隆 

在游动放线菌Actinoplanes sp.ATCC 33076中，ramo-orf26、ramo-orf27和ramo-orf28依次在ramo-orf29的上游，ramo-orf30和ramo-orf31依次在ramo-orf29的下游，我们取ramo-orf9上游至ramo-orf26部分片段、ramo-orf29的5’端片段作为双交换的左臂，ramo-orf29基因3’端片段至ramo-orf30部分片段作为双交换的右臂来构建双交换质粒。首先根据已经发表的游动放线菌Actinoplanes sp.ATCC33076相应序列(US 7635765)设计引物： 

左臂上游为5’-AAAAAGCTTCAGGGCGATGAGGATGC-3’； 

左臂下游为5’-AAATCTAGAGAAGCCGAAGACGCG-3’； 

右臂上游为5’-AAATCTAGAGCGGTCTCGCTGCTCT-3’； 

右臂下游为5’-AAAGATATCGCTGCTCGACGTAGGC-3’。 

上述引物由上海英骏生物技术有限公司合成。以游动放线菌ATCC33076的基因组总DNA为模板。使用宝生物公司的Primer star高保真DNA聚合酶来进行片段的克隆。PCR条件为：98℃，10s、66℃，15s、72℃，1.5min扩增30个循环。PCR产物上样电泳后，回收目的条带。回 收的片段与质粒进行连接，左臂PCR产物联入质粒pSP72(购自上海生物工程技术服务有限公司)，接入位点HindIII和XbaI，命名为pCJS1001并测序；右臂PCR产物联入质粒pSP72，接入位点XbaI和EcoRV，命名为pCJS1002，并测序。左臂序列与US 7635765中的相应序列比对为100％的同源性，右臂序列与编号US 7635765中的相应序列比对为100％的同源性。 

实施例2：双交换定点同框敲除ramo-orf29质粒pCJS1004的构建 

将实施例1中的右臂连入质粒pKC1139(购自上海生物工程技术服务有限公司)，接入位点XbaI和EcoRV，得到质粒，命名为pCJS1003。将实施例1中左臂正向联入质粒pCJS1003，接入位点HindIII和XbaI，得到质粒，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，采用氨苄青霉素抗性LB平板挑取阳性克隆，在LB培养基中37℃过夜培养后提取小量质粒进行酶切和PCR验证，最终构建完成双交换同框敲除质粒，命名为pCJS1004。构建策略图见图2。 

实施例3：敲除糖基转移酶的产无糖雷莫拉宁基因工程菌Actinoplanes sp.ATCC 33076.D29的构建 

从游动放线菌ATCC 33076斜面挑取适量菌体于50ml TSB培养基中培养56小时左右达到对数生长期，1％(v/v)接种量转接于50ml TSB培养基中培养48小时左右使菌体达到对数生长后期，离心倒去上清得到菌丝体，菌丝体用20ml的LB液体培养基洗涤2次(4000rpm，10min，4℃)，最后重悬于20ml LB培养基中，待用。用pCJS1004转化感受态大肠杆菌ET12567，挑转化子至装有4ml LB培养基[含阿伯拉霉素(Am)100μg/ml、卡那霉素(Kn)25μg/ml、氯霉素(Cm)100μg/ml]的小试管中，37℃振荡培养12小时。大肠杆菌ET12567接种于装有50ml LB培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养4小时左右，使菌液OD值在0.4～0.6之间，将菌液移入50ml的无菌塑料离心管，离心(4000rpm，10min，4℃)，倒去上清，菌体用20ml LB培养基洗涤2次(4000rpm，10min，4℃)，最后重悬于1～2ml LB培养基中。将该大肠菌液与之前重悬于20ml的游 动放线菌ATCC 33076菌丝体以1∶1(重悬液体积比)于EP管中混匀。将混合菌液涂MS平板，用涂棒充分混匀菌液，30℃恒温箱培养。培养20小时后，取出平板，涂抗生素，用量为每10个平板涂10ml双蒸水、100μl Am和400μl萘啶酸(NC)的混合液，再于30℃恒温箱培养。培养一周后出现接合子。敲除ramo-orf29的产无糖雷莫拉宁基因工程菌的构建过程见图3。 

挑取所得的接合子于装有4ml TSB培养基的小试管中(含Am50μg/ml、试管中加入2～3粒直径2～5毫米的玻璃珠)，30℃振荡培养。菌液摇浓后，取1μl菌液稀释于1ml无菌水中，混匀后取100μl涂含Am50μg/ml的游动放线菌ATCC33076平板，37℃培养以促进pCJS004整合至ATCC33076的基因组DNA上。4至5天后，37℃培养平板上的整合子单菌落于无抗生素的TSB培养基中培养，连续传代，促使其发生双交换。取第3代菌液1μl，稀释于10ml的无菌水中，混匀后取100μl涂ATCC33076平板(无抗性)，30℃培养。4至5天后，出现单菌落，挑取同一个单菌落分别在含Am50μg/ml的平板与无抗性的平板上培养，筛选得到20个在无抗性平板生长，而抗性平板不生长的菌落。在无抗性平板生长而在抗性平板不生长的克隆可能是发生双交换或者回复的单菌落。挑取菌落在无抗液体TSB培养基中培养，然后抽提其总DNA，以其为模板，设计相应的引物进行基因型筛选，上游引物为5’-AAAGGATCCATGGATGTCCCGAGGGTG-3’，下游引物为5’-AAATCTAGATCAGGGCTTGTCGCATCG-3’，PCR条件为98℃，10s、66℃，15s、72℃，2min扩增30个循环。PCR产物的电泳图见图4。扩增出1.8kb的片段的是回复型的野生菌株基因组，扩增出1.4kb的片段的是双交换突变株基因组，我们从20个菌落中筛选到8个双交换同框敲除突变株，并将相应扩增到的片段进行测序，测序结果表明突变株缺失了所设计敲除的目的片段，表明目标碱基序列已被正确敲除。最后将其中一株产无糖雷莫拉宁单位较高的突变株命名为Actinoplanes sp.ATCC33076.D29，并于2012年12月7日提交中国典型培养物保藏中心保藏(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏号为CCTCC M2012520。 

实施例4：产无糖雷莫拉宁的基因工程菌的发酵以及产物验证 

接种Actinoplanes sp.ATCC33076.D29于斜面28℃培养，培养7天后，接种于种子培养基(牛肉浸膏0.3％，进口蛋白胨0.5％，进口酵母粉0.5％，燕麦粉3.0％，碳酸钙0.4％，消前pH7.0)中于28℃，250rpm培养3天后转接于发酵培养基(葡萄糖6.0％，花生油1.0％，冷榨黄豆粉3.0％，碳酸钙1.0％，亮氨酸0.7％，消前pH7.0)中，于28℃，250rpm培养6天后放瓶，所得发酵液用草酸调节pH至4左右，加2倍体积丙酮混匀浸泡5小时，离心后取上清进行HPLC和LC-MS分析。HPLC条件为：水(0.4％甲酸铵)∶乙腈＝65∶35，流速0.8ml/min，柱温35℃，检测波长231nm，色谱柱为Agilent C18，进样量15μl，HPLC检测结果如图5所示，目标产物紫外吸收特征如图6所示；LC-MS检测条件，HPLC条件如上述，MS条件为：电喷雾离子源，正离子扫描方式。可见双交换同框敲除ramo-orf29的基因工程菌的发酵产物中已不存在雷莫拉宁组分，转而产生无糖雷莫拉宁。 

实施例5：从产无糖雷莫拉宁的基因工程菌发酵液中分离无糖雷莫拉宁 

依照实施例4对Actinoplanes sp.ATCC 33076.D29进行发酵培养，所得发酵液用18％HCl调节pH至3.5后过滤，滤饼经水洗后用等体积甲醇抽提半小时以上，抽提两次，通过减压浓缩蒸干甲醇，制得无糖雷莫拉宁的粗提物浓缩液。将粗提物浓缩液pH调节至8后置于以NM100为填料的的柱子上端(柱高×直径∶经乙醇与水v/v＝1∶4混合物平衡)，分别用不同比例的乙醇与水混合物(v/v＝1∶4、1∶1、3∶2)作为流动相，流速1ml/min洗脱杂质。再以pH为4的乙醇与水混合物(v/v＝7∶3)作为流动相，流速1ml/min，分部收集流出液，采用实施例4所述方法进行跟踪检测，收集目的物含量达到85％以上的流出液，浓缩至干得到纯化的无糖雷莫拉宁，收率为90％，纯度达到85％。 

实施例6：将ramo-orf29全序列完全敲除的产无糖雷莫拉宁基因工程菌的构建 

在游动放线菌ATCC 33076的基因组DNA中将编码参与雷莫拉宁生物合成的甘露糖基转移酶的ramo-orf29基因核苷酸序列全部同框敲除，从而阻断其表达来构建产无糖雷莫拉宁的基因工程菌。 

首先设计同框敲除中断引物： 

左臂上游为5’-AAAAAGCTT CCAGCACGGCCCGGTG-3’； 

左臂下游为5’-AAATCTAGA GGCGGCCAAGGCATCC-3’； 

右臂上游为5’-AAATCTAGA CAACCGACGTAGCACGACG-3’； 

右臂下游为5’-AAAGATATC GACCTTCCCGCCCCCG-3’。 

依照实施例1中所述的方法分别克隆得到双交换中断质粒的左臂和右臂，经过测序，其序列与US 7635765中所公开的序列具有100％一致性。 

将所得的左臂和右臂片段依照实施例2中所述的方法构建双交换同框敲除质粒pCJS2004。 

将所得的pCJS2004依照实施例3中所述的方法构建敲除糖基转移酶的产无糖雷莫拉宁基因工程菌Actinoplanes sp.ATCC 33076.D29-1。 

依照实施例4所述方法对上述所得到的产无糖雷莫拉宁基因工程菌Actinoplanes sp.ATCC 33076.D29-1进行发酵，并对产物进行验证，所得双交换同框敲除ramo-orf29全部碱基的基因工程菌的发酵产物中已不存在雷莫拉宁组分，转而产生无糖雷莫拉宁。 

实施例7：同框敲除ramo-orf29基因中457-1365位碱基的产无糖雷莫拉宁基因工程菌的构建 

在游动放线菌A.ATCC 33076的基因组DNA中将编码参与雷莫拉宁生物合成的甘露糖基转移酶的ramo-orf29基因序列中457-1365位碱基同框敲除，从而阻断其表达来构建产无糖雷莫拉宁的基因工程菌。 

首先设计同框敲除中断引物： 

左臂上游为5’-AAAAAGCTT ACGAGGGCGGGCTCGC-3’； 

左臂下游为5’-AAATCTAGA GATCGGCGTCGTGGCGA-3’； 

右臂上游为5’-AAATCTAGA GGCCTGCTGGCGGTGC-3’； 

右臂下游为5’-AAAGATATC TGTTGCCGCTGCCGAA-3’。 

依照实施例1中所述的方法分别克隆得到双交换中断质粒的1.5kb的左臂和1.5kb的右臂，经过测序，其序列与US 7635765中所公开的序列具有100％一致性。 

将所得的左臂和右臂片段依照实施例2中所述的方法构建双交换同框敲除质粒pCJS3004。 

将所得的pCJS2004依照实施例3中所述的方法构建敲除糖基转移酶的产无糖雷莫拉宁基因工程菌Actinoplanes sp.ATCC 33076.D29-2。 

依照实施例4所述方法对上述所得到的产无糖雷莫拉宁基因工程菌Actioplanes sp.ATCC 33076.D29-2进行发酵，并对产物进行验证，所得双交换同框敲除ramo-orf29基因457-1365位碱基的基因工程菌的发酵产物中已不存在雷莫拉宁组分，转而产生无糖雷莫拉宁。 

实施例8：同框敲除ramo-orf29基因中937-1788位碱基的产无糖雷莫拉宁基因工程菌的构建 

在游动放线菌A.ATCC 33076的基因组DNA中将编码参与雷莫拉宁生物合成的甘露糖基转移酶的ramo-orf29基因序列中937-1788位碱基同框敲除，从而阻断其表达来构建产无糖雷莫拉宁的基因工程菌。 

首先设计同框敲除中断引物： 

左臂上游为5’-AAAAAGCTT GCCGACAAGCGTGCACG-3’； 

左臂下游为5’-AAATCTAGA ATCCGCGGCAAGCGCC-3’； 

右臂上游为5’-AAATCTAGA TGCGCCACCGTGCCG-3’； 

右臂下游为5’-AAAGATATC CCGCGATGGAGCCGAT-3’。 

依照实施例1中所述的方法分别克隆得到双交换中断质粒的1.5kb的左臂和1.5kb的右臂，经过测序，其序列与US 7635765中所公开的序列具有100％一致性。 

将所得的左臂和右臂片段依照实施例2中所述的方法构建双交换同框敲除质粒pCJS3004。 

将所得的pCJS2004依照实施例3中所述的方法构建敲除糖基转移酶的产无糖雷莫拉宁基因工程菌Actinoplanes sp.ATCC 33076.D29-3。 

依照实施例4所述方法对上述所得到的产无糖雷莫拉宁基因工程菌 Actinoplanes sp.ATCC 33076.D29-3进行发酵，并对产物进行验证，所得双交换同框敲除ramo-orf29基因937-1788位碱基的基因工程菌的发酵产物中已不存在雷莫拉宁组分，转而产生无糖雷莫拉宁。 

Claims (14)

1.一种产无糖雷莫拉宁的基因工程菌，其是一种抑制或敲除了产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株中糖基转移酶基因的基因工程菌。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，所述糖基转移酶基因为产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株的ramo-orf29基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1的2727-4586位所示。

3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株是游动放线菌Actinoplanes sp.ATCC 33076。

4.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株的ramo-orf29基因被全部抑制或敲除。

5.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株的ramo-orf29基因的第322-723位的核苷酸片段被抑制或敲除。

6.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株的ramo-orf29基因的第457-1365位的核苷酸片段被抑制或敲除。

7.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株的ramo-orf29基因的第937-1788位的核苷酸片段被抑制或敲除。

8.一种重组穿梭载体，其特征在于，其包含由在产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株基因组中与ramo-orf29基因连锁的上游基因或其片段、ramo-orf29基因5’端片段、ramo-orf29基因3’端片段、以及在产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株基因组中与ramo-orf29基因连锁的下游基因或其片段依次连锁组成的DNA片段。

9.如权利要求8所述的重组穿梭载体，其特征在于，所述的依次连锁组成的DNA片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

10.如权利要求8所述的重组穿梭载体，其特征在于，所述重组穿梭载体的骨架是质粒pKC1139。

11.一种转化子，其特征在于，其包含权利要求8-10任一项所述的重组穿梭载体。

12.如权利要求11所述的转化子，其特征在于，所述转化子的宿主细胞是大肠杆菌ET12567。

13.一种制备如权利要求1所述的产无糖雷莫拉宁的基因工程菌的方法，其特征在于，包括将权利要求11或12任一项所述的转化子与产雷莫拉宁的游动放线菌接合，挑选同源双交换接合子。

14.一种制备无糖雷莫拉宁或其衍生物的方法，包括培养如权利要求1-7任一项所述的产无糖雷莫拉宁的基因工程菌，从培养物中获得无糖雷莫拉宁或其衍生物。