CN114349824A - 一种纯化利那洛肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纯化利那洛肽的方法，属多肽纯化技术领域。该方法利那洛肽粗品预处理得到利那洛肽粗肽水溶液；以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以磷酸为流动相A，以乙腈为流动相B，进行第一次HPLC纯化；除去溶剂得到利那洛肽第一步样品溶液；以四烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以氯化钠溶液为流动相A1；以水为流动相A2；以乙腈为流动相B，进行第二次HPLC转盐纯化；除去溶剂得到利那洛肽第二步样品溶液，得到利那洛肽样品溶液。本发明经过两次HPLC纯化，第一次得到的样品纯度达92％以上，第二次得到的样品纯度达99％以上，提高了利那洛肽的纯度和收率。

Description

一种纯化利那洛肽的方法
技术领域
本发明涉及肽纯化的领域，特别是一种纯化利那洛肽的方法。
背景技术
中文名：利那洛肽；英文名：Linaclotide；肽序列为：Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Thr-OH(1-6)，(2-10),(5-13)-tris。
利那洛肽(Linaclotide)是由美国Ironwood公司研发的一种鸟苷酸环化酶激动剂，于2012年8月30日获得美国FDA批准上市，商品名为Linzess。该药为胶囊剂，主要用于治疗便秘肠易激综合征(IBS-C)和慢性特发性便秘(CIC)，是首个具有此种作用机制的治疗便秘的多肽药物。该药物形态为白色至灰白色无定型的粉末，微溶于水和生理盐水。
固相合成利那洛肽，合成物中会产生多种影响样品的纯度和收率的杂质，通过现有纯化技术分离得到利那洛肽样品纯度低，收率低。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种纯化利那洛肽的方法，本发明经过两次HPLC纯化，第一次得到的样品纯度达92％以上，第二次得到的样品纯度为99％以上，提高了利那洛肽的纯度和收率。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种纯化利那洛肽的方法，包括如下步骤：
步骤一，利那洛肽粗品预处理得到利那洛肽粗肽水溶液；
步骤二，以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以磷酸为流动相A，以乙腈为流动相B，进行第一次HPLC纯化；
步骤三，除去溶剂，得到利那洛肽第一步样品溶液；
步骤四，以四烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以氯化钠溶液为流动相A1，以水为流动相A2；以乙腈为流动相B，进行第二次HPLC纯化；
步骤五，除去溶剂得到利那洛肽第二步样品溶液，得到利那洛肽样品溶液。
前述的一种纯化利那洛肽的方法，步骤一，利那洛肽粗品预处理得到利那洛肽粗肽水溶液；预处理步骤包括：
1)将利那洛肽粗品溶于乙腈水溶液中得到利那洛肽粗肽水溶液；
2)取利那洛肽水溶液用滤膜过滤除去不溶性颗粒，收集滤液备用。
前述的一种纯化利那洛肽的方法，步骤二，以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以0.1％磷酸为流动相A，以乙腈为流动相B，检测波长为230nm，进行第一次HPLC线性梯度洗脱，收取含有利那洛肽样品的馏分；固定相的粒度为10μm，0.1％磷酸的制备方法为：取1000ml水，加1ml磷酸，混合均匀，用氨水调节pH值至7.5得到0.1％磷酸。
前述的一种纯化利那洛肽的方法，步骤三，用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，得到利那洛肽第一步样品溶液，样品溶液为碱性。
前述的一种纯化利那洛肽的方法，步骤四，以四烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以15mmol/L的氯化钠溶液为流动相A1，以水为流动相A2，以乙腈为流动相B，检测波长为230nm，进行第二次HPLC梯度洗脱，收取含有利那洛肽样品的馏分；15mmol/L的氯化钠溶液的制备方法为：取1000ml水加氯化钠0.88g，溶解搅匀得到15mmol/L的氯化钠溶液。
前述的一种纯化利那洛肽的方法，步骤五，用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，得到利那洛肽样品溶液，样品溶液为酸性。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：
1、本发明用八烷基硅烷键合硅胶填料与流动相磷酸相结合，可以去除利那洛肽大部份的杂质及片段杂质；收集的样品纯度达92％以上。
2、本发明选用四烷基硅烷键合硅胶填料为固定相与的氯化钠溶液为流动相相结合的色谱条件梯度洗脱，可以除去样品中跟利那洛肽理化性能相近的杂质，可一次收到纯度为99％以上的样品；提高了利那洛肽成品纯度和收率。
附图说明
图1是实施例1利那洛肽粗品的HPLC的1/2图；
图2是实施例1利那洛肽粗品的HPLC的2/2图；
图3是实施例1第一次HPLC纯化后利那洛肽的HPLC图；
图4是实施例1第二次HPLC纯化后利那洛肽的HPLC图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种纯化利那洛肽的方法，包括如下步骤：
步骤一，利那洛肽粗品预处理得到利那洛肽粗肽水溶液；预处理步骤包括：
1)将利那洛肽粗品溶于乙腈水溶液中得到利那洛肽粗肽水溶液；
2)取利那洛肽水溶液用滤膜过滤除去不溶性颗粒，收集滤液备用，作为一种优选，滤膜为0.22μm滤膜。
步骤二，进行第一次HPLC纯化，去除利那洛肽片段杂质；
以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以0.1％磷酸为流动相A，以乙腈为流动相B，检测波长为230nm，进行第一次HPLC线性梯度洗脱，收取含有利那洛肽样品的馏分；固定相的粒度为10μm，0.1％磷酸的制备方法为：取1000ml水，加1ml磷酸，混合均匀，用氨水调节pH值至7.5得到0.1％磷酸。
步骤三，用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，得到利那洛肽第一步样品溶液，样品溶液为碱性。
步骤四，进行第二次HPLC纯化，去除与利那洛肽理化性能相近的杂质；
以四烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以15mmol/L的氯化钠溶液为流动相A1，以水为流动相A2，以乙腈为流动相B，检测波长为230nm，进行第二次HPLC梯度洗脱，收取含有利那洛肽样品的馏分；15mmol/L的氯化钠溶液的制备方法为：取1000ml水加氯化钠0.88g，溶解搅匀得到15mmol/L的氯化钠溶液。
步骤五，用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09Mpa以下除去部分乙腈，得到利那洛肽样品溶液，样品溶液为酸性。
为了证明本发明的纯化方法，能够去除杂质，得到纯度高，收率高的利那洛肽成品，用含3g、8g、32g利那洛肽粗肽样品用本方法做纯化实验，实验过程如下所示：
实施例1：
取利那洛肽粗品，利那洛肽粗品的HPLC图参照图1和2。
样品处理：将含3g利那洛肽粗肽(粗肽：4.6克)样品溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤。收集过滤后的利那洛肽粗肽水溶液备用。
第一步HPLC纯化
色谱条件：以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相(30mm×250mm，10μm)的色谱柱；以0.1％磷酸(取1000ml水，加1ml磷酸，混合均匀，用氨水调节pH值至7.5)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为20mL每分钟；检测波长为230nm；单针上样量为0.6g。以下表洗脱梯度进行洗脱。第一次HPLC纯化后利那洛肽的HPLC图参照图3。
Figure BDA0003453376780000041
收取纯度大于95％的利那洛肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09Mpa以下除去部分乙腈。得到利那洛肽第一步样品溶液。
第二步HPLC纯化
色谱条件：以四烷基硅烷键合硅胶填料为固定相(30mm×250mm，10μm)的色谱柱；以15mmol/L的氯化钠溶液(取1000ml水加氯化钠0.88g)为流动相A1；以水为流动相A2；以乙腈为流动相B；流速为20mL每分钟；检测波长为230nm；上样量为0.43g。以下表洗脱梯度进行洗脱。第二次HPLC纯化后利那洛肽的HPLC图参照图4。
Figure BDA0003453376780000042
Figure BDA0003453376780000051
收取纯度大于99.0％的利那洛肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09Mpa以下除去部分乙腈。溶液经对照品定量含利那洛肽2.20g，收率达73.3％。
实施例2
取利那洛肽粗品
样品处理：将含8g利那洛肽粗肽(粗肽：12.2克)样品溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤。收集过滤后的粗肽水溶液备用。
第一步HPLC纯化
色谱条件：以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相(30mm×250mm，10μm)的色谱柱；以0.1％磷酸(取1000ml水，加1ml磷酸，混合均匀，用氨水调节pH值至7.5)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为60mL每分钟；检测波长为230nm；单针上样量为1.6g。以下表洗脱梯度进行洗脱。
Figure BDA0003453376780000052
收取纯度大于95％的利那洛肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09Mpa以下除去部分乙腈。得到利那洛肽第一步样品溶液。
第二步HPLC纯化
色谱条件：以四烷基硅烷键合硅胶填料为固定相(50mm×250mm，10μm)的色谱柱：以15mmol/L的氯化钠溶液(取1000ml水加氯化钠0.88g)为流动相A1；以水为流动相A2；以乙腈为流动相B；流速为60mL每分钟；检测波长为230nm；上样量为1.2g。以下表洗脱梯度进行洗脱。
Figure BDA0003453376780000053
Figure BDA0003453376780000061
收取纯度大于99.0％的利那洛肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09Mpa以下除去部分乙腈。溶液经对照品定量含利那洛肽5.70g，收率达71.2％。
实施例3
取利那洛肽粗品
样品处理：将含32g利那洛肽粗肽(粗肽：48.8克)样品溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤。收集过滤后的粗肽水溶液备用。
第一步HPLC纯化
色谱条件：以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相(100mm×250mm，10μm)的色谱柱；以0.1％磷酸(取1000ml水，加1ml磷酸，混合均匀，用氨水调节pH值至7.5)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为200mL每分钟；检测波长为230nm；上样量为6.4g。以下表洗脱梯度进行洗脱。
Figure BDA0003453376780000062
收取含有利那洛肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09Mpa以下除去部分乙腈。得到利那洛肽第一步样品溶液。
第二步HPLC纯化
色谱条件：以四烷基硅烷键合硅胶填料固定相(100mm×250mm，10μm)的色谱柱；以15mmol/L的氯化钠溶液(取1000ml水加氯化钠0.88g)为流动相A1；以水为流动相A2；以乙腈为流动相B；流速为200mL每分钟；检测波长为230nm；上样量为4.8g。以下表洗脱梯度进行洗脱。
Figure BDA0003453376780000071
收取纯度大于99.0％的利那洛肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09Mpa以下除去部分乙腈。溶液经对照品定量含利那洛肽23.60g，收率达73.7％。
Figure BDA0003453376780000072
由3个实施例可知，通过本方法纯化利那洛肽粗品，得到的利那洛肽的纯度大于99.0％。
本发明纯化利那洛肽的方法，实验证明，经过两次HPLC纯化，第一次得到的样品纯度达92％，第二次得到的样品纯度为99％，提高了利那洛肽的纯度和收率。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种纯化利那洛肽的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
步骤一，利那洛肽粗品预处理得到利那洛肽粗肽水溶液；
步骤二，以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以磷酸为流动相A，以乙腈为流动相B，进行第一次HPLC纯化；
步骤三，除去溶剂，得到利那洛肽第一步样品溶液；
步骤四，以四烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以氯化钠溶液为流动相A1；
以水为流动相A2；以乙腈为流动相B，进行第二次HPLC转盐纯化；
步骤五，除去溶剂得到利那洛肽第二步样品溶液，得到利那洛肽样品溶液。
2.根据权利要求1所述的一种纯化利那洛肽的方法，其特征在于，步骤一中，
利那洛肽粗品预处理得到利那洛肽粗肽水溶液；所述预处理的步骤包括：
1)将利那洛肽粗品溶于乙腈水溶液中得到利那洛肽粗肽水溶液；
2)取利那洛肽水溶液用滤膜过滤除去不溶性颗粒，收集滤液备用。
3.根据权利要求1所述的一种纯化利那洛肽的方法，其特征在于，步骤二中，以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以0.1％磷酸为流动相A，以乙腈为流动相B，检测波长为230nm，进行第一次HPLC线性梯度洗脱，收取含有利那洛肽样品的馏分；所述固定相的粒度为10μm，所述0.1％磷酸的制备方法为：取1000ml水，加1ml磷酸，混合均匀，用氨水调节pH值至7.5得到0.1％磷酸。
4.根据权利要求1所述的一种纯化利那洛肽的方法，其特征在于，步骤三中，用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，得到利那洛肽第一步样品溶液，样品溶液为碱性。
5.根据权利要求1所述的一种纯化利那洛肽的方法，其特征在于，步骤四中，以四烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以15mmol/L的氯化钠溶液为流动相A1，以水为流动相A2，以乙腈为流动相B，检测波长为230nm，进行第二次HPLC梯度洗脱，收取含有利那洛肽样品的馏分；所述15mmol/L的氯化钠溶液的制备方法为：取1000ml水加氯化钠0.88g，得到15mmol/L的氯化钠溶液。
6.根据权利要求1所述的一种纯化利那洛肽的方法，其特征在于，步骤五中，用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，得到利那洛肽样品溶液。
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