CN109206486B - 一种硫酸多黏菌素b的杂质及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明属于药物分析及质量控制技术领域,具体涉及一种硫酸多黏菌素B的杂质及其分离制备方法。
背景技术
硫酸多黏菌素作为一种早期的非核糖体类抗菌药物,曾广泛应用于临床抗革兰阴性菌的治疗,后因其抗菌谱窄,毒副作用较明显而被替代。目前随着全球范围内多重耐药革兰阴性菌感染率不断增长,硫酸多黏菌素作为治疗革兰阴性菌的最后一道防线而再次被重视。根据不同菌株产生化学结构不同,硫酸多黏菌素总共有30多种类型,主要分为A、B、C、D、E五种亚型,其基本结构均为类环状十肽序列,包括一个七肽环和一个三肽侧链。三肽侧链各带有一个含氨基酸残基端的脂肪酸尾链,残基端的不同氨基酸组成导致其化学结构不全相同,其为硫酸多黏菌素分型的主要依据。最终仅多黏菌素B及E因其良好的疗效和相对较高的安全性而应用于临床,其区别在于硫酸多黏菌素B的氨基酸成分为苯丙氨酸,而多黏菌素E则为亮氨酸。临床上常用的多黏菌素B、E均为混合物。
硫酸多黏菌素B为发酵代谢产物,发酵液经纯化后得到构型相同的四个组分的硫酸多黏菌素B。在纯化硫酸多黏菌素B时会导致某些降解杂质含量升高,或产生新的降解杂质,但目前尚无关于硫酸多黏菌素B单个杂质的报道。为提高产品纯化工艺的可控性,保证产品质量,需要对产生的降解杂质进行研究。
发明内容
本发明提供了一种新的硫酸多黏菌素B的杂质D17。该杂质在用碱调节pH沉淀硫酸多黏菌素B,以纯化硫酸多黏菌素B时,会不可避免地产生,且在硫酸多黏菌素B产品中含量较大。本申请分离制备出该杂质,对其进行了结构确认。并通过对硫酸多黏菌素B降解条件的研究,给出了控制该杂质生成的方法。
本发明的目的可通过以下技术方案实现:
本发明提供了一种硫酸多黏菌素B的杂质D17,其结构如下:
该杂质在发酵液中未检出,但在硫酸多黏菌素B产品中会固定地出现,含量约0.6-0.8%。经检测,其相对保留时间为RRT1.16。后续研究发现,随着降解时体系环境不同,该杂质含量不同。
本发明还提供了一种硫酸多黏菌素B的杂质D17的制备方法,其特征在于:向硫酸多黏菌素B水溶液中加入氨水使硫酸多黏菌素B发生降解。
在一种优选实施方式中,硫酸多黏菌素B水溶液的浓度为5-15mg/ml。
在一种优选实施方式中,硫酸多黏菌素B水溶液中加入氨水后,调节溶液pH至6-11,降解温度为25-50℃,降解时间为0-42小时。
在一种优选实施方式中,硫酸多黏菌素B水溶液中加入氨水后,调节溶液pH至9.3,降解温度为33℃,降解时间为24小时。
本发明的第三个目的在于提供一种硫酸多黏菌素B的杂质D17的分离纯化方法,其特征在于:包括以下步骤,
(1)、将硫酸多黏菌素B成品溶于5%乙腈水溶液中,配制成上柱液。经高效制备液相分离得硫酸多黏菌素B杂质D17浓溶液;
(2)、向步骤(1)中所得硫酸多黏菌素B杂质D17浓溶液中加入氨水,析出白色沉淀,过滤,得沉淀。
(3)、将步骤(2)得到的沉淀用水分散,滴加5%硫酸溶液调pH约为6.5,冷冻干燥,冻干后的固体即为硫酸多黏菌素B杂质D17。
在一种优选实施方式中,步骤(1)中所述高效液相制备分离所用的色谱柱为Xtimate C18(welch),20*250nm,5um;流动相为乙腈:4.46g/L硫酸钠盐溶液(20∶80);检测波长为215nm。
在一种优选实施方式中,步骤(2)中加入氨水至体系pH为9-10。
本发明采用高分辨质谱、核磁等手段对分离得到的杂质D17进行了结构检测及确认。
本发明还提供一种控制硫酸多黏菌素B中杂质D17的方法,其特征在于:在用碱调节pH沉淀硫酸多黏菌素B时,一次性快速加入至析出硫酸多黏菌素B沉淀。
本发明提供的硫酸多粘菌素B的杂质D17,其可作为标准对照品用于检测硫酸多黏菌素B原料或制剂中杂质D17及其含量。
本发明针对硫酸多黏菌素B特定单杂进行研究,提供了一种新的硫酸多黏菌素B杂质D17,其制备分离方法、含量控制方法及作为标准对照品的用途。为优化硫酸多黏菌素B的工业化生产提供了技术支持,也提高了硫酸多黏菌素B产品的质量,保证了该药品的安全有效性。
附图说明
图1:实施例1中所用硫酸多黏菌素B原料的液相色谱图;
图2:硫酸多黏菌素B杂质D17的核磁共振氢谱;
图3:硫酸多黏菌素B杂质D17的核磁共振碳谱;
图4:硫酸多黏菌素B杂质D17的紫外光谱图;
图5:实施例5中CD630批次硫酸多黏菌素B制剂的液相色谱图。
具体实施方法
为了更好地理解本发明的内容,下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步的说明,但具体的实施方式并不意味着对本发明有任何限制。
本发明所用硫酸多粘菌素B及试剂均市售购得。
实施例1分离纯化硫酸多黏菌素B杂质D17
1、杂质D17的粗制
硫酸多黏菌素B溶于5%的乙腈溶液,用Agilent SD-1制备液相制备;色谱柱C18(5um,20×250mm);流动相为乙腈∶硫酸钠盐溶液4.46g/L=20∶80;检测波长215nm;流速25mL/min。收集馏分,并过C18制备色谱柱富集。用80%乙腈洗脱,收集杂质粗提品溶液。
2、杂质D17的精制
将收集的杂质粗提品溶液在35℃下减压浓缩,除去其中的乙腈。将浓缩液再次上制备柱纯化,收集其中杂质D17含量大于90%的馏分并对其进行富集除盐,得到硫酸多黏菌素B杂质D17浓溶液。
3、杂质D17的后处理
向硫酸多黏菌素B杂质D17浓溶液中加入氨水,调pH至9-10之间,析出白色沉淀,过滤,所得沉淀用水洗三次。得到的沉淀用水分散后,滴加5%稀硫酸溶液调pH至6.5左右,然后经冷冻干燥冻干,冻干后的固体即为硫酸多黏菌素B杂质D17。
实施例2硫酸多黏菌素B杂质D17的结构鉴定
将实施例1中所得杂质D17经高分辨质谱检测,结果如下:
硫酸多黏菌素B杂质高分辨质谱m/z:1203.7587[M+H]+,1225.7408[M+Na]+。
再将实施例1中所得杂质D17进行核磁检测,得到核磁共振氢谱和核磁共振碳谱,结果如下:
1H NMR(600MHz,D2O)δ7.30(t,J=7.2Hz,2H),7.25(t,J=7.2Hz,1H),7.10(d,J=7.2Hz,2H),4.72(t,J=7.2Hz,1H),4.50(dd,J=9.0,4.2Hz,1H),4.45(dd,J=9.6,4.2Hz,1H),4.38(dd,J=9.0,4.2Hz,1H),4.29(d,J=4.2Hz,1H),4.23(dd,J=9.6,3.0Hz,1H),4.20(dd,J=6.6,4.2Hz,1H),4.14(dd,J=6.6,4.2Hz,1H),4.00(t,J=7.8Hz,1H),3.91(dd,J=10.2,4.2Hz,1H),3.90(m,1H),3.89(d,J=4.8Hz,1H),3.29(m,2H),3.13(m,2H),3.06(m,1H),3.02(m,3H),3.01(m,2H),2.99(m,2H),2.94(m,2H),2.28(m,1H),2.24(t,J=7.2Hz,2H),2.16(m,4H),2.06(m,1H),2.02(m,1H),1.99(m,1H),1.90(m,2H),1.88(m,2H),1.49(m,2H),1.48(m,1H),1.38(m,1H),1.22(m,5H),1.17(m,1H),1.14(d,J=6.6Hz,3H),1.07(d,J=6.6Hz,3H),1.03(m,1H),1.02(m,1H),0.78(d,J=7.2Hz,3H),0.74(t,J=7.8Hz,3H),0.74(d,J=2.4Hz,3H),0.52(d,J=2.4Hz,3H)。
13C NMR(150MHz,D2O)δ177.54,175.52,173.47,173.20,173.10,172.71,172.48,172.42,172.03,171.99,170.66,135.62,129.16,128.88,127.44,67.10,66.58,60.71,58.92,54.82,53.60,52.05,51.69,51.28,51.09,50.99,50.77,39.13,37.85,36.81,36.40,36.31,36.28,35.64,35.40,35.32,33.50,31.29,29.88,28.83,28.54,28.48,28.43,27.81,25.73,25.60,23.97,22.18,20.66,19.07,18.78,18.54,10.66。
通过核磁共振氢谱和核磁共振碳谱推测出氢原子和碳原子位置归属,结合质谱信息即确认杂质D17的结构。杂质D17的结构式为:
实施例3硫酸多黏菌素B降解产生杂质D17因素的考察
1、溶液pH的影响
称取2.0g样品,溶于200ml纯水中,搅拌使其溶解,每瓶5ml分装。取未调节pH(pH为6.5)及用氨水调pH分别为8.5、8.8、9.3、9.8、10.3的样品各4瓶。同一pH下的4份分别在33℃降解20min、1h、2h、4h后取样进行高效液相检测。
色谱条件为:Agilent 1260高效液相色谱仪;
色谱柱:Waters symmetry-C18 4.6mm×25cm;
流动相:乙腈∶硫酸钠盐溶液(4.46g/L)=20∶80;
流速:1mL/min;
柱温:30℃;
检测波长:215nm。
统计杂质D17的含量,得到不同pH条件下,降解不同时间后D17的含量,结果如下:
注:pH为9.8时,开始有硫酸多黏菌素B沉淀析出,随着时间延长,析出硫酸多黏菌素B增多。
结果表明,未加氨水调节pH时,样品中杂质D17的含量在4小时内基本无变化;加入氨水后,在pH值9.8以下,随着pH值越大,相同时间内生成杂质D17的含量越多;pH为9.8或以上时,由于硫酸多黏菌素B沉淀不断析出,溶液状态下的硫酸多黏菌素B逐渐减少,降解产生杂质D17越来越缓慢。
2、降解时间的影响
取5瓶分装的样品溶液,用氨水调节pH=9.3,设定温度为33℃。分别在降解0h、4h、8h、24h、42h后取样进行高效液相检测,统计杂质D17的含量,结果如下:
降解时间(h) | 0 | 4 | 8 | 24 | 42 |
杂质D17含量(%) | 1.29 | 4.62 | 5.81 | 8.30 | 8.25 |
结果表明,pH为9.3时,降解24小时后有硫酸多黏菌素B固体析出,随后杂质D17含量上升缓慢,则选取24小时为降解时间。
3、降解温度的影响
取3瓶分装的样品溶液,用氨水调节pH=9.3,设定温度分别为:25℃、33℃、50℃,降解24h后取样进行高效液相检测,统计目标杂质的含量,结果如下:
温度(℃) | 25 | 33 | 50 |
杂质D17含量(%) | 7.14 | 8.31 | 2.40 |
结果表明,33℃条件下硫酸多黏菌素B降解产生的杂质D17含量最高。
综上,在由硫酸多黏菌素B样品制备杂质D17时,加入氨水调节降解条件为pH=9.3,在温度为33℃下降解24h产生杂质D17的含量最高。
实施例4控制杂质D17含量的方法
根据实施案例3,在进行硫酸多黏菌素B提取工艺中的沉淀步骤时,应一次性快速加碱至有硫酸多黏菌素B沉淀析出,硫酸多黏菌素B以固体形式存在可避免杂质D17的快速生成。
实施例5杂质D17作为标准品的应用
取硫酸多黏菌素B粉末适量,精密称定,加稀释液(水∶乙腈=8∶2)制成浓度为0.5mg/ml的溶液,作为供试品溶液;
另取制备得到的杂质D17,精密称定,加上述稀释液制成浓度为0.005mg/ml的溶液,作为对照品溶液;
取对照品溶液10uL,注入液相色谱仪。检测条件同实施例3,记录色谱图;
分别取对照品溶液和供试品溶液各10uL,注入液相色谱仪。检测条件同实施例3,记录色谱图。按外标法计算供试品中杂质D17的含量。
硫酸多黏菌素B供试品为购自Fresenius和X-GEN pharm的硫酸多黏菌素B制剂,分别对其进行检测,结果如下表所示:
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