CN112533590A

CN112533590A - 用于使伤口愈合的药物组合物

Info

Publication number: CN112533590A
Application number: CN201980050585.9A
Authority: CN
Inventors: 元哲喜
Original assignee: Lemonex Inc
Current assignee: Lemonex Inc
Priority date: 2018-07-31
Filing date: 2019-07-31
Publication date: 2021-03-19
Also published as: EP3845218A4; KR20200014704A; EP3845218A1; JP7140431B2; KR102316726B9; JP2021531321A; KR102316726B1

Abstract

本发明涉及能够通过具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加该多肽的活性或表达的物质的高效持续递送以优异的效率治疗伤口的药物组合物。

Description

用于使伤口愈合的药物组合物

技术领域

本发明涉及具有优异的伤口治愈效果的药物组合物。

背景技术

药物递送系统是指可以通过在使现有药物的功效和效果最大化的同时使其副作用最小化来有效地递送所需量的药物例如蛋白、核酸或其它小分子的医药技术。这种能够节约新药的开发所需的成本和时间的技术与纳米技术组合，最近已成为在制药工业创造新的附加值的先进技术之一。特别地，从80年代后期开始，例如美国、日本等技术发达国家的公司尽全力开发药物递送系统以及开发新药。

迄今为止，病毒基因、重组蛋白、脂质体、阳离子聚合物以及各种类型的纳米颗粒和纳米材料已用于将药物递送至动物细胞中。然而，发现很多阳离子脂质体和阳离子聚合物由于它们对细胞的高毒性而不适合于临床应用。此外，已尝试将化学地修饰核酸的主链的方法用于使核酸稳定地穿透细胞膜。然而，这样的方法由于昂贵、费时并且需要劳动密集型工序(labor intensive processes)而不适合于临床应用。作为有意义的尝试，开发了利用包括量子点、磁性颗粒或金纳米颗粒的各种类型的纳米颗粒的药物递送系统(drugdelivery system，DDS)。然而，这些颗粒的缺点在于：它们对细胞有毒性，具有不容易引入例如核酸等生物聚合物的结构，并且还具有低的引入至细胞中的效率。

需要有效的递送系统来研究生物活性物质在体内的功能或者用于细胞内递送。然而，能够递送多种多样的生物活性物质的通用递送系统、能够容纳和递送大量药物的系统和用于以持续的方式释放药物的系统的开发仍然不足。

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供具有优异的伤口治愈效果的药物组合物。

用于解决问题的方案

1.一种用于治疗伤口的药物组合物，其包含：

负载有具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的多孔二氧化硅颗粒，

其中多孔二氧化硅颗粒的特征在于，在下式1中的吸光度比达到1/2时，t为24以上。

[式1]

A_t/A₀

(其中A₀为通过将5ml包含1mg/ml多孔二氧化硅颗粒的悬浮液置于具有孔径为50kDa的孔的圆筒状渗透膜中来测量的多孔二氧化硅颗粒的吸光度，

使15ml与悬浮液相同的溶剂与渗透膜的外部接触，并且在37℃下以60rpm水平地搅拌渗透膜的内部和外部，

悬浮液的pH为7.4，和

A_t表示从测量A_o开始经过“t”小时后测得的多孔二氧化硅颗粒的吸光度)。

2.根据上述1的组合物，其中多孔二氧化硅颗粒通过如下来制备：使具有孔径小于5nm的孔的二氧化硅颗粒与扩张剂在120至180℃下反应24至96小时以使孔径小于5nm的孔扩张；并且将具有扩张的孔的二氧化硅颗粒在400℃以上的温度下煅烧至少3小时。

3.根据上述1的组合物，其中多孔二氧化硅颗粒的平均直径为150至1000nm，BET表面积为200至700m²/g，并且每克的体积为0.7至2.2ml。

4.根据上述1的组合物，其中多肽为乳铁蛋白、上皮生长因子、肝细胞生长因子或血管内皮生长因子。

5.根据上述4的组合物，其中乳铁蛋白由SEQ ID NO：1的序列构成。

6.根据上述4的组合物，其中上皮生长因子由SEQ ID NO：2的序列构成，肝细胞生长因子由SEQ ID NO：3的序列构成，并且血管内皮生长因子由SEQ ID NO：4的序列构成。

7.根据上述1的组合物，其中所述物质为负载有编码SEQ ID NO：1的序列的基因的质粒。

8.根据上述1的组合物，其中多孔二氧化硅颗粒携带具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽，并且在中性pH下、在颗粒的外表面上或孔的内部带负电。

9.根据上述1的组合物，其中多孔二氧化硅颗粒携带负载有编码具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽的基因的质粒，并且在中性pH下、在颗粒的外表面上或孔的内部带正电。

发明的效果

本发明的组合物可以以持续的方式、以高的效率递送具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质，由此以优异的效率治疗伤口。

本发明的组合物可以以持续的方式释放具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质，从而使具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质在体内维持较长时间，由此显示优异的药用效果。

附图说明

图1为根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的显微照片。

图2为根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的显微照片。

图3为在根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的制造过程中获得的小孔颗粒的显微照片。

图4为根据本发明的一个实施方案的小孔颗粒的显微照片。

图5为根据本发明的一个实施方案的各孔径的多孔二氧化硅颗粒的显微照片。可降解的递送载体(Degradable Delivery Vehicle(DDV))为根据实施方案的颗粒，其中括号中的数字意指颗粒的直径并且下标的数字意指孔径。例如，DDV(200)₁₀是指根据实施方案的粒径(particle diameter)(即，粒径(particle size))为200nm且孔径为10nm的颗粒。

图6为鉴定根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的生物降解性的显微照片。

图7为示出根据一个说明性实例的具有圆筒状渗透膜的管的视图。

图8为示出根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果的图。

图9为示出根据本发明的一个实施方案的各粒径的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果的图。

图10为示出根据本发明的一个实施方案的各孔径的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果的图。

图11为示出根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的吸光度针对环境的各pH随时间降低的结果的图。

图12为示出根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果的图。

图13为示出通过根据本发明的一个实施方案的携带乳铁蛋白或编码乳铁蛋白的基因的多孔二氧化硅颗粒来增加VEGF表达的结果的图。

图14为示出根据本发明的一个实施方案的携带乳铁蛋白或编码乳铁蛋白的基因的多孔二氧化硅颗粒的诱导细胞增殖的结果的图。

图15为示出根据本发明的一个实施方案的携带乳铁蛋白或编码乳铁蛋白的基因的多孔二氧化硅颗粒的诱导细胞增殖和血管生成的结果的图。

图16至图19为示出借助根据本发明的一个实施方案的携带乳铁蛋白或编码乳铁蛋白的基因的多孔二氧化硅颗粒的伤口愈合结果的图。

具体实施方式

在本发明的详细描述中，定义了术语的特定含义，然而，术语的特定含义基本上以本领域技术人员所理解的通常含义被接受并且不旨在限于以下定义的特定含义。

根据本发明的用于治疗伤口的药物组合物可以包含负载有具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的多孔二氧化硅颗粒。

可以使用具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽而没有限制，只要其具有上皮细胞或内皮细胞生长促进能力即可，例如，可以为乳铁蛋白和细胞生长因子等，其中细胞生长因子可以具体为上皮细胞生长因子、肝细胞生长因子或血管内皮生长因子，但是不限于此。

具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽可以源自与要给药的对象相同的物种，但是不限于此。此外，甚至可以使用源自其它物种的多肽，只要它们具有取决于序列之间的相似性的相同/相似的功能即可。例如，如果要给药的对象为人类，则乳铁蛋白可以包括源自人类的SEQ ID NO：1的氨基酸序列，并且，具体地，可以由SEQ ID NO：1的序列构成。此外，上皮细胞生长因子可以包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列，肝细胞生长因子可以包括SEQ IDNO：3的氨基酸序列，并且血管内皮生长因子可以包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列，具体地，这些质粒可以分别由上述相应的序列构成。

对用于增加具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽的活性或表达的物质没有限制，只要其可以增加上述活性或表达即可。例如，所述物质可以为携带编码具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽的基因的质粒。

可以使用本领域已知的质粒而没有限制。例如，携带乳铁蛋白基因的质粒可以包括SEQ ID NO：5的核苷酸序列，携带上皮生长因子的质粒可以包括SEQ ID NO：6的核苷酸序列，携带肝细胞生长因子的质粒可以包括SEQ ID NO：7的核苷酸序列，并且携带血管内皮生长因子的质粒可以包括SEQ ID NO：8的核苷酸序列，具体地，这些质粒可以分别由上述相应的序列构成。

要给药的对象可以包括包含人类的所有哺乳动物，并且，特别地，可以为人类，但是不限于此。

在本发明中，术语“伤口”意指组织割伤、撕裂、破裂、烧伤、创伤等，或者指源自造成损伤的病症或疾病的对人体的损伤。伤口可以为具有开放表面的开放性伤口或者不具有开放表面的闭合性伤口。此类伤口的一个实例可以为皮肤中的开放性伤口。开放性伤口可以包括病变、疮(sores)、坏死和溃疡。坏死可能与由感染、损伤或梗塞导致的死亡组织相关。溃疡可以为由坏死组织的脱落造成的器官或组织的表面上的局部缺损或凹陷。

此类伤口的一个实例可以为皮肤的具有受损的表皮、受损的真皮、受损的表皮和真皮或者受损的表皮、真皮和皮下脂肪层的伤口。

此外，上述伤口可以包括例如损伤(injuries)、肥厚性瘢痕、瘢痕瘤、割伤、切口(例如，手术切口)、擦伤、撕裂伤、骨折、挫伤、烧伤或截肢。

损伤治愈或治疗意指抑制皮肤损伤的发展、减少皮肤损伤或除去皮肤损伤。所述损伤具体地包括烧伤、溃疡、外伤、术后伤口、分娩伤口、慢性伤口、或由于皮炎导致的损伤。

本发明的多孔二氧化硅颗粒为基于二氧化硅(SiO₂)材料的颗粒并且具有纳米级的粒径。

本发明的多孔二氧化硅纳米颗粒为多孔颗粒，其各自具有纳米级的孔并且可以在颗粒的表面上和/或孔的内部携带具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质。

本发明的多孔二氧化硅颗粒为可生物降解的颗粒，其携带具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质，并且在对身体给药时可以在体内生物降解的同时释放具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质。具体地，本发明的多孔二氧化硅颗粒可以在体内缓慢地降解，从而以持续的方式释放具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质。例如，在下式1的吸光度比达到1/2时，t为24以上。

[式1]

A_t/A₀

悬浮液的pH为7.4，和

上式1意指多孔二氧化硅颗粒在类似于体内的环境中降解的速率。

如图7中所示，例如，可以在将多孔二氧化硅颗粒和悬浮液置于圆筒状渗透膜中并且还将相同的悬浮液置于渗透膜的外部之后测量上式1中的吸光度A₀和A_t。

本发明的多孔二氧化硅颗粒是可生物降解的，并且可以在悬浮液中缓慢地降解。50kDa的直径相当于约5nm，其允许可生物降解的多孔二氧化硅颗粒通过直径为50kDa的渗透膜，并且以60rpm水平搅拌圆筒状渗透膜以将悬浮液均匀地混合，以使降解的多孔二氧化硅颗粒可以从渗透膜中出来。

可以例如在其中用新的悬浮液替换渗透膜外部的悬浮液的环境下测量上式1中的吸光度。悬浮液可以连续替换或者每周期替换，其中所述周期是定期的或不规律的。例如，可以在1小时至1周的范围内以1小时间隔、2小时间隔、3小时间隔、6小时间隔、12小时间隔、24小时间隔、2天间隔、3天间隔、4天间隔、7天间隔等替换悬浮液，但是不限于此。

吸光度比为1/2意味着在t小时后吸光度为初始吸光度的一半，即，意味着约一半的多孔二氧化硅颗粒被降解。

悬浮液可以是缓冲溶液，例如，选自由磷酸盐缓冲盐水(PBS)和模拟体液(SBF)组成的组中的至少一种，并且更具体地为PBS。

在吸光度比达到1/2时，本发明的上式1中的“t”可以为24以上，例如，t可以为24至120。即，t可以为在上述范围内的24至96、24至72、30至70、40至70、50至65等，但是不限于此。

对于本发明的多孔二氧化硅颗粒，在上式1中的吸光度比达到1/5时，t可以为70至140。例如，t可以为在上述范围内的80至140、80至120、80至110、70至140、70至120、70至110等，但是不限于此。

对于本发明的多孔二氧化硅颗粒，在上式1中的吸光度比达到1/20时，t可以为130至220。例如，t可以为在上述范围内的130至200、140至200、140至180、150至180等，但是不限于此。

对于本发明的多孔二氧化硅颗粒，在上式1中的吸光度比达到0.01以下时，t可以为250以上。例如，t可以为300以上、350以上、400以上、500以上、1000以上等，并且上限可以为2000，但是不限于此。

对于本发明的多孔二氧化硅颗粒，上式1中的吸光度比与t具有高的正相关性。例如，皮尔森相关系数可以为0.8以上，例如0.9以上和0.95以上。

上式1中的“t”意味着多孔二氧化硅颗粒在类似于体内的环境下降解的速度。即，可以通过调整例如表面积、粒径、孔径、在多孔二氧化硅颗粒的表面上和/或孔的内部的取代基、和表面的致密性等来调节t。

例如，可以增加颗粒的表面积来使t减小，或者可以减小表面积来使t增大。可以通过调整颗粒的粒径和孔径来调节表面积。此外，如果通过使取代基处于颗粒的表面上和/或孔的内部来减少多孔二氧化硅颗粒对环境(例如溶剂)的直接暴露，则可以使t增大。此外，当多孔二氧化硅颗粒负载或携带具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质时、和在增加具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质与多孔二氧化硅颗粒之间的亲和性时，可以减少多孔二氧化硅颗粒对环境的直接暴露，从而使t增大。此外，可以通过制备具有更致密的表面的颗粒来使t增大。如上所述，已描述了调整上式1中的t的各种实例，但是不限于此。

本发明的多孔二氧化硅颗粒可以具有球形形状，但是不限于此。

本发明的多孔二氧化硅颗粒的平均直径可以为例如150至1000nm。例如，平均直径可以为在上述范围内的150至800nm、150至500nm、150至400nm、150至300nm、和150至200nm等，但是不限于此。

本发明的多孔二氧化硅颗粒的平均孔径可以为例如1至100nm。例如，平均直径可以为在上述范围内的5至100nm、7至100nm、7至50nm、10至50nm、10至30nm、7至30nm等，但是不限于此。具有如上所述的大直径的多孔二氧化硅颗粒可以携带大量的具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质，或者可以进一步携带大尺寸的具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质。

本发明的多孔二氧化硅颗粒的BET表面积可以为例如200至700m²/g。例如，BET表面积可以为在上述范围内的200至700m²/g、200至650m²/g、250至650m²/g、300至700m²/g、300至650m²/g、300至600m²/g、300至550m²/g、300至500m²/g、300至450m²/g等，但是不限于此。

本发明的多孔二氧化硅纳米颗粒的每克的体积可以为例如0.7至2.2ml。例如，该体积可以为在上述范围内的0.7至2.0ml、0.8至2.2ml、0.8至2.0ml、0.9至2.0ml、1.0至2.0ml等，但是不限于此。如果每克的体积过小，则降解速率可能会过高。此外，难以制造过大的颗粒或具有完整形状的颗粒。

本发明的多孔二氧化硅颗粒可以在其外表面上和/或孔的内部具有亲水性取代基和/或疏水性取代基。例如，仅亲水性取代基或仅疏水性取代基可以存在于颗粒的表面和孔的内部二者中，亲水性取代基或疏水性取代基可以存在于颗粒的表面或孔的内部，或者亲水性取代基可以存在于颗粒的表面上而疏水性取代基可以存在于孔的内部，反之亦然。

负载在根据本发明的多孔二氧化硅颗粒上的具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的释放主要通过纳米颗粒的降解来进行。具体地，调整多孔二氧化硅颗粒与具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的释放环境的相互作用以调节纳米颗粒的降解速率，从而可以调节具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的释放速率。可选地，具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质可以从纳米颗粒中扩散和释放，其中调整取代基可以调节具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质与纳米颗粒的结合力，从而控制具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的释放。

此外，为了增加多孔二氧化硅颗粒与难溶性(疏水性)的具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的结合力，可以使疏水性取代基存在于颗粒的孔内部。此外，在容易使用和配制的方面，还可以对颗粒的表面进行处理以具有亲水性取代基。

亲水性取代基可以包括例如羟基、羧基、氨基、羰基、巯基、磷酸基、硫醇基、铵基、酯基、酰亚胺基、硫代酰亚胺基、酮基、醚基、茚基、磺酰基、和聚乙二醇基等。此外，疏水性取代基可以包括例如取代或未取代的C1至C30烷基、取代或未取代的C3至C30环烷基、取代或未取代的C6至C30芳基、取代或未取代的C2至C30杂芳基、卤素基团、C1至C30酯基、和含卤素基团等。

此外，本发明的多孔二氧化硅颗粒可以在其外表面和/或孔的内部带正电、带负电和/或不带电。例如，颗粒的表面和孔的内部二者均可以带正电或带负电，并且仅颗粒的表面或孔的内部可以带正电或带负电。可选地，颗粒的表面可以带正电而孔的内部可以带负电，反之亦然。具体地，当多孔二氧化硅颗粒携带多肽时，颗粒的外表面和/或孔的内部可以带负电。可选地，当在多孔二氧化硅颗粒上负载有携带编码多肽的基因的质粒时，颗粒的外表面和/或孔的内部可以带正电。

可以例如借助阳离子取代基或阴离子取代基的存在来进行带电。

阳离子物质可以包括例如氨基或任何其它含氮基团。此外，阴离子取代基可以包括例如作为酸性基团的羧基(-COOH)、磺酸基(-SO₃H)、硫醇基(-SH)等，但是不限于此。

同样地，当通过调整取代基借助带电来调节多孔二氧化硅颗粒与具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的释放环境的相互作用时，可以调节纳米颗粒的降解速率以控制具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的释放速率。此外，具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质还可以从纳米颗粒中扩散和释放。在这一点上，调整取代基可以调节具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质与纳米颗粒的结合力，从而控制具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的释放。

此外，本发明的多孔二氧化硅颗粒可以包含取代基用于以下目的：在颗粒的表面上和/或孔的内部负载具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质；递送具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质；负载其它物质用于其它目的；或者结合其它取代基。此外，多孔二氧化硅颗粒还可以包括与其结合的抗体、配体、细胞穿膜肽(cell permeable peptide)或适体。

可以通过例如表面修饰来添加上述在颗粒的表面上和/或孔的内部的取代基、电荷、粘合剂等。

可以例如通过使具有要引入的取代基的化合物与颗粒反应来进行表面修饰，其中该化合物可以为例如具有C1至C10烷氧基的烷氧基硅烷，但是不限于此。烷氧基硅烷具有一个或多个烷氧基，例如，1至3个烷氧基。此外，可以存在要引入至未键合有烷氧基的部位的取代基、或被烷氧基取代的取代基。

本发明的多孔二氧化硅颗粒可以例如通过小孔颗粒制备和孔扩张工序来制造，并且，如果需要，可以进一步通过煅烧或表面修饰工序等来制造。如果实施煅烧和表面修饰工序二者，则可以在煅烧后对颗粒进行表面修饰。

小孔颗粒可以为例如平均孔径为1至5nm的颗粒。

可以通过在溶剂中添加表面活性剂和二氧化硅前体、然后进行搅拌和均匀化来收获小孔颗粒。

溶剂可以为水和/或有机溶剂，并且有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、γ-丁内酯、1,3-二甲基-咪唑啉酮、甲基乙基酮、环己酮、环戊酮、4-羟基-4-甲基-2-戊酮等；芳香族碳系材料，例如苯、甲苯、二甲苯、四甲基苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；二醇醚类(溶纤剂类)，例如乙二醇单乙醚、乙二醇单甲醚、乙二醇单丁醚、二甘醇单乙醚、二甘醇单甲醚、二甘醇单丁醚、丙二醇单甲醚、丙二醇单乙醚、二丙二醇二乙醚、三甘醇单乙醚等；其它，例如二甲基乙酰胺(DMAc)、N,N-二乙基乙酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)、二乙基甲酰胺(DEF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、N,N-二甲基甲氧基乙酰胺、二甲亚砜、吡啶、二甲砜、六甲基膦酰胺、四甲基脲、N-甲基己内酰胺、四氢呋喃、间二噁烷、对二噁烷、和1,2-二甲氧基乙烷等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。

当使用水和有机溶剂的混合溶剂时，水与有机溶剂的相对比可以为例如以体积比计为1:0.7至1.5，例如，1:0.8至1.3，但是不限于此。

表面活性剂可以包括例如鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基三甲基溴化铵(TMABr)、十六烷基三甲基氯化吡啶鎓(TMPrCl)、四甲基氯化铵(TMACl)等，并且具体地，可以使用CTAB。

可以例如以每1升溶剂1至10g例如1至8g、2至8g或3至8g的量添加表面活性剂，但是不限于此。

在将表面活性剂添加至溶剂中的情况下，可以在搅拌后添加二氧化硅前体。二氧化硅前体可以为例如原硅酸四甲酯(TMOS)，但是不限于此。

搅拌可以进行例如10至30分钟，但是不限于此。

可以以每1升溶剂0.5至5ml，例如，在上述范围内的0.5ml至4ml、0.5至3ml、0.5至2ml、1至2ml等的量添加二氧化硅前体，但是不限于此。

如果需要，可以进一步使用氢氧化钠作为催化剂，具体地，可以在向溶剂中添加表面活性剂之后并且在向溶剂中添加二氧化硅前体之前在搅拌下添加。

可以基于1M氢氧化钠水溶液以每1升溶剂0.5至8ml，例如，在上述范围内的0.5至5ml、0.5至4ml、1至4ml、1至3ml、2至3ml等的量添加氢氧化钠，但是不限于此。

在添加二氧化硅前体之后，可以使溶液在搅拌下反应。搅拌可以进行2至15小时，例如，在上述范围内的3至15小时、4至15小时、4至13小时、5至12小时、6至12小时、6至10小时等，但是不限于此。如果搅拌时间(反应时间)过短，则成核(nucleation)可能不充分。

搅拌后，可以使溶液老化。老化可以进行8至24小时，例如，在上述范围内的8至20小时、8至18小时、8至16小时、8至14小时、10至16小时、10至14小时等，但是不限于此。

此后，可以将反应产物清洗并且干燥以收获多孔二氧化硅颗粒，并且，如果需要，可以在清洗前进行未反应的材料的分离。

可以通过例如借助离心将上清液分离来进行未反应的材料的分离。例如，可以以6,000至10,000rpm进行离心，并且离心时间可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。

可以用水和/或有机溶剂进行清洗。具体地，由于不同的物质溶解于不同的溶剂中，因此水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。

有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、γ-丁内酯、1,3-二甲基-咪唑啉酮、甲基乙基酮、环己酮、环戊酮、4-羟基-4-甲基-2-戊酮等；芳香族碳系材料，例如苯、甲苯、二甲苯、四甲基苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；二醇醚类(溶纤剂类)，例如乙二醇单乙醚、乙二醇单甲醚、乙二醇单丁醚、二甘醇单乙醚、二甘醇单甲醚、二甘醇单丁醚、丙二醇单甲醚、丙二醇单乙醚、二丙二醇二乙醚、三甘醇单乙醚等；其它，例如二甲基乙酰胺(DMAc)、N,N-二乙基乙酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)、二乙基甲酰胺(DEF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、N,N-二甲基甲氧基乙酰胺、二甲亚砜、吡啶、二甲砜、六甲基膦酰胺、四甲基脲、N-甲基己内酰胺、四氢呋喃、间二噁烷、对二噁烷、和1,2-二甲氧基乙烷等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。

可以在例如以6,000至10,000rpm进行的离心下进行清洗，并且离心时间可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。

可选地，可以在不离心的情况下通过使颗粒通过过滤器滤出来进行清洗。过滤器可以具有尺寸小于或等于多孔二氧化硅颗粒的直径的孔。当用如上所述的此类过滤器来过滤反应溶液时，只有颗粒保留在过滤器上，所述颗粒可以通过在过滤器上倒水和/或有机溶剂来清洗。

在清洗中，水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。

可以例如在20至100℃下进行干燥，但是不限于此，并且还可以在真空状态下进行干燥。

此后，可以使收获的多孔二氧化硅颗粒的孔扩张，并且此类孔扩张可以使用孔扩张剂来进行。

孔扩张剂可以包括例如三甲基苯、三乙基苯、三丙基苯、三丁基苯、三戊基苯、三己基苯、甲苯、苯等，并且具体地，可以使用三甲基苯，但是不限于此。

此外，本文中使用的孔扩张剂可以为例如N,N-二甲基十六烷基胺(DMHA)，但是不限于此。

可以例如通过使多孔二氧化硅颗粒与孔扩张剂在溶剂中混合并且加热混合物以诱导反应来进行孔扩张。

溶剂可以为水和/或有机溶剂，并且有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、环己酮等；芳香族碳系材料，例如苯、甲苯、二甲苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、和丁醇等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。

可以以每1升溶剂10至200g，例如，在上述范围内的10至150g、10至100g、30至100g、40至100g、50至100g、50至80g、60至80g等的比例添加多孔二氧化硅颗粒，但是不限于此。

可以将多孔二氧化硅颗粒均匀地分散在溶剂中。例如，可以将多孔二氧化硅颗粒添加至溶剂中并且进行超声分散。在使用混合溶剂的情况下，可以将多孔二氧化硅颗粒分散在第一溶剂中，然后向其中添加第二溶剂。

可以以相对于100体积份溶剂为10至200体积份，例如，在上述范围内的10至150体积份、10至100体积份、10至80体积份、30至80体积份、30至70体积份等的比例添加孔扩张剂，但是不限于此。

反应可以在120至190℃，例如，在上述范围内的120至190℃、120至180℃、120至170℃、130至170℃、130至160℃、130至150℃、130至140℃等下进行，但是不限于此。

反应可以进行6至96小时，例如，在上述范围内的30至96小时、30至96小时、30至80小时、30至72小时、24至80小时、24至72小时、36至96小时、36至80小时、36至72小时、36至66小时、36至60小时、48至96小时、48至88小时、48至80小时、48至72小时、6至96小时、7至96小时、8至80小时、9至72小时、9至80小时、6至72小时、9至96小时、10至80小时、10至72小时、12至66小时、13至60小时、14至96小时、15至88小时、16至80小时、17至72小时等，但是不限于此。

可以在以上示例的范围内根据期望调整时间和温度，从而可以使反应充分地进行但不会过度进行。例如，当使反应温度降低时，可以增加反应时间，并且当使反应温度提高时，可以缩短反应时间。如果反应没有充分地进行，则孔扩张可能不充分。另一方面，如果反应过度进行，则颗粒可能会由于孔的过度扩张而塌陷。

反应可以例如通过逐渐升高温度来进行。具体地，可以通过将温度以0.5至15℃/min的速率从室温逐渐升高至以上限定的温度来进行反应。例如，可以使温度以1至15℃/min、3至15℃/min、3至12℃/min、3至10℃/min等的速率升高，但是不限于此。

反应可以在搅拌下进行。例如，可以以100rpm以上的速度，具体地，以100至1000rpm的速度进行搅拌，但是不限于此。

反应后，可以例如通过逐渐降低温度来使反应溶液缓慢地冷却。具体地，可以通过将温度以0.5至20℃/min的速率从以上限定的温度逐渐降低至室温来进行反应。例如，可以使温度以在上述范围内的1至20℃/min、3至20℃/min、3至12℃/min、3至10℃/min等的速率降低，但是不限于此。

冷却后，可以将反应产物清洗并且干燥以收获具有扩张的孔的多孔二氧化硅颗粒。如果需要，可以在清洗前首先分离未反应的材料。

可以通过例如借助离心将上清液分离来进行未反应的材料的分离。本文中，可以例如以6,000至10,000rpm进行离心，并且离心时间可以为3分钟至60分钟。例如，离心可以进行在上述范围内的3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。

可以用水和/或有机溶剂进行清洗。具体地，由于不同的物质溶解于不同的溶剂中，因此水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次、4次、5次、6次、7次、8次等。

有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、环己酮等；芳香族碳系材料，例如苯、甲苯、二甲苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、和丁醇等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。

此后，可以对收获的颗粒进行煅烧，其为加热颗粒以除去存在于颗粒的表面上和孔的内部的硅烷醇基从而降低颗粒的反应性、提供更致密的结构并且除去填充孔的有机物质的工序。例如，可以将颗粒加热至400℃以上的温度。对温度的上限没有特别限制，但是可以为1000℃、900℃、800℃、700℃等。加热可以进行例如3小时以上、或4小时以上。对加热时间的上限没有特别限制，但是可以为24小时、12小时、10小时、8小时、6小时、5小时等。更具体地，加热可以在400至700℃下进行3至8小时或者在500至600℃下进行4至5小时，但是不限于此。

除去填充孔的有机物质可以防止由残留的有机物质导致的细胞毒性或起泡的一些问题。

然后，可以对收获的多孔二氧化硅颗粒进行表面修饰，并且可以在颗粒的表面上和/或孔的内部进行表面修饰。颗粒表面和孔的内部二者可以以相同的方式进行表面修饰，或者可以以不同的方式进行表面修饰。

通过表面修饰可以使颗粒带电或具有亲水性和/或疏水性。

更具体地，为了有效地负载具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽和用于增加其活性或表达的物质，多孔二氧化硅颗粒的表面修饰可以通过具有选自由氨基、氨基烷基、烷基氨基、含有氮原子的杂环芳香族化合物基团、氰基和胍基组成的组中的至少一种取代基来进行。

可以例如通过使具有要引入的亲水性取代基、疏水性取代基、阳离子取代基或阴离子取代基的化合物与颗粒反应来进行表面修饰，其中该化合物可以为例如具有C1至C10烷氧基的烷氧基硅烷，但是不限于此。

烷氧基硅烷具有一个或多个烷氧基，例如，1至3个烷氧基。此外，可以存在要引入至未键合有烷氧基的部位的取代基、或被烷氧基取代的取代基。

当烷氧基硅烷与多孔二氧化硅颗粒反应时，在硅原子和氧原子之间形成共价键以使烷氧基硅烷可以键合至有机硅颗粒的表面和/或孔的内部。由于烷氧基硅烷具有要引入的取代基，因此可以将相应的取代基引入至多孔二氧化硅颗粒的表面和/或孔的内部。

反应可以通过使分散在溶剂中的多孔二氧化硅颗粒与烷氧基硅烷反应来进行。

带正电可以通过使多孔二氧化硅颗粒与具有例如含氮基团(例如，氨基或氨基烷基)等碱性基团的烷氧基硅烷反应来进行。具体地，可以使用N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺、N1-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)二亚乙基三胺、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷、N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]苯胺、三甲氧基[3-(甲基氨基)丙基]硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基二甲氧基甲基硅烷等，但是不限于此。

带负电可以通过使多孔二氧化硅颗粒与具有例如羧基、磺酸基、硫醇基、甲基膦酸酯基团、膦酸酯基团等酸性基团的烷氧基硅烷反应来进行。具体地，可以使用(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，但是不限于此。

可以通过使多孔二氧化硅颗粒与具有亲水性基团例如羟基、羧基、氨基、羰基、巯基、磷酸基、硫醇基、铵基、酯基、酰亚胺基、硫代酰亚胺基、酮基、醚基、茚基、磺酰基、和聚乙二醇基等的烷氧基硅烷反应来获得亲水性。具体地，可以使用N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺、N1-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)二亚乙基三胺、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷、(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷、三甲氧基[3-(甲基氨基)丙基]硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基二甲氧基甲基硅烷，但是不限于此。

可以通过使多孔二氧化硅颗粒与具有疏水性取代基例如取代或未取代的C1至C30烷基、取代或未取代的C3至C30环烷基、取代或未取代的C6至C30芳基、取代或未取代的C2至C30杂芳基、卤素基团、C1至C30酯基、和含卤素基团等的烷氧基硅烷反应来获得疏水性。具体地，可以使用三甲氧基(十八烷基)硅烷、三甲氧基正辛基硅烷、三甲氧基(丙基)硅烷、异丁基(三甲氧基)硅烷、三甲氧基(7-辛烯-1-基)硅烷、三甲氧基(3,3,3-三氟丙基)硅烷、三甲氧基(2-苯基乙基)硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、氰基甲基、3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]三硫代碳酸酯、(3-溴丙基)三甲氧基硅烷等，但是不限于此。

此外，为了通过表面修饰来增加多孔二氧化硅颗粒与难溶性(疏水性)的具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的结合力，可以使疏水性取代基存在于颗粒的孔内部。此外，在容易使用和配制的方面，还可以对颗粒的表面进行处理以具有亲水性取代基。此外，在颗粒的表面上可以存在取代基，从而结合另一具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质。

此外，表面修饰可以组合进行。例如，可以在颗粒的外表面上或孔的内部进行表面修饰两次以上。作为具体实例，可以使含有羧基的化合物通过酰胺键结合至其中引入有氨基的二氧化硅颗粒，从而改变带正电的颗粒以具有不同的表面性质，但是不限于此。

多孔二氧化硅颗粒与烷氧基硅烷的反应可以例如在加热下进行。加热可以在80至180℃，例如，在上述范围内的80至160℃、80至150℃、100至160℃、100至150℃、110至150℃等下进行，但是不限于此。

多孔二氧化硅颗粒与烷氧基硅烷的反应可以进行4至20小时，例如，在上述范围内的4至18小时、4至16小时、6至18小时、6至16小时、8至18小时、8至16小时、8至14小时、10至14小时等，但是不限于此。

可以根据表面修饰的程度根据期望来选择反应温度、时间和用于表面修饰的化合物的量。换言之，反应条件将取决于具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的亲水性、疏水性和电荷水平而变化。具体地，通过控制多孔二氧化硅颗粒的亲水性、疏水性和电荷水平，可以控制具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的释放速率。例如，如果具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质在中性pH下具有强的负电荷，则可以提高反应温度、可以延长反应时间或者可以增加所处理的化合物的量，从而使多孔二氧化硅颗粒具有强的正电荷，但是不限于此。

此外，本发明的多孔二氧化硅颗粒可以通过例如小孔颗粒的制备、孔扩张、表面修饰和孔内部修饰来制造。

小孔颗粒的制备和孔扩张可以通过上述工序来进行，并且，在小孔颗粒的制备之后和孔扩张之后，可以进行清洗工序和干燥工序。

如果需要，可以在清洗之前将未反应的材料分离，并且可以通过借助离心将上清液分离来进行未反应的材料的分离。

可以以6,000至10,000rpm进行离心，并且离心时间可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。

小孔颗粒的制备之后的清洗可以通过在上述范围内的方法/条件来进行，但是不限于此。

孔扩张之后的清洗可以在比上述实施方案更宽松的条件下进行。例如，清洗可以进行三次以下，但是不限于此。

表面修饰和孔内部修饰可以分别通过上述工序来进行。本文中，表面修饰和随后的孔内部修饰可以按该顺序进行，并且可以在上述两个工序之间进一步进行清洗工序。

当在小孔颗粒的制备和孔扩张之后在更宽松的条件下进行清洗时，例如用于颗粒制备和孔扩张的表面活性剂等反应溶液填充在孔中，以使在表面修饰期间不会使孔的内部被修饰，而是仅可以修饰颗粒的表面。此后，可以将在孔的内部的反应溶液洗去并除去。

表面修饰工序与孔内部修饰工序之间的颗粒清洗可以使用水和/或有机溶剂来进行。具体地，由于不同的物质溶解于不同的溶剂中，因此水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。

可以使具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质负载在多孔二氧化硅颗粒的表面上和/或孔的内部。本文中，可以例如通过将多孔二氧化硅颗粒与具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质在溶剂中混合来进行负载。

溶剂可以为水和/或有机溶剂，并且溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、环己酮等；芳香族碳系材料，例如苯、甲苯、二甲苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、和丁醇等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。

此外，可以使用PBS(磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate buffered salinesolution))、SBF(模拟体液(simulated body fluid))、硼酸盐缓冲盐水、tris缓冲盐水作为溶剂。

负载在多孔二氧化硅颗粒上的具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质可以在延长的时间内逐渐释放。此类持续释放可以是连续或不连续的、或者线性或非线性的。此外，该释放可以取决于多孔二氧化硅颗粒的特性和/或多孔二氧化硅颗粒与具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质之间的相互作用而变化。

负载在多孔二氧化硅颗粒上的具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质随着多孔二氧化硅颗粒被生物降解而释放。具体地，使根据本发明的多孔二氧化硅颗粒缓慢地降解从而使得以持续的方式释放具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质。此类释放可以通过例如调整多孔二氧化硅颗粒的表面积、粒径、孔径、在颗粒的表面上和/或孔的内部的取代基、表面致密性等来控制，但是不限于此。

负载在多孔二氧化硅颗粒上的具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质可以在从多孔二氧化硅颗粒分离并且扩散的同时释放。由于释放受到多孔二氧化硅颗粒、具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质及其释放环境之间的相关性的影响，因此，调节该相关性可以控制具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的释放。例如，通过借助表面修饰来增强或减弱多孔二氧化硅颗粒与具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的结合力，可以控制具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的释放。

更具体地，在所负载的具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质难溶(疏水)的情况下，颗粒的表面和/或孔的内部具有疏水性取代基，从而增加多孔二氧化硅颗粒与具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的结合力，由此可以以持续的方式释放具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质。例如，可以用具有疏水性取代基的烷氧基硅烷对多孔二氧化硅颗粒进行表面修饰。

如本文中所使用的，术语“难溶性”意指不溶、几乎不溶或仅微溶(在水中)，其为“Pharmaceutical Science”第18版(由U.S.P.、Remington和Mack Publishing Company发行)中定义的词语。

难溶性物质在1个大气压和25℃下可以具有例如小于10g/L、具体地小于5g/L、并且更具体地小于1g/L的水溶解度，但是不限于此。

当所负载的具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质是水溶性的(亲水性的)时，颗粒的表面和/或孔的内部具有亲水性取代基，从而增加多孔二氧化硅颗粒与具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的结合力，由此可以以持续的方式释放具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质。例如，可以用具有亲水性取代基的烷氧基硅烷对多孔二氧化硅颗粒进行表面修饰。

例如，水溶性物质在1个大气压和25℃下可以具有10g/L以上的水溶解度，但是不限于此。

在所负载的具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质带电的情况下，颗粒的表面和/或孔的内部带有相反的电荷，从而增加多孔二氧化硅颗粒与具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的结合力，由此可以以持续的方式释放具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质。例如，可以用具有酸性基团或碱性基团的烷氧基硅烷对多孔二氧化硅颗粒进行表面修饰。

具体地，如果具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质在中性pH下带正电，则颗粒的表面和/或孔的内部可以在中性pH下带负电，从而增加多孔二氧化硅颗粒与具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的结合力，由此可以以持续的方式释放具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质。例如，可以用具有例如羧基(-COOH)、磺酸基(-SO₃H)等酸性基团的烷氧基硅烷对多孔二氧化硅颗粒进行表面修饰。

此外，如果具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质在中性pH下带负电，则颗粒的表面和/或孔的内部可以带正电，从而增加多孔二氧化硅颗粒与具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的结合力，由此可以以持续的方式释放具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质。例如，可以用具有例如氨基或任何其它含氮基团的碱性基团的烷氧基硅烷对多孔二氧化硅颗粒进行表面修饰。

具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质可以释放例如7天至1年以上的时间，这取决于所需处理的类型、释放环境和要使用的多孔二氧化硅颗粒的类型。

此外，由于本发明的多孔二氧化硅颗粒是可生物降解的并且可以100％降解，因此所负载的具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质可以100％释放。

本发明的组合物具有可以在体内稳定地递送负载在多孔二氧化硅颗粒上的具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质并且可以以持续的方式将其释放至靶点、从而促进例如血管内皮生长因子(VEGF)等因子的表达的伤口治愈效果。

本发明的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体，并且可以与此类载体一起配制。如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体”是指不刺激生物体并且不抑制所给予的化合物的生物学活性和性质的载体或稀释剂。在配制为液体溶液的组合物中可接受的药用载体是无菌的并且生物相容的，并且可以包括盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射液、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、和这些组分中的一种或多种的混合物。此外，如果需要，可以添加其它通常的添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。还可以添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，以将药物组合物配制成可注射制剂例如水溶液剂、混悬剂和乳剂等，丸剂，胶囊剂，颗粒剂或片剂。

本发明的组合物可以任意剂型来应用并且可以以口服制剂或肠胃外制剂来制备。本发明的药物制剂可以包括适合于口服给药、直肠给药、经鼻给药、局部(包括脸颊和舌下)给药、皮下给药、阴道给药或肠胃外(包括肌内、皮下静脉内)给药的形式。可选地，还可以包括适合于通过吸入或吹入来给药的形式。

本发明的药物组合物以药学有效量来给药。可以取决于患者的疾病类型、严重程度、药物的活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径和释放速率、治疗持续时间、包括同时存在的药物的因素、和在医学领域众所周知的其它因素来确定有效剂量水平。本发明的药物组合物可以作为单独的治疗剂或与其它治疗剂组合来给药，可以与常规治疗剂顺序或同时给药，并且可以以单剂量或多剂量给药。考虑到所有上述因素，重要的是以可以以最小量达到最大效果而没有副作用的量来给予药物组合物，这可以由本领域技术人员容易地确定。

根据本发明的药物组合物的剂量可以取决于患者的体重、年龄、性别、健康状况或饮食、给药时间、给药方法、排泄率和疾病的严重程度而有很大变化，并且合适的剂量取决于例如蓄积在患者体内的药物量和/或所使用的本发明的递送系统的特定功效而变化。通常，可以基于在体内动物模型中和体外通常确定为有效的EC50来计算所述量，例如，每kg体重0.01μg至1g。此外，本发明的药物组合物可以在例如每天、每周、每月或每年等单位时间周期期间每单位时间给药一次或数次，或者可以使用输液泵长时间连续给药。考虑到药物在体内的保留时间、体内的药物浓度等来确定重复给药的次数。根据疾病治疗的过程，即使在治疗后也可以进一步给予组合物以防止复发(recurrence)。

本发明的药物组合物可以进一步包含如下化合物：所述化合物保持/增加显示相同或相似的与伤口的治疗相关的功能的一种或多种活性成分、或者保持/增加至少一种活性成分的溶解度和/或吸收。此外，组合物还可以任选地包含化学治疗剂、抗炎剂、抗病毒剂和/或免疫调节剂等。

此外，可以使用本领域已知的任何方法来配制本发明的药物组合物，以允许在对哺乳动物给药后活性成分的快速释放、持续释放或延迟释放。可以以散剂、颗粒剂、片剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂、软或硬明胶胶囊剂、无菌注射液、无菌粉末的形式来生产制剂。

本发明还涉及伤口治疗方法。

本发明的伤口治疗方法包括给予负载有具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的多孔二氧化硅颗粒。

上述具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质可以在上述范围内。

多孔二氧化硅颗粒可以在以上示例的范围内或者可以根据在以上示例的范围内的方法/条件来制备。

对象可以为包括人类的哺乳动物、特别是人类。

具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质可以根据在上述范围内的方法以组合物形式配制。

给药方法不受限制并且可以包括例如口服给药、直肠给药、经鼻给药、局部(包括脸颊和舌下)给药、皮下给药、阴道给药或肠胃外(包括肌内、皮下和静脉内)给药、或者通过吸入或吹入来给药。

此外，本发明涉及负载有具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的多孔二氧化硅颗粒在制造用于治疗伤口的药物组合物中的用途。

下文中，将参考以下实施例详细地描述本发明。下文中，本发明的多孔二氧化硅颗粒可以缩写为‘DegradaBALL或DDV’。

实验方法

实施例1.多孔二氧化硅颗粒(DDV或DegradaBALL)

1.多孔二氧化硅颗粒的制备

(1)多孔二氧化硅颗粒的制备

1)小孔颗粒的制备

将960ml蒸馏水(DW)和810ml MeOH置于2L圆底烧瓶中。将7.88g CTAB添加至烧瓶中，然后在搅拌下快速添加4.52ml 1M NaOH。在搅拌10分钟的同时添加均匀的混合物之后，进一步添加2.6ml TMOS。在搅拌6小时以均匀地混合之后，将反应溶液老化24小时。

然后，将反应溶液在8000rpm和25℃下离心10分钟以除去上清液，在8000rpm和25℃下离心10分钟，并且用乙醇和蒸馏水交替清洗五次。

此后，将所得产物在70℃的烘箱中干燥以收获1.5g粉末状小孔多孔二氧化硅颗粒(孔平均直径为2nm并且粒径为200nm)。

2)孔扩张

将1.5g小孔多孔二氧化硅颗粒粉末添加至10ml乙醇中并且进行超声分散，并且进一步添加10ml水和10ml TMB(三甲基苯)，然后进行超声分散。

此后，将分散液置于高压釜中，并且在160℃下反应48小时。

在高压釜中，反应在25℃下开始并且在使温度以10℃/min的速率升高的同时进行，然后以1至10℃/min的速率缓慢地冷却。

将冷却的反应溶液在25℃下以8000rpm离心10分钟以除去上清液，在25℃下以8000rpm离心10分钟，并且用乙醇和蒸馏水交替清洗五次。

然后，将产物在70℃的烘箱中干燥以收获粉末状多孔二氧化硅颗粒(孔径为10至15nm，并且粒径为200nm)。

3)煅烧

将在2)中制备的多孔二氧化硅颗粒放入玻璃小瓶中，在550℃下加热5小时，并且在反应完成之后缓慢地冷却至室温以制备颗粒。

(2)多孔二氧化硅颗粒的制备

除了将孔扩张时的反应条件改变为140℃和72小时以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。

(3)多孔二氧化硅颗粒的制备(10L规模)

除了使用大5倍的容器并且每种物质以5倍容量使用以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。

(4)多孔二氧化硅颗粒(粒径为300nm)的制备

除了使用920ml蒸馏水和850ml甲醇来制备小孔颗粒以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。

(5)多孔二氧化硅颗粒(粒径为500nm)的制备

除了使用800ml蒸馏水、1010ml甲醇和10.6g CTAB来制备小孔颗粒以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。

(6)多孔二氧化硅颗粒(粒径为1000nm)的制备

除了使用620ml蒸馏水、1380ml甲醇和7.88g CTAB来制备小孔颗粒以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。

(7)多孔二氧化硅颗粒(孔径为4nm)的制备

除了使用2.5ml TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。

(8)多孔二氧化硅颗粒(孔径为7nm)的制备

除了使用4.5ml TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。

(9)多孔二氧化硅颗粒(孔径为17nm)的制备

除了使用11ml TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。

(10)多孔二氧化硅颗粒(孔径为23nm)的制备

除了使用12.5ml TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。

(11)多孔二氧化硅颗粒的制备(双重修饰)

1)小孔颗粒的制备

通过与实施例1-1-(1)-1)相同的方法来制备小孔颗粒。

2)孔扩张

通过与实施例1-1-(1)-2)相同的方法，使小孔颗粒与TMB反应、冷却并且离心以除去上清液。此后，将剩余的溶液在与实施例1-1-(1)-2)相同的条件下离心，用乙醇和蒸馏水交替清洗三次，然后在与实施例1-1-(1)-2)相同的条件下干燥，由此收获粉末状多孔二氧化硅颗粒(孔径为10至15nm，并且粒径为200nm)。

3)表面修饰

在将0.8g至1g具有扩张的孔的多孔二氧化硅颗粒分散在50ml甲苯中之后，将5ml(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷添加至其中，然后在120℃下回流加热12小时。该过程之后是上述清洗和干燥过程，然后将1ml三甘醇(PEG3，2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸)、100mgEDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)和200mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分散在30ml PBS中并且使其在搅拌下在室温下反应12小时。然后将产物进行清洗和干燥。

由于前一步骤的反应溶液保留在孔的内部，因此孔的内部未被修饰。

4)清洗孔内部

将800mg表面修饰的颗粒粉末溶解于40ml 2M HCl/乙醇中并且在剧烈搅拌下回流12小时。

此后，将冷却的反应溶液以8000rpm离心10分钟以除去上清液，在8000rpm和25℃下离心10分钟，并且用乙醇和蒸馏水交替清洗五次。

此后，将产物在70℃的烘箱中干燥，由此收获粉末状多孔二氧化硅颗粒。

5)修饰孔内部

①通过与下述实施例1-2-(2)-1)相同的方法将丙基引入至孔中。

②通过与下述实施例1-2-(2)-2)相同的方法将辛基引入至孔中。

2.多孔二氧化硅颗粒的表面修饰

(1)带正电

1)粒径为300nm的颗粒

使实施例1-1-(4)的多孔二氧化硅颗粒与(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反应，以使其带正电。

具体地，用浴超声仪(bath sonicator)将100mg多孔二氧化硅颗粒分散在100ml圆底烧瓶中的10ml甲苯中。然后，添加1ml APTES并且在400rpm和130℃下搅拌12小时。

反应后，将产物缓慢地冷却至室温并且以8000rpm离心10分钟以除去上清液，进一步在8000rpm和25℃下离心10分钟，然后用乙醇和蒸馏水交替清洗五次。

此后，将产物在70℃的烘箱中干燥以收获在颗粒的表面上和孔的内部具有氨基的粉末状多孔二氧化硅颗粒。

2)粒径为200nm的颗粒

①通过使实施例1-1-(1)的多孔二氧化硅颗粒与(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反应来使颗粒带正电，并且除了添加0.4ml APTES和反应时间为3小时以外，以与实施例1-2-(1)-1)的方法相同的方式来修饰。

②通过使实施例1-1-(9)的多孔二氧化硅颗粒与(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反应来使颗粒带正电，并且以与实施例1-2-(1)-1)的方法相同的方式来修饰。

③通过使实施例1-1-(10)的多孔二氧化硅颗粒与(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反应来使颗粒带正电，并且以与实施例1-2-(1)-1)的方法相同的方式来修饰。

(2)疏水基团的引入

1)丙基

使实施例1-1-(1)的多孔二氧化硅颗粒与三甲氧基(丙基)硅烷反应以将丙基引入至颗粒的表面和孔的内部，并且除了添加0.35ml三甲氧基(丙基)硅烷来代替APTES、然后进行反应12小时以外，通过与实施例1-2-(1)相同的方法进行修饰。

2)辛基

使实施例1-1-(1)的多孔二氧化硅颗粒与三甲氧基正辛基硅烷反应以将丙基引入至颗粒的表面和孔的内部，并且除了添加0.5ml三甲氧基正辛基硅烷来代替APTES、然后进行反应12小时以外，通过与实施例1-2-(1)相同的方法进行修饰。

(3)带负电

1)羧基

通过使实施例1-1-(1)的多孔二氧化硅颗粒与琥珀酸酐(succinic anhydride)反应来使颗粒带负电。此外，除了使用DMSO(二甲亚砜)来代替甲苯、添加80mg琥珀酸酐来代替APTES以使反应在搅拌下在室温下进行24小时、和在清洗时使用DMSO来代替蒸馏水以外，以与实施例1-2-(1)-1)的方法相同的方式对带电荷的颗粒进行修饰。

2)硫醇基

除了使用1.1ml MPTES来代替APTES以外，以与实施例1-2-(1)-1)的方法相同的方式对颗粒进行修饰。

3)磺酸基

将100mg实施例1-2-(3)-2)的多孔二氧化硅纳米颗粒分散在1ml 1M硫酸水溶液和20ml 30％过氧化氢溶液中，并且在室温下搅拌以引发氧化反应，从而将硫醇基氧化为磺酸基。此后，以与实施例1-2-(1)-1)的方法相同的方式将产物进行清洗和干燥。

4)甲基膦酸酯基团

除了使用3ml THMP来代替APTES、使用10ml蒸馏水来代替甲苯并且添加1.5ml盐酸溶液以外，以与实施例1-2-(1)-1)的方法相同的方式对颗粒进行修饰。

3.颗粒形成和孔扩张的鉴定

在显微镜下观察在实施例1-1-(1)至(3)中制备的小孔颗粒和多孔二氧化硅颗粒，以确定小孔颗粒是否均匀形成或者孔是否充分扩张以均匀地形成多孔二氧化硅颗粒(图1至4)。

图1为实施例1-1-(1)中的多孔二氧化硅颗粒的照片，并且图2为实施例1-1-(2)中的多孔二氧化硅颗粒的照片，并且从这些图可以看出，均匀地形成了具有充分扩张的孔的球形多孔二氧化硅颗粒。

图3为实施例1-1-(1)中的小孔颗粒的照片，并且图4为实施例1-1-(1)和1-1-(3)的小孔颗粒的比较照片，并且从这些图可以看出，均匀地形成了球形小孔颗粒。

4.BET表面积和孔体积的计算

计算实施例1-1-(1)中的小孔颗粒和实施例1-1-(1)、(7)、(8)和(10)的多孔二氧化硅颗粒的表面积和孔体积。通过Brunauer-Emmett-Teller(BET)法来计算表面积，并且通过Barrett-Joyner-Halenda(BJH)法来计算孔径分布。

各颗粒的显微照片在图5中示出，并且计算结果在下表1中示出。

[表1]

5.生物降解性的鉴定

为了鉴定实施例1-1-(1)中的多孔二氧化硅颗粒的生物降解性，在0小时、120小时和360小时在显微镜下观察在37℃下在SBF(pH 7.4)中的生物降解性，并且其结果在图6中示出。

参照图6，可以看出多孔二氧化硅颗粒被生物降解并且在360小时之后几乎完全降解。

6.吸光度比的测量

根据下式1来测量随时间推移的吸光度比。

[式1]

A_t/A₀

使15ml与悬浮液相同的溶剂与渗透膜的外部接触，并且在60rpm和37℃下水平地搅拌渗透膜的内部和外部，并且

具体地，将5mg多孔二氧化硅颗粒粉末溶解于5ml SBF(pH 7.4)中。此后，将5ml多孔二氧化硅颗粒溶液置于图7中示出的具有孔径为50kDa的孔的渗透膜中。将15ml SBF添加至外膜，并且每12小时更换外膜的SBF。多孔二氧化硅颗粒的降解在37℃下、在60rpm的水平搅拌下来进行。

然后，吸光度通过UV-可见光谱法来测量并且在λ＝640nm处分析。

(1)吸光度比的测量

根据上述方法来测量实施例1-1-(1)中的多孔二氧化硅颗粒的吸光度比，并且其结果在图8中示出。

参照图8，可以看出，在吸光度比达到1/2时，t为约58小时，以证明非常缓慢的降解。

(2)粒径

根据上式1来测量实施例1-1-(1)、(5)和(6)中的多孔二氧化硅颗粒的吸光度，并且其结果在图9中示出(SBF用作悬浮液和溶剂)。

参照图9，可以看出t随着粒径的增加而降低。

(3)平均孔径

根据上式1来测量实施例1-1-(1)和(9)中的多孔二氧化硅颗粒以及作为对照的实施例1-1-(1)中的小孔多孔二氧化硅颗粒的吸光度，并且其结果在图10中示出(SBF用作悬浮液和溶剂)。

参照图10，可以看出，本发明实施例的多孔二氧化硅颗粒具有比对照显著更大的t。

(4)pH

测量实施例1-1-(4)中的多孔二氧化硅颗粒针对各pH的吸光度。在pH 2、5和7.4下在SBF和Tris中测量吸光度，并且其结果在图11中示出。

参照图11，可以看出，虽然针对pH，t存在差异，但是在所有吸光度比达到1/2时，t为24以上。

(5)带电

测量实施例1-2-(1)-1)中的多孔二氧化硅颗粒的吸光度，并且其结果在图12中示出(Tris(pH 7.4)用作悬浮液和溶剂)。

参照图12，可以看出，在带正电的颗粒的吸光度比达到1/2时，t为24以上。

7.具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加其活性或表达的物质的负载

(1)作为乳铁蛋白，使用由SEQ ID NO：1的序列构成的蛋白。作为颗粒，使用在表面上引入有甲基膦酸酯基团的实施例1-2-(3)-4)的颗粒。

将40μg多孔二氧化硅颗粒粉末和4μg蛋白在200μl 1×PBS中混合，然后在室温下温育1小时。将与上述相同的颗粒用于携带下述乳铁蛋白。

(2)对于质粒DNA，从pCMV载体扩增启动子部分以制备KanaR2-ColE1-CMV启动子部分。通过PCR从人cDNA文库扩增LTF编码部分，由此制备长度为约3kb的LTF ORF(pLEM-hLTF-101，SEQ ID NO：2)。

作为颗粒，使用在颗粒的表面上和孔的内部引入有氨基的实施例1-2-(1)-1)的颗粒。

在将10μg多孔二氧化硅颗粒和0.25μg LTF ORF在1×PBS条件下混合之后，在室温下加载(load)混合物30分钟。将与上述相同的颗粒用于携带下述乳铁蛋白质粒。

实施例2.伤口治愈效果的鉴定

(1)VEGF mRNA表达水平的评价

1)乳铁蛋白的使用

在将C2C12细胞以5.0×10⁴个细胞接种在12孔板中之后，将细胞温育24小时。然后，在无血清培养基中进行预饥饿处理(pre-starvation treatment)12小时。在更换含有0.1％FBS的培养基之后，用200μg/mL LTF蛋白来处理细胞。根据时间(0、1、2、3、6、12、24、48小时)，对细胞进行trizol处理以提取mRNA，并且通过PCR来确认VEGF mRNA表达水平。

2)携带乳铁蛋白质粒的颗粒的使用

在将C2C12细胞以5.0×10⁴个细胞接种在12孔板中之后，将细胞温育24小时。然后，在无血清培养基中进行预饥饿处理12小时。使用通过在20μg DDV上负载1μg LTF质粒DNA来制备的LTF pDNA@DDV复合物在无血清条件下处理细胞4小时。

然后，将细胞用1×PBS清洗两次，用含有0.1％FBS的培养基来替换培养基，按时间顺序(0、4、8、12、24和48小时)对细胞进行trizol处理以提取mRNA，并且通过PCR来确认LTF和VEGF mRNA表达水平。

结果，当用重组LTF(rLTF、乳铁蛋白)处理C2C12细胞系时，在6小时内以高水平诱导VEGF mRNA的表达水平，但是此后，VEGF mRNA的表达水平逐渐降低。

然而，当将负载在DDV上的LTF质粒DNA(pLTF)转染至C2C12细胞系中时，VEGF mRNA的表达在4小时后增加，并且即使在48小时后也持续以高水平诱导VEGF mRNA的表达(图13)。

(2)细胞增殖诱导效果的评价

在将HEK-293T细胞以5.0×10⁴个细胞接种在12孔板中之后，将细胞温育24小时。将1.0μg LTF pDNA添加至20.0μg DDV中以制备LTF pDNA@DDV复合物，然后在无血清条件下将细胞用该复合物处理4小时(模拟物(mock)仅用1.0μg LTF pDNA来处理)。在将细胞用1×PBS清洗一次之后，用含有1％FBS的培养基来替换培养基，并且将细胞温育48小时。48小时后，回收其中培养有HEK-294T细胞的培养基。

在将HT-1080细胞以2.0×10³个细胞接种在96孔板中之后，将细胞温育24小时。然后，在无血清培养基进行预饥饿处理12小时。将细胞分别用无血清培养基、10％FBS培养基、1％FBS培养基+从模拟物HEK-294T细胞(Mock HEK-294T cell)回收的培养基、1％FBS培养基+从用50％LTE pDNA DDV处理的HEK-293T细胞回收的培养基、和从用25％LTF pDNA DDV处理的HEK-293T细胞回收的培养基来处理。

为了确定和比较24、48、72和96小时后的细胞增殖，将细胞用10％CCK-8溶液处理并且温育1小时。此后，通过在450nm的波长处的吸光度来对细胞进行比较。

结果，HT-1080细胞系的增殖率在具有1％FBS的培养物中非常低，但是具有条件培养基的HT-1080细胞系显示以与具有10％FBS的培养液相似的形式诱导细胞增殖(图14)。

图14从左侧起依次示出在24、48、72和96小时的柱状图。

(3)细胞增殖诱导效果和血管生成诱导的评价

(1)HT-1080细胞

通过用负载在DDV上的乳铁蛋白处理HT-1080细胞来确定细胞的细胞增殖程度。

在将HT-1080细胞以3.0×10³个细胞接种在96孔板中之后，将细胞温育24小时。在将细胞用1×PBS清洗一次之后，将细胞分别用无FBS培养基、10％FBS培养基、1％FBS+携带乳铁蛋白(0、12.5、25、50、100、200、400μg/mL)的DDV、和无FBS培养基+携带乳铁蛋白(0、12.5、25、50、100、200、400μg/mL)的DDV，然后温育48小时。48小时后，将细胞用1×PBS清洗一次，用10％CCK-8溶液处理，然后温育1小时。此后，在450nm处确认吸光度以确定细胞增殖的程度。

(2)PAM-212细胞

使用负载在DDV上的重组LTF蛋白来处理PAM-212细胞以确定细胞增殖的程度。

在将PAM-212细胞以2.0×10³个细胞接种在96孔板中之后，将细胞温育24小时。将细胞用1×PBS清洗一次，然后分别用无FBS培养基、10％FBS、1％FBS+乳铁蛋白(100μg/mL)、1％FBS+携带乳铁蛋白(100μg/mL)的DDV和1％FBS处理。在48小时和96小时分别将细胞用1×PBS清洗一次，然后用10％CCK-8溶液处理。此后，将细胞温育1小时。然后，在450nm波长处确认吸光度以确定细胞增殖的程度。

(3)HUVEC细胞

使用负载在DDV上的VEGF蛋白和乳铁蛋白来处理HUVEC细胞以确定将细胞诱导成血管形状的效果。

在将HUVEC细胞以1.5×10⁴个细胞接种在96孔板中之后，将细胞分别用载体、携带VEGF蛋白(40ng/ml)的DDV(与携带乳铁蛋白的颗粒相同的颗粒)、和携带乳铁蛋白(20μg/mL)的DDV处理，然后温育4小时。4小时后，在显微镜下确认将细胞诱导成例如血管形状等网状组织的程度。

结果，确认到，当将乳铁蛋白负载在DDV上并且进行递送时，细胞增殖效果是优异的(图15)。

(4)损伤愈合效果的鉴定

1)损伤愈合动物模型(injury healing animal model)的制备

在将每只实验动物(啮齿类，C57BL/6)的背部剃毛之后，借助活检穿孔器(直径为5mm)来使动物受伤。

然后，将制备的组合物(50μl)注射至损伤病变周围的皮肤，并且用圆形硅树脂覆盖物(外径：30mm，内径：5mm)来使伤口闭合并且用手术线缝合，以用于观察和管理。为了防止伤口感染，将Tegaderm膜粘贴到伤口上并且用压力绷带来包扎伤口。

2)效果的鉴定

①对于被诱发损伤(injury-induced)的实验动物，分别将1×PBS、携带乳铁蛋白的DDV(500μg)、LTF pDNA(25μg)、DDV(500μg)、和携带LTF pDNA(25μg)的DDV注射至损伤病变周围的皮肤。每2天观察伤口一次，并且监控伤口修复程度。

在携带乳铁蛋白的DDV的情况下，使损伤愈合效果增强。具体地，携带pLTF的DDV显示最优异的损伤愈合效果(图16)。

②对于被诱发损伤的实验动物，分别将1×PBS、携带乳铁蛋白的DDV(500μg)、LTFpDNA(25μg)、DDV(500μg)、携带LTF pDNA(25μg)的DDV、携带EGF pDNA(25μg)的DDV、和携带HGF pDNA(25μg)的DDV注射至损伤病变周围的皮肤。每2天观察各伤口一次，并且监控伤口修复程度。使用图像分析程序(Image J)根据(成像当天损伤的尺寸/初始损伤的尺寸)×100(％)来比较伤口修复程度。

在携带乳铁蛋白的DDV的情况下，使损伤愈合效果增强。具体地，携带pLTF的DDV显示最优异的损伤愈合效果(图17)。

③对于被诱发损伤的实验动物，将1×PBS和携带乳铁蛋白的DDV(1mg)注射至损伤病变周围的皮肤。每2天观察伤口一次，并且监控伤口修复程度。使用图像分析程序(ImageJ)根据(成像当天损伤的尺寸/初始损伤的尺寸)×100(％)来比较损伤修复程度。

在携带乳铁蛋白的DDV的情况下，使损伤愈合效果增强(图18)。

④组织病理学检查

在损伤愈合动物模型的病变部位周围皮内注射携带乳铁蛋白或乳铁蛋白pDNA的DDV，并且，在14天之后，通过组织病理学检查来监控损伤愈合效果的增强。

在使实验动物安乐死之后，在损伤部位收集皮肤并且将组织用4％PFA来固定。将组织制成冷冻块(frozen block)，切片至厚度为7mm，染色，并且置于载玻片上以用于在显微镜下观察。

结果，在携带乳铁蛋白或pDNA的DDV的情况下，使损伤愈合效果增强，并且，特别是携带pDNA的DDV显示优异的效果(图19)。

<110> 雷莫内克斯生物制药有限公司(LEMONEX INC.)

<120> 用于使伤口愈合的药物组合物

<130> 19p07004

<150> US 62/712,321

<151> 2018-07-31

<150> KR 10-2019-0092942

<151> 2019-07-31

<160> 8

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 711

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Lys Leu Val Phe Leu Val Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu Gly Leu

1 5 10 15

Cys Leu Ala Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Thr Val Ser

20 25 30

Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Arg

35 40 45

Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln

50 55 60

Cys Ile Gln Ala Ile Ala Glu Asn Arg Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp

65 70 75 80

Gly Gly Phe Ile Tyr Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Arg Pro

85 90 95

Val Ala Ala Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln Pro Arg Thr His Tyr

100 105 110

Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Gly Ser Phe Gln Leu Asn Glu

115 120 125

Leu Gln Gly Leu Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ala Gly

130 135 140

Trp Asn Val Pro Ile Gly Thr Leu Arg Pro Phe Leu Asn Trp Thr Gly

145 150 155 160

Pro Pro Glu Pro Ile Glu Ala Ala Val Ala Arg Phe Phe Ser Ala Ser

165 170 175

Cys Val Pro Gly Ala Asp Lys Gly Gln Phe Pro Asn Leu Cys Arg Leu

180 185 190

Cys Ala Gly Thr Gly Glu Asn Lys Cys Ala Phe Ser Ser Gln Glu Pro

195 200 205

Tyr Phe Ser Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Arg Asp Gly Ala Gly

210 215 220

Asp Val Ala Phe Ile Arg Glu Ser Thr Val Phe Glu Asp Leu Ser Asp

225 230 235 240

Glu Ala Glu Arg Asp Glu Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asp Asn Thr Arg

245 250 255

Lys Pro Val Asp Lys Phe Lys Asp Cys His Leu Ala Arg Val Pro Ser

260 265 270

His Ala Val Val Ala Arg Ser Val Asn Gly Lys Glu Asp Ala Ile Trp

275 280 285

Asn Leu Leu Arg Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gly Lys Asp Lys Ser Pro

290 295 300

Lys Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro Ser Gly Gln Lys Asp Leu Leu Phe

305 310 315 320

Lys Asp Ser Ala Ile Gly Phe Ser Arg Val Pro Pro Arg Ile Asp Ser

325 330 335

Gly Leu Tyr Leu Gly Ser Gly Tyr Phe Thr Ala Ile Gln Asn Leu Arg

340 345 350

Lys Ser Glu Glu Glu Val Ala Ala Arg Arg Ala Arg Val Val Trp Cys

355 360 365

Ala Val Gly Glu Gln Glu Leu Arg Lys Cys Asn Gln Trp Ser Gly Leu

370 375 380

Ser Glu Gly Ser Val Thr Cys Ser Ser Ala Ser Thr Thr Glu Asp Cys

385 390 395 400

Ile Ala Leu Val Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly

405 410 415

Gly Tyr Val Tyr Thr Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala

420 425 430

Glu Asn Tyr Lys Ser Gln Gln Ser Ser Asp Pro Asp Pro Asn Cys Val

435 440 445

Asp Arg Pro Val Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Val Val Arg Arg Ser

450 455 460

Asp Thr Ser Leu Thr Trp Asn Ser Val Lys Gly Lys Lys Ser Cys His

465 470 475 480

Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu

485 490 495

Phe Asn Gln Thr Gly Ser Cys Lys Phe Asp Glu Tyr Phe Ser Gln Ser

500 505 510

Cys Ala Pro Gly Ser Asp Pro Arg Ser Asn Leu Cys Ala Leu Cys Ile

515 520 525

Gly Asp Glu Gln Gly Glu Asn Lys Cys Val Pro Asn Ser Asn Glu Arg

530 535 540

Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Asn Ala Gly

545 550 555 560

Asp Val Ala Phe Val Lys Asp Val Thr Val Leu Gln Asn Thr Asp Gly

565 570 575

Asn Asn Asn Glu Ala Trp Ala Lys Asp Leu Lys Leu Ala Asp Phe Ala

580 585 590

Leu Leu Cys Leu Asp Gly Lys Arg Lys Pro Val Thr Glu Ala Arg Ser

595 600 605

Cys His Leu Ala Met Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Met Asp

610 615 620

Lys Val Glu Arg Leu Lys Gln Val Leu Leu His Gln Gln Ala Lys Phe

625 630 635 640

Gly Arg Asn Gly Ser Asp Cys Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Gln Ser

645 650 655

Glu Thr Lys Asn Leu Leu Phe Asn Asp Asn Thr Glu Cys Leu Ala Arg

660 665 670

Leu His Gly Lys Thr Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Pro Gln Tyr Val

675 680 685

Ala Gly Ile Thr Asn Leu Lys Lys Cys Ser Thr Ser Pro Leu Leu Glu

690 695 700

Ala Cys Glu Phe Leu Arg Lys

705 710

<210> 2

<211> 1207

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Leu Leu Thr Leu Ile Ile Leu Leu Pro Val Val Ser Lys Phe Ser

1 5 10 15

Phe Val Ser Leu Ser Ala Pro Gln His Trp Ser Cys Pro Glu Gly Thr

20 25 30

Leu Ala Gly Asn Gly Asn Ser Thr Cys Val Gly Pro Ala Pro Phe Leu

35 40 45

Ile Phe Ser His Gly Asn Ser Ile Phe Arg Ile Asp Thr Glu Gly Thr

50 55 60

Asn Tyr Glu Gln Leu Val Val Asp Ala Gly Val Ser Val Ile Met Asp

65 70 75 80

Phe His Tyr Asn Glu Lys Arg Ile Tyr Trp Val Asp Leu Glu Arg Gln

85 90 95

Leu Leu Gln Arg Val Phe Leu Asn Gly Ser Arg Gln Glu Arg Val Cys

100 105 110

Asn Ile Glu Lys Asn Val Ser Gly Met Ala Ile Asn Trp Ile Asn Glu

115 120 125

Glu Val Ile Trp Ser Asn Gln Gln Glu Gly Ile Ile Thr Val Thr Asp

130 135 140

Met Lys Gly Asn Asn Ser His Ile Leu Leu Ser Ala Leu Lys Tyr Pro

145 150 155 160

Ala Asn Val Ala Val Asp Pro Val Glu Arg Phe Ile Phe Trp Ser Ser

165 170 175

Glu Val Ala Gly Ser Leu Tyr Arg Ala Asp Leu Asp Gly Val Gly Val

180 185 190

Lys Ala Leu Leu Glu Thr Ser Glu Lys Ile Thr Ala Val Ser Leu Asp

195 200 205

Val Leu Asp Lys Arg Leu Phe Trp Ile Gln Tyr Asn Arg Glu Gly Ser

210 215 220

Asn Ser Leu Ile Cys Ser Cys Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Val His Ile

225 230 235 240

Ser Lys His Pro Thr Gln His Asn Leu Phe Ala Met Ser Leu Phe Gly

245 250 255

Asp Arg Ile Phe Tyr Ser Thr Trp Lys Met Lys Thr Ile Trp Ile Ala

260 265 270

Asn Lys His Thr Gly Lys Asp Met Val Arg Ile Asn Leu His Ser Ser

275 280 285

Phe Val Pro Leu Gly Glu Leu Lys Val Val His Pro Leu Ala Gln Pro

290 295 300

Lys Ala Glu Asp Asp Thr Trp Glu Pro Glu Gln Lys Leu Cys Lys Leu

305 310 315 320

Arg Lys Gly Asn Cys Ser Ser Thr Val Cys Gly Gln Asp Leu Gln Ser

325 330 335

His Leu Cys Met Cys Ala Glu Gly Tyr Ala Leu Ser Arg Asp Arg Lys

340 345 350

Tyr Cys Glu Asp Val Asn Glu Cys Ala Phe Trp Asn His Gly Cys Thr

355 360 365

Leu Gly Cys Lys Asn Thr Pro Gly Ser Tyr Tyr Cys Thr Cys Pro Val

370 375 380

Gly Phe Val Leu Leu Pro Asp Gly Lys Arg Cys His Gln Leu Val Ser

385 390 395 400

Cys Pro Arg Asn Val Ser Glu Cys Ser His Asp Cys Val Leu Thr Ser

405 410 415

Glu Gly Pro Leu Cys Phe Cys Pro Glu Gly Ser Val Leu Glu Arg Asp

420 425 430

Gly Lys Thr Cys Ser Gly Cys Ser Ser Pro Asp Asn Gly Gly Cys Ser

435 440 445

Gln Leu Cys Val Pro Leu Ser Pro Val Ser Trp Glu Cys Asp Cys Phe

450 455 460

Pro Gly Tyr Asp Leu Gln Leu Asp Glu Lys Ser Cys Ala Ala Ser Gly

465 470 475 480

Pro Gln Pro Phe Leu Leu Phe Ala Asn Ser Gln Asp Ile Arg His Met

485 490 495

His Phe Asp Gly Thr Asp Tyr Gly Thr Leu Leu Ser Gln Gln Met Gly

500 505 510

Met Val Tyr Ala Leu Asp His Asp Pro Val Glu Asn Lys Ile Tyr Phe

515 520 525

Ala His Thr Ala Leu Lys Trp Ile Glu Arg Ala Asn Met Asp Gly Ser

530 535 540

Gln Arg Glu Arg Leu Ile Glu Glu Gly Val Asp Val Pro Glu Gly Leu

545 550 555 560

Ala Val Asp Trp Ile Gly Arg Arg Phe Tyr Trp Thr Asp Arg Gly Lys

565 570 575

Ser Leu Ile Gly Arg Ser Asp Leu Asn Gly Lys Arg Ser Lys Ile Ile

580 585 590

Thr Lys Glu Asn Ile Ser Gln Pro Arg Gly Ile Ala Val His Pro Met

595 600 605

Ala Lys Arg Leu Phe Trp Thr Asp Thr Gly Ile Asn Pro Arg Ile Glu

610 615 620

Ser Ser Ser Leu Gln Gly Leu Gly Arg Leu Val Ile Ala Ser Ser Asp

625 630 635 640

Leu Ile Trp Pro Ser Gly Ile Thr Ile Asp Phe Leu Thr Asp Lys Leu

645 650 655

Tyr Trp Cys Asp Ala Lys Gln Ser Val Ile Glu Met Ala Asn Leu Asp

660 665 670

Gly Ser Lys Arg Arg Arg Leu Thr Gln Asn Asp Val Gly His Pro Phe

675 680 685

Ala Val Ala Val Phe Glu Asp Tyr Val Trp Phe Ser Asp Trp Ala Met

690 695 700

Pro Ser Val Ile Arg Val Asn Lys Arg Thr Gly Lys Asp Arg Val Arg

705 710 715 720

Leu Gln Gly Ser Met Leu Lys Pro Ser Ser Leu Val Val Val His Pro

725 730 735

Leu Ala Lys Pro Gly Ala Asp Pro Cys Leu Tyr Gln Asn Gly Gly Cys

740 745 750

Glu His Ile Cys Lys Lys Arg Leu Gly Thr Ala Trp Cys Ser Cys Arg

755 760 765

Glu Gly Phe Met Lys Ala Ser Asp Gly Lys Thr Cys Leu Ala Leu Asp

770 775 780

Gly His Gln Leu Leu Ala Gly Gly Glu Val Asp Leu Lys Asn Gln Val

785 790 795 800

Thr Pro Leu Asp Ile Leu Ser Lys Thr Arg Val Ser Glu Asp Asn Ile

805 810 815

Thr Glu Ser Gln His Met Leu Val Ala Glu Ile Met Val Ser Asp Gln

820 825 830

Asp Asp Cys Ala Pro Val Gly Cys Ser Met Tyr Ala Arg Cys Ile Ser

835 840 845

Glu Gly Glu Asp Ala Thr Cys Gln Cys Leu Lys Gly Phe Ala Gly Asp

850 855 860

Gly Lys Leu Cys Ser Asp Ile Asp Glu Cys Glu Met Gly Val Pro Val

865 870 875 880

Cys Pro Pro Ala Ser Ser Lys Cys Ile Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Val

885 890 895

Cys Arg Cys Ser Glu Gly Tyr Gln Gly Asp Gly Ile His Cys Leu Asp

900 905 910

Ile Asp Glu Cys Gln Leu Gly Val His Ser Cys Gly Glu Asn Ala Ser

915 920 925

Cys Thr Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Thr Cys Met Cys Ala Gly Arg Leu

930 935 940

Ser Glu Pro Gly Leu Ile Cys Pro Asp Ser Thr Pro Pro Pro His Leu

945 950 955 960

Arg Glu Asp Asp His His Tyr Ser Val Arg Asn Ser Asp Ser Glu Cys

965 970 975

Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr

980 985 990

Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile

995 1000 1005

Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg His

1010 1015 1020

Ala Gly His Gly Gln Gln Gln Lys Val Ile Val Val Ala Val Cys Val

1025 1030 1035 1040

Val Val Leu Val Met Leu Leu Leu Leu Ser Leu Trp Gly Ala His Tyr

1045 1050 1055

Tyr Arg Thr Gln Lys Leu Leu Ser Lys Asn Pro Lys Asn Pro Tyr Glu

1060 1065 1070

Glu Ser Ser Arg Asp Val Arg Ser Arg Arg Pro Ala Asp Thr Glu Asp

1075 1080 1085

Gly Met Ser Ser Cys Pro Gln Pro Trp Phe Val Val Ile Lys Glu His

1090 1095 1100

Gln Asp Leu Lys Asn Gly Gly Gln Pro Val Ala Gly Glu Asp Gly Gln

1105 1110 1115 1120

Ala Ala Asp Gly Ser Met Gln Pro Thr Ser Trp Arg Gln Glu Pro Gln

1125 1130 1135

Leu Cys Gly Met Gly Thr Glu Gln Gly Cys Trp Ile Pro Val Ser Ser

1140 1145 1150

Asp Lys Gly Ser Cys Pro Gln Val Met Glu Arg Ser Phe His Met Pro

1155 1160 1165

Ser Tyr Gly Thr Gln Thr Leu Glu Gly Gly Val Glu Lys Pro His Ser

1170 1175 1180

Leu Leu Ser Ala Asn Pro Leu Trp Gln Gln Arg Ala Leu Asp Pro Pro

1185 1190 1195 1200

His Gln Met Glu Leu Thr Gln

1205

<210> 3

<211> 723

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu

1 5 10 15

Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln

20 25 30

Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr

35 40 45

Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val

50 55 60

Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu

65 70 75 80

Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys

85 90 95

Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe

100 105 110

Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys

115 120 125

Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys

130 135 140

Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His

145 150 155 160

Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg

165 170 175

Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg

180 185 190

Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr

195 200 205

Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly

210 215 220

Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe

225 230 235 240

Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg

245 250 255

Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His

260 265 270

Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met

275 280 285

Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln

290 295 300

Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro

305 310 315 320

Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro

325 330 335

Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro

340 345 350

Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg

355 360 365

Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gln

370 375 380

Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln

385 390 395 400

Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp

405 410 415

Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu

420 425 430

Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr

435 440 445

Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys

450 455 460

Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile

465 470 475 480

Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr

485 490 495

Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His

500 505 510

Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg

515 520 525

Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly

530 535 540

Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu

545 550 555 560

Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu

565 570 575

Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr Ile

580 585 590

Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser

595 600 605

Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp Gly Leu Leu

610 615 620

Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His

625 630 635 640

His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Ala Gly Ala

645 650 655

Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu

660 665 670

Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro

675 680 685

Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val

690 695 700

Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val

705 710 715 720

Pro Gln Ser

<210> 4

<211> 191

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

20 25 30

Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln

35 40 45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

50 55 60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65 70 75 80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

85 90 95

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

100 105 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

115 120 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly

130 135 140

Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr

145 150 155 160

Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln

165 170 175

Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg

180 185 190

<210> 5

<211> 6212

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLTF

<400> 5

cgagaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 60

taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 120

aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 180

atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 240

tacgccaagc tctagctaga ggtcgaccaa ttctcatgtt tgacagctta tcatcgcaga 300

tccgggcaac gttgttgcca ttgctgcagg cgcagaactg gtaggtatgg aagatctata 360

cattgaatca atattggcaa ttagccatat tagtcattgg ttatatagca taaatcaata 420

ttggctattg gccattgcat acgttgtatc tatatcataa tatgtacatt tatattggct 480

catgtccaat atgaccgcca tgttgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa 540

ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 600

atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 660

ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 720

aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtccgccc cctattgacg 780

tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta cgggactttc 840

ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 900

agtacaccaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 960

ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta 1020

ataaccccgc cccgttgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 1080

gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcc tcactctctt ccgcatcgct gtctgcgagg 1140

gccagctgtt gggctcgcgg ttgaggacaa actcttcgcg gtctttccag tactcttgga 1200

tcggaaaccc gtcggcctcc gaacggtact ccgccaccga gggacctgag cgagtccgca 1260

tcgaccggat cggaaaacct ctcgagaaag gcgtctaacc agtcacagtc gcaaggtagg 1320

ctgagcaccg tggcgggcgg cagcgggtgg cggtcggggt tgtttctggc ggaggtgctg 1380

ctgatgatgt aattaaagta ggcggtcttg agacggcgga tggtcgaggt gaggtgtggc 1440

aggcttgaga tccagctgtt ggggtgagta ctccctctca aaagcgggca ttacttctgc 1500

gctaagattg tcagtttcca aaaacgagga ggatttgata ttcacctggc ccgatctggc 1560

catacacttg agtgacaatg acatccactt tgcctttctc tccacaggtg tccactccca 1620

ggtccaagtt taaactgcgg ccgccaccat ggccctggtg tttctggtgc tgctgttcct 1680

gggcgccctg ggactgtgtc tggccggcag gcggagatct gtgcagtggt gcgccgtgtc 1740

tcagcccgag gccaccaagt gcttccagtg gcagcggaac atgcggaaag tgcgcggacc 1800

ccccgtgtcc tgcatcaagc gcgacagccc catccagtgc atccaggcca ttgccgagaa 1860

cagagccgac gccgtgaccc tggacggcgg ctttatctac gaagccggac tggcccctta 1920

taagctgagg cccgtggccg ccgaagtgta cggcaccgag cggcagccca gaacccacta 1980

ctacgccgtg gccgtggtca agaagggcgg cagcttccag ctgaacgagc tgcagggcct 2040

gaagtcctgc cacaccggcc tgagaagaac cgccggctgg aacgtgccta tcggcaccct 2100

gcggcccttt ctgaactgga ccggccctcc tgagcctatt gaggccgctg tggctagatt 2160

cttcagcgcc agctgcgtgc ctggcgccga taagggccag ttccccaacc tgtgcagact 2220

gtgtgctgga accggcgaga acaagtgcgc cttcagcagc caggaaccct acttcagcta 2280

cagcggcgcc ttcaagtgcc tgagagatgg cgctggcgac gtggccttca tccgggagag 2340

caccgtgttc gaggacctga gcgacgaggc cgagagggac gagtacgagc tgctgtgccc 2400

cgacaacacc cggaagcccg tggacaagtt caaggactgc cacctggcca gagtgccttc 2460

tcacgccgtg gtggccagaa gcgtgaacgg caaagaggac gccatctgga atctgctgcg 2520

gcaggcccag gaaaagttcg gcaaggacaa gagccccaag ttccagctgt tcggctctcc 2580

tagcggccag aaggatctgc tgttcaagga cagcgccatc ggcttcagca gagtgccccc 2640

cagaatcgac agcggcctgt acctgggcag cggctacttc accgccatcc agaacctgag 2700

aaagtccgag gaagaggtgg ccgccagacg ggctagagtc gtgtggtgtg ccgtgggcga 2760

gcaggaactg cggaagtgca accagtggag cggcctgagc gagggcagcg tgacatgtag 2820

cagcgccagc accaccgagg actgtatcgc cctggtgctg aagggcgagg ccgatgccat 2880

gtctctggat ggaggctacg tgtacaccgc cggcaagtgt ggactggtgc ccgtgctggc 2940

cgagaactac aagagccagc agagcagcga ccccgacccc aactgcgtgg acagacccgt 3000

ggagggatac ctggccgtgg ctgtcgtgag aagaagcgac accagcctga cctggaacag 3060

cgtgaagggc aagaagtctt gtcacaccgc cgtggaccgg accgccgggt ggaatatccc 3120

catgggcctg ctgtttaacc agaccggcag ctgcaagttc gacgagtact tcagccagag 3180

ctgcgcccct ggctctgatc ctagaagcaa cctgtgcgcc ctgtgcatcg gagatgagca 3240

gggcgagaat aagtgtgtgc ccaacagcaa cgagcggtac tacggctaca caggcgcctt 3300

tcgctgtctg gctgaaaatg ccggggatgt ggccttcgtg aaggacgtga ccgtgctgca 3360

gaacaccgac ggcaacaaca acgaggcctg ggccaaggac ctgaagctgg ccgacttcgc 3420

cctgctgtgc ctggacggca agagaaagcc cgtgaccgag gccagatcct gtcacctggc 3480

tatggctccc aaccacgctg tggtgtcccg gatggacaag gtcgaacgcc tgaaacaggt 3540

gctgctgcac cagcaggcca agttcggcag aaacggcagc gactgccccg ataagttctg 3600

cctgttccag agcgagacaa agaacctcct gttcaacgac aacaccgagt gcctggccag 3660

actgcacggc aagaccacct acgagaagta cctgggccct cagtacgtgg ccggcatcac 3720

caacctgaag aagtgcagca ccagccccct gctggaagcc tgcgagttcc tgcggaaggg 3780

cgcgccgtcg acctccatca cggcctataa gagtgagggg gagtcagcgg agttctcctt 3840

cccactcaac cttggagagg aaagcctgca gggagagttg agatggaagg cagagaaggc 3900

tccttcttcc cagtcctgga tcaccttctc cctaaagaac caaaaggtgt ctgtgcagaa 3960

gtctactagc aaccccaagt tccagctgtc cgaaacgctc ccactcaccc ttcagatacc 4020

ccaggtctcc cttcagtttg ctggttctgg caacctgacc ctgactctgg acagagggat 4080

actgtatcag gaagtgaacc tggtggtgat gaaagtgact cagcccgaca gcaacacttt 4140

gacctgtgag gtgatgggac ccacctcacc caagatgaga ctgatcttga agcaggagaa 4200

tcaggaggcc agggtctcca ggcaggagaa agtgattcaa gtgcaggccc ctgaagcagg 4260

ggtgtggcaa tgtctactga gtgaaggtga agaggtcaag atggactcca agatccaggt 4320

tttatccaaa gggttgaatt ccggatcact gcatcatatt ctggatgcac agaaaatggt 4380

gtggaatcat cgttaagtct agaaagcttg atatctagta atgagtttaa acgggggagg 4440

ctaactgaaa cacggaagga gacaataccg gaaggaaccc gcgctatgac ggcaataaaa 4500

agacagaata aaacgcacgg gtgttgggtc gtttgttcat aaacgcgggg ttcggtccca 4560

gggctggcac tctgtcgata ccccaccgag accccattgg ggccaatacg cccgcgtttc 4620

ttccttttcc ccaccccacc ccccaagttc gggtgaaggc ccagggctcg cagccaacgt 4680

cggggcggca ggccctgcca tagggatcca tgagccatat tcaacgggaa acgtcgaggc 4740

cgcgattaaa ttccaacatg gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg 4800

tcgggcaatc aggtgcgaca atctatcgct tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt 4860

ttctgaaaca tggcaaaggt agcgttgcca atgatgttac agatgagatg gtcagactaa 4920

actggctgac ggaatttatg cctcttccga ccatcaagca ttttatccgt actcctggtg 4980

atgcatggtt actcaccact gcgatccccg gaaaaacagc attccaggta ttagaagaat 5040

atcctgattc aggtgaaaat attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc cggttgcatt 5100

cgattcctgt ttgtaattgt ccttttaaca gcgatcgcgt atttcgtctc gctcaggcgc 5160

aatcacgaat gaataacggt ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag cgtaatggct 5220

ggcctgttga acaagtctgg aaagaaatgc ataaactttt gccattctca ccggattcag 5280

tcgtcactca tggtgatttc tcacttgata accttatttt tgacgagggg aaattaatag 5340

gttgtattga tgttggacga gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt gccatcctat 5400

ggaactgcct cggtgagttt tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa aaatatggta 5460

ttgataatcc tgatatgaat aaattgcagt ttcatttgat gctcgatgag tttttctaat 5520

cagaattggt taattggttg taacattatt cagattgggc cccgttccac tgagcgtcag 5580

accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 5640

gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 5700

caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc 5760

tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 5820

ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 5880

tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 5940

gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 6000

tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 6060

gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 6120

gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 6180

ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cg 6212

<210> 6

<211> 7088

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pEGF

<400> 6

cgagaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 60

taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 120

aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 180

atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 240

tacgccaagc tctagctaga ggtcgaccaa ttctcatgtt tgacagctta tcatcgcaga 300

tccgggcaac gttgttgcca ttgctgcagg cgcagaactg gtaggtatgg aagatctata 360

cattgaatca atattggcaa ttagccatat tagtcattgg ttatatagca taaatcaata 420

ttggctattg gccattgcat acgttgtatc tatatcataa tatgtacatt tatattggct 480

catgtccaat atgaccgcca tgttgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa 540

ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 600

atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 660

ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 720

aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtccgccc cctattgacg 780

tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta cgggactttc 840

ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 900

agtacaccaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 960

ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta 1020

ataaccccgc cccgttgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 1080

gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcc tcactctctt ccgcatcgct gtctgcgagg 1140

gccagctgtt gggctcgcgg ttgaggacaa actcttcgcg gtctttccag tactcttgga 1200

tcggaaaccc gtcggcctcc gaacggtact ccgccaccga gggacctgag cgagtccgca 1260

tcgaccggat cggaaaacct ctcgagaaag gcgtctaacc agtcacagtc gcaaggtagg 1320

ctgagcaccg tggcgggcgg cagcgggtgg cggtcggggt tgtttctggc ggaggtgctg 1380

ctgatgatgt aattaaagta ggcggtcttg agacggcgga tggtcgaggt gaggtgtggc 1440

aggcttgaga tccagctgtt ggggtgagta ctccctctca aaagcgggca ttacttctgc 1500

gctaagattg tcagtttcca aaaacgagga ggatttgata ttcacctggc ccgatctggc 1560

catacacttg agtgacaatg acatccactt tgcctttctc tccacaggtg tccactccca 1620

ggtccaagtt taaactgcgg ccgccaccat gctgctcact cttatcattc tgttgccagt 1680

agtttcaaaa tttagttttg ttagtctctc agcaccgcag cactggagct gtcctgaagg 1740

tactctcgca ggaaatggga attctacttg tgtgggtcct gcacccttct taattttctc 1800

ccatggaaat agtatcttta ggattgacac agaaggaacc aattatgagc aattggtggt 1860

ggatgctggt gtctcagtga tcatggattt tcattataat gagaaaagaa tctattgggt 1920

ggatttagaa agacaacttt tgcaaagagt ttttctgaat gggtcaaggc aagagagagt 1980

atgtaatata gagaaaaatg tttctggaat ggcaataaat tggataaatg aagaagttat 2040

ttggtcaaat caacaggaag gaatcattac agtaacagat atgaaaggaa ataattccca 2100

cattctttta agtgctttaa aatatcctgc aaatgtagca gttgatccag tagaaaggtt 2160

tatattttgg tcttcagagg tggctggaag cctttataga gcagatctcg atggtgtggg 2220

agtgaaggct ctgttggaga catcagagaa aataacagct gtgtcattgg atgtgcttga 2280

taagcggctg ttttggattc agtacaacag agaaggaagc aattctctta tttgctcctg 2340

tgattatgat ggaggttctg tccacattag taaacatcca acacagcata atttgtttgc 2400

aatgtccctt tttggtgacc gtatcttcta ttcaacatgg aaaatgaaga caatttggat 2460

agccaacaaa cacactggaa aggacatggt tagaattaac ctccattcat catttgtacc 2520

acttggtgaa ctgaaagtag tgcatccact tgcacaaccc aaggcagaag atgacacttg 2580

ggagcctgag cagaaacttt gcaaattgag gaaaggaaac tgcagcagca ctgtgtgtgg 2640

gcaagacctc cagtcacact tgtgcatgtg tgcagaggga tacgccctaa gtcgagaccg 2700

gaagtactgt gaagatgtta atgaatgtgc tttttggaat catggctgta ctcttgggtg 2760

taaaaacacc cctggatcct attactgcac gtgccctgta ggatttgttc tgcttcctga 2820

tgggaaacga tgtcatcaac ttgtttcctg tccacgcaat gtgtctgaat gcagccatga 2880

ctgtgttctg acatcagaag gtcccttatg tttctgtcct gaaggctcag tgcttgagag 2940

agatgggaaa acatgtagcg gttgttcctc acccgataat ggtggatgta gccagctctg 3000

cgttcctctt agcccagtat cctgggaatg tgattgcttt cctgggtatg acctacaact 3060

ggatgaaaaa agctgtgcag cttcaggacc acaaccattt ttgctgtttg ccaattctca 3120

agatattcga cacatgcatt ttgatggaac agactatgga actctgctca gccagcagat 3180

gggaatggtt tatgccctag atcatgaccc tgtggaaaat aagatatact ttgcccatac 3240

agccctgaag tggatagaga gagctaatat ggatggttcc cagcgagaaa ggcttattga 3300

ggaaggagta gatgtgccag aaggtcttgc tgtggactgg attggccgta gattctattg 3360

gacagacaga gggaaatctc tgattggaag gagtgattta aatgggaaac gttccaaaat 3420

aatcactaag gagaacatct ctcaaccacg aggaattgct gttcatccaa tggccaagag 3480

attattctgg actgatacag ggattaatcc acgaattgaa agttcttccc tccaaggcct 3540

tggccgtctg gttatagcca gctctgatct aatctggccc agtggaataa cgattgactt 3600

cttaactgac aagttgtact ggtgcgatgc caagcagtct gtgattgaaa tggccaatct 3660

ggatggttca aaacgccgaa gacttaccca gaatgatgta ggtcacccat ttgctgtagc 3720

agtgtttgag gattatgtgt ggttctcaga ttgggctatg ccatcagtaa taagagtaaa 3780

caagaggact ggcaaagata gagtacgtct ccaaggcagc atgctgaagc cctcatcact 3840

ggttgtggtt catccattgg caaaaccagg agcagatccc tgcttatatc aaaacggagg 3900

ctgtgaacat atttgcaaaa agaggcttgg aactgcttgg tgttcgtgtc gtgaaggttt 3960

tatgaaagcc tcagatggga aaacgtgtct ggctctggat ggtcatcagc tgttggcagg 4020

tggtgaagtt gatctaaaga accaagtaac accattggac atcttgtcca agactagagt 4080

gtcagaagat aacattacag aatctcaaca catgctagtg gctgaaatca tggtgtcaga 4140

tcaagatgac tgtgctcctg tgggatgcag catgtatgct cggtgtattt cagagggaga 4200

ggatgccaca tgtcagtgtt tgaaaggatt tgctggggat ggaaaactat gttctgatat 4260

agatgaatgt gagatgggtg tcccagtgtg cccccctgcc tcctccaagt gcatcaacac 4320

cgaaggtggt tatgtctgcc ggtgctcaga aggctaccaa ggagatggga ttcactgtct 4380

tgatattgat gagtgccaac tgggggtgca cagctgtgga gagaatgcca gctgcacaaa 4440

tacagaggga ggctatacct gcatgtgtgc tggacgcctg tctgaaccag gactgatttg 4500

ccctgactct actccacccc ctcacctcag ggaagatgac caccactatt ccgtaagaaa 4560

tagtgactct gaatgtcccc tgtcccacga tgggtactgc ctccatgatg gtgtgtgcat 4620

gtatattgaa gcattggaca agtatgcatg caactgtgtt gttggctaca tcggggagcg 4680

atgtcagtac cgagacctga agtggtggga actgcgccac gctggccacg ggcagcagca 4740

gaaggtcatc gtggtggctg tctgcgtggt ggtgcttgtc atgctgctcc tcctgagcct 4800

gtggggggcc cactactaca ggactcagaa gctgctatcg aaaaacccaa agaatcctta 4860

tgaggagtcg agcagagatg tgaggagtcg caggcctgct gacactgagg atgggatgtc 4920

ctcttgccct caaccttggt ttgtggttat aaaagaacac caagacctca agaatggggg 4980

tcaaccagtg gctggtgagg atggccaggc agcagatggg tcaatgcaac caacttcatg 5040

gaggcaggag ccccagttat gtggaatggg cacagagcaa ggctgctgga ttccagtatc 5100

cagtgataag ggctcctgtc cccaggtaat ggagcgaagc tttcatatgc cctcctatgg 5160

gacacagacc cttgaagggg gtgtcgagaa gccccattct ctcctatcag ctaacccatt 5220

atggcaacaa agggccctgg acccaccaca ccaaatggag ctgactcagt gagtctagaa 5280

agcttgatat ctagtaatga gtttaaacgg gggaggctaa ctgaaacacg gaaggagaca 5340

ataccggaag gaacccgcgc tatgacggca ataaaaagac agaataaaac gcacgggtgt 5400

tgggtcgttt gttcataaac gcggggttcg gtcccagggc tggcactctg tcgatacccc 5460

accgagaccc cattggggcc aatacgcccg cgtttcttcc ttttccccac cccacccccc 5520

aagttcgggt gaaggcccag ggctcgcagc caacgtcggg gcggcaggcc ctgccatagg 5580

gatccatgag ccatattcaa cgggaaacgt cgaggccgcg attaaattcc aacatggatg 5640

ctgatttata tgggtataaa tgggctcgcg ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct 5700

atcgcttgta tgggaagccc gatgcgccag agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg 5760

ttgccaatga tgttacagat gagatggtca gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc 5820

ttccgaccat caagcatttt atccgtactc ctggtgatgc atggttactc accactgcga 5880

tccccggaaa aacagcattc caggtattag aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg 5940

ttgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt 6000

ttaacagcga tcgcgtattt cgtctcgctc aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg 6060

ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag 6120

aaatgcataa acttttgcca ttctcaccgg attcagtcgt cactcatggt gatttctcac 6180

ttgataacct tatttttgac gaggggaaat taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg 6240

gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc 6300

cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat atggtattga taatcctgat atgaataaat 6360

tgcagtttca tttgatgctc gatgagtttt tctaatcaga attggttaat tggttgtaac 6420

attattcaga ttgggccccg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 6480

cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 6540

taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 6600

gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc 6660

acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 6720

ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 6780

ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 6840

cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 6900

aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 6960

gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 7020

gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 7080

gcaacgcg 7088

<210> 7

<211> 5651

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pHGF

<400> 7

cgagaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 60

taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 120

aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 180

atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 240

tacgccaagc tctagctaga ggtcgaccaa ttctcatgtt tgacagctta tcatcgcaga 300

tccgggcaac gttgttgcca ttgctgcagg cgcagaactg gtaggtatgg aagatctata 360

cattgaatca atattggcaa ttagccatat tagtcattgg ttatatagca taaatcaata 420

ttggctattg gccattgcat acgttgtatc tatatcataa tatgtacatt tatattggct 480

catgtccaat atgaccgcca tgttgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa 540

ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 600

atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 660

ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 720

aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtccgccc cctattgacg 780

tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta cgggactttc 840

ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 900

agtacaccaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 960

ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta 1020

ataaccccgc cccgttgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 1080

gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcc tcactctctt ccgcatcgct gtctgcgagg 1140

gccagctgtt gggctcgcgg ttgaggacaa actcttcgcg gtctttccag tactcttgga 1200

tcggaaaccc gtcggcctcc gaacggtact ccgccaccga gggacctgag cgagtccgca 1260

tcgaccggat cggaaaacct ctcgagaaag gcgtctaacc agtcacagtc gcaaggtagg 1320

ctgagcaccg tggcgggcgg cagcgggtgg cggtcggggt tgtttctggc ggaggtgctg 1380

ctgatgatgt aattaaagta ggcggtcttg agacggcgga tggtcgaggt gaggtgtggc 1440

aggcttgaga tccagctgtt ggggtgagta ctccctctca aaagcgggca ttacttctgc 1500

gctaagattg tcagtttcca aaaacgagga ggatttgata ttcacctggc ccgatctggc 1560

catacacttg agtgacaatg acatccactt tgcctttctc tccacaggtg tccactccca 1620

ggtccaagtt taaactgcgg ccgccaccat gtgggtgacc aaactcctgc cagccctgct 1680

gctgcagcat gtcctcctgc atctcctcct gctccccatc gccatcccct atgcagaggg 1740

acaaaggaaa agaagaaata caattcatga attcaaaaaa tcagcaaaga ctaccctaat 1800

caaaatagat ccagcactga agataaaaac caaaaaagtg aatactgcag accaatgtgc 1860

taatagatgt actaggaata aaggacttcc attcacttgc aaggcttttg tttttgataa 1920

agcaagaaaa caatgcctct ggttcccctt caatagcatg tcaagtggag tgaaaaaaga 1980

atttggccat gaatttgacc tctatgaaaa caaagactac attagaaact gcatcattgg 2040

taaaggacgc agctacaagg gaacagtatc tatcactaag agtggcatca aatgtcagcc 2100

ctggagttcc atgataccac acgaacacag ctttttgcct tcgagctatc ggggtaaaga 2160

cctacaggaa aactactgtc gaaatcctcg aggggaagaa gggggaccct ggtgtttcac 2220

aagcaatcca gaggtacgct acgaagtctg tgacattcct cagtgttcag aagttgaatg 2280

catgacctgc aatggggaga gttatcgagg tctcatggat catacagaat caggcaagat 2340

ttgtcagcgc tgggatcatc agacaccaca ccggcacaaa ttcttgcctg aaagatatcc 2400

cgacaagggc tttgatgata attattgccg caatcccgat ggccagccga ggccatggtg 2460

ctatactctt gaccctcaca cccgctggga gtactgtgca attaaaacat gcgctgacaa 2520

tactatgaat gacactgatg ttcctttgga aacaactgaa tgcatccaag gtcaaggaga 2580

aggctacagg ggcactgtca ataccatttg gaatggaatt ccatgtcagc gttgggattc 2640

tcagtatcct cacgagcatg acatgactcc tgaaaatttc aagtgcaagg acctacgaga 2700

aaattactgc cgaaatccag atgggtctga atcaccctgg tgttttacca ctgatccaaa 2760

catccgagtt ggctactgct cccaaattcc aaactgtgat atgtcacatg gacaagattg 2820

ttatcgtggg aatggcaaaa attatatggg caacttatcc caaacaagat ctggactaac 2880

atgttcaatg tgggacaaga acatggaaga cttacatcgt catatcttct gggaaccaga 2940

tgcaagtaag ctgaatgaga attactgccg aaatccagat gatgatgctc atggaccctg 3000

gtgctacacg ggaaatccac tcattccttg ggattattgc cctatttctc gttgtgaagg 3060

tgataccaca cctacaatag tcaatttaga ccatcccgta atatcttgtg ccaaaacgaa 3120

acaattgcga gttgtaaatg ggattccaac acgaacaaac ataggatgga tggttagttt 3180

gagatacaga aataaacata tctgcggagg atcattgata aaggagagtt gggttcttac 3240

tgcacgacag tgtttccctt ctcgagactt gaaagattat gaagcttggc ttggaattca 3300

tgatgtccac ggaagaggag atgagaaatg caaacaggtt ctcaatgttt cccagctggt 3360

atatggccct gaaggatcag atctggtttt aatgaagctt gccaggcctg ctgtcctgga 3420

tgattttgtt agtacgattg atttacctaa ttatggatgc acaattcctg aaaagaccag 3480

ttgcagtgtt tatggctggg gctacactgg attgatcaac tatgatggcc tattacgagt 3540

ggcacatctc tatataatgg gaaatgagaa atgcagccag catcatcgag ggaaggtgac 3600

tctgaatgag tctgaaatat gtgctggggc tgaaaagatt ggatcaggac catgtgaggg 3660

ggattatggt ggcccacttg tttgtgagca acataaaatg agaatggttc ttggtgtcat 3720

tgttcctggt cgtggatgtg ccattccaaa tcgtcctggt atttttgtcc gagtagcata 3780

ttatgcaaaa tggatacaca aaattatttt aacatataag gtaccacagt cataggtcta 3840

gaaagcttga tatctagtaa tgagtttaaa cgggggaggc taactgaaac acggaaggag 3900

acaataccgg aaggaacccg cgctatgacg gcaataaaaa gacagaataa aacgcacggg 3960

tgttgggtcg tttgttcata aacgcggggt tcggtcccag ggctggcact ctgtcgatac 4020

cccaccgaga ccccattggg gccaatacgc ccgcgtttct tccttttccc caccccaccc 4080

cccaagttcg ggtgaaggcc cagggctcgc agccaacgtc ggggcggcag gccctgccat 4140

agggatccat gagccatatt caacgggaaa cgtcgaggcc gcgattaaat tccaacatgg 4200

atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa 4260

tctatcgctt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat ggcaaaggta 4320

gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg gaatttatgc 4380

ctcttccgac catcaagcat tttatccgta ctcctggtga tgcatggtta ctcaccactg 4440

cgatccccgg aaaaacagca ttccaggtat tagaagaata tcctgattca ggtgaaaata 4500

ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt tgtaattgtc 4560

cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt 4620

tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga 4680

aagaaatgca taaacttttg ccattctcac cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct 4740

cacttgataa ccttattttt gacgagggga aattaatagg ttgtattgat gttggacgag 4800

tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt 4860

ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct gatatgaata 4920

aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaatc agaattggtt aattggttgt 4980

aacattattc agattgggcc ccgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 5040

gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 5100

cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 5160

ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc 5220

accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 5280

tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 5340

cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 5400

gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 5460

ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 5520

cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 5580

tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 5640

ccagcaacgc g 5651

<210> 8

<211> 4040

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pVEGF

<400> 8

cgagaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 60

taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 120

aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 180

atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 240

tacgccaagc tctagctaga ggtcgaccaa ttctcatgtt tgacagctta tcatcgcaga 300

tccgggcaac gttgttgcca ttgctgcagg cgcagaactg gtaggtatgg aagatctata 360

cattgaatca atattggcaa ttagccatat tagtcattgg ttatatagca taaatcaata 420

ttggctattg gccattgcat acgttgtatc tatatcataa tatgtacatt tatattggct 480

catgtccaat atgaccgcca tgttgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa 540

ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 600

atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 660

ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 720

aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtccgccc cctattgacg 780

tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta cgggactttc 840

ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 900

agtacaccaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 960

ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta 1020

ataaccccgc cccgttgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 1080

gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcc tcactctctt ccgcatcgct gtctgcgagg 1140

gccagctgtt gggctcgcgg ttgaggacaa actcttcgcg gtctttccag tactcttgga 1200

tcggaaaccc gtcggcctcc gaacggtact ccgccaccga gggacctgag cgagtccgca 1260

tcgaccggat cggaaaacct ctcgagaaag gcgtctaacc agtcacagtc gcaaggtagg 1320

ctgagcaccg tggcgggcgg cagcgggtgg cggtcggggt tgtttctggc ggaggtgctg 1380

ctgatgatgt aattaaagta ggcggtcttg agacggcgga tggtcgaggt gaggtgtggc 1440

aggcttgaga tccagctgtt ggggtgagta ctccctctca aaagcgggca ttacttctgc 1500

gctaagattg tcagtttcca aaaacgagga ggatttgata ttcacctggc ccgatctggc 1560

catacacttg agtgacaatg acatccactt tgcctttctc tccacaggtg tccactccca 1620

ggtccaagtt taaactgcgg ccgccaccat gaactttctg ctgtcttggg tgcattggag 1680

ccttgccttg ctgctctacc tccaccatgc caagtggtcc caggctgcac ccatggcaga 1740

aggagggggg cagaatcatc acgaagtggt gaagttcatg gatgtctatc agcgcagcta 1800

ctgccatcca atcgagaccc tggtggacat cttccaggag taccctgatg agatcgagta 1860

catcttcaag ccatcctgtg tgcccctgat gcgatgcggg ggctgctgca atgacgaggg 1920

cctggagtgt gtgcccactg aggagtccaa catcaccatg cagattatgc ggatcaaacc 1980

tcaccaaggc cagcacatag gagagatgag cttcctacag cacaacaaat gtgaatgcag 2040

accaaagaaa gatagagcaa gacaagaaaa tccctgtggg ccttgctcag agcggagaaa 2100

gcatttgttt gtacaagatc cgcagacgtg taaatgttcc tgcaaaaaca cagactcgcg 2160

ttgcaaggcg aggcagcttg agttaaacga acgtacttgc agatgtgaca agccgaggcg 2220

gtgagtctag aaagcttgat atctagtaat gagtttaaac gggggaggct aactgaaaca 2280

cggaaggaga caataccgga aggaacccgc gctatgacgg caataaaaag acagaataaa 2340

acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcataa acgcggggtt cggtcccagg gctggcactc 2400

tgtcgatacc ccaccgagac cccattgggg ccaatacgcc cgcgtttctt ccttttcccc 2460

accccacccc ccaagttcgg gtgaaggccc agggctcgca gccaacgtcg gggcggcagg 2520

ccctgccata gggatccatg agccatattc aacgggaaac gtcgaggccg cgattaaatt 2580

ccaacatgga tgctgattta tatgggtata aatgggctcg cgataatgtc gggcaatcag 2640

gtgcgacaat ctatcgcttg tatgggaagc ccgatgcgcc agagttgttt ctgaaacatg 2700

gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag atgagatggt cagactaaac tggctgacgg 2760

aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac tcctggtgat gcatggttac 2820

tcaccactgc gatccccgga aaaacagcat tccaggtatt agaagaatat cctgattcag 2880

gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg gttgcattcg attcctgttt 2940

gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc tcaggcgcaa tcacgaatga 3000

ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg taatggctgg cctgttgaac 3060

aagtctggaa agaaatgcat aaacttttgc cattctcacc ggattcagtc gtcactcatg 3120

gtgatttctc acttgataac cttatttttg acgaggggaa attaataggt tgtattgatg 3180

ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc aggatcttgc catcctatgg aactgcctcg 3240

gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa atatggtatt gataatcctg 3300

atatgaataa attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt tttctaatca gaattggtta 3360

attggttgta acattattca gattgggccc cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 3420

agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 3480

aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 3540

cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 3600

agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 3660

tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 3720

gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 3780

gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 3840

ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 3900

gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 3960

ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 4020

ggaaaaacgc cagcaacgcg 4040

Claims

1.一种用于治疗伤口的药物组合物，其包含：

负载有具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽或者用于增加所述多肽的活性或表达的物质的多孔二氧化硅颗粒，

其中，所述多孔二氧化硅颗粒的特征在于，在下式1中的吸光度比达到1/2时，t为24以上，

[式1]

A_t/A₀

(其中A₀为通过将5ml包含1mg/ml多孔二氧化硅颗粒的悬浮液置于具有孔径为50kDa的孔的圆筒状渗透膜中来测量的所述多孔二氧化硅颗粒的吸光度，

使15ml与所述悬浮液相同的溶剂与所述渗透膜的外部接触，并且在37℃下以60rpm水平地搅拌所述渗透膜的内部和外部，

所述悬浮液的pH为7.4，和

A_t表示从测量A_o开始经过t小时后测得的所述多孔二氧化硅颗粒的吸光度)。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多孔二氧化硅颗粒通过如下来制备：使具有孔径小于5nm的孔的二氧化硅颗粒与扩张剂在120至180℃下反应24至96小时以使所述孔径小于5nm的孔扩张；并且将具有扩张的孔的二氧化硅颗粒在400℃以上的温度下煅烧至少3小时。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多孔二氧化硅颗粒的平均直径为150至1000nm，BET表面积为200至700m²/g，并且每克的体积为0.7至2.2ml。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多肽为乳铁蛋白、上皮生长因子、肝细胞生长因子或血管内皮生长因子。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述乳铁蛋白由SEQ ID NO：1的序列构成。

6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述上皮生长因子由SEQ ID NO：2的序列构成，所述肝细胞生长因子由SEQ ID NO：3的序列构成，并且所述血管内皮生长因子由SEQ IDNO：4的序列构成。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述物质为负载有编码SEQ ID NO：1的序列的基因的质粒。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多孔二氧化硅颗粒携带所述具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽，并且在中性pH下、在所述颗粒的外表面上或所述孔的内部带负电。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多孔二氧化硅颗粒携带负载有编码所述具有上皮或内皮细胞生长促进能力的多肽的基因的质粒，并且在中性pH下、在所述颗粒的外表面上或所述孔的内部带正电。