CN116490215A - 靶向介导的内吞药物递送 - Google Patents

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Abstract

本发明属于智能药物递送领域。已经使用靶向介导的药物递送技术开发了靶向药品。与将药物“倾倒”到体内相反，这项技术选择性地且特异性地将药物引导到病变细胞/器官中。已发现这项技术可显著提高疾病治疗的功效并减少副作用，同时需要的药物量要少得多。此外，还使用了一种新颖的创新方法，其可以用于治疗例如癌症、自身免疫疾病、病毒性疾病、移植和与炎症相关的疾病。

Description

靶向介导的内吞药物递送
技术领域
本发明属于智能药物递送领域。已经使用靶向介导的药物递送技术开发了靶向药品。与将药物“倾倒”到体内相反，这项技术选择性地且特异性地将药物引导到病变细胞/器官中。已发现这项技术可显著提高疾病治疗的功效并减少副作用，同时需要的药物量要少得多。此外，还使用了一种新颖的创新方法，其可以用于治疗例如癌症、自身免疫疾病、病毒性疾病、移植和与炎症相关的疾病。
背景技术
本发明属于智能药物递送领域。药物递送涉及药剂，其也被称为药品、医药品或简称为药物。一般来说，其可以用于诊断、治愈、治疗或预防疾病。本发明尤其涉及药物递送和药物疗法。
值得注意的是，药物可以以多种方式分类。鉴于本发明，一个重要的区别在于小分子药物，例如通过化学合成获得的小分子药物，生物药剂，例如重组蛋白、疫苗、RNA和基因疗法，以及更复杂的分子等。作用方式和施用途径也可能不同。
药物施用的一个问题是通常需要相对大量的药物。原因之一是药物的施用位置与其应该递送到的位置不同；因此，它们通常需要穿过人体。结果，施药仅部分有效并且通常会引起副作用；视剂量而定，任何化合物都对人体有毒。
此外，药物的作用通常远非最佳。一个原因是待治疗的细胞或器官通常不处于对药物足够敏感的状态。
一些现有技术叙述了CRM197介导的药物靶向。例如Schenk等人在“有效的CRM197介导的药物靶向单核细胞(Efficient CRM197-mediated drug targeting tomonocytes)”，控制释放杂志(J.Controlled Release)158(2012),第139-147页中叙述了将药物有效递送到特定细胞储库以用于不能通过细胞屏障并且可能在脱靶组织中产生不期望的副作用的治疗。肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)在白细胞上表达，并且可以使用交叉反应材料(CRM)197靶向以实现特定药物递送，(CRM)197是白喉毒素的无毒变异体和HB-EGF的外源底物。他们使用荧光标记的CRM197和CRM197包被的脂质体来研究它们将药物递送到白细胞的潜在用途。他们证明CRM197引导的系统在体外被人类白细胞有效吸收。还发现CRM197在具有人类免疫系统组分的小鼠(HIS小鼠)和仓鼠体内特异性靶向白细胞。单核细胞代表最突出的白细胞亚群，显示出高度特异性的CRM197介导的摄取。因此，他们建议将CRM197作为一种新型靶向方法应用于需要选择性治疗单核细胞的疾病。US 2010/129437A1叙述了抗病毒化合物的靶向药物递送方法，包括化学试剂(如核苷类似物或蛋白酶抑制剂)和基于核酸的药物(如DNA疫苗、反义寡核苷酸、核酶、催化性DNA(DNAzyme)或RNA分子、siRNA或编码其的质粒)。此外，所述发明涉及将抗病毒化合物靶向药物递送到细胞、组织和器官内的细胞内靶部位，特别是中枢神经系统(CNS)内的靶部位，进入并穿过血脑屏障，通过靶向这些细胞、组织和器官上存在的内化摄取受体来实现。此外，抗病毒化合物或其药学上可接受的载体与配体缀合，所述配体促进与这些受体的特异性结合以及被这些受体内化。包封抗病毒化合物的脂质体通过PEG间隔物与CRM197缀合。而US 2010/209494 A1叙述了分子药品和药理学。更具体地说，它涉及脂质体和其作为治疗化合物的递送媒剂的用途。提供了一种脂质体，其包含至少一种包封内部隔室的脂质双层，其中所述脂质双层包含至少一种合成的吡啶衍生的两亲体，例如Saint-分子。
因此，本发明涉及一种药物递送，其解决了现有技术的一个或多个上述问题和缺点，在不损害功能和优势的情况下提供可靠的结果。
发明内容
本发明的一个目的是克服现有技术的药物递送的一个或多个限制并对其进行改进。在第一个方面，本发明涉及一种复合物，即一种化合物，所述复合物中成分中的一种和另一种与简单混合物相比更紧密地缔合，用于靶向介导的内吞药物递送，所述复合物包含以下各者作为成分：至少一种第一成分，所述第一成分包含靶向分子，在说明书和图中也称为B部分，所述靶向分子能够与肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)细胞受体相互作用，包括类似的生长因子，因此包括HB-EGF样生长因子，所述HB-EGF细胞受体能够在细胞中形成核内体，以及能够在酸性条件下在核内体膜中形成孔的直接或间接连接到所述靶向分子上的链，所述酸性条件例如在<6的pH，特别是pH<5.6，更特别是pH<5.0下，所述链特别是T链(也称为T部分)，优选连接到至少一种靶向分子上；直接或间接连接到所述至少一种第一成分上的至少一种第二成分，所述第二成分包含脂质体，所述至少一种脂质体包封一数量的至少一种活性化合物，所述活性化合物也被称为药品、医药品或简称为药物，是一种用于诊断、治愈或治疗疾病的药物，选自荧光化合物、同位素、铁磁性化合物、亚铁磁性化合物、亲脂性化合物以及水溶性化合物，特别是选自引起DNA链断裂或通过嵌入和抑制大分子生物合成与DNA相互作用的化合物，例如细胞抑制药物和细胞溶解药物，例如蒽环类药物，例如多索汀(Doxotin)、柔红霉素(daunorubicin)和多柔比星(doxorubicin)(CAS 23214-92-8)、长春花碱(vinblastin)、多西紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)(图4，CAS编号23214-92-8)、凋亡素(apoptin)、凋亡素相关蛋白(AAP)，例如AAP1、AAP2、AAP3、AAP4、AAP5和AAP6，HIV-tin、阿米汀(amytin)、考帕索汀(copaxotin)、泼尼汀(prednitin)、来索汀(lysotin)、保护素(protectin)、瓦第汀(vaditin)、加多汀(gadotin)、非戈汀(filgotin)和细菌素(bacteriotin)；基因或其序列；蛋白质；以及RNA序列，例如mRNA、siRNA和shRNA；以及编码mRNA、siRNA和shRNA的基因，优选具有<30个核苷酸，例如20-27个核苷酸的序列。本发明复合物通过为常规药物和“个性化药品”配备将药物带入患病细胞的归巢装置，大大增强了现有技术的疾病治疗。本发明复合物和剂量提供以下疾病治疗的改进：
1)通过避免蛋白质结合，所需药物量减少4-350倍
2)疾病治疗功效增强(靶组织中剂量百分比增加)，因此剂量降低20-30倍，
3)药物分布减少，且副作用小
4)部分规避耐药性
5)更好地控制疾病治疗，调节的药代动力学
6)提高患者的生活质量。
关于上述化合物，注意以下几点：
A.多索汀包含多柔比星盐酸盐
B.凋亡素包含编码具有以下氨基酸序列的凋亡素的表达质粒：
E.HIV-TIN包含
1)用凋亡素和多索汀进行踢杀(Kick and Kill)
2)表达质粒翻译通过例如针对病毒的启动子区的Prom-A提供转录基因沉默(TGS)以及通过递送shRNA以在白细胞膜上表达C46来抑制病毒进入。同样可以应用mRNA。
F.阿米汀包含编码包含以下氨基酸的蛋白中性溶酶(neprilysin)的表达质粒：
同样可以应用mRNA。
G.考帕索汀包含L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-酪氨酸的随机聚合物，其结构类似于髓鞘碱性蛋白。同样可以应用mRNA。
1)醋酸格拉替雷(glatiramer-acetate)的典型实例是：
EAYKAAEKAYAAKEAAKAKAEKKAAYAKAKAAKYEKKAKKAA
2)编码醋酸格拉替雷的表达质粒的典型实例是：
EAYKAAEKAYAAKEAAKAKAEKKAAYAKAKAAKYEKKAKKAA
H.泼尼汀包含半醋酸甲泼尼龙或醋酸地塞米松(也称为地塞汀(Dexatin))。
I.来索汀：包含
1)对于法布里病(Fabry Disease)：编码α-半乳糖苷酶A的表达质粒
2)对于戈谢病(Gaucher Disease)：编码葡糖脑苷脂酶的表达质粒
J.保护素包含：他克莫司(tacrolimus)和/或霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)
K.细菌素包含：多西环素盐酸盐(doxycycline-HCl)
L.瓦第汀包含：2-酰胺基苯并咪唑(diABZI-2；CAS编号934-32-7)
M.加多汀，包含Gd，能够捕获中子，作为增强剂用于例如CT、SPECT、MRI、扫描和诊断以及肿瘤疗法。
β-葡糖脑苷脂酶(也称为酸性β-葡糖苷酶、D-葡糖基-N-酰基鞘氨醇葡糖水解酶或GCase)：智人葡糖基神经酰胺酶β(GBA)，转录变异体1，mRNA序列
α-半乳糖苷酶A(α-GAL，也称为α-GALA；E.C.3.2.1.22)：氨基酸序列
O.非戈汀包含非戈替尼(Filgotinib)，用于治疗类风湿性关节炎。
本技术也称为IQ-靶向介导的药物递送(IQ-TMDD)，特别适用于治疗癌症、白细胞相关疾病和与炎症相关的疾病
肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)在细胞处的表达使得向这些细胞/器官的药物递送非常有选择性。已经表明，20000种癌症中有95％表达HB-EGF细胞受体。此外，将药物有效递送到特定细胞储库对于不能通过细胞屏障并且可能在脱靶组织中产生不期望的副作用的治疗特别重要。肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)在白细胞上表达，且可以使用交叉反应材料(例如CRM197)靶向以实现特定药物递送，CRM197是白喉毒素的无毒变异体和HB-EGF的外源底物。发明人使用荧光标记的交叉反应材料和交叉反应材料包被的脂质体来研究它们将药物递送到白细胞的潜在用途。发明人证明，交叉反应材料引导的系统在体外被人类白细胞有效吸收。还发现交叉反应材料在具有人类免疫系统组分的小鼠(HIS小鼠)和仓鼠体内特异性靶向白细胞。单核细胞代表最突出的白细胞亚群，显示出高度特异性的交叉反应材料介导的摄取(参见例如图1)。因此建立了交叉反应材料作为一种新的靶向方法在需要选择性治疗单核细胞的疾病中的应用。
本发明复合物的实例如图2所示。其中显示了一个圆形脂质体，包封着一种被鉴定为药物的活性化合物。连接于脂质体的是存在的至少一种第一成分，其包含靶向分子(正方形部分)和链(三角形部分)。任选地还有蛋白质，其在一端连接到本发明的链并连接到脂质体(至少一种第二成分)，通常显示白喉毒素的无毒突变体(圆形部分)。第一成分例如通过聚乙二醇(PEG)分子或聚乙烯-马来酰亚胺-DSPE连接到第二成分。本发明复合物的一种考虑的作用模式如图3所示。
多索汀被发现是一种有效且具有成本效益的靶向药品，其含有多柔比星、长春花碱、多西紫杉醇、紫杉醇，可通过应用的IQ-TMDD技术选择性地直接递送到例如癌细胞和癌症微环境的白细胞。多索汀将剂量降低25倍的多柔比星、长春花碱、多西紫杉醇、紫杉醇与靶向递送组合，引起与传统的非靶向脂质体相比，多柔比星、长春花碱、多西紫杉醇、紫杉醇的递送增强至少7倍，且副作用更少。凋亡素被认为是一种高度复杂的基因疗法，它触发一种机制，导致程序性细胞死亡(细胞凋亡)，例如仅癌细胞和转化细胞(即结构和/或组成发生变化的细胞，即细胞不断失去平衡，试图重新获得平衡，且因此易受伤害并对细胞凋亡敏感)而不是健康细胞的程序性细胞死亡。尽管凋亡素的机制已经过证明和测试，但事实证明无法将蛋白质或其相应基因递送到癌细胞中。通过将凋亡素与本发明IQ-TMDD复合物技术相结合，这个问题得到了解决。在一个实例中，(实体)癌主要包含癌细胞、癌症微环境的白细胞和癌症血管的内皮细胞。本发明特别适用于治疗这些(实体)癌的外表面以及癌症微环境。所有这些细胞都表达HB-EFG转运受体。由于多索汀可以迫使这些细胞进入转化状态，从而选择性地激活凋亡素迫使这些细胞凋亡，因此发现多索汀和凋亡素的组合可以治疗整个癌症，包括可能在治疗期间释放的转移细胞。因此，这种“踢杀”方法将大大提高癌症患者的生活质量。
在一个替代方案中，凋亡素提供了一种独特而具体的炎症性疾病治疗方法，例如自身免疫疾病(AID)。凋亡素可以在应激刺激后迫使转化细胞发生凋亡，绕过p53凋亡通路。此外，已显示，在类风湿性关节炎(RA)中，细胞应激，如紫外线和X射线照射，会引起所谓的SOS反应，类似于瞬态转化状态，这会激活凋亡素，凋亡素随后迫使RA成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)凋亡。在这里，我们提出了AID的“踢杀”治疗，通过首先应用多索汀作为应激刺激，然后进行凋亡素治疗来进行。
在另一替代方案中，提供了病毒性疾病的精准治疗。许多病毒性疾病被发现难以治疗，因为负责的病毒隐藏在作为病毒储库保存的细胞中。在这方面最重要的细胞是单核细胞和巨噬细胞。由于单核细胞和巨噬细胞高度表达IQ转运受体，因此可以通过用“踢杀”方法治疗这些细胞，从而根除这些病毒。
用于治疗HIV的进一步精准药品也提供了相同的技术。HIV-1/2经由其CXCR4和CCR5辅助受体进入CD4+-T细胞、树突细胞和巨噬细胞。通过多索汀/凋亡素(“踢杀”)方法根除HIV细胞现在提供了真正的治愈方法。在所有情况下，本发明对HIV的非病毒和精准治疗比现有技术的HIV治疗更有效且更具选择性。
脑淀粉样血管病(CAA)和“卡特韦克病(Katwijk Disease)”(HCHWA-D)的特征是淀粉样蛋白β(Aβ)的积累，这会导致脑中微出血(CAA和HCHWA-D)。脑啡肽酶是一种主要的Aβ单体和Aβ寡聚体降解酶。阿米汀是一种精准药品，用于将脑啡肽酶基因靶向递送到脑血管和血液隔室中的单核细胞。由于单核细胞移动到大脑中的炎症Aβ区域，本发明的双重治疗方法被认为可以分解Aβ并减少或阻止CAA、HCHWA-D和可能还有AD的进一步发展，特别是在使用阿米汀时。
醋酸格拉替雷(作为Copaxone出售)是一种免疫调节剂药剂，目前用于治疗多发性硬化症。最近表明，醋酸格拉替雷激活的巨噬细胞能够去除淀粉样蛋白-β(Aβ)寡聚体和单体，并挽救脑中的神经元连接，这为Copaxone治疗CAA、HCHWA-D和AD提供了理论依据。由于巨噬细胞是组织驻留的单核细胞并且都高度表达IQ转运受体，因此发现含有醋酸格拉替雷的IQ-TMDD能够选择性且更有效地将醋酸格拉替雷递送到巨噬细胞，且因此减少了副作用并增强了自脑和脑血管中清除Aβ。这随后以较低的剂量和较少的副作用减少了疾病进展。
多发性硬化症(MS)是一种慢性炎症性神经退行性疾病。特别是，单核细胞在缓解和复发MS方面发挥着重要作用。这些白细胞负责脑的免疫监视并移动到炎症部位。泼尼汀可将甲泼尼龙靶向递送到血液隔室中的单核细胞，以减少或停止其在脑中的炎症活动。通过这样做，泼尼汀以较低的剂量和较少的副作用增强了疾病治疗。与常规非靶向脂质体的应用相比，所需甲泼尼龙的剂量至少减少了30倍，而进入目标组织的剂量百分比增加了至少8倍。这意味着泼尼汀比目前的甲泼尼龙治疗模式更有效。这导致MS患者的生活质量提高。除了治疗MS，泼尼汀还可以用于治疗炎症和自身免疫疾病。
溶酶体贮积症(LSD)是由称为溶酶体的细胞器中化合物分解所需的单一酶缺乏引起的。当这些酶有缺陷或功能不佳时，化合物就会在这些细胞和组织/器官中积累。LSD主要影响儿童，且他们通常在年轻且不可预测的年龄死亡，许多在出生后几个月或几年内死亡。许多其他儿童在多年遭受其特定病症的各种症状之后死于这些疾病。因为LSD也与炎症有关，受某种LSD影响的细胞和器官会表达IQ受体(HB-EGF)。这意味着可以通过应用IQ靶向基因疗法(来索汀)来治疗这些细胞和器官。现有技术的治疗模式在将治疗剂递送到患病细胞和器官方面存在严重问题。来索汀通过选择性递送用于治疗戈谢病和法布里病的基因来满足这些需求。这大大提高了这些患者的生活质量。
治疗移植排斥.
保护素是一种精准药品，用于将免疫抑制药物(如他克莫司、霉酚酸酯(美酚酸(mephenolic acid)的前药)和泼尼松龙(prednisolone))选择性地递送到参与移植排斥的白细胞，如单核细胞、巨噬细胞、T细胞等。IQ-TMDD技术将显著增强这种治疗，减少副作用并控制疾病治疗，从而提高这些必须终生接受治疗的患者的生活质量。
治疗细胞内细菌.
生活在细胞内的细菌很难治疗，因为许多抗生素很难通过细胞膜。此外，细菌可能长期潜藏在包括单核细胞、巨噬细胞和T细胞在内的白细胞中，且在免疫抑制期间可能再次感染机体。由于炎症细胞和白细胞表达IQ转运受体，因此可以通过施加含有抗生素多西环素的细菌素非常有效地治疗这些细菌。
在第二个方面，本发明涉及至少一种包含根据本发明的复合物的剂量。所述剂量通常静脉内施加。剂量和复合物特别适用于两步法，称为“踢”和“杀”。其实例涉及根据本发明的至少两种剂量，至少一种第一剂量包含能够使细胞处于转化状态的第一活性化合物，至少一种第二剂量包含用于诱导所转化细胞凋亡的第二活性化合物。已经发现用现有技术将凋亡素递送到细胞即使不是不可能也是特别困难的。有前景的技术已经可用，但就发明人的知识而言，这些技术在凋亡素的递送方面都没有成功。凋亡素提供了一种独特而具体的治疗方法，例如癌症治疗方法。发现凋亡素，例如来自鸡贫血病毒(CAV)衍生的13.6kDa蛋白，在人类转化(癌症)细胞中诱导“程序性细胞死亡”(细胞凋亡)，而与肿瘤抑制蛋白p53无关。最初，人们认为癌症的发展主要是由增强的细胞增殖引起的。然而，已显示细胞凋亡水平降低也有助于癌症的形成。因此，细胞凋亡可以用于治疗癌症。凋亡素迫使癌细胞和转化细胞而非健康细胞凋亡。与仅治疗分裂癌细胞(包括健康细胞)的药物应用相比，这是一个主要优势。凋亡素不仅迫使快速分裂的癌细胞凋亡，而且迫使缓慢分裂的癌细胞，及甚至不分裂的癌细胞凋亡。此外，发现凋亡素诱导的细胞凋亡特别发生在癌细胞而不是非转化细胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2加速了凋亡素诱导的转化哺乳动物细胞凋亡，表达凋亡素的腺病毒载体已应用于小鼠，在人类肝癌或乳腺癌的癌内施用时减少癌症生长，且非病毒凋亡素载体已通过去唾液酸糖蛋白受体成功靶向肝癌细胞，然而这种受体主要存在于肝(癌)细胞中。这表明凋亡素治疗将通过减少副作用、提高功效和存活率以及随后改善患者的生活质量来显著改善癌症治疗。然而，凋亡素蛋白不能自然穿透癌细胞，且编码凋亡素的基因和mRNA也是如此，且因此需要递送装置。
在第三方面，本发明涉及施加根据本发明的剂量或根据本发明的复合物的方法，进一步包含施加局部紫外光、局部X射线辐射、局部热休克或其组合。局部辐射的施加被认为是踢步骤的替代方案。
本说明书的优点在整个说明书中详述。
发明具体描述
在本发明复合物的一个示例性实施例中，第一成分可以包含蛋白质(A-部分)，所述蛋白质具有>40kDa，优选>50kDa，例如>55kDa的分子量，并且优选具有<100kDa，优选<70kDa，例如<65kDa的分子量，并且优选连接到所述链上。
在本发明复合物的一个示例性实施例中，靶向分子可以包含白喉毒素的无毒突变体。
在一个示例性实施例中，本发明复合物可以包含作为第三成分的间隔物，所述间隔物连接到所述脂质体和所述第一成分上，例如连接到所述链或所述蛋白质上，优选是具有>400Da，例如>1kDa的分子量的间隔物，优选是PEG-间隔物，例如PEG 2000。
在一个示例性实施例中，本发明复合物可以包含2-100个第一成分/第二成分，优选10-90个第一成分/第二成分，更优选20-80个，例如40-70个第一成分/第二成分。
在一个示例性实施例中，本发明复合物可以用于治疗癌症，例如实体癌、白细胞疾病、自身免疫疾病、溶酶体贮积病、病毒性疾病、移植和与炎症相关的疾病，特别是寻常痤疮，过敏、阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease)、强直性脊柱炎、哮喘、动脉粥样硬化、自身免疫疾病，例如乳糜泻、1型糖尿病、格雷夫斯病(Graves'disease)、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、(类风湿)关节炎和系统性红斑狼疮、自身炎症性疾病，例如家族性地中海病、口糜、咽炎和宫颈腺炎。其它没有明确遗传原因的自身炎症性疾病包括成人发作型斯蒂尔病(adult-onset Still's disease)、全身性发作型幼年型特发性关节炎、施尼茨勒综合征(Schnitzler syndrome)和慢性复发性多灶性骨髓炎、慢性前列腺炎、克罗恩病(Crohn'sdisease)、皮炎、憩室炎、脑炎、纤维肌痛、肾小球肾炎、肝炎、化脓性汗腺炎、HIV/AIDS、超敏反应、炎症性肠病：克罗恩病、溃疡性结肠炎、间质性膀胱炎、扁平苔藓、白细胞缺陷、肥大细胞活化综合征、肥大细胞增多症、脑膜炎、肌病、肾炎、耳炎、帕金森病(Parkinson'sdisease)、盆腔炎性疾病、胰腺炎、再灌注损伤、风湿热、类风湿性关节炎、鼻炎、结节病、移植排斥、溃疡性结肠炎、血管炎、脑淀粉样血管病、HCHWA-D、多发性硬化症和COVID-19。
在一个示例性实施例中，本发明复合物可以用于涉及通过细胞屏障的药物递送。
在本发明复合物的一个示例性实施例中，所述靶向分子可以具有对所述HB-EGF受体<10-6摩尔，优选<10-8摩尔的解离常数Kd，且因此具有与所述受体的良好缔合。由此获得极好的递送。
在本发明复合物的一个示例性实施例中，所述至少一种靶向分子和/或至少一种脂质体不与内源性配体，即存在于例如血流中的配体相互作用，且因此到达体内的预定位置。
在本发明复合物的一个示例性实施例中，至少一种活性化合物可以偶联到至少一种第一成分、本发明靶向分子、本发明链、至少一种包含脂质体的第二成分或其组合上。
在本发明复合物的一个示例性实施例中，至少一种活性化合物选自荧光化合物，例如花青。
在本发明复合物的一个示例性实施例中，至少一种活性化合物选自同位素，例如选自由以下组成的群组的放射性核素：64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、70Ga、72Ga、89Zr、90Y、95Zr、99mTc、111In、114In、123I、124I、153Gd、159Gd和177Lu，其中所述放射性核素任选地作为阳离子存在，例如具有0、1、2、3、4、6或7的价态，例如Cu+、Cu2+、Cu3+、Cu4+、Ga+、Ga2+、Ga3+、Gd+、Gd2+、Gd3+、I+、I3 +、In+、In2+、In3+、Lu3+、Tc4+、Tc6+、Tc7+、Zr+、Zr2+、Zr3+、Zr4+、Y2+和Y3+。
在本发明复合物的一个示例性实施例中，至少一种活性化合物选自铁磁性化合物，例如Fe、Co、Ni、Gd和其组合。
在本发明复合物的一个示例性实施例中，至少一种活性化合物选自包含磁性组分(A,B)的铁磁性或亚铁磁性合金，其中组分A和/或组分B包含至少一种选自第3-12族、第4-6周期元素的磁性材料，例如Fe、Co、Ni、Gd和其组合，例如FePd、FeCo和FePt。
在本发明复合物的一个示例性实施例中，至少一种活性化合物组分A和/或组分B包含的材料选自镧系元素、钪、钇和其组合，例如选自Sc、Y、Sm、Gd、Dy、Ho、Er、Yb、Tb，例如Tb，和其组合。
在本发明复合物的一个示例性实施例中，至少一种活性化合物选自亚铁磁性化合物和来自亚铁磁性化合物的合金。
在一个示例性实施例中，本发明复合物用于成像，例如磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和荧光。
在一个示例性实施例中，本发明复合物用于手术或治疗，例如去除组织，例如去除癌组织。
在本发明复合物的一个示例性实施例中，所述第一成分可以是CRM197。
在本发明复合物的一个示例性实施例中，至少一种脂质体可以包含5-65重量％的活性化合物，优选10-60重量％的活性化合物，更优选20-50重量％的活性化合物，甚至更优选30-50重量％的活性化合物，例如40-45重量％的活性化合物，其中百分比是基于所述脂质体和活性化合物的总重量。
在本发明复合物的一个示例性实施例中，所述至少一种脂质体可以选自SAINT分子，例如EP-0755924中所示，例如SAINT18，以及包含SAINT分子的分子，例如saint-O-Somes。
在本发明复合物的一个示例性实施例中，至少一种水溶性活性化合物可以具有>0.1摩尔/升、优选>0.5摩尔/升的水溶解度。
在本发明复合物的一个示例性实施例中，至少一种亲脂性活性化合物可以具有>0.1摩尔/升、优选>0.5摩尔/升的己烷溶解度。在辛醇中也获得类似的溶解度。
在本发明复合物的一个示例性实施例中，所述至少一种活性化合物可以具有<10kDa，优选<5kDa，例如<2kDa的分子量。
在一个示例性实施例中，本发明复合物可以包含第一活性化合物，其中第一活性化合物使细胞处于转化状态，例如处于转化细胞由于不充分的p53细胞内级联而不能再进入细胞凋亡的状态，这可能是由(肿瘤抑制因子)基因突变以及病毒和细菌感染引起的。实例是癌症、通过肽基-精氨酸-脱亚胺酶-IV(PADI4)抑制p53的EB病毒(Epstein-BarrVirus)介导的自身免疫疾病(例如MS)以及永生化细胞。PADI4是一种去除精氨酸氨基并由此形成瓜氨酸的酶。实例是多索汀和多柔比星、长春花碱、多西紫杉醇、紫杉醇，它们由此提供踢效应。
在一个示例性实施例中，本发明复合物可以包含第二活性化合物，其中第二活性化合物诱导转化细胞的细胞凋亡，例如凋亡素(杀)。
在本发明复合物的一个示例性实施例中，可以包含至少一种脂质体通过以下方式获得：在非质子溶液中与间隔物反应，例如摩尔比为1:4:18:37:40的Mal-PEG2000-DSPE、DSPE-PEG2000、SAINT-C-18、POPC和胆固醇在氯仿:甲醇(9:1，v/v)中，由此提供脂质混合物；干燥所述脂质混合物，例如在减压氮气下；使所干燥的脂质混合物水合，例如在缓冲液中，例如pH为6-9，特别是pH 6.7，所述缓冲液包含活性化合物，例如凋亡素、基因或mRNA，由此将所述活性化合物掺入所述脂质体，例如Saint-O-some(SOS)中；对所获得的脂质体定大小，例如通过聚碳酸酯过滤器挤出，所述过滤器例如具有60-100nm，例如80nm的孔径，优选使用高压挤出机；以及温育所挤出的脂质体以将CRM197-PEG2000-DSPE转移到所述SOS中，并且任选地纯化所温育的复合物，例如在Sepharose柱上，并且任选地通过挤出对所述复合物进行灭菌，例如通过0.22μm过滤器。SOS包含一类新的基于脂质的药物递送装置，其由阳离子两亲体1-甲基-4-(顺-9-二油基)甲基-吡啶鎓-氯化物(SAINT-C18)配制而成。这些所谓的SAINT-O-Somes具有80-100nm的直径，与常规配制的脂质体一样稳定，并且在脂质体被细胞内吞时遇到的pH条件下，其内容物的释放效果极佳。它们特别适合疏水性药物以及更具亲脂性的药物的有效递送。
在一个示例性的实施例中，本发明的剂量可以包含0.01-1mg根据技术方案1至15中任一项所述的复合物/ml癌症，优选0.02-0.1mg/ml，例如0.04-0.07mg/ml。
在一个示例性实施例中，本剂量可以用于治疗肿瘤；白细胞疾病；病毒感染，例如HIV感染；以及白细胞，特别是巨噬细胞和单核细胞。
在一个示例性实施例中，本发明剂量可以包含至少一种包含能够使细胞处于转化状态的第一活性化合物的第一剂量，和至少一种包含用于诱导所转化细胞的凋亡的第二活性化合物的第二剂量。
在至少两种剂量的示例性实施例中，第一活性化合物可以选自引起DNA链断裂或通过嵌入和抑制大分子生物合成与DNA相互作用的化合物，例如细胞抑制药物和细胞溶解药物，例如蒽环类药物，例如多索汀和多柔比星、长春花碱、多西紫杉醇、紫杉醇和其组合，和/或其中第二活性化合物可以选自凋亡素和凋亡素相关蛋白(AAP)，例如AAP1、AAP2、AAP3、AAP4、AAP5、AAP6和其组合。在整个说明书和权利要求书中，术语“凋亡素”被认为与凋亡素、凋亡素相关蛋白(AAP)和类似化合物有关。
下文将通过以下实例进一步阐明本发明，这些实例是示例性和解释性的，且不应被认为是对本发明的限制。对于本领域的技术人员而言，可以清楚的是，可以想到落入保护范围内的许多变化形式，无论是显而易见的还是不明显的，特别是如本发明权利要求书或其任何组合所定义的。
附图说明
图1显示了莱顿大学(Leiden University)莱顿/阿姆斯特丹药物研究中心(Leiden/Amsterdam Center for Drug Research，LACDR)的血脑屏障(BBB)研究小组对动物模型进行的临床前研究，为IQ-TMDD提供了概念证据。
本发明复合物的实例如图2a-c所示。
本发明复合物的一种考虑的作用模式如图3所示。
图4显示了多柔比星的化学式。
图5显示了在癌症中对HB-EGF的亲和力表达。
图6为待治疗炎症疾病中涉及的白细胞的示意图。
图7显示了实验结果。
图8显示(左)：用Hoechst染成蓝色的MS病灶中的细胞核。可以观察到具有较大和较小细胞核的细胞；右图：与左图相同，但在荧光灯下。具有荧光CRM197的细胞与具有较大细胞核的细胞有关，很可能是单核细胞。
图9显示了仓鼠腹部施用后99mTc-CRM197分布的SPECT、CT和合并图片的横截面、正面截面和长度截面。白色箭头表示癌细胞的位置。1＝颈部，2＝腹部、肾脏、膀胱。
附图详细说明
图1显示了莱顿大学莱顿/阿姆斯特丹药物研究中心(LACDR)的血脑屏障(BBB)研究小组对动物模型进行的临床前研究，为IQ-TMDD提供了概念证据。
本发明复合物的实例如图2所示。
关于图3。显示了细胞通过HB-EGF样受体(IQ转运蛋白)摄取CRM197。CRM197的B链与IQ转运蛋白结合，IQ转运蛋白将CRM197转运到细胞中形成囊泡(核内体)。囊泡变成酸性(H+)，且CRM197的T链在囊泡壁上形成一个孔，允许A链从囊泡中逸出(核内体逸出)进入细胞内部(细胞质)。
CRM197是一种白喉毒素的无毒突变体，可与肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)结合。HB-EGF是一种早期反应基因，在癌症和炎症性疾病条件下的细胞中高度激活。这种由疾病诱导的HB-EGF的存在是一个主要优势，因为它通过本发明IQ-TMDD技术向患病细胞提供非常有选择性的药品递送，随后导致增强的疾病治疗。HB-EGF也存在于白细胞(WBC)中，这也为治疗与WBC相关的疾病提供了可能性。此外，这些细胞可用作局部药物递送平台，用于治疗与炎症相关的疾病，因为WBC会迁移到体内的炎症部位。CRM197选择性地与HB-EGF结合，并且不存在其它化合物以其它方式与这种受体结合。这意味着没有其它化合物对这种受体的竞争可能阻碍CRM197的细胞摄取。在称为核内体的媒剂中内化到细胞中后，CRM197的T链由于酸性环境而改变其构象并成为核内体膜中的孔。这允许特别是水溶性药物从核内体进入细胞的核内体逃逸。
CRM197使用一种有效且安全、无毒的内源性转运机制，称为受体介导的内吞作用(IQ-转运受体)，具有经证实的携带承载物(cargo-carrying)的性质，包括内在的核内体逃逸机制。IQ转运受体没有内源性配体，且因此预期既不会与内源性配体竞争，也不会阻断必需营养素向细胞的转运。关于CRM197的安全性，未观察到体外或体内毒性作用。CRM197已被充分表征(即已知的受体结合域、结合位点、制造过程)。CRM197是一种60kDa的蛋白质，对HB-EGF具有高亲和力(Kd＝10-8mol)。CRM197已经被成功地广泛使用。CRM197可以临床前和GMP级获得。
图4显示多柔比星的化学结构。
图5显示了各种癌症的HB-EGF表达(癌症基因组图谱)。
图6显示了白细胞的两个“家族”，它们从共同的前体细胞(多能造血干细胞)分化而来，并且与炎症相关的疾病有关。
图7显示了CRM197-FITC和FITC被U87MG(人类胶质母细胞瘤细胞)摄取：未缀合的FITC未被细胞内化。将细胞与FITC或FITC标记的CRM197(4和40μg)温育0、2、4、8和24小时。洗涤细胞并测定细胞内荧光。
具体实施方式
实例
已经进行了许多实验，显示出本发明的积极效果，详述如下。
IQ-转运受体介导的基因递送(绿色荧光蛋白质粒(pGFP))已成功应用于COS(猴肾-成纤维细胞)细胞、LLC-PK1(猪肾-上皮细胞)细胞和人类胶质母细胞瘤(脑癌)细胞。
在具有人类免疫系统的小鼠(即所谓的HIS小鼠)中进行的实验表明，荧光CRM197(CRM-FITC)而不是牛血清白蛋白(BSA-FITC)被血液和各种组织(骨髓、脾脏和肝脏)中的单核细胞和树突细胞吸收。
在注射到这些仓鼠的腹部后，IQ-TMDD被用于选择性地将放射性锝递送到癌症中。4小时后通过SPECT(单光子发射计算机断层扫描)和CT(计算机断层扫描)进行放射性定位。除了肾脏和膀胱中存在放射性(由于通过肾脏从血液中清除)外，可以看出这些仓鼠的颈部已经积累了放射性。这表明锝已被癌细胞选择性吸收。这通过在处死动物后分析颈部癌症得到证实。
仓鼠静脉内注射含有对照或含有IQ脂质体的HRP(辣根过氧化物酶，40kDa)和罗丹明-PE(红色染料)。发现IQ-脂质体在体外和体内被单核细胞(其具有许多HB-EGF样IQ转运蛋白)广泛吸收。相反，在对照脂质体与分离的单核细胞体外温育后，只能观察到轻微的红色信号，而在体内根本没有红色信号。这可以通过脂质体与单核细胞的特异性结合来解释，这种结合可以在体外观察到，但强度不足以承受体内的剪切应力(由于血流)。
在患有多发性硬化症(MS)的狨猴中进行的实验表明，在静脉内注射后，CRM-FITC已被血液隔室中的白细胞吸收并转运到狨猴大脑中的MS病灶。
用LPS刺激人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)两次。第二次刺激在第一次攻击后3小时进行。然后分别将静息的LPS激活的HUVEC与抗VCAM-1(AbVCAM)和非靶向型含有地塞米松的SAINT-O-Somes(dex SOS)一起温育。(A)荧光显微镜图像显示4小时温育后激活的HUVEC对靶向型SAINT-O-Somes的摄取。脂质体膜用DiI(红色)标记，且细胞核用Hoechst 33342(蓝色)染色。(B)AbVCAM-1SAINT-O-Some与VCAM-1缔合的特异性通过将细胞与50倍过量的抗VCAM-1单克隆抗体以及AbVCAM-1SAINT-O-Somes共同温育来测定。在分别共同温育3小时和21小时后，通过流式细胞仪分析对SAINT-O-Somes与激活的HUVEC的缔合进行量化。数据表示为来自一个实验的一式三份样品的平均荧光强度(MFI)值±SD。*，P<0.05，AbVCAM-1SAINT-O-Somes对比非靶向型SAINT-O-Somes；#，P<0.05，AbVCAM-1SAINT-O-Some与LPS的缔合刺激的HUVEC与未刺激的HUVEC；&，P<0.05，具有或不具有过量抗VCAM-1抗体之间的显著差异。
含有p65-siRNA的E-选择素靶向SOS可抑制NF-kB活性并减少血管性肾小球肾炎的炎症。
多索汀是一种制造成Saint-O-Some的含有多柔比星的IQ-精准药品(IQ-TMDD)。这种精准药品通过IQ转运分子靶向癌细胞，并通过IQ转运受体被癌细胞内化，并提供选择性和显著更有效的癌症治疗。模拟表明，所需剂量将减少25倍，而癌细胞吸收的药物量将从施用剂量的1.6％增加到11.1％。
由于多索汀允许对癌症进行三重治疗，包括癌细胞、癌症微环境中的白细胞和癌症血管的内皮细胞(参见实体癌的治疗)，多索汀治疗癌症比传统的治疗模式显著更有效。此外，由于受体介导的摄取到细胞中，药物外排转运蛋白引起的耐药性的发生在很大程度上被避免了。类似地，由于靶向递送、将多柔比星掺入脂质体以及显著更小的药物剂量，副作用也减少了。
发现用多柔比星溶液治疗AML细胞比用非靶向脂质体治疗有效得多。这是由于这些脂质体没有被这些细胞吸收，且多柔比星从这些脂质体中缓慢释放，且随后缓慢进入AML细胞。此类递送在癌症治疗中不是最理想的，并且还可能导致耐药性的快速发展。
材料和方法
一般程序
制备IQ药品的技术程序
制备IQ-Saint-O-Somes-脂质体(SOS)
IQ-SOS-脂质体在三步程序制备。
1)在CRM197处引入SH基团
SH基团通过SATA反应(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯)在CRM197处引入。SATA-经修饰的CRM197可以与含有PEG2000-马来酰亚胺-DSPE和PEG2000-DSPE的胶束反应。
2)制备SOS脂质体
SOS由摩尔比为1:4:18:37:40的Mal-PEG2000-DSPE、DSPE-PEG2000、SAINT-C-18、POPC和胆固醇在氯仿:甲醇(9:1，v/v)中制备。脂质混合物在减压氮气下干燥，然后在pH6.7的缓冲液中水合，含有凋亡素基因或凋亡素mRNA。使用高压挤出机，通过孔径为80nm的聚碳酸酯过滤器挤出，对如此形成的SOS定大小。
3)将CRM197胶束转移到SOS
将胶束和SOS温育以将CRM197-PEG2000-DSPE转移到SOS。SOS在Sepharose柱上纯化，并通过0.22μm过滤器挤出进行灭菌。根据既定程序(Kowalski等人,2015)对大小、脂质含量、蛋白质含量、基因含量和稳定性进行表征。
将治疗基因整合到表达质粒中
编码各种蛋白质和RNA的DNA质粒，如所述精准药品中的活性化合物所示，根据所需序列购自BaseClear(荷兰莱顿(Leiden,The Netherlands))，并克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)中(Invitrogen)。将质粒掺入SOS脂质体中。随后将CRM197连接到SOS-脂质体上，如上所示。
Fan等人,2018的细胞活力分析
进行MTT分析以分析细胞活力。实验前，将细胞以5×103个细胞/100ml培养基接种在96孔板中过夜。使用MTT比色分析(5mg/ml；目录号M2003；Sigma-Aldrich；Merck KGaA，德国达姆施塔特(Darmstadt,Germany))检查每个孔中的细胞活力。然后将MTT溶液添加到每个孔中，并在37℃下温育3小时；100μl二甲基亚砜用于稀释甲臜晶体。使用读板器在490nm处测量每个样品的光密度值。所有测定一式六份进行。
Fan等人,2018的细胞凋亡分析
细胞凋亡通过使用膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒APC(eBioscience；ThermoFisher Scientific,Inc.)进行。细胞(2×105个细胞/孔)在6孔板中培养直至其达到70-80％汇合度，之后通过胰蛋白酶消化收集细胞，用冰冷的膜联蛋白V结合缓冲液洗涤两次，并用含有5μl膜联蛋白V和5μl碘化丙锭(PI)的300μl 1X结合缓冲液染色，室温避光30分钟。随后，加入400μl膜联蛋白V结合缓冲液，并根据制造商的方案使用流式细胞术(BDBiosciences，美国新泽西州富兰克林湖(Franklin Lakes,NJ,USA))分析细胞；从每个样品中获取≥30,000个门控事件。早期凋亡细胞被异硫氰酸荧光素(FITC)膜联蛋白V染色，但不被PI染色；而晚期凋亡细胞和坏死细胞的FITC膜联蛋白V和PI染色呈阳性。
细胞的体外X射线治疗
X射线源是Andrex 225S MART设备(Andrex St，丹麦哥本哈根(Copenhagen,Denmark))，在200kV和4mA下使用，带有1-mm A1过滤器。应用剂量为5Gy。使用PTW剂量计监测剂量和剂量率。照射后，加入储存的培养基，且温育所照射的培养物以进行DNA转染。
1)凋亡素基因的发展
DNA质粒：根据Danen-Van Oorschot使用的凋亡素序列，编码凋亡素的DNA质粒购自BaseClear(荷兰莱顿)，并克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen)中。在用Lipofectin转染后，在人类癌细胞中测试凋亡素质粒，以研究细胞活力和凋亡素蛋白表达。此外，初步工作已经表明胶质母细胞瘤细胞会经历凋亡素诱导的细胞凋亡，并且CRM197靶向技术已证明可有效地将绿色荧光蛋白(GFP)质粒和凋亡素质粒递送到胶质母细胞瘤细胞中。
2)制备含有凋亡素基因的IQ-SOS
编码凋亡素或对照GFP基因的质粒被整合到PEG化的Saint-O-Somes中。
3)体外实验
在体外培养的选定AML细胞中研究了通过IQ-SOS进行凋亡素和对照GFP基因的质粒递送从而杀死癌细胞的功效。来自两种AML细胞系和仓鼠DDT-MF2癌细胞系的细胞与凋亡素基因/mRNA或对照GFP SOS温育74小时，以研究凋亡素诱导的细胞凋亡。
4)Fan等人,2018的细胞活力分析
进行MTT分析以分析细胞活力。实验前，将细胞以5×103个细胞/100ml培养基接种在96孔板中过夜。使用MTT比色分析(5mg/ml；目录号M2003；Sigma-Aldrich；Merck KGaA，德国达姆施塔特)检查每个孔中的细胞活力。然后将MTT溶液添加到每个孔中，并在37℃下温育3小时；100μl二甲基亚砜用于稀释甲臜晶体。使用读板器在490nm处测量每个样品的光密度值。所有测定一式六份进行。
5)细胞凋亡分析
细胞凋亡通过使用膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒APC(eBioscience；ThermoFisher Scientific,Inc.)进行。细胞(2×105个细胞/孔)在6孔板中培养直至其达到70-80％汇合度，之后通过胰蛋白酶消化收集细胞，用冰冷的膜联蛋白V结合缓冲液洗涤两次，并用含有5μl膜联蛋白V和5μl碘化丙锭(PI)的300μl 1X结合缓冲液染色，室温避光30分钟。随后，加入400μl膜联蛋白V结合缓冲液，并根据制造商的方案使用流式细胞术(BDBiosciences，美国新泽西州富兰克林湖)分析细胞；从每个样品中获取≥30,000个门控事件。早期凋亡细胞被异硫氰酸荧光素(FITC)膜联蛋白V染色，但不被PI染色；而晚期凋亡细胞和坏死细胞的FITC膜联蛋白V和PI染色呈阳性。
“踢杀”精准治疗癌症
癌症治疗
癌症治疗在许多情况下由于治疗功效差、许多副作用和耐药性的发生而受到限制。此外，超过90％的癌症死亡率是由于转移所致。这主要是由于癌细胞通过血管散播，这在转移级联中起着至关重要的作用，且主要涉及局部侵袭、内渗、循环、微转移形成和转移定植。许多研究表明，血管靶向杀死癌症会导致肿瘤转移，因为这些治疗主要集中在一个靶点，例如血管，留有癌转移逃逸进入体内的机会。
这里提供了一种创新和独特的癌症总体治疗方法，它提供了治愈的机会并提高了患者的生活质量。它包含应用多索汀引起的“踢”以及多索汀和凋亡素引起的“杀”。由于所调查的20000例癌症中有95％表达IQ转运受体(参见具有IQ转运受体表达的疾病(Diseaseswith expression of the IQ-transport receptor))，因此可以通过应用这种“踢杀”方法来治疗许多癌症。
癌症微环境
CME中的几乎所有(白血)细胞都表达IQ转运受体，因此CME通过应用“踢杀”方法进行治疗。
转化细胞
癌细胞以及由于病毒、基因突变或其它修饰的干扰而行为改变的细胞被称为“转化”细胞。这些细胞不能将它们异常的细胞状态改变为正常。当这些修饰导致阻断了从这种情况逃离的最终途径时，例如p53介导的细胞凋亡途径，这将导致慢性疾病，如癌症和自身免疫疾病(另参见自身免疫疾病的“踢杀”精准治疗(“Kick and Kill”precisiontreatment of Auto-Immune Diseases))。“踢杀”方法也能够迫使“转化细胞”凋亡。
治疗癌血管
癌血管有缺氧的问题，这是一种强烈的炎症刺激，且可诱导HB-EGF的表达。已经表明，在体外，HB-EGF参与癌血管形成，而在体内存在于腺囊性癌的癌血管内皮处。这些细胞用“踢杀”方法治疗，因为多索汀会杀死内皮细胞和/或使内皮细胞进入临时转化状态，从而激活凋亡素，凋亡素迫使这些细胞凋亡。这一切都将导致癌血管的塌陷和癌营养供应的切断，并随后杀死整个癌。
总体癌症治疗
由于IQ-转运受体表达于癌细胞处，包括转移细胞、癌症微环境(CME)的白细胞和癌血管的炎性内皮细胞，因此“踢杀”方法对癌症治疗非常有益。多索汀继而凋亡素联合治疗癌症将杀死所有这些细胞和/或使所有这些细胞进入转化状态，这将激活凋亡素，随后凋亡素将仅迫使这些细胞凋亡，包括转移细胞。此外，重复施用无毒的凋亡素将负责血液隔室的抗癌监测，因为凋亡素会迫使这些转移性癌细胞凋亡，而健康细胞则不会。因此，“踢杀”方法提供了对总体癌症的治疗，且因此有很大的治愈机会。
由多索汀和凋亡素引起的“踢杀”
凋亡素和多索汀的独特组合将提供具有优异功效的癌症精准治疗，因为：
1)凋亡素迫使癌细胞和转化细胞绕过p53通路发生凋亡。此外，已表明，在易癌变细胞中，紫外线和X射线照射等细胞应激会导致所谓的SOS反应，类似于瞬时转化状态，这会激活凋亡素，迫使这些细胞凋亡。
2)多柔比星是一种DNA损伤药物，会杀死细胞，且因此对细胞是一种严重的应激因子。此外，已经表明多柔比星是对细胞来说是强烈的SOS信号，可迫使细胞进入暂时的“转化”状态。
类似的方法应用于自身免疫疾病，结果也类似。蛋白质的瓜氨酸化是由酶肽酰精氨酸脱氨酶活性增加引起的，尤其是IV型(PADI4)。这种酶将氨基酸精氨酸转化为瓜氨酸。此外，已经表明，由于通过p21和p53抑制细胞凋亡(程序性细胞死亡)机制，PADI4可以挽救自身免疫细胞，如类风湿性关节炎(RA)中的成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)，使其免于凋亡。这意味着这些细胞不能再进入细胞凋亡状态，并且会不断产生瓜氨酸化蛋白质，从而引起与RA和其它AID相关的症状。
“踢杀”治疗
1)使用生长刺激和凋亡素治疗
体外实验表明，用40％的人类血清刺激成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)，然后进行凋亡素治疗，也会迫使这些细胞发生凋亡。这种治疗在人类身上并不直接可行，但也许可以用HB-EGF精准药品治疗这些细胞来替代，所述药品通过用HB-EGF激活表皮生长因子受体(EGFR)来刺激生长。
2)使用X射线和凋亡素治疗
已经表明，X射线治疗“转化的”成纤维细胞，随后进行凋亡素治疗，迫使这些细胞凋亡，而健康的成纤维细胞存活下来。这为以这种方式治疗RA中的成纤维细胞FLS开辟了道路。这是一种有吸引力的治疗方法，因为可以在局部应用X射线并调整剂量，然后施用凋亡素精准药品。
3)使用HIF-1α-mRNA或-质粒和凋亡素治疗
Fan等人已经表明，通过用siRNA抑制PADI4来治疗FLS细胞将增强这些细胞的凋亡。众所周知，PADI4阻断导致细胞凋亡的p53途径。因此，p53途径的恢复增强了细胞的凋亡。由于凋亡素绕过了这个途径，所以我们不需要阻断PADI4途径。因此，我们可以用热休克诱导因子-α(HIF-α)等应激因子处理FLS细胞，然后使用凋亡素精准药品迫使这些细胞凋亡。
4)使用多索汀和凋亡素治疗
已表明RA-FLS是转化细胞。这意味着应用额外的应激刺激(SOS信号)继而凋亡素将迫使这些细胞凋亡。多柔比星是一种DNA损伤药物，且对细胞来说是一种严重的应激因子。这开辟了通过首先用多索汀(一种含有多柔比星的精准药品)“踢”这些细胞，然后用凋亡素“杀”这些细胞来迫使FLS凋亡的方式。这种“踢杀”方法将有效根除受AID影响的细胞并减少甚至可能阻止疾病进展。
方法
细胞活力分析
进行MTT分析以分析细胞活力。实验前，将从RA动物(优选仓鼠)获得的细胞以5×103个细胞/100ml培养基接种在96孔板中过夜。使用MTT比色分析(5mg/ml；目录号M2003；Sigma-Aldrich；Merck KGaA，德国达姆施塔特(Darmstadt,Germany))检查每个孔中的细胞活力。然后将MTT溶液添加到每个孔中，并在37℃下温育3小时；100μl二甲基亚砜用于稀释甲臜晶体。使用读板器在490nm处测量每个样品的光密度值。所有测定一式六份进行。
细胞凋亡分析
细胞凋亡通过使用膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒APC(eBioscience；ThermoFisher Scientific,Inc.)进行。FLS(来自RA大鼠的2×105个细胞/孔)在6孔板中培养直至其达到70-80％汇合度，之后通过胰蛋白酶消化收集细胞，其用冰冷的膜联蛋白V结合缓冲液洗涤两次，并用含有5μl膜联蛋白V和5μl碘化丙锭(PI)的300μl 1X结合缓冲液染色，室温避光30分钟。随后，加入400μl膜联蛋白V结合缓冲液，并根据制造商的方案使用流式细胞术(BD Biosciences，美国新泽西州富兰克林湖)分析细胞；从每个样品中获取≥30,000个门控事件。早期凋亡细胞被异硫氰酸荧光素(FITC)膜联蛋白V染色，但不被PI染色；而晚期凋亡细胞和坏死细胞的FITC膜联蛋白V和PI染色呈阳性。
细胞的体外X射线治疗
X射线源是Andrex 225S MART设备(Andrex St，丹麦哥本哈根)，在200kV和4mA下使用，带有1-mm A1过滤器。应用剂量为5Gy。使用PTW剂量计监测剂量和剂量率。照射后，加入储存的培养基，且温育所照射的培养物以进行DNA转染。
A.病毒性疾病的“踢杀”精准治疗
病毒性疾病
许多病毒性疾病难以治疗，因为这些病毒隐藏在作为病毒储库保存的细胞中。在这方面最重要的细胞是单核细胞和巨噬细胞。
单核细胞和巨噬细胞作为病毒靶点和储库
作为病毒储库的细胞必须满足以下特征：
·有足够的使用寿命
·能够避免细胞凋亡
·能够避免免疫反应
·与其它细胞群有充分的相互作用
单核细胞是白细胞，根据定义是非分裂细胞，半衰期短(数小时)，限制了病毒复制，使病毒复制几乎不可能发生。单核细胞不断产生并广泛存在于血流中，在血流中它们可能会暴露于病毒。此外，单核细胞-巨噬细胞作为病毒感染的靶点具有几个吸引人的特征，因此病毒已经找到了避免限制并使这些细胞适应其复制的方法。
一旦病毒进入单核细胞，其RNA或DNA就会诱导产生：
·新的病毒粒子
·激活细胞凋亡途径以传播新病毒粒子的蛋白质
·增强单核细胞炎症活性从而吸引新的单核细胞的蛋白质
·减少单核细胞炎症活性以避免免疫反应的蛋白质
·下调细胞凋亡途径以保护巨噬细胞等病毒储库中病毒的蛋白质
在其生命周期结束时，单核细胞将在细胞凋亡或分化为巨噬细胞后死亡。巨噬细胞可能驻留在各种组织中，然后被称为组织细胞、库普弗细胞(Kupffer cell)、霍夫鲍尔细胞(Hofbauer cell)、肺泡巨噬细胞和小胶质细胞等。
所述病毒可感染单核细胞和巨噬细胞。因此，这些细胞可能起到病毒工厂的作用，但也会导致病毒在全身传播，因为单核细胞和巨噬细胞能够穿透组织屏障。此外，巨噬细胞的寿命很长，且因此可以作为主要的病毒储库发挥作用，当免疫系统受到抑制时，病毒可以从所述病毒储库中重新激活。
“踢杀”方法
这种创新和独特的方法提供了对表达IQ转运受体的细胞的根除。多柔比星是一种DNA损伤药物，且对细胞来说是一种严重的应激因子。这开辟了通过用多索汀(含有多柔比星)“踢”这些细胞并用凋亡素“杀”它们来迫使病毒感染的细胞凋亡的方式。这将根除病毒感染的单核细胞和包括有病毒的巨噬细胞。此外，由于许多病毒会发生突变，因此“踢杀”方法对于病毒的逃逸并不敏感。
HIV-tin-治疗HIV/AIDS的精准药品
HIV/AIDS
人类免疫缺陷病毒(HIV-1/2)目前得到良好管理，并通过现有的联合抗逆转录病毒疗法(cART)实现了血浆病毒抑制。然而，除了包括副作用在内的终身治疗之外，对患者的顺应性也提出了很高的要求。目前的HIV治疗涉及施用各种药物：
非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)
核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)
蛋白酶抑制剂(PI)
融合抑制剂
CCR5拮抗剂
整合酶链转移抑制剂(INSTI)
附着后抑制剂
3)“踢杀”方法
由于HIV-DNA整合到宿主DNA中，一旦整合，原病毒DNA就会在细胞分裂周期中与细胞DNA一起复制，就像任何细胞基因一样。特别是，常驻巨噬细胞充当病毒储库(参见感染细胞和HIV储库(Infected cells and HIV-reservoirs))。一种实现HIV治愈的方法被称为‘踢杀’(或‘慑杀(Shock and Kill)’)。在这里，储库被刺激以逆转潜伏期，且杀死现在可靶向的细胞。从理论上讲，这种“踢杀”的方法可以从体内根除HIV病毒。
目前，潜在的应用是多西汀/凋亡素“踢杀”治疗以及联合的转录基因沉默(TGS)和C46治疗。从这个角度出发，做了下面的实验：
1)TGS/C46治疗
a)构建用于TGS和C46治疗的IQ-TMDD质粒
b)测试IQ-TMDD质粒，所述质粒在脂质体转染后在人类CD4+-T细胞中提供TGS和C46表达
c)在HIV动物模型(没有大鼠或小鼠，优选是猕猴)中测试用于TGS和C46治疗的IQ-TMDD质粒
2)多索汀/凋亡素“踢杀”治疗
a)对多索汀和凋亡素在体外根除HIV感染细胞的研究。
b)对多索汀和凋亡素在动物(猕猴)中根除HIV的研究。
用CRM197-Alexa488(正方形)或BSA-Alexa488(三角形)处理CD4+-SupT1细胞。使用台盼蓝(Trypan blue)淬灭外部荧光信号，从而区分结合和内化(黑色符号)或单独内化(白色符号)。从与CRM197-Alexa488一起温育的2小时到6小时，总(结合+内化)信号明显高于单独的内化信号(*p<0.001)。显示的数据基于每个条件n＝3，且代表具有相似结果的3个独立实验。
G.阿米汀-用于治疗CAA、HCHWA-D和AD的精准药品
Neprilysin1基因，编码中性溶酶蛋白并制造在IQ-TMDD精准药品中，被递送到发炎的脑内皮细胞和单核细胞中，以减少或阻止CAA或HDHWA-D和可能的AD患者的疾病进展
双重疾病治疗模式
由于AD、CAA和HCHWA-D与炎症有关，这将导致HB-EGF在炎症细胞(包括脑血管内皮细胞)中的上调。此外，迁移到大脑炎症部位的单核细胞在正常情况下也表达了大部分IQ转运受体。这开启了双重治疗模式的可能性：
1)通过将IQ-SOS-NEP1基因精准药品靶向发炎的脑血管内皮细胞进行直接治疗。在那里，这些系统通过IQ转运受体(HB-EGF)内化到内皮细胞中。随后中性溶酶在这些细胞的表面表达，这将导致那里的Aβ单体和寡聚体分解。
2)通过靶向单核细胞进行间接治疗。单核细胞，还有其它白细胞，如中性粒细胞，已经具有非常高的IQ转运受体表达。静脉内施用IQ-SOS-NEP1基因精准药品后，单核细胞和其它白细胞装载有NEP1基因，且会在细胞表面表达NEP1酶。当这些细胞迁移到AD患者、CAA患者或HCHWA-D患者脑中的发炎疾病区域时，它们可以分解Aβ单体和寡聚体并延缓或阻止疾病进展。
在最近对几种细胞类型(包括猪LLC-PK1、灵长类动物COS1和人类胶质母细胞瘤细胞)进行的一系列实验中，我们已经通过我们的IQ靶向技术证明了受体介导的绿色荧光蛋白基因(质粒)摄取。为此目的，IQ转运分子与具有正电荷的聚合物(聚乙烯酰亚胺(PEI))偶联。由于质粒带负电荷，因此它们静电附着在IQ-PEI系统上。与各种细胞(例如灵长类动物COS-1细胞、猪LLC-PK1细胞和人类胶质母细胞瘤细胞)一起温育显示摄取，如通过细胞内荧光所示，同时用对照蛋白(辣根过氧化物酶)替换IQ转运分子并添加过量游离的IQ分子不会产生任何细胞内荧光。由于我们还将NEP1基因靶向炎症性脑内皮细胞，因此我们希望应用一种特殊类型的脂质体，称为Saint-O-Somes，它们能够整合高mRNA和基因负载。随附图式示意性地显示了最终导致NEP1基因细胞内递送的各个步骤。
1)NEP1-质粒
通过将来自pBKS载体的NotI/EcoRI萤火虫cDNA片段亚克隆到pIRESneo-载体的多位点人工接头(polylinker)中，构建了编码人类中性溶酶蛋白的pIRESneo-NEP(可在NCBI获得的AA序列)。基因DNA在DHα5中扩增，并使用QIAGEN Gene Mega试剂盒进行分离和纯化。纯度通过凝胶电泳继而溴化乙锭染色来确认，并根据260nm处的紫外吸收来测量DNA浓度。
1)IQ-NEP1-SOS-脂质体
这些是在两步程序中制备的(参见制备IQ-SOS-脂质体(Preparation IQ-SOS-liposomes))。
实验
1)离体实验
研究CAA患者死后脑中的小型血管和中型血管中HB-EGF的存在：切片是由CAA和HCHWA-D患者的死后脑制成，用PBS洗涤3次并在冰冷的4％多聚甲醛中固定。随后切片用T-PBS(PBS和0.1％ Tween 20，Sigma-Aldrich)洗涤，用10％兔正常血清(VectorLaboratories，美国加利福尼亚州伯灵格姆(Burlingame,CA,USA))和抗生物素蛋白/生物素封闭试剂盒(Vector Laboratories，美国加利福尼亚州伯灵格姆)遵循制造商的方案封闭。切片在T-PBS中与多克隆山羊抗HB-EGF(1:100，Santa Cruz Biotechnology，美国(USA))在4℃下温育过夜。切片用T-PBS洗涤3次，每次5分钟，并在室温下与生物素化兔抗山羊多克隆抗体(1:500，Jackson，美国)温育55分钟。接下来，将载玻片与链霉抗生物素蛋白-德州红罗丹明(Texas Red Rhodamine)(1:2000，Vector Laboratories，美国加利福尼亚州伯灵格姆)一起温育20分钟。用去离子水冲洗细胞并包埋在封固剂中以使用DAPI(Vectashield，Vector Technologies，加利福尼亚州伯灵格姆)发出荧光。然后将使用荧光显微镜评估HB-EGF表达。
2)体外实验
a)对内皮细胞和单核细胞靶向摄取IQ-GFP-质粒-脂质体的体外研究：制备IQ-GFP-脂质体后，人类脑内皮细胞的体外培养用于通过研究表达的GFP蛋白产生的荧光程度来研究炎症刺激后IQ-GFP-质粒-脂质体的摄取。
b)对IQ-脂质体对NEP1-质粒内皮靶向作用的体外研究：制备IQ-NEP-脂质体后，人类脑内皮细胞的体外培养用于研究炎症刺激后IQ-NEP1-脂质体的摄取。通过测量NEP1酶活性来估计NEP1蛋白的表达。
c)中性溶酶-1酶活性的测量：中性溶酶活性是在完整细胞或组织匀浆中使用戊二酰基-Ala-Ala-Phe-4-甲氧基-2-萘胺(GAAPN)作为底物测量的。对蛋白质含量进行定量。
用于MS、AD、CAA和HCHWA-D的精准药品
醋酸格拉替雷的应用
1)在MS中的醋酸格拉替雷(GA)
GA(也称为共聚物1、Cop-1或Copaxone)是目前用于治疗多发性硬化症的免疫调节剂。GA在美国被批准用于减少复发频率，但不能用于减少残疾进展。然而，观察性研究而非随机对照试验表明，它可能会减少残疾的进展。虽然多发性硬化症的最终诊断需要有两次或更多次症状和体征发作的病史，但醋酸格拉替雷被批准用于治疗预期诊断的首次发作。它还用于治疗复发缓解型多发性硬化症。它通过皮下注射施用。
GA是随机大小的肽的混合物，由髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)中发现的四种氨基酸构成，具体来说是谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸和酪氨酸。MBP是神经元髓鞘中的抗原，可刺激MS患者的自身免疫反应，因此所述肽可能作为攻击性免疫细胞的诱饵。
这些共聚氨基酸的分子量从5.5到9kDa不等。GA似乎通过竞争性结合主要组织相容性(MHC)II类分子来阻止T细胞激活，从而阻止其它抗原的呈递并阻碍T细胞激活。它在多发性硬化症中的功效与T细胞反应从促炎途径转变为抗炎途径有关。此外，由于脑中脑源性神经营养因子的GA激活分泌，它还提供神经保护作用。此外，GA似乎在移植物抗宿主病和炎症性肠病(结肠炎)等免疫介导的疾病中也具活性。
2)在CAA、HCHWA-D和阿尔茨海默病(AD)中的醋酸格拉替雷
CAA包含脑淀粉样血管病，且HCHWA-D相似但进展更快。这两种疾病的特征都是淀粉样蛋白-β(Aβ)在脑中的中型血管和较小血管中积聚。
最近已经表明，将神经元与骨髓来源的巨噬细胞共培养可保护突触免受Aβ原纤维的侵害，此外，巨噬细胞经GA免疫激活可赋予针对寡聚体的进一步保护。原纤维通过细胞内核内体蛋白水解和细胞外MMP-9酶促降解被清除。GA刺激的巨噬细胞或单核细胞的体内研究证实了体外数据。这表明激活的巨噬细胞可以清除Aβ寡聚体和原纤维，拯救突触，因此为治疗CAA、HCHWA-D和AD提供了理论依据。
1)制备考帕索汀
参见制备IQ-SOS-TMDD(Preparation IQ-SOS-TMDD)。
2)测试考帕索汀的功效
根据Li等人,2020，在将Aβ单体和寡聚体与考帕索汀激活的和未激活的人类单核细胞/巨噬细胞温育后，执行清除Aβ单体和寡聚体的功效。
3)考帕索汀的剂量
发现可显著降低考帕索汀的必要剂量，因为仅治疗白细胞，主要是单核细胞和巨噬细胞。目前的剂量是：
a)成人：20mg皮下1次/天或40mg皮下3次/周，间隔48小时。
b)12岁以上儿童：20mg皮下1次/天。
H.用于治疗多发性硬化症(MS)的精准药品
多发性硬化症(MS)
MS是中枢神经系统的慢性炎症性神经退行性疾病。早期以复发为特征，而晚期以进行性残疾为特征。除了小胶质细胞，白细胞，如单核细胞、巨噬细胞和树突细胞，在MS的病程中起着关键作用。美国有近100万人患有MS，而全球约有250万人。
治疗MS的一个基本问题是缺乏将治疗活性药物以高效选择性地递送到脑MS区域的能力。我们已经表明(参见MS-狨猴中单核细胞和树突细胞的脑穿透(Brain penetrationof monocytes and dendrocytes in MS-marmoset monkey))在血液隔室中加载荧光CRM197后，白细胞(很可能是单核细胞)能够穿透狨猴大脑中的MS病变(具有实验性自身免疫性脑脊髓炎的普通狨猴，一种MS动物模型(Callithrix jacchus with experimentalautoimmune encephalomyelitis,an animal model for MS))。此外，Meena和Cools(2019)最近表明，在脑发炎后，树突细胞也能够迁移到脑中。这是通过血脑屏障(位于脑中最小的血管)、脉络丛(位于脑中的脑室)和脑膜血管(位于脑外部)发生的。在非炎症条件下，这种迁移非常少，但在MS等炎症条件下，这种迁移会大大增强。
MS-治疗模式
单核细胞、巨噬细胞和树突细胞表达IQ转运受体(HB-EGF)，因此，可以用IQ靶向介导的甲泼尼龙(泼尼汀)递送来治疗这些细胞。因为主要是这些细胞促成了脑中的炎症过程，所以可以通过减少脑中这些细胞释放的促炎化合物来抑制它们的促炎活性。
甲泼尼龙广泛用于治疗MS，并已显示出是有效的。它与细胞内的受体结合，这与大多数其它抗MS药物，如与细胞外靶点结合的干扰素-β形成对比。所述药物已过专利期。
通过应用泼尼汀，我们期望提高MS治疗的功效，减少副作用并提高这些患者的生活质量。此外，泼尼汀还可以用于治疗与炎症相关的其它疾病，如(类风湿)关节炎、脑膜炎、脑炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病等。
血液和靶组织中的甲泼尼龙与血液中的蛋白质结合(78％)，且游离药物(22％)可以到达靶点。目标浓度为600ng/ml。相比之下，当在静脉内施用后作为靶向型IQ-脂质体(IQ-MPRED-SOS)应用于血液和靶组织时。无蛋白结合，所有药物均可到达靶部位。目标浓度为600ng/ml。结果是靶标处高10到100倍。
通常，本发明活性化合物的目标浓度在100-1000ng/ml的量级，例如200-500ng/ml。
材料和方法
制备含有甲泼尼龙(泼尼汀)的IQ-SOS
半醋酸甲泼尼龙被掺入PEG化Saint-O-Somes中。参见制备IQ-SOS-脂质体。
4)泼尼汀的其它应用
a)炎症性疾病，如(类风湿)关节炎、多发性硬化症、细菌性炎症、病毒性炎症、多发性硬化症、脑膜炎、脑炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病等。
b)由于地塞米松在激活糖皮质激素受体方面更有效，因此应该研究这种药物是否比甲泼尼龙更适用。
c)甲泼尼龙还有地塞米松已被证明对治疗Covid-19有效。
J.来索汀-治疗溶酶体贮积病的精准药品
溶酶体贮积病(LSD)
LSD是一组约50种由溶酶体功能缺陷引起的罕见遗传性代谢紊乱。溶酶体是带有酶的细胞囊泡，这些酶可以消化大分子并将碎片传递到细胞的其它部分以进行回收。这个过程需要几种关键酶。如果其中一种酶因突变而有缺陷，大分子就会在细胞内积聚，最终杀死细胞。LSD通常是由于脂质、糖蛋白(含糖蛋白)或所谓的粘多糖代谢所需的单一酶缺乏所致。个别地，LSD的发生率低于1:100,000；然而，作为一组来说，发病率约为1:5,000-1:10,000。大多数这些病症是常染色体隐性遗传，例如C型尼曼匹克病(Niemann-Pick disease,type C)，但也有少数是X连锁隐性遗传，例如法布里病和亨特综合征(Hunter syndrome)(MPSII)。
症状可能包括发育迟缓、运动障碍、癫痫发作、痴呆、耳聋和/或失明。在其它疾病中，肝脾肿大、全血细胞减少、肺心病和骨骼表现是突出的症状和体征。
用含有功能酶或能够产生功能酶的mRNA或质粒(编码功能酶)的IQ-精准药品治疗细胞和器官。IQ靶向药品的一个有趣特征是，在受影响的细胞内化到核内体后，这些细胞随后与溶酶体融合。这意味着功能酶被IQ-精准药品转运到细胞的正确部分(见随附图式)。与目前静脉内输注后的酶递送相比，这是功能酶的更先进和有效的递送。在目前静脉内输注后的酶递送的情况下，这种酶的活性仅限于细胞外的空间，因为这种酶不能通过细胞膜，且因此不能达到其最佳的细胞内活性环境。因此，发明人开发了一种IQ-精准药品，其包含IQ-靶向技术的选择性和应用配制成新型SOS药物递送系统的LSD-酶、LSD-mRNA或LSD-质粒。首先，我们将专注于开发一种IQ-TMDD精准药品(来索汀)，它能够将编码葡糖脑苷脂酶(戈谢病)或α-半乳糖苷酶A(法布里病)的基因靶向LSD影响的细胞。
由于T细胞、巨噬细胞、树突细胞和朗格汉斯细胞(Langerhans cell)(皮肤树突细胞)的平均寿命至少为两周，因此所需的给药方案通常每两周一次。
移植排斥.
移植排斥是通过细胞免疫引起的适应性免疫反应，诱导靶细胞凋亡，以及体液免疫(由分泌抗体分子的激活B细胞介导)，尽管所述作用与先天免疫反应的组分(吞噬细胞和可溶性免疫蛋白)结合。白细胞，特别是T细胞和B细胞，包括单核细胞和巨噬细胞，也被认为是移植排斥中的重要细胞。应用IQ-TMDD技术，可以选择性且非常有效地使用免疫抑制药物治疗白细胞，包括T细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞，剂量较低且副作用较小，同时也由于药物递送系统的调节的药代动力学而优化了治疗。保护素可能含有免疫抑制药物，如他克莫司、霉酚酸酯(＝美酚酸)和泼尼松龙或其组合。
实验
以下实验旨在研究保护素在下调白细胞尤其是T细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞活性方面的有效性：
1)炎症刺激后保护素对T细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞下调的体外研究
2)炎症刺激后保护素对仓鼠T细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞下调的体内研究。
通过细菌素治疗细胞内细菌。
生活在细胞内的细菌很难治疗，因为许多抗生素很难通过细胞膜。然而，由于这些疾病(如肺结核、莱姆病(Lyme Disease)、性传播疾病、落基山斑疹热(Rocky MountainSpotted fever)、Q热、军团病(Legionellosis))与炎症有关，HB-EGF细胞受体由受感染的细胞表达，且因此被制造成IQ-TMDD药品的抗生素可被带入受感染的细胞内，有效治疗这些细菌。此外，由于细菌隐藏在包括单核细胞和巨噬细胞在内的白细胞中以长期存活，并且这些细胞高度表达HB-EGF细胞受体，因此通过应用我们的IQ-TMDD技术，使用含有如多西环素、异烟肼(isoniasid)、利福平(rifampicin)等抗生素的细菌素，可以更有效地治疗这些细胞。
实验
进行以下实验：
1)通过用细菌素治疗这些细胞来杀死细菌感染的单核细胞和巨噬细胞的体外研究
2)通过用细菌素治疗这些细胞来杀死细菌感染的内皮细胞的体外研究
3)对细菌感染动物(仓鼠)通过用细菌素治疗这些动物来杀死细菌的体内研究。
L.瓦第汀
1)与Doxil-脂质体相比，在AML癌症患者的细胞和缺氧血管内皮细胞的细胞中研究了瓦第汀的体外功效
2)在既定癌症仓鼠模型(见上文)中研究了瓦第汀的体内功效。
3)以及最终研究了瓦第汀在人体中的功效。
CRM197靶向成像
目标
IQ靶向MRI显像剂CTscan的开发能够以高选择性内化到癌细胞、癌症微环境的白细胞和癌症脉管系统的内皮细胞中，提高了癌症的成像质量。
此外，IQ靶向放射性标记的开发也增强了这些化合物在癌症患者中的诊断和治疗功效。
癌症的精确成像
全身和局部身体成像的可能性
全身成像对于研究患者癌症和炎症性疾病的空间定位是必要的。这可以通过多种方式实现：
1)通过应用连接到IQ-(CRM197)靶向显像剂上或掺入IQ靶向Saint-O-Somes(SOS)中的放射性核素。
2)通过应用连接到靶向剂(CRM197)上或掺入IQ靶向SOS-脂质体中的顺磁性离子，如钆(Gd)。
1)施用IQ-靶向钆，然后进行MRI
钆在室温下是顺磁性的。顺磁性离子可提高核弛豫率，这使得钆可以用于磁共振成像(MRI)。有机钆复合物的溶液用作静脉内MRI造影剂，以增强医学磁共振成像和磁共振血管造影(MRA)程序中的图像。
在本申请中，Gd与DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)或可比的复合化合物复合并静脉内注射。在这种情况下，Gd化合物留在细胞外。本发明的IQ靶向方法提供了Gd被靶细胞(癌细胞和炎症细胞)内化的可能性。
在此类靶向显像剂中应用Gd有两种选择：
Gd3+与优选的DOTA(十二烷-四乙酸)复合并随后与CRM197直接偶联(通过SATA试剂成为硫酯)将提供MRI显像剂(参见图2b，其中点部分代表GD)。
这个程序的缺点是CRM197将涂有DOTA-Gd，这将降低HB-EGF受体的亲和力。
将Gd复合物(优选是大环DOTA)并入IQ-SOS。避免许多分子与CRM197结合将防止对HB-EGF的结合亲和力降低。此外，由于可以通过IQ-Gd-SOS脂质体在靶部位递送更多Gd，因此成像可以得到显著增强。这是有益的，因为MRI具有大约10-6mol的对比敏感度。此外，IQ-Gd-SOS将被靶组织吸收，并且由于Gd复合物是亲水性的，这将在这个组织中停留更长的时间，从而增强靶信号与环境信号之间的差异。IQ-Gd-SOS的另一个优点是将Gd掺入SOS中，这将降低Gd的全身毒性。图2c显示了用于MRI成像的含有钆(Gd)的IQ(CRM197)靶向SOS脂质体。
通过IQ-SOS-(Gd-NIRF)双标记试剂将非放射性全身成像和图像引导手术相结合，其优点是可以与区域(荧光)图像引导手术一起用于诊断性全身成像。此外，可以用于全身和局部身体成像的非放射性试剂的应用可能是有利的。优选地，此类试剂含有MRI可检测化合物(例如Gd)和荧光染料(如CF790、或AlexaFluor790、或NIRF染料)。荧光基团的发射波长优选在近红外(750-900nm)，因为这些试剂具有最大的临床转化潜力，由于在>750nm的激发波长下缺乏自发荧光而提供最低的背景，且因此具有最大的灵敏度。
IQ-靶向-SOS-显像剂优选包含以下部分：
a)含有与DOTA复合的Gd的SOS脂质体
b)含有掺入的荧光染料，如CF790或AlexaFluor790的SOS脂质体
c)以CRM197为靶向剂的外部标记的SOS脂质体。
用于非放射性IQ-SOS-(Gd)(CCscan)癌症显像剂的工作计划
对于癌症的全身和局部身体精确MRI成像，我们将在此处描述含有Gd的非放射性和靶向药物的开发：
我们优先开发IQ-SOS显像剂，因为Gd直接连接到CRM197会降低其对转运受体的亲和力。因此，以下工作计划是基于IQ-SOS显像剂的开发。
1)制备IQ-Gd-SOS剂(CCscan)：
a)将与DOTA复合的Gd掺入SOS脂质体中
b)将CRM197后插入所制备的SOS
2)研究癌细胞(DDT-MF2)和(适用时)炎性内皮细胞对CCscan的体外摄取，以及用DDT-MF2细胞评估CCscan的体外光学性质。
3)CCscan对植入了DDT-MF2癌细胞的仓鼠进行静脉内施用后的体内生物分布研究。空间身体定位可以通过MRI和局部通过检测NIRF发射来估计。24小时后，处死动物后收集器官，并在细胞溶解后测量荧光。
单核细胞和树突细胞在MS-狨猴中的脑渗透(MS-脑斑块成像)
在患有多发性硬化症(MS)的狨猴中进行的实验表明，在静脉内注射后，CRM-FITC已被血液隔室中的白细胞吸收并转运到狨猴大脑中的MS病灶。
结果表明，树突细胞能够在脑发炎后迁移到脑中。这是通过血脑屏障(位于脑中最小的血管)、脉络丛(位于脑中的脑室)和脑膜血管(位于脑外部)发生的。在非炎症条件下，这种迁移非常少，但在MS等炎症条件下，这种迁移会大大增强。
实体癌的体内成像，包括其癌症微环境(CME)
对在颈部植入癌细胞(DDT-MF2)的仓鼠进行的实验表明，标有99mTc的CRM197靶向这种癌症。这已通过SPECT扫描和CT扫描进行了研究(见随附图式)。将99mTc-CRM197施用到这些仓鼠的腹部。可以看出，在16小时后，除了在癌症中积累之外，放射性存在于腹部，而且还存在于这些动物的肾脏和膀胱中。这意味着99mTc-CRM197也相对较快地被肾脏排泄，这对于辐射暴露很重要。
由于CME中的细胞主要是白细胞，并且都不同程度地表达HB-EGF，这意味着癌细胞和CME都会被CRM197-靶向成像所成像。
成像结论
将GD制造成IQ-SOS将创造出一种强大的MRI显像剂，从而提高癌症患者的成像质量。而且，这样的组合不含放射性物质，并且可以提前制备。据调查，没有专利覆盖CRM197作为放射性显像剂、MRI显像剂或荧光显像剂的应用。
疗法结论
IQ技术还可以用于诊断和治疗放射性标记的靶向递送，包括α发射剂、β发射剂和γ发射剂。这些可以在化学疗法和免疫疗法之后应用。
非戈汀
非戈替尼的血浆半衰期为7小时。通过抑制JAK1，它的IC50为629nM或297ng/ml，并且在人类全血中对JAK1的选择性比对JAK2依赖性信号传导的选择性高30倍。通过羧酸酯酶介导的代谢物(t1/2＝19小时)具有活性，并表现出与母体化合物相似的JAK1选择性概况，尽管效力大大降低(IC50：11.9nM或4,529ng/mL)。非戈替尼被酯酶快速转化为其活性代谢物GS-829845，这两种化合物均可进入靶细胞。非戈汀的应用将非戈替尼递送到靶细胞中，避免了血液隔室中的代谢。此外，细胞摄取不再依赖于亲脂性(和蛋白质结合)，而是依赖于受体介导的摄取速率。随后，非戈替尼的细胞内可用性取决于其核内体/溶酶体降解和细胞内酯酶，这也决定了非戈替尼和其代谢物GS-829845的细胞内可用性。非戈替尼对治疗溃疡性结肠炎也有效。它提供了对例如类风湿性关节炎的更高治疗功效，剂量较低，且副作用较小。
方法
通过实时定量PCR估计JAK1-mRNA
用Trizol(Invitrogen)提取总RNA。来自每个样品的200ng总RNA用于IlluminamRNA剖析。对于实时qPCR分析，使用oligo dT和Superscriptase III(Life Technologies)将总RNA逆转录成cDNA，并使用SYBR green PCR在7900HT实时PCR系统(AppliedBiosystems，加利福尼亚州)上一式三份地进行实时qPCR。
IL-1α,β产生的估计
IL-1α和IL1-β由Eliza估计。IL-1α作为生物活性前体组成性存在于多种细胞内。它存在于例如肺的上皮细胞、皮肤的角质形成细胞和血管内皮细胞中。在导致细胞死亡的坏死过程中，释放出具有生物活性的IL-1α前体。此外，IL-1α也存在于单核细胞和B淋巴细胞的表面。IL-1β由更特定的细胞亚群产生；它是单核细胞、组织巨噬细胞和树突细胞的产物。
干扰素诱导的STAT1磷酸化的估计
STAT1磷酸化由IFN-α和IFN-γ诱导。STAT1 U2OS细胞(Invitrogen，目录号K1469)与化合物在37βC下预温育1小时，用30,000U/ml IFN-αB2(PBL IFN来源，目录号11115-1)或20ng/ml IFN-γ(PeproTech，目录号300-02，批号010827)在37βC下处理1小时，根据制造商的方案溶解(含有2nM Tb-Ab的溶解缓冲液；Invitrogen)，并在室温下温育60分钟。通过时间分辨荧光共振能量转移(PerkinElmer)检测pSTAT1。
人类JAK1-mRNA
下面给出了人类JAK1-mRNA的氨基酸序列：
JAK1-siRNA
用于人JAK1-mRNA的ON-TARGETplus SMARTpool小干扰RNA(siRNA)或与非靶向或GAPDH阴性对照siRNA将从Dharmacon获得。
SEQUENCE LISTING
<110> CRM 医疗有限公司
<120> 靶向介导的内吞药物递送
<130> 100537PC
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 750
<212> DNA
<213> plasmid
<221> amytin
<400> 1
MetGlyLysSerGluSerGlnMetAspIle ThrAspIleAsnThrProLysProLysLysLysGlnArgTrpThrProLeuGluIleSer LeuSerValLeuValLeuLeuLeuThrIleIleAlaValThrMetIleAlaLeuTyrAla ThrTyrAspAspGlyIleCysLysSerSer 60
AspCysIleLysSerAlaAlaArgLeuIle GlnAsnMetAspAlaThrThrGluProCysThrAspPhePheLysTyrAlaCysGlyGly TrpLeuLysArgAsnValIleProGluThrSerSerArgTyrGlyAsnPheAspIleLeu ArgAspGluLeuGluValValLeuLysAsp 120
ValLeuGlnGluProLysThrGluAspIle ValAlaValGlnLysAlaLysAlaLeuTyrArgSerCysIleAsnGluSerAlaIleAsp SerArgGlyGlyGluProLeuLeuLysLeuLeuProAspIleTyrGlyTrpProValAla ThrGluAsnTrpGluGlnLysTyrGlyAla 180
SerTrpThrAlaGluLysAlaIleAlaGln LeuAsnSerLysTyrGlyLysLysValLeuIleAsnLeuPheValGlyThrAspAspLys AsnSerValAsnHisValIleHisIleAspGlnProArgLeuGlyLeuProSerArgAsp TyrTyrGluCysThrGlyIleTyrLysGlu 240
AlaCysThrAlaTyrValAspPheMetIle SerValAlaArgLeuIleArgGlnGluGluArgLeuProIleAspGluAsnGlnLeuAla LeuGluMetAsnLysValMetGluLeuGluLysGluIleAlaAsnAlaThrAlaLysPro GluAspArgAsnAspProMetLeuLeuTyr 300
AsnLysMetThrLeuAlaGlnIleGlnAsn AsnPheSerLeuGluIleAsnGlyLysProPheSerTrpLeuAsnPheThrAsnGluIle MetSerThrValAsnIleSerIleThrAsnGluGluAspValValValTyrAlaProGlu TyrLeuThrLysLeuLysProIleLeuThr 360
LysTyrSerAlaArgAspLeuGlnAsnLeu MetSerTrpArgPheIleMetAspLeuValSerSerLeuSerArgThrTyrLysGluSer ArgAsnAlaPheArgLysAlaLeuTyrGlyThrThrSerGluThrAlaThrTrpArgArg CysAlaAsnTyrValAsnGlyAsnMetGlu 420
AsnAlaValGlyArgLeuTyrValGluAla AlaPheAlaGlyGluSerLysHisValValGluAspLeuIleAlaGlnIleArgGluVal PheIleGlnThrLeuAspAspLeuThrTrpMetAspAlaGluThrLysLysArgAlaGlu GluLysAlaLeuAlaIleLysGluArgIle 480
GlyTyrProAspAspIleValSerAsnAsp AsnLysLeuAsnAsnGluTyrLeuGluLeuAsnTyrLysGluAspGluTyrPheGluAsn IleIleGlnAsnLeuLysPheSerGlnSerLysGlnLeuLysLysLeuArgGluLysVal AspLysAspGluTrpIleSerGlyAlaAla 540
ValValAsnAlaPheTyrSerSerGlyArg AsnGlnIleValPheProAlaGlyIleLeuGlnProProPhePheSerAlaGlnGlnSer AsnSerLeuAsnTyrGlyGlyIleGlyMetValIleGlyHisGluIleThrHisGlyPhe AspAspAsnGlyArgAsnPheAsnLysAsp 600
GlyAspLeuValAspTrpTrpThrGlnGln SerAlaSerAsnPheLysGluGlnSerGlnCysMetValTyrGlnTyrGlyAsnPheSer TrpAspLeuAlaGlyGlyGlnHisLeuAsnGlyIleAsnThrLeuGlyGluAsnIleAla AspAsnGlyGlyLeuGlyGlnAlaTyrArg 660
AlaTyrGlnAsnTyrIleLysLysAsnGly GluGluLysLeuLeuProGlyLeuAspLeuAsnHisLysGlnLeuPhePheLeuAsnPhe AlaGlnValTrpCysGlyThrTyrArgProGluTyrAlaValAsnSerIleLysThrAsp ValHisSerProGlyAsnPheArgIleIle 720
GlyThrLeuGlnAsnSerAlaGluPheSer GluAlaPheHisCysArgLysAsnSerTyrMetAsnProGluLysLysCysArgValTrp 750
<210> 2
<211> 121
<212> DNA
<213> plasmid
<221> Apoptin
<400> 2
MetAsnAlaLeuGlnGluAspThrProPro GlyProSerThrValPheArgProProThrSerSerArgProLeuGluThrProHisCys ArgGluIleArgIleGlyIleAlaGlyIleThrIleThrLeuSerLeuCysGlyCysAla AsnAlaArgAlaProThrLeuArgSerAla 60
ThrAlaAspAsnSerGluSerThrGlyPhe LysAsnValProAspLeuArgThrAspGlnProLysProProSerLysLysArgSerCys AspProSerGluTyrArgValSerGluLeuLysGluSerLeuIleThrThrThrProSer ArgProArgThrAlaLysArgArgIleArg 120
Leu 121
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> plasmid
<221> glatimar-acetate
<400> 3
GluAlaTyrLysAlaAlaGluLysAlaTyr AlaAlaLysGluAlaAlaLysAlaLysAlaGluLysLysAlaAlaTyrAlaLysAlaLys AlaAlaLysTyrGluLysLysAlaLysLys AlaAla 42
<210> 4
<211> 1154
<212> DNA
<213> plasmid
<400> 4
MetGlnTyrLeuAsnIleLysGluAspCys AsnAlaMetAlaPheCysAlaLysMetArgSerSerLysLysThrGluValAsnLeuGlu AlaProGluProGlyValGluValIlePheTyrLeuSerAspArgGluProLeuArgLeu GlySerGlyGluTyrThrAlaGluGluLeu 60
CysIleArgAlaAlaGlnAlaCysArgIle SerProLeuCysHisAsnLeuPheAlaLeuTyrAspGluAsnThrLysLeuTrpTyrAla ProAsnArgThrIleThrValAspAspLysMetSerLeuArgLeuHisTyrArgMetArg PheTyrPheThrAsnTrpHisGlyThrAsn 120
AspAsnGluGlnSerValTrpArgHisSer ProLysLysGlnLysAsnGlyTyrGluLysLysLysIleProAspAlaThrProLeuLeu AspAlaSerSerLeuGluTyrLeuPheAlaGlnGlyGlnTyrAspLeuValLysCysLeu AlaProIleArgAspProLysThrGluGln 180
AspGlyHisAspIleGluAsnGluCysLeu GlyMetAlaValLeuAlaIleSerHisTyrAlaMetMetLysLysMetGlnLeuProGlu LeuProLysAspIleSerTyrLysArgTyrIleProGluThrLeuAsnLysSerIleArg GlnArgAsnLeuLeuThrArgMetArgIle 240
AsnAsnValPheLysAspPheLeuLysGlu PheAsnAsnLysThrIleCysAspSerSerValSerThrHisAspLeuLysValLysTyr LeuAlaThrLeuGluThrLeuThrLysHisTyrGlyAlaGluIlePheGluThrSerMet LeuLeuIleSerSerGluAsnGluMetAsn 300
TrpPheHisSerAsnAspGlyGlyAsnVal LeuTyrTyrGluValMetValThrGlyAsnLeuGlyIleGlnTrpArgHisLysProAsn ValValSerValGluLysGluLysAsnLysLeuLysArgLysLysLeuGluAsnLysHis LysLysAspGluGluLysAsnLysIleArg 360
GluGluTrpAsnAsnPheSerTyrPhePro GluIleThrHisIleValIleLysGluSerValValSerIleAsnLysGlnAspAsnLys LysMetGluLeuLysLeuSerSerHisGluGluAlaLeuSerPheValSerLeuValAsp GlyTyrPheArgLeuThrAlaAspAlaHis 420
HisTyrLeuCysThrAspValAlaProPro LeuIleValHisAsnIleGlnAsnGlyCysHisGlyProIleCysThrGluTyrAlaIle AsnLysLeuArgGlnGluGlySerGluGluGlyMetTyrValLeuArgTrpSerCysThr AspPheAspAsnIleLeuMetThrValThr 480
CysPheGluLysSerGluGlnValGlnGly AlaGlnLysGlnPheLysAsnPheGlnIleGluValGlnLysGlyArgTyrSerLeuHis GlySerAspArgSerPheProSerLeuGlyAspLeuMetSerHisLeuLysLysGlnIle LeuArgThrAspAsnIleSerPheMetLeu 540
LysArgCysCysGlnProLysProArgGlu IleSerAsnLeuLeuValAlaThrLysLysAlaGlnGluTrpGlnProValTyrProMet SerGlnLeuSerPheAspArgIleLeuLysLysAspLeuValGlnGlyGluHisLeuGly ArgGlyThrArgThrHisIleTyrSerGly 600
ThrLeuMetAspTyrLysAspAspGluGly ThrSerGluGluLysLysIleLysValIleLeuLysValLeuAspProSerHisArgAsp IleSerLeuAlaPhePheGluAlaAlaSerMetMetArgGlnValSerHisLysHisIle ValTyrLeuTyrGlyValCysValArgAsp 660
ValGluAsnIleMetValGluGluPheVal GluGlyGlyProLeuAspLeuPheMetHisArgLysSerAspValLeuThrThrProTrp LysPheLysValAlaLysGlnLeuAlaSerAlaLeuSerTyrLeuGluAspLysAspLeu ValHisGlyAsnValCysThrLysAsnLeu 720
LeuLeuAlaArgGluGlyIleAspSerGlu CysGlyProPheIleLysLeuSerAspProGlyIleProIleThrValLeuSerArgGln GluCysIleGluArgIleProTrpIleAlaProGluCysValGluAspSerLysAsnLeu SerValAlaAlaAspLysTrpSerPheGly 780
ThrThrLeuTrpGluIleCysTyrAsnGly GluIleProLeuLysAspLysThrLeuIleGluLysGluArgPheTyrGluSerArgCys ArgProValThrProSerCysLysGluLeuAlaAspLeuMetThrArgCysMetAsnTyr AspProAsnGlnArgProPhePheArgAla 840
IleMetArgAspIleAsnLysLeuGluGlu GlnAsnProAspIleValSerGluLysLysProAlaThrGluValAspProThrHisPhe GluLysArgPheLeuLysArgIleArgAspLeuGlyGluGlyHisPheGlyLysValGlu LeuCysArgTyrAspProGluGlyAspAsn 900
ThrGlyGluGlnValAlaValLysSerLeu LysProGluSerGlyGlyAsnHisIleAlaAspLeuLysLysGluIleGluIleLeuArg AsnLeuTyrHisGluAsnIleValLysTyrLysGlyIleCysThrGluAspGlyGlyAsn GlyIleLysLeuIleMetGluPheLeuPro 960
SerGlySerLeuLysGluTyrLeuProLys AsnLysAsnLysIleAsnLeuLysGlnGlnLeuLysTyrAlaValGlnIleCysLysGly MetAspTyrLeuGlySerArgGlnTyrValHisArgAspLeuAlaAlaArgAsnValLeu ValGluSerGluHisGlnValLysIleGly 1030
AspPheGlyLeuThrLysAlaIleGluThr AspLysGluTyrTyrThrValLysAspAspArgAspSerProValPheTrpTyrAlaPro GluCysLeuMetGlnSerLysPheTyrIleAlaSerAspValTrpSerPheGlyValThr LeuHisGluLeuLeuThrTyrCysAspSer 1080
AspSerSerProMetAlaLeuPheLeuLys MetIleGlyProThrHisGlyGlnMetThrValThrArgLeuValAsnThrLeuLysGlu GlyLysArgLeuProCysProProAsnCysProAspGluValTyrGlnLeuMetArgLys CysTrpGluPheGlnProSerAsnArgThr 1140
SerPheGlnAsnLeuIleGluGlyPheGlu AlaLeuLeuLys 1154
<210> 5
<211> 2281
<212> mRNA
<213> mRNA
<400> 5
ggaattactt gcagggctaa cctagtgcct atagctaagg caggtacctg catccttgtt 60
tttgtttagt ggatcctcta tccttcagag actctggaac ccctgtggtc ttctcttcat 120
ctaatgaccc tgaggggatg gagttttcaa gtccttccag agaggaatgt cccaagcctt 180
tgagtagggt aagcatcatg gctggcagcc tcacaggatt gcttctactt caggcagtgt 240
cgtgggcatc aggtgcccgc ccctgcatcc ctaaaagctt cggctacagc tcggtggtgt 300
gtgtctgcaa tgccacatac tgtgactcct ttgacccccc gacctttcct gcccttggta 360
ccttcagccg ctatgagagt acacgcagtg ggcgacggat ggagctgagt atggggccca 420
tccaggctaa tcacacgggc acaggcctgc tactgaccct gcagccagaa cagaagttcc 480
agaaagtgaa gggatttgga ggggccatga cagatgctgc tgctctcaac atccttgccc 540
tgtcaccccc tgcccaaaat ttgctactta aatcgtactt ctctgaagaa ggaatcggat 600
ataacatcat ccgggtaccc atggccagct gtgacttctc catccgcacc tacacctatg 660
cagacacccc tgatgatttc cagttgcaca acttcagcct cccagaggaa gataccaagc 720
tcaagatacc cctgattcac cgagccctgc agttggccca gcgtcccgtt tcactccttg 780
ccagcccctg gacatcaccc acttggctca agaccaatgg agcggtgaat gggaaggggt 840
cactcaaggg acagcccgga gacatctacc accagacctg ggccagatac tttgtgaagt 900
tcctggatgc ctatgctgag cacaagttac agttctgggc agtgacagct gaaaatgagc 960
cttctgctgg gctgttgagt ggatacccct tccagtgcct gggcttcacc cctgaacatc 1020
agcgagactt cattgcccgt gacctaggtc ctaccctcgc caacagtact caccacaatg 1080
tccgcctact catgctggat gaccaacgct tgctgctgcc ccactgggca aaggtggtac 1140
tgacagaccc agaagcagct aaatatgttc atggcattgc tgtacattgg tacctggact 1200
ttctggctcc agccaaagcc accctagggg agacacaccg cctgttcccc aacaccatgc 1260
tctttgcctc agaggcctgt gtgggctcca agttctggga gcagagtgtg cggctaggct 1320
cctgggatcg agggatgcag tacagccaca gcatcatcac gaacctcctg taccatgtgg 1380
tcggctggac cgactggaac cttgccctga accccgaagg aggacccaat tgggtgcgta 1440
actttgtcga cagtcccatc attgtagaca tcaccaagga cacgttttac aaacagccca 1500
tgttctacca ccttggccac ttcagcaagt tcattcctga gggctcccag agagtggggc 1560
tggttgccag tcagaagaac gacctggacg cagtggcact gatgcatccc gatggctctg 1620
ctgttgtggt cgtgctaaac cgctcctcta aggatgtgcc tcttaccatc aaggatcctg 1680
ctgtgggctt cctggagaca atctcacctg gctactccat tcacacctac ctgtggcgtc 1740
gccagtgatg gagcagatac tcaaggaggc actgggctca gcctgggcat taaagggaca 1800
gagtcagctc acacgctgtc tgtgactaaa gagggcacag cagggccagt gtgagcttac 1860
agcgacgtaa gcccaggggc aatggtttgg gtgactcact ttcccctcta ggtggtgcca 1920
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AspSerCysIleSerGluLysLeuPheMet GluMetAlaGluLeuMetValSerGluGlyTrpLysAspAlaGlyTyrGluTyrLeuCys IleAspAspCysTrpMetAlaProGlnArgAspSerGluGlyArgLeuGlnAlaAspPro GlnArgPheProHisGlyIleArgGlnLeu 120
AlaAsnTyrValHisSerLysGlyLeuLys LeuGlyIleTyrAlaAspValGlyAsnLysThrCysAlaGlyPheProGlySerPheGly TyrTyrAspIleAspAlaGlnThrPheAlaAspTrpGlyValAspLeuLeuLysPheAsp GlyCysTyrCysAspSerLeuGluAsnLeu 180
AlaAspGlyTyrLysHisMetSerLeuAla LeuAsnArgThrGlyArgSerIleValTyrSerCysGluTrpProLeuTyrMetTrpPro PheGlnLysProAsnTyrThrGluIleArgGlnTyrCysAsnHisTrpArgAsnPheAla AspIleAspAspSerTrpLysSerIleLys 240
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ArgHisIleSerProGlnAlaLysAlaLeu LeuGlnAspLysAspValIleAlaIleAsnGlnAspProLeuGlyLysGlnGlyTyrGln LeuArgGlnGlyAspAsnPheGluValTrpGluArgProLeuSerGlyLeuAlaTrpAla ValAlaMetIleAsnArgGlnGluIleGly 360
GlyProArgSerTyrThrIleAlaValAla SerLeuGlyLysGlyValAlaCysAsnProAlaCysPheIleThrGlnLeuLeuProVal LysArgLysLeuGlyPheTyrGluTrpThrSerArgLeuArgSerHisIleAsnProThr GlyThrValLeuLeuGlnLeuGluAsnThr 420
MetGlnMetSerLeuLysAspLeuLeu 429
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种用于靶向介导的内吞药物递送的复合物，其包含以下各者作为成分
(i)至少一种第一成分，其包含(ia)能够与肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)细胞受体相互作用的靶向分子，所述HB-EGF细胞受体能够在细胞中形成核内体，和
能够在酸性条件下在核内体膜中形成孔的连接到所述靶向分子上的(ib)链，特别是T链，优选连接到所述至少一种靶向分子，
连接到所述第一成分上的(ii)至少一种第二成分，所述第二成分包含脂质体，所述至少一种脂质体包封
(iia)一数量的至少一种活性化合物，其选自(iia1)荧光化合物、(iia2)同位素、(iia3)铁磁性化合物、(iia4)亚铁磁性化合物、(iia5)亲脂性化合物以及(iia6)
水溶性化合物，其中所述亲脂性化合物(iia5)和/或水溶性化合物(iia6)选自引起DNA链断裂的化合物，或通过嵌入和抑制大分子生物合成而与DNA相互作用的化合物，特别是选自(iia5,6)细胞抑制药物和细胞溶解药物，例如蒽环类药物，例如多索汀(doxotin)、柔红霉素(Daunorubicin)和多柔比星(doxorubicin)、长春花碱(vinblastin)、多西紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、凋亡素(apoptin)、HIV-tin、阿米汀(amytin)、考帕索汀(copaxotin)、泼尼汀(prednitin)、来索汀(lysotin)、保护素(protectin)、2-酰胺基苯并咪唑、加多汀(gadotin)、非戈汀(filgotin)和细菌素(bacteriotin)；(iia5,6)基因或其序列；(iia5,6)蛋白质；以及(iia5,6)RNA序列，其中所述序列具有<30个核苷酸，
其中所述至少一种脂质体选自SAINT分子、包含SAINT分子的分子，
其中所述至少一种脂质体包含5-65重量％的活性化合物。
2.根据权利要求1所述的复合物，其中所述第一成分包含蛋白质(A-部分)，所述蛋白质具有>40kDa，优选>50kDa，例如>55kDa的分子量，并且优选具有<100kDa，优选<70kDa，例如<65kDa的分子量，并且优选连接到所述链上。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的复合物，其中所述靶向分子包含白喉毒素的无毒突变体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的复合物，其包含作为第三成分的间隔物，所述间隔物连接到所述脂质体和所述第一成分上，例如连接到所述链或所述蛋白质上，优选是具有>400Da，例如>1kDa的分子量的间隔物，优选是PEG-间隔物，例如PEG 2000。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的复合物，其包含2至100个第一成分/第二成分，优选10至90个第一成分/第二成分，更优选20至80个，例如40至70个第一成分/第二成分。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的复合物，其用于治疗癌症，例如实体癌、白细胞疾病、溶酶体贮积病、病毒性疾病、移植和与炎症相关的疾病，特别是寻常痤疮，过敏、阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease)、强直性脊柱炎、哮喘、动脉粥样硬化；自身免疫疾病，例如乳糜泻、1型糖尿病、格雷夫斯病(Graves'disease)、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、(类风湿)关节炎和系统性红斑狼疮；自身炎症性疾病，例如家族性地中海病、口糜、咽炎和宫颈腺炎，其它没有明确遗传原因的自身炎症性疾病，包括成人发作型斯蒂尔病(adult-onset Still's disease)、全身性发作型幼年型特发性关节炎、施尼茨勒综合征(Schnitzler syndrome)和慢性复发性多灶性骨髓炎、慢性前列腺炎、克罗恩病(Crohn'sdisease)、皮炎、憩室炎、脑炎、纤维肌痛、肾小球肾炎、肝炎、化脓性汗腺炎、HIV/AIDS、超敏反应、炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、间质性膀胱炎、扁平苔藓、白细胞缺陷、肥大细胞活化综合征、肥大细胞增多症、脑膜炎、肌病、肾炎、耳炎、帕金森病(Parkinson'sdisease)、盆腔炎性疾病、胰腺炎、再灌注损伤、风湿热、类风湿性关节炎、鼻炎、结节病、移植排斥、溃疡性结肠炎、血管炎、脑淀粉样血管病、HCHWA-D、多发性硬化症和COVID-19。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的复合物，用于涉及通过细胞屏障的药物递送。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的复合物，其中所述靶向分子对所述HB-EGF受体具有<10-6摩尔，优选<10-8摩尔的解离常数Kd。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的复合物，其中所述至少一种靶向分子和/或至少一种脂质体不与内源性配体相互作用。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的复合物，其中所述至少一种活性化合物选自(iia1)荧光化合物，例如花青；(iia2)同位素，例如选自由以下组成的群组的放射性核素：64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、70Ga、72Ga、89Zr、90Y、95Zr、99mTc、111In、114In、123I、124I、153Gd、159Gd和177Lu，其中所述放射性核素任选地作为阳离子存在，例如具有0、1、2、3、4、6或7的价态，例如Cu+、Cu2+、Cu3+、Cu4+、Ga+、Ga2+、Ga3+、Gd+、Gd2+、Gd3+、I+、I3+、In+、In2+、In3+、Lu3+、Tc4+、Tc6+、Tc7+、Zr+、Zr2+、Zr3+、Zr4+、Y2+和Y3+；(iia3)铁磁性化合物，例如Fe、Co、Ni、Gd和其组合；包含磁性组分(A,B)的合金，其中组分A和/或组分B包含至少一种选自第3至12族、第4至6周期元素的磁性材料，例如Fe、Co、Ni、Gd和其组合，例如FePd、FeCo和FePt，和/或其中组分A和/或组分B包含的材料选自镧系元素、钪、钇和其组合，例如选自Sc、Y、Sm、Gd、Dy、Ho、Er、Yb、Tb，例如Tb，和其组合；以及(iia4)亚铁磁性化合物；以及来自亚铁磁性化合物的合金。
11.根据权利要求10所述的复合物，其用于成像，例如磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和荧光。
12.根据权利要求10所述的复合物，其用于手术或治疗，例如去除组织，例如去除癌组织。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的复合物，其中所述第一成分是CRM197。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的复合物，其中所述至少一种脂质体包含10至60重量％的活性化合物，优选20至50重量％的活性化合物，更优选30至50重量％的活性化合物，例如40至45重量％的活性化合物，其中百分比是基于所述脂质体和活性化合物的总重量。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的复合物，其中所述至少一种脂质体选自SAINT18和saint-O-Somes。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的复合物，其中至少一种水溶性活性化合物具有>0.1摩尔/升，优选>0.5摩尔/升的水溶解度，或者其中至少一种亲脂性活性化合物具有>0.1摩尔/升，优选>0.5摩尔/升的己烷溶解度。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的复合物，其中所述至少一种活性化合物具有<10kDa，优选<5kDa，例如<2kDa的分子量。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的复合物，其包含第一活性化合物，其中所述第一活性化合物使细胞处于转化状态，例如多索汀、多柔比星、长春花碱、多西紫杉醇、紫杉醇(踢(KICK))；和/或包含第二活性化合物，其中所述第二活性化合物诱导细胞凋亡，特别是所转化细胞的凋亡，例如凋亡素(杀(KILL))。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的复合物，其中所述至少一种脂质体通过以下方式获得
-在非质子溶液中与间隔物反应，例如摩尔比为1:4:18:37:40的Mal-PEG2000-DSPE、DSPE-PEG2000、SAINT-C-18、POPC和胆固醇在氯仿:甲醇(9:1，v/v)中，由此提供脂质混合物，
-干燥所述脂质混合物，例如在减压氮气下，
-使所干燥的脂质混合物水合，例如在缓冲液中，例如pH为6至9，特别是pH 6.7，所述缓冲液包含活性化合物，例如凋亡素、基因或mRNA，由此将所述活性化合物掺入所述脂质体，例如Saint-O-some(SOS)中，
-对所获得的脂质体定大小，例如通过聚碳酸酯过滤器挤出，所述过滤器例如具有60-100nm，例如80nm的孔径，优选使用高压挤出机，以及
-温育所挤出的脂质体以将CRM197-PEG2000-DSPE转移到所述SOS中，并且任选地
-纯化所温育的复合物，例如在Sepharose柱上，并且任选地通过挤出对所述复合物进行灭菌，例如通过0.22μm过滤器。
20.至少一种剂量，其包含根据权利要求1至19中任一项所述的复合物。
21.根据权利要求20所述的至少一种剂量，其包含每毫升癌症0.01至1mg根据权利要求1至15中任一项所述的复合物，优选0.02至0.1mg/ml，例如0.04至0.07mg/ml。
22.根据权利要求20至21中任一项所述的至少一种剂量，其用于治疗肿瘤；白细胞疾病；病毒感染，例如HIV感染；以及白细胞，特别是巨噬细胞和单核细胞。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的至少两种剂量，至少一种第一剂量包含能够使细胞处于转化状态的第一活性化合物，而至少一种第二剂量包含用于诱导所转化细胞的凋亡的第二活性化合物。
24.根据权利要求23所述的至少两种剂量，其中所述第一活性化合物选自引起DNA链断裂或通过嵌入和抑制大分子生物合成而与DNA相互作用的化合物，如细胞抑制药物和细胞溶解药物，例如蒽环类药物，例如多索汀和多柔比星、长春花碱、多西紫杉醇、紫杉醇和其组合，和/或其中所述第二活性化合物选自凋亡素、AAP1、AAP2、AAP3、AAP4、AAP5、AAP6和其组合。
25.一种施用根据权利要求20至24中任一项所述的剂量或根据权利要求1至16中任一项所述的复合物的方法，其还包括应用局部紫外光、局部X射线辐射、局部热休克或其组合。

Claims (25)

1.一种用于靶向介导的内吞药物递送的复合物，其包含以下各者作为成分
(i)至少一种第一成分，其包含(ia)能够与肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)细胞受体相互作用的靶向分子，所述HB-EGF细胞受体能够在细胞中形成核内体，和
能够在酸性条件下在核内体膜中形成孔的连接到所述靶向分子上的(ib)链，特别是T链，优选连接到所述至少一种靶向分子，
连接到所述第一成分上的(ii)至少一种第二成分，所述第二成分包含脂质体，所述至少一种脂质体包封
(iia)一数量的至少一种活性化合物，其选自(iia1)荧光化合物、(iia2)同位素、(iia3)铁磁性化合物、(iia4)亚铁磁性化合物、(iia5)亲脂性化合物以及(iia6)
水溶性化合物，其中所述亲脂性化合物(iia5)和/或水溶性化合物(iia6)选自引起DNA链断裂的化合物，或通过嵌入和抑制大分子生物合成而与DNA相互作用的化合物，特别是选自(iia5,6)细胞抑制药物和细胞溶解药物，例如蒽环类药物，例如多索汀(doxotin)、柔红霉素(Daunorubicin)和多柔比星(doxorubicin)、长春花碱(vinblastin)、多西紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、凋亡素(apoptin)、HIV-tin、阿米汀(amytin)、考帕索汀(copaxotin)、泼尼汀(prednitin)、来索汀(lysotin)、保护素(protectin)、2-酰胺基苯并咪唑、加多汀(gadotin)、非戈汀(filgotin)和细菌素(bacteriotin)；(iia5,6)基因或其序列；(iia5,6)蛋白质；以及(iia5,6)RNA序列，其中所述序列具有<30个核苷酸。
2.根据权利要求1所述的复合物，其中所述第一成分包含蛋白质(A-部分)，所述蛋白质具有>40kDa，优选>50kDa，例如>55kDa的分子量，并且优选具有<100kDa，优选<70kDa，例如<65kDa的分子量，并且优选连接到所述链上。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的复合物，其中所述靶向分子包含白喉毒素的无毒突变体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的复合物，其包含作为第三成分的间隔物，所述间隔物连接到所述脂质体和所述第一成分上，例如连接到所述链或所述蛋白质上，优选是具有>400Da，例如>1kDa的分子量的间隔物，优选是PEG-间隔物，例如PEG 2000。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的复合物，其包含2至100个第一成分/第二成分，优选10至90个第一成分/第二成分，更优选20至80个，例如40至70个第一成分/第二成分。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的复合物，其用于治疗癌症，例如实体癌、白细胞疾病、溶酶体贮积病、病毒性疾病、移植和与炎症相关的疾病，特别是寻常痤疮，过敏、阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease)、强直性脊柱炎、哮喘、动脉粥样硬化；自身免疫疾病，例如乳糜泻、1型糖尿病、格雷夫斯病(Graves'disease)、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、(类风湿)关节炎和系统性红斑狼疮；自身炎症性疾病，例如家族性地中海病、口糜、咽炎和宫颈腺炎，其它没有明确遗传原因的自身炎症性疾病，包括成人发作型斯蒂尔病(adult-onset Still's disease)、全身性发作型幼年型特发性关节炎、施尼茨勒综合征(Schnitzler syndrome)和慢性复发性多灶性骨髓炎、慢性前列腺炎、克罗恩病(Crohn'sdisease)、皮炎、憩室炎、脑炎、纤维肌痛、肾小球肾炎、肝炎、化脓性汗腺炎、HIV/AIDS、超敏反应、炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、间质性膀胱炎、扁平苔藓、白细胞缺陷、肥大细胞活化综合征、肥大细胞增多症、脑膜炎、肌病、肾炎、耳炎、帕金森病(Parkinson'sdisease)、盆腔炎性疾病、胰腺炎、再灌注损伤、风湿热、类风湿性关节炎、鼻炎、结节病、移植排斥、溃疡性结肠炎、血管炎、脑淀粉样血管病、HCHWA-D、多发性硬化症和COVID-19。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的复合物，用于涉及通过细胞屏障的药物递送。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的复合物，其中所述靶向分子对所述HB-EGF受体具有<10-6摩尔，优选<10-8摩尔的解离常数Kd。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的复合物，其中所述至少一种靶向分子和/或至少一种脂质体不与内源性配体相互作用。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的复合物，其中所述至少一种活性化合物选自(iia1)荧光化合物，例如花青；(iia2)同位素，例如选自由以下组成的群组的放射性核素：64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、70Ga、72Ga、89Zr、90Y、95Zr、99mTc、111In、114In、123I、124I、153Gd、159Gd和177Lu，其中所述放射性核素任选地作为阳离子存在，例如具有0、1、2、3、4、6或7的价态，例如Cu+、Cu2+、Cu3+、Cu4+、Ga+、Ga2+、Ga3+、Gd+、Gd2+、Gd3+、I+、I3+、In+、In2+、In3+、Lu3+、Tc4+、Tc6+、Tc7+、Zr+、Zr2+、Zr3+、Zr4+、Y2+和Y3+；(iia3)铁磁性化合物，例如Fe、Co、Ni、Gd和其组合；包含磁性组分(A,B)的合金，其中组分A和/或组分B包含至少一种选自第3至12族、第4至6周期元素的磁性材料，例如Fe、Co、Ni、Gd和其组合，例如FePd、FeCo和FePt，和/或其中组分A和/或组分B包含的材料选自镧系元素、钪、钇和其组合，例如选自Sc、Y、Sm、Gd、Dy、Ho、Er、Yb、Tb，例如Tb，和其组合；以及(iia4)亚铁磁性化合物；以及来自亚铁磁性化合物的合金。
11.根据权利要求10所述的复合物，其用于成像，例如磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和荧光。
12.根据权利要求10所述的复合物，其用于手术或治疗，例如去除组织，例如去除癌组织。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的复合物，其中所述第一成分是CRM197。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的复合物，其中所述至少一种脂质体包含5至65重量％的活性化合物，优选10至60重量％的活性化合物，更优选20至50重量％的活性化合物，甚至更优选30至50重量％的活性化合物，例如40至45重量％的活性化合物，其中百分比是基于所述脂质体和活性化合物的总重量。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的复合物，其中所述至少一种脂质体选自SAINT分子，例如SAINT18，以及包含SAINT分子的分子，例如saint-O-Somes。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的复合物，其中至少一种水溶性活性化合物具有>0.1摩尔/升，优选>0.5摩尔/升的水溶解度，或者其中至少一种亲脂性活性化合物具有>0.1摩尔/升，优选>0.5摩尔/升的己烷溶解度。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的复合物，其中所述至少一种活性化合物具有<10kDa，优选<5kDa，例如<2kDa的分子量。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的复合物，其包含第一活性化合物，其中所述第一活性化合物使细胞处于转化状态，例如多索汀、多柔比星、长春花碱、多西紫杉醇、紫杉醇(踢(KICK))；和/或包含第二活性化合物，其中所述第二活性化合物诱导所转化细胞的凋亡，例如凋亡素(杀(KILL))。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的复合物，其中所述至少一种脂质体通过以下方式获得
-在非质子溶液中与间隔物反应，例如摩尔比为1:4:18:37:40的Mal-PEG2000-DSPE、DSPE-PEG2000、SAINT-C-18、POPC和胆固醇在氯仿:甲醇(9:1，v/v)中，由此提供脂质混合物，
-干燥所述脂质混合物，例如在减压氮气下，
-使所干燥的脂质混合物水合，例如在缓冲液中，例如pH为6至9，特别是pH 6.7，所述缓冲液包含活性化合物，例如凋亡素、基因或mRNA，由此将所述活性化合物掺入所述脂质体，例如Saint-O-some(SOS)中，
-对所获得的脂质体定大小，例如通过聚碳酸酯过滤器挤出，所述过滤器例如具有60-100nm，例如80nm的孔径，优选使用高压挤出机，以及
-温育所挤出的脂质体以将CRM197-PEG2000-DSPE转移到所述SOS中，并且任选地
-纯化所温育的复合物，例如在Sepharose柱上，并且任选地通过挤出对所述复合物进行灭菌，例如通过0.22μm过滤器。
20.至少一种剂量，其包含根据权利要求1至19中任一项所述的复合物。
21.根据权利要求20所述的至少一种剂量，其包含每毫升癌症0.01至1mg根据权利要求1至15中任一项所述的复合物，优选0.02至0.1mg/ml，例如0.04至0.07mg/ml。
22.根据权利要求20至21中任一项所述的至少一种剂量，其用于治疗肿瘤；白细胞疾病；病毒感染，例如HIV感染；以及白细胞，特别是巨噬细胞和单核细胞。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的至少两种剂量，至少一种第一剂量包含能够使细胞处于转化状态的第一活性化合物，而至少一种第二剂量包含用于诱导所转化细胞的凋亡的第二活性化合物。
24.根据权利要求23所述的至少两种剂量，其中所述第一活性化合物选自引起DNA链断裂或通过嵌入和抑制大分子生物合成而与DNA相互作用的化合物，如细胞抑制药物和细胞溶解药物，例如蒽环类药物，例如多索汀和多柔比星、长春花碱、多西紫杉醇、紫杉醇和其组合，和/或其中所述第二活性化合物选自凋亡素、AAP1、AAP2、AAP3、AAP4、AAP5、AAP6和其组合。
25.一种施用根据权利要求20至24中任一项所述的剂量或根据权利要求1至16中任一项所述的复合物的方法，其还包括应用局部紫外光、局部X射线辐射、局部热休克或其组合。
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