ES2662326T5 - Vesículas de suministro terapéutico - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓN
Vesículas de suministro terapéutico
Campo técnico
La presente invención se refiere, entre otras cosas, a exosomas de suministro terapéutico que comprenden constructos polipeptídicos, métodos para producir dichos exosomas de suministro terapéutico, composiciones farmacéuticas y usos médicos de los mismos.
Estado de la técnica
Los exosomas y microvesículas son vesículas unidas a la membrana que se diferencian con base en su proceso de biogénesis y propiedades biofísicas, incluyendo el tamaño y los marcadores de proteínas de la superficie. Los exosomas son partículas pequeñas homogéneas que varían de 40 a 150 nm de tamaño y se derivan normalmente de la ruta de reciclado endocítico. En la endocitosis, se forman vesículas endocíticas en la membrana plasmática y se fusionan para formar endosomas tempranos. Estos maduran y llegan a convertirse en endosomas tardíos en los que las vesículas intraluminales brotan en un lumen intravesicular. En vez de fusionarse con el lisosoma, estos cuerpos multivesiculares se fusionan directamente con la membrana plasmática y liberan exosomas en el espacio extracelular. La biogénesis de exosomas, la clasificación de la carga de proteína, y la liberación implican al complejo de clasificación endosomal requerido para el transporte (complejo ESCRT) y otras proteínas asociadas, tales como Alix y Tsg101.
En contraste, otro tipo de vesículas extracelulares, a saber, microvesículas, se producen directamente a través del brote hacia el exterior y la fisión de las vesículas de membrana de la membrana plasmática, y por lo tanto, sus marcadores de superficie dependen en gran medida de la composición de la membrana de origen. Además, tienden a constituir una población más grande y heterogénea de vesículas extracelulares, que varían de 150 a 1.000 nm de diámetro. Sin embargo, se ha demostrado que ambos tipos de vesículas proporcionan ARNm, miARN y proteínas funcionales a las células receptoras. El Andalousi et al., 2013, Adv Drug Deliv Rev 65 (3), 391-7 describe cómo exosomas se pueden utilizar para la administración de siRNA dirigidos a través de barreras biológicas.
Para mantener un equilibrio fisiológico en la señalización del receptor y la respuesta existen múltiples receptores tanto en una forma unida a la membrana como en una forma soluble. La forma de la membrana es normalmente capaz de señalizar, mientras que la forma soluble es incompetente para la señalización. La forma soluble se presenta a menudo como la parte extracelular de la forma unida a la membrana. La porción soluble se genera en dos formas diferentes: (1) empalme alternativo del pre-ARNm, y (2) por escisión de las proteasas extracelulares (a menudo metaloproteasas). La forma soluble une su ligando y por lo tanto secuestra al ligando, inhibiendo su unión con la forma unida a la membrana, lo que significa que disminuirá la señalización total a partir de esa ruta. La forma soluble a menudo aumenta cuando la ruta de señalización es muy activa. Por ejemplo, las formas solubles de los dos receptores alfa del factor de necrosis tumoral (TNFRa) aumentan en condiciones patológicas tales como sepsis e inflamación con el fin de reducir el proceso inflamatorio.
Los receptores señuelo han recibido un interés sustancial desde un punto de vista terapéutico, ya que proporcionan un enfoque altamente específico y adaptado para disminuir la concentración fisiológica de una proteína de interés. La modalidad terapéutica depende de la administración de los receptores señuelo para disminuir la actividad de una ruta de señalización particular. Los receptores señuelo a menudo se fusionan con la porción Fc de un anticuerpo para aumentar su semivida y aumentar la avidez de los receptores cuando dos vienen a corta distancia el uno del otro. Un ejemplo de esta estrategia es Etanercept, que es el sTNFR2 fusionado con un fragmento Fc. Etanercept está clínicamente aprobado para el tratamiento de la artritis reumatoide, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante y artritis idiopática juvenil poliarticular moderada a severamente activa, y se ha demostrado que es segura y eficaz en los últimos 19 años desde su aprobación inicial. Varias otras proteínas de fusión del receptor señuelo están en ensayos clínicos, por ejemplo, VEGF, EGF, FGF y angiopoyetina.
Aunque aplicados con éxito en varios contextos terapéuticos y para una amplia serie de dolencias, los receptores señuelo y otros compuestos biológicos (biofarmacéuticos) adolecen de una serie de inconvenientes, por ejemplo relativos a la farmacocinética, toxicidad, farmacodinámica, y eficacia terapéutica.
Resumen de la invención
Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es superar los problemas antes identificados asociados con el uso de productos biológicos, y específicamente receptores señuelo, y para satisfacer las necesidades existentes en la técnica , es decir, proporcionar una eficacia terapéutica optimizada, farmacocinética significativamente mejorada, así como efectos secundarios reducidos de polipéptidos biofarmacéuticos tales como receptores señuelo y compuestos biológicos (productos biofarmacéuticos) en general.
Por lo tanto, la presente invención proporciona, en un primer aspecto, un exosoma para suministro terapéutico que tiene unido a su membrana un constructo polipeptídico, en donde el constructo polipeptídico comprende al menos un polipéptido transportador fusionado a al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico presente al menos presente al menos parcialmente en el exterior del exosoma de suministro y en donde al menos el receptor señuelo del polipéptido terapéutico es incompetente para señalización, es decir, que no es capaz de transmitir las señales que transmite en circunstancias normales. Normalmente, el receptor señuelo se une a y secuestra un ligando circulante o ligando que puede de hecho estar presente en una célula objetivo y/o en la superficie de una célula objetivo. Sin desear estar ligado a ninguna teoría, se supone que un receptor señuelo del polipéptido terapéutico presente en la superficie de un exosoma de suministro terapéutico secuestra a su compañero o compañeros de interacción, es decir, el objetivo y/o ligando, virtualmente en la misma forma que el receptor señuelo del polipéptido libre, aunque con una semivida significativamente mejorada, disminución de los efectos secundarios, y en general una farmacocinética significativamente mejorada, y eficacia terapéutica, en virtud de su unión a un exosoma. Al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico presente en el exosoma de suministro terapéutico puede estar parcial o completamente desprovisto de su dominio de señalización, hasta volver al receptor del polipéptido terapéutico incompetente para señalización, y el dominio de señalización puede ser parcial o completamente reemplazado por el polipéptido transportador, pero la incapacidad para contribuir a la señalización también puede derivarse de alteraciones en la secuencia del polipéptido. Por ejemplo, en diversas realizaciones de la presente invención puede ser suficiente reemplazar ciertos aminoácidos para volver al receptor del polipéptido terapéutico incompetente para señalización, y/o el receptor del polipéptido terapéutico puede volverse incompetente para señalización simplemente uniendo al receptor señuelo con el polipéptido transportador (usando tecnología recombinante) que transporta el constructo polipeptídico completo a la superficie de la vesícula extracelular.
De forma importante, los exosomas pueden tener actividades terapéuticas en sí mismos. Por ejemplo, vesículas derivadas, por ejemplo, de células madre mesenquimales pero también de otras células son conocidas por ser innatamente inmunosupresoras ya que portan varios miARN, proteínas y lípidos bioactivos que, por ejemplo, suprimen las células T citotóxicas y activan la expansión de las células T reguladoras. El efecto represivo sobre el sistema inmune es un requisito previo también para la posterior regeneración tisular después de una lesión del tejido. Por lo tanto, elegir, por ejemplo, una fuente apropiada de células para la derivación de exosomas solo proporcionará una ventaja terapéutica adicional comparado con el uso de anticuerpos señuelos monoclonales del receptor (tales como Etanercept e Infliximab) solamente.
En otros aspectos, la presente invención proporciona exosomas de suministro terapéutico y composiciones farmacéuticas que comprenden los exosomas de acuerdo con la presente invención para uso en medicina, y más específicamente para uso en el tratamiento, alivio y/o profilaxis de diversas enfermedades y trastornos que pueden ser tratados usando productos biofarmacéuticos terapéuticos (productos biológicos).
Por lo tanto, la presente invención se refiere esencialmente al uso de exosomas como vehículos de suministro o administración para productos biofarmacéuticos, específicamente productos biológicos basados en polipéptidos, y más específicamente receptores señuelo (también conocidos como receptores sumidero). La presente invención, por lo tanto, se refiere al uso de exosomas que comprenden diversos polipéptidos, como se define en la presente memoria, en el tratamiento de un gran número de enfermedades y trastornos, como se divulga en este documento.
En aspectos adicionales, la presente invención se refiere a métodos para producir los exosomas de suministro terapéutico de la presente invención. En un segundo aspecto, se proporciona un método para purificar exosomas de suministro terapéutico de acuerdo con el primer aspecto, que comprende las etapas de: (i) exponer una muestra que comprende al menos un exosoma de suministro terapéutico a ultrafiltración; (ii) exponer la muestra obtenible a partir de la etapa (i) a cromatografía líquida de exclusión por tamaño.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos para aumentar el rendimiento de exosomas de acuerdo con el primer aspecto que comprende la exposición de las células (que son la fuente de los exosomas) a inhibidores de la autofagia.
La presente invención proporciona por lo tanto exosomas, métodos y composiciones, así como otros diversos aspectos y formas de realización, para mejorar el suministro, la administración, y las características, por ejemplo, de los agentes polipeptídicos biofarmacéuticos. La presente invención resulta en eficacia terapéutica optimizada (por ejemplo debido a la multivalencia del receptor señuelo del polipéptido terapéutico y los efectos regeneradores terapéuticos inherentes de exosomas mismos), farmacocinética significativamente mejorada (a través, por ejemplo, de menor eliminación renal) biodistribución mejorada a algunos órganos, tales como el cerebro, así como efectos secundarios reducidos de polipéptidos biofarmacéuticos (por ejemplo, a través de fusión con células receptoras para conferir protección celular directa), tales como receptores señuelo y otros tipos de productos biológicos.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la eficacia del tratamiento, en un modelo de colitis de ratón, de exosomas que comprenden un receptor señuelo del polipéptido terapéutico incompetente para señalización, que se compone de un receptor del factor de necrosis tumoral 1 soluble incompetente para señalización (sTNFR1) (que puede ser uno de sTNFR 1A (SEQ ID NO: 30) o sTNFR 1B (SEQ ID NO: 31)), fusionado al polipéptido transportador CD63 (SEQ ID NO: 14). Los exosomas que muestran sTNFR1-CD63 incompetente para señalización tratan con éxito la colitis inducida (línea negra continua) con una pérdida inicial menor de peso corporal. Los exosomas competentes para señalización (línea gris discontinua) muestran una clara eficacia antiterapéutica (línea de puntos de micción) ya que suministran más receptores de señalización a las células, mientras que los ratones tratados en forma simulada (línea punteada) no mostraron ninguna eficacia clínicamente relevante. Los exosomas no modificados (es decir, exosomas desprovisto de cualquier constructo polipeptídico introducido artificialmente) (línea gris larga punteada) también indujeron remisión moderada de la colitis, probablemente debido a sus efectos antiinflamatorios inherentes.
La Figura 2 muestra la confirmación mediante transferencia Western de la presencia, en la superficie exosomal del polipéptido CD63-sTNFR1 utilizado para el tratamiento de la colitis de la Figura 1.
La Figura 3 muestra la actividad neutralizante de los exosomas señuelo sTNFR1 de la Figura 1 en la citotoxicidad mediada por TNFa. Los exosomas que presentan sTNFR1-CD63 incompetente para señalización exhiben una buena neutralización de TNFa en una forma dependiente de la dosis (línea negra continua) y los exosomas que contienen sTNFR1-CD63 competente para señalización son, como en la Figura 1, lo que agrava la respuesta (línea gris discontinua de trazos cortos). Los exosomas sin modificar (línea gris discontinua de trazos largos) también muestran un efecto moderado debido a sus propiedades antiinflamatorias.
La Figura 4 muestra un gráfico sobre los efectos inhibidores del tumor de exosomas que presentan ya sea al receptor del factor de crecimiento endotelial vascular soluble (sVEGFR) (SEQ ID NO: 17) fusionado a CD63 (línea negra continua) o sVEGFR incompetente para señalización fusionado a sindecano (SEQ ID NO: 23-26) (línea negra discontinua). Los ratones tratados con exosomas que comprenden los constructos polipeptídicos anteriores tenía una carga tumoral considerablemente reducida después del tratamiento, mientras que el tratamiento con exosomas que comprenden un polipéptido sVEGFR competente para señalización presentó de nuevo un resultado desmejorado comparado con el control (línea gris discontinua de trazos cortos).
La Figura 5 muestra la eficacia del tratamiento en ratones MDX de exosomas que comprenden la activina receptora del polipéptido señuelo terapéutico (SEQ ID NO: 40-43) fusionada a las proteínas portadoras sindecano (línea negra continua) o sinaptotagmina (SEQ ID NO: 27) (línea gris discontinua de trazos largos). El tratamiento cada dos semanas con los exosomas de suministro terapéutico anteriores dio como resultado un aumento de peso corporal considerablemente mayor que el tratamiento con exosomas no modificados y el tratamiento simulado.
La Figura 6 muestra las secuencias de aminoácidos de diversos constructos polipeptídicos de acuerdo con la presente invención. Algunos de los constructos incluyen etiquetas His (para facilitar la purificación), mientras que otros comprenden EGFP (para facilitar la detección) pero los constructos pueden aplicarse naturalmente con o sin dichos residuos/secuencias adicionales.
La Figura 7 ilustra la mayor eficacia terapéutica observada al utilizar exosomas (que comprenden un polipéptido terapéutico que comprende al receptor del factor 1 de necrosis tumoral soluble (sTNFR1) fusionados al polipéptido transportador CD63) obtenidos a través de purificación por cromatografía líquida-ultrafiltración (UF-LC) (línea negro continua), en comparación con los mismos exosomas obtenidos a través de un proceso de ultracentrifugación (UC) convencional (línea negra continua cruzada). La mayor eficacia terapéutica es más probablemente debida a la estabilidad biofísica mejorada de los exosomas obtenidos a través de UF-LC, que a su vez produce una menor acumulación en el tejido pulmonar.
La Figura 8 muestra la inhibición de la autofagia que da como resultado rendimientos exosomales mayores. El gráfico muestra, de izquierda a derecha, células tratadas con medio de cultivo únicamente (como control de línea base) medio complementado con factor de crecimiento (por ejemplo, complementado con IGF-1), medio que comprenden inhibidores de autofagia (3-metiladenina y bafilomicina) o un medio que comprende activadores de autofagia (rapamicina). El tratamiento con inhibidores de autofagia da como resultado un gran aumento en el rendimiento exosomal, que puede explotarse en la producción de exosomas de acuerdo con la presente invención.
La Figura 9 muestra cómo los ratones con EAE tratados con exosomas que exhiben receptores señuelo terapéuticos incompetentes para señalización para IL6 (SEQ ID NO: 1-2), IL-1p (SEQ ID NO: 3-5) y TNFa (línea negra continua y líneas negras continuas con círculos, cuadrados y diamantes), muestran una manifestación muy moderada de enfermedad comparado con el control tratado en forma simulada (línea discontinua), mientras que los ratones tratados con exosomas competentes para señalización (TNFR1 competente para señalización) de hecho muestran una enfermedad empeorada (línea gris discontinua).
La Figura 10 ilustra los efectos de las condiciones que inducen estrés en el enriquecimiento de las proteínas antiapoptóticas y metabólicamente activas, de acuerdo con términos de GO (términos de GO: traducción, procesos metabólicos, glicolisis y proteínas ribosómicas). Comparado con las células cultivadas bajo condiciones normales, los exosomas que pueden ser obtenidos de las células cultivadas bajo condiciones que inducen estrés (por ejemplo, privación de suero y/o privación de oxígeno) están enriquecidos en proteínas para supervivencia y procesos metabólicos, lo que es beneficioso para aplicaciones de medicina regenerativa.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona, en un primer aspecto, un exosoma de suministro terapéutico que tiene unido a su membrana un constructo polipeptídico, donde el constructo polipeptídico comprende al menos un polipéptido transportador fusionado a al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico presente al menos parcialmente en el exterior del exosoma de suministro, y donde al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico es incompetente para señalización. En otros aspectos, la presente invención proporciona exosomas de suministro y composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención para su uso en medicina, así como métodos para producir exosomas de suministro.
Cuando las características, realizaciones o aspectos de la presente invención se describen en términos de grupos de Markush, una persona experta en la técnica también reconocerá que la invención también se describe en términos de cualquier miembro o subgrupo de miembros individuales del grupo de Markush. La persona experta en la técnica reconocerá además que la invención también se describe por lo tanto en términos de cualquier combinación de miembros o subgrupos individuales de miembros de grupos de Markush. Además, debe observarse que las realizaciones y características de la presente invención también se aplican mutatis mutandis a todos los demás aspectos y/o realizaciones de la invención. Por ejemplo, al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico descrito en relación con los exomas de suministro terapéutico se entiende que es potencialmente relevante/aplicable/está presente en el contexto de los métodos de producción de exosomas de suministro o en el contexto de las composiciones farmacéuticas como las de la presente invención. Además, ciertas realizaciones descritas en relación con ciertos aspectos, por ejemplo, las rutas de administración de los exomas de suministro terapéutico, como se describe en relación con aspectos pertenecientes al tratamiento de ciertas indicaciones médicas, pueden ser también naturalmente relevantes en relación con otros aspectos y/o realizaciones tales como aspectos/realizaciones que pertenecen a las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Como observación general, los receptores señuelo del polipéptido terapéutico y los polipéptidos portadores de acuerdo con la presente invención se pueden combinar libremente en todas y cada una de las combinaciones posibles de la invención sin desviarse del alcance y la esencia de la invención, y las secuencias pueden desviarse fuertemente de las secuencias originales siempre que cualquier polipéptido transportador dado mantenga su capacidad de transportar al receptor señuelo del polipéptido terapéutico a la superficie de un exosoma, y siempre que cualquier receptor señuelo del polipéptido terapéutico mantenga su capacidad de unirse a su objetivo de una manera terapéuticamente eficaz. Siempre que se conserven sus propiedades biológicas, las secuencias polipeptídicas pueden desviarse hasta en un 50% (calculado utilizando, por ejemplo, BLAST o ClustalW) en comparación con el polipéptido nativo, aunque es preferible una identidad de secuencia lo más alta posible. La combinación (fusión) del portador y los polipéptidos del receptor señuelo implica que ciertos segmentos de los respectivos polipéptidos pueden reemplazarse y/o modificarse, lo que significa que la desviación de la secuencia nativa puede ser grande siempre que se conserven las propiedades clave.
Por conveniencia y claridad, ciertos términos empleados en este documento se recogen y describen a continuación. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.
El término "exosoma" significa cualquier vesícula derivada de la ruta endo-lisosomal.
El término "unido a su membrana" se debe entender como unido en el sentido de cómo un polipéptido biológico normalmente está unido a una membrana vesicular, es decir, predominantemente a través de interacciones no covalentes, pero posiblemente también a través de enlaces covalentes. La unión a la membrana puede comprender unión dentro del exosoma, en la membrana del exosoma, en el exterior del exosoma, o cualquier combinación de los mismos. Un ejemplo típico de un polipéptido que se "une" a la membrana de un exosoma es un polipéptido transmembrana que abarca la membrana vesicular de dos capas de un exosoma desde el espacio intraexosomal a través de la membrana exosomal al medio extraexosomal.
El término "constructo polipeptídico" (o "constructo polipeptídico terapéutico") se entiende que se relaciona con cualquier polipéptido que comprenda un "polipéptido transportador", como se define en la presente memoria, y un "receptor señuelo del polipéptido terapéutico", como se define en la presente memoria. El constructo polipeptídico se puede unir a la membrana del exosoma de suministro de acuerdo con la presente invención, preferiblemente en una forma transmembrana (es decir, con el constructo polipeptídico extendiéndose desde el interior del exosoma de suministro, a través de la membrana del exosoma de suministro, hacia el exterior de exosoma de suministro). Cuando el receptor señuelo del polipéptido terapéutico tiene una configuración transmembrana, puede ser preferible si el polipéptido transportador está presente sustancialmente en el interior del exosoma de suministro mientras que el receptor señuelo del polipéptido terapéutico está presente al menos parcialmente en el exterior del exosoma de suministro, para poder ejercer su efecto terapéutico.
El término "incompetente para señalización" se debe entender que no es capaz de transmitir señales bioquímicas, es decir un polipéptido que es incompetente para señalización simplemente está uniendo su compañero de interacción extracelular, pero tras la unión no se trasmiten o generan señales (es decir, no intracelulares, no intravesiculares o no extracelulares). Por ejemplo, en el caso del TNFR soluble (sTNFR), incluso si se transfiere a las células inmunes, una TNFR incompetente para señalización no puede ejercer una respuesta biológica ya que carece de componentes de señalización cruciales. Del mismo modo, las imitaciones del EGFR (SEQ ID NO: 18) pueden carecer del dominio transmembrana que prohíbe la inserción en la membrana de células receptoras, por lo que no son capaces de transmitir señales biológicas, por ejemplo, en el caso de una transferencia a una célula receptora. Es importante destacar que en un contexto clínico, en el caso de TNFr, la transferencia de un receptor incompetente para señalización a las células receptoras ofrece otra capa de protección, ya que entonces protege directamente las células de la señalización excesiva de TNF compitiendo por la unión del ligando. Para mayor claridad, tanto el receptor señuelo del polipéptido terapéutico y/o el constructo polipeptídico completo pueden ser incompetentes para señalización. Por ejemplo, el receptor señuelo del polipéptido terapéutico puede convertirse en incompetente para señalización a través, por ejemplo, de una mutación específica del sitio, pero un receptor del polipéptido terapéutico competente para señalización puede convertirse en incompetente para señalización mediante reemplazo y/o unión a su dominio de señalización por un polipéptido transportador.
El término "polipéptido transportador" debe entenderse como cualquier polipéptido que puede usarse para transportar un constructo polipeptídico a una ubicación exomal adecuada. Más específicamente, se entenderá que el término "polipéptido transportador" comprende cualquier polipéptido que permite el transporte o desplazamiento de un constructo polipeptídico (del que dicho "polipéptido transportador" forma parte) a, al menos parcialmente, la membrana del exosoma y, al menos parcialmente, el lado extraexosomal (por ejemplo, la superficie) de un exosoma de suministro de acuerdo con la presente invención. Los ejemplos de polipéptidos portadores son, por ejemplo, Lamp2b (SEQ ID NO: 22), CD9 (SEQ ID NO: 12), CD81 (SEQ ID NO: 13), CD63, sindecano, ALIX (SEQ ID NO: 28), sintenina (SEQ ID NO: 29), y sinaptotagmina, pero numerosos otros polipéptidos capaces de transportar un constructo polipeptídico al menos parcialmente al lado extraexosomal de exosomas de suministro están comprendidos dentro del alcance de la presente invención.
Los términos "receptor señuelo del polipéptido terapéutico", "receptor señuelo del polipéptido" y "receptor señuelo" se usan indistintamente en este documento y se entenderá que se relacionan con cualquier polipéptido (a menudo llamado un receptor señuelo o sumidero) que puede ser utilizado para propósitos terapéuticos a través del secuestro (unión) de un objetivo y/o ligando adecuado (normalmente un ligando en circulación o un ligando presente en una célula también en circulación pero potencialmente cualquier ligando en la superficie y/o dentro de una célula objetivo), ejerciendo así su efecto terapéutico. El receptor señuelo se une y/o secuestra su objetivo, que en esencia inhibe al objetivo de llevar a cabo su función que puede contribuir a tratar una enfermedad y/o trastorno. Los procesos de transducción de señal de las clases principales de receptor se describen en detalle a continuación, para ejemplificar ciertos receptores señuelo del polipéptido terapéutico de acuerdo con la presente invención. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, los receptores señuelo de la presente invención son preferiblemente incompetentes para señalización, para garantizar eficacia y seguridad terapéutica.
Los términos "ligando" y "objetivo" en el contexto de la presente invención se entenderá que comprenden cualquier molécula que está unida (normalmente con alta afinidad, por ejemplo, una Kd de menos de 100 pM, pero preferiblemente por debajo de 1 pM o más preferiblemente por debajo de 100 nM o más preferiblemente por debajo de 100 nM) por los receptores señuelo de polipéptidos terapéuticos de acuerdo con la presente invención. El ligando (que puede ser cualquier polipéptido o carbohidrato/polisacárido o esencialmente cualquier molécula, por ejemplo presente en la superficie de una célula) está normalmente circulando libremente en la sangre o en cualquier fluido corporal (TNFa es un ejemplo de tal ligando de polipéptido que circula libremente para el receptor de TNFa) pero también puede ser un polipéptido o cualquier otro tipo de molécula presente en una célula y/o dentro de una célula que circule en un fluido corporal, por ejemplo, sangre. Un ejemplo de un objetivo unido a una célula puede ser CD19, que actualmente está en células B en circulación, y que puede unirse mediante un receptor de polipéptido terapéutico tal como rituximab comercialmente disponible. Por lo tanto, se entenderá que el término "ligando" incluye moléculas tanto polipeptídicas como no polipeptídicas (por ejemplo, carbohidratos o cualquier otro tipo de molécula).
La frase "se une a un ligando/objetivo" se entenderá como el receptor señuelo del polipéptido terapéutico que tiene la capacidad de unirse a un ligando y/o un objetivo en el cuerpo humano y/o animal, lo que significa que el receptor señuelo puede unirse y secuestrar su ligando, para ejercer un efecto terapéutico inhibiendo al ligando/objetivo de llevar a cabo su función fisiológica normal. El ligando/objetivo está normalmente circulando en el torrente sanguíneo o se expone al entorno extracelular al estar presente en la superficie de una célula objetivo.
La transducción de señal normalmente ocurre in vivo cuando un ligando extracelular se une a un receptor de superficie celular y lo activa. A su vez, el receptor cambia las proteínas/moléculas intracelulares, lo que inicia una ruta de señalización. Hay dos grupos principales de receptores; receptores extracelulares y receptores intracelulares.
Los receptores extracelulares se pueden dividir además en diferentes clases:
1. Receptores acoplados a proteína G (7-TM)
2. Tirosina e histidina quinasas
3. Integrinas
4. Receptores con puerta Toll
5. Canal de iones controlado por ligando
Los receptores 7-TM tienen 7 regiones transmembrana y están unidos a una proteína G heterotrimérica. Tras la unión del ligando, el receptor experimenta un cambio conformacional y la proteína G se vuelve activa. Las subunidades de proteína G activadas se separan del receptor e inician la señalización a través de muchas proteínas efectoras más adelante tales como fosfolipasas y canales iónicos. Los receptores adrenérgicos y de quimioquina pertenecen a esta familia. Los receptores 7-TM pueden convertirse en incompetentes para señalización al eliminar el sitio de unión para las proteínas G. Por ejemplo, el reemplazo del sitio de unión intracelular de las proteínas G con el sitio de unión de sintenina de los sindecanos dirigiría un receptor incompetente para señalización a un exosoma.
Los receptores de tirosina quinasa (RTK) son proteínas transmembrana con un dominio quinasa intracelular y un dominio de unión a ligando extracelular. Ejemplos de ligandos son factores de crecimiento, insulina, etc. Para inducir una señal, los RTK necesitan formar dímeros en la membrana plasmática. Cuando se forma un dímero, la interacción entre los dominios intracelulares inicia la autofosforilación de los residuos de tirosina lo que causa un cambio conformacional en el receptor. Los dominios quinasa de los receptores se activan posteriormente y se fosforilan las moléculas de señalización más adelante para crear una cascada de señalización.
Los receptores de tirosina pueden convertirse en incompetentes para señalización al eliminar o mutar el dominio quinasa o el dominio tirosina. Esto se puede hacer de manera similar que con los receptores 7-TM. Además, el dominio extracelular de los receptores de tirosina podría fusionarse con una proteína exosomal, tal como CD63, Lamp2b, etc.
Las integrinas son proteínas transmembrana que son importantes para la unión celular a otras células, así como a la matriz extracelular. Las integrinas también participan en la transducción de señales de las proteínas de matriz extracelular tales como fibronectina y colágeno. Las integrinas cambian su conformación al unirse al ligando; las integrinas carecen de un dominio quinasa, lo que significa que las integrinas necesitan moléculas adaptadoras para transmitir la señal a la célula. Hay varias moléculas adaptadoras y quinasas unidas a integrinas. Las integrinas pueden existir en dos conformaciones diferentes: una forma inactiva y una forma activa. La forma inactiva es común en leucocitos no activados; cuando los leucocitos se activan, la célula cambia sus integrinas a un estado activo. Las integrinas son incompetentes para señalización sin sus moléculas adaptadoras, por lo que los sitios de unión para las moléculas adaptadoras y las quinasas pueden eliminarse para generar receptores incompetentes para la señalización.
Los receptores tipo Toll tienen cuatro moléculas adaptadoras conocidas que se activan tras la unión del ligando. Estas cuatro moléculas adaptadoras, Myd88, TIRAP, TRIF y TRAM, posteriormente activan moléculas intracelulares, y los receptores tipo Toll inhiben o activan miles de genes cuando se activan. Los receptores tipo Toll pueden convertirse en incompetentes para señalización mediante la eliminación del sitio de unión y/o de los sitios de interacción para las moléculas adaptadoras.
Los diversos polipéptidos mencionados en la presente solicitud (por ejemplo polipéptidos transportadores tales como Lamp2b o CD63 y receptores señuelo del polipéptido terapéutico tales como sTNFR o VEGFR, etc.) se entenderá que se refieren también a polipéptidos homólogos que tienen identidades de secuencia con el polipéptido en cuestión, preferiblemente por encima del 50%, más preferiblemente por encima del 60%, más preferiblemente por encima del 70%, más preferiblemente por encima del 80%, y más preferiblemente por encima del 90%.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un exosoma de suministro terapéutico que tiene unido a su membrana un constructo polipeptídico, donde el constructo polipeptídico comprende al menos un polipéptido transportador fusionado a al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico presente al menos parcialmente en el exterior de la vesícula de suministro y en donde al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico es incompetente para señalización, para permitir la unión y secuestro de su molécula objetivo sin la generación y/o transmisión de ninguna señal. En una realización preferida, al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico se une a un ligando circulante, pero puede unirse naturalmente también a una molécula objetivo presente en una célula objetivo. El constructo del polipéptido terapéutico puede comprender al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico (indistintamente llamado un "receptor señuelo", pero dichos receptores señuelo del polipéptido terapéutico también pueden relacionarse con polipéptidos terapéuticos no clasificados necesariamente como receptores señuelo como tales) es decir, incompetentes para señalización (o alternativamente en algunas realizaciones competentes para señalización), fusionados a un polipéptido transportador. Naturalmente, un solo exosoma de suministro puede comprender más de un constructo polipeptídico (es decir, una pluralidad de constructos están presentes en un solo exosoma) y también más de un tipo de constructo polipeptídico (un solo exosoma podría, por ejemplo, comprender una pluralidad de (1) constructos que comprenden al receptor del VEGF, como el receptor señuelo, y un polipéptido transportador, tal como Lamp2b, y (2) constructos que comprenden al receptor del EGF, como el receptor señuelo, y el polipéptido transportador CD63). Los inventores se han dado cuenta de forma inesperada que el uso de exosomas como vehículos de suministro para los receptores señuelo del polipéptido terapéutico (por ejemplo, productos biofarmacéuticos) resulta no sólo en una farmacocinética mejorada sino inesperadamente también aumenta la eficacia de los receptores señuelo del polipéptido terapéutico, posiblemente como resultado de los efectos regenerativos ejercidos por los mismos exosomas. Además, el empleo de exosomas como vectores de suministro para los polipéptidos terapéuticos no sólo facilita la producción en comparación con productos biológicos clásicos, sino el hecho de que cada exosoma de suministro comprende potencialmente una pluralidad considerable de constructos terapéuticos (que a su vez puede comprender una pluralidad de receptores señuelo del polipéptido terapéutico) que potencialmente conduce a una multivalencia del receptor que mejora la eficacia terapéutica y mejora los resultados del tratamiento.
En realizaciones preferidas, al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico puede estar parcial o completamente desprovisto de su dominio de señalización, para hacerlo incompetente para señalización. Esto puede lograrse truncando o mutando el polinucleótido que codifica el dominio de señalización, o eliminando completamente dicho polinucleótido, para bloquear cualquier señalización del receptor señuelo del polipéptido terapéutico. En una realización adicional, el dominio de señalización del receptor señuelo del polipéptido terapéutico puede reemplazarse parcial o completamente por el polipéptido transportador, para minimizar posiblemente el tamaño del constructo polipeptídico.
Los inventores se han dado cuenta de que, sorprendentemente, en algunos casos es preferible utilizar receptores señuelo de polipéptidos terapéuticos que son incompetentes para señalización, con el fin de evitar la generación de señales que de otro modo podrían tener un impacto negativo sobre la eficacia terapéutica.
En una realización de acuerdo con la presente invención, el polipéptido transportador puede estar localizado parcialmente dentro del exosoma de suministro terapéutico y/o parcialmente en la membrana del exosoma de suministro terapéutico y/o parcialmente fuera del exosoma de suministro terapéutico. En una realización preferible, el polipéptido transportador está presente sustancialmente en el interior del exosoma de suministro o en su membrana, mientras que el receptor señuelo del polipéptido terapéutico está presente al menos parcialmente en el exterior del exosoma de suministro, para poder ejercer su efecto terapéutico. Por lo tanto, el constructo polipeptídico puede estar presente preferiblemente en forma transmembrana (es decir, un constructo polipeptídico transmembrana), con el polipéptido transportador presente sustancialmente en el interior o en la membrana del exosoma y el receptor señuelo del polipéptido terapéutico presente sustancialmente en el exterior del exosoma de suministro (y el polipéptido transportador y/o el receptor señuelo del polipéptido terapéutico que se extiende a través de la membrana del exosoma de suministro). En una realización, puede usarse más de un polipéptido transportador, para mejorar la expresión del receptor señuelo del polipéptido terapéutico en la superficie (exterior) del exosoma de suministro terapéutico.
La ubicación del polipéptido transportador en la membrana puede variar dependiendo de la aplicación y del polipéptido terapéutico en cuestión; siendo la consideración principal que el receptor señuelo del polipéptido terapéutico sea capaz de interactuar con su compañero de interacción, normalmente un ligando circulante, que normalmente está presente extracelularmente, por ejemplo, en la sangre o en cualquier otro fluido corporal o en una célula objetivo circulante. En realizaciones adicionales, al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico puede fusionarse con el polipéptido transportador a través de un enlace químico seleccionado del grupo que comprende un enlace peptídico (amida), un enlace tioéter, un puente disulfuro y una interacción biotina-estreptavidina. La formación de un enlace peptídico (amida) puede conseguirse naturalmente mediante tecnología recombinante (es decir, mediante la expresión de un polinucleótido adecuado en una célula capaz de producir vesículas de suministro adecuadas), pero dicho enlace también puede generarse usando diversas estrategias de conjugación comúnmente empleadas en la técnica, por ejemplo, conjugación mediada por EDC/NHS, conjugación sulfo-NHS o cualquier otro tipo de enfoque de conjugación de amida (péptido). Sin embargo, otras metodologías para acoplar al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico y al menos un polipéptido transportador pueden comprender formar un puente disulfuro entre, por ejemplo, dos residuos de cisteína, o que utilizan la interacción natural entre biotina y estreptavidina para conectar el receptor señuelo del polimérico terapéutico y el polipéptido transportador. Una alternativa al uso de constructos de fusión y la formación de enlaces químicos es colocar una etiqueta lipídica en el receptor señuelo de polipéptidos terapéuticos y recubrir de manera no covalente la superficie del exosoma de suministro con el receptor señuelo de polipéptidos terapéuticos por medio de la intercalación simple de lípidos.
Dichas etiquetas de lípidos pueden incluir colesterol, estearilo, diestearilo, miristoilo, palmitoilo, decanoilo y otros lípidos adecuados conocidos por una persona experta en la técnica.
El polipéptido transportador puede seleccionarse del grupo que comprende Lamp2b, CD63, sindecano, sinaptotagmina, dominio ALIX (CHAMP 4), dominio de unión ALIX-sintenina, proteínas de ESCRT, PDGF, sintenina-PDZ, dominio de P6 y P9, CD81, CD9 y cualquier combinación de los mismos. De nuevo, la consideración principal detrás de seleccionar un polipéptido transportador apropiado se refiere a su capacidad de transportar eficazmente el receptor señuelo del polipéptido terapéutico a una ubicación exosomal apropiada (normalmente su superficie, o al menos a una parte de la membrana del exosoma de suministro terapéutico que le permite al receptor señuelo del polipéptido terapéutico interactuar y unirse al ligando, es decir, su compañero de interacción, para ejercer su efecto terapéutico). Además de acuerdo con la presente invención, el polipéptido transportador puede comprender la parte citoplásmica del sindecano. La parte citoplásmica del sindecano tiene un dominio de unión a PDZ que se une al complejo sintenina-ALIX, y el complejo sintenina-ALIX forma posteriormente un exosoma (el dominio PDZ, por lo tanto, guiaría esencialmente al receptor hacia el exosoma).
Al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico de acuerdo con la presente invención se puede seleccionar del grupo que comprende receptores, por ejemplo, de las siguientes familias de receptores: insulina, PDGF (SEQ ID NO: 15-16), FGF (SEQ ID NO: 36-39), EGF, NGF (SEQ ID NO: 32), VEGF, HGF, TRK, EPH, AXL, LTK, TIE, ROR, DDR, RET, KLG, RYK, MuSK, TGF Tipo I y Tipo II (SEQ ID NO: 33-35), activina y TNF, PTCH1 (SEQ ID NO: 44), interleuquinas (IL) 1, 6, 12, 17, 23 y otras (SEQ ID NO: 1-11), angiopoyetina, péptidos de presentación en fagos HER que se unen a ligandos para los receptores anteriores (y posiblemente también presentación en fago hacia los receptores para ocupar el espacio de unión a través del impedimento alostérico), receptores 7-TM, integrinas, selectinas (por ejemplo, selectinas E, P y L (SEQ ID NO: 19-21), ligandos de integrinas/selectinas, anticuerpo unidos a la membrana, receptores de células T, receptores de células NK, receptores tipo Toll, PAMP, etc.
Además, los receptores modificados genéticamente que se unen a varios ligandos tales como VEGF y angiopoyetina (DAAP) están de acuerdo con la presente invención, y además todas las familias de receptores y receptores específicos mencionados anteriormente están en línea con la presente invención. Además de acuerdo con la presente invención, el constructo polipeptídico unido a los exosomas de suministro terapéutico puede comprender más de un receptor señuelo del polipéptido terapéutico, y también más de un polipéptido transportador, para optimizar, por ejemplo, los efectos terapéuticos o el transporte del receptor señuelo del polipéptido terapéutico a la membrana del exosoma de suministro (o su superficie).
El constructo polipeptídico de acuerdo con la presente invención puede formarse en consecuencia a partir de cualquier combinación de al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico y al menos un polipéptido transportador. Los ejemplos de realizaciones comprenden, por ejemplo, (i) al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico de la familia de TNF (por ejemplo TNFR1) combinado con un polipéptido transportador seleccionado de CD63 (SEQ ID NO: 14), Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina o cualquier otro polipéptido transportador adecuado capaz de transportar al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico a la superficie (o esencialmente cualquier ubicación adecuada en un exosoma de suministro terapéutico), (ii) al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico de la familia de VEGF (por ejemplo VEGFR) combinado con un polipéptido transportador seleccionado de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina o cualquier otro polipéptido transportador adecuado capaz de transportar al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico a la superficie (o esencialmente cualquier ubicación adecuada en un exosoma de suministro terapéutico), (iii) al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico de la familia de FGF combinado con un polipéptido transportador seleccionado de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina, o cualquier otro polipéptido transportador adecuado capaz de transportar al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico a la superficie (o esencialmente cualquier ubicación adecuada en un exosoma de suministro terapéutico), (iv) al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico de la familia de EGF combinado con un polipéptido transportador seleccionado de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina o cualquier otro polipéptido transportador adecuado capaz de transportar al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico a la superficie (o esencialmente cualquier ubicación adecuada en un exosoma de suministro terapéutico), (v) al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico de la familia de activina combinado con un polipéptido transportador seleccionado de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina, (vi) al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico de la familia de receptores de interleuquina (por ejemplo, IL6R (SEQ ID NO: 1) o IL12R beta 1 (SeQ ID NO: 4) o IL1R tipo 1 (SEQ ID NO: 3)) combinado con un polipéptido transportador seleccionado, por ejemplo, de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina o cualquier otro polipéptido transportador adecuado capaz de transportar al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico a la superficie (o esencialmente cualquier ubicación adecuada en un exosoma de suministro terapéutico), o cualquier otro polipéptido transportador adecuado capaz de transportar al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico a la superficie (o esencialmente cualquier ubicación adecuada en un exosoma de suministro terapéutico).
En aún otra realización ventajosa de la presente invención, un polipéptido transportador adecuado (tal como CD63, Lamp2b, CD9, CD81, sinaptotagmina, o sindecano, etc.) se fusiona a PTCH1, creando un constructo polipeptídico capaz de secuestrar al erizo sónico (SHH), que es una importante molécula de señalización implicada en diversos cánceres. Los inventores han observado experimentalmente una disminución de la carga tumoral en ratones tratados con exosomas que comprenden diversos polipéptidos portadores acoplados a PTCH1 y a un dominio de unión a SHH específicamente seleccionado de PTCH1. Por ejemplo, en la configuración experimental reportada en la Figura 4, los exosomas que comprenden constructos polipeptídicos que comprenden CD63 o Lamp2b como el polipéptido transportador y PTCH1 como el receptor señuelo del polipéptido terapéutico mostraron una eficacia antitumoral similar como la de los constructos de sindecano-VEGFR mostrada en el gráfico en cuestión.
En realizaciones adicionales, el exosoma de suministro terapéutico de acuerdo con la presente invención puede comprender además al menos una entidad de direccionamiento presente. Dicha entidad de direccionamiento está normalmente presente al menos parcialmente en el exterior del exosoma de suministro, con el fin de permitir el direccionamiento de los exosomas a tejidos, tipos de células u órganos de interés, por ejemplo, para aumentar la concentración de exosomas de suministro localmente en el sitio donde la eficacia terapéutica debe ser lo más alta posible. La entidad de direccionamiento puede ser un péptido o un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo), pero también puede ser una molécula pequeña (tal como una vitamina), un carbohidrato, un ácido nucleico (tal como un aptámero) o cualquier otro tipo de molécula que pueda conferir propiedades de direccionamiento a exosomas de suministro terapéutico.
Generalmente, la presente invención proporciona exosomas de suministro de acuerdo con la presente invención para uso en medicina, y más específicamente, la presente invención se refiere al uso en la profilaxis y/o alivio y/o tratamiento de enfermedades y trastornos seleccionados del grupo que comprende la enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática, psoriasis, síndrome periódico asociado al receptor del factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAPS), deficiencia del antagonista del receptor de la interleuquina 1 (DIRA), endometriosis, hepatitis autoinmune, esclerodermia, miositis, accidente cerebrovascular, lesión aguda de la médula espinal, vasculitis, síndrome de Guillain-Barré, infarto agudo de miocardio, ARDS, sepsis, meningitis, encefalitis, insuficiencia hepática, insuficiencia renal, enfermedad de injerto contra huésped, distrofia muscular de Duchenne y otras enfermedades musculares, enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, ALS, caquexia inducida por cáncer, anorexia, diabetes mellitus tipo 2 y cánceres (por ejemplo, cánceres sensibles a EGF, VEGF, FGF). Algunos de los tipos de cáncer de relevancia para la presente invención comprenden, por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitoma, carcinoma de cerebelo o cerebral de células basales, cáncer del conducto biliar, cáncer de vejiga, tumor óseo, glioma del tallo encefálico, cáncer cerebral, tumor cerebral (astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral / glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, glioma hipotalámico de las vías de la visión), cáncer de mama, adenomas / carcinoides bronquiales, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide (infantil, gastrointestinal), carcinoma primario desconocido, linfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso / glioma maligno, cáncer de cuello uterino, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, tumor de células redondas pequeñas desmoplásicas, cáncer endometrial, ependimoma, cáncer de esófago, tumor de células germinales extracraneales, tumor de células germinales extragonadales, cáncer de vías biliares extrahepáticas, cáncer de ojo (melanoma intraocular, retinoblastoma), cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales (extracraneales, extragonadales u ováricas), tumor trofoblástico gestacional, glioma (glioma del tronco encefálico, astrocitoma cerebral, glioma hipotalámico y del camino de la visión), carcinoide gástrico, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes (páncreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (cáncer de células renales), cáncer de laringe, leucemias ((linfoblástica aguda (también llamada leucemia linfocítica aguda), mieloide aguda (también llamada leucemia mielógena aguda), linfocítica crónica (también llamada leucemia linfocítica crónica), mielógena crónica (también llamada leucemia mieloide crónica), leucemia de células pilosas)), cáncer de cavidad labial y oral, liposarcoma, cáncer de hígado (primario), cáncer de pulmón (células no pequeñas, células pequeñas), linfomas ((linfoma relacionado con el SIDA, linfoma de Burkitt, linfoma cutáneo de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (una antigua clasificación de todos los linfomas excepto de Hodgkin), linfoma del sistema nervioso central primario)), meduloblastoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico con oclusión primaria, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple / neoplasia de células plasmáticas, micosis fungoide, enfermedades mielodisplásicas / mieloproliferativas, leucemia mielógena, leucemia mieloide crónica (aguda, crónica), mieloma, cáncer de la cavidad nasal y del seno paranasal, carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma / histiocitoma fibroso maligno de hueso, cáncer de ovario, cáncer de epitelio ovárico (tumor epitelial-estromal superficial), tumor de células germinales ováricas, tumor maligno potencial bajo de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de células de islotes pancreáticos, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, astrocitoma pineal, germinoma pineal, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, adenoma pituitario, blastoma pleuropulmonar, cáncer de próstata, cáncer rectal, carcinoma de células renales (cáncer de riñón), retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándula salival, sarcoma (tumores de la familia del sarcoma de Ewing, sarcoma de Kaposi, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma uterino), síndrome de Sézary, cáncer de piel (no melanoma, melanoma), cáncer de intestino delgado, cáncer de células escamosas, de cuello de células escamosas, cáncer de estómago, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, cáncer de testículo, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de células transicionales de la pelvis renal y el uréter, cáncer de uretra, cáncer uterino, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y/o tumor de Wilm (cáncer de riñón).
Además, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden exosomas de suministro terapéutico de acuerdo con la presente invención, normalmente formuladas con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable se puede seleccionar del grupo que comprende cualquier material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo un relleno sólido o líquido, un diluyente, un excipiente, un vehículo, un disolvente o un material de encapsulación, que puede estar involucrado, por ejemplo, en la suspensión, mantenimiento de la actividad o porte o transporte de los exosomas de suministro terapéutico de un órgano o parte del cuerpo a otro órgano o parte del cuerpo (por ejemplo, desde la sangre a cualquier tejido y/u órgano y/o parte del cuerpo de interés).
La presente invención también se refiere a aplicaciones cosméticas de los exosomas de suministro. Por lo tanto, las realizaciones de la presente invención pueden hacer parte de productos para el cuidado de la piel tales como cremas, lociones, geles, emulsiones, ungüentos, pastas, polvos, linimentos, protectores solares, champús, etc., que comprenden los exosomas de suministro, para mejorar y/o aliviar los síntomas y problemas como la piel seca, arrugas, pliegues, crestas y/o pliegues de la piel. Los exosomas de suministro pueden exhibir efectos beneficiosos sin que esté presente el constructo polipeptídico, pero la presencia de un constructo polipeptídico adecuado puede potenciar adicionalmente la eficacia cosmética. En una realización, los exosomas de suministro de acuerdo con la presente invención pueden comprender una toxina botulínica (por ejemplo, Botox, por ejemplo, los tipos A-G de toxina botulínica) como receptor señuelo del polipéptido terapéutico (las toxinas botulínicas no sólo se pueden usar para aplicaciones cosméticas, sino también podrían ser aplicada, por ejemplo, para el tratamiento de dolores de cabeza por migraña y distonía). En una realización preferida, los exosomas de una célula adecuada productora de exosomas están comprendidos en una crema, loción o gel cosmético para uso en el tratamiento (que normalmente es para fines cosméticos) de arrugas, líneas, pliegues, crestas y/o arrugas de la piel.
Los exosomas de acuerdo con la presente invención comprenden un constructo polipeptídico terapéutico.
Los exosomas que comprenden un constructo polipeptídico terapéutico pueden mediar efectos antiinflamatorios, antiapoptóticos y proliferativos celulares que pueden mejorar la cicatrización de heridas y la regeneración de la piel. Los experimentos llevados a cabo utilizando (i) exosomas sin ningún constructo polipeptídico terapéutico y (ii) exosomas que comprenden un constructo polipeptídico terapéutico VEGFR1 (con CD63 o Lamp2b como polipéptido transportador) demuestran que ambas estrategias muestran una gran potencia cosmética para aliviar, por ejemplo, telangiectasias (pequeños vasos sanguíneos dilatados localizados cerca de la piel). También se demostró que los exosomas desprovistos de polipéptidos terapéuticos alivian problemas cosméticos tales como piel seca, arrugas, erupciones cutáneas, etc., y adicionalmente exosomas que comprenden, por ejemplo, polipéptidos terapéuticos que contienen TNFR son altamente potentes en el tratamiento de erupciones, descamación y potencialmente psoriasis y problemas relacionados con la psoriasis.
En realizaciones adicionales, los exosomas de suministro de acuerdo con la presente invención pueden comprender receptores señuelo de polipéptidos terapéuticos tales como colágeno, lamininas (por ejemplo, lamininas 111,211, 511 y/o 521) y/o péptidos que penetran en la célula (CPP).
Opcionalmente, se pueden incluir glicosaminoglicanos (GAG) y/u otros tipos de carbohidratos en los exosomas de suministro, para aumentar adicionalmente los efectos relacionados con el mantenimiento de la integridad estructural de la piel.
En un aspecto de acuerdo con la presente invención, el constructo polipeptídico puede comprender un constructo polipeptídico que comprende prácticamente cualquier receptor señuelo del polipéptido terapéutico que se puede unir a un ligando circulante fusionado a prácticamente cualquier polipéptido transportador.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención son naturalmente adecuadas para su uso en medicina, y específicamente en la profilaxis y/o alivio y/o tratamiento de enfermedades y trastornos seleccionados del grupo que comprende enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática, psoriasis, síndrome periódico asociado al receptor del factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAPS), deficiencia del antagonista del receptor de la interleuquina 1 (DIRA), endometriosis, hepatitis autoinmune, esclerodermia y miositis, accidente cerebrovascular, lesión aguda de la médula espinal, vasculitis, síndrome de Guillain-Barré, infarto agudo de miocardio, ARDS, sepsis, meningitis, encefalitis, insuficiencia hepática, insuficiencia renal, enfermedad de injerto contra huésped, distrofia muscular de Duchenne y otras enfermedades musculares, caquexia inducida por cáncer, anorexia, diabetes mellitus tipo 2 y cáncer (por ejemplo, cánceres sensibles al EGF, VEGF, FGF).
Los exosomas de suministro terapéutico de acuerdo con la presente invención se pueden administrar a un sujeto humano o animal a través de varias rutas diferentes, por ejemplo administración auricular (ótica), bucal, conjuntival, cutánea, dental, electro-osmosis, endocervical, endosinusal, endotraqueal, enteral, epidural, extraamniótica, extracorpórea, hemodiálisis, infiltración, intersticial, intraabdominal, intraamniótico, intraarterial, intraarticular, intrabiliar, intrabronquial, intrabursal, intracardíaca, intracartilaginosa, intracaudal, intracavernosa, intracavitaria, intracerebral, intracisternal, intracorneal, intracoronal (dental), intracoronaria, cavernosa intracorpórea, intradérmica, intradiscal, intraductal, intraduodenal, intradural, intraepidérmica, intraesofágica, intragástrica, intragingival, intrabiliar, intralesional, intraluminal, intralinfática, intramedular, intrameningea, intramuscular, intraocular, intraovárica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrasinal, intraespinal, intrasinovial, intratendinoso, intratesticular, intratecal, intratorácica, intratubular, intratumoral, intratimpánica, intrauterina, intravascular, intravenosa, intravenosa en bolo, intravenosa por goteo, intraventricular, intravesical, intravítrea, iontoforesis, irrigación, laríngea, nasal, nasogástrica, técnica de vendaje oclusivo, oftálmica, oral, orofaríngea, otra, parenteral, percutánea, periarticular, peridural, perineural, periodontal, rectal, respiratoria (inhalación), retrobulbar, tejido blando, subaracnoideo, subconjuntival, subcutánea, sublingual, submucosa, tópica, transdérmica, administración transmucosal, transplacentaria, transtraqueal, transtimpánica, uretral, ureteral y/o vaginal, y/o cualquier combinación de las rutas de administración anteriores.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para producir un exosoma de suministro terapéutico, que comprende las etapas de (i) proporcionar al menos un constructo polinucleotídico que codifica al menos un constructo polipeptídico, donde el constructo polipeptídico comprende al menos una polipéptido transportador fusionado a al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico que se une a un ligando circulante, (ii) introducir dicho al menos un constructo polinucleotídico en una célula capaz de producir exosomas de suministro adecuados (mediante la traducción del constructo polinucleotídico en el constructo polipeptídico correspondiente), y (iii) recoger al menos un exosoma de suministro producido por la célula de la etapa (ii). El método puede comprender además una etapa de purificación, en la que el exosoma de suministro terapéutico se purifica mediante un procedimiento seleccionado del grupo que comprende cromatografía líquida (LC), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), filtración por centrifugación, filtración de flujo tangencial, centrifugación, inmunoprecipitación, etc., o cualquier combinación de los mismos.
Los inventores se han dado cuenta sorprendentemente de que la aplicación de una combinación secuencial de filtración (preferiblemente ultrafiltración (UF)) y cromatografía líquida de exclusión por tamaño (LC) da como resultado una purificación optimizada, que a su vez conduce a una eficacia terapéutica superior. Además, en comparación con la ultracentrifugación (UC), que se emplea rutinariamente para purificar exosomas, la cromatografía líquida de ultrafiltración secuencial (UF-LC) es considerablemente más rápida y posible para aumentar los volúmenes de fabricación, lo que es un inconveniente importante de la metodología UC actual. Sin embargo, como se describirá con mayor detalle a continuación, la implicación más ventajosa del uso de UF-LC en lugar de UC es el hecho de que los exosomas (y otras vesículas extracelulares a las que se aplica UF-LC) conservan sus propiedades biofísicas y biológicas, lo que da como resultado una menor acumulación en el tejido pulmonar tras la administración in vivo y, por lo tanto, mejora la eficacia terapéutica.
De acuerdo con el análisis por microscopía electrónica (EM), las vesículas de ambas preparaciones de UF y UC presentaban una morfología redondeada o en forma de copa. En la mayoría de los casos, el diámetro de la vesícula se midió en alrededor de 100 nm, y esto estaba de acuerdo con los resultados obtenidos a través del análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Sin embargo, es de notar que una fracción de vesículas en la muestra de UC se distorsionó claramente (se rompió o fusiono para formar vesículas un poco más grandes) y tales vesículas no se observaron en muestras de UF. Por lo tanto, estos resultados indican que la metodología UC tuvo un impacto negativo sobre la integridad vesicular.
Para verificar la presencia de agregados de vesículas en muestras de UC, los inventores examinaron a continuación los exosomas marcados con CD63-EGFP HEK293T directamente mediante microscopía de fluorescencia. De forma similar a los resultados de FCS, solo las muestras de UC mostraron agregados grandes visibles en el canal de fluorescencia, que no se observaron con las muestras de UF. Esto se corroboró usando los exomas marcados con colorante fluorescente DiOC6. Por lo tanto, el método de aislamiento de UF da como resultado la conservación de las propiedades biofísicas inherentes de las vesículas en comparación con la UC, lo que da como resultado la fusión / agregación y ruptura de las vesículas.
Los experimentos de UF de acuerdo con la presente invención se realizaron principalmente usando filtros con un corte de peso molecular de 100 kDa, 250 kDa y/o 500 kDa, o cualquier combinación secuencial de los mismos. En realizaciones preferidas, es preferible un corte de 100 kDa, pero dado el número de biomoléculas con mayor peso molecular, es posible que los componentes secretados por células/medio distintos de los exosomas estén atrapados en los filtros y el protocolo de UF se refinó adicionalmente usando cromatografía líquida de exclusión por tamaño altamente no convencional. Se cargaron muestras de UF entre otras en una columna de LC de exclusión por tamaño Sephacryl S-300 o Sephacryl S-500 en la que se recogieron dos fracciones distintas con base en la absorbancia de la celda de flujo de UV a 280 nm. NTA reveló que el 98% de las partículas se recuperaron en la fracción 1, donde el tamaño de partícula modal era consistente en las tres réplicas de UF-LC. La tinción de proteína total posterior en SDS-PAGE confirmó que muchas de las proteínas contaminantes originalmente observadas en la muestra de UF se eluyeron en la fracción 2 mientras que la fracción 1 no tenía ningún nivel detectable de proteína. Mediante el uso de transferencia Western (WB), los marcadores exosomales tales como Alix y CD9 solo se detectaron en la fracción 1 y no en la fracción 2, lo que indica que la fracción 1 contenía exosomas puros. Además, la velocidad de recuperación de vesículas después del fraccionamiento por LC fue de 70 /-19%, por lo tanto, la LC no obstaculizó la ganancia en rendimiento de partículas conseguida por Uf sola. WB corroboró estos datos, ya que los marcadores exosomales se expresaban más fuertemente en la fracción 1 de LC en comparación con las muestras purificadas por UC. Además, la proporción de proteína por vesícula fue mucho menor para UF-LC en comparación con las muestras de UC. EM también se realizó en la fracción 1 y 2, donde las vesículas intactas en forma de copa se detectaron solo en la fracción 1, mientras que los agregados proteicos se observaron en la fracción 2. Además, cuando los exosomas marcados con CD63-EGFP HEK293T purificados con UF-LC se visualizaron por microscopía fluorescente, las vesículas positivas para EGFP parecieron similares a las vesículas purificadas por UF, lo que indica que LC no afectó las propiedades biofísicas de las vesículas. Por lo tanto, los inventores han descubierto que el uso de un método de dos etapas que combina UF con LC posterior sorprendentemente permite un aislamiento altamente eficaz de altos rendimientos de exosomas biofísicamente intactos libres de contaminación proteica. El campo de los exosomas se basa actualmente completamente en la efectividad percibida del método de UC, que los presentes inventores han demostrado ser muy poco confiable.
El método de purificación por UF-LC de la presente invención y el método de UC convencional aislaron vesículas con contenidos proteicos similares, como se evidencia por el buen solapamiento proteómico entre los dos métodos. Sin embargo, de manera importante, el método por u F-LC da como resultado una purificación de alto rendimiento de vesículas desprovistas de contaminación no exosomal.
A pesar de perfiles proteómicos similares de exosomas aislados mediante el método de UF-LC de la presente invención y métodos de UC convencionales, los inventores plantearon la hipótesis de que las diferencias claras en la integridad del exosoma entre los métodos de purificación (agregación de vesículas y fusión después de la purificación por UC) podrían influir sus propiedades biológicas in vivo. Dado que está bien establecido que las partículas agregadas típicamente muestran acumulación pulmonar después de la inyección intravenosa (IV), los inventores especularon que los exosomas purificados por UC podrían distribuirse preferentemente a los tejidos pulmonares en comparación con las vesículas purificadas por UF-LC. Para investigar esto, se inyectó la misma cantidad de exosomas marcados con colorante fluorescente del cercano infrarrojo (DiR) (con base en cálculos de NTA) a través de la vena de la cola en ratones Balb/c adultos y se analizó la biodistribución utilizando imágenes IVIS 24 h después de la inyección. Como se postuló, los exosomas purificados por UC mostraron una señal 4,6 veces (p < 0,0001) más fuerte en los pulmones en comparación con las vesículas purificadas por UF-LC. La señal del hígado fue como se esperaba más alta en el grupo de UF-LC (p < 0,0001), ya que la fluorescencia total inyectada solo difería en un 6%. Por lo tanto, las vesículas aisladas usando los métodos de UF-LC altamente ventajosos de la presente invención están biofísicamente intactas, no se acumulan preferentemente en el pulmón y, por lo tanto, son más adecuadas para aplicaciones terapéuticas in vivo.
Como puede apreciarse a partir de la descripción anterior, el método de UF-LC es generalmente aplicable a la purificación de cualquier tipo de vesículas (tales como exosomas, liposomas, etc.) y puede comprender exponer cualquier tipo de preparación adecuada de vesículas que necesite ser purificada con u F-Lc . Sin embargo, la presente invención se refiere a la obtención de exosomas a partir de una fuente adecuada (por ejemplo exosomas producidos por los métodos de la presente invención, que pueden comprender opcionalmente constructos polipeptídicos que a su vez comprenden polipéptidos transportadores y receptores señuelo terapéuticos), exponiendo los exosomas (que están normalmente presentes en un medio que también comprende varios otros componentes tales como proteínas y péptidos) a una etapa de ultrafiltración seguida de una etapa de cromatografía líquida de exclusión por tamaños (LC).
Además, en una realización preferida, la presente invención se refiere a un método para producir un exosoma de suministro terapéutico, que comprende las etapas de (i) proporcionar al menos un constructo polinucleotídico que codifica al menos un constructo polipeptídico, en el que el constructo polipeptídico comprende al menos un polipéptido transportador fusionado con al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico que se une a un ligando circulante, (ii) introducir al menos dicho constructo polinucleotídico en una célula capaz de producir exosomas de suministro adecuados (mediante la traducción del constructo polinucleotídico en el constructo polipeptídico correspondiente), y, (iii) purificar los exosomas de suministro de la etapa (ii) usando ultrafiltración (UF) seguido de cromatografía líquida de exclusión por tamaño (LC). Los exosomas de suministro obtenidos usando dicha metodología pueden, por lo tanto, exhibir una estabilidad biofísica significativamente mejorada y propiedades biológicas que los exosomas obtenidos a través de la metodología de UC convencional. En una realización adicional, se puede usar al menos un filtro para la etapa de UF, y el o los filtros pueden tener el mismo o diferente corte, por ejemplo, inicialmente se podría realizar una primera etapa con un corte de 100 kDa y en una segunda etapa un filtro con un corte de 200 kDa. Naturalmente, el filtro puede seleccionarse para tener un corte apropiado, por ejemplo, de 100 kDa, 200 kDa, 500 kDa, etc. Además, en realizaciones adicionales, la columna utilizada para la etapa de LC puede tener esencialmente cualquier tamaño de poro adecuado. S-300, S-500 y S-1000 de una columna de Sephacryl funcionó igualmente bien, produciendo consistentemente dos picos bien definidos, siendo uno de dichos picos la fracción que contenía las vesículas.
En una realización adicional de la presente invención, la producción de exosomas puede aumentarse incluyendo inhibidores de autofagia en el medio de cultivo celular cuando se cultivan las células productoras de exosomas. Como se muestra en la Figura 8, el tratamiento de las células con inhibidores de autofagia dio como resultado un sorprendente aumento del rendimiento exosomal. Se pueden usar diversas sustancias para inhibir las diferentes etapas de la vía de autofagia, por ejemplo, que incluyen, pero no se limitan a Bafilomicina A y cloroquina (que inhibe la fusión del autofagosoma con el lisosoma) y/o 3-metiladenina (que es un inhibidor de PI3K que dificulta la formación de etapas previas del autofagosoma). Por lo tanto, la presente invención se refiere además al uso de inhibidores de autofagia para aumentar el rendimiento del exosoma en cultivo celular. Las sustancias inhibidoras de la autofagia de acuerdo con la presente invención pueden incluir inhibidores de beclina 1, inhibidores de PI3K (por ejemplo, 3-metiladenina) e inhibidores de la fusión entre autofagosoma y lisosoma (por ejemplo, Bafilomicina A y cloroquina). Por lo tanto, en un aspecto general, la presente invención se refiere a aumentar el rendimiento de exosomas tratando la célula o células que producen exosomas con al menos un inhibidor de la autofagia.
Un método para producir un exosoma de suministro terapéutico de acuerdo con la presente invención puede comprender las etapas de (i) proporcionar al menos un constructo polinucleotídico que codifica al menos un constructo polipeptídico, (ii) introducir al menos dicho constructo polinucleotídico en una célula capaz de producir exosomas que comprenden el constructo polipeptídico traducido a partir del constructo polinucleotídico, (iii) cultivar dichas células en presencia de al menos un inhibidor de la autofagia, (iv) purificar los exosomas suministrados obtenidos de dichas células usando la purificación por UF-LC.
El método para producir un exosoma de suministro terapéutico puede comprender alternativamente las etapas de (i) proporcionar (a) al menos un constructo polinucleotídico que codifica al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico, y (b) al menos un constructo polinucleotídico que codifica al menos un polipéptido transportador, (ii) la introducción de al menos un constructo polinucleotídico (a) y al menos un constructo polinucleotídico (b) en una célula capaz de producir exosomas de suministro, y (iii) recoger al menos una exosoma de suministro producido por la célula de la etapa (ii). Cuando se emplea este método, al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico y al menos un polipéptido transportador pueden formar un único constructo polipeptídico mediante la formación, por ejemplo, de un puente disulfuro entre el polipéptido transportador y el receptor señuelo del polipéptido terapéutico, o mediante la formación de una interacción biotina-estreptavidina, o a través de la formación de cualquier otro tipo de enlace químico, incluyendo la formación de un complejo de sindecano-sintenina-ALIX.
En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un constructo polipeptídico que comprende al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico que se une a una molécula objetivo, fusionado a al menos un polipéptido transportador. Dicho constructo polipeptídico puede en realizaciones ejemplares comprender, por ejemplo, (i) al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico de la familia de TNF combinado con un polipéptido transportador seleccionado de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina (o cualquier derivado o análogo del mismo), o cualquier otro polipéptido transportador adecuado capaz de transportar al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico a la superficie (o esencialmente cualquier ubicación adecuada en un exosoma de suministro terapéutico), (ii) al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico de la familia del VEGF combinado con un polipéptido transportador seleccionado de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina (o cualquier derivado o análogo del mismo), o cualquier otro polipéptido transportador adecuado capaz de transportar al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico a la superficie (o esencialmente cualquier ubicación adecuada en un exosoma de suministro terapéutico ), (iii) al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico de la familia del FGF combinado con un polipéptido transportador seleccionado de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina (o cualquier derivado o análogo del mismo), o cualquier otro polipéptido transportador adecuado capaz de transportar al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico a la superficie (o esencialmente cualquier ubicación adecuada en un exosoma de suministro terapéutico), (iv) al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico de la familia del EGF combinado con un polipéptido transportador seleccionado de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina (o cualquier derivado o análogo del mismo), o cualquier otro polipéptido transportador adecuado capaz de transportar al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico a la superficie (o esencialmente cualquier ubicación adecuada en un exosoma de suministro terapéutico), (v) al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico de la familia de activina combinado con un polipéptido transportador seleccionado de CD63, Lamp2b , sindecano, sinaptotagmina (o cualquier derivado o análogo del mismo), o cualquier otro polipéptido transportador adecuado capaz de transportar al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico a la superficie (o esencialmente cualquier ubicación adecuada en un exosoma de suministro terapéutico).
Además, la presente invención puede referirse en aspectos adicionales a un constructo polinucleotídico que codifica al menos un polipéptido terapéutico de acuerdo con la presente invención, y, en un aspecto adicional, una célula que comprende al menos un constructo polinucleotídico y/o al menos un constructo polipeptídico. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un exosoma de suministro terapéutico obtenible mediante los métodos de acuerdo con la presente invención. Las células que pueden utilizarse para los fines de la presente invención comprenden, por ejemplo, células mesenquimales, células madre adultas (por ejemplo, mioblastos), células madre pluripotentes inducidas (iPS), células madre de sangre de cordón umbilical, células madre embrionarias y/o células madre amnióticas, células derivadas de sangre (por ejemplo, células B, macrófagos, células DC, células T, células NK, plaquetas, etc.), células eucariotas inmortalizadas o líneas celulares (por ejemplo, células de neuroblastoma NSC34, N2a y SHSY5Y, HEK células, células madre neuronales C17.2, células neuroendoteliales bEND3, células HeLa, células U2OS, etc.), o cualquier combinación de estas fuentes de células.
Los inventores se han dado cuenta inesperadamente de que el proteoma de las vesículas extracelulares que pueden obtenerse de las células expuestas a condiciones de cultivo inductoras de estrés (tales como falta de suero y privación de oxígeno) se mejora en términos de GO positivos en comparación con el proteoma de vesículas extracelulares de células cultivadas bajo condiciones de control normales. Se analizaron vesículas extracelulares (tales como exosomas) de células expuestas a falta de suero y/o privación de oxígeno (es decir, suministro reducido de oxígeno) con LC / MS / MS del estado de la técnica (proteómica) para examinar los cambios en el proteoma en las diferentes condiciones de cultivo producidas. Sorprendentemente, las condiciones inductoras de estrés enriquecieron las proteínas antiapoptóticas y metabólicamente activas en mayor medida que las condiciones de cultivo normales según los términos de GO (figura 10) (términos de GO: traducción, procesos metabólicos, glucólisis y proteínas ribosómicas). Por lo tanto, la falta de suero y/o la privación de oxígeno enriquecen las proteínas para la supervivencia y los procesos metabólicos en los exosomas, lo que sería un beneficio para fines regenerativos. Los términos de GO se normalizaron para el proteoma de los exosomas de una célula de control de referencia y el enriquecimiento se expresó como el número de veces que aumentó sobre el valor esperado de la célula de referencia. Por tanto, en un aspecto adicional aplicable en general, la presente invención se refiere al uso de condiciones inductoras de estrés para enriquecer el proteoma de un exosoma para proteínas metabólicamente activas y/o proteínas antiapoptóticas, es decir, términos de GO positivos tales como traducción, procesos metabólicos, glucólisis y/o proteínas ribosómicas. En una realización adicional, el método para obtener exosomas de suministro de acuerdo con la presente invención puede comprender una etapa en la que las células a partir de las cuales se obtienen los exosomas están expuestas a condiciones inductoras de estrés (por ejemplo, pero sin limitación, privación de oxígeno y/o falta de suero), con el fin de inducir el enriquecimiento de proteínas metabólicamente activas y/o proteínas antiapoptóticas para potenciar los efectos regeneradores de los exosomas. Cuando se comparan vesículas de control (sin ningún polipéptido terapéutico) cultivadas bajo condiciones de inducción de estrés con vesículas de control (sin ningún polipéptido terapéutico) cultivadas en condiciones normales, las vesículas extracelulares expuestas al estrés generan un efecto terapéutico claramente mejorado en varios modelos inflamatorios, lo que indica que las capacidades regenerativas de las vesículas extracelulares (notablemente exosomas) se han incrementado debido a las condiciones de cultivo que inducen estrés.
Un aspecto particularmente ventajoso de la presente invención se refiere a exponer células a partir de las cuales se deben obtener exosomas a una combinación tanto de inhibidores de autofagia como a condiciones inductoras de estrés, con el fin de (1) aumentar el rendimiento de exosomas y (2) aumentar la capacidad regenerativa de los exosomas así producidos. Los exosomas obtenidos a través de este enfoque combinatorio se pueden purificar usando el protocolo de UF-LC ventajoso de la presente invención, para garantizar verdaderamente que se optimiza la eficacia terapéutica de los exosomas.
Además, la presente invención se refiere a un método de tratamiento que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de exosomas de suministro terapéutico a un sujeto que lo necesita, en donde el método está dirigido a mejorar, aliviar y/o prevenir enfermedades tales como la enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática, psoriasis, síndrome periódico asociado al receptor del factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAPS), deficiencia del antagonista del receptor de la interleuquina 1 (DIRA), endometriosis, hepatitis autoinmune, esclerodermia, miositis, accidente cerebrovascular, lesión aguda de la médula espinal, vasculitis, síndrome de Guillain-Barré, infarto agudo de miocardio, ARDS, sepsis, meningitis, encefalitis, insuficiencia hepática, insuficiencia renal, enfermedad de injerto contra huésped, distrofia muscular de Duchenne y otras enfermedades musculares, enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, caquexia inducida por cáncer, anorexia, diabetes mellitus tipo 2 y cánceres (por ejemplo, cánceres sensibles al EGF, v Eg F, FGF). Algunos de los tipos de cáncer de relevancia para la presente invención comprenden, por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitoma, carcinoma de cerebelo o cerebral de células basales, cáncer del conducto biliar, cáncer de vejiga, tumor óseo, glioma del tallo encefálico, cáncer cerebral, tumor cerebral (astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral / glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, glioma hipotalámico de las vías de la visión), cáncer de mama, adenomas / carcinoides bronquiales, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide (infantil, gastrointestinal), carcinoma primario desconocido, linfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso / glioma maligno, cáncer de cuello uterino, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, tumor de células redondas pequeñas desmoplásicas, cáncer endometrial, ependimoma, cáncer de esófago, tumor de células germinales extracraneales, tumor de células germinales extragonadales, cáncer de vías biliares extrahepáticas, cáncer de ojo (melanoma intraocular, retinoblastoma), cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales (extracraneales, extragonadales u ováricas), tumor trofoblástico gestacional, glioma (glioma del tronco encefálico, astrocitoma cerebral, glioma hipotalámico y del camino de la visión), carcinoide gástrico, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes (páncreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (cáncer de células renales), cáncer de laringe, leucemias ((linfoblástica aguda (también llamada leucemia linfocítica aguda), mieloide aguda (también llamada leucemia mielógena aguda), linfocítica crónica (también llamada leucemia linfocítica crónica), mielógena crónica (también llamada leucemia mieloide crónica), leucemia de células pilosas)), cáncer de cavidad labial y oral, liposarcoma, cáncer de hígado (primario), cáncer de pulmón (células no pequeñas, células pequeñas), linfomas ((linfoma relacionado con el SIDA, linfoma de Burkitt, linfoma cutáneo de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (una antigua clasificación de todos los linfomas excepto de Hodgkin), linfoma del sistema nervioso central primario)), meduloblastoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico con oclusión primaria, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple / neoplasia de células plasmáticas, micosis fungoide, enfermedades mielodisplásicas / mieloproliferativas, leucemia mielógena, leucemia mieloide crónica (aguda, crónica), mieloma, cáncer de la cavidad nasal y del seno paranasal, carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma / histiocitoma fibroso maligno de hueso, cáncer de ovario, cáncer de epitelio ovárico (tumor epitelial-estromal superficial), tumor de células germinales ováricas, tumor maligno potencial bajo de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de células de islotes pancreáticos, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, astrocitoma pineal, germinoma pineal, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, adenoma pituitario, blastoma pleuropulmonar, cáncer de próstata, cáncer rectal, carcinoma de células renales (cáncer de riñón), retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándula salival, sarcoma (tumores de la familia del sarcoma de Ewing, sarcoma de Kaposi, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma uterino), síndrome de Sézary, cáncer de piel (no melanoma, melanoma), cáncer de intestino delgado, cáncer de células escamosas, de cuello de células escamosas, cáncer de estómago, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, cáncer de testículo, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de células transicionales de la pelvis renal y el uréter, cáncer de uretra, cáncer uterino, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y/o tumor de Wilm (cáncer de riñón).
A diferencia de muchas otras terapias, los exosomas y otras vesículas extracelulares tienen el potencial de cruzar la barrera hematoencefálica (BHE). Los exosomas de suministro terapéutico que comprenden receptores señuelo incompetentes para señalización, por ejemplo, para IL6, IL-1p y TNFa pueden modular por lo tanto los diversos trastornos del sistema nervioso central (SNC) y específicamente varias formas de neuroinflamación. La neuroinflamación es la inflamación del sistema nervioso, incluido el sistema nervioso central (SNC). La neuroinflamación puede ser aguda, por ejemplo, infección o eventos traumáticos, o crónica, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas (incluida la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y las enfermedades desmielinizantes, tales como la esclerosis múltiple (EM)). En el SNC, las células gliales, que incluyen microglia y astrocitos, tienen un papel importante en la inmunidad innata. Estas células, entre otros tipos de células en el cerebro, pueden producir citoquinas y quimioquinas que actúan como neuromoduladores. Las citoquinas más comunes en la neuroinflamación del SNC incluyen IL6, IL-1p y TNFa. La producción de estas citoquinas proinflamatorias puede causar neurotoxicidad y puede comprometer la integridad de la barrera hematoencefálica (BHE).
En un modelo in vivo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), los ratones tratados con exosomas de suministro terapéutico que comprenden diversos receptores señuelo del polipéptido terapéutico (como se describió anteriormente) mostraron un fenotipo de enfermedad notablemente mejorado, como se ilustra en la Figura 9. Por tanto, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a la administración de cualquier receptor adecuado (por ejemplo, IL-6R, TNFR1, IL-1pR, y/o cualquier combinación de los mismos) al SNC, para tratar esencialmente cualquier neuroinflamación.
Además, la presente invención se refiere adicionalmente a reactivos, kits, medios celulares y procesos de cultivo celular. Por ejemplo, los procesos de cultivo celular que utilizan los métodos para producir los exosomas de suministro terapéutico de la presente invención pueden emplearse en una variedad de líneas celulares adecuadas productoras de exosomas, tales como células mesenquimales, células madre adultas (por ejemplo, mioblastos), células madre pluripotentes inducidas (iPS), células madre del cordón umbilical, células madre embrionarias y/o células madre amnióticas, células derivadas de la sangre (por ejemplo, células B, macrófagos, células DC, células T, células NK, plaquetas, etc.), líneas celulares o células eucariotas inmortalizadas (por ejemplo, células de neuroblastoma NSC34, N2a y SHSY5Y, células HEK, células madre neuronales C17.2, células neuroendoteliales bEND3, células HeLa, células U2OS, etc.), o cualquier combinación de estas fuentes de células. En realizaciones adicionales, la presente invención se refiere al medio de cultivo celular, a cualquier reactivo adecuado para uso in vitro, y/o a un kit de partes que comprende los exosomas de suministro terapéutico. Los kits particularmente ventajosos pueden comprender, opcionalmente en contenedores separados, un medio celular para cultivar células productoras de exosomas e inhibidores de la autofagia, para aumentar el rendimiento de producción de exosomas. Los medios de cultivo celular de acuerdo con la presente invención se pueden adaptar para que contengan muy poco o nada de suero con el fin de garantizar que los exosomas producidos por las células expresen cantidades mayores de proteínas metabólicamente activas y antiapoptóticas, para aumentar su capacidad regenerativa inherente. Por ejemplo, en una realización preferida, la presente invención se refiere a un kit que comprende (i) medios de cultivo para cultivo celular en condiciones de falta de suero para potenciar los efectos regeneradores de los exosomas producidos, (ii) inhibidores de la autofagia tales como cloroquina, bafilomicina A, y/o 3-metiladenina, o cualquier combinación de los mismos para aumentar el rendimiento de producción de los exosomas, y células adecuadas para la producción de exosomas.
Debe entenderse que los aspectos que sirven como ejemplo, realizaciones y alternativas y variantes descritos anteriormente pueden modificarse sin apartarse del alcance de la invención, entre otros con respecto a los constituyentes y componentes descritos aplicados (por ejemplo, los receptores señuelo de polipéptidos terapéuticos, y los polipéptidos transportadores, etc.), materiales (por ejemplo, tipos de células, etc.) y parámetros del método (por ejemplo, técnicas de purificación, enfoques de conjugación, etc.). La invención se ejemplificará adicionalmente con los ejemplos adjuntos, que naturalmente también se pueden modificar sin apartarse del alcance de la invención.
Ejemplos
Producción de vesículas de suministro basadas en células
Un tipo de célula que produce una vesícula de suministro terapéutico adecuado, tal como un exosoma, una microvesícula o cualquier otro tipo de estructura derivada de células, se coloca en una placa / siembra con una densidad apropiada en un medio celular. En el caso de la producción de exosomas, un tipo de célula productora de exosomas se coloca en una placa / siembra con una densidad apropiada en un medio celular. El medio celular se elimina después de 24 horas y la placa se lava con PBS 3 veces. Se añade un nuevo medio fresco sin exosomas o un medio libre de suero. Los exosomas se purifican a partir de los medios acondicionados. El tiempo de incubación antes de que los medios se tomen de las células usualmente varía de 48-72 horas dependiendo del tipo de célula, pero puede aumentar o disminuir bajo ciertas circunstancias.
El medio en el que se cultivan las células está siempre sin exosomas y micropartículas foráneas mediante ultracentrifugación a 110.000 g durante la noche antes de la incubación con las células. Alternativamente, se aplica en su lugar un medio sin suero, tal como OptiMEM o DMEM.
El medio acondicionado puede purificarse con diferentes técnicas; ultrafiltración con LC secuencial o purificación mediante cromatografía líquida de alta resolución, ultracentrifugación o kits comercialmente disponibles. Antes de la ultrafiltración o ultracentrifugación, el medio acondicionado se limpia de células y desechos celulares mediante centrifugación del medio a 300 g durante 5 minutos. El sobrenadante se centrifuga posteriormente a 1.500 g durante 15 minutos y se pasa a través de un filtro de 0,2 micrómetros. El medio acondicionado se limpia así de vesículas y agregados de más de 200 nanómetros de tamaño. La filtración a través de 0,2 micrómetros se puede intercambiar con una centrifugación a 15.000 g durante 30 minutos.
Mediante ultrafiltración o flujo tangencial, se concentra el medio acondicionado. El límite de MWCO es en ambos métodos usados de 100 kDa. El medio concentrado se purifica adicionalmente mediante LC o HPLC, usando una columna adecuada, tal como Sephacryl S-300. La primera fracción de LC / HPLC contiene los exosomas.
Mediante ultracentrifugación, el medio acondicionado se centrifuga a 110.000 g durante 70 minutos, se descarta el sobrenadante y el sedimento se resuspende en PBS y se centrifuga una vez más a 110.000 g durante 70 minutos. El sobrenadante se descarta y el sedimento se resuspende en PBS. Para purificar aún más los exosomas, la segunda etapa del proceso de purificación se puede realizar con una almohadilla de sacarosa al 30%. La almohadilla atrapa a los exosomas. Los exosomas se eluyen de la almohadilla de sacarosa mediante otra etapa de centrifugación en PBS a 110.000 g durante 70 minutos y luego el sedimento se resuspende en PBS.
La muestra del exosoma se puede analizar con una transferencia western, ELISA, NTA y microscopía electrónica. La cantidad de receptores señuelo en cada muestra se puede determinar por ELISA hasta un polipéptido de interés. La dosis administrada se calcula luego como la cantidad de polipéptido administrada a partir de la concentración obtenida del ELISA.
Producción de vesículas artificiales
También se pueden utilizar liposomas, estructuras de tipo lipídico, lipidoides y otros tipos de vesículas de suministro basadas en lípidos producidas artificialmente. Estas vesículas pueden producirse por técnicas conocidas en el arte y el constructo polipeptídico que comprende el polipéptido transportador y el receptor señuelo del polipéptido terapéutico pueden cargarse en las vesículas usando tecnología estándar, por ejemplo, marcación con lípidos, etc.
Validación del protocolo de purificación con UF-LC
Cultivo de células
Se cultivaron NSC-34, una fusión de células de médula espinal de ratón embrionarias enriquecidas con neuronas motoras con neuroblastoma de ratón, N2a, una línea celular de neuroblastoma de ratón, B16F10, una línea celular de melanoma de ratón y células de riñón embrionario humano (HEK293T) a 37°C con un 5% de CO2 en medio completo compuesto por medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen), complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS, Cellgro), y penicilina/estreptomicina (pen/estrep, 5.000 pg/mL, Cellgro). Para el aislamiento de exosomas, los medios se cambiaron 24 h después de la siembra por medio previamente centrifugado u OptiMEM. El medio previamente centrifugado es DMEM complementado con FBS al 10% que se había centrifugado previamente a 120.000 g durante 70 minutos antes de elaborar el medio desprovisto de vesículas. Tanto OptiMEM como el medio previamente centrifugado fueron complementados con pen/estrep. El medio acondicionado se recogió luego para el aislamiento del exosoma 48 h después de la incubación. Para experimentos a gran escala, los medios acondicionados recogidos de múltiples matraces se combinaron antes del aislamiento de los exosomas.
Transfección de células HEK293T
Se sembraron 6 millones de células un día antes de la transfección en una placa de cultivo de 15 cm con medio completo DMEM. La transfección del plásmido CD63-EGFP se realizó usando polietilenimina (PEI) a una relación de pADN:PEI de 1:4. Brevemente, se diluyeron 25 pg de plásmido y 100 pg de PEI en 500 pL de OptiMEM en tubos separados. Después de 5 min de incubación a temperatura ambiente (TA), las soluciones de pADN y PEI se combinaron y se incubaron durante 30 minutos más a temperatura ambiente para formar los complejos de DNA/PEI. Los complejos se añadieron gota a gota a las células. Después de 4 h, se eliminó el medio de cultivo celular que contenía los complejos; las células se lavaron con solución salina regulada con fosfato (PBS) y se añadió a las células OptiMEM fresco, complementado con antibióticos P/S. Después de 48 h de incubación, el medio acondicionado se recogió para el aislamiento del exosoma.
Ultracentrifugación (UC) para aislamiento de exosomas
El aislamiento de exosomas por UC se realizó como se describe a continuación. Brevemente, el protocolo 1 implica dos centrifugaciones a baja velocidad, 300 g durante 5 minutos seguidos de 1.200 g durante 10 minutos para eliminar los residuos celulares y las partículas más grandes. El sobrenadante se filtró posteriormente a través de un filtro de jeringa de 0,22 pm antes de la etapa final de ultracentrifugación a 120.000 g durante 70 minutos. El protocolo 2 sigue el del protocolo 1 pero incluye un lavado de PBS adicional a 120.000 g durante 70 minutos. Brevemente, el medio acondicionado se sometió a una centrifugación inicial a baja velocidad a 300 g durante 5 minutos, seguido de una centrifugación a 10.000 g durante 30 minutos. El sobrenadante se ultracentrifugó luego a 120.000 g durante 70 minutos. El protocolo 4 es similar al protocolo 1 pero carece de la etapa de filtración con jeringa de 0,22 pm.
Ultrafiltración (UF) para el aislamiento de exosomas
El protocolo de UF implica las mismas centrifugaciones iniciales a baja velocidad que las del protocolo de UC. En lugar de una ultracentrifugación a alta velocidad en la etapa final, los sobrenadantes del cultivo celular se centrifugaron en un filtro de centrifugación Amicon Ultra-15 de corte de 100 kDa (Millipore) mientras que los perfundidos placentarios se centrifugaron en un filtro de corte de 300 kDa (Vivaspin, Sartorius Stedim) a 3.500 g durante 15 min. A continuación, se agregó PBS a los filtros y se centrifugó para lavar las muestras.
Fraccionamiento por cromatografía líquida de muestras de UF (UF-LC) de cultivo celular
Las muestras de UF, preparadas como se describió anteriormente, se cargaron en una columna HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR para muestras recogidas del medio condicionado OptiMEM y una columna 26/60 S-500 Hr para muestras recogidas de un medio acondicionado previamente centrifugado (GE Healthcare), conectado a un ÁKTA prime (GE Healthcare) equipado con una celda de flujo de UV. Cada fracción individual se recogió de acuerdo con la absorbancia de UV. Las fracciones recogidas se concentraron a continuación usando un filtro de centrifuga Amicon Ultra-15 con corte de 30 kDa (Millipore) hasta 300-400 pL y se almacenaron a -80°C hasta análisis adicionales.
Fracción de cromatografía líquida de muestras de UF (UF-LC) a partir de perfusiones placentarias
Se cargó 1 mL de la muestra STBM de UF en una columna XK16/70 Sephacryl S-1000 (GE Healthcare), conectada al colector de fracciones (RediFrac, Pharmacia). Se utilizó una velocidad de bomba de 2 mL/min y se recogieron fracciones de 4 mL. Las fracciones recogidas se concentraron a continuación en un filtro de centrífuga de 30 kDa (Vivaspin, Sartorius Stedim), se diluyeron hasta 300-400 pL y se almacenaron a -80°C hasta un análisis posterior.
Transferencia Western
La transferencia Western se realizó usando la celda Bio-Rad® Mini-PROTEAN® Tetra o el sistema iBlot® (Invitrogen, Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para comparar de forma cruzada el rendimiento de los exosomas, se procedió a cargar volúmenes iguales del sedimento o filtrado del exosoma resuspendido en el gel.
Para el sistema Bio-Rad, se mezclaron 15 pL de muestras de exosomas con 15 pL de regulador de muestra Laemilli 2X (Bio-Rad) que contenía 5% de p-mercaptoetanol y se calentó a 100°C durante 10 min. Después, se cargaron las muestras en un gel de SDS-poliacrilamida Tris/Glicina al 10%, de 1,5 mm, y se corrieron a 170 V durante 60-70 minutos en regulador de operación, hasta que el frente del tinte alcanzó el fondo del tanque. Las proteínas en el gel se transfirieron luego a una membrana de fluoruro de polivinilidina (PVDF) (Millipore) a 100 V durante 60-70 min en regulador de transferencia que contenía un 20% de metanol. Las membranas se incubaron luego en regulador de bloqueo (leche descremada al 5% en solución salina regulada Tris con Tween-20 al 0,1% (TBS-T) durante 60 minutos a temperatura ambiente (TA) con agitación suave.
Para el sistema iBlot®, se mezclaron 30 pL de muestra con un regulador de muestra que contenía ditiotreitol 0,5 M (DTT), carbonato de sodio 0,4 M (Na2CO3), SDS al 8% y glicerol al 10%, y se calentó a 65°C durante 5 min. Después, se cargaron las muestras en un gel Bis-Tris NuPAGE® Novex® al 4-12% y se corrieron a 120 V en el regulador de corrimiento hasta que el frente del tinte alcanzó el fondo del gel. Las proteínas en el gel se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa iBlot (Invitrogen) durante 7 minutos con el sistema iBlot. Las membranas se tiñeron con colorante Ponceau S que luego se eliminó por lavado con PBS antes de bloquear con regulador de bloqueo Odyssey durante 60 minutos a Ta con agitación suave.
Después de la etapa de bloqueo, la membrana se incubó con solución de anticuerpo primario recién preparada (anti-CD9, anti-PDC6I (Alix), anti-Tsg101 y anti-Calnexina, todo a una dilución 1:1.000 de Abcam, Cambridge, Reino Unido) durante la noche a 4°C o 2 horas a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron tres veces, 10 min cada vez usando regulador de lavado (TBS-T) con agitación vigorosa antes de añadir la solución de anticuerpo secundario (IgG anti-ratón DyLight-800 a una dilución 1:10.000 si se detecta Alix; IgG anti-conejo DyLight-800 a una dilución de 1:10.000 para detectar CD9, Tsg101 y Calnexina) y se incubaron durante 1 h a Ta . Después de la incubación del anticuerpo secundario, las membranas se lavaron tres veces, 10 min cada vez y se visualizaron escaneando ambos canales de 700 y 800 nm en el sistema de formación de imágenes infrarrojas LI-COR Odyssey CLx. Para el sondeo posterior de otras proteínas en la misma membrana, se lavó la membrana tres veces, 10 minutos cada vez antes de nueva incubación con el siguiente anticuerpo primario.
Análisis de seguimiento de nanopartículas
Para la determinación del tamaño de partícula, se realizó un análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) con un instrumento NanoSight NS500 equipado con el software analítico NTA 2.3. Para todos los registros, se utilizó un nivel de cámara de 13 o 15 y función automática para todos los ajustes posteriores a la adquisición: el desenfoque y el tamaño de partícula mínimo esperado, excepto en el umbral de detección donde se fijaron en 5. Las muestras se descongelaron sobre hielo y se diluyeron en PBS entre 1:500 a 1:20.000 para lograr un recuento de partículas entre 2 x 108 y 2 x 109 por mL. Una vez que se determinó la dilución de la muestra, se cargó la muestra en la cámara de la muestra y se ajustó el foco de la cámara para hacer que las partículas aparecieran como puntos de luz puntiagudos. Usando la función de control de la secuencia de comandos, se grabaron cinco videos de 30 o 60 s para cada muestra; incorporando un avance de muestra y un retraso de 5 s entre cada grabación. Para los exosomas positivos para GFP, se usó la misma configuración con una alteración menor, que consistía en que la muestra estaba bajo flujo constante en la cámara de muestra para no blanquear la señal de GFP. Estas medidas se analizaron utilizando la función de proceso de lote y los resultados se exportaron a Microsoft Excel para su posterior análisis.
Cuantificación de proteínas y ARN en exosomas
Se cuantificaron las cantidades de proteína en exosomas usando el kit de ensayo microBCA (Thermo Scientific) y se midieron los niveles de ARN usando el kit de ensayo de ARN Quant-iTMR RiboGreen® (Life Technologies), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Microscopía de electrones
Se diluyeron 5 pL de la suspensión de exosomas 1:1 con PBS y se añadieron sobre rejillas de microscopía electrónica recubiertas con carbono Formvar durante 20 min. La rejilla se transfirió con papel de filtro y se añadieron 15 pL de acetato de uranilo (UA) al 2% en la rejilla durante 1 minuto. A continuación, se eliminó el UA y se añadieron 15 pL de agua destilada durante 1 minuto. Se retiró la gotita de agua y se dejó secar la rejilla al aire durante 15 minutos. Las rejillas se visualizaron luego en el microscopio electrónico.
Microscopía de fluorescencia
Se generaron exosomas positivos de CD63-EGFP como se describió anteriormente. Las partículas se cuantificaron mediante NTA y las muestras de UF-LC y UC se diluyeron a la misma concentración de partículas/mL. Antes de cualquier medición, los exosomas se volvieron a suspender con una aguja 27G. Las muestras se colocaron en un portaobjetos de microscopio y se cubrieron con un cubreobjetos y se analizaron. La microscopía se realizó utilizando un microscopio invertido Olympus IX-81 (Olympus America, Center Valley PA, EE.UU.) equipado con un objetivo 20X. Se usó el siguiente conjunto de filtros de fluorescencia (Chroma Technology Corp., Bellows Falls, VT, EE.UU.), con la longitud de onda central y el ancho de banda de los filtros de excitación y emisión como se indicó: GFP (excitación, 470/40 nm; emisión 525/50 nm).
Espectrometría de masas en tándem con cromatografía líquida (LC-MS/MS) de exosomas
Los exosomas de UC y UF-LC se concentraron mediante SpeedVac y se lisaron con SDS al 1%, HEPES 25 mM, DTT 1 mM. Los lisados se calentaron a 95°C durante 5 min, seguido de sonicación durante 1 minuto y centrifugación a 14.000 g durante 15 min. El sobrenadante se mezcló con DTT 1 mM, urea 8 M, HEPES 25 mM, pH 7,6 y se transfirió a una unidad de filtración por centrifugación de corte de 10 kDa (Pall, Nanosep®), y se centrifugó a 14.000 g durante 15 minutos, seguido por adición del regulador de urea 8 M y centrifugación nuevamente. Las proteínas se alquilaron con yodoacetamida 50 mM (IAA) en urea 8 M, HEPES 25 mM durante 10 min. Las proteínas se centrifugaron luego a 14.000 g durante 15 minutos seguido de 2 adiciones más y centrifugaciones con urea 8 M, HEPES 25 mM. Se añadió tripsina (Promega) en urea 250 mM, HEPES 50 mM al lisado celular en una relación de 1:50 de tripsina:proteína y se incubó durante la noche a 37°C. Las unidades del filtro se centrifugaron a 14.000 g durante 15 minutos, seguido de otra centrifugación con MQ y se recolectó el flujo. Los péptidos se limpiaron con un cartucho de estratos X-C (Phenomenex).
Antes del análisis en Q Exactive (Thermo Fischer Scientific, San José, CA, EE.UU.), los péptidos se separaron usando un sistema Agilent 1200 nano-LC. Las muestras se atraparon en una columna Zorbax 300SB-C18, y se separaron en una columna NTCC-360/100-5-153 (Nikkyo Technos., Ltd) usando un gradiente de A (3% de ACN, 0,1% de FA) y B (95% de ACN, 0,1% de FA), variando de 7% a 40% de B en 240 min con un flujo de 0,4 pL/min. El Q Exactive fue operado de una forma dependiente de los datos, seleccionando los 5 mejores precursores para la fragmentación por HCD. El barrido de reconocimiento se realizó a una resolución de 70.000 a 300-1700 m/z, utilizando masa de bloqueo con una relación m/z 445,120025, con un tiempo máximo de inyección de 100 ms y un objetivo de 1 x 106 iones. Para la generación de espectros de fragmentación de HCD, se utilizó un tiempo máximo de inyección de iones de 500 ms y AGC de 1 x 105 antes de la fragmentación al 30% de energía de colisión normalizada, resolución de 17.500. Los precursores se aislaron con un ancho de 2 m/z y se colocaron en la lista de exclusión durante 70 s. Los estados de carga únicos y no asignados se rechazaron de la selección del precursor.
Se usó proteoma descubridor 1.3 con percolador de secuestro para la identificación de proteínas. La tolerancia de la masa del precursor se estableció en 10 ppm y para los fragmentos en 0,02 Da. La metionina oxidada se fijó como modificación dinámica y la carbamidometilación como modificación estática. Los espectros se emparejaron con una base de datos de un conjunto de 72 combinada de mus musculus y bos taurus, y los resultados se filtraron con FDR al 1%. Se consideró que las identificaciones en bos taurus se originaron en FBS y se eliminaron. El análisis de enriquecimiento del término de GO se realizó usando Panther.
Biodistribución de exosomas en ratones
Los sobrenadantes celulares acondicionados se filtraron a través de un filtro de jeringa de 0,22 pm y se incubaron con DiR (yoduro de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindodicarbocianina) 1pM (Invitrogen). El medio acondicionado con DiR se ultracentrifugó luego a 110.000 g durante 70 minutos o se concentró con un filtro de centrifugación Amicon Ultra de 100 kDa (Millipore). El sedimento de UC se resuspendió y se centrifugó de nuevo en PBS para purificar el DiR o LC sin unir fraccionado como se describió anteriormente. Los exosomas purificados se cuantificaron con NTA y se inyectaron cantidades iguales de partículas de ambas preparaciones de UC y LC en la vena de la cola de ratones Balb/c (n = 5). Veinticuatro horas después de la inyección, se recolectaron los órganos y se sometieron a formación de imágenes en el espectro del sistema de imagenología in vivo (IVIS) (Caliper). El IVIS se configuró para registrar la fluorescencia durante 2 segundos (excitación 710, emisión 760) y los datos obtenidos se analizaron con el software de IVIS. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la Junta Local Sueca para Animales de Laboratorio. Los experimentos se realizaron de acuerdo con el permiso ético y se diseñaron para minimizar el sufrimiento y el dolor de los animales.
Tratamiento de la colitis utilizando exosomas que muestran CD63-sTNFR1 incompetente para señalización
Se usó el modelo de colitis inducido por TNBS bien estudiado en ratones, simulando la tormenta de citoquinas, la diarrea, la disminución de peso y la inflamación intestinal observadas en pacientes con IBD. Se dividieron 24 ratones en cuatro grupos de tratamiento, con 6 ratones por grupo. Los ratones se sensibilizaron previamente aplicando 150 pL de una solución de acetato de aceite de oliva con 2% de TNBS sobre la piel, 1 semana antes de la inducción de la colitis. La colitis se indujo luego dando una infusión rectal de 100 pL de solución que contenía TNBS al 1,5% en etanol al 40%. Inmediatamente después de la inducción de colitis, se administraron 30 pg de exosomas en 200 pL por vía intravenosa en la vena de la cola. A los ratones se les administró exosomas señuelo TNFR1-CD63, incompetentes para señalización, exosomas no modificados, exosomas TNFR1-CD63 competentes para señalización, o p Bs como tratamiento simulado, dependiendo del grupo de tratamiento asignado. Se registró diariamente el peso corporal.
Como puede verse a partir de la Figura 2, la administración de exosomas que comprenden el receptor señuelo de acuerdo con la presente invención conduce a un tratamiento exitoso de la colitis en ratones. Los exosomas señuelo incompetentes para señalización tratan satisfactoriamente la colitis inducida en pocos días con menos pérdida de peso corporal, mientras que los exosomas no modificados muestran un efecto moderado. Los receptores señuelo competentes para la señalización de hecho agravan la condición.
Transferencia Western de CD63-sTNFR1 en la superficie exosomal
Se realizó transferencia Western hacia la parte extracelular de TNFR1, para verificar la presencia del constructo polipeptídico CD63-sTNFR1 en la superficie exosomal. El peso molecular predicho para el constructo para CD63-TNFR1 es de 38,52 kDa, que se puede observar en la proximidad de la banda de referencia de 37 kDa, tanto en la muestra de lisado celular como en la muestra de exosoma. La proteína de fusión se carga sobre los exosomas con gran eficacia, ya que la banda es muy fuerte en la fracción del exosoma (la banda alrededor de 15 kDa es una banda inespecífica irrelevante).
Neutralización de la toxicidad mediada por TNFa
La actividad neutralizante de los exosomas CD63-TNFR1 incompetentes para señalización, los exosomas CD63-TNFR1 competentes para señalización y los exosomas de las células N2a contra TNF-a humano se midieron en la línea celular WEHI 164 de ratón tratada con actinomicina D como se describió previamente (Austgulen et al., 1986, Khabar et al., 1995), con el fin de verificar la afinidad de unión por TNFa. Brevemente, las células WHEI 164 se sembraron por triplicado a razón de 1x104 células/pozo en una placa de 96 pozos y se cultivaron en medio RPMI 1640 complementado con FBS al 10% (v/v) durante 20 h. Posteriormente, se añadieron exosomas diluidos en forma serial (concentración final: 0,5-100 pg/mL) en el medio que contenía 2 pg/mL de actinomicina D al cultivo celular junto con 0,1 ng/mL de TNF-a humano. Las células se incubaron durante 20 h adicionales a una temperatura de 37 grados centígrados y se analizó la viabilidad celular usando un kit colorimétrico de determinación de crecimiento celular con base en MTT (Sigma, St. Louis, MO). El valor ED50 se calculó mediante análisis de regresión no lineal sigmoide complejo usando el software de gráfico Sigma (Systat software, Inc. Richmond, CA).
Eficacia antitumoral de exosomas y liposomas que muestran sindecano incompetente para señalización/CD63-
sVEGFR1
Se implantaron 30 ratones con 1x106 células de melanoma B16/F10 en el flanco el día cero. Los ratones fueron divididos en cinco grupos de tratamiento, con 6 ratones por grupo. Después de una semana (día 7), los ratones recibieron inyecciones intravenosas de 30 pg de exosomas en 200 pL que se repitieron cada dos días durante dos semanas. A los ratones se les administró exosomas que comprenden sindecano-sVEGFR1 incompetentes para señalización, exosomas CD63-sVEGFR1 incompetentes para señalización, exosomas no modificados y exosomas que comprenden CD63-sVEGFR1 competente para señalización o PBS como tratamiento simulado dependiendo del grupo de tratamiento asignado. El volumen del tumor se midió cada dos días.
La flecha en la Figura 4 indica el inicio del tratamiento (día 7). Los ratones tratados con exosomas sVEGFR1 señuelo incompetentes para señalización (sindecan-sVEGFR1 EXO y CD63-sVEGFR1 EXO) mostraron la menor carga tumoral después del tratamiento. El tratamiento con exosomas no modificados tuvo un efecto moderado sobre el tamaño del tumor, mientras que el tratamiento con exosomas que comprende CD63-sVEGFR1 competente para señalización resultó en una condición agravada, en comparación con el grupo de control tratado de manera simulada.
Los experimentos anteriores también se repitieron con liposomas que comprenden el mismo conjunto de receptores señuelo polipeptídicos y se obtuvieron resultados similares.
Tratamiento de ratones MDX
Se sembraron células N2a a razón de 3 millones por matraz de 150 cm2 y se cultivaron en DMEM con FBS al 10%. Después de 24 horas, las células se transfectaron con PEI con plásmidos que codificaban activina sindecano incompetente para señalización o activina-sinaptotagmina incompetente para señalización. Cuatro horas después de la transfección, se cambió el medio por OptiMEM. Después de 72 horas del cambio del medio, los exosomas producidos por las células N2a se recogieron por ultrafiltración y purificación LC secuencial. Los exosomas se usaron inmediatamente o se almacenaron a -20. Los ratones MDX se obtuvieron a través de Charles River con un peso de alrededor de 18-19 gramos. Los ratones se asignaron en 4 grupos con 6 ratones en cada grupo. Los ratones recibieron inyecciones de exosomas o PBS dos veces a la semana durante 12 semanas. El peso se registró antes de cada inyección.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un exosoma de suministro terapéutico que comprende unido a su membrana un constructo polipeptídico, en el que el constructo polipeptídico comprende al menos un polipéptido transportador fusionado a al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico presente al menos parcialmente en el exterior del exosoma de suministro y en el que al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico es incompetente para señalización.
2. El exosoma de suministro terapéutico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el constructo polipeptídico es un constructo polipeptídico transmembrana.
3. El exosoma de suministro terapéutico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico se fusiona con el polipéptido transportador a través de un enlace químico seleccionado del grupo que comprende un enlace peptídico (amida), un enlace tioéter, un puente disulfuro, una interacción biotina-estreptavidina, y cualquier combinación de los mismos.
4. El exosoma de suministro terapéutico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos un polipéptido transportador se selecciona de Lamp2b, CD9, CD81, CD63, sindecano, sinaptotagmina, ALIX, sintenina y cualquier combinación de los mismos.
5. El exosoma de suministro terapéutico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico se selecciona del grupo que comprende receptores de las siguientes familias de receptores: insulina, PDGF, FGF, EGF, VEGF, HGF, TRK. , EPH, AXL, LTK, TIE, ROR, DDR, RET, KLG, PTCH1, RYK, MuSK, activina, TGF tipo I, TGF tipo II y TNF, interleuquina (IL) y cualquier combinación de los mismos.
6. El exosoma de suministro terapéutico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para uso en medicina.
7. El exosoma de suministro terapéutico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para uso en el tratamiento y/o profilaxis de la enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática, psoriasis, síndrome periódico asociado al receptor del factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAPS), deficiencia del antagonista del receptor de interleucina 1 (DIRA), endometriosis, hepatitis autoinmune, esclerodermia, miositis, accidente cerebrovascular, lesión aguda de la médula espinal, vasculitis, síndrome de Guillain-Barré, infarto agudo de miocardio, ARDS, sepsis, meningitis, encefalitis, insuficiencia hepática, insuficiencia renal, enfermedad de injerto contra huésped, distrofia muscular de Duchenne y otras enfermedades musculares, caquexia inducida por cáncer, anorexia, diabetes mellitus, enfermedades y/o trastornos neuroinflamatorios, cáncer (por ejemplo, cánceres sensibles al EGF, VEGF, FGF), cáncer de colon, cáncer de mama y glioma.
8. Una composición farmacéutica que comprende un exosoma de suministro terapéutico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
9. Un método para purificar exosomas de suministro terapéutico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 que comprende las etapas de:
(i) exponer una muestra que comprende al menos un exosoma de suministro terapéutico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 a ultrafiltración;
(ii) exponer la muestra obtenible de la etapa (i) a cromatografía líquida de exclusión por tamaño.
10. Un método para aumentar el rendimiento de producción de exosomas de suministro terapéutico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende exponer células productoras de vesículas a partir de las cuales se deben obtener los exosomas de suministro terapéutico a al menos un inhibidor de autofagia.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que al menos un inhibidor de autofagia se selecciona del grupo que comprende inhibidores de beclina 1, inhibidores de PI3K (por ejemplo, 3-metiladenina), inhibidores de la fusión entre autofagosoma y lisosoma (por ejemplo, Bafilomicina A y cloroquina) y cualquier combinación de los mismos.
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