JP2009501128A - 炎症疾患および炎症障害の研究および処置のための組成物および方法 - Google Patents

炎症疾患および炎症障害の研究および処置のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

炎症によって引き起こされるか、悪化されるか、またはそうでなければ影響される疾患および障害の処置において使用され得る組成物および方法が開示される。本発明は特に、ウイルスベクターを含む組成物であって、該ベクターの細胞への送達が炎症のメディエーターを阻害する組成物に関する。このベクターは発現制御配列に作動可能に連結した核酸を含み、この核酸が炎症のメディエーターを阻害する。本発明は、1つの局面においては、炎症を阻害し、そして炎症疾患の被験体を処置するのに使用され得るベクター構築物に関する。

Description

(I.関連出願への相互参照)
本願は、2005年1月20日に出願された、米国仮特許出願第60/646,099号に対する利益を主張する。米国仮特許出願第60/646,099号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
(II.背景)
炎症に関連する多数の疾患および障害が存在し、そして炎症に関連する多数の経路および分子が存在する。本発明で同定された組成物および方法を使用する、炎症疾患の処置の方法が開示される。
本発明の目的に従って、本明細書中に態様化され、そして広範に説明されるように、本発明は、1つの局面においては、炎症を阻害し、そして炎症疾患の被験体を処置するのに使用され得るベクター構築物に関する。
炎症疾患および障害の研究および処置のための、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、トランスジェニック動物に関連する方法および組成物、ならびにそれらを作製および使用する方法が開示される。
(詳細な説明)
開示された方法および組成物は、具体例の以下の詳細な説明およびその中で、そして、図およびそれらの以前のおよび以下の説明に含まれる実施例を参照することでより容易に理解されることができる。
現在の化合物、組成物、小節果、装置および/または方法が開示されて、記載される前に、それらが特定の合成方法に限られていないことを理解すべきである、または、特に明記しない限り、または、特定の試薬特に明記しない限りに対する特定の組換え型生物工学方法はこのように、もちろん、変化することができる。本願明細書において用いられる用語が具体例だけを記載するためにあって、極限ことを目的としないとも理解される。
A.定義
仕様および添付の請求の範囲において用いられているように、単数形「」「」そして、含む複数の照会先前後関係がさもなければはっきり口述する。このように、例えば、「薬剤担体」の参照は、2またはよりこの種のキャリア、などの混合物を含む。
範囲は、「約」1特定の値より、および/または「ほとんど」他の特定の値まで本願明細書において表されることができる。この種の範囲が表されるときに、他の実施例は1特定の値からおよび/またはその他に特定の値を含む。同様に、値が近似値として表されるときに、「あたりを」先例を用いて、特定の値が他の実施例を形成することが理解されよう。範囲の各々の指標が他の指標に関して、そして、それぞれに他の指標で両方とも重要であると更に理解される。本願明細書において開示される多くの値がある、そして、その特定の値「について」のように、各値も開示されて本願明細書においてあると値自体に加えても理解される。例えば、値「10」が開示される場合、「約10」も開示される。値が開示される、それも理解されるその非常に値「以下の」適切に熟練した職人によって理解されるように、値間の「値以上の」および可能な範囲も開示される。例えば、値「10」が開示される場合、「10以下の」ものも「10以上である」のと同程度よく開示される。それも、理解されるそのの全体にわたってアプリケーション、データが、多くの異なるフォーマットにおいて設けられている、そして、このデータが、指標および出発点を表して、データポイントのいかなる組合せのためにも変動する。例えば、特定のデータポイント「10」および特定のデータポイント15が開示される場合、それはその超過、超過または同等を理解されるか、より小さいか、より小さいかまたは、10に対する同等、および同等である、そして、15は10および15との間に同じく開示されて考慮される。
この仕様で、そして、続く請求項で、参照は、以下の意味を有するために定められる多くの条件になされる:
その後記載されているイベントまたは詳細が発生することができるかまたは発生することができない、そして、それがそうしない所で、説明が前記イベントまたは詳細が発生する例および例を含む「任意」または「任意に」手段。
「プライマ」は、酵素操作の若干のタイプをサポートすることができる、そして、酵素操作が発生することができるように、目標核酸によって交雑することができるプローブのサブセットである。下塗りは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体のいかなる組合せもまたは酵素操作を妨げない技術で利用可能な類似体から製造されることができる。
「プローブ」は、ハイブリダイゼーションで例えば、典型的にシーケンスに特有の方法で、目標核酸と相互に作用することができる分子である。核酸のハイブリダイゼーションは、よく従来技術において理解されて、本願明細書において述べられる。概して、プローブは、従来技術においてヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体のいかなる組合せもまたは利用可能な類似体から製造されることができる。
この用途の全体にわたって、さまざまな刊行物は、参照される。これらの刊行物の開示は、より完全に、これが関係する最高水準の技術を記載するために、全体としてこの用途へ本願明細書に引用したものとする。開示される参照は、すなわち、参照が依存される文で述べられてそれらに含まれる材料のためにも、本願明細書において、個々に、そして、特に引用したものとする。
B.組成物および方法
組成物自体と同様に開示された組成物に本願明細書において開示される方法の範囲内で用いられるように準備させるために用いる構成要素は、開示される。これらの、そしてまた他の、材料は、本願明細書において開示される、そして、それは、理解される、そのいつの組合せ(サブセット)相互作用、グループ、その他これらの中で材料が開示されること各さまざまな個人および総体的な組合せの特別参照およびこれらの化合物の順列が明確に開示されることができないと共に、各々が、特に考察されて、本願明細書において記載されている。例えば、特定のベクターが開示されて、述べられる、そして、プロモータを含む多くのベクター成分が述べられる場合、特に示されない限り、プロモータおよび他のベクター成分および変更態様のどの組合せおよび順列も非常に可能である、分子A、BおよびCのクラスが分子D、EおよびFの種類および組合せ分子の例と同様に開示される場合、ADは開示される、そして、各々が個々に詳述されない場合であっても、各々は組合せ、AE、A−F5 BD、B−E、BF、CD、CEおよびCFが開示されて考慮されることを意味して個々に、そして、集合的に考察される。同様に、いかなるサブセットもまたはこれらの組合せは、開示されもする。このように、例えば、AE、BFおよびCEの亜属は、開示されて考慮される。この概念は、開示された組成物を製作し使用する方法におけるステップを含むがこれに限らずこの用途のすべての態様にあてはまる。このように、実行されることができる様々な追加ステップがある場合、その各々のこれらの追加ステップがいかなる特定実施例もまたは開示された方法の実施例の組合せによって実行されることができるものと理解される。
1. 炎症性疾患
ポリペチドを含む組成物、核酸、ベクターおよび細胞(炎症性疾患および障害の研究および治療において使われることができる)が、本願明細書において提供する。炎症は刺激、損傷または感染に対する組織の局所化された防御反応である。そして、痛み、赤み、膨張および時々機能の損失によって特徴づけられる。ここで使用する「炎症性障害」または「炎症性疾患」とは、組織がウイルス、バクテリア、外傷、化学薬品、熱、寒さまたは他のいかなる有害な刺激でも傷つくときに、発生する継続されたか慢性炎症のようないかなる状態、炎症が含まれる疾患または障害、もを指す。刺激または不快は、皮膚炎、目炎症、腸炎症等のため哺乳類の炎症の、例えば、結果として生じることができる。更に、慢性炎症が他の疾患または病気(例えば骨関節炎、自己免疫性疾患、癌等)を呈するために危険を増すことができると通常、思われている。
一つの態様では、設けられている組成物および方法は、研究および関節炎治療に関する。疾患としての関節炎は、多くの異なる障害および症状を含むことができて、本体の多くの部分に影響を及ぼすことができる。関節炎によって、概して、痛み(運動および、時々膨張することの損失)が生じる。関節炎は、実は一組の100以上の現在の医学的状態のために使用する用語である。関節炎は、最も一般的には年上の個人と関係しているが、幼少という早い時期に始まることができる。若干の形は、それらの若年成人年の人々に影響を及ぼす。関節炎状況の中の一般の態様はそれらが筋骨格系および特にジョイントに影響を及ぼすということである。ここで、二個以上の骨は接触する。関節炎関連の共同の課題は、痛み、剛性、炎症および関節軟骨(骨の端をカバーする丈夫な、なめらかな組織(それらが互いに対してすべることを可能にする))および周囲の構造への損害を含むことができる。この種の損害は、共同の関係の位置に応じて、共同の虚弱、不安定性および可視変形に導くことができる。それらが五体に影響を及ぼすという点で、関節炎状況の多数は全体的である。これらの疾患において、関節炎は実質的にいかなる身体の器官またはシステムにも損傷を引き起こすことがありえる。そして、心臓、肺、腎臓、血管および皮膚を含む。
関節炎の若干の異なる種類は、骨関節炎、慢性関節リウマチ、痛風、強直性脊椎炎、若年性関節炎、全身性エリテマトーデス(狼瘡)強皮症および線維筋痛である。骨関節炎はジョイントの骨の端をカバーする軟骨が悪化する退行性骨関節症である。そして、骨が骨にすれ始めるにつれて、痛みおよび運動の損失を与える。それは、関節炎で最も一般的な形である。慢性関節リウマチは、共同のライニングが本体の免疫システム活動状況の一部として燃やされる自己免疫性疾患である。慢性関節リウマチは最も重大なおよび停止タイプのうちの1つである。そして、大部分は女性に影響を及ぼす。痛風は、大部分は男性を襲う。それは、通常本体化学の欠陥の結果である。この痛みを伴う状態は、多くの場合小さいジョイント(特に親指)を攻撃する。幸いにも、痛風は、たいてい薬物および食事における変更によって完全におさえられることができる。強直性脊椎炎は、脊椎に影響を及ぼす一種の関節炎である。炎症の結果、脊椎の骨は、一緒に成長する。若年性関節炎は、児童に起こる全ての種類の関節炎のための一般項である。児童は、若年性慢性関節リウマチまたは狼瘡、強直性脊椎炎または他のタイプの関節炎の児童形を開発することができる。全身性エリテマトーデス(狼瘡)は、本体の全体にわたってジョイントおよび他の結合組織を燃やすことができて、損傷を与えることができる障害である。強皮症は、肥厚および皮膚の硬化が生じる本体の結合組織の病気である。線維筋痛は、広範囲にわたる痛みが骨まで筋肉および付属品に影響を及ぼす障害である。それは、大部分は女性に影響を及ぼす。
別の態様においては、設けられている組成物および方法は、神経炎症の研究および治療に関する。外傷、発作、感染または神経変性によってであるにせよ、神経炎症(活性小こう細胞および星状細胞および広範囲にわたる炎症伝達物質のローカル表示によって特徴づけられる)は脳外傷に対する基本的な反応である。この局部組織反応は、必ず修理および元気を回復させる方法の一部である。それでも、末梢性疾患の多くの炎症性の状況の様に、神経炎症は、CNS障害の病態生理学に関与することができる。例えば、アルツハイマー病(AD)で、ADの神経炎症、炎症誘発性サイトカイン遺伝子の特定の染色体の多型をもつADのための増加した危険率および非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)をしている個人のための疾患危険の減少の範囲によって証明されたように、Aβ堆積に対する神経膠の被駆動炎症反応は、神経変性を促進すると考えられる。
いかなる炎症性疾患のも研究および処理に対する設けられている組成物および方法関係の使用は、本願明細書において考慮される。このように、設けられている組成物および方法は、炎症性腸疾患の研究および処理に関する。設けられている組成物および方法は、慢性皮膚科学的障害の研究および治療に関する。
設けられている組成物および方法の特定の効果は、そうである本願明細書炎症伝達物質およびその開示されたモジュレータを分配する能力(周縁管理による脳に対する)を記載されている。例えば、ベクターがそうであるFIVは、缶が配達することを本願明細書において開示した本願明細書主題の範囲内の標的部位に対する核酸を開示する。開示されたFIV構造物は循環への注入によって、または、局所的に標的部位への注入によって全身的に分配されることができる。そうすると、管理のいずれの方法も脳(例えば小こう細胞または星状細胞)の細胞に結果として核酸の配送になることができる。全身投与の後に核酸または導入遺伝子を脳に分配するFIVベクターの使用はPatent Cooperation Treaty Application NO.PCT/US03/13672および米国仮特許出願番号第10/781,142号に記載されている。そして、それらがこの教示に関したので、それはそれらの全部の参照によって組み込まれて本願明細書においてある。このように、本願明細書において述べられるように、主題のジョイントの注入を経て、例えば、本願明細書において開示されるように、神経性炎症性障害は炎症性の調停者の出産による既治療でありえる。加えて、本願明細書において述べられるように、骨および/またはジョイントに関連した炎症性の状況はジョイントへの注入によって、または、システム注入またはIP注入で扱われることができる。
2. 炎症性規定能
関節炎および神経炎症のような炎症性疾患は、炎症性規定能の表示または活動を阻害することによって、部分的には、処理されることができる。炎症性規定能(本明細書で用いられる)は、炎症を調整して、例えば、サイトカイン(例えばEL−Iβ)プロスタグランジン(例えばプロスタグランジンE2(PGE2))プロスタグランジンシンターゼ(例えばCOX−I、COX−2、cPGESおよびmPGES)およびそのモジュレータを含むタンパク質に関連する。a)インターロイキン−1。
炎症性規定能の実施例は、インターロイキン1(IL1)である。IL−1は、2つの主要なイソ型、IL−1αおよびIL−1βとして存在する強力な免疫調節性サイトカインである。これらの2つの分子は順番に重要な相違を示して、通常、直接の細胞×細胞コミュニケーションに関与していると考えられるIL−1αを有するいくらか異なる役割があるが、IL−1βは分泌される。にもかかわらず、これらの2つの分子は、NFKBおよびMAPキナーゼの活性化を含む炎症誘発性シグナル伝達カスケードを促進するEL−Iレセプタ1型(EL−1R1)と同じ公知の膜関連のレセプタによって行う[Rothwell、NJおよび、G.N。Luheshi.Trans Neurosci.(2000) 23:618−625]。
Eliの効果に対抗する少なくとも2つの分子は、確認された。EL−I受容体アンタゴニスト(EL−lra)は受容体結合を争う、そして、EL−Iレセプタ2型(EL−1R2)(細胞内の領域を欠いている)はおとりレセプタとして役立つと考えられる[Rothwell、NJおよび、G.N。Luheshi.Trans Neurosci.(2000) 23:618−625]。これらの分子の各々の表示は、調整される。炎症反応に対するEL−Iの貢献は、従って、これらの家族との間に表現の相対的なバランス次第である[Arend、W.P.サイトカイン及びGrowth Factor Rev.(2002)13:323−340]。一つの実施例において、EL−1βの成熟形態はIL−1raから分泌シグナルに取り付けられる。そして、それはIL−1βの分泌シグナル・シーケンスと同じシーケンスである。
通常のおよび骨関節炎軟骨からの洗浄および外植体研究は、サイトカインが疾病状態において調整されて上へある主張を支持する。具体的には、Moosその他は[Moos V、その他(1999)J Rheumatol 26:870−9]膝からの軟骨または10人の規制と比較した骨関節炎(OA)患者の股関節が、OA軟骨において調整されて上へあるJL−Iβを含む、サイトカインを示したことを証明した。脛肉その他[むこうずねS−j、など(2003)J Appl Physiol;95:308 − 13]これらの方法の酸化窒素(NO)の役割を決定するIL−1βがある場合には、半月のマトリックス回転率上の機械的ストレスの影響を検討した。IL−1の存在に関係なく、圧縮に応答するプロテオグリカン解放の刺激はNOS2に依存していた。これらの発見は、IL−1がNOに依存している経路による細胞間マトリックス回転率上の機械的ストレスの効果を調整することができることを示唆する。Joostenその他[Joosten LA、その他(1999)J Immunol;163:5049−55]IL−1のブロッキングが破壊的な関節炎の軟骨および骨保護療法であることを証明したが、TNFアルファ拮抗剤は組織滅失にほとんど影響を及ぼさない。Webbその他は[Webb GR、その他(1998)Osteoarthr及びCartil 6167−76]OA滑膜上澄がこれらのサイトカインに対する通常の滑液の上澄および中和抗体が部分的に、または、全く軟骨細胞p55 TNFR表現を増加させるOA上澄の能力を廃止したより高いインターロイキン1β(IL−1β)およびインターロイキン6(IL−6)の濃度を含むことを証明した。これらの結果は、OA滑膜によってできるIL−1およびIL−6が分解的サイトカインによって軟骨細胞を刺激により影響されやすくすることによって疾患の進行に関与することを示唆する。関節軟骨損害の程度にかかわりなく、鉄工その他は[鉄工MD、その他(1997)J Rheumatol 24:365−71]OA患者から、EL−lα、IL−1(SおよびTNFαin滑膜の生産を検討した。共同の置換外科療法時に患者に示す最もひどい変化については、それらは、炎症誘発性サイトカインの生産を有する慢性の炎症性の変化が初期のOA患者からの滑膜の特徴であることを示唆する。この低級滑膜炎は、結果としてOAの発病学に関与することができるサイトカインの生産になる。
IL−1の両方のイソ型が脳において作られるにもかかわらず、大部分の仕事は不βの役割に集中した。主に小こう細胞によってできて、IL−βは、CNS損傷の後に急速に誘発される。IL−βは多くの細胞目標に影響を及ぼす。そして、星状細胞、神経単位および血管内皮細胞を含む。中で、これらのセル群(IL−1上方制御サイトカインおよびケモカイン)は、細胞表面接着分子およびマトリックス・メタロプロテアーゼの表示を誘導して、細胞増殖を刺激する[St Pierre、B.A.CNS細胞上のサイトカインのなどEffects:グリア(中で):(編集)Ransohoff、R.M.E.N。Beveniste、Cytokines、そして、CNS(CRC Press)Boca Raton((1996)pp.151−168)]。さらに、IL−βが脳星状細胞のCOX−2を誘発することが証明された。そして、炎症誘発性プロスタグランジンPGE2の生産に導いた、[O’Banion、M.K.などNeurochem.(1996) 66:2532−2540]。まとめると、複数の脳細胞タイプ上のIL−1の無数の効果は、重要な役割を脳神経炎症性の反応を調整する際のIL−1家族に提案する。
神経炎症上のIL−1および明らかな脳外傷から神経変性疾患にわたっている状況のその遍在する表現の重大な影響は、それがCNS損傷に関与するかもしれないことを示唆する[Rothwell、NJ.そして、G.N.Luheshi.Trans Neurosci.(2000) 23:618−625]。これは、ケースであるように見える。例えば、IL−βは、発作の試作機において誘発される[Minami、M.K.などJ.Neurochem.(1992)58が:390−392]そして、IL−βの注入は、損害を悪化させるが、IL−lraまたはIL−1遮断抗体を有する処理は、著しく組織損傷を減らす、[Loddick、S.A.およびNJ.Rothwell.J.Cereb.血液Flow Metab.(1996)16:932−940およびYamasaki(Y.N.Matsuura、H.Shozuhara、H.Onodera、Y.ItoyamaおよびK.Kogure).発作(1995)26:676−681]。同様に、虚血傷害は、酵素が不足しているマウスを変えているインターロイキン1において、著しく減らされる[Friedlander、R.M.などJ.Exp.med.(1997) 185:933−940]。別の例として、ヒトIL−lra導入遺伝子のGFAPに誘導された表示は、非開放性頭部損傷[Tehranian、R.S.などJ。Neurotrauma(2002)19:939−951]のネズミのモデルの水腫、サイトカイン生産および神経病学的欠損を減らす。最後に、1型IL−1レセプタを欠いているマウスの鋭い脳外傷の研究は、小膠細胞活性化、白血球浸入および星状細胞活性化の劇的なアテニュエーションを示した[Basu、A.などJ.Neurosci.(2002) 22:6071−6082]。血管細胞接着分子−1、いくつかのサイトカインおよびCOX−2を含む多数の炎症伝達物質の表示はDL−IRlノックアウト・マウスにおいても非常に還元していた。そして、IL−1の信号を送っている経路が神経膠の活性化および神経炎症性の反応にとって重要なことを示した。しかしながら、短期注入およびウィルス・デリバリー系は、慢性刺激を提供しない、そして、遺伝子のノックアウト・システムは、現像の間、潜在的代償の変化によって難しくなる。b)シクロオキシゲナーゼCOX。
炎症性規定能の他の実施例は、酵素シクロオキシゲナーゼ(コックス)である。シクロオキシゲナーゼは非ステロイド系抗炎症薬(剤)(NSADDs)の主要な標的である。そして、それは多くの炎症性の状況の治療のメーンステーである。シクロオキシゲナーゼはプロスタノイドにアラキドン酸の転換の第一段階に触媒作用を及ぼす。そして、一群の強力な脂質規定能が多様な生理的方法で作用する。
シクロオキシゲナーゼは、2つのイソ型の中に存在することは公知である:COX−I(多くの組織のそれは、プロスタノイドの構成的に表されたおよび(に)責任があるホメオスタシス生産であるように見える)およびCOX−2(その表現が成育因子、サイトカインおよびホルモン類のような多様な刺激に応答して急速に調整された時から、「誘導性の」イソ型としばしば呼ばれる)[O’Banion MK、その他(1991).J Biol Chem 266:23261−7;O’Banion MK、その他(1992).Proc Natl Acad Sci U.S.A.89:4888−92]。これらの2つのCOXイソ型の差異、それらが演奏する役割およびプロスタノイドの動作は、以前チェックされた[羽根JR、その他(1998).Annu.Rev.Pharmocol.毒物学38:97−120;鉄工、WL、その他(2000).Annu Rev Biochem 69:145−82]。
PGE2(原理炎症性プロスタノイド)の選択的に抑制性生産に対する関心は、伝えられるところでは異なったコックス・イソ型に連結する少なくとも2つのPGE2シンターゼ・イソ型の認識によって高められた。より詳しくは、膜関連のイソ型(mPGES)は、COX−2に機能的に連結するが、サイトゾル酵素(cPGES)は、COX−Iにリンクされるように見える−PGE2の中で依存している製造(Taniokaなど2000;Murakamiなど(2000))。細胞局在が若干の役割を演ずることができるにもかかわらず、機能的な継手は主に発現パターンの要因である:COX−2と同様に、mPGESは炎症誘発性刺激によって劇的にアップレギュレートされるが、cPGESは現在まで検討される細胞システムにおいて構成的に表される(Jackobsonなど、1999;Stichtenothなど、2001;Hanなど(2002))。加えて、COX−2およびmPGESは、アジュバント関節炎(Manciniなど、2001)のネズミ・モデルにおいて、同等にアップレギュレートされる。
3. 抑制
炎症性規定能の活動を調整するために行う組成物は、本願明細書において設けられている。「活性」(本明細書で用いられる)は、いかなる機能もまたは本願明細書において開示される組成物の処理に関連して、例えば、転写、翻訳、翻訳後修飾、トランスロケーション、同種親和性であるか好異種の締め具、分泌、エンドサイトーシスまたは分解を含む。本願明細書において設けられている炎症性規定能の一つ以上の動作を禁止する組成物は、従って、開示される。これらの組成物は、炎症性規定能インヒビターとして本願明細書において参照される。抑制または、阻害または抑制のような、本明細書で用いられる抑制の形は、制限するかまたは制限するつもりである。故障排除または、還元または故障排除のような、本明細書で用いられる例えばサイズまたは量の故障排除(dimmishのための手段)の形。どこで阻害または故障排除のうちの1つが使われても、明確に別途示されない限り、その他が使われることもできるものと理解される。例えば、何かが「自己抑制的な」ものと呼ばれる場合、それは「還元した」ものと呼ばれるとみなされもする。
a) 遺伝子形質発現のノックダウン
炎症性規定能の活動は、遺伝子形質発現レベルで調整されることができる。開示された炎症性規定能インヒビターは、遺伝子形質発現インヒビターでありえる。ターゲッティング遺伝子形質発現の方法は、通常、目標とされる遺伝子の配列に基づく。炎症性規定能の目標とされたノックダウンに適用されることができるいずれの種類の方法は、開示される。「ノックダウン」によって、検出可能なメッセンジャーRNA表現の減少は、意味される。核酸が、通常、ノックダウン遺伝子形質発現に用いられて、一般に、標的配列(例えばメッセンジャーRNA)に交雑することができる配列から成る。この種の機能的な核酸の例としては、アンチセンス分子、リボザイム、三重式の成形核酸、外部のガイド・シーケンス(EGS)および小さい干渉するリボゾームリボ核酸(siRNA)が挙げられる。
アンチセンス分子は、標準的であるか非正規塩基の対合による目標核酸分子と相互に作用するように設計されている。アンチセンス分子および標的分子の相互作用は、例えば、RNAseHによって媒介されるリボゾームリボ核酸−DNAハイブリッド低下による標的分子の滅失を促進するように設計されている。あるいは、アンチセンス分子は、標的分子(例えば転写または複製)に通常起こる処理機能を中断するように設計されている。アンチセンス分子は、標的分子のシーケンスに基づいて設計されることができる。標的分子で最も近づきやすい地方を見つけることによるアンチセンス効率の最適化のための多数の方法が、存在する。典型的な方法は生体外選択実験である、そして、DNA修飾はジメチル硫酸およびDEPCを使用することを研究する。アンチセンス分子が標的分子を10−6、10−8、10−10または10−12以下の解離定数(kd)で縛ることが好ましい。方法の代表試料および設計の援助およびアンチセンス分子の使用がアメリカ特許の以下の非限定的なリストにおいて見つけられることができる技術:5,135,917、5,294,533、5,627,158、5,641,754、5,691,317、5,780,607、5,786,138、5,849,903、5,856,103、5,919,772、5,955,590、5,990,088、5,994,320、5,998,602、6,005,095、6,007,995、6,013,522、6,017,898、6,018,042、6,025,198、6,033,910、6,040,296、6,046,004、6,046,319および6,057,437。しかしながら、リリー硫酸ナイルブルー染色法またはsiRNAまたはそれらの使用法の効果は、機構の任意型に限られていない。
シーケンスに基づいて上記の通りに設計されるいかなるアンチセンス分子も、本願明細書において開示する本願明細書炎症伝達物質を開示する。アンチセンス・シーケンスの実施例は、IL−lαのために本願明細書において開示される(配列番号70)IL−β(配列番号71)COX−I(配列番号72)COX−2(配列番号73)cPGES(配列番号74)そして、mPGES(SEQ E)NO:75)。
リボザイムは、分子内に、または、分子間的に、化学反応に触媒作用を及ぼすことができる核酸分子である。リボザイムは、このように触媒核酸である。リボザイムが分子間反応に触媒作用を及ぼすことが好ましい。ヌクレアーゼに触媒作用を及ぼす多くの異なるタイプのリボザイムまたは自然分類(例えばハンマーヘッド・リボザイム)で見つかるリボザイムに基づく核酸ポリメラーゼ典型的反応が、ある(以下のアメリカ特許に対する有限責任でなく、実施例のために:5,334,711、5,436,330、5,616,466、5,633,133、5,646,020、5,652,094、5,712,384、5,770,715、5,856,463、5,861,288、5,891,683、5,891,684、5,985,621、5,989,908、5,998,193、5,998,203、LudwigおよびSproatによるWO 9858058、LudwigおよびSproatによるWO 9858057およびLudwigおよびSproatによるWO 9718312)ヘアピン・リボザイム(以下のアメリカ特許に対する有限責任でなく、実施例のために:5,631,115、5,646,031、5,683,902、5,712,384、5,856,188、5,866,701、5,869,339および6,022,962)そして、テトラヒメナ・リボザイム(以下のアメリカ特許に対する有限責任でなく、実施例のために:5,595,873、そして、5,652,107)。自然分類で見つからない、しかし、新規特異反応に触媒作用を及ぼすために設計された多くのリボザイムも、ある(以下のアメリカ特許に対する有限責任でなく、実施例のために:5,580,967、5,688,670、5,807,718、そして、5,910,408)。好適なリボザイムは、リボゾームリボ核酸またはDNA基質を切断して、より好ましくは、リボゾームリボ核酸基質を切断する。リボザイムは、概して認識による核酸基質および次の裂開を有する標的基板の締め具を切断する。この認識は、大部分は標準的であるか非正規塩基対相互作用に、しばしば基づく。標的基板の認識が標的基板配列に基づくので、この所有物はリボザイムに特に核酸の目標特異的切断の良好な候補を作る。様々な異なる反応を引き起こすためにリボザイムを製作し使用する方法の代表例は、アメリカ特許の以下の非限定的なリストで見つかることができる:5,646,042、5,693,535、5,731,295、5,811,300、5,837,855、5,869,253、5,877,021、5,877,022、5,972,699、5,972,704、5,989,906および6,017,756。
シーケンスに基づいて上記の通りに設計されるいかなるリボザイムも、本願明細書において開示する本願明細書炎症伝達物質を開示する。ハンマーヘッド・リボザイムは、GUCサイトにすぐ3フィート・メッセンジャーRNAを切断して、実施例(5’−GUC−3フィート・シーケンス)のために、リボゾームリボ核酸基質を切断することができる。ハンマーヘッド・リボザイムを設計する、異なるシーケンスのどの開裂が、公知で、例えば、本願明細書において開示される特許において、開示されて、引用したものとされる。ハンマーヘッド・リボザイムは、3つのパーツから典型的に成る。第1の一部は、GUC認識部位のシーケンス5フィートに交雑する領域であって、第1のハイブリダイゼーション腕と呼ばれていることができる。第二部品は、ハンマーヘッド・リボザイムの中心的な触媒領域から成って、概してシーケンス3’CAAAGCAGGAGUGCCUGAGUAGUC5’を有する(配列番号82)。このシーケンス上のバリエーションは、公知で、開示されて、本願明細書において開示される特許において参照によって、例えば、組み込まれて本願明細書においてある。1/3一部は、GUC切断部位にすぐ3フィート・シーケンスに交雑することができる配列から成って、第2のハイブリダイゼーション腕と呼ばれていることができる。ハイブリダイゼーションアームは、例えば、長く長く3−40のヌクレオチド、長く5−30のヌクレオチド、8−20、長くヌクレオチドおよび10−15のヌクレオチド(50のヌクレオチドまでのいかなる長さと同様にも)から基質と結合することを可能にしているいかなるlebghtでもありえる。例えば、ハンマーヘッド・リボザイムはメッセンジャーRNA標的配列の中で核酸三つ子GUCを確認することによって設計されることができる、そうすると、触媒コアに本願明細書において述べられるのと同程度本願明細書において述べられる適切な交雑させているアームを確認する。ハンマーヘッド・リボザイム・シーケンスの実施例は、EL−lαのために本願明細書において開示される(配列番号76)IL−1β(配列番号77)COX−I(配列番号78)COX−2(配列番号79)cPGES(配列番号81)そして、mPGES(配列番号80)しかし、本願明細書において述べられるように、その他も開示されるものと理解される。さらにまた、本願明細書において述べられるように、分析を使用して、生体外で、そして、生体内で、1は、所与のリボザイム(またはいかなる機能的な核酸(例えばsiRNAまたはアンチセンス)も)を活性のそのレベルを見つけるため検査することができる。
三重式の成形機能的な核酸分子は、二本鎖であるか一本鎖核酸と相互に作用することができる分子である。三重式の分子が目標領域と相互に作用するときに、三重式と呼ばれている構造は形成される。そこにおいて、合成の従属部分をWatson−CrickおよびHoogsteen塩基対合の上に形成しているDNAの3つの要素がある。それらが目標地方を高親和性および特異性で縛ることができるので、三重式の分子は好まれる。三重式の成形分子が標的分子を10¨6未満の1kdで縛ることが好ましい、10インチ、10インチまたは10インチ。様々な異なる標的分子を結合するために三重式の成形分子を製作し使用する方法の代表例は、アメリカ特許の以下の非限定的なリストで見つかることができる:5,176,996、5,645,985、5,650,316、5,683,874、5,693,773、5,834,185、5,869,246、5,874,566および5,962,426。
外部のガイド・シーケンス(EGSs)は複合体を形成している目標核酸分子を結合する分子である、そして、この複合体はRNアーゼPによって認識される。そして、それは標的分子を切断する。EGSsは、特に選択の余地のリボゾームリボ核酸分子を目標とするように設計されていることがありえる。セルの中の処理運搬RNA(運搬RNA)のRNAse P援助。細菌RNAse Pは、目標リボゾームリボ核酸が生じるEGSを用いて実質的にいかなるリボゾームリボ核酸シーケンスも切断するために補充されることができる:自然な運搬RNA基質を模倣するために合成のEGS。(Yale(そして、Forsterおよびアルタイ山間人)によってWO 92/03566 Science 238:407−409の(1990))。同様に、リボゾームリボ核酸の真核生物EGS/RNAse Pに誘導された裂開は、eukaroticなセルの中で所望の目標を切断するために利用されることができる。(Yuanなど、会報Natl. Acad. Sci.USA 89:8006−8010の(1992);YaleによるWO 93/22434;YaleによるWO 95/24489;Yuanおよびアルタイ山間人(EMBO J 14):159−168の(1995)およびCarraraなど、会報Natl. Acad. Sci.(USA)92:2627−2631の(1995))。様々な異なる標的分子の裂開を促進するためにEGS分子を製作し使用する方法の代表例は、アメリカ特許の以下の非限定的なリストで見つかる:5,168,053、5,624,824、5,683,873、5,728,521、5,869,248および5,877,162。
遺伝子形質発現は、リボゾームリボ核酸干渉(RNAi)による非常に特定の方法で、効果的に静まることもできる。このサイレンシングは、最初は二重鎖RNA(二本鎖RNA)(Fire,A.その他(1998)Nature、391、806 811)(Napoli、C、その他(1990)Plantセル2(279 289))の追加によって観察された(Harmon、GJ。(2002)Nature、418、244 251)。一旦二本鎖RNAがセルに入ると、それはRNアーゼIIIによって切断される−3’末端(Elbashir、S.M.その他(2001)Genes Dev.(15:188−200))(Bernstein、E.その他(2001)Nature、409、363 366)(Hammond、S.M.その他(2000)Nature(404:293−296))上の2つのヌクレオチド突出を含む長さの二本鎖小さい干渉するリボゾームリボ核酸(siRNA)21−23ヌクレオチドへの酵素(Dicer)のように。ATPに依存するステップにおいて、siRNAsは多サブユニット・タンパク質複合体に組み込まれる。そして、共通にRNAiによって誘発されたサイレンシング複合体(RISC)として公知である。そして、それはsiRNAsを目標RNA配列(Nykanen、A.その他(2001)セル、107:309 321)へ導く。数ポイントで、二重siRNAは解ける、そして、アンチセンスストランドがRISCに縛られたままで、内およびエキソヌクレアーゼ(Martinez、J.その他(2002)セル、110:563−574)の組合せによって補完的なメッセンジャーRNAシーケンスの低下を導くように見える。しかしながら、リリー硫酸ナイルブルー染色法またはsiRNAまたはそれらの使用法の効果は、機構のanytypeに限られていない。
短い干渉するリボゾームリボ核酸(siRNA)はsequence−に特有の転写後遺伝子サイレンシングを誘発することができる二重鎖RNAである。それによって、減少するかまたは遺伝子形質発現さえ阻害する。一つの実施例において、siRNAは、siRNAおよび目標リボゾームリボ核酸との間に配列同一性の領域の中で、相同のリボゾームリボ核酸分子(例えばメッセンジャーRNA)の特定の分解を誘発する。例えば、3フィートに突き出ている端によってベース・ペアードときに、WO 02/44321は目標メッセンジャーRNAの配列特異的低下ができるsiRNAsを開示する、本願明細書においてこれらのsiRNAsを作る方法のための参照によって組み込まれて。シーケンスに特有の遺伝子サイレンシングは、酵素ダイサーによってできるsiRNAsを模倣する、合成、短い二重鎖RNAを使用している哺乳動物細胞において成し遂げられることができる(Elbashir、S.M.など(2001)Nature、411:494 498)(Ui−Tei、K.その他(2000)FEBS Lett 479:79−82)。siRNAは、化学的にそうでありえる、または、vzYro総合されて中で、または、細胞内部でsiRNAsに処理される短い二本鎖ヘアピンのようなリボゾームリボ核酸(shRNAs)の結果であることができる。合成siRNAsは、通常、アルゴリズムおよび従来のDNA/リボゾームリボ核酸シンセサイザを使用して設計される。供給元は、Ambion(Austin、テキサス州)ChemGenes(Ashland、マサチューセッツ州)Dharmacon(Lafayette、コロラド州)Glen Research(英貨、バージニア州)MWB Biotech(Esbersberg、Germany)Proligo(Boulder、コロラド州)およびQiagen(Vento、Netherlands)を含む。siRNAは、キット(例えばAmbion)を使用して、生体外で合成されることもできる』s SILENCER siRNA Constructionキット。シーケンスに基づいて上記の通りに設計されるいかなるsiRNAも、本願明細書において開示する本願明細書炎症伝達物質を開示する。siRNAの実施例は、以下から成る:COX−I(配列番号:47−52)COX−2(配列番号:53−58)cPGES(配列番号:41−46)そして、mPGES(配列番号59)。
ベクターからsiRNAの生産は、shRNAの転写によって、より共通にされる。例えばImgenexのGeneSuppressor Construction KitsおよびインビトロゲンのBLOCK−iT誘導性のRNAiプラスミドおよびレンチウイルス・ベクターのような、shRNAから成るベクターの製造のためのキットは、利用できる。シーケンスに基づいて上記の通りに設計されるいかなるshRNAも、本願明細書において開示する本願明細書炎症伝達物質を開示する。shRNAプライマー配列の実施例は、COX−Iのために開示される(配列番号:64−65)COX−2(SEQ DD NOs:66−67)cPGES(配列番号:60−61)そして、mPGES(配列番号62−63)。
b) 結合する抑制
目標とされることができる炎症性規定能の他の活動は、他の分子(例えばレセプタ)に対する同種親和性および好異種の締め具である。このように、炎症性規定能インヒビターは、リガンド結合阻害剤でありえる。タンパク質をそのレセプタに結合することを阻害する方法は、例えば、リガンドかレセプタの結合部を争う分子の使用に基づくことがありえる。60. このように、リガンド結合阻害剤は、例えば、レセプタを起動させることのないレセプタの締め具を争うポリペチドでありえる。同様に、リガンド結合阻害剤は、リガンドの締め具を争うおとりレセプタでありえる。この種のおとりレセプタは可溶性のレセプタ(例えば、膜貫通領域を欠いている)でありえる、または、それは信号(例えば、細胞質の尾部を欠いている)を変換する能力が欠如していること以外の細胞において表される変異体レセプタでありえる。リガンドかレセプタに特有の抗体は、締め具を阻害するために用いることもできる。リガンド結合阻害剤が、主題によって自然にできることもできる。あるいは、抑制の分子は、レセプタかリガンドの目標とされた突然変異に基づいて設計されることができる。
このように、図示する実施例として、リガンド結合阻害剤は、IL−1受容体アンタゴニスト(IL−Ira)でありえる。リガンド結合阻害剤はIL−Iraの断片から成るポリペチドでもありえる。そこにおいて、断片はIL−1R1を結合することができる。リガンド結合阻害剤は更にIL−1R2でありえる。そして、それは結合しているIL−1を争うことができるレセプタの可溶形態である。リガンド結合阻害剤は、更にIL−1R1の断片から成るポリペチドでありえる。IL−1R1断片は細胞質の尾部を欠いていることができる。そして、それはToll/インターロイキン1(DLI)受容体(TIR)領域を含む(SEQ DD NOのアミノ酸384−528:8)。IL−1R1の断片は、膜貫通領域に対応するアミノ酸を欠いていることができる。
4. 抗体
炎症伝達物質またはそれらのレセプタに特有の抗体が、本願明細書において用いられることができる。 設けられている組成物および方法用に例えば、開示するIL−1βまたはEL−Iレセプタに特有の中和抗体または前記antibodesをコード化している核酸である。
(1) 通常、抗体
条件「抗体」広義に本願明細書において使用されて、そして、ポリクローナルおよび単クローン抗体を含む。完全な免疫グロブリン分子(また、「抗体」がそれらの免疫グロブリン分子の断片またはポリマーである期間に含まれる)および免疫グロブリン分子またはその断片の人間であるかヒト化バージョンに加えて、それらが炎症伝達物質またはそれらのレセプタと相互に作用するそれらの能力のために選択される限り、この種のその炎症伝達物質はそのレセプタと相互に作用するのを妨げられる。抗体は本願明細書において、または、類似した方法によって記載されている生体外分析を使用しているそれらの所望の活性を試験されることができる。そして、それの後、それらの生体内での治療的なおよび/または予防動作は周知の臨床試験方法に従ってテストされる。本明細書で使用される「単クローン抗体」という用語は、抗体、i.e.集団内の抗体が抗体分子の小さいサブセットに存在してもよい可能な自然に生じる突然変異で同一である個人の実質的に均一な人口から得られる抗体を意味する。本願明細書において単クローン抗体は特に、一部の重いおよび/または軽いチェーンが特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに帰属している抗体の対応配列と同一であるか相同である「キメラの」抗体を含む。その一方で、それらが所望の拮抗的な活性(見る、米国特許第4,816,567号およびMorrisonなど、会報Natl. Acad. Sci.USA、81:6851−6855の(1984))を呈する限り、チェーン(s)の剰余は他の種に由来するかまたは他の抗体クラスまたはサブクラス(この種の抗体の断片と同様に)に帰属している抗体の対応配列と同一であるか相同である。開示された単クローン抗体は、モノフォニックのクローンの抗体を生産するいかなる手順も使用して作られることができる。例えば、 抗体がハイブリードーマ法を使用して用意されることができるモノクローナルが、開示した − 例えば、人々は、256:495にケーラーおよびMilstein(Nature)によって(1975)を解説した。ハイブリードーマ法において、マウスまたは他の適当な宿主動物はリンパ球を引き出すために免疫している剤によって典型的に免疫される。そして、それは生じるかまたは特に免疫している剤と結合する抗体を生産してできる。あるいは、リンパ球は生体外で、例えば免疫されることができる。そして、本願明細書において記載されているHIV Env−CD4−共同−受容体複合体を使用する。単クローン抗体は、組換えDNA方法(例えば米国特許番号4,816,567(Cabillyその他)に記載されているそれら)によって作られることもできる。開示された単クローン抗体をコード化しているDNAは、直ちに分離されることができて、従来の手順(例えば、特にネズミの抗体の重鎖および軽鎖をコード化している遺伝子と結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)を用いて順序付けた。抗体または作動中の抗体フラグメントのライブラリは、例えば、Barbasその他にBurtonその他に対する米国特許番号5,804,440および米国特許番号6,096,441にて説明したように、バクテリオファージ表示技術を使用して、発生することもできて、放送されることもできる。生体外方法は、プレペアリング一価抗体にも適している。生産する抗体の消化はそれについて、特に、Fabフラグメントを分解する、公知技術のルーチン技術を使用して達成されることができる。例えば、消化は、パパインを使用して実行されることができる。パパイン消化の実施例は、1994年12月22日に発表されるWO 94/29348および米国特許番号4,342,566に記載されている。抗体のパパイン消化は概して2つの同一のFab分屑を生じる。そして、Fabフラグメント(単一の抗原結合部位を有する各々)および残余のFcフラグメントと呼ばれている。ペプシン処理は、2つの抗原結合部位を有して、テストを架橋させることがまだできる断片を得る。他のシーケンスに取り付けられるかどうか、断片は特定領域または特定のアミノ酸残基の挿入、削除、置換または他の選択された変更態様を含むこともできると、抗体の活性が定めた、または、抗体フラグメントは非改質抗体または抗体フラグメントと比較して著しく変えられないかまたは損なわれない。これらの変更態様はさらに若干の所有物が、例えば接着しているジスルフィドができるアミノ酸を除去して/加えるために、そのバイオ長命を増加させるために定めることができる、その分泌の特徴を変えるために、いかなるケースも、抗体または抗体フラグメントにおいてなどは生理活性所有物(例えばその同族のテストに対する特異的結合)を所有しなければならない。抗体または抗体フラグメントの機能的であるか能動的な領域はタンパク質の特定の領域の突然変異生成によって確認されることができる。そして、表されたポリペチドの表示およびテストが続く。この種の方法は、従来技術において熟練した実務家にとって直ちに明らかで、抗体または抗体フラグメントをコード化している核酸の部位特異的突然変異を含むことができる。(Zoller、MJ.ゴロゴロ.Opin.iotechnol。3:348−354, 1992)。ここで使用しているように、用語「抗体」または「抗体」は、ヒト抗体および/またはヒト化抗体を言及することもできる。多くの人間外の抗体(例えばマウス、ネズミまたはウサギに由来するそれら)は、人間において自然に抗原性で、このように、人間に与えられるときに、望ましくない免疫応答を起こすことができる。従って、方法のヒトであるかヒト化抗体の使用は、人間に投与される抗体が望ましくない免疫応答を呼び起こすという可能性を少なくするのに役立つ。
(2) ヒト抗体
開示されたヒト抗体は、いかなる技術も使用して準備されることができる。ヒト単クローン抗体産生の技術の実施例は、Coleその他によって記載されているそれらを含む。{モノクローナルのAntibodiesおよびCancerTherapy、Alan R.Liss、77ページ、1985)そして、Boernerその他によって(J.Immunol.147(l):86−95, 1991)。ヒト抗体(そして、その断片)は、バクテリオファージ表示ライブラリを使用して生じることもできる(Hoogenboomなど、J.MoI.生物学、227:381、1991;マークなど、J.MoI.Biol、222:581、1991)。開示されたヒト抗体は、トランスジェニック動物から得られることもできる。例えば、ヒト抗体の完全なレパートリを生じることができる、移植遺伝子の、突然変異のマウスは、免疫化に応答して、記載されていた(Jakobovitsなど、会報Natl. Acad. Sci.USA、90参照:2551−255の(1993);Jakobovitsなど、Nature、362:255−258の(1993);Bruggermannなど、Immunol.のYear、7:33(1993))。具体的には、これらのキメラのおよび生殖系列変異体マウスの抗体H鎖J領域(J(H))遺伝子の同型接合の削除は結果として内因性の抗体産生の完全な抑制になる、そして、この種の生殖系列変異体マウスへのヒト生殖系列抗体遺伝子配列の成功した転送はテスト・チャレンジに応じて結果としてヒト抗体の生産になる。所望の活性を有する抗体は、本願明細書において記載されて、Env−CD4−共同−受容体複合体を使用することを選ばれる。
(3) ヒト化抗体
抗体人間化技術は、抗体分子の一つ以上のポリペプチド鎖をコード化しているDNAの塩基配列を操作するために、一般に組換えDNA技術の使用を含む。したがって、人間外の抗体(または断片単独)のヒト化形は、ヒト(受取人)抗体のフレームワークに組み込まれる人間外の(ドナー)抗体から一部の抗原結合部位を含むキメラ抗体または抗体チェーン(または断片単独(例えばFv、Fab、Fab1または抗体の他の抗原結合性部分))である。ヒト化抗体を生成するために、受取人(人間的な)抗体分子の一つ以上の相補性決定領域(CDR)から残基は、テストを結合している特徴(例えば特異性の特定のレベルおよび標的抗原のための親和性)を要求したことは公知であるドナー(人間でない)抗体分子の一つ以上のCDRから、残基と交換される。ある場合には、ヒト抗体のFvフレームワーク(FR)残基は、対応する人間外の残基と交換される。ヒト化抗体は、残基ウインチを含むこともできる輸入されたCDRまたはフレームワークのレシピエント抗体が配列するどちらのmもないことを見つける。
通常、ヒト化抗体は、人間でないソースからそれにもたらされる一つ以上のアミノ酸残基を有する。実際には、ヒト化抗体は、概して、若干のCDR残基およびおそらく数FRの残基が齧歯目の抗体の類似したサイトから残基によって置換されるヒト抗体である。ヒト化抗体は、少なくとも一般に一部の抗体恒常部(Fc)(概してヒト抗体のそれ)を含む(ジョーンズなど、Nature、321:522−525の(1986)Reichmannなど、Nature、332:323−327の(1988)およびPresta(Curr).Opin.struct.Biol、2:593−596の(1992))。人間外の抗体を人間らしくする方法は、公知技術である。例えば、齧歯目のCDRまたはCDRシーケンスをヒト抗体の対応配列と置換することによって、ヒト化抗体は、冬および同僚(ジョーンズなど、Nature、321:522−525の(1986)Riechmannなど、Nature、332:323−327の(1988)Verhoeyenなど、Science、239:1534−1536の(1988))の方法に従って発生することができる。ヒト化抗体を生じるために用いることができる方法は、米国特許番号4,816,567(Cabillyその他)米国特許番号5,565,332(Hoogenboomその他)米国特許番号5,721,367(キーその他)米国特許番号5,837,243(Deoその他)米国特許番号5、939,598(Kucherlapatiその他)米国特許番号6,130,364(Jakobovitsその他)および米国特許番号6,180,377(Morganその他)に記載されてもいる。
(4) 抗体の管理
本願明細書において開示されるように、抗体の管理はされることができる。抗体送出のための核酸方法も、存在する。広く効力を消している反xxx抗体および抗体フラグメントは抗体または抗体フラグメントをコード化する核酸準備(例えばDNAまたはリボゾームリボ核酸)として患者または主題に与えられることもできる。そうすると、患者のまたは主題の自身の細胞は核酸を始めて、コード化された抗体または抗体フラグメントを生じて、隠す。例えば、本願明細書において開示されるように、核酸の配送がいかなる手段によってもあることができる。
C.組成物
炎症性規定能の活動を阻害することができる構造物は、本願明細書において開示される。一つの態様では、構造物は核酸から成るベクターである。そこにおいて、核酸はインヒビターのために符号化する。構造物の核酸は、炎症性規定能のシーケンスに基づくことがありえる。
1. 炎症伝達物質−シーケンス
開示された構造物は、IL−1αのシーケンスに基づいて、核酸から成ることができる。核酸一次構造は、ヒトIL−1αのシーケンスに基づくことがありえる。ヒトIL−1αをコード化している核酸の例は、配列番号である:1、Accession番号NM_000575。
開示された構造物は、IL−1βのシーケンスに基づいて、核酸から成ることができる。核酸一次構造は、ヒトIL−1βのシーケンスに基づいてそうすることができる。ヒトIL−1βをコード化している核酸の例は、配列番号である:2、Accession番号NM_000576。
開示された構造物は、不lraのシーケンスに基づいて、核酸から成ることができる。核酸一次構造は、ヒトIL−lraのシーケンスに基づいてそうすることができる。ヒトEL−lraをコード化している核酸の例は、配列番号である:5、Accession番号NM_173842。
開示された構造物は、IL−1R1のシーケンスに基づいて、核酸から成ることができる。
核酸一次構造は、人間のIL−1RAのシーケンスに基づいてそうすることができるヒトIL−1R1をコード化している核酸の例は、配列番号である:8、Accession番号NM_000877。
開示された構造物は、EL−1R2のシーケンスに基づいて、核酸から成ることができる。核酸一次構造は、ヒトIL−1R2のシーケンスに基づいてそうすることができる。ヒトIL−1R2をコード化している核酸の例は、配列番号である:9、Accession番号NM_173343。68. 開示された構造物は、コックス−1のシーケンスに基づいて、核酸から成ることができる。核酸一次構造は、ヒトCOX−Iのシーケンスに基づいてそうすることができる。ヒトCOX−Iをコード化している核酸の例は、配列番号である:10、Accession番号M59979。
開示された構造物は、コックス−2のシーケンスに基づいて、核酸から成ることができる。核酸一次構造は、ヒトCOX−2のシーケンスに基づいてそうすることができる。ヒトCOX−2をコード化している核酸の例(配列番号11、Accession番号NM_000963。
開示された構造物は、mPGESのシーケンスに基づいて、核酸から成ることができる。核酸一次構造は、ヒトmPGESのシーケンスに基づいてそうすることができる。ヒトmPGESをコード化している核酸の例は、配列番号である:12、Accession番号NM_004878。
開示された構造物は、cPGESのシーケンスに基づいて、核酸から成ることができる。核酸一次構造は、ヒトcPGES/p23のシーケンスに基づいてそうすることができる。ヒトcPGES/p23をコード化している核酸の例は、配列番号である:13、Accession番号L24804。
核酸が炎症の規定能の表示を禁止することができる機能的な核酸は、本願明細書において開示される。また、本願明細書において開示する核酸から成る構造物が、使用可能な状態で発現制御配列との関連がある機能的な核酸をコード化する。機能的な核酸は、siRNAから成ることができる。siRNAは、COX−Iのための核酸一次構造に由来することができる(配列番号10)。このように、siRNAは、核酸一次構造配列番号を有することができる:47、48、49、50、51、または52。siRNAは、COX−2のための核酸一次構造に由来することができる(配列番号11)。このように、siRNAは、核酸一次構造SEQ E)NOを有することができる:53、54、555、56、57、または58。siRNAは、mPGESのための核酸一次構造に由来することができる(配列番号12)。このように、siRNAは、核酸一次構造配列番号を有することができる。
siRNAは、cPGESのための核酸一次構造に由来することができる(配列番号13)。このように、siRNAは、核酸一次構造配列番号を有することができる:41,42、43、44、45、または46。
使用可能な状態で、発現制御配列(ポリペチドがIL−1を不1R1.に結合することを阻害することができる)との関連があるポリペチドをコード化している核酸から成る構造物は本願明細書において開示するポリペチドは、IL−1raから成ることができる。ポリペチドは、アミノ酸配列配列番号を有することができる:
ポリペチドは、IL−1raの断片から成ることができる。ポリペチドは、アミノ酸配列SEQ ED NOに、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%のアイデンティティを有することができる:
核酸は、シーケンスSEQ ID NO.5から成ることができる。核酸は、ポリペチドをコード化する少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、核酸一次構造配列番号に対する95%のアイデンティティによってそれ:5開示もする、核酸一次構造配列番号によって、本願明細書において記載されているにつれて、厳しい状況の下で交雑することができる核酸、か何かが、状況である。
ポリペチドはIL−1R1の断片から成ることができる。そこにおいて、断片はIL−1を結合することができる、そして、断片は信号cascaseを起動させる還元した能力を有する。当業者が直ちにIL−1を結合するポリペチドの能力を決めることができるかまたは標準生化学および分子遺伝学技術および試薬を使用している信号cascaseを起動させることができるものと理解される。例えば、断片は、膜貫通領域を欠いているトランケーションでありえる。膜貫通領域はどこで確認されなかった、当業者が、例えば、疎水性プロット線を使用しているアミノ酸配列に基づいてこの領域の近似の位置を推定することができるものと理解される。別の例として、断片は細胞質の尾部の一部を欠いていることができる。そして、それはToll/インターロイキン1(IL−1)受容体(TIR)領域を含む(配列番号のアミノ酸384−528:8)。ポリペチドは、アミノ酸配列配列番号を有することができる:ポリペチドは、アミノ酸配列配列番号まで少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%のアイデンティティを有することができる:核酸は、シーケンス配列番号から成ることができる:核酸は、ポリペチドをコード化する少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、核酸一次構造配列番号に対する95%のアイデンティティによってそれ:開示もする、核酸一次構造配列番号によって、本願明細書において記載されているにつれて、厳しい状況の下で交雑することができる核酸、か何かが、状況である:
ポリペチドは、IL−1R2から成ることができる。ポリペチドは、アミノ酸配列配列番号を有することができる:40。ポリペチドはIL−1R2の断片から成ることができる。そこにおいて、断片はEL−Iを結合することができる、そして、断片は信号cascaseを起動させる還元した能力を有する。ポリペチドは、アミノ酸配列配列番号まで少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%のアイデンティティを有することができる:40。核酸は、シーケンス配列番号から成ることができる:9。核酸は、ポリペチドをコード化する少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、核酸一次構造配列番号に対する95%のアイデンティティによってそれ:9。開示もする、核酸一次構造配列番号によって、本願明細書において記載されているにつれて、厳しい状況の下で交雑することができる核酸、か何かが、状況である:9。
本願明細書、開示されたポリペチドは、分泌シグナルから更に成ることができる。分泌シグナルはIL−lra分泌シグナル配列でありえる。そして、それはIL−1βの分泌シグナル・シーケンスと同じシーケンスである。このように、分泌シグナルは、ポリペチド・シーケンス配列番号から成ることができる:14。分泌シグナルは、核酸一次構造配列番号によってコード化されることができる:68。
開示された構造物は、ベクター・デリバリー系に組み込まれることができる。かくして、開示する核酸から成るベクターが、本願明細書において提供する。発現制御配列は、通常、プロモータである。プロモータは、いかなるプロモータ(例えば本願明細書において述べられるそれら)でもありえる。
本願明細書において設けられている構造物の目標とされたおよびグローバルな交付も、開示される。グローバルな導入遺伝子送出のための偽型ネコ免疫不全ウイルス(FIV)は、開示される。治療的な遺伝子の安定な発現は、治効を強化していて、長期の治療的な結果の原因となっている遺伝子の異常の長期にわたる回復を補助する。本願明細書において開示されるバックボーンFIVシステムのうちの1つは、Poeschla EM、など、Nature Medicine 4に記載される:354−357.(1998)。例えば、本願明細書において開示する周産期の全身FΙV後のマウスの3ヵ月以上間のレポーター遺伝子lacZの安定な表示が、(lacZ)管理である。
これらの構造物の研究のためのモデル系は、移植遺伝子でexisionallyに起動するIL−1βである(XAT)マウス(IL−1βXAT)そして、そのバリエーション。バリエーションは、例えば組織特異的プロモータの使用を例えばCOLL1A1−DL−β5XAT1マウスに含む。このマウスモデルはU.S.特許出願番号第60/627,604号の主題である。そして、それは開示されたマウスモデルに関連した教示のためのその全部の参照によって組み込まれて本願明細書においてある。このマウスモデルは、Creレコンビナーゼ発現ベクター(例えば標的部位に対するFΙV(Cre))の配達に基づいて、局所化された炎症の誘導を考慮に入れる。例えばCOLLI Al−DLIβXATの接点へのFΙV(Cre)の配達」マウスは、型関節炎に炎症を誘発することができる。モデルがこのようにそうすることができるこのマウスは、例えば、関節炎上の設けられている構造物の効果を試験したものであるかまたは最適化したものである。また、本願明細書において開示するいずれでも分配するFIVベクターの能力をあるの本願明細書ベクターの循環かジョイントへの注入後の主題の脳に対する核酸または導入遺伝子を提供する。このように、IL−βXΛTおよびそのバリエーションが、循環またはジョイントへのFΙV(Cre)の配達後の神経炎症のモデルとして使われることができる。
2. 核酸
本願明細書において開示される様々な分子がある。そして、例えば、例えば、さまざまな機能的な核酸と同様に、本願明細書において開示される他のいかなるタンパク質と同様にも不lraをコード化する核酸を含む基礎を形成される核酸である。開示された核酸は実施例、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体のためにメイクアップされる、または、ヌクレオチドは置換する。これらおよび他の分子の非限定的な例は、本願明細書において述べられる。例えば、ベクターが細胞(表されたメッセンジャーRNAが概してA、C、GおよびU.Likewiseから成り立つ)において表されるときに、例えば、アンチセンス分子が例えば外因の配達による細胞または細胞環境にもたらされる場合、アンチセンス分子が細胞環境のアンチセンス分子の分解を減らすヌクレオチド類似体から成り立つことがadvantagousであるものと理解されるものと理解される。
a)ヌクレオチドおよび関連した分子
ヌクレオチドは、ベース部分、糖残基およびリン酸塩部分を含む分子である。ヌクレオチドは、インター・ヌクレオシド結合を作成しているそれらのリン酸塩部分および糖残基で結びつけられることができる。ヌクレオチドのベース部分は、アデニン−9−イル(A)細胞罪−1−イル(C)グアニン−9−イル(G)ウラシル−1−イル(U)およびサイミン−1−イル(T)でありえる。ヌクレオチドの糖残基は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸塩部分は、リン酸五価である。ヌクレオチドの非限定的な実施例は、3’−AMP(3’−アデノシン一リン酸)または5’−GMP(5’−GMP)である。
ヌクレオチド類似体は、若干のタイプの変更態様を含むヌクレオチドであるためにどちらかベース、糖またはリン酸塩部分。ヌクレオチドに対する変更態様は、公知技術である、そして、糖の変更態様またはリン酸塩部分と同様に実施例、5‐メチルシトシン(5−me−C)5‐ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチンおよび2−アミノ・アデニンのために含む。
ヌクレオチド代理は、ヌクレオチドに対する類似の機能特性を有する分子である、しかし、いずれが、リン酸塩部分(例えばペプチド核酸(PNA))を含まないか。ヌクレオチド代理は、Watson−CrickまたはHoogsteen方法の核酸を認識する、しかし、リン酸塩部分以外の部分で結びつけられる分子である。適当な目標核酸と相互に作用するときに、ヌクレオチド代理は二重螺旋タイプ構造にかなうことが可能である。
増強(例えば細胞取り込み)に他のタイプの分子(接合体)をヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に連結することも、可能である。接合体は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に化学的にリンクされることができる。この種の接合体としては、コレステロール部分のような脂質部分が挙げられるがこれらに限られない。(Letsingerなど、会報Natl. Acad. Sci.USA、1989,86、6553−6556)
Watson−筋肉痙攣相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド代理のWatson−筋肉痙攣表面を有する少なくとも一つの相互作用である。ヌクレオチドのWatson−Crick表面、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド代理は、C2(Nl)を含む、そして、プリン・ベースのヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド代理のC6位置およびC2(N3、ピリミジン・ベースのヌクレオチドのC4位置、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド代理)。
Hoogsteen相互作用はヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のHoogsteen表面に起こる相互作用である。そして、それは二重鎖のDNAの主溝において露出する。Hoogsteen表面は、プリンヌクレオチドのC6位置で、N7位置および反応基(NH2またはO)を含む。
b)配列
例えば、タンパク質がGenbankに開示されることを本願明細書において開示した他のものと同様に不lraに関連した様々なシーケンスがある、そして、これらのシーケンスその他は全体として、そこにおいて、含まれる個々の部分列のためにと同様に参照によって組み込まれて本願明細書においてある。
様々なシーケンスは本願明細書において設けられている、そして、www.pubmed.政府で、これらその他はGenbankで見つかることができる。当業者は、シーケンス矛盾および違いを分解して、特定のシーケンスに関する組成物および方法を他の関連配列に合わせる方法を理解する。プライマおよび/またはプローブは、本願明細書において開示されて、従来技術において公知の情報を与えられるいかなるシーケンスのためにも設計されることができる。
c)始動用燃料注入装置、そして、プローブ
プライマおよびプローブを含む(本願明細書において開示される遺伝子と相互に作用することができる)組成物は、開示される。特定の実施例において、下塗りは、DNA増幅反応を支持するために用いる。概して、プライマは、シーケンスに特有の方法で延長されることができる。シーケンスに特有の方法のプライマの拡張は、シーケンスおよび/またはプライマが雑種を作られるかまたはさもなければ関連する核酸分子の組成が構成またはプライマの拡張によってできる製品の配列を導くかまたは影響するいかなる方法も含む。シーケンスに特有の方法のプライマの拡張は、従って、PCR、DNA塩基配列決定、DNA拡張、DNAポリメリゼーション、RNA転写または逆転写を含むが、これに限定されるものではない。シーケンスに特有の方法のプライマを増幅する技術および状況は、好まれる。特定の実施例において、プライマが、DNA増幅反応(例えばPCRまたは直接のシークエンシング)のために用いられる。特定の実施例で、プライマが非酵素的技術を使用して延長されることもできるものと理解される。ここで、例えば、それらがシーケンスに特有の方法のプライマを延長するために化学的に反応するように、プライマを延長するために用いるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは修正される。概して、開示されたプライマは核酸または核酸の領域によって交雑する、または、それらは核酸を補うものまたは核酸の領域を補うものによって交雑する。
3. シーケンス類似点
本願明細書において述べられるように、条件相同およびアイデンティティの使用が類似性と同じものを意味するものと理解される。このように、例えば、語相同の使用が2つの非自然のシーケンスとの間に使われる場合、これがこれらの2つのシーケンスの進化の関係を必ずしも示しているというわけではなくて、むしろそれらの核酸一次構造との類似点または関連性に注目しているものと理解される。それらが進化的に関連があるかどうかに関係なく、2つの進化的に関連した分子間の決定相同のための方法の多数はシーケンス類似性を判断するためにいかなる二個以上の核酸またはタンパク質にも日常的に適用される。
一般に、起こるかもしれないいかなる周知の異型および誘導体またはそれらも定める一つの方法が、開示された遺伝子および本願明細書においてタンパク質の中で、特定の周知のシーケンスに相同に関して異型および誘導体を定めることによってあるものと理解される。本願明細書において開示される特定のシーケンスのこのアイデンティティも、本願明細書において他で述べられる。一般のIn、遺伝子の異型および本願明細書においてタンパク質が、最少、あたりを定まったシーケンスに対する70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99パーセント相同または土地の人でシーケンスを有することを概して開示した。当業者は、容易に、2つのタンパク質または核酸(例えば遺伝子)の相同を決定する方法を理解する。例えば、相同がその最高レベルにあるように、相同は2つのシーケンスを整列配置した後に算出されることができる。
算出相同の他の方法は、発表されたアルゴリズムによって実行されることができる。比較のためのシーケンスの最適配列は、SmithおよびWaterman Advのローカル相同アルゴリズムによって実行されることができる。出願Math.2:482の(1981)(NeedlemanおよびWunsch(J.Mol Biol.48)の相同配列アルゴリズムによる):443の(1970)(PearsonおよびLipman(会報Natl. Acad. Sci.U.S.A.85)の類似性方法の検索による):2444の(1988)(これらのアルゴリズム(ウィスコンシンGenetics Software Package、Genetics Computer Group、575人のScience博士、Madison、WIのGAP、BESTFIT5 FASTAおよびTFASTA)のコンピュータ化された実施態様による、または、点検による)。
相同の同一形式は、例えばZuker(M.科学244)において開示されるアルゴリズムによって、核酸のために得られることができる:48−52、1989、Jaegerなど会報国家アカデミちょうこくしつ座USA 86:7706−7710、1989、Jaegerなど方法Enzymol.183:281−306(少なくとも核酸配列に関連した材料のための参照によって組み込まれて本願明細書においてある1989)。方法のいずれかが概して用いられることができる、そして、特定の例で、これらのさまざまな方法の結果が異なることができるものと理解される、しかし、熟練した職人はアイデンティティがこれらの方法のうちの少なくとも1つによって分かる場合、シーケンスが定まったアイデンティティを有して、本願明細書において開示されることが言われているだろうと理解する。
例えば、本願明細書において使われるように、他のシーケンスに特定のパーセント相同を有するとして詳述されるシーケンスは上記の算出方法のいかなる一つ以上もだけ算出されるにつれて、詳述された相同を有するシーケンスに関連する。例えば、他の算出方法のいずれかによって算出されるにつれて第1のシーケンスが第2のシーケンスに80パーセントの相同を有しない場合であっても、第1のシーケンスがZuker算出方法を使用している第2のシーケンスに80パーセントの相同を有するために算出される場合、第1のシーケンスは第2のシーケンスに80パーセントの相同を、本明細書で定義されるように、有する。別の例として、SmithおよびWaterman算出方法、NeedlemanおよびWunsch算出方法、Jaeger算出方法または他の算出方法のいずれかによって算出されるにつれて第1のシーケンスが第2のシーケンスに80パーセントの相同を有しない場合であっても、第1のシーケンスがZuker算出方法およびPearsonを使用している第2のシーケンスおよびLipman算出方法に80パーセントの相同を有するために算出される場合、第1のシーケンスは第2のシーケンスに80パーセントの相同を、本明細書で定義されるように、有する。さらに別の例として、第1のシーケンスが算出方法(実際には、異なる算出方法が結果として異なる算出相同パーセンテージにしばしばなるにもかかわらず)の各々を用いた第2のシーケンスに80パーセントの相同を有するために算出される場合、第1のシーケンスは第2のシーケンスに80パーセントの相同を、本明細書で定義されるように、有する。
4. ハイブリダイゼーション/選択的ハイブリダイゼーション
用語ハイブリダイゼーションは、概して少なくとも2つの核酸分子、例えばプライマまたはプローブの間のシーケンス駆動相互作用および遺伝子を意味する。シーケンス駆動相互作用は、2つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体との間に発生する相互作用またはヌクレオチド誘導体mにヌクレオチドに特有の方法を定める。シーケンス駆動相互作用は、実施例、Cと相互に作用しているGまたはTと相互に作用しているA間である。概して、シーケンス駆動相互作用は、Watson−Crick表面またはヌクレオチドのHoogsteen表面に起こる。2つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に知られている多くの状況およびパラメータに影響を受ける。例えば、2つの核酸分子が交雑するかどうか、反応の塩濃度、pHおよび温度はすべて影響する。
2つの核酸分子間の選択的なハイブリダイゼーションのパラメータは、当業者にとって周知である。例えば、若干の実施例で、選択的なハイブリダイゼーション状況は、厳しいハイブリダイゼーション状況として定義されることができる。例えば、ハイブリダイゼーションの厳しさは、ハイブリダイゼーションの一方または両方の温度および塩濃度によって制御されて、ステップを洗っている。例えば、選択的なハイブリダイゼーションを達成するハイブリダイゼーションの条件は、洗っている温度が約50C〜Tmの下の20°Cであるように、温度の組合せで洗うことによって続かれるTm(分子の半分がそれらのハイブリダイゼーションからパートナーを分離する融解温度)および選択される塩濃度の下の約12−250Cである温度で、ハイブリダイゼーションを高イオン強度溶液(6X SSCまたは6X SSPE)に関係させることができる。温度および塩状況は、フィルタに固定される参照DNAのサンプルが興味がある標識核酸に交雑して、それから異なる厳しさの状態の下で、洗われる予備実験において、経験的に直ちに決定される。ハイブリダイゼーション温度は、DNA−リボゾームリボ核酸およびRNA−リボゾームリボ核酸ハイブリダイゼーションのために典型的により高い。状況が、あるいは、周知のように、厳しさを達成するために上記の通りに使われることができる。(Sambrookなど、Molecular Cloning:Laboratory Manual、第2のEd.Cold Spring Harbor Laboratory、コールドスプリングハーバー、New York、1989;Kunkelなど手法Enzymol.1987:154:少なくとも核酸のハイブリダイゼーションに関連した材料のための参照によって組み込まれて本願明細書においてある367、1987)。DNAの好ましい厳しいハイブリダイゼーション条件:DNAハイブリダイゼーションが6X SSCの約68°C(水溶液において)であることができる、または、6X SSPEは680Cで洗うことによって続いた。要求される相補性の程度が減少して、更に、GCまたは可変性が捜されるいかなる領域のA−T豊かさにも依存しているにつれて、ハイブリダイゼーションおよび、必要に応じて、洗うこと厳しさはしたがって、還元していることがありえる。同様に、要求される相同が増加して、更に、GCまたは、すべて周知のように、高い相同が要求されるいかなる領域のA−T豊かさにも依存しているにつれて、ハイブリダイゼーションおよび、必要に応じて、洗うこと厳しさはしたがって、増加することができる。
選択的なハイブリダイゼーションを定める他の方法は、他の核酸に結合される核酸のうちの1つの量(パーセンテージ)に注目することによってある。例えば、若干の実施例で、選択的なハイブリダイゼーション状況は、少なくともあたりを、極限核酸の60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100パーセントが非限定的な核酸に密接に結びつく時である。概して、非限定的なプライマは、実施例、10または100または1000倍の過剰に直面しそうである。この種の分析は制限することおよび非限定的なプライマが例えばある状況の下で実行されることができる、10倍または100倍または下記の1000倍それらkd、核酸分子のわずか1つが10倍または100倍または1000倍である所で、または、一つの所で、または、または、両方の核酸分子は上記である。
選択的なハイブリダイゼーションを定める他の方法は、酵素処理でをハイブリダイゼーションが所望の酵素操作を促進することを必要とする状況の下で操作させるプライマのパーセンテージに注目することによってある。例えば、若干の実施例で、選択的なハイブリダイゼーション状況は、少なくともあたりを、プライマの60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100パーセントが酵素操作を促進する状況の下で操作される酵素処理でである時である。そして、少なくともプライマの60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100パーセントについて分子が延長されるときに酵素操作がDNA拡張、そして状況がそうである選択的なハイブリダイゼーションである場合、実施例間である。好適な状況も、製造業者によって示唆されるか、または操作を実行している酵素に適当であるとして従来技術において示されるそれらを含む。
ちょうど相同と同様に、様々な方法が2つの核酸分子との間にハイブリダイゼーションのレベルを決定するために開示されて本願明細書においてあるものと理解される。これらの方法および状況が2つの核酸分子との間にハイブリダイゼーションの異なるパーセンテージを提供することができるものと理解される、しかし、特に明記しない限り、方法のいずれかのパラメータを満たすことは充分である。例えば、80%のハイブリダイゼーションが必要とされる場合、そして、ハイブリダイゼーションがこれらの方法のいずれか一つの必須パラメタの中で発生する限り、それは本願明細書において開示されて考慮される。
当業者が構成または方法が集合的に、または、単独で決定ハイブリダイゼーションのこれらの基準のいずれか一つを満たす場合、それが本願明細書において開示される構成または方法であると理解するものと理解される。
5. 細胞に対する組成物の配送
本願明細書、開示された核酸は、主題の細胞または細胞に届けられることができる。生体外で、または、生体内で、核酸を細胞に届けるために用いることができる多くの組成物および方法が、ある。これらの方法および組成物は、主に2つのクラスに細分化されることができる:ウィルス・ベースのデリバリー系および非ウイルス・ベースのデリバリー系。例えば、核酸は、多くの直納方式(例えば細胞またはキャリア(例えばカチオンのリポソーム)の遺伝形質のエレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウィルス・ベクター、ウィルス核酸、バクテリオファージ核酸、バクテリオファージ、コスミドまたはバイア転送)で届けられることができる。実施例、Wolff、J.A.など、Science、247、1465−1468のために、トランスフェクションのための適切な手段は、ウィルス・ベクター、化学トランスフェクタントまたはphysico機械の方法(例えばエレクトロポレーションおよびDNAの直接的な拡散)を含んで、(1990)によって記載されている;して、Wolff、J.A.Nature、352、815−818、(1991)。この種の方法は、本願明細書において記載されている組成物および方法の用途に、公知技術のおよび、直ちに順応性がある。特定のケースにおいて、方法は、特に大きいDNA分子によって機能するために、様式でフィードする。更に、これらの方法は、キャリアのターゲッティング特性を用いて特定の疾患および菌体群を目標とするために用いることができる。
a)デリバリー系に基づく核酸
導入ベクターは、細胞(例えばプラスミド)に、または、組換えレトロウィルスまたはアデノウィルスの一部として遺伝子を、例えば、届ける一般戦略の一部として遺伝子を届けるために用いるいかなるヌクレオチド構造でもありえる(などCancerReを押し込む。53:83−88, (1993))。
ここで使用しているように、プラスミドまたはウィルス・ベクターは、低下のない細胞に開示された核酸(例えばIL−Ira、COX−I siRNA、COX−2 siRNA、cPGES siRNA)またはmPGES siRNA構造物を運搬する剤であって、開示されたシーケンスのプロモータを産生している表示をそれが分配される細胞に含む。若干の実施例において、IL−1ra、COX−1 siRNA、COX−2 siRNA、cPGES siRNAまたはmPGES siRNA構造物のためのベクターは、ウイルス、レトロウィルスまたはレンチウイルスに由来する。ウィルス・ベクターは、例えば、HIVバックボーンおよびレンチウイルスを有するこれらのウイルスを含むAdenovirus、Adeno−付随ウイルス、ヘルペスウイルス、Vacciniaウイルス、Polioウイルス、AIDSウィルス、ニューロンの栄養のウイルス、Sindbisおよび他のRNAウィルスでありえる。それらをベクターとしての用途に適しているようにするこれらのウイルスの特性を共有するいかなるウィルス系統も、抜擢されている。レトロウィルスは、ミューリンMaloney Leukemiaウイルス、MMLVおよびベクターとしてMMLVの望ましい特性を表すレトロウィルスを含む。レトロウイルスベクタは、例えば、より大きい遺伝子の弾頭(すなわち導入遺伝子)を持っていることが可能である。そして、開示されたIL−lra、COX−I siRNA、COX−2 siRNA、cPGES siRNAまたはmPGES siRNAは構成してまたはマーカー遺伝子は他のウイルス性より(進路)誘導する、そして、一般的に用いられるベクターがこの理由間である。しかしながら、それらは、非増殖細胞に役立つものではなくある。アデノウイルスベクタは、比較的安定なおよび、(と)連動して、高力価を有するために容易で、エアゾール製剤において分配されることができて、非分裂細胞をトランスフェクションさせることができる。痘瘡ウィルス・ベクターは大きい、そして、差込み遺伝子のいくつかの場所を有する、それらは耐熱で、室温で、格納されることができる。好ましい実施例はウィルス・ベクターである。そして、それは宿主生物の免疫応答を抑制するために設計された。そして、ウイルス抗原によって引き出される。このタイプの好適なベクターは、インターロイキン8または10のためのコード領域を担持する。
ウィルス・ベクターは、遺伝子を細胞にもたらす化学であるか物理的な方法より高い処理(遺伝子を導く能力)能力を有することができる。概して、ウィルス・ベクター封じ込め、非構造的初期遺伝子、構造後期遺伝子、RNAポリメラーゼIH反訳記録は、ウィルスゲノムの転写および複製を制御するために、複製およびカプシド形成およびプロモータに必要な末端反復を逆にした。ベクターとして設計されるときに、ウイルスは概して離れた初期遺伝子の一つ以上を有する、そして、遺伝子または遺伝子/プロモータ・カセットは取り除かれたウィルスDNAの代わりにウィルスゲノムに嵌入される。このタイプの構造物は、最高約8kbの外国の遺伝形質を担持することができる。取り除かれた初期遺伝子の必要な機能は、trans.の初期遺伝子の遺伝子産物を表すために設計された細胞系によって、典型的に供給される。
(1) レトロウイルスベクタ
レトロウィルスは、逆推進ロケット技師viridaeのウイルス一系統に帰属していて、任意型、サブファミリ、膝または屈性を含んでいる動物ウィルスである。レトロウイルスベクタは、一般に、Verma、I.M.Retroviral遺伝子導入ベクターによって記載されている。Microbiology−1985、American Society for Microbiology、pp.229−232、Washington、(1985)において、いずれが、本願明細書において引用したものとする。遺伝子治療のためのレトロウイルスベクタを使用する方法の実施例は、米国特許番号4,868,116および4,980,286に記載されている;PCT出願WO 90/02806およびWO 89/07136;そして、Mulligan(科学260:926−932の(1993));という教示いずれが本願明細書に引用したものとする。
レトロウィルスは、基本的に、核酸貨物をそれに包装したパッケージである。核酸貨物は、それによってもたらすパッケージングシグナル(複製された娘分子がパッケージ・コートの範囲内で能率的に包装されることを確実にする)。パッケージ信号に加えて、複製のために、シスおよび複製されたウイルスの包装において必要である分子数が、ある。概して、レトロウイルス・ゲノムは、開口器、polおよびタンパク質外殻で製作中に含まれるenv遺伝子を含む。それが的状赤血球へ転送されることになっていることは、開口器、polおよび外来性DNAと典型的に交換されるenv遺伝子である。レトロウィルス・ベクターはパッケージ・コートに編入のためのパッケージングシグナルを装備するのが当り前であると、開口器転写単位の始まりの信号を送るシーケンス、逆転写の運搬RNAプライマを結合するプライマー結合部位を含む逆転写のために必要な要素、DNA合成の間、リボゾームリボ核酸索のスイッチを導くターミナルの反復配列、DNA合成の第2の索の合成の初回抗原刺激場所として役立つ3フィートLTRに対するプリンの豊富なシーケンス5フィートおよびDNAの挿入を可能にするLTRの端の近くの特定のシーケンスが宿主ゲノムに嵌入するレトロウィルスの中で述べる。開口器、polおよびenv遺伝子の除去は、約8kbの外国のシーケンスがウィルスゲノムに嵌入されて、転写される後退になって、複製に新規なレトロウイルス粒子にパックされるのを許す。核酸のこの量は、各反訳記録のサイズに応じて、多くの遺伝子にものの配送に充分である。挿入物は、他の遺伝子と一緒の陽であるか負の選択マーカを有することが好ましい。
大部分のレトロウイルスベクタの複製機械および包装タンパク質が除去された(開口器、polおよびenv)ので、ベクターはそれらを包装細胞系に入れることによって典型的に発生する。包装細胞系は、複製および包装機械を含むレトロウィルスによってトランスフェクションしたかまたは変わった細胞系であるが、いかなるパッケージングシグナルも欠いている。選択の余地のDNAを担持しているベクターがこれらの細胞系にトランスフェクションするときに、ヘルパー細胞によってシスにおいて設けられている機械によって、興味がある遺伝子を含んでいるベクターは複製されて、新規なレトロウイルス粒子にパッケージされる。それらが必要な信号を欠いているので、機械のためのゲノムは包装されない。
(2) アデノウイルス媒介生物
複製に欠陥があるアデノウィルスの構造は、記載されていた(Berknerなど、J.Virology 61:1213−1220の(1987);Massieなど、MoI.細胞.生物学6:2872−2883の(1986);Haj−Ahmadなど(J)。Virology 57:267『−27’4(1986);Davidsonなど、J.Virology 61:1226−1239の(1987);Zhang「リポソームによって媒介されるトランスフェクションおよびPCR分析による組換えアデノウィルスの生成および識別」BioTechniques 15:868−872の(1993))。ベクターとしてのこれらのウイルスの使用の利益はそれらがそれらが他の細胞型まで広がることができる範囲において制限されるということである。これは、次のことの故である。それらは最初の感染細胞の中で複製することができるが、新規な伝染性ウィルス粒子を形成することができない。組換えアデノウィルスは、気道上皮、肝細胞、脈管内皮、CNS実質および多くの他の組織部位への直接の、生体内での配達の後、高性能遺伝子導入を達成することを示した(Morsy、J.Clin.Invest.92:1580−1586 (1993);Kirshenbaum、J.Clin.Invest.92:381−387 (1993);Roessler、J.Clin.Invest.92:1085−1092 (1993);Moullier、Nature Genetics 4:154−159の(1993);La Salle、Science 259:988−990の(1993);Gomez−Foix、J.Biol.化学267:25129−25134の(1992);Rich、Human Gene Therapy 4:461−476の(1993);Zabner、Nature Genetics 6:75−83の(1994);Guzman、Circulation Research 73:1201−1207の(1993);Bout、Human Gene Therapy 5:3−10の(1994);Zabner、セル75:207−216(1993);Caillaud、Eur.J.Neuroscience 5:1287−1291の(1993);そして、Ragot、J.Gen.Virology 74:501−507の(1993))。組換えアデノウィルスは、野生型または複製に欠陥があるアデノウィルスとして同様に特定の細胞表面マーカ(ウイルスがreceptor−によって媒介されるエンドサイトーシスによって内在化される)と結合することによって、遺伝子トランスダクションを達成する(ChardonnetおよびDales(Virology 40):462−477の(1970);BrownおよびBurlingham(J.Virology 12):386−396の(1973);SvenssonおよびPersson(J.Virology 55):442−449の(1985);Seth、その他、J.Virol.51:650−655 (1984);Seth、など、Mol.細胞.生物学4:1528−1533の(1984);Vargaなど、J.Virology 65:6061−6070の(1991);Wickhamその他、セル73:309−319(1993))。
ウィルス・ベクターは離れたEl遺伝子を有したアデノウィルスに基づく1でありえる、そして、これらのvironsは細胞系(例えばヒト293の細胞系)において発生する。他の好ましい例として、ElおよびE3遺伝子は、アデノウィルス・ゲノムから除去される。
(3) アデノ関連ウィルス・ベクター
他のタイプのウィルス・ベクターは、アデノ衛星ウィルス(AAV)に基づく。それが多くの細胞型を感染させることができて、人間に非病原であるので、この不完全なパルボウィルスは好適なベクターである。AAVタイプ・ベクターは約4〜5kbを運搬することができる、そして、野生型AAVは染色体19に安定して挿入することは公知である。このサイト固有統合所有物を含む媒介生物は、好まれる。
この種のベクターの特に好適な実施例はAvigen(San Francisco)によってできるP4.1 Cベクターである。そして、遺伝子のようなCA(単純ヘルペスウィルス・チミジンキナーゼ遺伝子、HSV−tkおよび/またはマーカー遺伝子を含むことができる)が緑色蛍光タンパク質(GFP)をコード化する。他のタイプのAAVウイルスにおいて、AAVは、使用可能な状態で異種遺伝子にリンクされる細胞に特有の表現を導くプロモータを含んでいる少なくとも一つのカセットの側面に位置する一対の逆にされた末端反復(ITR)を含む。いかなるヌクレオチド配列に対するこの前後関係参照も遺伝子において異形のまたはAAVまたはB19パルボウィルス固有でない。
概して、AAVおよびB 19コード領域は削除された。そして、結果として安全な、無細胞毒性ベクターになった。AAV ITR(またはその変更態様)感染性およびサイトを与える−特定の統合は、細胞毒性でないおよびプロモータ以外の細胞に特有の表現を導く。連合した状態特許番号6,261,834は、AAVベクターに関連した材料のための参照によって組み込まれて、本願明細書においてある。
本発明のベクターは、このように、相当な毒性のない哺乳類の染色体への統合ができるDNA分子を提供する。
ウイルス性において挿入された遺伝子、そして、通常レトロウイルス・プロモータおよび/または所望の遺伝子産物の表示を制御するのを助けるエンハンサを含む。プロモータは、通常、転写開始点に関して比較的固定された場所においてとき機能するDNAの配列または配列である。プロモータは、RNAポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用のために必要な炉心構成要素を含んで、上流要素および反応要素を含むことができる。
(4) レンチウイルス・ベクター
ベクターは、レンチウイルス・ベクターでありえる以下から成る有限責任でない以外のために、SIVベクター、HTVベクターまたはこれらのベクターの複合型構造物(HIVバックボーンを有するウイルスを含む)。これらのベクターも、第1の、第2のおよび、第三世代のレンチウイルスを含む。第三世代のレンチウイルスは、少なくとも3つの独立プラスミドまたは構造物に分割されるレンチウイルスをパックしている遺伝子を有する。また、ベクターは、それらをベクターとしての用途に適しているようにするこれらのウイルスの特性を共有するいかなるウィルス系統でもありえる。レンチウイルス・ベクターは、感染のための長い潜伏期間を有することによって典型的に特徴づけられる特別なタイプのレトロウイルス・ベクターである。さらにまた、レンチウイルス・ベクターは、非分裂細胞を感染させることができる。レンチウイルス・ベクターは、ウイルスのレンチウイルス一系統から、ウイルスの核酸バックボーンに基づく。概して、レンチウイルス・ベクターは、5フィートおよびレンチウイルス(例えばSIVおよびHIV)の3フィートLTR領域を含む。レンチウイルス・ベクターも、レンチウイルス(例えばSIVおよびHIV)のRev Responsive Element(RRE)を装備するのが当り前である。
(a) ネコ免疫不全ウィルス・ベクター
開示された構造物が中に分配されることができる1種類のベクターは、Poeschlaその他によって(1998)開発されるVSV−G偽入力されたネコ免疫不全ウィルスシステムである。このレンチウイルスは、能率的に分裂終了細胞と同様に分周、成長逮捕者を感染させることを示した。さらに、そのレンチウイルス特性のため、それはホストのゲノムに導入遺伝子の編入を考慮に入れる。そして、安定遺伝子形質発現に導く。これは3−ベクター系である。それによって、各々は異なった指示を与える:FIVベクターは、変異する包装およびエンベロープ遺伝子を有する興味がある導入遺伝子およびレンチウイルス装置を担持する。小胞性口内炎ウィルスG−グリコプロテイン・ベクター(VSV−G;Burnsなど、1993)trans.のウイルスエンベロープの形成の一因となる。第三段ベクターは、指示をトランス(Poeschlaその他、1998)で包むことを与える。FIV生産は、293−T細胞への上述したベクターの完成した生体外以下の同時トランスフェクションである。FIVの豊富な上澄が、それから集められて、濾過されて、直接使われることができるかまたは、遠心によって集中に続いている。タイターは、日常的に104 − 107bfu/ml − の間で変動する。
(5) ベクターパッケージング
上記のように、レトロウイルスベクタは、ウイルスの統合、組込ウイルスの複製、非組込ウイルスの複製、細胞浸潤および伝染性の粒子へのウイルスの包装と同程度多様なものを制御する多くの異なる配列要素を含むレトロウィルスに基づく。ベクターが理論的にはそれらの必要な要素の全てを含むことができると共に、外因の遺伝子要素(外因の遺伝子要素が十分に小さい場合)と同様に、必要な要素の典型的に多数は取り外される。包装および複製成分の全てが主題の範囲内で用いられる典型的レトロウイルス、含んでいるレンチウイルス・ベクターから取り除かれたので、ベクターはベクターをパッケージして、細胞系をパックすることを用いることにより最初の伝染性の粒子にパッケージされることを必要とする。概して、レトロウィルスの無数の機能が少なくとも2本のベクター、包装ベクターおよび配達ベクター上へ切り離されるように、レトロウイルスベクタは設計された。伝染性の粒子が生じることができる前に、この種のシステムはそれから、同じ細胞の要素の全てを提供しているベクターの全てに存在を要求する。包装ベクターは概して、レトロウィルスに由来する構造および複製遺伝子を担持する、そして、配達ベクターは的状赤血球において好ましくは表される外因の遺伝子要素を担持するベクターである。この種のシステムは、包装ベクターの包装機能を複数のベクター(例えば第三世代レンチウイルス・システム)に分割することができる。ダル、T.など、「条件つきの包装システムを有するThird−生成レンチウイルス・ベクター」8463−71 (1998)。
レトロウィルスは、外膜タンパク(env)を装備するのが当り前である。Envタンパク質は、本質的に、核酸貨物を囲むタンパク質である。さらに、細胞感染症特異性は、典型的レトロウィルスと関連した特定のEnvタンパク質に基づく。典型的包装ベクター/送出ベクター系において、タンパク質がそうであるEnvが例えばプロテアーゼ(プロの)またはインテグラーゼタンパク質より別々のベクターから表現した。
(6) 細胞系パッケージング
ベクターは、それらを包装細胞系に入れることによって、典型的に発生する。包装細胞系は、複製および包装機械を含むレトロウィルスによってトランスフェクションしたかまたは変わった細胞系であるが、いかなるパッケージングシグナルも欠いている。選択の余地のDNAを担持しているベクターがこれらの細胞系にトランスフェクションするときに、ヘルパー細胞によってシスにおいて設けられている機械によって、興味がある遺伝子を含んでいるベクターは複製されて、新規なレトロウイルス粒子にパッケージされる。それらが必要な信号を欠いているので、機械のためのゲノムは包装されない。細胞系をパックすることの1つのタイプは、293の細胞系である。
(7) 大きいペイロード・ウィルス・ベクター
大きいヒトヘルペスウイルスの分子遺伝子の実験は、大きな異形のDNA断片がヘルペスウィルスへの感染のために寛容な細胞においてクローンをつくられることができて、伝播されることができて、決められることができるそれによって手段を提供した(Sunなど、Nature遺伝学8:33−41, 1994;CotterおよびRobertson.Curr Opin MoI Ther 5:633−644, 1999)。これらの大きいDNAウィルス(単純ヘルペスウィルス(HSV)およびEBウィルス(EBV)には、>150kb、ヒト異形のDNAの断片を特定の細胞に届けるために、可能性がある。EBV組換え型は、エピソームDNAとして感染したB細胞のDNAの大きな部分を維持することができる。ヒト・ゲノム挿入物を330kbへ担送される個々のクローンは、遺伝的に厩舎にこれらのエピソームの保守がEBVへの感染の間、表されて構成的に特定のEBV核タンパク質(EBNAl)を必要とすると明らかだった。加えて、これらのベクターがトランスフェクションのために用いられることができる。ここで、大量のタンパク質は生体外で一過性に発生することができる。ヘルペスウィルス・アンプリコン・システムは、>220kb、DNAの部分を包装して、エピソームとしてDNAを安定して維持することができる細胞を汚染するために用いてもいる。
他の役立つシステムは、例えば、複製することおよびホスト制限された非複製しているワクシニアウィルス・ベクターを含む。
b)システムベースの非核酸
開示された組成物は、さまざまな方法で的状赤血球に届けられることができる。例えば、あるいは、リン酸カルシウム沈殿で、組成物は、エレクトロポレーションで、または、リポフェクションで届けられることができる。選択される配達メカニズムは目標とされる細胞のタイプに一つには依存する、そして、配達が発生することであるかどうか、生体内で、または、生体外で例示する。
このように、開示された核酸またはベクターに加えて、組成物は、例えば、リポソーム(例えばカチオンのリポソーム(例えばDOTMA、ドープ、DC−コレステロール)またはアニオン性リポソーム)のような脂質から成ることができる。リポソームは、必要に応じて、特定の細胞を目標とするのを容易にするために、タンパク質から更に成ることができる。化合物およびカチオンのリポソームから成る構成の管理は、標的器官に血液輸入性に与えられることができるかまたは気道の的状赤血球に、気道に吸入されることができる。リポソームに関して、Brighamなど Am J.Resp.細胞.MoI.生物学1:95−100の(1989);Felgnerなど Proc.Natl.Acad.Sci USA 84:7413−7417の(1987);米国特許No.4,897,355参照。さらにまた、化合物は、特定の細胞型(例えばマクロファージ)に目標とされることができる、または、化合物の拡散またはミクロ莢膜から化合物の配達が比速度または投与量のために設計されるミクロ莢膜の構成要素として管理されることができる。
いずれが政府および主題(すなわち遺伝子トランスダクションまたはトランスフェクション)の細胞への外来性DNAの取り込みを含むかについて記載されている方法において、細胞に対する組成物の配送が、様々な機構を介してあることができる。一つの例として、配達が、LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO−BRL、会社、Gaithersburg、MD)SUPERFECT(Qiagen, Inc.Hilden、Germany)およびTRANSFECT AM(Promega Biotec Inc.、Madison、WI)(従来技術において手順標準に従って開発される他のリポソームと同様に)のような市販のリポソーム準備を使用して、リポソームを介してあることができる。加えて、開示された核酸またはベクターはエレクトロポレーションによって生体内で達成されることができる。そして、それのための技術はSONOPORATION機械(ImaRx Pharmaceutical社、Tucson、AZ)によってと同様にGenetronics, Inc.(San Diego、CA)から利用できる。
材料は、溶液(中止(例えば、微小粒子、リポソームまたは細胞に組み込まれる))においてもよい。これらは、抗体、レセプタまたは受容体リガンドを介して特定の細胞型に目標とされることができる。以下の参照は、腫瘍組織に特定のタンパク質を目標とするこの技術の使用の実施例である(Senter、など、Bioconjugate化学、2:447−451((1991));Bagshawe、K.D.Br.J.Cancer、60:275−281((1989));Bagshawe、など、Br.J.Cancer、58:700−703((1988));Senter、など、Bioconjugate化学、4:3−9((1993));Battelli、など、CancerImmunol。Immunother.35:421−425((1992));PieterszおよびMcKenzie(Immunolog)。再調査、129:57−80((1992));そして、Roffler、など、Biochem.Pharmacol、42:2062−2065((1991)))。これらの技術が、様々な他のspeciifc細胞型のために用いられることができる。「秘密」および他の抗体のような車両は、リポソーム(結腸癌に脂質によって媒介される薬物ターゲティングを含む)細胞特定のリガンドによるDNAのレセプタによって媒介されるターゲッティング、リンパ球に誘導された腫瘍ターゲッティングおよび生体内ネズミのグリオーマ細胞の非常に特定の治療的なレトロウイルス・ターゲッティングを活用させた。以下の参照は、腫瘍組織に特定のタンパク質を目標とするこの技術の使用の実施例である(Hughesなど、CancerResearch、49:6214−6220((1989));そして、LitzingerおよびHuang、小Biochimica Biophysica Acta(1104:179−187)(1992))。一般に、レセプタは、エンドサイトーシス(いずれの構成型またはリガンド起因性も)の経路に関係している。これらのレセプタは、クラトリン−被覆陥入においてクラスター形成するか、クラトリン−被覆小胞を介して細胞に刺さるか、レセプタがソートされる酸性化されたエンドソーム、そうすると、細胞表面に対するいずれのリサイクルも貫通するか、細胞内に格納されるか、または、ライソソームにおいて劣化する。内部移行経路は、様々な機能(例えば養分吸収、活性タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、リガンドのウイルスおよび毒素、解離および低下の日和見主義的なエントリおよびレセプタ・レベルの規則)に間に合う。多くのレセプタは一つ以上の細胞内の経路をたどる。そして、細胞型、レセプタ集中、タイプのリガンド、リガンド結合価およびリガンド集中次第である。受容体依存性エンドサイトーシスの中で分子および細胞状の機構チェックする(Brown、そして、Greene、DNA、そして、セルBiology 10:6、399−409(1991))。
宿主細胞ゲノムに組み込まれることになっている細胞に届けられるのが当り前である核酸は、統合シーケンスを装備する。特にウィルス・ベースのシステムが用いられるときに、これらのシーケンスはしばしばウィルス関連配列である。インター・グレーン動作システムがそうでもありえるこれらのウイルス性は配送(例えばリポソーム)の非核の酸ベースのシステムを使用して届けられることになっている核酸に加入させた。そして、核酸が配達において含有するように、システムは宿主ゲノムに組み込まれて来ることでありえる。
宿主ゲノムへの統合の他の一般の技術は、例えば、宿主ゲノムを有する相同組み換えを促進するように設計されたシステムを含む。これらのシステムは概して、表されるために核酸の側面に位置しているシーケンスに依存する。そして、届けられた核酸に宿主ゲノムに組み込ませられて、ベクター核酸および目標核酸間の遺伝子組換えが起こる宿主細胞ゲノムの範囲内で標的配列を有する十分な相同を有する。ビボ/エキソビボにおいて、相同組み換えを促進するのに必要なこれらのシステムおよび方法は、当業者に知られている。
c)インビボ/エキソビボ
上述の通り、組成物は、薬学的に受け入れられるキャリアにおいて投与されることができて、生体内で細胞および/または公知技術の(例えば裸のDNAの取り込み、リポソーム融合、遺伝子銃を経たDNAの筋内注射、エンドサイトーシスなど)様々な機構によるエキソビボで主題に届けられることができる。
生体外方法が使用される場合、細胞または組織は公知技術の標準プロトコルに従って取り出されることができて、本体の外側で維持されることができる。組成物は、いかなる遺伝子導入機構(例えばリン酸カルシウムによって媒介される遺伝子送出、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはプロテオリポソーム)を介しても、細胞にもたらされることができる。変換された細胞はそれから注入されることができる(例えば、薬学的に受け入れられるキャリアにおいて)または、ホモ局所的は細胞または組織タイプのための標準分析法につき主題の中へと戻して、移植できた。標準分析法は、主題に移植またはさまざまな細胞の注入で知られている。
6. 発現系
細胞に届けられる核酸は、表現制御装置を装備するのが当り前である。例えば、ウィルスおよびレトロウイルス・システムの挿入された遺伝子は通常プロモータを含むおよび/または、役に立つエンハンサは所望の遺伝子産物の表示を制御する。プロモータは、通常、転写開始点に関して比較的固定された場所においてとき機能するDNAの配列または配列である。プロモータは、RNAポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用のために必要な炉心構成要素を含んで、上流要素および反応要素を含むことができる。
a)ウィルス・プロモータおよびエンハンサ
哺乳動物宿主細胞のベクターから転写を制御している好適なプロモータは、さまざまなソース(例えば例えばウイルスのゲノム)から得られることができる:ポリオーマ、Simian Virus 40(SV40)アデノウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルスおよび最も好ましくはサイトメガロウィルス(或いは異形の哺乳類のプロモータ(例えばβactiiiプロモータ)から)。SV40ウイルスの初期のおよび遅いプロモータは、また、SV40ウィルス複製開始点を含むSV40制限フラグメントとして、便利に得られる(Fiersなど、Nature、273:113 (1978))。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモータは、HindiπE制限フラグメントとして便利に得られる(Greenway、PJ.など、Gene 18:355−360 (1982))。もちろん、宿主細胞または近縁種からのもプロモータは、本願明細書において役立つ。エンハンサは、一般に、転写開始点から一定距離で機能しなくて、いずれの5フィート(Laimins、L.など、会報Natl. Acad. Sci.78:993の(1981))または3フィート転写単位(Lusky、M.L.など、MoI.CellBio.3:1108の(1983))でもありえる一連のDNAに関連する。さらにまた、エンハンサが、イントロンの中であることができる(Banerji(J.L.など)Cell33:729の(1983))暗号配列自体の中でと同様に(Osborne、T.F.など、MoI。細胞Bio.4:1293 (1984))。それらは通常長さの10〜300の塩基対である、そして、それらはシスにおいて機能する。エンハンサは、転写を近くのプロモータから増やすように機能する。エンハンサも、しばしば、転写の調節の媒介となる反応要素を含む。プロモータは、転写の調節の媒介となる反応要素を含むこともできる。エンハンサは、しばしば遺伝子の発現調節を決定する。多くのエンハンサー配列が現在哺乳類の遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトプロテインおよびインシュリン)から公知であると共に、概して、1は一般の表現のための真核細胞ウイルスからエンハンサを使用する。好適な実施例は、複製起点(塩基対100−270)の後期側上のSV40エンハンサ、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサ、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサおよびアデノウィルス・エンハンサである。
プロモータおよび/またはエンハンサは、それらの機能を起こす光または特定の化学イベントによって特に活性化されることもできる。システムは、試薬(例えばテトラサイクリンおよびデキサメサゾン)によって調整されることができる。照射(例えばガンマ照射またはアルキル化化学療法剤)への露出によってウィルス・ベクター遺伝子形質発現を強化する方法も、ある。
特定の実施例において、プロモータおよび/またはエンハンサ領域は、転写される転写単位の領域の表示を最大にするために、構成型プロモータおよび/またはエンハンサとして働くことができる。特定の構造物においてプロモータおよび/またはエンハンサ領域がすべての真核細胞タイプにおいて作動中であることそれが特定の時刻に1種類の特定の細胞において表されるだけの場合であっても。このタイプの好適なプロモータは、CMVプロモータ(650のベース)である。他の好適なプロモータは、SV40プロモータ、サイトメガロウィルス(完全長プロモータ)およびレトロウイルス・ベクターLTFである。
真核生物宿主細胞(イースト、菌類、昆虫、設備、動物、人間または有核細胞)において使用する発現ベクターは、メッセンジャーRNA表現に影響を及ぼすことができる転写の終了のために必要なシーケンスを含むこともできる。これらの地方は、メッセンジャーRNAをコード化している組織因子タンパク質の非翻訳部分のポリアデニル化部分として転写される。3フィート非翻訳地方も、転写終結部位を含む。転写単位もポリアデニル化領域を含むことが好ましい。この領域の1つの利益は、それが転写された装置がメッセンジャーRNAのように処理されて、輸送されるという可能性を増加させるということである。識別および表現構造物のポリアデニル化信号を使用する能力は、確立されている。相同のポリアデニル化信号が導入遺伝子構造物において使われることが好ましい。特定の転写単位において、ポリアデニル化領域は、ポリアデニル化信号前半S V40に由来して、約400のベースから成る。転写された装置が単独で、または、シーケンスが表現を改善する上記と結合して他の標準シーケンス、または、安定性の、構造物を含むことは、好まれもする。
特定の実施例において、プロモータは、構成型プロモータである。これは、他の要素の追加がない場合転写制御が生じるいかなるプロモータでもありえる。この種のプロモータの例は、CMVプロモータおよびβアクチン・プロモータ(本願明細書においてジ苦しめられる他と同様に)である。特定の実施例において、プロモータは、プロモータの一つ以上の異なるタイプの融合から成ることができる。例えば、CMVプロモータおよびβアクチン・プロモータの制御領域は周知で、理解した、実施例はいずれがあるかについて本願明細書において明らかにした。例えば、これらのプロモータの部分は、生産物に融着されることができるCMV−βアクチン融合プロモータ(例えば配列番号ものに示されるもの)18.この種のプロモータがCMV成分およびβアクチン成分を有するものと理解される。これらの部品は、それぞれにプロモータとして機能することができて、このように、βアクチン・プロモータおよびCMVプロモータとそれ自身考えられる。プロモータは、プロモーター作用が生じる周知のプロモータのいかなる部分でもありえる。CMVおよびBeta Actinプロモータを含む多くのプロモータが理解される機能的な領域を有することが、そして、これらがβアクチン・プロモータまたはCMVプロモータとして使われることができることが、周知である。さらにまた、これらの領域は、決定されることができる。例えば、配列番号 15−33は、多くのCMVプロモータ、βアクチン・プロモータおよび融合プロモータを示す。これらのプロモータは比較されることができる、そして、例えば、本願明細書において記載されているにつれて、機能地域は正確に概説した。さらにまた、これらのシーケンスの各々は、プロモーター領域を開示された核酸に提供するために、いかなる組合せにおいても、それぞれに、または、一緒に機能することができる。
プロモータは、非構成型プロモータ(例えば細胞特定のプロモータ)でもありえる。これらは、現像またはステージまたは1種類の特定の細胞(例えば心臓細胞であるか、神経細胞または骨細胞)の特定の時刻にオンにされるプロモータである。特定のプロモータがそうである細胞、神経エノラーゼspecifcプロモータ(NSE)プロコラーゲン・プロモータCOLL1A1の若干の実施例(配列番号35)そして、COL2A1(配列番号36)CDlIbプロモータ(特定のPBMC−microglia/macrophage/monocyte)(配列番号69)そして、神経膠の特定の神経膠の筋原線維の酸タンパク質(GFAP)プロモータ(配列番号34)。
組換え型システムが組織特異的方法で表されることができるものと理解される。組織特異的発現が組織の存在のため発生することができるものと理解される−具体的なプロモータ。概して、プロモータがそれが特有である組織に存在することによって作動中になるときに、組織特異プロモータの制御下のタンパク質は転写される。従って、すべての細胞は、グローバルな表現のない特定の遺伝子のために符号化することができる。このように、標識タンパク質は、結果を難しくすることができる他の近くの組織の表現のない特定の組織または表現がホストに有害である組織のタンパク質の発現に存在することを示すことができる。方法が、開示する。そこにおいて、レコンビナーゼは、EDAプロモータ、胸部組織に特有のプロモータ、例えばWAPプロモータ、卵巣の組織に特有のプロモータ、例えばACTBプロモータまたは骨組織(例えばオステオカルシン)に特有のプロモータの管理下である。いかなる組織特定のプロモータも、用いられることができる。前立腺(精巣)に固有なプロモータ、そして、神経開示もする。若干の組織特異プロモータの例は限定されるものではないが、MUCl、EEA、ACTB、WAP、bHLH−EC2、HOXA−I、Alpha−フェトプロテイン(AFP)オプシン、CRl/2、Fc−γ−Receptor 1(Fc−γ−Rl)MMTVD−LTR、ヒトインスリン促進、Pdha−2を包含する。例えば、AFPプロモータの使用は、肝臓のための特異性を作成する。他の実施例、HOXA−Iはニューロンの組織特異的プロモータである、そして、このように、HOXA−1の制御中で表されるタンパク質はニューロンの組織において表されるだけである。www.pubmed.govで、これらおよび他の組織特異プロモータのためのシーケンスは、従来技術において周知で、例えば、Genbankにおいて見つかる。
b)マーカー
ウィルス・ベクターは、標識製品をコード化している核酸一次構造を含むことができる。この標識製品は遺伝子が細胞に届けられたかどうか決定するために用いる、そして、分配される一度は表されている。好適なマーカー遺伝子はE.CoIi lacZ遺伝子である。そして、それはβ−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコード化する。
若干の実施例において、標識は、選べる標識でありえる。哺乳動物細胞のための適切な選択マーカの実施例は、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体G418、hydromycinおよびピューロマイシンである。この種の選択マーカが哺乳類の宿主細胞にうまく変えられるときに、選択圧の下に配置される場合、変わる哺乳類の宿主細胞は生存することができる。選択的な制度の2つの広く使われている異なったカテゴリが、ある。第1のカテゴリは、細胞の代謝および補足培地から独立しているようになる能力が欠如している突然変異細胞線の使用に基づく。2つの実施例は、以下の通りである:CHO DHFR−細胞およびマウスLTK−細胞。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンのような栄養分の追加なしで成長する能力が欠如している。これらの細胞が完全なヌクレオチド合成経路のために必要な特定の遺伝子を欠いているので、失ったヌクレオチドが補足培地において設けられていない限り、それらは生存することができない。媒体を補充することの変形例は完全なDHFRまたはTK遺伝子をそれぞれの遺伝子を欠いている細胞にもたらすことである。このように、それらの成長要求性を変える。DHFRまたはTK遺伝子によって変わらなかった別体セルは、非補足培地の生存ができない。
第2類は、いかなる細胞型においても使用する抜取方式に関連して、突然変異細胞線の使用を必要としない有力な適任者である。これらの方式は、概して、宿主細胞の成長を抑えるために、薬を使用する。新規な遺伝子を有するそれらの細胞は、タンパク質を運搬している薬剤耐性を表して、選択を生き残る。この種の有力な適任者の実施例は、薬ネオマイシンを使用する、(South P.およびBerg、P.J.Molec.Appl.Genet.1:327の(1982))ミコフェノール酸、(Mulligan、R.C.およびBerg(P.Science 209):1422の(1980))またはハイグロマイシン、(Sugden、B.など、MoI.細胞.生物学5:410−413 (1985))。3つの実施例は、それぞれ、適当な薬G418またはネオマイシン(geneticin)に対する抵抗、xgpt(ミコフェノール酸)またはハイグロマイシンを伝達するために、真核生物制御中で細菌遺伝子を使用する。他は、ネオマイシン類似体G418およびpuramycinを含む。
c)転写後調節エレメント
開示されたベクターは、転写後調節エレメントを含むこともできる。転写後調節エレメントは、メッセンジャーRNA安定性を強化することができるかまたは転写されたメッセンジャーRNAの翻訳を強化することができる。典型的な転写後調節配列は、ウッドチャック肝炎ウィルスから分離されるWPREシーケンスである。[Zufferey R、など、J Virol;73:2886−92 (1999)]。転写後調節エレメントは3フィートおよび外因の遺伝子に対する5フィート配置されることができる、しかし、それらが外因の遺伝子に3フィート配置されることが好ましい。
d)トランスダクション効率要素
トランスダクション効率要素は、ベクターの包装およびトランスダクションを強化するシーケンスである。これらの要素は、ポリ・プリン・シーケンスを装備するのが当り前である。トランスダクション効率要素の実施例は、中心ポリ・プリン路(ppt)を含むppt−ctsシーケンスおよびHTV−I pSG3分子クローンからの中央端末サイト(cts)である(配列番号であるHIV−I pSG3クローンの中で1塩基対4327〜4483)。
e)3フィート非翻訳地方
真核生物宿主細胞(イースト、菌類、昆虫、設備、動物、人間または有核細胞)において使用する発現ベクターは、メッセンジャーRNA表現に影響を及ぼすことができる転写の終了のために必要なシーケンスを含むこともできる。これらの3フィート非翻訳地方は、外因の遺伝子をコード化しているメッセンジャーRNAの非翻訳部分のポリアデニル化部分として転写される。3フィート非翻訳地方も、転写終結部位を含む。転写単位も、ポリアデニル化領域を含むことができる。この領域の1つの利益は、それが転写された装置がメッセンジャーRNAのように処理されて、輸送されるという可能性を増加させるということである。識別および表現構造物のポリアデニル化信号を使用する能力は、確立されている。相同のポリアデニル化信号が、導入遺伝子構造物において使われることができる。転写単位の実施例において、ポリアデニル化領域は、ポリアデニル化信号前半SV40に由来して、約400のベースから成る。転写された装置は、単独で、または、シーケンスが表現を改善する上記と結合する他の標準シーケンスまたは安定性を含むことができる、構造物。
7. ペプチド
a)タンパク質異型
ポリペチドをコード化する核酸から成る構造物は、本願明細書において開示される。本願明細書において述べられるように、これらのポリペチド(例えばIL−Ira)の各々の多数の異型があることができて、それは、考察されて本願明細書においてある。加えて、開示される周知の機能蛋白質に、IL−Iraのような、また、開示されたメタうなずきおよび組成物において機能するこれらのタンパク質の誘導体も、ある。タンパク質異型および誘導体は当業者に周知である、そして、アミノ酸配列変更態様は含むことができる。例えば、アミノ酸配列変更態様は、概して3つのクラスの一つ以上に落ちる:代用であるか、挿入性であるか、欠失の異型。挿入は、一つであるか複数のアミノ酸残基の内部シーケンス挿入と同様にアミノおよび/またはC末端融合を含む。例えば、挿入は、通常、アミノまたはC末端融合のおよそ1〜4つの残基程度それらより小さい挿入である。免疫原の融合タンパク誘導体(例えば実施例に記載されているそれら)は、生体外で架橋させることによって標的配列に免疫原性を与えるために十分に大きいポリペチドを溶解させることによって作られるかまたは組換え細胞培養物によって融合をコード化しているDNAによって変わる。削除は、タンパク質配列から一つ以上のアミノ酸残基の除去によって特徴づけられる。概して、2から6までだけについて、残基は、タンパク質分子の中でいかなる唯一のサイトでも削除される。これらの異型は通常、タンパク質をコード化しているDNAのヌクレオチドのサイト固有突然変異生成によって準備される。それによって、異型をコード化しているDNAを生産する、そして。その後で、組換え細胞培養物のDNAを表す。実施例Ml 3プライマ突然変異生成およびPCR突然変異生成のために、周知のシーケンスを有するDNAの予め定められたサイトで置換突然変異をもたらすことの技術は、周知である。アミノ酸置換は、概して一つの残基であるが、すぐに多くの異なる場所で発生することができる;挿入が、通常およそ1からの10のアミノ酸残基に対するについて程度ある;そして、削除は、1から30の残基にについて変動する。削除または挿入は、隣接対(すなわち2つの残基の削除または2つの残基の挿入)において、好ましくはなされる。置換、削除、挿入またはいかなるそれらの組み合わせも、最終的な構造物に到達するために化合することができる。突然変異は、解読枠からシーケンスを配置してはならなくて、好ましくは、第2のメッセンジャーRNA構造を生産することができる補完的な地方をつくらない。代用の異型は少なくとも一つの残基が取り除かれたそれらである、そして、異なる残基がその位置に嵌入される。この種の置換は、一般に以下の表1および2に従ってなされて、保存的置換と呼ばれる。
Figure 2009501128
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機能または免疫学的なアイデンティティの相当な変化は、すなわち、表2のそれらより保守的でないセレクティング置換によってなされる。そして、より(a)を維持することの置換におけるポリペチド・バックボーンの構造が例えば標的部位の分子または側の大半(c)のシートであるからせんのコンフォメーション、負担(b)または疎水性として鎖をつくるというそれらの趣旨の著しく異なる残基を選択する。一般に、タンパク質所有物において最も大きな変化をもたらすと思われる置換はそれらであるそれ(a)親水性残基(例えばセリルまたはスレオニル)は恐怖病の残基(例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル)間で(またはそばに)置換される;システインまたはプロリンは、他のいかなる残基(またはそばに)とも置換される(b);電気陽性の側鎖(例えばリジル、アルギニルまたはヒスチジル)を有する残基は、電気的陰性残基(またはそばに)(例えばグルタミルまたはアスパルチル)と置換される(c);または、大きな側鎖(例えばフェニルアラニン)を有する残基は、硫酸化および/またはグリコシル化の場所の数を増加させることによって、この場合、側鎖(例えばグリシン)(e)を有していない(またはそばに)ものと置換される(d)。122. 例えば、生物学上および/または化学的に類似しているもう一方を有する1つのアミノ酸残基の置換は、保存的置換として当業者に公知である。例えば、保存的置換は、もう一方のための1つの恐怖病の残基またはもう一方のための1つの極地の残基を交換している。置換は、組合せ(例えばGIy、Ala)を含む;VaI、He、Leu;Asp、GIu;Asn、GIn;Ser、Thr;Lys、Arg;そして、Phe、チロシン基。各明確に開示されたシーケンスのこの種の保守的に置換されたバリエーションは、本願明細書において設けられているモザイク・ポリペチドの中で含まれる。
代用であるか欠失の突然変異生成は、N−グリコシル化(Asn−X−Thr/Ser)またはO−グリコシル化(SerまたはThr)の場所を嵌入するために使用されることができる。システインまたは他の不安定な残基のも削除は、望ましくてもよい。削除または潜在的プロテオリシス・サイト(例えばArg)のうち置換塩基性残基の1つを削除するかまたはグルタミニルまたはヒスチジル残基によって1つを置換することによって、例えば完成している。
特定の翻訳後誘導体化は、表されたポリペチド上の組換え宿主細胞の動作の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、しばしば、対応するグルタミルおよびasparyl残基に非アミド化される翻訳後である。あるいは、これらの残基は、緩酸性状況の下で非アミド化される。他の後翻訳変更態様は、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニン残基の水酸基のリン酸化、リシンのo−アミノ基のメチル化、アルギニンおよびヒスチジン側鎖(T.E.Creighton、Proteins:構造、そして、Molecular Properties、W.H.Freeman& Co.San Francisco pp 79−86[1983])N末端アミンの中でアセチル化、そして、若干の例(C末端のカルボキシルのアミド化)を含む。
本願明細書において開示されたタンパク質の異型および誘導体を定める一つの方法が特定の周知のシーケンスに相同/アイデンティティに関して異型および誘導体を定めることによってあるものと理解される。例えば、配列番号:5は、IL−lraおよび配列番号の特定のシーケンスを記載する:9は、IL−1R2タンパク質の特定の配列を記載する。これらの異型が特に開示する、そして、本願明細書において他のタンパク質は開示した。そして、少なくともそうした、定まったシーケンスに対する70%または75%または80%または85%または90%または95%の相同。当業者は、容易に、2つのタンパク質の相同を決定する方法を理解する。例えば、相同がその最高レベルにあるように、相同は2つのシーケンスを整列配置した後に算出されることができる。
算出相同の他の方法は、発表されたアルゴリズムによって実行されることができる。比較のためのシーケンスの最適配列は、SmithおよびWaterman Advのローカル相同アルゴリズムによって実行されることができる。Appl.Math.2:482の(1981)(NeedlemanおよびWunsch(J.MoL Biol.48)の相同配列アルゴリズムによる):443の(1970)(PearsonおよびLipman(会報Natl. Acad. Sci.U.S.A.85)の類似性方法の検索による):2444の(1988)(これらのアルゴリズム(ウィスコンシンGenetics Software Package、Genetics Computer Group、575人のScience博士、Madison、WTのGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA)のコンピュータ化された実施態様による、または、点検による)。
相同の同一形式は、例えばZuker(M.科学244)において開示されるアルゴリズムによって、核酸のために得られることができる:48−52、1989、Jaegerなど会報Natl. Acad. Sci.USA 86:7706−7710、1989、Jaegerなど方法Enzymol.183:281−306(少なくとも核酸配列に関連した材料のための参照によって組み込まれて本願明細書においてある1989)。
保守的な突然変異および相同の説明が一緒に、いかなる組合せ(例えば異型が保守的な突然変異である特定のシーケンスに少なくとも70%の相同を有する実施例)にも組み込まれることができるものと理解される。
この仕様がさまざまなタンパク質およびタンパク質配列について述べるように、それらのタンパク質配列をコード化することができる核酸も開示されるものと理解される。これは変性核酸を含んで特定のタンパク質配列(すなわちすべての核酸と同様に1つの特定のタンパク質配列をコード化するシーケンスを有するすべての核酸)に関連したすべての変性シーケンスを含む。そして、タンパク質配列の開示された異型および誘導体をコード化する。このように、各特定の核酸一次構造が本願明細書において書かれることができないと共に、どのシーケンスも事実開示されて、開示されたタンパク質配列で本願明細書において記載されているものと理解される。アミノ酸配列がどんな特定のDNAの塩基配列が有機体の範囲内でそのタンパク質をコード化するかについて指し示さないと共に、開示されたタンパク質の特定の異型が本願明細書において開示されそして、記載される本願明細書で、そのタンパク質をそのタンパク質が起こる特定の有機体にコード化する周知の核酸一次構造も公知であるとも理解される。
開示された組成物に組み込まれることができる多数のアミノ酸およびペプチド類似体があるものと理解される。例えば、表1および表2に示される異なる機能的な置換基、それからアミノ酸を有する多数のDアミノ酸またはアミノ酸が、ある。ペプチド類似体の立体異性体と同様に、自然に生じるペプチドの逆の立体異性体は、開示される。これらのアミノ酸は運搬RNA分子に、例えば、アンバーコードンを利用する優れたおよび工学遺伝子の構造物のアミノ酸を充填することによってポリペプチド鎖に直ちに組み込まれることができる。そして、アナログのアミノ酸をサイト固有方法のペプチド鎖に嵌入する、(Thorsonなど、Molecの手法.生物学77:43−73の(1991)Zoller、BiotechnologyのCurrentオピニオン、3:348−354の(1992);Ibba、Biotechnology及びGenetic Enginerring Reviews 13:197−216の(1995)Cahillなど、TBS、14の(10):400−403 (1989);Benner、TIB Tech、12:158−163の(1994);IbbaおよびHennecke、Bio/技術、12:678−682の(1994)本願明細書においていずれが少なくともアミノ酸アナログに関連した材料間の参照によって全部組み込まれる)。
ペプチドに似ている分子は、生じることができる、しかし、いずれが、自然なペプチド結合を介して接続されない。例えば、アミノ酸のための結合またはアミノ酸アナログは、CH2NH−を含むことができる−CH2S−−CH2−CH2−−CH=CH−(シスおよびトランス)−COCH2−−CH(OH)CH2−そして−CHH2SO−(これらその他は、Spatola、Amino Acids、PeptidesおよびProteinsのChemistryおよびBiochemistryのA.F.B.Weinstein、編集、Marcel Dekker、New York、267ページ(1983)で見つかることができる;Spatola、A.F.Vega Data(1983 3月)第1巻、発行3、Peptide Backbone Modifications(一般の再調査);Morley、傾向Pharm Sci(1980)pp.463−468;Hudson、D.など、Int J Pept Prot Res 14:177−185の(1979)(−CH2NH−CH2CH2);SpatolaなどLife Sci 38:1243−1249の(1986)(−CH H2S);Hann J.化学Soc Perkin Trans.1307−314の(1982)(−CH−CH−シスおよびトランス);AlmquistなどJ.Med.化学23:1392−1398の(1980)(−COCH2);23:2533(1982)Jennings−WhiteなどTetrahedron Lett(−COCH2);Szelkeなどヨーロッパ人Appln、EP 45665 CA(1982):97:39405(1982)(−CH(OH)CH2);HolladayなどTetrahedron.Lett 24:4401−4404の(1983)(−C(OH)CH2);そして、Hraby Life Sci 31:189−199の(1982)(−CH2−S);各々いずれが本願明細書に引用したものとする。非ペプチド−CH2NH結合が特に好適である。ペプチド類似体が結合原子(例えばb−アラニン、g−アミノ酪酸、など)との間に一つ以上の原子を有することができるものと理解される。
アミノ酸アナログおよび類似体およびペプチド類似体は、しばしば強化されたか望ましい特性(例えばより経済的な製造、より大きな化学的安定性、強化された薬理学的性質(半減期、吸収、効力、有効性、その他)変えられた特異性(例えば生物学的活性度の広域抗菌スペクトル)還元した抗原性、その他)を有する。
D−アミノ酸はより安定ペプチドを生成するために用いることができる。−その理由は、次のことにある。Dアミノ酸はペプチダーゼその他によって認識されない。同一形式(例えばL−リシンの代わりにD−リシン)のD−アミノ酸を有する共通配列の一つ以上のアミノ酸の組織的置換は、より安定ペプチドを生成するために用いることができる。システイン残基は、環化するかまたは一緒に二個以上のペプチドを取り付けるために用いることができる。これは、特定のコンフォメーションにペプチドを拘束するために有益でありえる。(RizoおよびGierasch Ann.61:387(1992)Rev.Biochem.(ここにて組み込まれる))。
8. 製薬製品の薬剤担体/配送
本願明細書において開示される組成物は、薬学的に受け入れられるキャリアにおいて生体内に投与されることもできる。「薬学的に受け入れられる」によって意味する、材料はそれほど生物学上、または、別に望ましくなくなくて、すなわち、でなくて、材料は、核酸またはベクターとともに、いかなる望ましくない生体影響も引き起こすことのない主題に与えられることができてまたはそれがある医薬品組成物の他の構成要素のいずれかを有する有害な方法で相互に作用することが、含有した。キャリアは当然、主成分のいかなる低下も最小化して、主題のいかなる逆副作用も最小化するように選択される。そして、そのことは当業者にとって周知である。
組成物は、腹こう内投与によって、非経口的に(例えば、静注で)筋肉内投与によって経口投与されることができる経皮的、体外で、局所的等吸入薬による局在鼻腔内の管理または管理を含む。ここで使用しているように、「局在鼻腔内の管理」は、鼻および鼻孔の一方または両方を通る鼻の通路に組成物の配送を意味して、吹付け機構または液滴メカニズムによって、または、核酸またはベクターのエアロゾール適用で配達から成ることができる。吸入薬による組成物の管理は、吹付けまたは液滴メカニズムによって配達を経て鼻または口によってありえる。配達が、直接挿管法を介して呼吸器(例えば肺)のいかなる領域にもあることもできる。必要な組成物の正確な量は、主題、治療されているアレルギー性障害のひどさ、特定の核酸または使用する媒体動物の種、年齢、重量および全身状態次第であって、その投与様式などを従属させるために、主題から変化する。このように、すべての構成のための正確な量を特定することは、可能でない。しかしながら、適当な量は、従来技術において、教示を本願明細書において与えられるルーチン試験だけを使用して、当業者で測定されることができる。
使われる場合、構成の非経口投与は通常、注入によって特徴づけられる。液溶体またはサスペンション(サスペンションの注入より前の液体の溶解に適している確実な形)として、または、エマルジョン類として、注射剤は、従来の形で準備されることができる。恒常的な投与量が維持されるように、非経口投与のためのより最近修正されたアプローチは遅い解放または持効性システムの使用を必要とする。米国特許番号3,610,795(本願明細書において引用したものとする)参照。
材料は、溶液(中止(例えば、微小粒子、リポソームまたは細胞に組み込まれる))においてありえる。これらは、抗体、レセプタまたは受容体リガンドを介して特定の細胞型に目標とされることができる。以下の参照は、腫瘍組織に特定のタンパク質を目標とするこの技術の使用の実施例である(Senter、など、Bioconjugate化学、2:447−451((1991));Bagshawe、K.D.Br.J.Cancer、60:275−281((1989));Bagshawe、など、Br.J.Cancer、58:700−703((1988));Senter、など、Bioconjugate化学、4:3−9((1993));Battelli、など、CancerImmunol.Immunother.35:421−425((1992));PieterszおよびMcKenzie(Immunolog).再調査、129:57−80((1992));そして、Roffler、など、Biochem.Pharmacol、42:2062−2065((1991)))。
「秘密」および他の抗体のような車両は、リポソーム(結腸癌に脂質によって媒介される薬物ターゲティングを含む)細胞特定のリガンドによるDNAのレセプタによって媒介されるターゲッティング、リンパ球に誘導された腫瘍ターゲッティングおよび生体内ネズミのグリオーマ細胞の非常に特定の治療的なレトロウイルス・ターゲッティングを活用させた。以下の参照は、腫瘍組織に特定のタンパク質を目標とするこの技術の使用の実施例である(Hughesなど、CancerResearch、49:6214−6220、(1989);そして、LitzingerおよびHuang、小Biochimica Biophysica Acta(1104:179−187)(1992))。一般に、レセプタは、エンドサイトーシス(いずれの構成型またはリガンド起因性も)の経路に関係している。これらのレセプタは、クラトリン−被覆陥入においてクラスター形成するか、クラトリン−被覆小胞を介して細胞に刺さるか、レセプタがソートされる酸性化されたエンドソーム、そうすると、細胞表面に対するいずれのリサイクルも貫通するか、細胞内に格納されるか、または、ライソソームにおいて劣化する。内部移行経路は、様々な機能(例えば養分吸収、活性タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、リガンドのウイルスおよび毒素、解離および低下の日和見主義的なエントリおよびレセプタ・レベルの規則)に間に合う。多くのレセプタは一つ以上の細胞内の経路をたどる。そして、細胞型、レセプタ集中、タイプのリガンド、リガンド結合価およびリガンド集中次第である。受容体依存性エンドサイトーシスの中で分子および細胞状の機構チェックする(Brown、そして、Greene、DNA、そして、セルBiology 10:6、399−409(1991))。
a)薬学的に受け入れられるキャリア
組成物が、抗体を含んで、薬学的に受け入れられるキャリアと組み合わせて治療的に用いられることができる。
適切なキャリアおよびそれらの製剤は、Remingtonに記載されている:薬局(第19の編集)編集A.R.のScienceおよび実践Gennaro、Mack Publishing社、Easton、PA 1995。概して、薬学的に受け入れられる塩の適当な量が、製剤を均等緊張にするために、製剤において使われる。薬学的に受け入れられるキャリアの例には、制限されるわけではないが、食塩水、リンゲル液およびブドウ糖溶液が含まれる。溶液のpHは、好ましくは約5つの乃至約8から、そして、より好ましくは、約7つの乃至約7.5からある。更なるキャリアは、例えば、抗体(マトリックスが造形品の形である)を含んでいる固体の疎水性ポリマーの半透性の母体のような持効性薬剤を含むフィルム、リポソームまたは微小粒子。例えば、特定のキャリアが投与経路および管理されている構成の集中によって、より好ましくてもよいことは、それらの当業者にとって明らかである。
薬剤担体は、当業者に公知である。これらは最も概して人間に対する薬の投与のための標準キャリアである。そして、溶液(例えば生理的pHの無菌水、食塩水および緩衝された溶液)を含む。組成物は、筋注で、または、皮下に投与されることができる。他の化合物は、当業者によって使われる標準手順に従って管理される。
医薬品組成物は、選択の余地の分子に加えて、キャリア、増粘剤、希釈液、バッファ、防腐剤、表面活性剤および同類を含むことができる。医薬品組成物は、一つ以上の主成分(例えば抗菌因子、抗炎症薬、麻酔薬、など)を含むこともできる。
医薬品組成物は、局所であるか全身治療が要求されるかどうかに依存している多くの方法で、そして、既治療である領域上に投与されることができる。管理は、経口的に、吸入によって、または、非経口的に、例えば点滴静注(皮下であるか、腹腔内であるか、筋肉内の注入)による局所的(眼科学的に、経膣的に、直腸に、鼻腔内に含むこと)でありえる。開示された抗体は、静注で、腹膜内に、筋注で、皮下に、内部空腔、または、経皮的を施されることができる。
非経口投与に対する準備は、滅菌水性であるか非水溶溶液、サスペンションおよびエマルジョン類を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注射用有機エステルである。水性担体は食塩および緩衝剤を含む水、アルコール/水溶液、懸濁液または乳濁液などである。非経口的車両は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウムを含むか、リンゲルのものを泌乳したか、または、油を固定した。静脈内溶媒は、流体および栄養を含む補液、電解質補充薬(例えばリンゲルのブドウ糖に基づくそれら)などを含む。防腐剤および他の添加物は、現在(例えば抗微生物性、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなど)でもありえる。
局所投与用製剤は、軟膏、ローション剤、クリーム、ゲル類、低下、坐薬、スプレー、液体および粉を含むことができる。従来の薬剤担体(水性の)は粉末になる、または、油性ベース、増粘剤などは必要でありえたか望ましくありえた。
内服のための組成物は、粉または顆粒、サスペンションまたは溶液を水または非水系媒体、カプセル、小さい袋または錠剤に含む。増粘剤、調味料、希釈液、乳化剤、分散している援助または結合剤は、望ましくありえた。
組成物のいくつかは、薬学的に受け入れられるacid−またはbase−付加塩(塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およびリン酸のような無機酸および蟻酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸およびフマル酸のような有機酸を有する反応によって形成される)として、または、無機塩基(例えばモノ、di−トリアルキルおよびアリール・アミンおよび置換されたエタノールアミンのような水酸化ナトリウム、安水、水酸化カリウムおよび有機塩基)を有する反応によって投与されることができる。
b)治療的な用途
組成物を投与するための有効薬量およびスケジュールは経験的に決定されることができる、そして、この種の決定をすることは従来技術において技術の範囲内である。組成物の管理のための用量範囲は、障害の症状が影響を受ける所期の効果を生じるのに十分大きなそれらである。投与量は、逆副作用(例えば不必要な交差反応、アナフィラキシー反応、など)を引き起こすほど大きくてはならない。通常、投薬は年齢、状態、性交および患者(投与経路)の疾患の範囲によって変化するまたは、他剤が療法および缶に含まれるかどうか、当業者で測定される。投与量は、いかなる反表示の場合にはも個々の医師によって調整されることができる。1または数日間、投薬は、変化することができて、毎日一つ以上の服用政権において管理されることができる。ガイダンスは、製薬製品の所与の種類のための適切な投薬のための文献で見つかることができる。例えば、抗体のためのセレクティング適当な線量のガイダンスは、抗体(例えばMonoclonal AntibodiesのHandbook、Ferroneなど、編集、Noges Publications、Park Ridge、NJ.(1985)ch.)を治療的な使用する能力についての文献で見つかることができる。22およびpp.303−357;鉄工など、Human DiagnosisおよびTherapyのAntibodies、Haberなど、編集、Raven Press、New York(1977)pp.365−389。使用する抗体の典型的1日の適用量は日につき約1つのμg/キログラムから少なくとも最高100mg/kgの体重に単独でわたるかもしれない。そして、前述の要因次第である。
処理、抑制または防止炎症のための開示された構成(例えばベクター)の管理の後に、治療的なベクターの有効性は、よく熟練した実務家に知られているさまざまな方法で評価されることができる。例えば、当業者は、構成(例えばベクター)が本願明細書において開示されて構成が炎症を減らすと述べることによって主題の処理または抑制性炎症において有効であると従来技術において理解する。
9. 動物
ベクターのいずれかの生殖系列伝送から成っているトランスジェニック動物または本願明細書において設けられている核酸は、本願明細書において設けられている。一つの態様では、本願明細書において設けられているトランスジェニック動物は、切除活性トランスジェニック(XAT)動物である。開示された遺伝子導入実験動物は、導入遺伝子表現を時間的に、そして、炎症要素の中で空間的に調整することができた(Brooks、AI、など1991。自然Biotech 15:57−62;Brooks、AI、など1999.神経報告10:337−344;Brooks、AL、など2000。Proc Natl Acad Sci USA 97:13378−13383)。トランスジェニック動物が組換え部位から成る核酸から成る所で、本願明細書において開示されるように、レコンビナーゼの配達がCreレコンビナーゼのような細胞に設けられているトランスジェニック動物の中でそれらのセルの中で結果として炎症性モジュレータ(例えばJL−Iβ、JL−lra、COX−2)の表示になるものと理解される。
「導入遺伝子」によって、技術によって細胞に嵌入されて、その細胞およびその後継者のゲノムの一部になる核酸一次構造は、意味される。この種の導入遺伝子細胞に異形で(例えば、異なる種に由来する)部分的に、または、完全に、ある(しかし、必ずあるというわけではない)。おそらくゲノムに通常存在しないシーケンス、あるが、通常転記しなくて、所与のゲノムまたは他のいかなる遺伝子においても並進した(「表される」)遺伝子または1がゲノムにもたらすことを望むDNAを有する遺伝子またはDNAを含むがこれに限らず、用語「導入遺伝子」は、広く、動物のゲノムにもたらされるいかなる核酸にも関連する。これは、遺伝子を含むことができるそれ通常そうである1が表現において変わったことを望む、または1が変えられたか異なる形で導くことを望む非移植遺伝子のゲノムに存在する。導入遺伝子は一つ以上の転写性調節配列を含むことができる、そして、他のいかなる核酸(例えばイントロン)も選択された核酸の最適発現のために非常に必要でありえる。導入遺伝子は、長くわずか1対のヌクレオチドでありえるが、長く、または、より長くさえ少なくとも好ましくは50、100、150、200、250、300、350、400、または500ヌクレオチドについてあって、例えば、全てのゲノムでありえる。導入遺伝子は、符号化または非コード・シーケンスまたはそれらの組み合わせでありえる。通常導入遺伝子には、適当な状況の下で一つ以上の導入遺伝子の表示をドライブすることができる調節性の要素が具備されている。「トランスジェニック動物」によって、上記の通りの導入遺伝子から成る動物は、意味される。トランスジェニックアニマルは、公知技術である技術によって作られる。本願明細書において開示されるように、いかなる組合せにおいても、開示された核酸(全体または一部の)は導入遺伝子でありえる。
本願明細書において開示される核酸分子のいずれかをもつ動物の範囲内で細胞をトランスフェクションさせる方法によってできる動物は、開示される。核酸分子のいずれかが本願明細書において開示した動物の範囲内で細胞をトランスフェクションさせる方法によってできる動物が、開示する、そこにおいて、動物は、哺乳類である。開示もする動物の範囲内で細胞をトランスフェクションさせる方法によってできる動物が、本願明細書において開示される核酸分子のいずれかである、そこにおいて、哺乳類は、マウス、ネズミ、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタまたは霊長類である。
開示されたトランスジェニック動物はいかなる人間以外の動物(好ましくは非人間哺乳類(例えばマウス、ネズミ、ウサギ、リス、ハムスター、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロ・ブタ、プレーリードッグ、ヒヒ、リスザルおよびチンパンジ、など)鳥または両生類)でもありえる。そこにおいて、一つ以上の細胞は人間の介入として、例えば公知技術の移植遺伝子の技術によって導かれる異形の核酸を含む。核酸は、マイクロインジェクションによって、または、組換えウイルスへの感染によって例えば、直接、または、間接的に、細胞の前駆体へのはじめにによって、細胞にもたらされる。開示されたトランスジェニック動物は、直接操作された、または、開示された核酸の一つ以上を受信する最初の動物であった動物の結果を含むこともできる。この分子は染色体の範囲内で集積されることができる、または、それはDNAを染色体外で複製していることができる。トランスジェニック動物の製造に関連した技術のために、なかでも、Hoganその他を(1986)見ることManipulating Mouse Embryo−A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory、コールドスプリングハーバー、N.Y.1986)。
移植遺伝子の実験に適している動物は、標準商業的なソース(例えばCharles川(Wilmington、Mass.)Taconic(Germantown、N.Y.)およびHarlan SD系(Indianapolis、若者。))から得られることができる。例えば、トランスジェニック動物がマウスである場合、多くのマウス圧力は適切である、しかし、C57BL/6雌のマウスが胚の検索および転送のために用いられることができる。C57BL/6雄が交接のために用いられることができる、そして、vasectomizedされたC57BL/6種畜は擬似妊娠を刺激するために用いることができる。Vasectomizedマウスおよびネズミは、供給元から得られることができる。トランスジェニックアニマルは、ミクロインジェクション法および胚幹細胞方法を含むいかなる周知の手順によっても作られることができる。齧歯目の胚の操作のための、そして、DNAのマイクロインジェクションのための手順は、Hoganその他において詳述する、Manipulating Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory、コールドスプリングハーバー、N.Y−1986)(いずれの教示も一般に公知で、本願明細書において組み込まれる)。
トランスジェニックアニマルは、それらのDNAを分析することによって確認されることができる。この目的のために、例えば、トランスジェニック動物が尾部(例えば齧歯動物)をもつ動物であるときに、尾部サンプル(1〜2cm)は3週間目の動物から取り除かれることができる。これらからのDNAまたは他のサンプルは(lor実施例)それから準備されることができて、解析した。そして、トランスジェニックを検出するサザンブロット、PCRまたはスロット汚点によって、(F(O))動物およびそれらの後継者(F(1)およびF(2))は失敗する。更なる本発明は、本発明のトランスジェニック動物および第2の動物の雑種の結果である移植遺伝子の人間以外の動物を提供する。トランスジェニックアニマルは他のトランスジェニック動物によって飼育されることができる。ここで、2つのトランスジェニック動物は異なる導入遺伝子を使用して発生した。そして、他の遺伝子産物上の1つの遺伝子産物の効果を試験するかまたは2つの遺伝子産物の併用効果をテストする。
設けられている組成物は、関節炎のマウスモデルを使用して評価されることができる。ジョイントのIL−1βの長期にわたる表示が関節炎患者に示してそれと類似の関節症の現像に導くことができるにつれて、TL−β.の長期にわたる、低い水平な関節腔内の移植遺伝子の表示に基づく関節炎のマウスモデルは開示するTL−βの役割、TNFαおよび他の炎症伝達物質(例えばプロスタノイド)は、関節炎の病因において、よく認識される。2つは、最も一般的には関節炎の中で形をなす骨関節炎(OA)(65歳以上のすべての成人の約80%−90%に影響を及ぼす)および慢性関節リウマチ(RA)(一般のU.S.人口のほぼ1%に影響を及ぼす)である。異なった違いがOAおよびRAの間に存在するにもかかわらず、両方とも炎症誘発性カスケードに二次性を開発するように見える。以前の動物モデルは、関節炎を調査して、TNFαトランスジェニック・マウスモデルと同様に、遺伝子工学による滑膜細胞の生体外転送の後にメチル化ウシ血清アルブミン/IL−lβのモデル、IL−1βの関節腔内の管理、TL−βの構成型関節腔内の表示を含む新規な治療法をテストする際に貴重であると判明した。上述したJL−Iβモデルは有害な剤の直接の管理に基づくが、TNFce遺伝子導入マウスは生体内でTNFceの長期にわたる表示に基づいて、TNFoの役割上の有益な洞察をここまで得た;関節炎の発現において。しかしながら、大多数のトランスジェニックマウスと同様に、TNFαトランス起源は、抑制されていないおよび特徴のない発達上の代償の変化に影響されやすい。
生殖系列を利用している方法(身体のモザイク分析)に基づく設けられているマウス母数模型は、興味がある遺伝子を「活性化する」Creレコンビナーゼを表すウィルス・ベクターの休止中の転写単位および身体の遺伝子導入を含んでいる組換え性基質を送信した。IL−1βは切除されたでトランスジェニック(JL−IβXAτ)マウスを起動させた、そして、そのバリエーションはこの方法を使用して発生した。設けられているマウスモデルはU.S.特許出願番号第60/627,604号の主題である。そして、それは完全に参照によって組み込まれて本願明細書においてある。このマウスモデルは、Creレコンビナーゼ発現ベクター(例えば標的部位に対するFΙV(Cre))の配達に基づいて、局所化された炎症の誘導を考慮に入れる。バリエーションは、例えば細胞であるか組織特異的プロモータの使用を例えばCOLL1A1−IL−1βXATマウスに含む。例えば、COLL1A1−IL−βXATマウスの接点へのFΙV(Cre)の配達は、例えば、型関節炎に炎症を誘発することができる。このマウスモデルが、このように、例えば、試験に用いられることができるかまたは関節炎上の設けられている構造物の効果を最適化することができる。別の例として、FΙV(Cre)の配布への配達またはCOLL1A1−IL−1β1マウスのジョイントは、モデル(例えばアルツハイマー病)に、脳の炎症を誘発することができる。
IL−1βXAT調節は側頭部(時間)において制御される、そして、生殖系列を利用している(1)Cre/loxP分子遺伝学的方法による空間(場所)傾向は興味がある遺伝子を「活性化する」Creレコンビナーゼを表すウィルス・ベクターの休止中の転写単位および(2)身体の遺伝子導入を含んでいる組換え性基質(例えば結腸Li−悪いβXAT)を送信した。このように、これらのマウスが、マウスのジョイント(例えば膝)のIL−1β構成的発現を誘発するために、本願明細書において用いられることができる。例えば、局所化された導入遺伝子活性化(すなわちIL−1β)は、関心領域に、FΙV(Cre)(ジョイントの柔らかいおよび硬い薄紙を変換することができるレンチウイルス)の嚢内の注入および遺伝子転写に導いている
Figure 2009501128
カセットの組換え性切除によってIL−1βマウスにおいて達成されることができる。遺伝子組換えによって媒介される遺伝子「活性化」は、永久に、このように慢性のIL−β合成を許容している感染細胞の遺伝子の構成を変える。COLL1A1プロモータは軟骨細胞、骨細胞および繊維芽細胞に遺伝子形質発現を目標とするために更に用いることができる。そして、興味があるいかなるジョイントの関節炎の研究も利用できるこの遺伝子導入マウスを作る。このプロモータは、骨および軟骨の遺伝子形質発現を目標とすることを示して、CMVプロモータ(図1)の代わりに、IL−1βXAT遺伝子においてクローンをつくられた:(COLL1A1−IL1βXAT)COLL1A1=>
Figure 2009501128
IL1β−IRES−lacZ。
COLL2は、他の適切なプロモータである。この導入遺伝子は、pRc/CMV−CreWT発現ベクターの一時的なトランスフェクションによるCreレコンビナーゼの表示の後に、または、レンチウイルス・ベクターFΙV(Cre)による感染の後、建設されて、ネズミのNTH 3T3安定細胞系においてテストされた。
レコンビナーゼの身体の遺伝子導入は、Creのようなレコンビナーゼを生じているベクター系の任意型を使用して実行されることができる。しかしながら、特定の実施例において、例えば、ベクター系が自己不活性化しているベクター系(。そこにおいて、プロモータ)であることレコンビナーゼの組換え部位によってそのように側面に位置するレコンビナーゼの製造に応じて、レコンビナーゼが、それ自身の製造を減少して調整する。レコンビナーゼのための配達ベクターは、伝達されるCREでありえる。
例えば、休止中のCOLLI−ILβXATの活性化は、自動不活性化しているCreネコ免疫不全ウイルスFΙV(Cre)を介して、関心領域(例えば膝)に、Creレコンビナーゼの転送によって伝達されることができる。このFIVベクター系の効果は、以前、ウィルス溶液の関節内投与を受信したマウスのレポーター遺伝子lacZ(β−ガラクトシダーゼ)を使用して検討された[Kyrkanides S、その他(2004)。J Dental Res 83:65−70]そこにおいて、柔らかい(関節円板)および硬い(軟骨)TMJ薄紙のトランスダクションは、示された。FIV(Cre)ベクターは、lacZ遺伝子の場所のloxPの側面に位置された(「floxedされた」)nlsCreカセットのクローンをつくることによって造られた;核移行信号(nls)は、PCRによってcre転写解読枠に融和して、オーダーメードのfloxedされたクローン化カセットを使用している製造業者の指示につき、TOPOにその後2.1本のベクター(インビトロゲン)のクローンをつくった。自動不活性化しているcre遺伝子を開発する理由は、最近の紙に基づく[Pfeifer AおよびBrandon EP、Kootstra Neeltje、Gage FH、Verma IM(2001)。Proc Natl Acad Sci U.S.A.98:11450−5]それによって、著者は、レンチウイルス・ベクターを使用している感染によって伝達されるCreレコンビナーゼの長期にわたる表示のため、細胞毒性を報告した。設けられている構造物(COLLIの切除された活性化を生じるCreレコンビナーゼの十分なレベルの製造の)において−FΙV(Cre)を有する的状赤血球の成功したトランスダクションの後に、遺伝子組換えILlβXAT、Creが切除されたloxP−に誘導された自己によってcre遺伝子を非活性化することが、予期される。
10. キット
本願明細書において開示される方法を実施する際に用いられることができる試薬に引かれるキットは、本願明細書において開示される。キットはいかなる試薬もまたは本願明細書において述べられる試薬の組合せを含むことができる、または、それは必要であるためによく理解されているか開示された方法の実行において有益である。例えば、キットは、意味されるにつれてバッファおよび酵素がプライマを使用することを必要としたのと同程度よく、方法の特定の実施例で述べられる増幅反応を実行するために、プライマを含むことができる。
D.手法
さもなければ特に強調されない限り、本願明細書において開示される組成物および開示された方法を実行するのに必要な和議はその特定の試薬または化合物のための当業者に知られているいかなる方法も使用してなされることができる。
1. 核酸合成
例えば実施例(核酸)のために、プライマとして使用されるオリゴヌクレオチドが、標準化学合成法を使用して作られることができるかまたは酵素法または他のいかなる周知の方法も使用してできることができる。この種の方法はヌクレオチド断片隔離が続く標準酵素消化から変動することができる(実施例、Sambrookなど、Molecular Cloningのために見る。TA「研究所マニュアル、第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールドスプリングハーバー、N.Y.1989)Chapters 5、6、例えば、Milligenを使用しているシアノエチル・ホスホラミダイト方法またはベックマン・システムに単に合成方法)lPlus DNA合成装置(例えば、モデル8700は、Milligen−Biosearch、Burlington、MAまたはABIモデル380Bのシンセサイザを自動化した)。オリゴヌクレオチドを作ることに役立つ合成方法は、Ikutaなど(Ann)によっても記載されている。Rev.Biochem.53:323−356の(1984)(リン酸トリエステル、そして、亜リン酸エステル−トリエステル法)およびNarangなど、手法EnzymoL、65:610−620の(1980)(ホスフォトリエステル法)。核酸分子がそれらのような周知の方法を用いて作られることができるタンパク質は、Nielsenによって、Bioconjugに記載された(化学5:3−7の(1994))。
2. ペプチド合成
開示されたタンパク質(例えば配列番号)を生産する1つの方法:5は、タンパク質化学技術によって二個以上のペプチドまたはポリペチドを結びつけることである。例えば、ペプチドまたはポリペチドは、Fmoc(9−fluorenyhnethyloxycarbonyl)かBoc(tert−butyloxycarbonoyl)化学を使用している今日到達している実験装置を使用して、化学的に合成されることができる。(ABI、Foster City、CA)。当業者は、開示されたタンパク質に対応するペプチドまたはポリペチドが、例えば、標準化学反応によって合成されることができると直ちに認めることができる。例えば、ペプチドまたはポリペチドは合成されることができて、その合成樹脂から隔離されることができないが、ペプチドまたはタンパク質の他の断片は総合されることができて、その後樹脂から隔離されることができる。それによって、他の断片に機能的に防がれる末端基を露出させる。ペプチド縮合反応によって、これらの2つの断片は、それぞれ、抗体または断片単独を形成するためにそれらのカルボキシルおよびアミノ末端でペプチド結合を介して接続される共有結合ででありえる。(GA(1992)にSynthetic Peptidesを与える:使用者Guide.W.H.Freeman and Co.N.Y.(1992);Bodansky MおよびTrost B.(Ed)。Peptide Synthesisの(1993)Principles。Springer−Verlag社、NY(それは、少なくともペプチド合成に関連した材料のための参照によって組み込まれて、本願明細書においてある)。あるいは、本願明細書において記載されているにつれて、ペプチドまたはポリペチドは生体内でそれぞれに合成される。一旦分離されると、これらの独立ペプチドまたはポリペチドは類似のペプチド縮合反応を介してペプチドまたは断片単独を形成するために連結されることができる。
例えば、部分によって比較的短いペプチド断片がそうであることができる、クローンをつくられたか合成ペプチドの酵素ライゲーションは、より大きなペプチド断片、ポリペチドまたは総タンパク領域(Abrahmsen Lなど、生化学、30:4151(1991))を生じるために接続した。あるいは、合成ペプチドの自国の化学ライゲーションは、総合的により短いペプチド断片から大きいペプチドまたはポリペチドを造るために利用されることができる。この方法は、2つのステップ化学反応から成る(Native Chemical LigationによるProteinsのDawsonなどSynthesis。科学、266:776−779の(1994))。第一段階は、最初の共有結合的製品としてチオエステルにリンクされた中間体を与えるためにアミノ末端システイン残基を含んでいる他の保護されていないペプチド部分を有する保護されていない合成peptide−チオエステルの化学選択的な反応である。反応条件の変化なしで、この中間体は、ライゲーション・サイトで自国のペプチド結合を形成するために、自然発生的な、急速な分子内反応を受ける(Baggiolini Mその他(1992)FEBS会報307:97−101;Clark−ルイスIその他、J.Biol.Chem.269:16075(1994);Clark−ルイスIその他、Biochemistry、30:3128(1991);Rajarathnam Kなど、Biochemistry 33:6623−30の(1994))。
あるいは、化学ライゲーションの結果として、ペプチド部分との間に形成される結合が不自然な(非ペプチド)結合(Schnolzer、Mなど科学、256:221(1992))である所で、保護されていないペプチド部分は化学的に連結される。この技術は、完全な生物学的活性度を有する大量の比較的純粋なタンパク質と同様にタンパク質領域の類似物を総合するために用いた(非リスルMilton RCなど、Protein Chemistry IVの技法。Academic Press、New York、pp.257−267(1992))。
3. 組成物を作製する方法
組成物に導いている中間体を作るのと同様に、和議をする方法は、開示される。これらの和議(例えば合成化学法および標準分子生物学方法)をするために用いられることができる様々な方法が、ある。これらを作る方法およびその他が組成物が特に開示されることを開示したものと理解される。
プロモータ要素および核酸要素が本願明細書において開示した手術の方法の結鎖を含んでいる方法によってできる核酸分子は、開示される。核酸要素は、例えば、リガンド結合阻害剤をコード化することができる。かくして、開示する手術の方法の結鎖から成る方法によってできる核酸分子が、プロモータ要素およびIL−lra要素である。開示もする手術の方法の結鎖から成る方法によってできる核酸分子が、プロモータ要素およびIL−1R2要素である。開示もする分子が手術の方法の結鎖から成る方法によって生産した核酸が、プロモータ要素およびIL−1R1断片要素である。開示もする分子が手術の方法の結鎖から成る方法によって生産した核酸が、プロモータ要素およびIL−1断片要素である。
開示もする手術の方法の結鎖から成る方法によってできる核酸分子が、核酸が本願明細書において開示される遺伝子形質発現inhinitorをコード化するプロモータ要素および核酸要素である。一例として、開示する手術の方法で方法から成っている結鎖を私によってできる核酸分子が、プロモータ要素およびCOX−I siRNA要素である。開示もする手術の方法の結鎖から成る方法によってできる核酸分子が、プロモータ要素およびCOX−2 siRNA要素である。開示もする手術の方法の結鎖から成る方法によってできる核酸分子が、プロモータ要素およびmPGES siRNA要素である。開示もする手術の方法の結鎖から成る方法によってできる核酸分子が、プロモータ要素およびcPGES siRNA要素である。
開示された核酸のいずれかを有する細胞を変える方法によってできる細胞は、更に開示される。非天然に存在する開示された核酸のいずれかを有する細胞を変える方法によってできる細胞は、開示される。
開示された核酸のいずれかを表す方法によってできるペプチドのいずれか、開示される。開示された核酸のいずれかを表す方法によってできる非自然に生じる開示されたペプチドのいずれか、開示される。非自然に開示された核酸のいずれかを表す方法によってできる開示されたペプチドのいずれか、開示される。
本願明細書において開示される核酸分子のいずれかをもつ動物の範囲内で細胞をトランスフェクションさせる方法によってできる動物は、開示される。核酸分子のいずれかが本願明細書において開示した動物の範囲内で細胞をトランスフェクションさせる方法によってできる動物が、開示する、そこにおいて、動物は、哺乳類である。開示もする動物の範囲内で細胞をトランスフェクションさせる方法によってできる動物が、本願明細書において開示される核酸分子のいずれかである、そこにおいて、哺乳類は、マウス、ネズミ、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタまたは霊長類である。開示もする哺乳類がマウス、有ていまたは人間以外の霊長類である哺乳類である。
また、開示する、動物に合計加算の方法によってできる動物が、本願明細書において開示される細胞のいずれかである。
E. 組成物を使用する手法
1. 調査ツールとして組成物を使用する方法
開示された組成物が、調査ツールとしてさまざまな方法で用いられることができる。例えば、開示された組成物(例えば配列番号):例えば結合するインヒビターとして働くことによって、5は、IL−1およびIL−1R1の間の相互作用を研究するために用いることができる。
2. 治療的な用途
組成物を投与するための有効薬量およびスケジュールは経験的に決定されることができる、そして、この種の決定をすることは従来技術において技術の範囲内である。組成物の管理のための用量範囲は、障害の症状が影響を受ける所期の効果を生じるのに十分大きなそれらである。投与量は、逆副作用(例えば不必要な交差反応、アナフィラキシー反応、など)を引き起こすほど大きくてはならない。通常、投薬は年齢、状態、性交および患者(投与経路)の疾患の範囲によって変化するまたは、他剤が療法および缶に含まれるかどうか、当業者で測定される。投与量は、いかなる反表示の場合にはも個々の医師によって調整されることができる。1または数日間、投薬は、変化することができて、毎日一つ以上の服用政権において管理されることができる。ガイダンスは、製薬製品の所与の種類のための適切な投薬のための文献で見つかることができる。
処理、抑制または防止炎症のための開示された構成(例えば開示された構造物)の管理の後に、治療的な構造物の有効性は、よく熟練した実務家に知られているさまざまな方法で評価されることができる。例えば、当業者は、構成(例えば開示された構造物)が本願明細書において開示されて炎症または抑制を処理するかまたは構成がこれらの疾患と関連した状況の開始を減らすと述べることによって主題の炎症の影響を減らす際に有効であると従来技術において理解する。さらにまた、構造物から作り出されるタンパク質または反訳記録の量は、いかなる診断法も使用して分析されることができる。例えば、それは、主題または患者からサンプル(例えば、(制限されないが)血液またはその他細胞(例えば神経細胞))の構造物から作り出されるタンパク質の存在を検出するために構造物核酸または抗体分析の存在を検出するためにPCR法分析を使用して測定されることができる。
F.実施例
以下の実施例は、当業者に完全な開示および本願明細書において請求される化合物、組成物、小節果、装置および/または方法が行われて、評価される方法の説明を提供するために出されて、単に典型的なことを目的として、開示を制限することを目的としない。効果は数(例えば総計、温度、その他)に関して精度を確実にするために実行された、しかし、いくらかのエラーおよび偏差は占められなければならない。特に明記しない限り、パーツは重量部である、温度は0Cにおいてあるかまたは外界温度である、そして、圧力は大気のもので、又はその近くで、ある。
1. 実施例1−誘導性のインターロイキン−1β導入遺伝子の構造−IL−1βXAT
ヒトIL−1β相補DNAは、以下の通りにPCR法(PCR)によって、ヒトU937細胞(ATCC、Manassas VA)からクローンをつくられた:完全メッセンジャーRNAは、製造業者の指示につきTRIzolR試薬(インビトロゲン、Carlsbad CA)を使用して抽出された。PCR下塗りは、成熟した、分泌されたIL−1βタンパク質に対応する相補DNAの部分の増幅のために設計された。ヒトIL−1受容体アンタゴニスト遺伝子(ILl−RA)のペプチド分泌シグナル(一本鎖)は、TLIβ転写解読枠(ORF)に上流で、適当な区画化および移植遺伝子のIL−1βペプチドの分泌を確実にするために、上のPCRプライマに組み込まれた。このPCRを合成された一本鎖−ILlβ融合構造物は、製造業者の指示につきTOPO 2.1ベクター(インビトロゲン)に、直接クローンをつくられた。その後、細胞自主的なおよび不必要なβ−ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子(lacZ)はIL−βORFに対する挿入されたダウンストリームであった。そして、ウシ成長ホルモン・ポリA尾部(ピコアンペア)シーケンスが続いた:ssIL−lβ−IRES−lacZ双シストロン性遺伝子(図1)。第2のORF(lacZ)の翻訳は、内部リボソーム入力順(IRES)によって促進性である。実験の初期の間、双シストロン性ssIL−lβ−IRES−lacZ導入遺伝子の表示はサイトメガロウィルス・プロモータ(CMV)によって偏在してドライブされた。そして、それの転写はloxPの側面に位置された(floxedされた)転写性終了カセットSTOPfl/fl.によって禁止された。転写性活性化および導入遺伝子表現は、loxPに誘導されたDNA組換によってオンにされることができるバクテリオファージPl Creレコンビナーゼ(Cre/loxPシステム)によって仲介する。
a)Creによって媒介される誘導性の導入遺伝子の活性化
TLIβXAτの機能は、2つの異なる実験的な戦略によって生体外で試験された。第一に、Creレコンビナーゼによる調節は、生体外でNIH 3T3マウス繊維芽細胞(ATCC)において評価された。遺伝子は野生型cre遺伝子によって一過性に共同表された(発現ベクターpRc/CMV−CreWTに、クローンをつくった;インビトロゲン)LIPOFECTAMINEを使用している一時的なトランスフェクションの後に、製造業者につき2000の試薬(インビトロゲン)は、指示である。予想されるにつれて、loxP目指してなられるCreレコンビナーゼの一時的発現および「floxedされた」転写性終了シグナル
Figure 2009501128
の切除は最終的に遺伝子活性化に導く。コントロールの条件は、jL_1βXAτw−to足指eXpressjonベクターpRc/CMV−(いかなる遺伝子も欠く)(単純なNTH 3T3細胞と同様に)の同時トランスフェクションを含んだ。TLIβ表現はリバーストランスクリプターゼPCR(RT−PCR)によってメッセンジャーRNAレベルと評価された、そして、lacZ表現はX−gal組織化学によって評価された。手短に言えば、IL−1β反訳記録は、単純なNIH 3T3細胞において検出されなかった;対照的に、TLIβと7+Cre同時トランスフェクションがssIL−1βおよびlacZ遺伝子形質発現(図2)の誘導において結果になった。加えて、IL−1βXAT機能は、誘導性のCreレコンビナーゼ細胞系において評価された。そして、本願明細書において293HGLVP/CrePr(最近Cre/loxP技術を利用している切除されたで活性遺伝子の規則をテストするために開発されて、U.S.特許出願番号第10/978927号に記載されている安定細胞系)が、参照によって組み込まれる)。この細胞系は、転写性双対の下にCreレコンビナーゼを配置することによる誘導性の、loxPに誘導されたDNA組換系と翻訳後制御(Kyrkanidesなど、2003、(本願明細書において参照によって組み込まれる))とを具備している。手短に言えば、システムは、2つの構成要素から成る:(1)キメラの転写性アクティベータGLVPおよびCrePr融合タンパク(2)(細菌Creレコンビナーゼおよび変異するプロゲステロンレセプタhPR891遺伝子から成る)カスタムメイドのGAL45/TATA最小のプロモータによってドライブされて。変異するhPR891レセプタは、合成プロゲステロン化合物ミフェプリストーン(RU486)に、非常に影響される。hPR891に対するRU486の締め具は結果としてGLVPの活性化およびCrePrの次の合成になる。そして、それの活動は翻訳後レベルの回されたonbyRU486でもある。JL−IβXAΥトランスフェクション後の293HGLVP/CrePr細胞のRU486管理は、結果としてDNA切除された遺伝子組換えおよびヒトIL−1βおよび細菌β−ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子(lacZ)の次の発現になった。実験の概要のための図3を言及する。
b)IL−1βXAT活性化は、生物学上強力なIL−1βサイトカインを生じる
生物学上作動中のTl−βサイトカインを合成して、分泌するネズミの細胞の能力は、以下の通りに生体外で試験された。図2に記載されているそれと類似の実験において、ネズミのNIH 3T3繊維芽細胞は、EL−1βXAT遺伝子によってトランスフェクションした。付随して、Creレコンビナーゼはこれらの細胞(pRc/CMV−CreWTベクターの同時トランスフェクション)において一過性に表された、そして、条件付きの上澄の媒体は72時間に集められた。ヒトIL−1βの存在は、ELISAによって確認された。馴化培地はそれから単純なネズミの繊維芽細胞に配置された、そして、誘導性のシクロオキシゲナーゼCOX−2のレベルは以前記載されているプロトコルを使用している全niRNA抽出物の定量的RT−PCRによるサイトカイン効力の基準として評価された[Moore、AH、などNeuroimmunology Journal。148(l−2):32−40, 2004]。制御実験条件は、IL−1βτ遺伝子(単純な細胞と同様に)に加えてpRc/CMV−バックボーン・ベクター(cre遺伝子を欠く)によって共同トランスフェクションする細胞に由来する馴化培地を含んだ。手短に言えば、Cre活性IL−1β5CAX細胞から集められる均し培地で処理されるネズミの繊維芽細胞は、pRc/CMV−既治療または単純な細胞に由来するメディアにさらされる細胞と比較して、結果として重要なCOX−2誘導になった。実験の概要のための図4を参照。
c)IL−1βは、下流の炎症関連の遺伝子を誘導する
IL−1βは多分化能炎症誘発性サイトカインである。そして、それの表示は急速にアップレギュレートされた以下の外傷および/または炎症である。さらに、あり余る程の炎症関連の遺伝子はIL−1βによって次々に誘導される。そして、炎症反応の増悪に導く。IL−1βは下流の炎症性の遺伝子を調整する。そして、コラゲナーゼA(MMP−2)およびB(MMP−9)と同様にシクロオキシゲナーゼ(COX−2)および細胞間の粘着力molecule−1(ICAM−1)(単核細胞化学誘引物質protein−1(MCP−I))の誘導性のイソ型を含む。ICAM−lおよびMCP−Iは損傷(すなわち好中球および単核細胞、それぞれ)の部位の循環免疫細胞の補充と関連した分子であるが、MMP−2およびMMP−9は関節炎および損傷の間の組織滅失と関連したコラゲナーゼである。主要なネズミ血管内皮細胞は、転写性レベル(メッセンジャーRNA)で酵素活性レベル(ザイモグラフィ)と同様にICAM−I、MCP−I、MMP−2およびMMP−9の調節上のIL−1βの効果を調査する代表的な齧歯目のモデルとして使用された。図5は、時間とともにこれらの遺伝子の調節を要約する。IL−1βはCOX−2、MCP−I、ICAM−Iおよび誘導性のコラゲナーゼB(MMP−9)の統合をアップレギュレートした。構成型コラゲナーゼB(MMP−2)のメッセンジャーRNAレベルはJL−Iβによって変えられなかった、しかし、面白いことに、おそらく他のMMPから翻訳後活性化のため、MMP−2酵素活性も時間とともに増加した。
d) COLL1A1プロモータは、細胞を生じているコラーゲンiに、不β表現をドライブする
ジョイントのIL−1βの長期にわたる表示は、関節炎患者に示して、それと類似の関節症の開発に導くことができる。これはマウスのEL−1βの時間的に、そして、空間的に制御された表示を使用して示されることができる。そして、それはプロコラーゲン1遺伝子のAl連鎖の3.6Kbのプロモータによって軟骨細胞、骨細胞および繊維芽細胞にターゲッティングIL−1βXAT導入遺伝子表現によって達成されることができる。このプロモータは、骨および軟骨の遺伝子形質発現を目標とすることを示して、CMVプロモータ(図1)の代わりに、IL−lβXAT遺伝子においてクローンをつくられた:(COLLIAI−ILI1S1)COLL1A1=>
Figure 2009501128
ssILlβ−IRES−lacZ。
コラーゲン1プロモータはFΙV(Cre)が主に関節嚢の中で表面的に位置する細胞を汚染するという予測に基づいて選択された。そして、半月、軟骨およびおそらく骨(Kyrkanidesなど、2004)を含んだ。COLL2は、他の適切なプロモータである。この導入遺伝子は、pRc/CMV−CreWT発現ベクターの一時的なトランスフェクションによるCreレコンビナーゼの表示の後に、または、レンチウイルス・ベクターFΙV(Cre)による感染の後、建設されて、ネズミのMH 3T3厩舎細胞系においてテストされた。Creレコンビナーゼの表示は、導入遺伝子活性化およびIL−1β表現に導いた。実験の概要のための図6を言及する。
e) Coll−病気/J7マウスのジョイントの導入遺伝子活性化
CoIl−BL1βXATマウス(2セットのCollアール−JLβ)のジョイントの導入遺伝子活性化の効果を評価するために1マウスは、左右の膝(左右の顎関節(TMJ)と同様に)の関節腔内のFΙV(Cre)注入(合計106の伝染性の粒子)を受信した。マウスは、身繕い挙動および移動における変更のための8週の期間にわたってモニタされた。マウスはその後殺された、そして、それらの膝およびTMΒは組織学的に分析された。
行動の変化は、前述したように評価された(Dubuisson、D.およびDennis(S.Pain 1977);4:161−74;Abbott FV、などEur J Pharmacol 1986;126:126−41)本願明細書においてどのアールが、これらの方法に関連した教示のための参照によって加入させた。手短に言えば、一群のCoIL−1Ll/7トランスジェニックマウス(N=3)は、生後2ヵ月で左右の膝のFΙV(Cre)の106の伝染性の粒子の単一の関節内投与を受信した。加えて、マウス(N=3)の第二群は、塩分のある注入を受信して、規制として役立った。セッションの間に、各マウスは、1時間ビデオテープに録画された。テープは、それからデジタル的にコンピュータへ移されて、それぞれ3分の20の期間において分析された。各マウスを示している身繕いおよび一なめの継続は、動物のグループ譲渡に盲目だった調査者による秒として記録されて、合計された。Coll−IL1βXATトランスジェニックマウスの膝へのFΙV(Cre)の注入は、食塩水を注入された規制(図9、P<0.05)と比較して、結果として身繕いの継続の4倍の増加になった。
回転シリンダ(20回転数/分)を離れたマウス伐採量が記録されるまで、マウス(N=3)の4つのグループはrotorod機器(Columbus計測器、Columbus OH)および経過時間によって機関車挙動に関して評価された。マウスは、関節内投与(8週 − 16週の年齢)の後に、8週の期間にわたって評価された。図10に示すように、FIV(Cre)−注入されたColl−ILlj3XΛTトランスジェニックマウスが制御FΙV(gfp)ベクター(TG+gfp)(他の対照動物グループ(WT−Cre及びWT−食塩水)と同様に)を注射されるトランスジェニックマウスと比較して重要な機関車悪化(Tg+Cre)を開発することが証明された。
レポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼの免疫細胞化学的検出は、β−ガラクトシダーゼおよびCreレコンビナーゼに対して上がるこのマウスモデルを使用している抗体のFΙV(Cre)によってColl−病気/S1導入遺伝子の活性化を確認するために使用された。β−ガラクトシダーゼ(図11A)Creレコンビナーゼ(図11B)のテキサス州Red抱合型免疫検出、同じ顕微鏡視野(図11C)のB/Wイメージ、パネルA+B方式(図11D)の重なりおよびパネルA+B+C(11E図)の重なりのFITC複合免疫検出が、図11において示す。β−ガラクトシダーゼおよびCreレコンビナーゼの共発現は、生体内で(図11、中実の矢)示される。すべての感染細胞が同じ容量の導入遺伝子CoIlAl→ILlβ−IRES−lacZを表すというわけではないことを示している緑色細胞(図11、開いた矢)より多くの赤血球があることに注意されたい。
4ヵ月のCollから集められる膝部のH&E染色−FΙV(Cre)によって注入されるIL 1β51遺伝子導入マウスは、繊維性攣縮(図12 A、中実の矢)の、そして、関節唇(Fig.l2B、開いた矢)の形成を明らかにした。対照的に、制御ベクターFlV(GFP)を受信した遺伝子導入マウスは、この種の解剖学精神錯乱(図12B)を呈しなかった。アルシアンブルー/オレンジ半定量的評価は、軟骨(図12C、より少ない青変病)の減少およびCollの骨(図12D、より少ないレッドステイン)密度を示した−規制(12E図)と比較したELlβXAT+FIV(Cre)膝。さらに、関節の表面の肥厚と一緒の増加したクローン化は、実験動物(Fig.l2C(小さい矢によって示される))において観察された。これらの観察は、Creレコンビナーゼによって導入遺伝子誘導の後に膝の関節炎の存在を示す。
膝のFΙV(Cre)注入およびColMLlβXATマウスのTMJの8週後に、脳は、免疫細胞化学によって小こう細胞および星状細胞の活性化のために評価された。MHC−クラスII抗原に対して上がる単クローン抗体を使用して、活性小こう細胞の存在は、脳(図13 A、C)において検出された。対照的に、対照動物は、いかなるMHC−II陽性細胞も示さなかった。面白いことに、グリア原線維酸性タンパク質(GFAP)(図13B,D)によって評価されるにつれて、これらの動物の脳の星状細胞活性化の欠如があった。一般に、対照動物(不活発なトランスジェニックマウス)は、MHC−IIまたはGFAP免疫細胞化学によって脳炎の徴候を示さなかった。
CollのTMJのFΙV(Cre)注入の数週間後に8−ジョイントの解剖学異常がそうであった悪いβ57マウスは、半定量的アルシアンブルー − オレンジG組織化学 − によって評価した。半月と同様に顆状ヘッドを表している非アクティブのColl−IL1XATマウスからのTMJ部が、図14AおよびCで示す。比較として、図14BおよびCは、Collから集められるTMJ部を表す−TMJのFΙV(Cre)を注射されるILβXATマウス。TMJ細胞層の見かけの再編成はFΙV(Cre)注入に続いているのを認められた。それによって、最も表面的な細胞層の損失は軟骨細胞(図14、開いた矢)の増殖の層の分裂を伴って強調された。加えて、アルシアンブルー−オレンジG組織化学(図14)−によって半定量的に評価されるにつれて、軟骨容量の減少はFIV(Cre)−既治療Coll−JJL1XATマウスの顆状上部において観察された。
2. 実施例2−成熟したマウスの関節炎の発現:IL−1β身体のモザイクモデル
a) 不1B身体のモザイク・マウスの開発
成熟したマウスのJX−1βの長期にわたる、低レベルの関節腔内の表示は、結果として関節炎の発現になることができる。感染細胞の遺伝子の構成の永続的な変化により、特定の場所で、そして、特定の発育時期の間、これは、IL−1βの長期の表示の誘導のための身体のモザイク分析法を使用して示されることができる。身体のモザイク分析モデルは従来のトランスジェニックマウスと比較して重要な効果を提供する。−その理由は、次のことにある。それは現像の間、トランスジェニックマウスにおいてしばしば遭遇される代償の改作を回避して、遺伝子(Brooksなど、1997、1999)の局所の活性化を許容する。コラーゲンI、プロモータは、FFV(Cre)が主に、半月、軟骨およびおそらく海綿状の骨細胞を含む、関節嚢の中で表面的に位置する細胞を汚染するという予測に基づいて導入遺伝子表現をドライブするために基礎を形成されて選択された。COLL2は、適切なプロモータの他の選択である。
COLLI−IL1βXATは、施肥されたC57BL/6卵母細胞において微量注入されて、その後偽妊娠母に植設された。マイクロインジェクションのワンセットは8匹の子犬を非常に与えられてすでに実行された。それについて、3はELlβXAT導入遺伝子に対して特に設計されるプライマを使用している尾部格安品から抽出されるゲノムDNAのPCRによる陽創設者と確認された。3人の創設者は、機能的な導入遺伝子の生殖系列伝送の分析のためのC57B1/6野生型在庫マウスで育てられた(Ngoなど、2002;Pinkert 2003)。事実、少なくとも2人の創設者は研究費提出時に移植遺伝子の子犬をうまく与えた。そして、それは更なる繁殖のための満期まで上がっていた。
b) 生体内でCOLLl−病気/の活性化を特徴づける
COLLI−IL1βXAT機能は、3ヵ月のマウスの膝関節カプセル(50μl体積のほぼ107の伝染性の粒子)へのFΙV(Cre)注入の後の移植遺伝子の境界および休止中のCOLLI−悪いβXATの活性化において評価されることができる。休止中のCOLLIを起動させるFΙV(Cre)の能力−本願明細書においてこの教示のための参照によって組み込まれて、ILlβXAT遺伝子は、U.S.特許出願No 60/627,604において先に述べていた。COLLl−ILl/1活性化は、以下の通りに評価されることができる。第一に、lacZ表現は、前述したように(Kyrkanidesなど、2001、2004)X−gal組織化学および免疫細胞化学によって脱石灰された組織学部において直ちに評価されることができる。ssIL−1βおよびlacZ反訳記録レベルは、実験的なFΙV(Cre)関節内注入および制御FΙV(lacZ)関節内投与マウスから全メッセンジャーRNA膝抽出物の半定量的RT−PCRによって評価されることができる。ssIL−1βおよびβ−ガラクトシダーゼの局在は、細菌β−ガラクトシダーゼおよびヒトIL−1βに対して特に上がる免疫細胞化学を使用している抗体によって、組織学部に達成されることができる;変換された細胞のアイデンティティは、以下のテストに対して上がる倍の免疫蛍光法を使用している抗体によって確認されることができる。骨細胞/骨送風は、表現アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、タイプIコラーゲンによって確認されることができる。軟骨細胞は、コラーゲンII(Scott−一般経費など、2002)の検出によって確認されることができる。組織学的に、ssIL−1βメッセンジャーRNA局在は、in situハイブリッド形成(ISH)によって実行されることができる;変換された細胞のアイデンティティは免疫細胞化学(ICC)を有する結合ISHによって確認されることができる。そして、上述した抗体を使用する。共同の滑液の分泌されたヒトIL−lβのレベルは実施例1にて説明したように、ELISAによって分析されることができる(#DLB50のカタログ化する;研究開発Systems Inc(Minneapolis MN))。3−5のマウス線は、遺伝子活性化の後にメッセンジャーRNA、タンパク質および組織学レベルで導入遺伝子機能のために分析されることができる。この目的のために、トランスジェニックマウスは、生後2ヵ月で関節内にFΙV(Cre)FIV(lacZ)または食塩水を注射されることができて、4週後に、その後分析されることができる。2本のマウス線は結果としてなる。そして、1が更に分析されることができるIL−1βの「適度な」レベルを有する「高さ」およびもう一方を表す。
c) 膝の不1B表現の長期間作用を調査する
膝のIL−1β表現の効果は、FΙV(Cre)FΙV(lacZ)または食塩水の関節内投与の後、時間とともに(4−8−12−16週)若年成人(3ヵ月)COLLl−ELβXATトランスジェニックマウスにおいて研究されることができる。COLLIの膝に対するCreレコンビナーゼの関節腔内の転送−ILlβXATトランスジェニックマウスは、感染細胞によって結果としてヒトIL−1βの継続された表示になることができる。対照的に、FIV(lacZ)−注入されたマウスは、検出可能な人間のILlβ表現が欠如している。食塩既治療マウスは、規制として役立つこともできる。関節内投与の後、動物は、それらのケージに戻されることができる。その後、FΙV(Cre)FΙV(lacZ)および食塩関節内投与の効果は、2つのCOLLIにおいて分析されることができる−上で確認されるIL1βτ遺伝子導入マウス線:マウスの中のIL−1βの最も高い表示によって特徴づけられる1つは、IL−1β(「適度な」)の正中の表示を、分析(膝ホモジェネートのELIZAによって定まる)以下のFΙV(Cre)intra−骨関節注入(「高い」)および第2のマウス線に沿って並べる。IL−1β式の効果は、時間とともに評価されることができる(4−8−12−16週)。
d) 分析的な−行動の評価
関節痛および共同の機能不全(膝の痛み)は(1)機関車性能で測定されることができる回転シリンダ(rotorod機器、Columbus計測器、Columbus OH)および(2)筋力に評価されるにつれて、逆にされたメッシュ法によって評価されるにつれて。手短に言えば、この方法は、握力を評価することによって、神経筋の状態を評価する。ワイヤラスによって一端にカバーされた透明プラスチック・シリンダ(20cmのx 20cm×30cm)は、造られた。メッシュワイヤ棒は、離れて直径1mmおよび1cmであった。動物がメッシュの中央に閉じこもるように、スクリーンの矩形領域はテープを巻かれた。マウスがスクリーンに配置されたあと、シリンダは上に向かい横に寝具を通じて下にされた:メッシュからのそれらの落下までの経過時間は、数秒で記録された。マウスが第1のトライの10sより少なく落ちる場合、この動物は第2のチャンスを与えられた。これらの方法は、臨床経験から採用されて、関節痛をもつヒト患者に示す行動のおよび身体のイベントを繰り返すことをねらう。メッシュを離れたマウス落下までの完全経過時間は、このように記録されることができる。
e) 周縁評価
不βが多くのinflammation−関連の遺伝子を誘導することは公知の多分化能サイトカインであるので、サイトカイン(TNFα、TL−6、ネズミのIL−1β)接着分子(ICAM−I5 VCAM−I)ケモカイン(MCP−I)およびコラゲナーゼ(MMP−3、MMP−9)の表示はメッセンジャーRNAおよびタンパク質レベルで評価されることができる。加えて、プロスタグランジンPGE2の生産と同様に、誘導性のCOX−2、COX−1、mPGESおよびcPGESのレベルは、前述したように(REF)メッセンジャーRNAおよびタンパク質レベルで測定されることができる。さらに、共同の形態学は、以下の通りにH&Eで染色した組織学部において評価されることができる。関節軟骨の変形性変化は、評価されることができて、光学顕微鏡の下で検討される矢状切片において等級分けされることができて、5つのカテゴリにスコアされることができた:等級0、見かけの変化でない;等級1、関節軟骨の表面的な繊維性攣縮;等級2、非石灰化された軟骨に限られている欠陥;等級3、石灰化軟骨に達している欠陥;そして、等級4、関節の表面の軟骨下骨層の露顕。各ジョイントは、連続切片の中で観察される最高スコアに従って等級分けされることができる。ジョイントの好中球、単核細胞/マクロファージおよびリンパ球を含む炎症細胞の存在は免疫細胞化学によって組織学レベルで調査されることができる、そして、実験的なおよび制御マウスの二重免疫蛍光法は4−8−12−16週後療法を犠牲にした。手短に言えば、好中球は、ネズミ反マウス好中球抗体によって検出されることができる(MCA771GA;血清科学技術、Raleigh、NC);単核細胞及びマクロファージは、ネズミ反マウスCD11b抗体で着色されることができる(MC A74;血清科学技術のInc);活性細胞は、ネズミ反主組織適合性複合系クラスII抗体によって免疫局在性でありえる(MHC−II;Bachem、Torrance、CA;クローンER−TR3)。リンパ球は、CD3に対して上がる単クローン抗体によって検出されることができる(MCA 1477;血清科学技術)そして、細胞の数のCD4(血清科学技術)定量化は、分野(汚染性プロフィールと同様に)につき、陽性細胞の数に関して、両方とも記載されていることができる。血管内皮細胞は、PECAM−I(CD31)(Kyrkanidesなど2003)に対して上がる抗体によって検出されることができる。
FIVタンパク質の導入がFIVベクターを有するマウス既治療の免疫性反応を誘発することができるので、ホストの免疫性反応はFIV関節内投与の後に特徴づけられることができる。ウィルスおよび移植遺伝子のタンパク質に対する抗体の存在(タイター)は、異なる実験的な時点で血清において量的に評価されることができる。この目的で、ヒトIL−1βと同様にFIV p24テストのための免疫グロブリンGおよび免疫グロブリンMタイターは、カスタマイズされたELISA方法によって評価されることができる。手短に言えば、ELISAプレートは、ヒトIL−1βの5つのμgでおおわれていることができる(シグマ体;St. Louis MO)またはp24組換え型タンパク質(IDEXX Laboratory社;Westbrook ME)。試験血清を有する培養の後、プレートは、アルカリ性phosphatase−複合ヤギ抗マウス免疫グロブリンGおよび免疫グロブリンMによって暖められることができる(South Biotechnology Associates、Inc;Birmingham AL)。Anxibodyタイターは、線形外挿(Kangなど、2002)を仮定している塩分のある注射されたマウスの吸光度レベル(405ナノメートルで)に達した血清希釈剤として確立されることができる。
f) 中枢神経系評価
多くの小さい神経ペプチド(例えばP物質(SP)およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP))は、末梢から中枢神経系(CN)まで痛みの伝送に関係した。マウス膝のDL−1βの継続された表示は、周辺炎症反応に加えて、CNSの神経伝達物質の表示の変化を誘発することができる。従って、SPおよびCGPvPの表示は、以前記載されている(Kyrkanidesなど2002a、2002b)方法を適応させている実験的なおよび制御マウスの脊髄において評価されることができる。特定の強調は、膝からの侵害受容の求心性神経が脊髄の背角でシナプスを形成する脊髄の領域に与えられることができる。
g) 結果および変形例
FΙV(Cre)の関節内投与は、結果としてIL−1βの表示になることができる:ジョイントのFIV−によって媒介されるCreレコンビナーゼ表現は、永久に膝の感染細胞の遺伝子の構成を変えることができて、結果としてIL−1βの関節腔内の表示になることができる。FIVを有する以前の仕事は、関節内投与の後にウイルスによって柔らかいおよび硬い関節の薄紙の成功した感染症を示した(Kyrkanides S.などDental Research Journal.83(l):本願明細書においてこの教示のための参照によって組み込まれる65−70(2004))。FΙV(Cre)注入はCOLLl−ILlβXATトランスジェニックマウスに繰り返されることもできる。そして、動物が26週間生存することができる。その時には、それらは犠牲にされることができて、前述したように分析されることができる。COLLI−ILlβ遺伝子は、FrV(COLLl−IL1β)(COLL1A1駆動ssIL−1Ll|8を有する細胞を変換することができるウイルス)を開発するために確立した分子生物学方法を使用しているFIVバックボーン・ベクターにクローンをつくられることもできる。さらに、より強いプロモータは、チキンβ−アクチン/CMV融合プロモータ(Dalyなど、1999)のような、新規なFIV(COLLl−ILIiS)ベクターの関節内投与の後にssIL−1βを膝に吹きつけるために使用されることができる。これは、身体のモザイクモデルに対する現実的代案である。この目的で、レポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼの表示は、膝(Kyrkanidesなど、2004)の最高5週および生体内肝臓および脳の最高3ヵ月間観察された。身体のモザイクモデルの効果は、FΙV(Cre)注入が結果として細胞ゲノムの永続的な変更になって、ヒト患者のその守る(遵守する)と類似の慢性低レベルの炎症に導くということである。
3. 実施例3−関節炎の管理のための小さい抑制のsiRNAベースの処理
IL−1βは、シクロオキシゲナーゼ−2(コックス−2)(炎症の間のプロスタノイドの生産の鍵となる律速酵素)のインデューサである。それが関節痛の場合しばしば利用される市販の店頭および処方薬の標的であった時から、COX−2は特定の治療的な関心の中である。cyclooxygenase−プロスタグランジン経路のCOX−2、同じく他の部材を減らすことができる小さい抑制のリボゾームリボ核酸(siRNA)構造物は開発された。そして、mPGESおよびcPGESを含んだ。これらのsiRNA構造物が、ネコのような免疫不全ウィルス・プラットフォーム(例えばFIV(siRNA))から表されることができて、関節炎治療のための遺伝子治療のために使われることができる。従って、FIV(siRNA)導入ベクターは、COX−2、構成型イソ型COX−I、同じくcPGESおよびmPGESのために発生することができる。この目的で、共同の病理学および挙動は、関節炎の誘導の後のさまざまな時点で、そして、COX−2およびCOX−I(混合インヒビター(すなわちイブプロフェン)と同様に)のための薬理学的選択的阻害剤で治療されるマウスと比較してFIV(siRNA)を有するIL−1βXATマウス既治療において調査されることができる。
a) トランスジェニックマウスの抗炎症の療法
不Iβがコックス−2の表示をプロスタグランジンE2(PGE2)(ジョイントを含む多くの組織の炎症の主要な規定能)を形成するようにすると確認された。COX−2(構成的に表されたCOX−Iと同様に)時間的に(時間経過)空間的に分子レベルで特徴づけられて、そして、(表現のサイト)そして、関節炎(IL−1βトランスジェニックマウスの神経伝達物質表現および行動の計測と同様に)に関連したPGE2レベルおよび他の炎症伝達物質によって関連させることができる。実施例2において確認される創設者線のトランスジェニックマウスは、COX−I、COX−2、mPGESおよびcPGESのためのFIV(siRNA)を有する既治療でありえる。加えて、マウスの他のグループは、COX−2(NS−398)に対して、食事のNSAIDイブプロフェンと同様にpharamocologicなインヒビターを与えられることができる。手短に言えば、膝炎症は、FΙV(Cre)の関節内投与によって、8週間目のC0LLl−ILlj3XATトランスジェニックマウスにおいて誘発されることができる。抗炎症の制度の臨床用途に合わせて、FIV(Cre)−mjectedマウスが膝関節病理学および機能不全(実施例2に由来するデータに基づく)を示し始めるときに、抗炎症の処理は始められることができる。あるいは、抗炎症性処理は、FΙV(Cre)注入の前か後に、硬化時間から始まることができる。マウスは、抗炎症の処理(4−8−12−16週)の開始の後に、さまざまな時点で殺されることができる。従って、中枢神経系変化にと同程度よく、治療の効果は、膝関節炎(解剖学、組織学的の、分子変化)および機能不全(行動の変化)に特徴づけられることができる。
b) FIV(siRNA)開発および管理
偽入力されたレンチウイルスは、インターロイキン1駆動炎症が始められた小さい抑制のリボゾームリボ核酸(siRNA)種マウス接点の表示をドライブするために用いることができる。19−21の塩基対のサイズを有するこれらの短い二重鎖RNAは、生体外で、そして、生体内で(Hannon、2002)目標メッセンジャーRNAシーケンスのガイディング配列特異的低下によって、哺乳動物細胞の遺伝子サイレンシングを能率的に伝達することができる。FIVはRNAポリメラーゼElプロモータを含むベクターの基礎を形成した。そして、一本鎖RNAのドライブ表示はそれにおいて活発に抑制のリボゾームリボ核酸種を届けるために用いることができる。これらのリボゾームリボ核酸種は、短いヘアピン・リボゾームリボ核酸(shRNA)を細胞内の処理から形成する茎−ループ構造を含む(システムBiosciences;Paddisonなど(2004))。これらのような方法が、多種多様な生体内でのシステムで用いられた(Tiscorniaなど、2003;Rubinsonなど、2003)含むことは、脳(Hommelなど、2003)の特定の遺伝子形質発現の中でsiliencingすることを局所化した。効果的に脂質仲介のProstaglandin E2の生産に関係する多くのキー分子の遺伝子サイレンシングを伝達するsiRNAsは、本願明細書において開示される。これは、例えば、COX−Iおよび−2を含む、そして、細胞内可溶質およびタイプ−1膜はプロスタグランジンE2シンターゼ(PGES)を結びつけた。shRNAのもののためのシーケンス符号化は、緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター遺伝子を含んでいるFIVクローニングベクタに、下位クローンをつくられることができる。培養組織の細胞のトランスフェクションのsiRNA活性の成功したテストの後、VSV−G偽入力されたウィルス粒子は、レンチウイルス表現/クローニングベクタの同時発現によってパックされることができて、ベクターを293Tの細胞で包んでいることができる。これらのウィルス粒子は、複製不適格者以外の感染症コンピテントでありえて、テストされることができて、炎症を起こしたジョイントに噴射される前に、生体外でタイターした。
c) 薬理学的抗炎症の療法
コックス−2選択的阻害剤(NS−398;Kyrkanidesなど、2002)COX−IインヒビターSC−560(食事の64ppm)または混合インヒビター(食事の375ppmのイブプロフェン)は、食事を介してマウスに与えられることができる。この投与経路は長期間治療(週−月)を単純化する、そして、生体内に特にこれらの酵素を阻害するために必要な経口投与量は前もって決定されていた(Jantzenなど、2002;ミュラー−Deckerなど、2002)。
d) 結果及び変形例
抗炎症の治療は、侵害知覚を減らすことができる。しかしながら、NSAIDは、COXから独立した機構によって炎症に影響することができる。例えば、若干のNSAIDは、ペルオキシゾーム増殖因子活性レセプタPPAR−γのためのリガンドであって、この機構(hi追加)によるいくつかのNSAIDSがIKBキナーゼを阻害することによって炎症誘発性NF−/cB活性の刺激に対する反応を抑制することを示したという抗炎症の趣旨を行うことができる。他のポイントの潜在的重要性は、COXイソ型を目標としている薬が平行した5−リポキシゲナーゼ経路の付随するアップレギュレーションに導くことができるということである。シクロオキシゲナーゼおよび5−リポキシゲナーゼ(ML3000)の二重インヒビターの効果の最近の研究は、同時抑制が消炎作用の十分なレベルを得ることを必要とすることができることを示唆する。事実、この種の大型そりは、現在Europeの位相HI臨床試験においてある。この種の通りが、本願明細書において使われることもできる。
面白いことに、COX−Iおよびコックス−2は、末梢性炎症でのそれらの役割に加えて、両方とも中枢神経系のレベルで痛みの中心処理の数度に関係されるように見える。全体の、行動のおよび、病理学的利点は、予想されるfroniNS−398管理およびCOX−2ノックアウト・マウスである。若干のモデル系において、COX−Iが、炎症および痛みに影響するとわかった。このように、COX−I選択的阻害剤およびCOX−Iノックアウト・マウスを有する結果は、利点を示すこともできる。最近、COX−IおよびCOX−2に加えて、少なくとも2つの新規なPGE2シンターゼ・イソ型は、結果としてプロスタグランジンの生産になる酵素の一系統に加えられた:膜関連のmPGES(COX−2に機能的に連結する)およびCOX−Iに依存するPGE2生産との関連があるように見える細胞内可溶質cPGES。細胞局在が若干の役割を演ずることができるにもかかわらず、機能的な継手は主に発現パターンの要因である:COX−2と同様に、mPGESは炎症誘発性刺激によって劇的にアップレギュレートされるが、cPGESは現在まで検討される細胞システムにおいて構成的に表される。加えて、COX−2およびmPGESは、アジュバント関節炎のネズミ・モデルにおいて、同等にアップレギュレートされる。従って、mPGESは、JIL−1βによって誘発された関節炎で役割を果たすことができる。このように、mPGESの調節も、本願明細書において考慮される。これは、確立したおよび日常的に使用される方法を使用することによって、直ちに達成されることができる。事実、少なくともIL−1β誘導された脳炎モデル(Mooreなど2004)で、最近のデータは、COX−2が転写性レベルでmPGESを調整することを示唆する。
選択される線量が以前、重大な毒性の証拠のない長期のマウス実験のコックス活動を害することを示したことは、指摘にとって重要である。しかしながら、NSAID食事(そして、規制)を入れられる動物は、ドラッグ処理の可能な毒作用を評価するために、毎週量られることができる。
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添付の図面(中に組み込まれて、この仕様の一部を構成する)は、いくつかの実施例を例示して、説明と共に開示された組成物および方法を例示する。
図1は、IL−1βXAT−切除されて活性化された導入遺伝子−を示す。IL−1βXATは、サイトメガロウィルス・プロモータ(CMV)から成る双シストロン性遺伝子である、「floxedされた」転写性終了カセット
Figure 2009501128
が続く。ヒトIL−1 RAペプチド分泌シグナル(一本鎖)は、成熟したヒトIL−1βORF(ssIL−1β)レポーターlacZ遺伝子およびウシ成長ホルモン・ポリAメッセンジャーRNA尾部(ピコアンペア)に溶融した。内部リボゾーム進入シグナルは、第1のORFのほぼ45%で、翻訳および第2のORF(lacZ)の表示を容易にする。
図2は、誘導性のIL−βXAT導入遺伝子のCreによって媒介される活性化を示す。EL−1βXAT遺伝子は、ネズミの繊維芽細胞NIH 3T3細胞線にトランスフェクションした。発現ベクターpRc/CMV−CreWTの同時トランスフェクション後のCreレコンビナーゼの一時的発現は結果としてIL−1ΒXAT活性化になった。そして、IL−1βメッセンジャーRNAの高次はRT−PCR(X−gal組織化学(10X)によって評価されるlacZ表現と同様に)によって検出した。コントロールの条件は(a)純粋なNIH 3T3細胞(LL−1βXATおよびpRc/CMV−バックボーン・ベクター(c)によって共同トランスフェクションする(b)細胞と同様に)を含んだ。そして、それは強いCMVプロモータから最小の自然発生的なリードスルーのためおそらくIL−1βおよびlacZ表現の背景レベルを示した。 図3は、CrePrが切除されたloxPに誘導されたIL−1βを誘発することを示す遺伝子組換え、そして、遺伝子活性化。IL−1βXAT遺伝子は293HGLVP/CrePr細胞およびTL−βの表示に一過性にトランスフェクションした、そして、lacZはRU486(10−7M)管理の後に評価された。RT−PCRによって評価されるにつれて、RLJ486によるCreレコンビナーゼの(A)活性化は結果としてTL−βおよびlacZメッセンジャーRNAの増加機構になった。デモンストレーション目的のために、IL−1β標準曲線(1μg−10−5μg)は、このパネルに含まれる。(B)Concomitantly、ヒトTL−βのためのELISAによって評価されるにつれて、タンパク質がRU486−既治療細胞の上澄の媒体で見つけられた分泌されたTL−βの著しくより高いレベル。レポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼの表示は、Xgal組織化学によっても確認された(C):単純な細胞は背景染色の最小のレベルだけを提示するが、培養基のRU486の追加は結果としてX−gal陽性細胞の数の重要な増加になった。切除されたDNA組換がそうであった(D)EL−1βXATは、ゲノムDNAのPCRによって、
Figure 2009501128
の側面に位置したプライマ・セット(UP及びLP)を使用しているRU486(10−7M)を含んでいるメディアと同様に質素な成長媒体で処理される細胞からの抽出物を確認したシーケンス。質素な媒体の下の細胞のPCR増幅は、全長の産物(約3Kb)休止中のIL−1β状態の直説法、コントラスト、大きさにおいて1Kb、PCR製品を産生されるRU486−既治療細胞、DNA組換の直説法および
Figure 2009501128
カセットの切除を得た。
図4は、生物学上強力なEL−1βサイトカインの表示のTL−βXAT駆動結果を示す。導入遺伝子から派生したIL−1βサイトカインの生物学的効力は、以下の通りに生体外で評価された。マウスの繊維芽細胞は、以前上の(pRc/CMV−creWTベクターを有する同時トランスフェクション)図2にて説明したように、Creによって誘発されたIL−1βXATによってトランスフェクションした洗練されたNTH 3T3細胞から集められる馴化培地を有する既治療であった。COX−2反訳記録レベルは、的状赤血球(ネズミの繊維芽細胞)において前述したように測定されて、TL−β生物学的効力の基準として使用された。馴化培地は、的状赤血球への追加の前に、37℃で2時間の中和抗体によって暖められた。中間の収集した調子単純なNEH 3T3細胞(ELISAによって定まる含んでいる<3.9pg/mLのhIL−lβ)がそうであった(A)馴化培地は、ネズミの繊維芽細胞(次々にネズミのCOX−2メッセンジャーRNAの低次を示した)に配置した。さらに、また、IL−1βXAT+pRc/CMV−バックボーン・ベクター(含まれた<3.9pg/mLのhCL−lβ)によってトランスフェクションするNTH 3T3細胞から(B)均し培地は、ネズミのCOX−2メッセンジャーRNAの低次を示した。対照的に、IL−1βXAT+pRc/CMV−CreWTから(C)均し培地は、COX−2メッセンジャーRNAを著しく誘発されるNIH 3T3細胞(1ng/mLのKTL−Iβ)をトランスフェクションさせた的状赤血球;制御ウサギIgG抗体(5つのμg/ミリリットルIgG1アイソタイプ)を有する均し培地の(D)プレインキュベーションは、COX−2規則に最小の影響を及ぼした。しかしながら、ウサギ反hIL−1β(5つのμg/ミリリットルIgG1)抗体を有する均し培地の(E)プレインキュベーションは、COX−2誘導を減らした。(F)陽性のコントロール:ヒト組換えIL−1β(1ng/mL+5μg IgG1アイソタイプ)の相加。(G)ヒト組換えIL−1βは、5つのμg/ミリリットル中和抗体によって、前孵化した。結果は、結論においてグループA.と関連してCOX−2メッセンジャーRNAの誘導を折り畳むにつれて、この実験がEL−lβXAT遺伝子の活性化が結果として生物学上強力なIL−1βの生産およびその後誘導性のCOX−2の増加機構になることを証明したことを明らかにされる。(N=3)。*p<0.05;S.E.M。 図5は、IL−1βが炎症関連の遺伝子を誘導することを示す。IL−1βの効果は、代表的な齧歯目の細胞型として主要なネズミ内皮細胞培養を利用して、生体外で評価された。この実験では、ネズミのIL−1β(10ng/mL)は、洗練された一次細胞に与えられて、72時間のコースの上の反訳記録レベルで、その後いくつかの炎症関連の遺伝子の調節がないか調べられた。これらの分子は、コラゲナーゼ−A(B)(MMP−2)と同様に、シクロオキシゲナーゼ(COX−2)(細胞間の粘着力molecule−1(ICAM−I)および単核細胞化学誘引物質タンパク質−1(MCP−I))の誘導性のイソ型を含む(A)そして−B(MMP−9)。ザイモグラフィによって評価されるにつれて、パネル(C)はMMP−2およびMMP−9の酵素活性レベルを表す。 図6は、COLLI−ILβXAT遺伝子のCreによって媒介される活性化を示す。プロコラーゲンのAl一続きの中で3.6Kbのプロモーター、遺伝子(骨および軟骨の遺伝子形質発現を目標とすることを示した)は、pRc/CMV−CreWTベクターおよびHΙV(Cre)ウイルスへの感染を有するtrasfectionの後に、IL−1βXAT遺伝子の発現をNEH 3T3安定細胞系に吹きつけた。パネル(A)はpRc/CMV−CreWTを有するこの種の安定細胞系のトランスフェクション(+)を表す。そして、RT−PCRによって検出されるにつれて、付随してCreレコンビナーゼを有する人間のIL−1β表現の表示に導く。対照的に、未処理の細胞、()IL−1βおよびCreレコンビナーゼの欠如によって特徴づけられた。COLLIのRT−PCR以下の感染症によって評価されるにつれて、パネル(B)は類似のIL−1βおよびCre表現を表す−HΙV(Cre)ウイルスを有するIL−1βXAT細胞系。細胞のIL−1βXATの存在は、示すようにPCRによって確認された。 図7は、トランスジェニックマウスを示す。マイクロインジェクションの2つの連続は、総勢3本の候補トランスジェニックCOLL1A1−IL−1βXATマウス線を得た:#4、#11および#12。この図は、また、低次で内因性のネズミのIL−1β遺伝子を増幅するプライマーセットを使用している導入遺伝子のPCR増幅を表す。導入遺伝子伝送は、#4、11および12人の移植遺伝子の創設者の子において検討された。F2マウスは、膝関節にFΙV(cre)を両側性に注射されて、毎週機関車挙動および質量の変化をモニタされている。c=control;トランスジェニックマウスが線をひく4、11、12、13、14=;+=PCR正の制御;−=PCR下塗り制御。 図8は、プロスタグランジンE2炎症性の経路のメッセンジャーRNAの符号化遺伝子のsiRNA。siRNAノックダウンによって、メッセンジャーRNAノックダウンを示す。NEH3T3のものは、100−200nM化学的に総合されたsiRNA種を有する標準状態の下でトランスフェクションした、そして、完全リボゾームリボ核酸は、60時間後に集められた。メッセンジャーRNAノックダウンは、QRT−PCRを使用して決定された。西洋のイムノブロッティングは、cPGES、mPGES、COX−2およびCOX−Iタンパク質のsiRNAノックダウンを示すために用いた。NIH3T3細胞はcPGES、mPGES、COX−2およびCOX−Iと相補的な200nMの化学的に合成されたsiRNAによってトランスフェクションした、そして、総タンパクは60時間後に集まった。それぞれ、サンプルは、抗マウスcPGES、mPGES、COX−2およびCOX−I抗体によって探索された。 図9は、膝のFΙV(Cre)の注入の後、Coll−ILlβτマウスの行動の変化を示す。Aグループ・トランスジェニックマウス(N=3)は、生後2ヵ月で左右の膝のFΙV(Cre)の106の伝染性の粒子の単一の関節内投与を受信した。加えて、マウス(N=3)の第二群は、塩分のある注入を受信して、規制として役立った。セッションの間に、各マウスは、1時間ビデオテープに録画された。テープは、それからデジタル的にコンピュータへ移されて、それぞれ3分の20の期間において分析された。各マウスを示している身繕いおよび一なめの継続は、秒として記録されて、合計された。反応の分析は、動物のグループ譲渡に盲目だった調査者によってなされた。統計解析は、t−Testなものによって実行された。エラーは、=SEMを閉鎖する。*=P<0.05。 図10は、膝のFΙV(Cre)の注入の後、Coll−IL1βXATマウスの機関車悪化を示す。マウス(N=3)の4つのグループは回転機器(Columbus Instruments、Columbus OH)によって機関車挙動に関して評価された、そして、回転シリンダ(20回転数/分)からよいマウスまでの経過時間は記録された。マウスは、関節内投与(8週 − 16週の年齢)の後に、8週の期間にわたって評価された。 図11はCollの膝のFΙV(Cre)注入に明らかにする−悪いβ5マウスは結果として導入遺伝子誘導になった。レポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼの免疫細胞化学的検出は、Collの活性化を確認するために使用された−β−ガラクトシダーゼおよびCreレコンビナーゼに対して上がるこのマウスモデルを使用している抗体のFΙV(Cre)によるILlβXAT導入遺伝子。(A)FICT−は、β−ガラクトシダーゼの免疫検出、Creレコンビナーゼの(B)テキサス州Red抱合型免疫検出および同じ顕微鏡視野の(C)B/Wイメージを接合した。パネルA+B方式の(D)オーバーラップおよび生体内でβ−ガラクトシダーゼおよびCreレコンビナーゼの共発現を示しているパネルA+B+Cの(E)重なり(中実の矢;すべての画像は、2OXの拡大で捕えられた。”m”=meniscus;”a”=articular面;”I”=骨関節空間内。 図12は、FΙV(Cre)の注入の後に、Coll−IL1βXATマウスの膝関節の関節炎変化を示す。FΙV(Cre)によって注入される4ヵ月のColl−IL1βXAT遺伝子導入マウスから集められる膝部の(A)H&E染色は、繊維性攣縮(中実の矢)の、そして、関節唇(開いた矢)の形成を明らかにした。対照的に、制御ベクターFIV(GFP)を受信した遺伝子導入マウスは、この種の解剖学精神錯乱を呈しなかった(B)。(C)アルシアンブルー/オレンジ半定量的評価は、軟骨の減少およびCoIlの骨密度を示した。(D)規制と比較したTLlβT+FIV(Cre)膝。さらに、関節の表面の肥厚と一緒の増加したクローン化は、実験動物(小さい矢によって示される)において観察された。 図13は、Collの脳炎を示す−膝およびTMJのFIV(Cre)の注入後のIL1βXATマウス。膝のFΙV(Cre)注入およびColl−IL1βXATマウスのTMJの8週後に、脳は、免疫細胞化学によって小こう細胞および星状細胞の活性化のために評価された。単クローン抗体がMHC−クラスII抗原に対して上げた(A)Using、活性小こう細胞の存在は、脳において検出された。対照的に、対照動物は、いかなるMHC−II陽性細胞も示さなかった。(C)大グリア原線維酸性タンパク質(GFAP)によって評価されるにつれて、パネルA.(B)Thereの拡大がこれらの動物の脳の星状細胞活性化の欠如であって。パネルB.の中で(D)大拡大 図14は、CollのTMJの関節炎のような変化を示す−FΙV(Cre)の関節内注入の後のIL1βXATマウス。CollのTMJのFΙV(Cre)注入の数週間後に8−ILlβジョイントのマウス解剖学異常は、半定量的アルシアンブルー − オレンジG組織化学 − によって評価された。半月と同様に顆状ヘッドを表している非アクティブのColl−IL1βXATマウスからの(A)TMJ部。Jn比較、TMJのFΙV(Cre)を注射されるColl−IL1βXATマウスから集められるTMJ部(B)。パネルB.の確認された領域の中で(C)大パネルA.(D)の確認された領域の中で拡大。 図15は、遺伝子および蛋白質療法のためのカスケードの炎症カスケードおよび戦略目標を示す。図13は、IL−1βの抑制を示す』中和抗体による生物学の活性。中間の収集した調子単純なNIH 3T3細胞がそうであった(A)Conditionedは、ネズミの繊維芽細胞(次々にネズミのCOX−2の低次にリボゾームリボ核酸を示した)に配置した。IL−1βXAT+pRc/CMV−バックボーン・ベクターによってもトランスフェクションするNHJ 3T3細胞からの(B)Conditioned媒体は、ネズミのCOX−2メッセンジャーRNAの低次を示した。対照的に、IL−1βXAT+pRc/CMV−CreWTトランスフェクションするNDH 3T3細胞から(C)均し培地は、著しく標的遺伝子のCOX−2メッセンジャーRNAを誘発した;制御ウサギIgG抗体(5ng/mLのIgG1アイソタイプ)を有する均し培地の(D)プレインキュベーションは、COX−2規則に最小の影響を及ぼした。しかしながら、ウサギ反EL1β(5ng/mLのIgG1)抗体を有する均し培地の(E)プレインキュベーションは、COX−2誘導を減らした。(F)ポジティブコントロール:ヒト組換えIL−1β(1ng/mL+5ナノグラムIgG1アイソタイプ)の追加。(G)ヒト組換えIL−1βは、5ng/mLの中和抗体によって、前孵化した。結果は、グループAと関連するCOX−2メッセンジャーRNAの折り目誘導として示される。 図16は、不βの抑制が中和抗体による生物学の活性であることを示す。中間の収集した調子単純なNIH 3T3細胞がそうであった(A)Conditionedはネズミの繊維芽細胞上に配置した。そして、それは次々にネズミのCOX−2メッセンジャーRNAの低次を示した。IL−1βXAT+pRc/CMV−バックボーン・ベクターによってもトランスフェクションするNIH 3T3細胞からの(B)Conditioned媒体は、ネズミのCOX−2メッセンジャーRNAの低次を示した。対照的に、IL−1βXAT+pRc/CMV−CreWTトランスフェクションするNIH 3T3細胞から(C)均し培地は、著しく的状赤血球のCOX−2メッセンジャーRNAを誘発した;制御ウサギIgG抗体(5ng/mLのIgG1アイソタイプ)を有する均し培地の(D)プレインキュベーションは、COX−2規則に最小の影響を及ぼした。しかしながら、ウサギ反IL−lβ(5ng/mLのIgG1)抗体を有する均し培地の(E)プレインキュベーションは、COX−2誘導を減らした。(F)ポジティブコントロール:ヒト組換えIL−1β(1ng/mL+5ナノグラムIgG1アイソタイプ)の追加。(G)ヒト組換えIL−1βは、5ng/mLの中和抗体によって、前孵化した。結果は、グループAと関連するCOX−2メッセンジャーRNAの折り目誘導として示される。 図17は、FIV(IL1ra)がIL−1ra受容体アンタゴニストを表している遺伝子を有する細胞をうまく変換することを示す。FIV(IL1ra)は、パネルAにて図示するように、建設されて、限定酵素によって、パネルB.FIV(IL1ra)において表される分析がそれから生体外で検証されることを確認した;IL1ra表現は、メッセンジャーRNAおよびタンパク質レベルでこのウイルスに感染しているネズミのNIH 3T3細胞において評価された。感染細胞の(C)RT−PCR分析は、IL1raメッセンジャーRNAの表示を示した。対照的に、単純な細胞は、いかなるIL1ra表現も示さなかった。ハウスキーピング遺伝子G3PDHも、使用された。注入された細胞の媒体の(D)IL1raタンパク質レベルは、ELISAによって評価された。FIV(IL1ra)による細胞の感染は、結果として治療的なIL1raレベル(>30μg/ミリリットル)になった。対照的に、FΙV(gfp)および単純な細胞は、IL1raを表さなかった。

Claims (37)

  1. ウイルスベクターを含む組成物であって、該ベクターの細胞への送達が炎症のメディエーターを阻害する、組成物。
  2. 前記ベクターは発現制御配列に作動可能に連結した核酸を含み、該核酸が前記炎症のメディエーターを阻害する、請求項1に記載の組成物。
  3. 前記核酸はsiRNAである、請求項2に記載の組成物。
  4. 前記siRNAは、COX−1の遺伝子発現を阻害する、請求項3に記載の組成物。
  5. 前記siRNAは、配列番号49の核酸配列を含む、請求項4に記載の組成物。
  6. 前記siRNAは、COX−2の遺伝子発現を阻害する、請求項3に記載の組成物。
  7. 前記siRNAは、配列番号53の核酸配列を含む、請求項6に記載の組成物。
  8. 前記siRNAは、mPGESの遺伝子発現を阻害する、請求項3に記載の組成物。
  9. 前記siRNAは、配列番号59に記載の核酸配列を含む、請求項8に記載の組成物。
  10. 前記siRNAは、cPGESの遺伝子発現を阻害する、請求項3に記載の組成物。
  11. 前記siRNAは、配列番号43に記載の核酸配列を含む、請求項10に記載の組成物。
  12. 前記ベクターは、前記炎症のメディエーターのそのレセプターへの結合を阻害するポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項1に記載の組成物。
  13. 前記ポリペプチドはIL−1レセプターへのIL−1βの結合を阻害する、請求項12に記載の組成物。
  14. 前記ポリペプチドはIL−1raである、請求項12に記載の組成物。
  15. 前記ポリペプチドはヒトIL−1raである、請求項14に記載の組成物。
  16. 前記核酸は、配列番号5に示される配列を有する、請求項12に記載の組成物。
  17. 前記核酸は、配列番号38に示される配列に対して、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%同一なポリペプチドをコードする、請求項12に記載の組成物。
  18. 任意の変化が保存的な変化である、請求項17に記載の組成物。
  19. 前記核酸は、ストリンジェントな条件下で配列番号5にハイブリダイズする、請求項12に記載の組成物。
  20. 前記発現制御配列は、構成的プロモーターである、請求項2に記載の組成物。
  21. 前記プロモーターはCMVプロモーターである、請求項20に記載の組成物。
  22. 前記CMVプロモーターは、配列番号15に示される核酸配列を含む、請求項21に記載の組成物。
  23. 前記プロモーターはβアクチンプロモーターである、請求項20に記載の組成物。
  24. 前記βアクチンプロモーターは、配列番号16に示される核酸配列を含む、請求項23に記載の組成物。
  25. 前記発現制御配列は組織特異的プロモーターである、請求項2に記載の組成物。
  26. 前記発現制御配列は誘導性プロモーターである、請求項2に記載の組成物。
  27. 前記ベクターがさらにマーカー配列を含む、請求項2に記載の組成物。
  28. 前記ベクターがレンチウイルスである、請求項2に記載の組成物。
  29. 前記ベクターは、ネコ免疫不全ウイルスを含む、請求項28に記載の組成物。
  30. 前記ベクターは、ヒト免疫不全ウイルスを含む、請求項28に記載の組成物。
  31. 前記ベクターは、少なくとも3ヶ月間安定に組み込まれ得る、請求項28に記載の組成物。
  32. 細胞を含む組成物であって、該細胞は、請求項1に記載のベクターを含む、組成物。
  33. 被験体における炎症を阻害する方法であって、該方法は、該被験体に、請求項1に記載のベクターを投与する工程を包含する、方法。
  34. 関節炎の被験体を処置する方法であって、該方法は、該被験体に、請求項1に記載のベクターを投与する工程を包含する、方法。
  35. 前記被験体は、変形性関節炎、慢性関節リウマチ、痛風、強直性脊椎炎、若年性関節炎、全身性エリテマトーデス(狼瘡)、強皮症、または線維筋痛症を有する、請求項34に記載の方法。
  36. 神経炎症から生じる中枢神経系障害を有する被験体を処置する方法であって、該方法は、該被験体に、請求項1に記載のベクターを投与する工程を包含する、方法。
  37. 前記被験体はアルツハイマー病を有する、請求項36に記載の方法。
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