BRPI0707276A2 - antagonistas de receptor nogo - Google Patents

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Dingyi Wen
R Blake Pepinsky
Jane K Relton
Xinzhong Wang
Alexey A Lugovskoy
Werner Meier
Ellen Garber
Laura Silvian
Paul H Weinreb
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Biogen Idec Inc
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Abstract

ANTAGONISTAS DE RECEPTOR NOGO A presente invenção refere-se a polipeptídeos de receptor Nogo-1 imunogênicos, anticorpos de receptor Nogo-1, fragmentos de ligação de antígeno desses, receptores Nogo solúveis e proteínas de fusão desses e ácidos nucléicos que codificam os mesmos. Também são descritos polinucleotídeos antagonistas de receptor Nogo. Também são descritas composi-ções que compreendem, e métodos para fazer e usar, tais anticorpos de receptor Nogo, fragmentos de ligação de antígeno desses, receptores Nogo solúveis, e proteínas de fusão desses, ácidos nucléicos que codificam os mesmos e polinucleotídeos antagonistas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para"ANTAGONISTAS DE RECEPTOR NOGO".
Campo da Invenção
Essa invenção refere-se a neurobiologia e biologia molecular.
Mais particularmente, essa invenção refere-se a polipeptídeos imunogênicosde receptor Nogo-1 (NgR1), anticorpos de receptor Nogo-1, fragmentos deligação de antígeno desses, receptores Nogo solúveis e proteínas de fusãodesses e ácidos nucléiços que codificam os mesmos. Essa invenção aindase refere a polinucleotídeos antagonistas de receptor Nogo-1. Essa invençãoainda referé-se a composições que compreendem, e métodos para fazer eusar tais anticorpos de receptor Nogo, fragmentos de ligação de antígenodesses, polipeptídeos imunogênicos de receptor Nogo-1, receptores Nogosolúveis e proteínas de fusão desses, ácidos nucléicos que codificam osmesmos e polinucleotídeos antagonistas,
Antecedentes da Invenção.
Axônios e dendritos de neurônios são longas extensões celula-res dos neurônios. A extremidade distai ae um axônio ou neurito em exten-são compreende uma região especializada, conhecida como o cone de cres-cimento. Cones de crescimento sentem o ambiente local e direcionam ocrescimento axonal em direção a célula alvo do neurônio. Cones de cresci-mento respondem a vários sinais ambientais, por exemplo, adesividade desuperfície, fatores de crescimento, neurotransmissores e campos elétricos. Aorientação de crescimento no cone envolve várias classes de moléculas deadesão, sinais intercelulares assim como fatores que estimulam e inibem oscones de adesão. O cone de adesão de um neurito em crescimento avançaem várias proporções, mas tipicamente na velocidade de um a dois milíme-tros por diá.
Cones de crescimento têm o formato de mãos, com uma amplaexpansão achatada (microespinhos ou filopódios) que se aderem diferencia-damente às superfícies no embrião. Os filopódios são continuamente ativos,alguns filopódios se retraem para dentro do cone de crescimento, enquantooutros continuam a alongar através do substrato. Os alongamentos entrefilopódios diferentes formam lamelipódios.
O cone de crescimento explora a área que está à frente dele ede cada lado com seus lamelipódios e filopódios. Quando um alongamentoentra em contato com uma superfície que não é favorável para crescimento,ele retrocede. Quando um alongamento entra em contato com uma superfí-cie favorável para crescimento, ele continua a se estender e direciona o co-ne de crescimento naquela direção. O cone de crescimento pode ser guiadopor pequenas variações nas propriedades de superfície dos substratos.Quando um cone de crescimento atinge uma célula-alvo apropriada, umaconexão sináptica é criada.
A função de células nervosas é grandemente influenciada pelocontato entre o neurônio e outras células no seu ambiente imediato (U. Ruti-shauser, Τ. M. Jessell, Physiol. Rev. 68:819 (1988)). Essas células incluemcélulas gliais especializadas, oligodendrócitos no sistema nervoso central(CNS), e células de Schwann no sistema nervoso periférico (PNS), que co-brem o axônio neuronal com mielina (uma estrutura isolante de membranasde múltiplas camadas) (G. Lemke, em An Introduction to Moiecuiar Neuro-biology, Z. Hall, Ed. (Sinauer, Sunderland, Mass.), p. 281 (1992)).
Embora neurônios do CNS tenham a capacidade de regenera-ção após lesão, eles são inibidos de fazê-lo devido à presença de proteínasinibidoras presentes na mielina e possivelmente também por outros tipos demoléculas normalmente encontradas no seu ambiente local (Brittis & Flana-gan, Neuron 5a 11-14 (2001); Jones et ai, J. Neurose. 22:2792-2803 (2002);Grimpe et al, J. Neurosci. 22:3144-3160 (2002)).
Várias proteínas inibidoras da mielina que são encontradas emoligodendrócitos foram caracterizadas, por exemplo, NogoA (Chen et al, Na-ture 403:434-439 (2000); Grandpre et al, Nature 403:439- 444 (2000)), glico-proteína associada à mielina (MAG, McKerracher et al, Neuron 73:805-811(1994); Mukhopadhyay et al, Neuron 73:151-161 (1994)) e glicoproteína deoligodendrócitos (OM-gp, Mikol & Stefansson, J. CeH Biol. 706:1213-1219(1988)). Cada uma dessas proteínas foi mostrada separadamente comosendo um Iigante para o receptor Nogo-1 neuronal (Wang et al., Nature477:941-944 (2002); Liu et al, Science 297:1190-93 (2002); Grandpre et al,Nature 403:439-444 (2000); Chen et al, Nature 403:434-439 (2000); Dome-niconi et al, Neuron 35:283-90 (2002)).
O receptor Nogo-1 é uma proteína de membrana ancorada àGPI que contém oito repetições ricas em Ieucina (Fournier et al, Nature409:341-346 (2001)). Ao interagir com uma proteína inibidora (por exemplo,NogoA, MAG e OM-gp), o complexo do receptor Nogo-1 transduz sinais quelevam ao colapso do cone de crescimento e inibição do crescimento de neu-ritos.
Há uma necessidade urgente de moléculas que inibam a ligaçãodo receptor Nogo-1 aos seus Iigantes e atenuem o colapso do cone de cres-cimento mediado pela mielina e inibição do crescimento de neuritos.
Sumário da Invenção
A presente invenção é direcionada ao uso de antagonistas dereceptor Nogo-1 para promover o crescimento de neuritos, sobrevivênciaaxonal, e regeneração axonal em neurônios do CNS. A invenção apresentamoléculas e métodos úteis para inibir a inibição do crescimento de neuritos,promover sobrevivência neuronal, e/ou promover regeneração axonal emneurônios do CNS.
A invenção também refere-se a polipeptídeos solúveis de recep-tor Nogo-1 e proteínas de fusão que os compreendem, e anticorpos e frag-mentos antigênicos desses direcionados contra regiões imunogênicas espe-cíficas do receptor Nogo-1. A invenção ainda refere-se a polipeptídeos imu-nogênicos de receptor Nogo-1 que se ligam aos anticorpos da invenção. Ainvenção também refere-se a polipeptídeos de receptor Nogo-1 que são Ii-- gados por um anticorpo monoclonal que se liga ao receptor Nogo-1. Taispolipeptídeos podem ser usados, inter alia, como imunógenos ou para ras-treamento de anticorpos para identificar aqueles com especificidade similar aum anticorpo da invenção. A invenção ainda refere-se a ácidos nucléicosque codificam os polipeptídeos dessa invenção, vetores e células hospedei-ras que compreendem tais ácidos nucléicos e métodos de fazer os peptí-deos. Os anticorpos, receptores solúveis e proteínas de fusão de receptordessa invenção antagonizam ou bloqueiam o receptor Nogo-1 e são úteispara inibir a ligação do receptor Nogo-1 aos seus ligantes, inibir o colapso docone de crescimento em um neurônio e diminuir a inibição de crescimentoou brotamento de neurito em um neurônio.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptí-deo selecionado a partir do grupo que consiste em AAAFTGLTLLEQL-DLSDNAQLR (SEQ ID NO: 26); LDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 27); LDLSD-DAELR (SEQ ID NO: 29); LDLASDNAQLR (SEQ ID NO: 30); LDLASDDA-ELR (SEQ ID NO: 31); LDALSDNAQLR (SEQ ID NO: 32); LD ALSDDAELR(SEQ ID NO: 33); LDLSSDNAQLR (SEQ ID NO: 34); LDLSSDEAELR (SEQID NO: 35); DNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 36); DNAQLR (SEQ ID NO: 37);ADLSDNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 41); LALSDNAQLRWDPTT (SEQ IDNO: 42); LDLSDNAALRVVDPTT (SEQ ID NO: 43); LDLSDNAQLHVVDPTT(SEQ ID NO: 44); e LDLSDNAQLAVVDPTT (SEQ ID NO: 45).
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um ácido nu-cléico que codifica um polipeptídeo da invenção. Em algumas modalidades,o ácido nucléico é operativamente ligado a uma seqüência de controle deexpressão. Em algumas modalidades, a invenção proporciona um vetor quecompreende um ácido nucléico da invenção.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma célulahospedeira que compreende um ácido nucléico ou que compreende o vetorda invenção. Em algumas modalidades, a invenção proporciona um métodode produzir um polipeptídeo da invenção que compreende cultivar a célulahospedeira que compreende um ácido nucléico ou vetor da invenção e recu-perar o polipeptídeo da célula hospedeira ou do meio de cultura.
- Em algumas modalidades, a invenção proporciona um métodode produzir um anticorpo compreendendo as etapas de imunizar um hospe-deiro com um polipeptídeo da invenção ou uma célula hospedeira que com-preende um ácido nucléico ou que compreende o vetor da invenção e recu-perar o anticorpo. A invenção também proporciona um anticorpo produzidopelo método ou um fragmento de ligação de antígeno desse.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um anticorpoou fragmento de ligação de antígeno desse que se liga especificamente aum polipeptídeo da invenção, em que o anticorpo não é o anticorpo mono-clonal produzido pela linhagem celular de hibridoma HB 7E11 (No. de aces-so da ATCC PTA-4587).
Em algumas modalidades da invenção, o anticorpo ou fragmentode ligação de antígeno (a) inibe o colapso do cone de crescimento de umneurônio; (b) diminui a inibição do crescimento e brotamento de neurito emum neurônio; e (c) inibe a ligação do receptor Nogo-1 a um ligante. Em al-gumas modalidades, o crescimento e brotamento de neurito é crescimentoaxonal. Em algumas modalidades, o neurônio é um neurônio do sistemanervoso central.
Em algumas modalidades, um anticorpo da invenção é mono-clonal. Em algumas modalidades, um anticorpo da invenção é um anticorpode murino. Em algumas modalidades, um anticorpo da invenção é selecio-nado a partir do grupo que consiste em um anticorpo humanizado, um anti-corpo quimérico e um anticorpo de cadeia única.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um métodode inibir a ligação do receptor Nogo-1 a um ligante, compreendendo a etapade colocar o receptor Nogo-1 em contato com um anticorpo da invenção oufragmento de ligação de antígeno desse. Em algumas modalidades o liganteé selecionado a partir do grupo que consiste em NogoA, NogoB, NogoC,MAG e OM-gp.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um métodopara inibir o colapso do cone de crescimento em um neurônio, compreen-dendo a etapa de colocar o neurônio em conato com um anticorpo da inven-- ção ou fragmento de ligação de antígeno desse.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um métodopara diminuir a inibição de crescimento ou brotamento de neurito em umneurônio, compreendendo a etapa de colocar o neurônio em contato com umanticorpo da invenção ou fragmento de ligação de antígeno desse. Em al-gumas modalidades, o crescimento ou brotamento de neurito é crescimentoaxonal. Em algumas modalidades, o neurônio é um neurônio do sistemanervoso central.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma compo-sição que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e um anti-corpo da invenção ou um fragmento de ligação de antígeno desse. Em al-gumas modalidades, a composição ainda compreende um ou mais agentesterapêuticos adicionais.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um métodode promover sobrevivência de um neurônio em risco de morrer, compreen-dendo colocar o neurônio em contato com uma quantidade eficaz de um an-ticorpo anti-receptor Nogo-1 da invenção ou fragmento de ligação de antíge-no desse. Em algumas modalidades o neurônio está in vitro. Em algumasmodalidades, o neurônio está em um mamífero. Em algumas modalidades, omamífero apresenta sinais e sintomas de esclerose múltipla, ALS, doença deHuntington, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, neuropatia diabéti-ca, acidente vascular cerebral, lesões cerebrais traumáticas, ou lesão damedula espinhal.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um métodode promover sobrevivência de um neurônio em um mamífero, cujo neurônioestá em risco de morrer, compreendendo (a) fornecer uma célula hospedeiracultivada que expressa um anticorpo anti-receptor Nogo-1 da invenção ouum fragmento de ligação de antígeno desse; e (b) introduzir a célula hospe-deira no mamífero no local, ou próximo ao local do neurônio.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um métodode terapia gênica de promover sobrevivência de um neurônio em risco demorrer, cujo neurônio está em um mamífero, compreendendo administrar nolocal, ou próximo do local do neurônio, um vetor viral que compreende umaseqüência de nucleotídeo que codifica um anticorpo anti-receptor Nogo-1 dainvenção ou um fragmento de ligação de antígeno desse, em que o anticor-po anti-receptor Nogo-1 ou fragmento de ligação de antígeno desse é ex-presso a partir da seqüência de nucleotídeo no mamífero em uma quantida-de suficiente para promover a sobrevivência do neurônio.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptí-deo isolado de 60 resíduos ou menos que compreende uma seqüência deaminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em: aminoácidos 309a 335 de SEQ BD NO:49; aminoácidos 309 a 336 de SEQ ID NO:49; amino-ácidos 309 a 337 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 338 de SEQ IDNO:49; aminoácidos 309 a 339 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 340de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 341 de SEQ ID NO:49; aminoácidos309 a 342 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 343 de SEQ ID NO:49; a-minoácidos 309 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 345 de SEQ IDNO:49; aminoácidos 309 a 346of SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 347 deSEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 348 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309a 349 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 350 de SEQ ID NO:49; aminoá-cidos 300 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 301 a 344 de SEQ IDNO:49; aminoácidos 302 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 303 a 344de SEQ ID NO:49; aminoácidos 304 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos305 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 306 a 344 de SEQ ID NO:49; a-minoácidos 307 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 308 a 344 de SEQ IDNO:49; aminoácidos 336 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 335 a 344de SEQ ID NO:49; aminoácidos 334 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos333 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 332 a 344 de SEQ ID NO:49; a-minoácidos 331 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 330 a 344 de SEQ H)NO:49; aminoácidos 329 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 328 a 344de SEQ EO NO:49; aminoácidos 327 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos326 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 325 a 344 de SEQ ID NO:49; a-minoácidos 324 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 323 a 344 de SEQ IDNO:49; aminoácidos 322 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 321 a 344de SEQ ID NO:49; aminoácidos 320 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos319 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 318 a 344 de SEQ ID NO:49; a-minoácidos 317 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 316 a 344 de SEQ IDNO:49; aminoácidos 315 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 314 a 344de SEQ ID NO:49; aminoácidos 313 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos312 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 311 a 344 de SEQ ID NO:49; a-minoácidos 310 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 336 a 344 de SEQ IDNO:49; aminoácidos 336 a 345 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 336 a 346de SEQ ID NO:49; aminoácidos 336 a 347 de SEQ ID NO:49; aminoácidos336 a 348 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 336 a 349 de SEQ ID NO:49; a-minoácidos 336 a 350 de SEQ ID NO:49; variantes ou derivados de qualquerum dos ditos fragmentos de polipeptídeo, e uma combinação de pelo menosdois de qualquer um dos ditos fragmentos de polipeptídeo; exceto por atétrês substituições de aminoácido.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptí-deo isolado de 60 resíduos ou menos compreendendo uma seqüência deaminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em: 311 a 344 deSEQ ID NO:49; aminoácidos 310 a 348 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 323a 328 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 339 a 348 de SEQ ID NO:49; aminoá-cidos 378 a 414 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 27 a 38 de SEQ ID NO:49;aminoácidos 39 a 61 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 257 a 267 de SEQ IDNO:49; aminoácidos 280 a 292 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 301 a 323de SEQ ID NO:49; aminoácidos 335 a 343 de SEQ ID NO:49; aminoácidos310 a 335 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 326 a 328 de SEQ ID NO:49; va-riantes ou derivados de qualquer um dos ditos fragmentos de polipeptídeo, euma combinação de pelo menos dois de qualquer um dos ditos fragmentos.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um fragmentode polipeptídeo isolado de 60 resíduos ou menos, compreendendo uma se-qüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de referên-cia, exceto por até três substituições de aminoácido individuais, em que adita seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupoque consiste em: (a) aminoácidos χ a 344 de SEQ ID NO:49, (b) aminoáci-dos 309 a y de SEQ ID NO:49, e (c) aminoácidos χ a y de SEQ ID NO:49,em que χ é qualquer número inteiro de 305 a 326, e y é qualquer númerointeiro de 328 a 350; e em que o dito fragmento de polipeptídeo inibe a inibi-ção de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo. Em algumasmodalidades, a invenção proporciona um fragmento de polipeptídeo isoladode 60 resíduos ou menos, compreendendo uma seqüência de aminoácidoidêntica a uma seqüência de aminoácido de referência, exceto por até trêssubstituições de aminoácidos individuais, em que a dita seqüência de ami-noácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a)aminoácidos x" a 344 de SEQ ID NO:49, (b) aminoácidos 309 a y' de SEQ IDNO:49, e (c) aminoácidos x' a y' de SEQ ID NO:49, onde x1 é qualquer núme-ro inteiro de 300 a 326, ey'é qualquer número inteiro de 328 a 360, e emque o dito fragmento de polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neu-rito mediada pelo receptor Nogo. Em algumas modalidades, a invenção pro-porciona um fragmento de polipeptídeo isolado de 60 resíduos ou menos,compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência deaminoácido de referência, exceto por até três substituições de aminoácidoindividuais, em que a dita seqüência de aminoácido de referência é selecio-nada a partir do grupo que consiste em: aminoácidos 309 a 335 de SEQ IDNO:49; aminoácidos 309 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 310 a 335de SEQ ID NO:49; aminoácidos 310 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos309 a 350 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 300 a 344 de SEQ ID NO:49; eaminoácidos 315 a 344 de SEQ ID NO:49. Em algumas modalidades, a in-venção proporciona um fragmento de polipeptídeo isolado de 60 resíduos oumenos, compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica a uma se-qüência de aminoácido de referência, exceto por até três substituições deaminoácido individuais, em que a dita seqüência de aminoácido de referên-cia são os aminoácidos 309 a 335 de SEQ ID NO:49.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptí-deo da invenção que é cíclico. Em algumas modalidades, o polipeptídeo cí-clico ainda compreende uma primeira molécula ligada na terminação-N euma segunda molécula ligada na terminação-C; em que a primeira molécula* e a segunda molécula são unidas uma a outra para formar a dita moléculacíclica. Em algumas modalidades, a primeira e segunda moléculas são sele-cionadas a partir do grupo que consiste em: uma molécula de biotina, umresíduo de cisteína e um resíduo de cisteína acetilado. Em algumas modali-dades, a primeira molécula é uma molécula de biotina ligada à terminação-Ne a segunda molécula é um resíduo de cisteína ligado à terminação-C dopolipeptídeo de invenção. Em algumas modalidades, a primeira molécula éum resíduo de cisteína acetilado ligado à terminação-N e a segunda molécu-la é um resíduo de cisteína ligado à terminação-C do polipeptídeo da inven-ção. Em algumas modalidades, a cisteína C-terminal tem uma porção NH2ligada.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptí-deo isolado que compreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e umsegundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito primeiro fragmento depolipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma pri-meira seqüência de aminoácido de referência, exceto por até vinte substitui-ções de aminoácido individuais, em que a dita primeira molécula de aminoá-cido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) ami-noácidos a até 445 de SEQ ID NO:49, (b) aminoácidos 27 até b de SEQ IDNO:49, e (c) aminoácidos a até b de SEQ ID NO:49, em que a é qualquernúmero inteiro de 25 até 35, e b é qualquer número inteiro de 300 até 450;em que o dito segundo fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüên-cia de aminoácido idêntica a uma segunda seqüência de aminoácido de re-ferência, exceto por até vinte substituições de aminoácido individuais, emque a dita segunda seqüência de aminoácido de referência é selecionada apartir do grupo que consiste em (a) aminoácidos c até 445 de SEQ IDNO:49, (b) aminoácidos 27 até d de SEQ ID NO:49, e (c) aminoácidos c atéd de SEQ ID NO:49, em que c é qualquer número inteiro de 25 a 35, e d équalquer número inteiro de 300 a 450; e em que o dito polipeptídeo inibe ainibição de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo. Em algumasmodalidades, a invenção ainda proporciona um polipeptídeo isolado quecompreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e um segundo fragmen-- to de polipeptídeo, em que o primeiro fragmento de polipeptídeo compreen-de uma seqüência de aminoácido idêntica a uma primeira seqüência de a-minoácido de referência, exceto por até vinte substituições de aminoácidoindividuais, em que a primeira seqüência de aminoácido de referência é se-lecionada a partir do grupo que consiste em: (a) aminoácidos 27 a 310 deSEQ ID NO:49 e (b) aminoácidos 27 a 344 de SEQ ID NO:49. Em algumasmodalidades, a invenção ainda proporciona um polipeptídeo isolado quecompreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e um segundo fragmen-to de polipeptídeo, em que o segundo fragmento de polipeptídeo compreen-de uma seqüência de aminoácido idêntica a uma primeira seqüência de a-minoácido de referência, exceto por até vinte substituições de aminoácidoindividuais, em que a segunda seqüência de aminoácido de referência é se-lecionada a partir do grupo que consiste em: (a) aminoácidos 27 a 310 deSEQ ID NO:49 e (b) aminoácidos 27 a 344 de SEQ ID NO:49. Em algumasmodalidades, a invenção ainda proporciona um polipeptídeo isolado quecompreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e um segundo fragmen-to de polipeptídeo, em que o segundo fragmento de polipeptídeo compreen-de uma seqüência de aminoácido idêntica a uma primeira seqüência de a-minoácido de referência, exceto por até vinte substituições de aminoácidoindividuais, em que o primeiro fragmento de polipeptídeo compreende osaminoácidos 27 a 310 de SEQ ID NO:49 e o segundo fragmento de polipep-tídeo compreende os aminoácidos 27 a 310 de SEQ ID NO:49 ou em que oprimeiro fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 27 a 344 deSEQ ÍD NO:49 e o segundo fragmento de polipeptídeo compreende os ami-noácidos 27 a 310 de SEQ ID NO:49 ou em que o primeiro fragmento depolipeptídeo compreende os aminoácidos 27 a 344 de SEQ ID NO:49 e osegundo fragmento de polipeptídeo compreende aminoácidos 27 a 344 deSEQ ID NO:49.
Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que oprimeiro fragmento de polipeptídeo está situado à montante do segundofragmento de polipeptídeo. Em algumas modalidades, a invenção ainda pro-porciona um Iigante de peptídeo situado entre o primeiro fragmento de poli-peptídeo e o segundo fragmento de polipeptídeo. Em algumas modalidades,a invenção ainda proporciona que o ligante de peptídeo compreende SEQ IDNO:65 (G4S)3. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona queo ligante de polipeptídeo compreende SEQ ID NO:66 (G4S)2.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptí-deo da invenção em que pelo menos um resíduo de cisteína é substituídopor um aminoácido heterólogo. Em algumas modalidades, pelo menos umresíduo de cisteína é C266. Em algumas modalidades, o pelo menos umresíduo de cisteína é C309. Em algumas modalidades, o pelo menos umresíduo de cisteína é C335. Em algumas modalidades, o pelo menos umresíduo de cisteína é C336. Em algumas modalidades, o pelo menos umresíduo de cisteína é substituído por um aminoácido de substituição selecio-nado a partir do grupo que consiste em alanina, serina e treonina. Em algu-mas modalidades, o aminoácido de substituição é alanina.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptí-deo isolado que compreende: (a) uma seqüência de aminoácido idêntica auma seqüência de aminoácido de referência exceto que pelo menos um re-síduo de cisteína da dita seqüência de aminoácido de referência é substituí-do por um resíduo de aminoácido diferente, em que a dita seqüência de a-minoácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (i)aminoácidos a até 445 de SEQ ID NO:49, (iii) aminoácidos 27 a b de SEQ IDNO:49, e (iii) aminoácidos a até b de SEQ ID NO:49, em que a é qualquernúmero inteiro de 25 a 35, e b é qualquer número inteiro de 300 a 450; e (b)um polipeptídeo heterólogo; em que dito poiipeptíaeo inibe a inibição decrescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo. Em algumas modalida-des, a invenção ainda proporciona que C266 da dita seqüência de aminoáci-do de referência é substituído por um resíduo de aminoácido diferente. Emalgumas modalidades, a invenção ainda proporciona que C309 da dita se-qüência de aminoácido de referência é substituído por um resíduo de ami-noácido diferente. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporcionaque C335 da dita seqüência de aminoácido de referência é substituído porum resíduo de aminoácido diferente. Em algumas modalidades, a invençãoainda proporciona que C266 e C309 da dita seqüência de aminoácido dereferência são substituídos por aminoácidos diferentes. Em algumas modali-dades, a invenção ainda proporciona que C309 e C335 da dita seqüência deaminoácido de referência são substituídos por aminoácidos diferentes. Emalgumas modalidades, a invenção ainda proporciona que o aminoácido dife-rente é alanina.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptí-deo isolado que compreende: (a) uma seqüência de aminoácido idêntica auma seqüência de aminoácido de referência, exceto por até vinte substitui-ções de aminoácido individuais, em que a dita seqüência de aminoácido dereferência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) aminoácidos aaté 445 de SEQ ID NO:49,(ii) aminoácidos 27 a b de SEQ ID NO:49, e (iii)aminoácidos a até b de SEQ ID NO:49, em que a é qualquer número inteirode 25 a 35, e b é qualquer número inteiro de 300 a 450; e (b) um polipeptí-deo heterólogo; em que dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento deneurito mediada pelo receptor Nogo.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptí-deo isolado que compreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e umsegundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito primeiro fragmento depolipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma pri-meira seqüência de aminoácido de referência, exceto por até vinte substitui-ções de aminoácido individuais, em que a dita primeira seqüência de amino-ácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) a-minoácidos a até 305 de SEQ ID NO:49, (b) aminoácidos 1 a b de SEQ iDNO:49, and (c) aminoácidos a até b de SEQ ID NO:49, em que a é qualquernúmero inteiro de 1 to 27, e b é qualquer número inteiro de 264 a 309; e emque o dito segundo fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüênciade aminoácido idêntica a uma segunda seqüência de aminoácido de refe-rência, exceto por até vinte substituições de aminoácido individuais, em quea dita segunda seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partirdo grupo que consiste em: (a) aminoácidos c a 332 de SEQ ID N0:60, (b)aminoácidos 275 a d de SEQ ID N0:60, e (c) aminoácidos c a d de SEQ IDN0:60, em que c é qualquer número inteiro de 265 to 306, e d é qualquernúmero inteiro de 308 a 340; e em que o dito polipeptídeo inibe a inibição decrescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo. Em certas modalida-des, a primeira seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partirdo grupo que consiste em: (a) aminoácidos 1 a 274 de SEQ ID NO:49; e (b)aminoácidos 1 a 305 de SEQ ID NO:49. Em certas modalidades, a segundaseqüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo queconsiste em: (a) aminoácidos 275 a 311 de SEQ ID N0:60; (b) aminoácidos275 a 332 de SEQ ID N0:60; (c) aminoácidos 306 a 311 de SEQ ID N0:60;(d) aminoácidos 306 a 308 de SEQ BD N0:60; e (e) aminoácidos 306 a 309de SEQ ID N0:60. Em uma modalidade, o primeiro fragmento de polipeptí-deo compreende os aminoácidos 1 a 274 de SEQ ID NO:49 e o segundofragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 275 a 311 de SEQID N0:60. Em algumas modalidades, o primeiro fragmento de polipeptídeocompreende os aminoácidos 1 a 274 de SEQ ID NO:49 e o segundo frag-mento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 275 a 332 de SEQ IDN0:60. Em algumas modalidades, o primeiro fragmento de polipeptídeocompreende os aminoácidos 1 a 305 de SEQ ID NO:49 e o segundo frag-mento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 306 a 311 de SEQ LDN0:60. Em algumas modalidades, o primeiro fragmento de polipeptídeocompreende os aminoácidos 1 a 305 de SEQ ID NO:49 e o segundo frag-mento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 306 a 308 de SEQ BDN0:60. Em algumas modalidades, o primeiro fragmento de polipeptídeocompreende os aminoácidos 1 a 305 de SEQ ID NO:49 e o segundo frag-mento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 306 a 309 de SEQ IDN0:60. Em algumas modalidades pelo menos um aminoácido adicional éadicionado à terminação-C do segundo fragmento de polipeptídeo. Em umamodalidade, o pelo menos o aminoácido adicional é triptofano. Em algumasmodalidades, A269 do primeiro fragmento de polipeptídeo é substituído porum resíduo de aminoácido diferente. Em uma modalidade, o aminoácido di-ferente é triptofano.
Em algumas modalidades a invenção proporciona um polipeptí-deo isolado que compreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e umsegundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito primeiro fragmento depolipeptídeo consiste nos aminoácidos 1 a 310 de SEQ ID NO:49, exceto poraté vinte substituições de aminoácido individuais; e em que o dito segundofragmento de polipeptídeo consiste nos aminoácidos 311 a 318 de SEQ IDN0:60, exceto por até cinco substituições de aminoácido individuais; e emque dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neurito mediada peloreceptor Nogo.
Em algumas modalidades a invenção ainda proporciona que opolipeptídeo heterólogo é selecionado a partir do grupo que consiste em: (a)albumina sérica, (b) uma região Fc, (c) um peptídeo de sinal, (d) um sinali-zador de polipeptídeo, e (e) uma combinação de dois ou mais dos ditos poli-peptídeos heterólogos. Em algumas modalidades, a invenção ainda propor-ciona que a região Fc é selecionada a partir do grupo que consiste em: umaregião Fc de IgA; uma região Fc de IgD; uma região Fe de IgG, uma regiãoFc de IgE; e uma região Fe de IgM. Em uma modalidade, a região Fc é umaregião Fc de IgG. Em algumas modalidades, a invenção ainda proporcionaque a o Iigante de peptídeo está situado ente a seqüência de aminoácido e aregião'Fc de IgG. Em uma modalidade, o Iigante de peptídeo compreendeSEQ ID NO:66 (G4S)2 Em algumas modalidades, a invenção ainda propor-ciona que o sinalizador de polipeptídeo é selecionado a partir do grupo queconsiste em: sinalizador FLAG; sinalizador Strep; sinalizador de polihistidina;sinalizador VSV-G; sinalizador de hemaglutinina (HA) de vírus influenza; esinalizador de c-Myc.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptí-deo da invenção ligado a uma ou mais porções de polialquileno glicol. Emalgumas modalidades, a invenção ainda proporciona que a uma ou maisporções de polialquileno glicol é uma porção de polietileno glicol (PEG). Emalgumas modalidades, a invenção ainda proporciona um polipeptídeo da in-venção ligado a 1 a 5 porções de PEG.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polinucle-otídeo isolado que codifica um polipeptídeo da invenção. Em algumas moda-s lidades, a invenção ainda proporciona que a seqüência de nucleotídeo é o-perativamente ligada a um elemento de controle de expressão (por exemplo,um promotor induzível, um promotor constitutivo ou um sinal de secreção).Modalidades adicionais incluem um vetor que compreende um polinucleotí-deo isolado da invenção e uma célula hospedeira que compreende o ditovetor.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polinucle-otídeo isolado selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um polinu-cleotídeo anti-sentido; (ii) uma ribozima; (iii) um pequeno RNA de interferên-cia (siRNA); e (iv) um pequeno RNA em forma de grampo (shRNA).
Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado é um poli-nucleotídeo anti-sentido que compreende pelo menos 10 bases complemen-tares à porção codificante do mRNA de NgR1. Em algumas modalidades, opolinucleotídeo é uma ribozima.
Em modalidades adicionais, o polinucleotídeo é um siRNA ouum shRNA. Em algumas modalidades, a invenção proporciona que estesiRNA ou o shRNA inibe a expressão de NgR1. Em algumas modalidades, ainvenção ainda proporciona que o siRNA ou shRNA é pelo menos 90% idên-tico à seqüência de nucleotídeo que compreende: CUACUUCUCCCG-CAGGCG ou CCCGGACCGACGUCUUCAA ou CUGACCACUGAGU-CUUCCG. Em outras modalidades, a seqüência de nucleotídeo do siRNA oushRNA é CUACUUCUCCCGCAGGCG ou CCCGGACCGACGUCUUCAA ouCUGACCACUGAGUCUUCCG.
Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que aseqüência de nucleotídeo do siRNA ou do shRNA é complementar ao mRNAproduzido pela seqüência de nucleotídeo GATGAAGAGGGCGTCCGCT ouGGGCCTGGCTGCAGAAGTT ou GACTGGTGACTCAGAGAAGGC.
Modalidades adicionais da invenção incluem composições far-macêuticas que compreendem os polipeptídeos, polinucleotídeos, vetores oucélulas hospedeiras da invenção, e em certas modalidades, um veículo far-maceuticamente aceitável. Em certas modalidades, a composição compre-ende os aminoácidos 27 a 310 de SEQ ID NO: 7 e um agente antiinflamató-1 rio. Em outras modalidades, a composição compreende os aminoácidos 27 a310 de SEQ ID NO: 9 e um agente antiinflamatório. Em algumas modalida-des, a invenção ainda proporciona que o agente antiinflamatório é selecio-nado a partir do grupo que consiste em um agente antiinflamatório esteroidale um agente antiinflamatório não-esteroidal. Em certas modalidades, agenteantiinflamatório esteroidal é selecionado a partir do grupo que consiste emhidrocortisona, 21-acetoxipregnenolona, alclomerasona, algestona, amcino-nida, beclometasona, betametasona, valerato de betametasona, budesonida,cloroprednisona, clobetasol, propionato de clobetasol, clobetasona, butiratode clobetasona, clocortolona, cloprednol, corticosterona, cortisona, cortiva-zol, deflazacon, desonida, desoximerasona, dexametasona, diflorasona, di-flucortolona, difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida, flumetasona,pivalato de flumetasona, flunisolida, acetonida de flucinolona, fluocinonida,acetonida de fluorocinolona, butil fluocortin, fluocortolona, hexanoato de fluo-rocortolona, valerato de diflucortolona, fluorometolona, acetato de fluperolo-na, acetato de fluprednidano, fluprednisolona, flurandenolida, formocortal,halcinonida, halometasona, acetato de halopredona, hidrocortamato, hidro-cortisona, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, fosfato dehidrocortisona, 21-succinato de sódio de hidrocortisona, tebutato de hidro-cortisona, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilprednisolona, furoa-to de mometasona, parametasona, prednicarbato, prednisolona, 21-diedriaminoacetato de prednisolona, fosfato de sódio de prednisolona, succi-nato de sódio de prednisolona, 21-m-sulfobenzoato de sódio de prednisolo-na, 21-estearoglicolato de sódio de prednisolona, tebutato de prednisolona,21-trimetilacetato de prednisolona, prednisona, prednival, prednilidano, 21-dietilaminoacetato de prednilidano, tixocortol, triancinolona, acetonida detriancinolona, benetonida de triamcinolona e hexacetonida de triancinolona.Em uma modalidade particular, o agente antiinflamatório esteroidal é metil-prednisolona. Em outras modalidades, o agente antiinflamatório não-esteroidal é selecionado a partir do grupo que consiste em alminoprofeno,benoxaprofeno, ácido buclóxico, carprofeno, fenbufeno, fenoprofeno, flupro-feno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indoprofeno, cetoprofeno, miroprofeno, na-proxeno, oxaprozin, pirprofeno, pranoprofeno, suprofeno, ácido tiaprofênico,tioxaprofeno, indometacina, acemetacina, alclofenaco, clidanaco, diclofena-co, fenclofenaco, ácido fenclózico, fentiazaco, furofenaco, ibufenaco, isoxe-paco, oxpinaco, sulindaco, tiopinaco, tolmetina, zidometacina, zomepiraco,ácido flufenâmico, ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, ácido niflúmico,ácido tolfênamico, diflunisal, flufenisal, isoxicam, piroxicam, sudoxicam, te-noxicam, ácido acetil salicílico, sulfasalazina, apazona, bezpiperilon, fepra-zona, mofebutazona, oxifenbutazona e fenilbutazona.
Modalidades adicionais incluem composições onde os aminoáci-dos 27 a 310 de SEQ ID NO: 7 ou 9 são fundidos a um polipeptídeo heteró-logo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo heterólogo é Fc.
Modalidades da invenção também incluem métodos para pro-mover o crescimento de neurito, que compreendem colocar um neurônio emcontato com um agente que inclui polipeptídeos, polinucleotídeos, ou com-posições da invenção, em que o dito agente inibe a inibição de crescimentode neurito mediada pelo receptor Nogo-1.
Modalidades adicionais incluem um método para inibir a trans-dução de sinal pelo complexo de sinalização de NgR1, compreendendo co-locar um neurônio em contato com uma quantidade eficaz de um agente queinclui polipeptídeos, polinucleotídeos ou composições da invenção, em que odito agente inibe a transdução de sinal pelo complexo de sinalização de N-gR1.
Outras modalidades incluem um método para tratar uma doença,distúrbio, ou lesão do sistema nervoso central (CNS) em um mamífero, quecompreende administrar a um mamífero que necessita de tratamento, umaquantidade eficaz de um agente que inclui polipeptídeos, polinucleotídeos oucomposições da invenção, em que o dito agente inibe a inibição de cresci-mento de neurito mediada pelo receptor Nogo-1. Em certas modalidades, adoença, distúrbio ou lesão é selecionada a partir do grupo que consiste emesclerose múltipla, ALS, doença de Huntington, doença de Alzheimer, doen-ça de Parkinson, neuropatia diabética, acidente vascular cerebral, lesõescerebrais traumáticas, lesão da medula espinhal, neurite óptica, glaucoma,1 perda de audição, e Ieucodistrofia adrenal.
Em algumas modalidades a invenção ainda proporciona que opolipeptídeo está fundido a um polipeptídeo heterólogo. Em algumas moda-lidades, o polipeptídeo heterólogo é albumina sérica. Em algumas modalida-des, o polipeptídeo heterólogo é uma região Fe. Em algumas modalidades, opolipeptídeo heterólogo é um peptídeo de sinal. Em algumas modalidades, opolipeptídeo heterólogo é um sinalizador de polipeptídeo. Em algumas mo-dalidades, a invenção ainda proporciona que a região Fc é selecionada apartir do grupo que consiste em: uma região Fc de IgA; uma região Fc deIgD; uma região Fc de IgG; uma região Fc de IgE; e uma região Fc de IgM.Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que o sinalizadorde polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em: sinalizadorFLAG; sinalizador Strep; sinalizador de polihistidina; sinalizador VSV-G; si-nalizador de hemaglutinina (HA) de vírus influenza; e sinalizador de c-Myc.
Breve Descrição dos Desenhos
A Figura 1 é uma representação esquemática da estrutura doreceptor Nogo-1 humano. sNogoR310 humano contém os resíduos 26 a 310de SEQ ID NO:7 e sNogoR344 contém dos resíduos 26 a 344 de SEQ IDNO:6. sNogoR310 de rato contém os resíduos 27 a 310 de SEQ ID NO:9 esNogoR344 contém os resíduos 27 a 344 de SEQ ID NO:8.
A Figura 2 representa um gráfico de antigenicidade para a prote-ína do receptor Nogo-1 usando o programa Vector Nti™. P-617 de rato éSEQ ID NO: 10 e P-618 de rato é SEQ ID NO: 11. P-617 de humano é SEQID NO:47 e P-618 de humano é SEQ ID NO:48.
A Figura 3A é um gráfico representando a atividade de ligaçãodo anticorpo anti- receptor Nogo-1, 7E11. O gráfico mostra o efeito da con-centração de 7E11 sobre a ligação de Nogo66 ao receptor Nogo-1. A Figura3B representa a atividade de ligação do anticorpo anti-Receptor Nogo-1,1H2. O gráfico mostra o efeito da concentração de 1H2 sobre a ligação deNogo66 a sNogoR344-Fc (também referido aqui e no pedido de patente dosEstados Unidos 60/402.866 como Fc-sNogoR344 ou lg-sNogoR344). Fc-MAG não competiu com Nogo66 pela ligação a sNogoR344-Fc.
A Figura 4 representa os resultados de um ELISA para anticor-pos anti-Nogo-R-1 1H2, 3G5 e 2F7. O efeito dos anticorpos sobre a OD450na presença de antígenos imobilizados foi determinada. Os antígenos imobi-lizados foram sNogoR310-Fc (também referido aqui e no pedido de patentedos Estados Unidos 60/402.866 como Fc-sNogoR310 ou lg-sNogoR310),sNogoR344-Fc, p-617, p-618, p-4, p-5 e ovalbumina e BSA.
A Figura 5 é um gráfico representando os efeitos do anticorpomonoclonal, 7Ε11, sobre ο crescimento de neurito de DRG de rato na pre-sença de quantidades variadas de mielina.
A Figura 6A é um gráfico representando o efeito da ligação desNogoR310 a 125l-Nogo66 e 125l-Nogo40 na presença dos seguintes compe-tidores: Nogo66, Nogo40 e sobrenadante de anticorpo monoclonal anti-Receptor Nogo-1. A Figura 6B representa a atividade de ligação de 125I-Nogo66 a sNogoR310.
A Figura 7 é um gráfico representado o efeito de sNogoR310-Fcsobre a ligação de 125l-Nogo40 a sNogoR310.
A Figura 8 é um gráfico representado a atividade de ligação desNogoR310-Fc a 125l-Nogo40.
A Figura 9A é um gráfico do efeito de sNogoR310 sobre o cres-cimento de neurito /célula na presença ou ausência de mielina. A Figura 9Bé um gráfico do efeito de sNogoR310 sobre o crescimento de neurito na pre-sença ou ausência de mielina.
A Figura 10A é um gráfico representado o efeito de sNogoR310-Fc sobre o crescimento de neurito de DRG de rato P4 na presença ou au-sência de quantidades crescentes de mielina. A Figura 10B representa onúmero de neuritos/célula após tratamento com PBS1 PBS + sNogoR310-Fc,20ng de mielina e mielina + sNogoR310-Fc.
A Figura 11 é um gráfico representado o efeito do anticorpo mo-noclonal 5B10 sobre o crescimento de neurito /célula na presença de quanti-dades crescentes de mielina.
A Figura 12 é um gráfico representando o efeito de sNogoR310-Fc sobre o score de BBB até 30 dias após a indução de lesão em um mode-Io de transecção de medula espinhal de rato.
As Figuras 13A e 13B relatam o score de BBB Iocomotor comouma função de tempo após hemissecção dorsal nos camundongos WT outransgênicos da Linhagem 08 ou Linhagem 01. A Figura 13C representa gra-ficamente o ângulo do plano inclinado tolerado máximo como uma função dotempo após lesão para camundongos WT e transgênicos. A Figura 13Dmostra erros dos membros traseiros durante subida em grade inclinada co-mo uma função do tempo após a lesão. Em todos os gráficos, médias ±s.e.m. de 7 a 9 camundongos em cada grupo são relatadas. Os valores dogrupo transgênico são diferentes estatisticamente dos camundongos WT,(dois asteriscos, P < 0,01; teste de t-Student).
A Figura 14A mostra o score de BBB Iocomotor como uma fun-ção do tempo após hemissecção dorsal em animais tratados com veículo ousNogoR310-Fc. A Figura 14B mostra erros dos membros traseiros durantecaminhada em grade como uma função do tempo após a lesão. A Figura14C mostra análises de pegadas revelando um menor comprimento de pas-sada e uma maior largura de passada em camundongos de controle do queem ratos não-lesionados ou Iesionados + sNogoR310-Fc. Em todos os gráfi-cos, médias ± s.e.m. de 7 a 9 ratos em cada grupo são relatadas. Os valoresdo grupo sNogoR310-Fc são estatisticamente diferentes do controle (Figuras14A-B). Os valores de controle são estatisticamente diferentes dos ratossem SCI ou SCI + sNogoR310-Fc na Figura 14C. (asterisco, p< 0,05; doisasteriscos, ρ < 0,01; teste de t-Student).
A Figura 15 mostra um modelo de ligação do anticorpo anti-rNgR1, 1D9, ao fragmento solúvel de NgR1 de rato (srNgR310).
A Figura 16A mostra a seqüência de nucleotídeo do cDNA doreceptor Nogo humano. Os códons de início e de parada estão sublinhados.As regiões-alvo do RNAi selecionado estão em itálico. RNAi-1 e RNAi-3 a-tingem especificamente o gene de NgR humano, RNAi-2 foi desenhado paraatingir os genes de NgR de ser humano, camundongo e rato. A Figura 16 Bmostra as seqüências de nucleotídeo dos oligonucleotídeos de DNA usadospara a construção de RNAi de NgR no vetor de expressão pU6.
A Figura 17 descreve os resultados do teste de transfecção tran-sitória de atenuação (knockdown) por RNAi em células L de camundongo.
A Figura 18 mostra a transfecção do vetor de expressão de NgRhumano em células SKN e 293.
A Figura 19 representa o teste de transfecção transitória de ate-nuação por RNAi em células SKN humanas.
A Figura 20 mostra uma representação esquemática de um vetorIentiviral de RNAi. O cassete de expressão de RNAi pode ser inserido nosítio de Pacl ou no sítio de EcoRI. LTR-repetições terminais longas; RRE-elementos de resposta Rev; cPPT-trato de polipurina central; CBA-beta acti-na de galinha; WPRE-elemento regulatório pós-transcricional de vírus daHepatite da Marmota; SIN LTR-LTR auto-inativante.
A Figura 21 mostra uma análise de Western blot usando o anti-corpo 7E11 para demonstrar inibição de NgR1 em células NeuroScreen clo-nadas.
A Figura 22 mostra um resumo da expressão de NgR em célulasNeuroScreen clonadas transduzidas com RNAi de LV (clone # 3G9, 1E5 1E9IE10), LV-NgR ou células naives. Os resultados dos sinais de NgR e GAPDHno Western blot foram quantificados por densitometria.
A Figura 23 mostra quatro clones de célula NeuroScreen queforam estabelecidos com diferentes níveis atenuação de NgR. A expressãode NgR é mostrada como a porcentagem da proporção dos sinais de N-gR:GAPDH em células de NeuroScreen naives.
As Figuras 24A-B mostram o efeito do ectodomínio ao NgR1 derato (27 a 310) fundido a uma IgG de rato [NgR(310)ecto-Fc] e metilpredni-solona (MP) sobre a inibição de crescimento de neurito induzida por mielinaem gânglios da raiz dorsal (DRGs) de pintos in vitro. (A) Neurônios de DRGde embrião de pintos de 13 dias dissociados foram plaqueados sobre salinatamponada com fosfato (PBS) ou mielina (400 ng/cavidade) na presença deNgR(310)ecto-Fc ou MP. (B) Quantificação de crescimento de neurito porcélula (η-3) expressa como uma porcentagem do controle com PBS ± SEM(η-3). Barra de graduada, 200μΓΤΐ. P < 0,05 comparado com controle com PBS.
As Figuras 25A-E mostram o efeito do ectodomínio do NgR1 derato (27 a 310) fundido a uma IgG de rato [NgR(310)ecto-Fc] e metilpredni-solona (MP) sobre recuperação funcional após lesão da medula espinhal(SCI). (A) Score de BBB foi registrado semanalmente por 4 semanas. (B) Oscore de BBB em ratos tratados com MP 2 dias após SCI. (C) Escores deBBB normalizados para o dia 2 para animais individuais. (D) Freqüência decoordenação de pisada plantar consistente e de membros anteriores-posteriores, ilustrando a proporção de ratos em cada grupo que atingiramum score de 14 ou mais 3 e 4 semanas após SCI. (E) Distância média entrepassos nos grupos tratados com NgR(310)ecto-Fc- e MP + NgR(310)ecto-Fc- em comparação com controles.
As Figuras 26A-B mostram o efeito do tratamento com ecto-domínio do NgR1 de rato (27 a 310) fundido a uma IgG de rato [N-gR(310)ecto-Fc] e metilprednisolona (MP) sobre o número de axônios nosentido caudal à lesão da medula espinhal.
A Figura 27 mostra o efeito do ecto-domínio de NgR1 de rato (27a 310) fundido a uma IgG de rato [NgR(310)ecto-Fc] e tratamento com metil-prednisolona (MP) sobre o número de axônios marcados com biotina dextranamina (BDA) em contato com neurônios motores no corno ventral.
Descrição Detalhada da Invenção
Definições e Técnicas Gerais
A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos ecientíficos usados aqui têm o mesmo significado entendido geralmente porum versado na técnica à qual essa invenção pertence. No caso de conflito, opresente pedido, incluindo as definições regulará. Ainda, a menos que re-querido de outra forma pelo contexto, termos no singular devem incluir osplurais e termos no plural devem incluir o singular. Todas as publicações,patentes e outras referências mencionadas aqui estão incorporadas por refe-rência na sua totalidade para todas as finalidades.
Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àquelesdescritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção,métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Os materiais, métodose exemplos são apenas ilustrativos, e não são pretendidos como limitantes.
Outras características e vantagens da invenção ficarão claras a partir dadescrição detalhada e das reivindicações.
Ao longo desse relatório descritivo e reivindicações, a palavra"compreende" ou variações, tais como, "compreendem" ou "compreenden-do", devem ser entendidas por implicar a inclusão de um inteiro ou grupo deinteiros estabelecido, mas não a exclusão de nenhum inteiro ou grupo deinteiros.
A fim de definir ainda mais essa invenção, os seguintes termos edefinições são fornecidos aqui.
Deve ser observado que o termo "um" ou "uma" entidade, refere-se a uma ou mais daquelas entidades; por exemplo, "uma molécula de imu-noglobulina", é entendida como representando uma ou mais moléculas deimunoglobulina. Dessa forma, os termos "o(a)" (ou "um(a)"), "um(a) ou mais"e "pelo menos um(a)" podem ser usados aqui intercambiavelmente.
Como usado aqui, o termo "consiste em" ou variações, tal como,"consistem em ou consistindo em", como usado ao longo do relatório descri-tivo e reivindicações, indica a inclusão de qualquer número inteiro ou grupode número inteiros citados, mas que nenhum inteiro ou grupo de númerosinteiros adicional pode ser adicionado ao método, estrutura ou composiçãoespecificada.
Como usado aqui, o termo "consiste essencialmente em", ouvariações, tal como, "consistem essencialmente em" ou "consistindo essen-cialmente em", como usado ao longo da especificação e reivindicações, indi-ca a inclusão de qualquer inteiro ou grupo de inteiros citado, e a inclusãoopcional de qualquer inteiro ou grupo de inteiros que não altera substancial-mente as propriedades básicas ou novas do método, estrutura ou composi-ção especificada.
Como usado aqui, "anticorpo" significa uma imunoglobulina in-tacta, ou um fragmento de ligação de antígeno dessa. Anticorpos dessa in-venção podem ser de qualquer isotipo ou classe (por exemplo, M, D, G, E eA) ou qualquer subclasse (por exemplo, G1 a G4, A1 a A2) e podem ter tan-to uma cadeia leve kappa (κ) como Iambda (λ).
Como usado aqui, "Fc" significa uma porção de uma cadeia pe-sada de imunoglobulina que compreende um ou mais domínios da regiãoconstante da cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Por exemplo, uma porção daregião constante da cadeia pesada de um anticorpo que é obtenível por di-gestão com papaína.Como usado aqui, "proteína de fusão de NogoR" significa umaproteína que compreende uma porção do receptor Nogo-1 solúvel fundida aum polipeptídeo heterólogo.
Como usado aqui, "anticorpo humanizado" significa um anticorpono qual pelo menos uma porção das seqüências não humanas é substituídapor seqüências humanas. Exemplos de como fazer anticorpos humanizadospodem ser encontrados nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.054.297,5.886.152 e 5.877.293.
Como usado aqui, "anticorpo quimérico" significa um anticorpoque contém uma ou mais regiões de um primeiro anticorpo e uma ou maisregiões de pelo menos outro anticorpo. O primeiro anticorpo e os anticorposadicionais podem ser da mesma espécie ou de espécies diferentes.
Como usado aqui e no Pedido de Patente dos Estados Unidos60/402.866, "receptor Nogo", "NogoR", "NogoR-1", "NgR", "NgR-1", "NgR1"e "NGR1" significam cada, Receptor Nogo-1.
Como usado aqui, o termo "polipeptídeo" é pretendido para a-branger um único "polipeptídeo" assim como vários "poiipeptíaeos", e refere-se a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) ligados linear-mente por ligações de amida (também conhecidas como ligações peptídi-cas). O termo "polipeptídeo" refere-se qualquer cadeia ou cadeias de dois oumais aminoácidos, e não se refere a um comprimento específico do produto.Dessa forma, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, "proteí-na", "cadeia de aminoácido" ou qualquer outro termo usado para referir auma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, estão incluídos dentroda definição de "polipeptídeo" e o termo "polipeptídeo" pode ser usado aoinvés de, ou intercambiavelmente com, qualquer um desses termos. O termo"polipeptídeo" também é pretendido para referir aos produtos de modifica-ções pós-expressão do polipeptídeo incluindo sem limitação, glicosilação,acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos proteto-res/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ou modificação por ami-noácidos que não ocorrem naturalmente. Um polipeptídeo pode ser derivadode uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia recombinante,mas não é necessariamente traduzido a partir de uma seqüência de ácidonucléico designada. Ele pode ser gerado de qualquer maneira, incluindo porsíntese química.
Um polipeptídeo da invenção pode ter um tamanho de cerca de3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75 oumais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1.000 ou mais, ou 2.000 oumais aminoácidos. Polipeptídeos podem ter uma estrutura tri-dimensionaldefinida, embora eles não tenham necessariamente tal estrutura. Polipeptí-deos com uma estrutura tri-dimensional definida são referidos como enove-lados, e polipeptídeos que não possuem uma estrutura tri-dimensional defi-nida, mas ao invés disso, podem adotar um grande número de conforma-ções diferentes, são referidos como desenovelados. Como usado aqui, otermo glicoproteína refere-se a uma proteína acoplada a pelo menos umaporção de carboidrato que está ligada à proteína através de uma cadeia Iate-ral que contém oxigênio ou que contém nitrogênio de um resíduo de amino-ácido, por exemplo, um resíduo de serina ou um resíduo de asparagina.
Por um polipeptídeo "isolado", ou um fragmento, variante ou de-rivado desse é pretendido um polipeptídeo que não está no seu ambientenatural. Nenhum nível particular de purificação é necessário. Por exemplo,um polipeptídeo isolado pode ser removido do seu ambiente natural ou nati-vo. Polipeptídeos produzidos de forma recombinante e proteínas expressasem células hospedeiras são considerados isolados para o propósito da in-venção, já que são polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram sepa-rados, fracionados ou purificados parcialmente ou substancialmente porqualquer técnica adequada.
Na presente invenção, um "fragmento de polipeptídeo" refere-sea uma seqüência de aminoácido curta de um polipeptídeo maior. Fragmen-tos de proteína podem ser "independentes" ou podem estar compreendidosdentro de um polipeptídeo maior do qual o fragmento forma uma parte daregião. Exemplos representativos de fragmentos de polipeptídeo da inven-ção incluem, por exemplo, fragmentos que compreendem cerca de 5 amino-ácidos, cerca de 10 aminoácidos, cerca de 15 aminoácidos, cerca de 20 a-minoácidos, cerca de 30 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos, cerca de 50aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos, cerca de 70 aminoácidos, cerca de80 aminoácidos, cerca de 90 aminoácidos, e cerca de 100 aminoácidos oumais de extensão.
Os termos "fragmento", "variante", "derivado" e "análogo" quan-do se referindo a um polipeptídeo da presente invenção incluem qualquerpolipeptídeo que retém pelo menos alguma atividade biológica. Polipeptí-deos descritos aqui podem incluir fragmentos, variantes ou moléculas deri-vadas deles sem limitações, contanto que o polipeptídeo ainda sirva parasua função. Polipeptídeos e fragmentos de polipeptídeo de NgR1 da presen-te invenção podem incluir fragmentos proteolíticos, fragmentos de deleção, eem particular, fragmentos que atingem mais facilmente o sítio de ação quan-do dados a um animal. Fragmentos de polipeptídeo ainda incluem qualquerporção do polipeptídeo que compreende um epitopo antigênico ou imunogê-nico do polipeptídeo nativo, incluindo epitopos lineares assim como tridimen-sionais. Polipeptídeos e fragmentos de polipeptídeo de NgRI da presenteinvenção podem compreender regiões variantes, incluindo fragmentos des-critos acima, e também polipeptídeos com seqüências de aminoácido altera-das devido a substituições, deleções ou inserções de aminoácido. Variantespodem ocorrem naturalmente, tal como uma variante alélica. Por "variantealélica" são pretendidas formas alteradas de um gene que ocupam um dadolócus em um cromossomo de um organismo. Genes II, Lewin, B., ed., JohnWiley & Sons, Nova Iorque (1985). Variantes que não ocorrem naturalmentepodem ser produzidas usando técnicas de mutagênese conhecidas. Polipep-tídeos e fragmentos de polipeptídeo de NgR1 da invenção podem compre-ender substituições de aminoácido conservativas ou não conservativas, de-leções ou adições. Polipeptídeos e fragmentos de polipeptídeo de NgR1 dapresente invenção também podem incluir moléculas derivadas. Polipeptí-deos variantes também podem ser referidos aqui como "análogos de poli-peptídeo". Como usado aqui, um "derivado" de um polipeptídeo ou um frag-mento de polipeptídeo refere-se a um polipeptídeo em questão que tem umou mais resíduos derivatizados quimicamente por reação de um grupo lateralfuncional. Também incluídos como "derivados" estão aqueles peptídeos quecontêm um ou mais derivados de aminoácido de ocorrência natural dos vinteaminoácidos comuns. Por exemplo, 4-hidroxiprolina pode ser substituída porprolina; 5-hidroxilisina pode ser substituída por lisina; 3-metil-histidina podeser substituída por histidina; homoserina pode ser substituída por serina; eornitina pode ser substituída por lisina.
Como usado aqui, o termo "ligação de dissulfeto" inclui a ligaçãocovalente formada entre dois átomos de enxofre. O aminoácido cisteínacompreende um grupo tiol que pode formar uma ligação ou ponte de dissul-feto com um segundo grupo tiol.
Como usado aqui, "proteína de fusão" significa uma proteína quecompreende um primeiro polipeptídeo conectado linearmente, através deligações peptídicas, a um segundo polipeptídeo. O primeiro polipeptídeo e osegundo polipeptídeo podem ser idênticos ou diferentes, e eles podem serconectados diretamente ou conectados através de Iigante de peptídeo (vejaabaixo).
O termo "polinucleotídeo" é pretendido para abranger um únicoácido nucléico assim como vários ácidos nucléicos, e refere-se a uma molé-cula ou constructo de ácido nucléico isolado, por exemplo, RNA mensageiro(mRNA) ou DNA de plasmídio (pDNA). Um polinucleotídeo pode conter umaseqüência de nucleotídeos da seqüência de cDNA de extensão completa,incluindo as seqüências 5' e 3' não traduzidas, as seqüências codificantes.Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação fosfodiéster convencio-nal ou uma ligação não convencional (por exemplo, uma ligação de amida,tal como encontrado em ácidos peptídeo nucléicos (PNA)). O polinucleotídeopode ser composto de qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxirribonucle-otídeo, que pode ser RNA ou DNA não-modificado ou RNA ou DNA modifi-cado. Por exemplo, polinucleotídeos podem ser compostos de DNA filamen-to simples ou duplo, DNA que é uma mistura de regiões de filamento simplese dupla, RNA de filamento simples e duplo, e RNA que é uma mistura deregiões de filamento simples e duplo, moléculas híbridas que compreendemDNA e RNA que podem ser de filamento simples, ou mais tipicamente, defilamento duplo, ou uma mistura de regiões de filamento simples e duplo.Além disso, os polinucleotídeos podem ser compostos de regiões de fila-mento triplo que compreendem RNA ou DNA ou ambos RNA e DNA. Polinu-cleotídeos também podem conter uma ou mais bases modificadas ou estru-turas principais de RNA e DNA modificados por razões de estabilidade oupor outras razões. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritia-das, e bases incomuns tal como inosina. Uma variedade de modificaçõespode ser feita ao DNA e RNA; dessa forma, "polinucleotídeo" abrange for-mas modificadas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente.
O termo "ácido nucléico" refere-se a qualquer um ou mais seg-mentos de ácido nucléico, por exemplo, fragmento de DNA ou RNA presen-tes em um polinucleotídeo. Por ácido nucléico ou polinucleotídeo "isolado" épretendida uma molécula de ácido nucléico, DNA ou RNA que foi removidado seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante quecodifica um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR da invençãocontido em um vetor é considerado isolado para os propósitos da presenteinvenção. Exemplos adicionais de polinucleotídeo isolado incluem polinucle-otídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou po-linucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) em solução.Moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vivo ou in vitro depolinucleotídeos de acordo com a presente invenção. Polinucleotídeos ouácidos nucléicos isolados de acordo com a presente invenção incluem aindatais moléculas produzidas sinteticamente. Além disso, um polinucleotídeo ouum ácido nucléico pode ser ou pode incluir um elemento regulatório tal comoum promotor, sítio de ligação de ribossomo, ou um terminador de transcri-ção.
Como usado aqui, uma "região codificante" é uma porção deácido nucléico que consiste em códons traduzidos em aminoácidos. Emboraum "códon de parada" (TAG, TGA, ou TAA) não seja traduzido em um ami-noácido, ele pode ser considerado como sendo parte de uma região codifi-cante, mas quaisquer seqüências flanqueadoras, por exemplo, promotores,sítios de ligação de ribossomo, terminadores transcricionais, íntrons e seme-lhantes, não são parte de uma região codificante. Duas ou mais regiões co-dificantes da presente invenção podem estar presentes em um único cons-tructo de polinucleotídeo, por exemplo, em um único vetor, ou em construc-tos de polinucleotídeo separados, por exemplo, em vetores separados (dife-rentes). Além disso, qualquer vetor pode conter uma única região codifican-te, ou pode compreender duas ou mais regiões codificantes, por exemplo,um único vetor pode codificar separadamente uma região variável de cadeiapesada de imunoglobulina e uma região variável de cadeia leve de imuno-globulina. Além disso, um vetor, polinucleotídeo, ou ácido nucléico da inven-ção pode codificar regiões codificantes heterólogas, tanto fundidas como nãofundidas a um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo ou fragmento depolipeptídeo de NgR da presente invenção. Regiões codificantes heterólogasincluem sem limitação, elementos ou motivos especializados, tal como umpeptídeo de sinal secretor ou um domínio funcional heterólogo.
Em certas modalidades, o polinucleotídeo ou ácido nucléico éDNA. No caso de DNA, um polinucleotídeo que compreende um ácido nu-cléico que codifica um polipeptídeo normalmente pode incluir um promotore/ou outros elementos de controle de transcrição ou tradução operativamen-te associados com uma ou mais regiões codificantes. Uma associação ope-rável é quando uma região codificante para um produto gênico, por exemplo,um polipeptídeo, está associada com uma ou mais seqüências regulatóriasde forma a colocar a expressão do produto gênico sob a influência ou con-trole da(s) seqüência(s) regulatória(s). Dois fragmentos de DNA (tal comouma região codificante de polipeptídeo e um promotor associado a ela) estão"operativamente associados" se a indução da função do promotor resultar natranscrição de mRNA que codifica o produto gênico desejado e se a nature-za da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interferir com a habilida-de das seqüências regulatórias de expressão direcionarem a expressão doproduto gênico ou interferir com a habilidade do molde de DNA ser transcri-to. Dessa forma, uma região promotora estaria operativamente associadacom um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo se o promotor fossecapaz de efetuar a transcrição daquele ácido nucléico. O promotor pode serum promotor célula-específico que direciona transcrição substancial do DNAapenas em células predeterminadas. Outros elementos de controle de trans-crição, além de um promotor, por exemplo, intensificadores, operadores, re-pressores, e sinais de terminação de transcrição, podem estar operativa-mente associados com o polinucleotídeo para direcionar transcrição célula-específica. Promotores e outras regiões de controle de transcrição adequa-das conhecidas são descritas aqui.
Várias regiões de controle de transcrição são conhecidas dosversados na técnica. Essas incluem, sem limitação, regiões de controle detranscrição que funcionam em células de vertebrados, tal como, mas nãolimitado a, segmentos de promotores e intensificadores de citomegalovírus(o promotor precoce imediato, em conjunto com o íntron-A), vírus símio 40 (opromotor precoce), e retrovírus (tal como o vírus do sarcoma de Rous). Ou-tras regiões de controle de transcrição incluem aquelas derivadas de genesde vertebrados, tal como actina, proteína de choque térmico, hormônio decrescimento bovino e β-globina de coelho, assim como outras seqüênciascapazes de controlas a expressão gênica em células eucarióticas. Regiõesde controle de transcrição adequadas adicionais incluem promotores e in-tensificadores tecido-específicos, assim como promotores induzíveis por Iin-focina (por exemplo, promotores induzíveis por interferons ou interleucinas).
De forma semelhante, uma variedade de elementos de controlede tradução é conhecida daqueles versados na técnica. Eles incluem, masnão são limitados a, sítios de ligação de ribossomos, códons de início e ter-minação de tradução, e elementos derivados de pircornavírus (particular-mente um sítio interno de entrada do ribossomo, ou IRES, também referidocomo uma seqüência CITE).
Em outras modalidades, um polinucleotídeo da presente inven-ção é RNA, por exemplo, na forma de RNA mensageiro (mRNA).
Regiões codificantes de polinucleotídeo e ácido nucléico da pre-sente invenção podem estar associadas com regiões codificantes adicionaisque codificam peptídeos secretórios ou de sinal, que direcionam a secreçãode um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção.De acordo com a hipótese de sinal, proteínas secretadas por células demamífero têm um peptídeo de sinal ou seqüência líder secretória que é cli-vada da proteína madura uma vez que a exportação da cadeia de proteínacrescente através do retículo endoplasmático rugoso tiver iniciado. Aquelesversados na técnica sabem que polipeptídeos secretados por células de ver-tebrados geralmente têm um peptídeo de sinal fundido à terminação-N dopolipeptídeo, que é clivado do polipeptídeo completo ou de "extensão com-pleta" para produzir uma forma secretada ou "madura" do polipeptídeo. Emcertas modalidades, o peptídeo de sinal nativo, por exemplo, um peptídeo desinal de cadeia pesada ou de cadeia leve de imunoglobulina é usado, ou umderivado funcional dessa seqüência que retém a habilidade de direcionar asecreção do polipeptídeo que está operativamente associado com ele. Alter-nativamente, um peptídeo de sinal heterólogo de mamífero, ou um derivadofuncional desse, pode ser usado. Por exemplo, a seqüência líder selvagempode ser substituída pela seqüência líder de ativador de plasminogênio teci-dual humano (TPA) ou de β-glicuronidase de camundongo.
Como usado aqui, o termo "manipulado" inclui manipulação demoléculas de ácido nucléico ou polipeptídeo por meios sintéticos (por exem-plo, por técnicas recombinantes, síntese de peptídeo in vitro, por acoplamen-to enzimático ou químico de peptídeos ou combinações dessas técnicas).
Como usado aqui, os termos "ligado", "fundido" e "fusão" sãousados intercambiavelmente. Esses termos referem-se à união de dois oumais elementos ou componentes, por qualquer meio, incluindo conjugaçãoquímica ou meios recombinantes. Uma "fusão in-frame" refere-se à união deduas ou mais fases abertas de leitura (ORFs) de polinucleotídeo para formaruma ORF mais comprida contínua, de uma maneira que mantenha a fase deleitura traducional correta das ORFs originais. Dessa forma, uma proteína defusão recombinante é uma única proteína que contém dois ou mais segmen-tos que correspondem a polipeptídeos codificados pelas ORFs originais (cu-jos segmentos normalmente não estão unidos na natureza). Embora a fasede leitura seja tornada contínua ao longo dos segmentos fundidos, os seg-mentos podem estar separados fisicamente ou espacialmente, por exemplo,por uma seqüência Iigante in-frame.
Uma seqüência "ligante" é uma sucessão de um ou mais ami-noácidos que separa duas regiões codificantes de polipeptídeo em uma pro-teína de fusão. Um ligante típico compreende pelo menos 5 aminoácidos.
Ligantes adicionais compreendem pelo menos 10 ou pelo menos 15 amino-ácidos. Em certas modalidades, os aminoácidos de um ligante de peptídeosão selecionados para que o ligante seja hidrofílico. O ligante (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (G4S)3 (SEQ ID NO:65) é um ligante preferido que é amplamenteaplicável a vários anticorpos já que ele fornece flexibilidade suficiente. Ou-tros Iigantes incluem (GIy-GIy-GIy-GIy-Ser)2 (G4S)2 (SEQ BD NO: 66), GluSer Gly Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO:67),Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr (SEQ ID NO:68),Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gln (SEQ IDNO:69), Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp (SEQ IDN0:70), Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly (SEQ IDNO:71), Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg SerLeu Asp (SEQ ID NO:72), e Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Glu Leu AlaPhe Arg Ser Leu Asp (SEQ ID NO:73). Exemplos de Iigantes mais curtosincluem fragmentos dos Iigantes acima, e exemplos de Iigantes mais longosincluem combinações de fragmentos dos Iigantes acima, e combinações dosligantes acima com fragmentos dos Iigantes acima.
No contexto de polipeptídeos, uma "seqüência linear" ou uma"seqüência" é uma ordem de aminoácidos em um polipeptídeo em uma dire-ção amino para carbóxi terminal na qual os resíduos ao lado um do outro naseqüência são contíguos na estrutura primaria do polipeptídeo.
O termo "expressão" como usado aqui refere-se a um processopelo qual um gene produz um bioquímico, por exemplo, um RNA ou polipep-tídeo. O processo inclui qualquer manifestação da presença funcional dogene dentro da célula incluindo, sem limitação, atenuação ("knockdown") degene, assim como, expressão transitória e expressão estável. Ele inclui, semlimitação, a transcrição do gene em RNA mensageiro (mRNA), RNA detransferência (tRNA), pequeno RNA em forma de grampo (shRNA), pequenoRNA de interferência (siRNA) ou qualquer outro produto de RNA, e a tradu-ção de tal mRNA em polipeptídeo(s), assim como qualquer outro processoque regula a transcrição ou a tradução. Se o produto final desejado for umbioquímico, expressão inclui a criação daquele bioquímico e quaisquer pre-cursores. Expressão de um gene produz um "produto gênico". Como usadoaqui, um produto gênico pode tanto ser um ácido nucléico, por exemplo, umRNA mensageiro produzido por transcrição de um gene, como um polipeptí-deo que é traduzido a partir de um transcrito. Produtos gênicos descritosaqui ainda incluem ácidos nucléicos com modificações pós-trancricionais,por exemplo, poliadenilação, ou polipeptídeos com modificações traducio-nais, por exemplo, metilação, glicosilação, a adição de lipídios, associaçãocom outras subunidades de proteína, clivagem proteolítica, e semelhantes.
O termo "interferência de RNA" ou "RNAi" refere-se ao silencia-mento ou diminuição de expressão gênica por siRNAs. É o processo de si-lenciamento gênico pós-transcricional, seqüência-específico em animais eplantas, iniciado pelo siRNA que é homólogo na sua região de dúplex à se-qüência do gene silenciado. O gene pode ser endógeno ou exógeno ao or-ganismo, integrado em um cromossomo, ou presente em um vetor de trans-fecção que não está integrado ao genoma. A expressão do gene é comple-tamente ou parcialmente inibida. RNAi também pode ser considerada parainibir a função de um RNA alvo; a função do RNA alvo pode ser completa ouparcial.
Como usados aqui, os termos "tratar" ou "tratamento" referem-sea medidas de tratamento terapêuticas e profiláticas ou preventivas, em que oobjetivo é prevenir ou reduzir (retardar) uma alteração fisiológica ou distúrbioindesejado, tal como a progressão de esclerose múltipla. Resultados benéfi-cos ou desejados incluem, mas não são limitados a, alívio dos sintomas, di-minuição da extensão da doença, estado de doença estabilizado (isto é, quenão piora), atraso ou retardo da progressão da doença, melhora ou paliaçãodo estado de doença, e remissão (quer parcial ou total), detectável ou inde-tectável. "Tratamento" também pode significar prolongamento da sobrevidaquando comparada com a sobrevida esperada sem receber tratamento. A-queles que necessitam de tratamento incluem aqueles já com a condição oudistúrbio, assim como, aqueles com tendência a ter a condição ou distúrbioou aqueles nos quais a condição ou distúrbio deve ser prevenida.
Por "sujeito" ou "indivíduo" ou "animal" ou "paciente" ou "mamí-fero", entende-se qualquer indivíduo, particularmente um indivíduo mamífe-ro, para quem o diagnóstico, prognóstico ou terapia é desejado. Indivíduosmamíferos incluem, mas não são limitados a, seres humanos, animais do-mésticos, animais de fazenda, animais de zoológico, animais de esportes,animais de estimação tais como cachorros, gatos, porquinhos-da-india, coe-lhos, ratos, camundongos, cavalos, gado, vacas; primatas tais como símios,macacos, orangotangos e chimpanzés; canídeos tais como cachorros e lo-bos; felídeos tais como gatos, leões, e tigres; eqüinos tais como cavalos,burros, e zebras; animais que servem de alimento tais como vacas, porcos,e carneiro; ungulados tais como cervos e girafas; roedores tais como ca-mundongos, ratos, hamster, e porcos da guiné; e assim por diante. Em cer-tas modalidades, o mamífero é um indivíduo humano.
Como usado aqui, uma "quantidade terapeuticamente eficaz"refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de temponecessários, para obter o resultado terapêutico desejado. Um resultado te-rapêutico pode ser, por exemplo, diminuição dos sintomas, sobrevida pro-longada, mobilidade melhorada, e semelhantes. Um resultado terapêuticonão precisa ser uma "cura".
Como usado aqui, uma "quantidade profilaticamente eficaz" refe-re-se a uma quantidade eficaz em dosagens e por períodos de tempo ne-cessários para atingir o resultado profilático desejado. Tipicamente, já queuma dose profilática é usada em indivíduos antes ou em um estágio anteriorda doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor do que a quan-tidade terapeuticamente eficaz.
A invenção é direcionada a certos antagonistas de NgR1 quepromovem sobrevivência neuronal, crescimento de neuritos e regeneraçãoaxonal de neurônios, por exemplo, neurônios do CNS. Por exemplo, a pre-sente invenção proporciona polipeptídeos e fragmentos de polipeptídeo, an-ticorpos e fragmentos desses, e polinucleotídeos de NgR1 que estimulam ocrescimento axonal sob condições nas quais o crescimento axonal é nor-malmente inibido. Dessa forma, antagonistas de NgR1 da invenção são úteisno tratamento de lesões, doenças ou distúrbios que podem ser aliviadas porpromover sobrevivência neuronal, ou pela estimulação de crescimento ouregeneração axonal no CNS.
Doenças, distúrbios ou lesões do CNS exemplares incluem, masnão são limitadas a, esclerose múltipla (MS), Ieucoencefalopatia multifocalprogressiva (PML), encefalomielite (EPL), mielinólise pontina central (CPM),adrenoleucodistrofia, doença de Alexander, doença de Pelizaeus Merzba-cher (PMZ), Leucodistrofia de Célula Globóide (doença de Krabbe) e Dege-neração Walleriana, neurite óptica, mielite transversa, esclerose lateral amio-trófica (ALS), doença de Huntington, doença de Alzheimer, doença de Par-kinson, lesão da medula espinhal, lesão cerebral traumática, lesão pós-radiação, complicações neurológicas de quimioterapia, acidente vascularcerebral, neuropatia óptica isquêmica aguda, deficiência de vitamina E, sín-drome de deficiência de vitamina E isolada, AR, síndrome de Bassen-Kornzweig, síndrome de Marchiafava-Bignami, Ieucodistrofia metacromática,neuralgia trigeminal, e paralisia de Bell. Dentre essas doenças, MS é a maisprevalente, afetando aproximadamente 2,5 milhões de pessoas em todo omundo.
Polipeptídeos de Receptor Noao-1
Em um aspecto, a presente invenção refere-se a polipeptídeosde receptor Nogo-1 que são imunogênicos. Em algumas modalidades dainvenção, o polipeptídeo imunogênico consiste essencialmente em uma se-qüência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em L-DLSDNAQLRVVDPTT (rato) (SEQ ID NO: 1); LDLSDNAQLRSVDPAT (hu-mano) (SEQ ID NO: 2); AVASGPFRPFQTNQLTDEELLGLPKCCQPDAADKA(rato) (SEQ ID NO: 3); AVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKA(humano) (SEQ ID NO: 4); e CRLGQAGSGA (camundongo) (SEQ ID NO: 5).
Em algumas modalidades, a invenção refere-se a polipeptídeosde receptor Nogo-1 que são ligados por um anticorpo monoclonal que se ligaao receptor Nogo-1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é reconhecidopelo anticorpo monoclonal 7E11. Em algumas modalidades, o polipeptídeo éselecionado a partir do grupo que consiste em: LDLSDNAQLR (SEQ ID NO:27); LDLSDDAELR (SEQ ID NO: 29); LDLASDNAQLR (SEQ ID NO: 30);LDLASDD AELR (SEQ ID NO: 31); LDALSDNAQLR (SEQ ID NO: 32);LDALSDDAELR (SEQ ID NO: 33); LDLSSDNAQLR (SEQ ID NO: 34); L-DLSSDEAELR (SEQ" ID NO: 35); DNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 36);DNAQLR (SEQ ID NO: 37); ADLSDNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 41);LALSDNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 42); LDLSDNAALRVVDPTT (SEQ IDNO: 43); LDLSDNAQLHVVDPTT (SEQ ID NO: 44); e LDLSDNA-QLAVVDPTT (SEQ ID NO: 46).
Em algumas modalidades, a invenção refere-se a um ácido nu-cléico que codifica um polipeptídeo de SEQ ID NOs: 1 a 5, 26 a 27, 29 a 37e 41 a 45. Em algumas modalidades da invenção, a molécula de ácido nu-cléico é ligada a uma seqüência de controle de expressão (e.g., pCDNA(l)).
A presente invenção também refere-se a um vetor que compre-ende um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da invenção. Em algu-mas modalidades da invenção, o vetor é um vetor de clonagem. Em algumasmodalidades da invenção, o vetor é um vetor de expressão. Em algumasmodalidades da invenção, o vetor contém pelo menos um marcador selecio-nável.
A presente invenção também se refere a células hospedeirasque compreendem o ácido nucléico ou vetor descrito acima.
A presente invenção também se refere a um método de produzirum polipeptídeo imunogênico da invenção compreendendo a etapa de culti-vas uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, a célula hospedeira éprocariótica. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é eucariótica.Em algumas modalidades, a célula hospedeira é de levedura.
A presente invenção também está direcionada para certos poli-peptídeos e fragmentos de polipeptídeo de Receptor Nogo-1 úteis, por e-xemplo, para promover crescimento de neurito, promover sobrevivência neu-ronal, promover sobrevivência axonal ou inibir a transdução de sinal pelocomplexo de sinalização de NgR1. Tipicamente, os polipeptídeos e fragmen-tos de polipeptídeo da invenção agem para bloquear a inibição mediada porNgR1 da sobrevivência neuronal, crescimento de neurito, ou regeneraçãoaxonal dos neurônios do sistema nervoso central (CNS).
O polipeptídeo de NgR1 humano é mostrado abaixo como SEQID NO:49.
NgR1 humano de extensão completa (SEQ ID NO:49):MKRASAGGSRLLAWVLWLQAWQVAAPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQGLQAVPVGIPAASQRIFLHGNRISHVPAASFRACRNLTILWLHSNVLARIDAAAPTGLALLEQLDLSDNAQLRSVDP ATFHGLGRLHTLHLDRCGLQELGPGLFRGLAALQYLYLQDNALQALPDDTFRDLGNLTHLFLHG>nUSSVPERAFRGLHSDDRLLLHQ^VAHVHPHAFRDLGRLMTLYL^AhMLSALPTEALAPLRALQYlJILNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPCSLPQRLAGRDLKRLAANDLQGCAVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKASVLEPGRPASAGNALKGRVPPGDSPPGNGSGPRIIINDSPFGTLPGSAEPPLTAVRPEGSEPPGFPTSGPRRRPGCSRKNRTRSHCRLGQAGSGGGGTGDSEGSGALPSLTCSLTPLGLALVLWTVLGPC
O polipeptídeo de NgR 1 de rato é mostrado abaixo como SEQID N0:50.
NgRI de rato de extensão completa (SEQ !D NO:5Q)10125] MKRASSGGSRIiAWVLWLQAWRVATPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQGLQAVP
TGIPASSQRIFLHGNRISHVPAASFQSCRNLTILWLHSNALARIDAAAFTGLTLLEQLDLSDNAQLHVVDPTTFHGLGHLHTLHLDRCGLRELGPGLFRGLAALQYLYLQDNNLQALPDNTFRDLGNLTHLFIJHGNRIPSVPEHAFRGI^SLDRLLLHQNHVARVHPHAFRDLGRO^^Lk^LRSLQYLRIJTOl^WVCDCRARPLWAWLQKFRGS
CAVASGPFRPIQTSQLTDEELLSLPKCCQPDAADKASVLEPGRPASAGNALKGRVPPGDTPPGNGSGPRH MDSPFGTLPSSAEPPLTALRPGGSEPPGLPTTGPRRRPGCSRJCNRTRSHCRLGQAGSGASGTGDAEGSGALPALACSIAPLGI^VLWTVLGPC
O polipeptídeo de NgR1 de camundongo é mostrado abaixo co-mo SEQ ID NO:51.
NgR1 de camundongo de extensão completa (SEQ ID NO:51)[0127] MKRASSGGSRLLAWVLWLQAWRVATPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQGLQAVPTGIP ASSQBJFLHGNRISHVP AASFQSCRNLTILWLHSNALARroAAAFTGLT^HVVDPTTFHGLGHLHTLHLDRCGLRELGPGLFRGLAALQYLYLQDNNLQALPDNl^HLFLH GNRjPSVPEHAFRGLHSLDRLLLHQNHVARVHPH^
LMPLRSLQYLRLNDNPWVCDCRARPLWA WLQKFRGS S SE VPCNLPQRLADRDLKRLAASDLEG
CAVASGPFRPIQTSQLTOEELLSLPKCCQPDAADKASVLEPGRPASAGNALKGRVPPGDTPPGNGSGPRHD^SPFGTIPSSAEPPLTALRPGGSEPPGLPTTGPRRRPGCSRKNRTO5GTGDAEGSGALPALACSLAPLGLALVLWTVLGPCAnticorpos
A presente invenção ainda se refere a um anticorpo, ou umfragmento de ligação de antígeno deste, que se liga especificamente a umpolipeptídeo de Receptor Nogo-1 da invenção. Em algumas modalidades, oanticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno deste, se liga a um polipeptí-deo que consiste essencialmente em uma seqüência de aminoácido selecio-nada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a 5, 26 a 27, 29 a 37e 41 a 45. O anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno da presente in-venção pode ser produzido in vivo ou in vitro. A produção do anticorpo oufragmento de ligação de antígeno é discutida abaixo.
Um anticorpo, ou um fragmento de ligação de antígeno deste, dainvenção inibe a ligação do Receptor Nogo-1 a um Iigante (por exemplo, No-goA, NogoB, NogoC, MAG, OM-gp) e diminui a inibição mediada por mielinade crescimento e brotamento de neuritos, particularmente crescimento axo-nal, e atenua o colapso do cone de crescimento mediado pela mielina.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Receptor Nogo-1, ouum fragmento de ligação de antígeno deste, é de murino. Em algumas mo-dalidades, o Receptor Nogo-1 é de rato. Em outras modalidades, o ReceptorNogo-1 é humano. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Receptor No-go-1, ou fragmento de ligação de antígeno deste, é recombinante, manipula-do, humanizado e/ou quimérico.
Em algumas modalidades, o anticorpo é selecionado a partir dogrupo que consiste em: 7E11 monoclonal (No. de acesso ATCC® PTA-4587); 1H2 monoclonal (No. de acesso ATCC® PTA-4584); 2F7 monoclonal(No. de acesso ATCC® PTA-4585); 3G5 monoclonal (No. de acesso ATCC®PTA- 4586); e 5B10 monoclonal (No. de acesso ATCC® PTA-4588). Em al-gumas modalidades, o anticorpo é o anticorpo policlonal 46.
Fragmentos de ligação de antígeno exemplares são, Fab, Fab',F(ab')2, Fv, Fd, dAb, e fragmentos que contêm fragmentos de regiões de de-terminação de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia única,(scFv), anticorpos quiméricos, e diacorpos e polipeptídeos que contêm pelomenos uma porção de uma imunoglobulina que é suficiente para conferir aopolipeptídeo ligação a um antígeno específico (por exemplo, imunoadesi-nas).
Como usado aqui, Fd significa um fragmento que consiste nosdomínios Vh e CHi; Fv significa um fragmento que consiste nos domínios Vle Vh de um único braço de um anticorpo; e dAb significa um fragmento queconsiste em um domínio Vh (Ward et al, Nature 347:544-546 (1989)). Comousado aqui, anticorpo de cadeia única (scFv) significa um anticorpo no qual,uma região Vl e uma região Vh são pareadas para formar moléculas mono-valentes através de um Iigante sintético que permite que eles sejam forma-dos como uma única cadeia de proteína (Bird et al, Science 242.423-426(1988) e Huston et al, Proc. NatL Acad. Sei. USA 85:5879-5883 (1988)).Como usado aqui, diacorpo significa um anticorpo biespecífico no qual osdomínios Vh e Vl são expressos em uma única cadeia de polipeptídeo, masusando um Iigante que é curto demais para permitir o pareamento entre osdois domínios na mesma cadeia, forçando assim que os domínios pareiemcom domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de liga-ção de antígeno (veja, por exemplo, Holiiger, P., et ai., Proc. Nati Acad. Sei.USA 90:6444-6448 (1993) e Poljak, R. J., et al, Structure 2:1121-1123(1994)). Como usado aqui, imunoadesina que se liga especificamente a umantígeno de interesse, significa uma molécula na qual uma ou mais CDRspodem estar incorporadas, tanto covalentemente como não-covalentemente.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma subuni-dade de polipeptídeo de um anticorpo de receptor Nogo-1 da invenção, emque a subunidade de polipeptídeo é selecionada a partir do grupo que con-siste em: (a) uma cadeia pesada ou uma região variável desta; e (b) umacadeia leve ou uma região variável desta.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um ácido nu-cléico que codifica uma cadeia pesada ou a região variável desta, ou a ca-deia leve e a região variável desta, de um subunidade de polipeptídeo de umanticorpo de Receptor Nogo-1 da invenção.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma regiãohipervariável (CDR) de um anticorpo de receptor Nogo-1 da invenção ou umácido nucléico que codifica uma CDR.Imunização
Anticorpos da invenção podem ser gerados por imunização deum hospedeiro adequado (por exemplo, vertebrados, incluindo seres huma-nos, camundongos, ratos, carneiros, cabras, porcos, gado, cavalos, répteis,peixes, anfíbios, e em ovos de pássaros, répteis, e peixe). Tais anticorpospodem ser policlonais ou monoclonais.
Em algumas modalidades, o hospedeiro é imunizado com umpolipeptídeo imunogênico de receptor Nogo-1 da invenção. Em outras moda-lidades, o hospedeiro é imunizado com o receptor Nogo-1 associado com amembrana celular de uma célula intacta ou rompida e anticorpos da inven-ção são identificados pela ligação a um polipeptídeo de receptor Nogo-1 dainvenção.
Em algumas modalidades, o antígeno de receptor Nogo-1 é ad-ministrado com um adjuvante para estimular a resposta imune. Adjuvantesfreqüentemente precisam ser administrados em adição ao antígeno a fim decriar uma resposta imune ao antígeno. Esses adjuvantes são geralmentesubstâncias insolúveis ou não-degradáveis que promovem inflamação ines-pecífica, com recrutamento de fagócitos mononucleares no local da imuniza-ção. Exemplos de adjuvantes incluem, mas não são limitados a, adjuvantede Freund, RIBI (dipeptídeos de muramil), ISCOM (complexos de imunoes-timulação) ou fragmentos destes.
Para uma revisão de métodos para fazer anticorpos, veja, porexemplo, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988); Yelton,D.E. etal, Ann. Rev. of Biochem. 50:657-80. (1981); e Ausubel et ai, CurrentProtocols in Molecular Biology iNova Iorque: John Wiley & Sons) (1989). Adeterminação de imunorreatividade com um polipeptídeo imunogênico dereceptor Nogo-1 da invenção pode ser feita por qualquer um de vários méto-dos bem-conhecidos, incluindo, por exemplo, ensaio de imunoblot e ELISA.
Produção de Anticorpos e Linhagens Celulares Produtoras deAnticorpo
Anticorpos monoclonais da invenção podem ser feitos por pro-cedimentos comuns descritos, por exemplo, em Harlow & Lane, Antibodies,A Laboratory Manual (1988), supra.
Resumidamente, em um momento apropriado o animal é sacrifi-cado e as células- B esplênicas e/ou de Iinfonodos são imortalizadas porqualquer um de vários métodos que são bem-conhecidos na técnica, incluin-do mas não limitados, a transformação, tal como com EBV ou fusão comuma linhagem celular imortalizada, tal como células de mieloma. Após isso,as células são separadas clonalmente e os sobrenadantes de cada clonetestados quanto à produção de um anticorpo específico para um polipeptí-deo imunogênico de receptor Nogo-1 da invenção. Métodos de selecionar,clonar e expressar hibridomas são bem-conhecidos na técnica. De formasemelhante, métodos para identificar a seqüência de nucleotídeo e aminoá-cido dos genes de imunoglobulina são conhecidos na técnica.
Outras técnicas adequadas para produzir um anticorpo da in-venção envolvem exposição in vitro de linfócitos ao receptor Nogo-1 ou a umpolipeptídeo imunogênico da invenção, ou alternativamente, seleção de bi-bliotecas de anticorpos em vetores de fago ou similares. Veja, Huse et ai,Science, 246:1275-81 (1989). Anticorpos úteis na presente invenção podemser empregados com ou sem modificação.
Antígenos (nesse caso receptor Nogo-1 ou um polipeptídeo imu-nogênico da invenção) e anticorpos podem ser marcados pela ligação, cova-Ientemente ou não-covalentemente, de uma substância que fornece um sinaldetectável. Vários marcadores e métodos de conjugação são conhecidos natécnica, e podem ser empregados na prática da invenção. Marcadores ade-quados incluem, mas não são limitados a, radionuclídeos, enzimas, substra-tos, co-fatores, inibidores, agentes fluorescentes, agentes quimioluminescen-tes, partículas magnéticas e semelhantes. Patentes que ensinam o uso detais marcadores incluem as Patentes U.S. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350;3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 e 4.366.241. Ainda, imunoglobulinas re-combinantes podem ser produzidas (veja Patente U.S. 4.816.567).
Em algumas modalidades da invenção, um anticorpo têm múlti-plas especificidades de ligação, tal como um anticorpo bifuncional preparadopor qualquer um de vários métodos conhecidos daqueles versados na técni-ca, incluindo a produção de hibridomas híbridos, troca de dissulfeto, reticula-ção química, adição de Iigantes de peptídeo entre dois anticorpos monoclo-nais, e introdução de dois grupos de cadeias pesadas e leves de imunoglo-bulina em uma linhagem celular particular, e assim por diante (veja abaixopara discussão mais detalhada).
Os anticorpos dessa invenção também podem ser anticorposmonoclonais humanos, por exemplo, aqueles produzidos por células imorta-lizadas humanas, por camundongos SCID-hu ou outros animais não-humanos capazes de produzir anticorpos "humanos".
Bibliotecas de Apresentação em Faqo
Anticorpos anti-receptor Nogo-1 dessa invenção podem ser iso-lados por rastreamento de uma biblioteca combinatória de anticorpo recom-binante. Bibliotecas combinatórias exemplares são para ligação a um poli-peptídeo imunogênico de receptor Nogo-1 da invenção, tal como bibliotecade apresentação em fago de scFv, preparada usando cDNAs de Vl e Vhpreparados a partir de mRNA derivado de um animal imunizado com um po-lipeptídeo imunogênico de receptor Nogo-1 da invenção. Metodologias parapreparar e rastrear tais bibliotecas são conhecidas na técnica. Há métodos emateriais disponíveis comercialmente para gerar bibliotecas de apresenta-ção em fago (por exemplo, Pharmacia Recombinant Phage Antibody Sys-tem, catálogo no. 27-9400-01; o kit de apresentação em fago StratageneSurfZAP™, catálogo no. 240612; e outros e MorphoSys). Também há outrosmétodos e reagentes que podem ser usados para gerar e rastrear bibliote-cas de apresentação de anticorpo (veja, por exemplo, Ladner et al. Pat. U.S.No. 5.223.409; Kang et al. Publicação PCT No. WO 92/18619; Dower et al.Publicação PCT No. WO 91/17271; Winter et al Publicação PCT No. WO92/20791; Markland et al. Publicação PCT No. WO 92/15679; Breitling et al.Publicação PCT No. WO 93/01288; McCafferty et al. Publicação PCT No.WO 92/01047; Garrard et ai Publicação PCT No. WO 92/09690; Fuchs etal,Bio/Technology 9: 1370-1372 (1991); Hay etal, Hum. Antibod. Hybridomas3:81-85; (1992) Huse etal, Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty etal,Nature 348:552-554 (1990); Griffiths et al, EMBO J. 12:725-734 (1993);Hawkins et al, J. Mol. Bioi 226:889-896 (1992); Clackson et al, Nature352:624-628 (1991); Gram et al, Proc. Natl Acad. Sci USA 89:3576-3580(1992); Garrad et al, Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom etal,Λ/uc/. /Ac/ds F?es. 79:4133-4137 (1991); e Barbas etal, Proc. Nati Acad. SciUSA 88:7978-7982 (1991).
Após o rastreamento e isolamento de um anticorpo anti-Receptor Nogo-1 da invenção a partir de uma biblioteca de apresentação deimunoglobulina recombinante, o ácido nucléico que codifica o anticorpo sele-cionado pode ser recuperado a partir do conjunto de apresentação (por e-xemplo, do genoma do fago) e subclonado em outros vetores de expressãopor técnicas de DNA recombinante comuns. De desejado, o ácido nucléicoainda pode ser manipulado adicionalmente para criar outras formas de anti-corpo da invenção, como descrito abaixo. Para expressar um anticorpo iso-lado por rastreamento de uma biblioteca combinatória, DNA que codifica acadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo ou as regiões variáveis destas, écionado em um vetor de expressão recombinante e introduzido em uma cé-lula hospedeira de mamífero, como descrito acima.
Troca de classe
Anticorpos anti-receptor Nogo-1 da invenção podem ser dequalquer isotipo. Um anticorpo de qualquer isotipo desejado pode ser produ-zido por troca de classe. Para a troca de classe, ácidos nucléicos que codifi-cam Vl ou Vh, que não incluem nenhuma seqüência de nucleotídeo que co-difica Cl ou Ch, são isolados usando métodos bem-conhecidos na técnica.
Os ácidos nucléicos que codificam Vl ou Vh são então operativamente liga-dos a uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma Cl ou Ch de umaclasse desejada de molécula de imunoglobulina. Isso pode ser obtido usan-do um vetor ou ácido nucléico que compreende uma cadeia de Cl ou Ch,como descrito acima. Por exemplo, um anticorpo anti- receptor Nogo-1 dainvenção que era originalmente IgM pode ter a classe trocada para uma IgG.
Além disso, a troca de classe pode ser usada para converte uma subclassede IgG em outra, por exemplo, de IgGI para lgG2.Anticorpos mutados
Em outras modalidades, anticorpos ou fragmentos de ligação deantígeno destes, da invenção podem ser mutados nos domínios variáveisdas cadeias pesada e/ou leve para alterar uma propriedade de ligação doanticorpo. Por exemplo, uma mutação pode ser feita em uma ou mais dasregiões de CDR para aumentar ou diminuir o Kd do anticorpo para o receptorNogo-1, para aumentar ou diminuir K0ff, ou para alterar a especificidade deligação do anticorpo. Métodos em mutagênese sítio-direcionada são bem-conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Sambrook et al, Molecular Clon-ing - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) eAusubel et al, Current Protocols in Molecular Biology (Nova Iorque: John Wi-Iey & Sons) (1989). Em uma modalidade preferida, mutações são feitas emum resíduo de aminoácido que é conhecido por ser alterado em comparaçãoà linhagem germinativa em uma região variável de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 da invenção. Em algumas modalidades, as mutações sãofeitas em um ou mais resíduos de aminoácido que são conhecidos por seralterados quando comparados à linhagem germinativa em uma região variá-vel de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 da invenção. Em outra modalidade,um ácido nucléico que codifica uma região variável de cadeia pesada ou decadeia leve de anticorpo é mutado em uma ou mais das regiões de estruturaprincipal. Uma mutação pode ser feita em uma região de estrutura principalou domínio constante para aumentar a meia-vida. Uma mutação em umaregião de estrutura principal ou domínio constante também pode ser feitapara alterar a imunogenicidade do anticorpo, para fornecer um sítio para Ii-gação covalente ou não-covalente a outra molécula, ou para alterar tais pro-priedades como fixação do complemento. Mutações podem ser feitas emcada uma das regiões de estrutura principal, do domínio constante, e dasregiões variáveis em um único anticorpo mutado. Alternativamente, muta-ções podem ser feitas em apenas uma das regiões de estrutura principal,das regiões variáveis ou do domínio constante em um único anticorpo muta-do.
Anticorpos de Fusão e ImunoadesinasEm outra modalidade, pode ser feito um anticorpo de fusão ouimunoadesina que compreende todo ou uma porção de um anticorpo anti-Receptor Nogo-1 da invenção ligado a outro polipeptídeo. Em algumas mo-dalidades, apenas a região variável do anticorpo anti-receptor Nogo-1 é Iiga-da ao polipeptídeo. Em outras modalidades, o domínio Vh de um anticorpoanti-receptor Nogo-1 dessa invenção é ligado a um primeiro polipeptídeo,enquanto que o domínio Vl do anticorpo é ligado a um segundo polipeptídeoque se associa com o primeiro polipeptídeo de uma maneira que permiteque os domínios Vh e Vl interajam um com o outro para formar um sítio deligação de anticorpo. Em outras modalidades, o domínio Vh é separado dodomínio Vl por um Iigante que permite que os domínios Vh e Vl interajamum com o outro (veja abaixo sob Anticorpos de Cadeia Única). O anticorpoVh -Iigante- Vl é então ligado a um polipeptídeo de interesse. O anticorpo defusão é útil para direcionar um polipeptídeo para uma célula ou tecido queexpressa um Iigante de receptor Nogo-1. O polipeptídeo de interesse podeser um agente terapêutico, tal como uma toxina, ou pode ser um agente dediagnóstico, tai com uma enzima que pode ser facilmente visuaiizada, taicomo peroxidase de rábano silvestre. Além disso, podem ser criados anti-corpos de fusão nos quais dois (ou mais) anticorpos de cadeia única sãoligados um ao outro. Isso é útil quando deseja-se criar um anticorpo divalen-te ou polivalente em uma única cadeia de polipeptídeo, ou quando deseja-secriar um anticorpo biespecífico.
Anticorpos de Cadeia Única
A presente invenção inclui um anticorpo de cadeia única (scFv)que se liga a um polipeptídeo de receptor Nogo-1 da invenção. Para produziro scFv, DNA codificante de Vh e Vl é operativamente ligado a um DNA quecodifica um Iigante flexível, por exemplo, que codifica a seqüência de amino-ácido (GIy4-Ser)3 (SEQ ID NO: 10), tal que as seqüências de Vh e Vl possamser expressas como uma proteína de cadeia única contígua, com as regiõesde Vl e Vh unidas pelo Iigante flexível (veja, por exemplo, Bird et al, Science242:423-426 (1988); Huston et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883(1988); McCafferty et al, Nature 348:552-554 (1990)). O anticorpo de cadeiaúnica pode ser monovalente, se apenas uma única Vh e Vl forem usadas,bivalente se duas Vh e Vl forem usadas, ou polivalente, se mais do que duasVh e VL forem usadas.
Anticorpos Quiméricos
A presente invenção ainda inclui um anticorpo biespecífico, oufragmento de ligação de antígeno deste, no qual uma especificidade é paraum polipeptídeo de receptor Nogo-1 da invenção. Em uma modalidade, podeser gerado um anticorpo quimérico que se liga especificamente a um poli-peptídeo de receptor Nogo-1 da invenção através de um domínio de ligaçãoe a uma segunda molécula através de um segundo domínio de ligação. Oanticorpo quimérico pode ser produzido através de técnicas de biologia mo-lecular recombinante, ou pode ser conjugado fisicamente. Além disso, podeser gerado um anticorpo de cadeia única que contém mais do que uma Vh eVl que se liga especificamente a um polipeptídeo da invenção e a outra mo-lécula que está associada com o colapso do cone de crescimento mediadopela mielina e inibição de crescimento e brotamento de neurito. Tais anticor-pos biespecíficos podem ser gerados usando técnicas que são bem-conhecidas, por exemplo, Fanger et ai, Immunol Methods 4: 72-81 (1994) eWright & Harris, supra, e em conjunto com (iii) veja por exemplo, Trauneckeret al. Int. J. Câncer (Supl.) 7: 51 -52 (1992).
Em algumas modalidades, os anticorpos quiméricos são prepa-rados usando uma ou mais das regiões variáveis de um anticorpo da inven-ção. Em outra modalidade, o anticorpo quimérico é preparado usando umaou mais regiões de CDR do dito anticorpo.
Anticorpos Derivatizados e Marcados
Um anticorpo, ou um fragmento de ligação deste, da invençãopode ser derivatizado ou ligado a outra molécula (por exemplo, outro peptí-deo ou proteína). Em geral, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodeste, é derivatizado tal que a ligação a um polipeptídeo da invenção não éafetada adversamente pela derivatização ou marcação. Por exemplo, umanticorpo ou porção de anticorpo da invenção pode ser ligada funcionalmen-te (por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente oude outra forma) a uma ou mais outras entidades moleculares, tal como outroanticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecífico ou um diacorpo), um a-gente de detecção, um agente citotóxico, um agente farmacêutico, e/ou umaproteína ou peptídeo que pode mediar a associação do anticorpo ou frag-mento de ligação de anticorpo com outra molécula (tal como região centralde estreptavidina ou um sinalizador de polihistidina).
Em algumas modalidades, um anticorpo derivatizado é produzi-do por reticulação de dois ou mais anticorpos (do mesmo tipo ou de tiposdiferentes, por exemplo, para criar anticorpos biespecíficos). Reticuladoresadequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, que têm dois gru-pos reativos distintamente separados por um espaçador apropriado (por e-xemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) ou homobifun-cional (por exemplo, suberato de disuccinimidila). Tais Iigantes estão dispo-níveis por Pierce Chemical Company, Rockford, III.
Em algumas modalidades, o anticorpo derivatizado é um anti-corpo marcado. Agentes de detecção exemplares com os quais um anticor-po ou porção de anticorpo da invenção pode ser derivatizada são compostosfluorescentes, incluindo fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodami-na, cloreto de 5-dimetilamina-1-naftalenossulfonila, ficoeritrina, lantanídeofosforoso e semelhantes. Um anticorpo também pode ser marcado com en-zimas que são úteis para detecção, tal como peroxidase de rábano silvestre,β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, glicose oxidase e semelhan-tes. Em modalidades que são marcadas com uma enzima detectável, o anti-corpo é detectado por adicionar reagentes adicionais que a enzima usa paraproduzir um produto de reação detectável. Por exemplo, peroxidase de rá-bano silvestre com peróxido de hidrogênio e diaminobenzidina. Um anticorpotambém pode ser marcado com biotina, e detectado através de medida indi-reta da ligação de avidina e estreptavidina. Um anticorpo também pode sêrmarcado com um epitopo de polipeptídeo predeterminado reconhecido porum repórter secundário (por exemplo, seqüências de pares de zíper de Ieu-cina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação demetal e sinalizadores de epitopo).Um anticorpo anti-receptor Nogo-1, ou fragmento de ligação deantígeno deste, também pode ser marcado com um aminoácido radiomarca-do. O radiomarcador pode ser usado tanto para fins de diagnóstico comoterapêuticos. O anticorpo anti-receptor Nogo-1 radiomarcado pode ser usadodiagnosticamente, por exemplo, para determinar os níveis de receptor Nogo-1 em um indivíduo. Além disso, o anticorpo anti-receptor Nogo-1 radiomar-cado pode ser usado terapeuticamente para tratar lesão da medula espinhal.Exemplos de marcadores para polipeptídeos incluem, mas não são limita-dos, aos seguintes radioisótopos ou radionuclídeos - - 3H, 14C1 15N, 35S, 90Y,99Tcl111Inl125Il131I.
Um anticorpo anti-receptor Nogo-1, ou fragmento de ligação deantígeno deste, também pode ser derivatizado com um grupo químico talcomo polietileno glicol (PEG), um grupo metila ou etila, ou um grupo de car-boidrato. Esses grupos podem ser úteis para melhorar as características bio-lógicas do anticorpo, por exemplo, para aumentar a meia-vida sérica ou paraaumentar a ligação ao tecido.Caracterização de Anticorpos Anti-Receptor Nogo-1Classe e subclasse de Anticorpos Anti-Receptor Nogo-1
A classe e a subclasse de anticorpos anti-receptor Nogo-1 po-dem ser determinadas por qualquer método conhecido na técnica. Em geral,a classe e subclasse de um anticorpo podem ser determinadas usando anti-corpos que são específicos para uma classe e subclasse particular de anti-corpo. Tais anticorpos são disponíveis comercialmente. A classe e subclassepodem ser determinadas por ELISA, Western blot, assim como outras técni-cas. Alternativamente, a classe e subclasse podem ser determinadas porseqüenciamento de todo ou de uma porção dos domínios constantes dascadeias pesada e/ou leve dos anticorpos, comparando suas seqüências deaminoácido a seqüências de aminoácido conhecidas de várias classes esubclasses de imunoglobulinas, e determinando a classe e subclasse dosanticorpos.
Afinidade de ligação de anticorpo anti-receptor Noao-1 a receptor Nogo-1
A afinidade de ligação e taxa de dissociação de um anticorpoanti-receptor Nogo-1 da invenção a um polipeptídeo de receptor Nogo-1 dainvenção podem ser determinadas por qualquer método conhecido na técni-ca. Por exemplo, a afinidade de ligação pode ser medida por ELISAs compe-titivos, RIAs, BIAcore ou tecnologia KinExA. A taxa de dissociação tambémpode ser medida por BIAcore ou tecnologia KinExA. A afinidade de ligação etaxa de dissociação são medidas por ressonância de plasma de superfície,usando, por exemplo, BIAcore. A Kd de 7E11 e 1H2 foram determinadoscomo sendo 1 χ 10"7 M e 2 χ 10"8 Μ, respectivamente.Inibição da atividade de receptor Nogo-1 por anticorpo anti-receptor Nogo-1
Em algumas modalidades, um anticorpo anti-receptor Nogo-1,ou um fragmento de ligação de antígeno deste, da invenção inibe a ligaçãodo receptor Nogo-1 a um ligante. A IC5o de tal inibição pode ser medida porqualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por ELISA, RIA, ouAntagonismo Funcional. Em algumas modalidades, a IC50 está entre 0,1 e500 nM. Em algumas modalidades, a IC50 está entre 10 e 400 nM. Em outrasmodalidades ainda, o anticorpo ou porção deste tem uma IC5o entre 60 nM e400 nM. A IC50 de 7E11 e 1H2 foram determinadas como sendo 400 nM e 60nM, respectivamente, em um ensaio de ligação. Veja também, tabela 3, in-fra.
Em algumas modalidades, a presente invenção também incluianticorpos específicos de NgR1, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari-antes, ou derivados que são antagonistas da atividade de NgR1. Por exem-plo, a ligação de certos anticorpos de NgR1 a NgR1 bloqueia a inibição me-diada por NgR1 da sobrevivência neuronal, crescimento de neurito ou rege-neração axonal de neurônios do sistema nervoso central (CNS).
Em outras modalidades, a presente invenção inclui um anticor-po, ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivado deste, que seliga especificamente ou preferivelmente a pelo menos um epitopo de NgR1,onde o epitopo compreende, consiste essencialmente em, ou consiste empelo menos cerca de quatro a cinco aminoácidos de SEQ ID NO:49, pelomenos sete, pelo menos nove, ou entre pelo menos 15 a cerca de 30 ami-noácidos de SEQ ID NO:49, Os aminoácidos de um dado epitopo de SEQ IDNO:49 como descrito, podem ser, mas não precisam ser, contíguos ou linea-res. Em certas modalidades, o pelo menos um epitopo de NgR1 compreen-de, consiste essencialmente em, ou consiste em um epitopo não linear for-mado pelo domínio extracelular de NgR1 quando expresso sobre a superfí-cie de uma célula ou como um fragmento solúvel, por exemplo, fundido auma região Fc de IgG. Dessa forma, em certas modalidades o pelo menosum epitopo de NgR1 compreende, consiste essencialmente em, ou consisteem pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8,pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos25, entre cerca de 15 a cerca de 30, ou pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35,40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 100 aminoácidos contíguosde SEQ ID NO:49, onde aminoácidos não-contíguos formam um epitopo a-través do enovelamento da proteína.
Em outras modalidades, a presente invenção inclui um anticor-po, ou um fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivado deste, quese liga especificamente ou preferivelmente a pelo menos um epitopo de N-gR1, onde o epitopo compreende, consiste essencialmente em, ou consisteem, além de um, dois, três, quatro, cinco, seis ou mais aminoácidos contí-guos ou não contíguos de SEQ ID NO: 49, como descrito acima, uma porçãoadicional que modifica a proteína, por exemplo, uma porção de carboidratoque pode ser incluída de modo que o anticorpo de NgR1 se ligue com maiorafinidade a proteína-alvo modificada do que a uma versão não modificada daproteína. Alternativamente, o anticorpo de NgR1 não se liga à versão nãomodificada da proteína-alvo.
Em certas modalidades, um anticorpo, ou fragmento de ligaçãode antígeno, variante ou derivado deste, da invenção se liga especificamentea pelo menos um epitopo de NgR1 ou fragmento ou variante descrito acima,isto é, se liga a tal epitopo mais facilmente do que se ligaria a um epitoponão relacionado, ou aleatório; se liga preferivelmente a pelo menos um epi-topo de NgR1, ou fragmento ou variante descrito acima, ístò é, se liga a talepitopo mais facilmente do que se ligaria a um epitopo relacionado, similar,homólogo ou análogo; inibe competitivamente a ligação de um anticorpo dereferência, que por si só, se liga especificamente ou preferivelmente a umcerto epitopo de NgR1 ou fragmento ou variante descrito acima; ou se liga apelo menos um epitopo de NgR1 ou fragmento ou variante descrito acimacom uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação KD me-nor do que cerca de 5 χ 10"2 Μ, cerca de 10"2 M, cerca de 5 χ 10"3 Μ, cercade 10"3 M, cerca de 5 χ 10"4 M1 cerca de 10'4 M, cerca de 5 χ 10"5 Μ, cercade 10"5 M, cerca de 5 χ 10"6 M1 cerca de 10"6 M, cerca de 5 χ 10"7 Μ, cercade 10"7 M, cerca de 5 χ 10"8 M1 cerca de 10"8 M, cerca de 5 χ 10"9 Μ, cercade 10"9 M, cerca de 5 χ 10"10 Μ, cerca de 10"10 M, cerca de 5 χ 10"11 Μ, cercade 10"11 M, cerca de 5 χ 10"12 Μ, cerca de 10"12 M, cerca de 5 χ 10"13 Μ, cer-ca de 10"13 M, cerca de 5 χ 10"14 Μ, cerca de 10"14 M, cerca de 5 χ 10"15 Μ,ou cerca de 10~15 M. Em um aspecto particular, o anticorpo, ou fragmentodeste, se liga preferivelmente a um polipeptídeo de NgR1 humano, ou frag-mento deste, em relação a um polipeptídeo de NgR1 de murino, ou fragmen-to deste.
Como usado no contexto das constantes de dissociação de liga-ção de anticorpo, o termo "cerca de" permite o grau de variação inerente nosmétodos utilizados para medir afinidade de anticorpo. Por exemplo, depen-dendo do nível de precisão da instrumentação usada, erro padrão baseadono número de amostras medidas, e erro de arredondamento, o termo "cercade 10"2 M" poderia incluir, por exemplo, de 0,05 M a 0,005 M.
Em modalidades específicas, um anticorpo, ou fragmento de li-gação de antígeno, variante ou derivado deste, da invenção se liga a poli-peptídeos de NgR 1 ou fragmentos ou variantes destes, com uma taxa dedissociação (off rate) (k(off)) menor ou igual a 5 X 10"2 sèg'1, 10"2 seg"1, 5 X10"3 seg"1 ou 10"3 seg"1. Alternativamente, um anticorpo, ou fragmento deligação de antígeno, variante, ou derivado deste, da invenção se liga a poli-peptídeos de NgR1 ou fragmentos ou variantes destes, com uma taxa dedissociação (k(off)) menor ou igual a 5 X 10"4 seg"1, 10"4 seg"1, 5 X 10'5 seg'1,ou 10"5 seg"1, 5 X 10 6 seg'1, 10"6 seg"1, 5 X 10 7 seg"1 ou 10"7 seg"1.
Em outras modalidades, um anticorpo, ou fragmento de ligação,variante ou derivado deste, da invenção se liga a polipeptídeos de NgR1 oufragmentos ou variantes destes, com uma taxa de associação (k(on)) maiorou igual a 103 M-1 seg"1, 5 X 103 IVT1 seg"1, 104 M"1 seg"1 ou 5 X 104 M"1 seg"1.Alternativamente, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, vari-ante ou derivado deste da invenção se liga a polipeptídeos de NgR1 oufragmentos ou variantes destes, com uma taxa de associação (k(on)) maiordo que ou igual a 105 M1 seg"1, 5 X 105 M1 seg"1, 106 M"1 seg"1, ou 5 X 106M"1 seg"1 ou IO7M"1 seg1.
Em uma modalidade, um antagonista de NgR1 para uso nos mé-todos da invenção é uma molécula de anticorpo, ou um fragmento imunoes-pecífico deste. A menos que seja especificamente observado, como usadoaqui, um "fragmento deste" em relação a um anticorpo refere-se a um frag-mento imunoespecífico, isto é, um fragmento de ligação de antígeno. Emuma modalidade, um anticorpo da invenção, é uma molécula de ligação, po-lipeptídeo de ligação, ou anticorpo biespecífico, por exemplo, um anticorpo,minicorpo, anticorpo com um domínio deletado ou proteína de fusão biespe-cífica, que tem especificidade de ligação por mais do que um epitopo, porexemplo, mais do que um antígeno ou mais do que um epitopo no mesmoantígeno. Em uma modalidade, um anticorpo biespecífico tem pelo menosum domínio de ligação específico para pelo menos um epitopo em ngR1. Umanticorpo biespecífico pode ser um anticorpo tetravalente que tem dois do-mínios de ligação ao alvo específicos para um epitopo de NgR1 e dois do-mínios de ligação ao alvo específicos para um segundo alvo. Dessa forma,um anticorpo biespecífico tetravalente pode ser bivalente para cada especifi-cidade.
Certas modalidades da presente invenção compreendem a ad-ministração de um anticorpo antagonista de NgR1, ou fragmento imunoes-pecífico deste, no qual pelo menos uma fração de um ou mais dos domíniosde região constante foram deletados ou alterados de outra maneira de modoa fornecer características bioquímicas desejadas, tais como funções efetorasreduzidas, a habilidade de dimerizar não-covalentemente, habilidade aumen-tada de se localizar em um local de um tumor, meia-vida sérica reduzida, oumeia-vida sérica aumentada quando comparado com um anticorpo inteiro,inalterado com aproximadamente a mesma imunogenicidade. Por exemplo,certos anticorpos para uso nos métodos de tratamento descritos aqui sãoanticorpos com domínio deletado que compreendem uma cadeia de polipep-tídeo similar a uma cadeia pesada de imunoglobulina, mas que não têm pelomenos uma porção de um ou mais dos domínios da cadeia pesada. Por e-xemplo, em certos anticorpos, um domínio inteiro da região constante doanticorpo modificado será deletado, por exemplo, todo ou parte do domínioCH2 será deletado.
Em certos anticorpos antagonistas de NgR1 ou fragmentos imu-noespecíficos destes, para uso nos métodos terapêuticos descritos aqui, aporção Fc pode ser mutada para alterar, por exemplo, aumentar, diminuir oumodular a função efetora usando metodologias conhecidas na técnica. Porexemplo, a deleção ou inativação (através de mutações pontuais ou outrosmeios) de um domínio de região constante pode reduzir ou alterar a ligaçãodo receptor Fc do anticorpo modificado circulante aumentando assim a loca-lização do tumor. Em outros casos, pode ocorrer que modificações da regiãoconstante compatíveis com a presente invenção diminuem a ligação docomplemento e assim reduzem a meia-vida sérica e associação inespecíficade uma citotoxina conjugada. Outras modificações ainda da região constantepodem ser usadas para modificar ligações de dissulfeto ou porções de oli-gossacarídeo que permitem localização intensificada devido a especificadade antígeno aumentada ou flexibilidade do anticorpo. O perfil fisiológico re-sultante, a biodisponibilidade e outros efeitos bioquímicos das modificações,tal como localização do tumor, biodistribuição e meia-vida sérica, podem serfacilmente medidos e quantificados usando técnicas imunológicas bem-conhecidas sem experimentação excessiva.
Formas modificadas de anticorpos ou fragmentos imunoespecífi-cos destes, para uso nos métodos diagnósticos e terapêuticos descritos aquipodem ser feitos a partir de anticorpos precursores ou parentais inteiros u-sando metodologias conhecidas na técnica. Metodologias exemplares sãodiscutidas aqui em mais detalhes.
Em certas modalidades ambas as regiões variável e constantede anticorpos antagonistas de NgR 1 ou fragmentos imunoespecíficos des-tes, para uso nos métodos de tratamento descritos aqui são completamentehumanos. Anticorpos completamente humanos podem ser feitos usando me-todologias que são conhecidas na técnica e conforme descrito aqui. Por e-xemplo, anticorpos completamente humanos contra um antígeno específicopodem ser preparados por administrar o antígeno a um animal transgênicoque foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta a estímulo anti-gênico, mas cujos Ioci antigênicos foram desativados. Técnicas exemplaresque podem ser usadas para fazer tais anticorpos são descritas nas PatentesU.S. 6.150.584; 6.458.592; 6.420.140. Outras metodologias são conhecidasna técnica. Anticorpos completamente humanos podem igualmente ser pro-duzidos por várias tecnologias de apresentação, por exemplo, apresentaçãoem fago, ou outros sistemas de apresentação, como descrito em mais deta-lhes em outro local neste documento.
Anticorpos antagonistas de NgR1 ou fragmentos imunoespecífi-cos destes, para uso nos métodos de diagnóstico e tratamento descritos a-qui podem ser feitos ou manufaturados usando metodologias que são co-nhecidas na técnica. Em certas modalidades, moléculas de anticorpo oufragmentos destas, são "produzidas recombinantemente", isto é, são produ-zidas usando tecnologia de DNA recombinante. Técnicas exemplares parafazer moléculas de anticorpo ou fragmentos destas são discutidos em maisdetalhes em outro local neste documento.
Anticorpos antagonistas de NgR1, ou fragmentos imunoespecífi-cos destes, para uso nos métodos de tratamento descritos aqui incluem de-rivados que são modificados, por exemplo, pela ligação covalente de qual-quer tipo de molécula ao anticorpo tal que a ligação covalente não impeçaque o anticorpo se ligue especificamente ao seu epitopo cognato. Por exem-plo, mas não como forma de limitação, os derivados de anticorpo incluemanticorpos que foram modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação,peguilação, fosforilação, amidação, derivatização ou por grupos proteto-res/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um Iigante ce-lular ou outra proteína, etc. qualquer uma de várias modificações químicaspodem ser realizadas por técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitadasa clivagem química especifica, acetilação, formilação, síntese metabólica detunicamicina, etc. adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais ami-noácidos não-clássicos.
Em modalidades preferidas, um anticorpo antagonista de NgR1,ou fragmento imunoespecífico deste, para uso nos métodos de tratamentodescritos aqui, não farão surgir uma resposta imune deletéria no animal aser tratado, por exemplo, em um ser humano. Em uma modalidade, anticor-pos antagonistas de NgR1 ou fragmentos imunoespecíficos destes para usonos métodos de tratamento descritos aqui podem ser modificados para re-duzir sua imunogenicidade usando metodologias conhecidas na técnica. Porexemplo, anticorpos podem ser humanizados, primatizados, desimunizados,ou anticorpos quiméricos podem ser feitos. Esses tipos de anticorpos sãoderivados de um anticorpo não-humano, tipicamente um anticorpo de murinoou primata, que retém ou retém substancialmente as propriedades de liga-ção de antígeno do anticorpo parental, mas que é menos imunogênico emhumanos. Isso pode ser obtido por vários métodos, incluindo (a) enxertar osdomínios variáveis não-humanos inteiros em regiões constantes humanaspara gerar anticorpos quiméricos; (b) enxertar pelo menos uma parte de umaou mais das regiões de determinação de complementaridade (CDRs) não-humanas em um estrutura principal e regiões constantes humanas com ousem retenção de resíduos críticos do estrutura principal; ou (c) transplantaros domínios variáveis não-humanos inteiros, mas "ocultando" os mesmoscom uma seção semelhante a uma humana por substituição de resíduos desuperfície. Tais métodos são descritos em Morrison et ai, Proc. Natl. Acad.Sci 87:6851-6855 (1984); Morrison et al, Adv. Immunol. 44:65-92 (1988);Verhoeyen et al, Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun.28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 37:169-217 (1994), e Pat. U.S.Nos. 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762, e 6.190.370, todos os quais estão pormeio deste incorporados por referência na sua totalidade.
Desimunização também pode ser usada para diminuir a imuno-genicidade de um anticorpo. Como usado aqui, o termo "desimunização"inclui alteração de um anticorpo para modificar epitopos de célula T (veja,por exemplo, W09852976A1, W00034317A2). Por exemplo, seqüências deVH e VL do anticorpo inicial são analisadas e um epitopo de célula T huma-no "mapeado" de cada região V mostrando a localização de epitopos emrelação às regiões de determinação de complementaridade (CDRs) e outrosresíduos chave dentro da seqüência. Epitopos de célula T individuais domapa de epitopos de célula T são analisados a fim de identificar substitui-ções de aminoácido alternativas com baixo risco de alterar a atividade doanticorpo final. Uma gama de seqüências de VH e VL alternativas é dese-nhada, compreendendo combinações de substituições de aminoácido e es-sas seqüências são subseqüentemente incorporadas em uma gama de poli-peptídeos de ligação, por exemplo, anticorpos antagonistas de NgR1, oufragmentos imunoespecíficos destes, para uso nos métodos de diagnóstico etratamento descritos aqui, que são então testados quanto à função. Tipica-mente, entre 12 e 24 anticorpos variantes são gerados e testados. Genes decadeia pesada e leve completos compreendendo regiões V modificadas e Chumanas são então clonados em vetores de expressão e os plasmídeossubseqüentes introduzidos em linhagens celulares para a produção do anti-corpo inteiro. Os anticorpos são então comparados em ensaios bioquímicose biológicos apropriados, e a variante ótima é identificada.
Anticorpos antagonistas de NgR1, ou fragmentos destes, parauso nos métodos da presente invenção podem ser gerados por qualquermétodo adequado conhecido na técnica. Anticorpos policlonais podem serproduzidos por vários procedimentos bem-conhecidos na técnica. Por exem-pio, um fragmento imunoespecífico de NgR1 pode ser administrado a váriosanimais hospedeiros incluindo, mas não limitados, a coelhos, camundongo,ratos, etc. para induzir a produção de soros contendo anticorpos policlonaisespecíficos para o antígeno. Vários adjuvantes podem ser usados para au-mentar a resposta imunológica, dependendo da espécie de hospedeiro, eincluem, mas, não são limitados a, adjuvante de Freund (completo e incom-pleto), géis minerais, tal como hidróxido de alumínio, substâncias ativas nasuperfície, tal como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos,emulsões oleosas, hemocianinas de keyhole limpet, dinitrofenol, e adjuvan-tes humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Tais adjuvantes também são bem-conhecidos na técnica.
Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando umagrande variedade de metodologias conhecidas na técnica, incluindo o uso detecnologias de hibridoma, recombinantés e de apresentação em fago, ouuma combinação destas. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem serproduzidos usando metodologias de hibridoma incluindo aquelas conhecidasna técnica e ensinadas, por exemplo, em Harlow et ai, Antibodies: A Labora-tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2- ed. (1988); Hammer-Iing et al., em: Monoclonal Antibodies and T- Cell Hybridomas Elsevier, N.Y.,563-681 (1981) (as ditas referências incorporadas por referência nas suastotalidades). O termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui, não é Iimita-do a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. O termo "an-ticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que é derivado de um únicoclone, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico ou de fago, e não aométodo pelo qual ele é produzido. Dessa forma, o termo "anticorpo mono-clonal" não é limitado a anticorpos produzidos através da tecnologia de hi-bridoma. Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma gran-de variedade de metodologias conhecidas na técnica incluindo o uso de tec-nologia de hibridoma, recombinante e de apresentação em fago.
Usando protocolos reconhecidos na técnica, em um exemplo,anticorpos são criados em mamíferos por injeções subcutâneas ou intraperi-toneais do antígeno relevante (por exemplo, antígenos de NgR1 purificadosou células ou extratos celulares contendo tais antígenos) e um adjuvante.Essa imunização faz surgir tipicamente uma resposta imune que compreen-de a produção de anticorpos reativos para o antígeno de esplenócitos e Iin-fócitos ativados. Enquanto os anticorpos resultantes podem ser colhidos dosoro dos animais para fornecer preparações policlonais, é freqüentementedesejado isolar linfócitos individuais do baço, nodos linfáticos ou sangue pe-riférico para fornecer preparações homogêneas de anticorpos monoclonais(MAbs). Preferivelmente, os linfócitos são obtidos do baço.
Nesse processo bem-conhecido (Kohler et al, Nature 256:495(1975)) os linfócitos de vida relativamente curta, ou mortais, de um mamíferoque foi injetado com o antígeno são fundidos com uma linhagem celular tu-moral imortal (por exemplo, uma linhagem celular de mieloma), produzindoassim células híbridas ou "hibridomas" que são imortais e capazes de pro-duzir anticorpo codificado geneticamente da célula B. os híbridos resultantessão segregados em estirpes genéticas únicas por seleção, diluição, e reculti-vo com cada estirpe individual compreendendo genes específicos para aformação de um único anticorpo. Elas produzem anticorpos que são homo-gêneos contra um antígeno desejado e, em relação a sua porcentagem ge-nética pura, são chamamos "monoclonais".
Células de hibridoma preparadas dessa forma são semeadas ecultivadas em um meio de cultura adequado que contém preferivelmenteuma ou mais substâncias que inibem o crescimento e sobrevivência de célu-las de mieloma não-fundidas, parentais. Aqueles versados na técnica avalia-rão que reagentes, linhagens celulares e meios para a formação, seleção ecrescimento dos hibridomas são disponíveis comercialmente a partir de vá-rias fontes e protocolos padronizados são bem estabelecidos. Geralmente, omeio de cultura no qual as células de hibridoma são cultivadas é testadoquanto à produção de anticorpos monoclonais contra o antígeno desejado.Preferivelmente, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonaisproduzidos pelas células de hibridoma é determinada por ensaios in vitro, talcomo, imunoprecipitação, radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorven-te ligado à enzima (ELISA). Após terem sido identificadas as células de hi-bridoma que produzem anticorpos da especificidade, afinidade e/ou ativida-de desejada, os clones podem ser subclonados por procedimentos de dilui-ção Iimitante e cultivados por métodos usuais (Goding, Monoclonal Antibodi-es: Principies and Practice, Academic Press, pp 59-103 (1986)). Ainda seráavaliado que os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones podemser separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro por procedimentosde purificação convencionais, tais como, por exemplo, proteína-A, cromato-grafia em hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia deafinidade.
Fragmentos de anticorpo que reconhecem epitopos específicospodem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, fragmentos Fab eF(ab')2 podem ser produzidos por clivagem proteolítica de moléculas de i-munoglobulina, usando enzimas tais como papaína (para produzir fragmen-tos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab')2). Fragmentos F(ab')2contêm a região variável, a região constante de cadeia leve e o domínio CH1da cadeia pesada.
Aqueles versados na técnica também avaliarão que DNA quecodifica anticorpos ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, sítios de liga-ção de antígeno) também pode ser derivado de bibliotecas de fago de anti-corpo. Em uma particular, tal fago pode ser utilizado para apresentar domí-nios de ligação de antígeno expressos a partir de um repertório ou bibliotecade anticorpo combinatória (por exemplo, humana ou de murino). Fagos queexpressam um domínio de ligação de antígeno que se liga ao antígeno deinteresse podem ser selecionados ou identificados com antígeno, por exem-plo, usando antígeno marcado ou antígeno ligado ou capturado a uma su-perfície sólida ou esfera (bead). Fagos usados nestes métodos são tipica-mente fagos filamentosos incluindo domínios de ligação fd e M13 expressosa partir de fagos com domínios de anticorpo Fab, Fv ou Fv estabilizados pordissulfeto fundidos de forma recombinante à proteína do gene Ill ou do geneVlll do fago. Métodos exemplares são descritos, por exemplo, em EP 368684 B1; patente U.S. 5.969.108, Hoogenboom, H.R. & Chames, Immunol.Today 27:371 (2000); Nagy et ai Nat. Med. 0:801 (2002); Huie et al, Proc.Natl. Acad. Sci USA 98:2682 (2001); Lui et ai, J. Moi Bioi 315:1063 (2002),cada um dos quais está incorporado aqui por referência. Várias publicações(por exemplo, Marks et ai, Bio/Technology 70:779-783 (1992)) descreverama produção de anticorpos humanos de alta afinidade por embaralhamento decadeia, assim como infecção combinatória e recombinação in vivo comouma estratégia para construir grandes bibliotecas de fagos. Em outras moda-lidades, apresentação ribossomal pode ser usada para substituir bacteriófa-gos como a plataforma de apresentação (veja, por exemplo, Hanes et ai,Nat. BiotechnoL 75:1287 (2000); Wilson et al, Proc. Nati Acad. Sci USA98:3750 (2001); ou Irving et ai, J. Immunoi Methods 24&Ά\ (2001)). Aindaem outra modalidade, bibliotecas de superfície de célula podem ser rastrea-das por anticorpos (Boder et al., Proc. Nati Acad. Sci USA 97: 10701 (2000);Daugherty et al., J. Immunoi Methods 243:211 (2000)). Tais procedimentosfornecem alternativas às técnicas de hibridoma tradicionais para o isolamen-to e subseqüente clonagem de anticorpos monoclonais.
Em métodos de apresentação em fago, domínios de anticorposfuncionais são apresentados sobre a superfície das partículas de fago quecarregam as seqüências de polinucleotídeo que as codificam. Em particular,seqüências de DNA que codificam regiões de VH e VL são amplificadas debibliotecas de cDNA animal (por exemplo, bibliotecas de cDNA de tecidoslinfóides de humano ou murino) ou bibliotecas de cDNA sintéticas. Em certasmodalidades, o DNA que codifica as regiões de VH e VL são unidos juntospor um Iigante de scFv por PCR e clonados em um vetor de fagomídeo (porexemplo, ρ CANTAB 6 ou pComb 3 HSS). O vetor é eletroporado em E. colie a E. coli é infectada com um fago auxiliar. Fagos usados nesses métodossão tipicamente fagos filamentosos incluindo fd e M13 e as regiões de VH eVL são geralmente fundidas de forma recombinante ao gene Ill ou ao geneVlll de fago. Fagos que expressam um domínio de ligação de antígeno quese liga a um antígeno de interesse (isto é um polipeptídeo de NgR1 ou umfragmento deste) podem ser selecionados ou identificados com antígeno, porexemplo, usando antígeno marcado ou antígeno ligado ou capturado a umasuperfície sólida ou esfera.
Exemplos adicionais de métodos de apresentação em fago quepodem ser usados para fazer os anticorpos incluem aqueles descritos emBrinkman et al., J. Immunol. Methods 752:41-50 (1995); Ames et ai, J. Im-munol. Methods 784:177-186 (1995); Kettleborough et al, Eur. J. Immunol24:952-958 (1994); Persic et ai, Gene 187:9-18 (1997); Burton et al, Ad-vances in Immunology 57:191-280 (1994); Pedido PCT No.PCT/GB91/01134; publicações PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e Pat.U.S. Nos. 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908;5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225;5.658.727; 5.733.743 e 5.969.108; cada um dos quais está incorporado aquipor referência na sua totalidade.
Como descrito nas referências acima, após a seleção dos fagos,as regiões codificantes de anticorpo dos fagos podem ser isoladas e usadaspara gerar anticorpos inteiros, incluindo anticorpos humanos, ou qualqueroutro fragmento de ligação de antígeno desejado, e expressas em qualquerhospedeiro desejado, incluindo células de mamífero, células de inseto, célu-las de planta, leveduras e bactérias. Por exemplo, técnicas para produzirrecombinantemente fragmentos Fab, Fab' e F(ab')2 também podem ser em-pregados usando métodos conhecidos na técnica tais como aqueles descri-tos na Publicação PCT WO 92/22324; Mullinax et al, BioTechniques12(6):864-869 (1992); e Sawai et al, AJRI 34:26-34 (1995); e Better et al,Science 240: 1041-1043 (1988) (as ditas referências estão incorporadas porreferência nas suas totalidades).
Exemplos de técnicas que podem ser usadas para produzir Fvse anticorpos de cadeia única incluem aquelas descritos nas Pat. U.S. Nos.4.946.778 e 5.258.498; Huston et al, Methods in Enzymology 205:46-88(1991); Shu et al, PNAS 90:7995-7999 (1993); e Skerra et al, Science240·. 1038-1040 (1988). Para alguns usos, incluindo uso in vivo de anticorposem seres humanos e ensaios de detecção in vitro, pode ser preferível usaranticorpos quiméricos, humanizados ou humanos. Um anticorpo quimérico éuma molécula na qual diferentes porções do anticorpo são derivadas de es-pécies animais diferentes, tal como anticorpos que têm uma região variávelderivada um anticorpo monoclonal murino e uma região constante de imu-noglobulina humana. Métodos para produzir anticorpos quiméricos são co-nhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985);Oi et al, BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al, J. Immunol. Methods125:191-202 (1989); Pat. U.S. Nos. 5.807.715; 4.816.567; e 4.816397, queestão incorporadas aqui por referência nas suas totalidades. Anticorpos hu-manizados são moléculas de anticorpo de espécies não-humanas que seligam ao antígeno desejado tendo uma ou mais regiões de determinação decomplementaridade (CDRs) das espécies não-humanas e regiões de estru-tura principal de uma molécula de imunoglobulina humana. Freqüentemente,resíduos de estrutura principal nas regiões de estrutura principal humanasserão substituídos pelo resíduo correspondente do anticorpo doador de CDRpara alterar, preferivelmente, melhorar, a ligação ao antígeno. Essas substi-tuições no estrutura principal são identificadas por métodos bem-conhecidosna técnica, por exemplo, por modelagem das interações da CDR e resíduosdo estrutura principal para identificar resíduos do estrutura principal impor-tantes para a ligação ao antígeno e comparação de seqüência para identifi-car resíduos de estrutura principal incomuns em posições particulares (veja,por exemplo, Queen et al, Pat. U.S. No. 5.585.089; Riechmann et al, Nature332:323 (1988), que estão incorporadas aqui por referência nas suas totali-dades). Anticorpos podem ser humanizados usando uma variedade de me-todologias conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, enxerto de CDR(EP 239.400; publicação PCT WO 91/09967; Pat. U.S. Nos. 5.225.539;5.530.101; e 5.585.089), "veneering" ou "resurfacing" (EP 592.106; EP519.596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnickaet al, Protein Engineering 7(6j:805-814 (1994); Roguska. et al, PNAS91:969-973 (1994)), e embaralhamento de cadeia (Pat. U.S. No. 5.565.332).
Anticorpos completamente humanos são particularmente dese-jáveis para tratamento terapêutico de pacientes humanos. Anticorpos huma-nos podem ser feitos por uma variedade de métodos conhecidos na técnicaincluindo métodos de apresentação em fago descritos acima usando biblio-tecas de anticorpo derivadas de seqüências de imunoglobulina humana. Ve-ja também, Pat. U.S. Nos. 4.444.887 e 4.716.111; e publicações PCT WO98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO96/33735, e WO 91/10741; cada uma das quais está incorporada aqui porreferência na sua totalidade.
Anticorpos humanos também podem ser produzidos usando ca-mundongos transgênicos que são incapazes de expressar imunoglobulinasendógenas funcionais, mas que podem expressar genes de imunoglobulinahumana. Por exemplo, os complexos de genes de imunoglobulina de cadeiapesada e leve humana podem ser introduzidos aleatoriamente ou por re-combinação homóloga em células-tronco embrionárias de camundongo. Al-ternativamente, a região variável humana, região constante, e região de di-versidade podem ser introduzidas em células-tronco embrionárias de ca-mundongo em adição aos genes humanos de cadeia pesada e leve. Os ge-nes de imunoglobulina de cadeia pesada e leve de camundongo podem sertornados não-funcionais separadamente ou simultaneamente com a introdu-ção de Ioci de imunoglobulina humana por recombinação homóloga. Em par-ticular, a deleção homozigótica da região JH impede a produção de anticor-po endógeno. As células-tronco embrionárias modificadas são expandidas emicroinjetadas em blastocistos para produzir camundongos quiméricos. Oscamundongos quiméricos são então cruzados para produzir prole homozigo-ta que expressa anticorpos humanos. Os camundongos quiméricos são en-tão imunizados no modo normal com um antígeno selecionado, por exemplo,toda ou uma porção de um polipeptídeo-alvo desejado. Anticorpos monoclo-nais direcionados contra o antígeno podem ser obtidos a partir do camun-dongo transgênico imunizado usando tecnologia de hibridoma convencional.Os transgenes de imunoglobulina humana carregados pelos camundongostransgênicos sofrem rearranjo durante a diferenciação de células-B, e sub-seqüentemente sofrem troca de classe e mutação somática. Dessa forma,usando tal técnica, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE tera-peuticamente úteis. Para um resumo dessa tecnologia para produzir anticor-pos humanos, veja, Lonberg & Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995).Para uma discussão detalhada dessa tecnologia para produzir anticorposhumanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para produzir taisanticorpos, veja, por exemplo, as publicações PCT WO 98/24893; WO96/34096; WO 96/33735; Pat. U.S. Nos. 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425;5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; e 5.939.598 que estão incorpo-radas aqui por referência nas suas totalidades. Além disso, empresas taiscomo Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) e GenPharm (San Jose, Calif.) podemser contratadas para fornecer anticorpos humanos direcionados contra umantígeno selecionado usando tecnologia similar àquela descrita acima.
Anticorpos completamente humanos que reconhecem um epito-po selecionado podem ser gerados usando uma técnica referida como "sele-ção guiada". Nessa abordagem, um anticorpo monoclonal não-humano sele-cionado, por exemplo, um anticorpo de camundongo é usado para guiar aseleção de um anticorpo completamente humano que reconhece o mesmoepitopo (Jespers et ai, Bio/Technology 12.899-903 (1988)). Veja também,Patente U.S. No. 5.565.332.
Em outra modalidade, DNA que codifica anticorpos monoclonaisdesejados podem ser facilmente isolados e seqüenciados usando procedi-mentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeoque são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as ca-deias pesada e leve de anticorpos murinos). As células de hibridoma isola-das e subclonadas servem como uma fonte preferida do tal DNA. Uma vezisolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são entãotransfectados em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas tais co-mo células de E. coli, células COS de símio, células de Ovário de HamsterChinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem imunoglobulinas deoutra maneira. Mais particularmente, o DNA isolado (que pode ser sintéticoconforme descrito aqui) pode ser usado para clonar seqüências da regiãoconstante e variável para os anticorpos produzidos conforme descrito emNewman et ai, Pat. U.S. No. 5.658.570, depositada em 25 de janeiro de1995, que está incorporada aqui por referência. Basicamente, isso exige aextração de RNA das células selecionadas, conversão para cDNA, e amplifi-cação por PCR usando iniciadores específicos de lg. Iniciadores adequadospara essa finalidade também são descritos na Pat. U.S. 5.658.570. Comoserá discutido em mais detalhes abaixo, células transformadas que expres-sam os anticorpos desejados podem ser cultivadas em quantidades relati-vãmente grandes para fornecer suprimentos clínicos e comerciais da imuno-globulina.
Em uma modalidade específica, a seqüência de aminoácido dosdomínios variáveis de cadeia pesada e/ou leve pode ser inspecionada paraidentificar as seqüências das regiões de determinação de complementarida-de (CDRs) por métodos que são bem-conhecidos na técnica, por exemplo,por comparação a seqüências de aminoácido conhecidas de outras regiõesvariáveis de cadeia pesada e leve para determinar as regiões de hipervaria-bilidade de seqüência. Usando técnicas de DNA recombinante de rotina,uma ou mais das CDRs podem ser inseridas dentro de regiões de estruturaprincipal, por exemplo, dentro de regiões de estrutura principal humanas pa-ra humanizar um anticorpo não-humano. As regiões de estrutura principalpodem ser regiões de estrutura principal que ocorrem naturalmente ou con-senso, e preferivelmente regiões de estrutura principal humanas (veja, porexemplo, Chothia et al, J. MoL BioL 278:457-479 (1998) para umas listagemde regiões de estrutura principal humanas), Preferivelmente, o polinucleotí-deo gerado pela combinação das regiões de estrutura principal e CDRs codi-fica um anticorpo que se liga especificamente a pelo menos um epitopo deum polipeptídeo desejado, por exemplo, NgR1. Preferivelmente, uma oumais substituições de aminoácido podem ser feitas dentro das regiões deestrutura principal, e preferivelmente as substituições de aminoácido melho-ram a ligação do anticorpo ao seu antígeno. Adicionalmente, tais métodospodem ser usados para fazer substituições ou deleções de aminoácido deum ou mais resíduos de cisteína da região variável que participam em umaligação de dissulfeto intracadeia para gerar moléculas de anticorpo que nãotêm uma ou mais ligações de dissulfeto intracadeia. Outras alterações aopolinucleotídeo são abrangidas pela presente invenção e estão dentro doconhecimento da técnica.
Além disso, técnicas desenvolvidas para a produção de "anticor-pos quiméricos" (Morrison et al, Proc. NatL Acad. Sei. USA 81:851-855(1984); Neuberger et al, Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al, Nature374:452-454 (1985)) por combinar genes de uma molécula de anticorpo decamundongo de especificidade de antígeno apropriada junto com genes deuma molécula de uma molécula de anticorpo humano de atividade biológicaapropriada podem ser usadas. Como usado aqui, um anticorpo quimérico éuma molécula na qual diferentes porções são derivadas de diferentes espé-cies de animais, tais como aquelas que têm uma região variável derivada deum anticorpo monoclonal murino e uma região constante de imunoglobulinahumana, por exemplo, anticorpos humanizados.
Alternativamente, técnicas descritas para a produção de anticor-pos de cadeia única (Pat. U.S. No. 4.694.778; Bird, Science 242:423-442(1988); Huston etal, Proc. Natl. Acad. SciUSA 85:5879-5883 (1988); e Wardet al, Nature 334:544-554 (1989)) podem ser adaptadas para produzir anti-corpos de cadeia única. Anticorpos de cadeia única são formados por ligaros fragmentos de cadeia pesada e leve da região Fv através de uma ligaçãode aminoácido, resultando em um anticorpo de cadeia única. Técnicas paraa montagem de fragmentos Fv funcionais em E. coli também podem ser u-sadas (Skerra etal, Science 242:1038-1041 (1988)).
Anticorpos antagonistas de NgR1 também pode ser anticorposhumanos ou substancialmente humanos gerados em animais transgênicos(por exemplo, camundongos) que são incapazes de produzir imunoglobulinaendógena (veja Pat. U.S. Nos. 6.075.181. 5.939.598. 5.591.669 e 5.589.369cada uma das quais está incorporada aqui por referência). Por exemplo, foidescrito que a deleção homozigota da região de união da cadeia pesada doanticorpo em camundongos mutantes de linhagem germinativa e quiméricosresulta na inibição completa da produção de anticorpo endógeno. A transfe-rência de um conjunto de genes de imunoglobulina humana para tais ca-mundongos mutantes de linhagem germinativa resultará na produção de an-ticorpos humanos mediante estimulo antigênico. Outro meio preferido degerar anticorpos humanos usando camundongos SCID é descrito na Pat.U.S. No. 5.811.524 que está incorporada aqui por referência. Será avaliadoque o material genético associado com esses anticorpos humanos tambémpode ser isolado e manipulado como descrito aqui.
Outro meio altamente eficaz para gerar anticorpos recombinan-tes é descrito por Newman, Biotechnology 10: 1455-1460 (1992). Especifi-camente, essa técnica resulta na geração de anticorpos primatizados quecontêm domínios variáveis de macaco e seqüências constantes humanas.Essa referência está incorporada por referência aqui na sua totalidade. Alémdisso, essa técnica também é descrita nas Pat. U.S. Nos. 5.658.570.5.693.780 e 5.756.096 designadas em comum, cada uma das quais estáincorporada que por referência.
Em outra modalidade, linfócitos podem ser selecionados por mi-cromanipulação e os genes variáveis isolados. Por exemplo, células mono-nucleares de sangue periférico podem ser isoladas de um mamífero imuni-zado e cultivadas por cerca de 7 dias in vitro. As culturas podem ser rastrea-das por IgGs específicas que satisfazem os critérios do rastreamento. Ascélulas de cavidades positivos podem ser isoladas. Células B produtoras deIg individuais podem ser isoladas por FACS ou por identificação delas emum ensaio de placa de hemólise mediada pelo complemento. Células B pro-dutoras de Ig podem ser micromanipuladas em um tubo e os genes de VH eVL podem ser amplificados usando, por exemplo, RT-PCR. Os genes de VHe VL podem ser clonados em um vetor de expressão de anticorpo e transfec-tadas em células (por exemplo, células eucarióticas ou procarióticas) paraexpressão.
Alternativamente, linhagens celulares produtoras de anticorpopodem ser selecionadas e cultivadas usando metodologias bem-conhecidasdo versado na técnica. Tais metodologias são descritas em uma variedadede manuais de laboratório e publicações primárias. Com relação a isso, téc-nicas adequadas para uso na invenção, conforme descrito abaixo, são des-critas em Current Protocols in Immunology, Coligan et ai, Eds., Green Publi-shing Associates & WiIey-InterScience, John Wiley & Sons, Nova Iorque(1991) que está aqui incorporada por referência na sua totalidade, incluindosuplementos.
Anticorpos para uso nos métodos terapêuticos aqui contidos po-dem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica para a sínte-se de anticorpo, em particular, por síntese química, ou preferivelmente, portécnicas de expressão recombinante descritas aqui.
Será avaliado ainda que o escopo dessa invenção ainda abran-ge todos os alelos, variantes e mutações de seqüências de DNA de ligaçãode antígeno.
Como é sabido, RNA pode ser isolado das células de hibridomaoriginais ou de outras células transformadas por técnicas usuais, tal comoextração e precipitação com isotiocianato de guanidínio seguido por centrifu-gação ou cromatografia. Onde desejável, mRNA pode ser isolado a partir doRNA total por técnicas usuais tal como cromatografia em oligo dT celulose.Técnicas adequadas são conhecidas na técnica.
Em uma modalidade, cDNAs que codificam as cadeias leve epesada do anticorpo podem ser feitos, tanto simultaneamente como separa-damente, usando transcriptase reversa e DNA polimerase de acordo commétodos bem-conhecidos. PCR pode ser iniciado por iniciadores consensoda região constante ou por iniciadores mais específicos baseados nas se-qüências publicadas de DNA e aminoácido das cadeias pesada e leve. Co-mo discutido acima, PCR também pode ser usado para isolar clones de DNAque codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo. Nesse caso as biblio-tecas podem ser rastreadas por iniciadores consenso ou sondas homólogasmaiores tais como sondas de região constante de camundongo.
DNA, tipicamente DNA de plasmídeo, pode ser isolado das célu-las usando metodologias conhecidas na técnica, mapeado por restrição eseqüenciado de acordo com técnicas usuais, bem-conhecidas descritas emdetalhes, por exemplo, nas referências anteriores relacionadas a técnicas deDNA recombinante. Logicamente, o DNA pode ser sintético de acordo com apresente invenção em qualquer ponto durante o processo de isolamento ouanálise subseqüente.
Expressão recombinante de um anticorpo, ou fragmento, deriva-do ou análogo deste, por exemplo, uma cadeia pesada ou leve de um anti-corpo que é um antagonista de NgR1, requer a construção de um vetor deexpressão que contém um polinucleotídeo que codifica o anticorpo. Uma vezque um polinucleotídeo que codifica uma molécula de anticorpo ou uma ca-deia pesada ou leve de um anticorpo, ou uma porção desta (preferivelmentecontendo o domínio variável de cadeia pesada ou leve), da invenção foi obti-do, o vetor para a produção da molécula de anticorpo pode ser produzidopor tecnologia de DNA recombinante usando metodologias bem-conhecidasna técnica. Dessa forma, métodos para preparar uma proteína por expressarum polinucleotídeo que contém uma seqüência de nucleotídeo que codificaum anticorpo são descritos aqui. Métodos que são bem-conhecidos daque-Ies versados na técnica podem ser usados para construir vetores de expres-são que contêm seqüências codificantes de anticorpo e sinais de controletranscricional e traducional apropriados. Esses métodos incluem, por exem-plo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas, e recombina-ção genética in vivo. A invenção, dessa forma, proporciona vetores replicá-veis que compreendem uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma mo-lécula de anticorpo da invenção, ou uma cadeia pesada ou leve desta, ouum domínio variável de cadeia pesada ou leve, operativamente ligada a umpromotor. Tais vetores podem incluir a seqüência de nucleotídeo que codifi-ca a região constante da molécula de anticorpo (veja, por exemplo, Publica-ção PCT WO 86/05807; Publicação PCT WO 89/01036; e Pat. U.S. No.5.122.464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado em tal vetorpara expressão na cadeia pesada ou ieve nativa.
O vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeirapor técnicas convencionais e as células transfectadas são então cultivadaspor técnicas convencionais para produzir um anticorpo para isso nos méto-dos descritos aqui. Dessa forma, a invenção inclui células hospedeiras quecontêm um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção, ou umacadeia pesada ou leve deste, operativamente ligado a um promotor heteró-logo. Em modalidades preferidas para a expressão de anticorpos de cadeiadupla, vetores que codificam ambas as cadeias pesada e leve podem ser co-expressos na célula hospedeira para expressão da molécula de imunoglobu-Iina completa, como detalhado abaixo.
Uma variedade de sistemas de vetor de expressão em hospedei-ro pode ser utilizada para expressar moléculas de anticorpo para uso nosmétodos descritos aqui. Tais sistemas de expressão em hospedeiro repre-sentam veículos pelos quais as seqüências codificantes de interesse podemser produzidas e subseqüentemente purificadas, mas também representamcélulas que podem, quando transformadas ou infectadas com as seqüênciascodificantes de nucleotídeo apropriadas, expressar uma molécula de anti-corpo da invenção in situ. Estes incluem, mas não são limitados, a microor-ganismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli, B. subtilis) transforma-das com vetores de expressão de DNA de bacteriófago, DNA de plasmídeoou DNA de cosmídeo recombinante contendo seqüências codificantes deanticorpo; leveduras (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadascom vetores de expressão de levedura recombinantes contendo seqüênciascodificantes de anticorpo; sistemas de células de inseto infectadas com veto-res de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, baculovírus) con-tendo seqüências codificantes de anticorpo; sistemas de células de plantainfectadas com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo,vírus do mosaico da couve flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) outransformadas com vetores de expressão de plasmídeo recombinantes (porexemplo, plasmídeo Ti) contendo seqüências codificantes de anticorpo; ousistemas de células de mamíferos (por exemplo, células COS, CHO, BLK,293, 3T3) carregando constructos de expressão recombinante que contêmpromotores derivados do genoma de células de mamífero (por exemplo,promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o pro-motor tardio de adenovírus; o promotor do vírus da vacínia de 7,5K). Preferi-velmente, células bacterianas tais como Eseheriehia coli, e mais particular-mente, células eucarióticas, especialmente para a expressão de molécula deanticorpo recombinante inteira, são usadas para a expressão de uma molé-cula de anticorpo recombinante. Por exemplo, células de mamífero, assimcomo, células de ovário de hamster chinês (CHO), em conjunto com um ve-tor tal como o elemento do promotor de gene precoce intermediário principalde citomegalovírus humano é um sistema de expressão eficaz para anticor-pos (Foecking et ai, Gene 45:101 (1986); Cockett et al, Bio/Teehnology 8:2(1990)).
Em sistemas bacterianos, vários vetores de expressão podemser vantajosamente selecionados dependendo do uso pretendido para a mo-lécula de anticorpo sendo expressa. Por exemplo, quando uma grande quan-tidade de uma tal proteína deve ser produzida, para a geração de composi-ções farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, vetores que direcionam aexpressão de altos níveis de produtos de proteínas de fusão que são facil-mente purificados podem ser desejáveis. Tais vetores incluem, mas não sãolimitados, ao vetor de expressão de E. coli pUR278 (Ruther et ai, EMBO J. 2:1791 (1983)), no qual a seqüência codificante do anticorpo pode ser ligadaindividualmente no vetor in frame com a região codificante de IacZ para quea proteína de fusão seja produzida; vetores pIN (Inouye & lnouye, NucleicAcids Res. 73:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol Chem.24:5503-5509 (1989)); e semelhantes. Vetores pGEX também podem serusados para expressar polipeptídeos estranhos como proteínas de fusãocom glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão sãosolúveis e podem ser facilmente purificadas das células Iisadas por adsorçãoe ligação a uma matriz de esferas de glutationa-agarose seguido por eluiçãona presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são desenhados para in-cluir sítios de clivagem de protease trombina ou fator Xa para que o produtodo gene alvo clonado possa ser liberado da porção de GST.
Em um sistema de inseto, o vírus da poliedrose nuclear de Auto-grapha californica (AcNPV) é tipicamente usado como um vetor para expres-sar genes estranhos. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. Aseqüência codificante de anticorpo pode ser clonada individualmente emregião não-essenciais (por exemplo, o gene de poliedrina) do vírus e coloca-da sob o controle de um promotor de AcNPV (por exemplo, o promotor depoliedrina).
Em células hospedeiras de mamífero, vários sistemas de ex-pressão a base de vírus podem ser utilizados. Nos casos onde um adenoví-rus é usado como um vetor de expressão, a seqüência codificante do anti-corpo de interesse pode ser ligada a um complexo de controle de transcri-ção/tradução de adenovírus, por exemplo, o promotor tardio e seqüêncialíder tripartida. Esse gene quimérico pode então ser inserido no genoma doadenovírus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção em uma regiãonão-essencial do genoma viral (por exemplo, região E1 ou E3) resultará emum vírus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula de an-ticorpo em hospedeiros infectados (por exemplo, veja Logan & Shenk, Proc.Natl. Acad. Sci USA 81\355-359 (1984)). Sinais de início específicos podemtambém ser necessários para tradução eficaz de seqüências codificantesinseridas. Esses sinais incluem o códon de início ATG e seqüências adja-centes. Além disso, o códon de inicio deve estar in phase com a fase de lei-tura da seqüência codificante desejada para garantir a tradução do insertointeiro. Esses sinais de controle traducional exógenos e códons de início po-dem ser de uma variedade de origens, tanto natural como sintética. A eficá-cia de expressão pode ser aumentada pela inclusão de elementos intensifi-cadores de transcrição apropriados, terminadores de transcrição, etc. (vejaBittner et al, Methods in EnzymoL 153:51 -544 (1987)).
Além disso, pode ser escolhida uma cepa de célula hospedeiraque modula a expressão das seqüências inseridas, ou modifica e processa oproduto gênico da forma específica desejada. Tais modificações (por exem-plo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos deproteína podem ser importantes para a função da proteína. Células hospe-deiras diferentes têm características e mecanismos específicos para o pro-cessamento pós-traducional e modificação de proteínas e produtos gênicos.Linhagens celulares ou sistemas hospedeiros apropriados podem ser esco-lhidos para garantir a modificação e processamento corretos da proteína es-tranha expressa. Para essa finalidade, células hospedeiras eucarióticas quepossuem o maquinário celular para processamento apropriado do transcritoprimário, glicosilação e fosforilação do produto gênico podem ser usadas.Tais células hospedeiras de mamífero incluem, mas não são limitadas aCHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, e em particular, li-nhagens celulares de câncer de mama tal como, por exemplo, BT483,Hs578T, HTB2, BT20 e T47D, e linhagem celular de glândula mamária nor-mal tal como, por exemplo, CRL7030 e Hs578Bst.
Para produção de proteínas recombinantes a longo prazo e comalto rendimento, expressão estável é preferida. Por exemplo, linhagens celu-lares que expressam estavelmente a molécula de anticorpo podem ser ma-nipuladas. Ao invés de usar vetores que expressão que contêm origens dereplicação virais, células hospedeiras podem ser transformadas com DNAcontrolado por elementos de controle de expressão apropriados (por exem-plo, seqüências promotoras, intensificadoras, terminadores de transcrição,sítios de poliadenilação, etc), e um marcador selecionável. Após a introdu-ção do DNA estranho, células manipuladas podem ser deixadas crescer por1-2 dias em um meio enriquecido, e então são passadas para um meio sele-tivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistên-cia à seleção e permite que as células se integrem estavelmente ao plasmí-deo nos seüs cromossomos e cresçam para formar focos que por sua vezpodem ser clonados e expandidos em linhagens celulares. Esse método po-de ser usado vantajosamente para manipular linhagens celulares que ex-pressam estavelmente a molécula de anticorpo.
Vários sistemas de seleção podem ser usados, incluindo, masnão limitados aos genes de timidina quinase do vírus do herpes simples (Wi-gler et al., Cell 11:223 (1977)), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase(Szybalska & Szybalski, Proc. Nati Acad. Sci USA 48:202 (1992)), e adeninafosforibosiltransferase (Lowy et al., Cell 22:817 1980) podem ser usados nascélulas-tk, -hgprt ou aprt, respectivamente. Ainda, resistência a antimetabóli-tos pode ser usada como a base de seleção para os seguintes genes: dhfr,que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., Proc. Nati Acad. SciUSA 77:357 (1980); O1Hare etal, Proc. Nati Acad. Sci USA 78:1527 (1981));gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc.Nati Acad. Sci USA 78:2072 (1981)); neo, que confere resistência ao ami-noglicosídeo G-418 Clinicai Pharmacy 12:488-505; Wu & Wu, Biotherapy3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicoi 32:573-596(1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); e Morgan & Anderson, Ann.Rev. Biochem. 62:191-211 (1993); TIB TECH 11(5):155-215 (maio, 1993); ehygro, que confere resistência a higromicina (Santerre et al, Gene 30:147(1984). Métodos comumente usados na técnica de tecnologia de DNA re-combinante que podem ser usados são descritos em Ausubel et al (eds.),Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Krie-gler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press,NY (1990); e nos capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocolsin Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al.,J. Mol. Bioi 150Λ (1981), que estão aqui incorporados por referência nassuas totalidades.
Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podemser aumentados por amplificação de vetor (para uma revisão, veja Bebbing-ton & Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the ex-pression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, AcademicPress, Nova Iorque, Vol. 3. (1987)). Quando um marcador no sistema dovetor que expressa o anticorpo é amplificável, o aumento no nível do inibidorpresente na cultura da célula hospedeira aumentará o número de cópias dogene marcador. Já que a região amplificada está associada com o gene doanticorpo, a produção do anticorpo também aumentará (Crouse et al., Mol.Cel. Biol. 3:257 (1983)).
A célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois vetoresde expressão da invenção, o primeiro vetor codificando um polipeptídeo de-rivado da cadeia pesada e o segundo vetor codificando um polipeptídeo de-rivado da cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores selecioná-veis idênticos que permitem expressão igual dos polipeptídeos de cadeiapesada e leve. Alternativamente, pode ser usado um único vetor que codificatanto os polipeptídeos de cadeia pesada como de cadeia leve. Em tais situa-ções, a cadeia leve é vantajosamente colocada antes da cadeia peada paraevitar excesso de cadeia pesada livre tóxica (Proudfoot, Nature 322:52(1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:2197 (1980)). As seqüênciascodificantes para as cadeias pesada e leve podem compreender cDNA ouDNA genômico.
Uma vez que uma molécula de anticorpo da invenção tenha sitoexpressa recombinantemente, ela pode ser purificada por qualquer métodoconhecido na técnica para purificação de uma molécula de imunoglobulina,por exemplo, por cromatografia (por exemplo, cromatografia de troca de íon,afinidade, particularmente por afinidade pelo antígeno específico após comProteína A, e cromatografia de coluna por tamanho), centrifugação, solubili-dade diferencial, ou por qualquer outra técnica usual para a purificação deproteínas. Alternativamente, um método preferido para aumentar a afinidadede anticorpos da invenção é descrito em US 2002 0123057 A1.
Em uma modalidade, uma molécula de ligação ou molécula deligação de antígeno para uso nos métodos da invenção compreende umaregião constante sintética em que um ou mais domínios são parcialmente oucompletamente deletados ("anticorpos com domínio deletado"). Em certasmodalidades, anticorpos modificados compatíveis compreenderão construc-tos com domínio deletado ou variantes em que todo o domínio CH2 foi re-movido (constructos ACh2). Para outras modalidades um pequeno peptídeode conexão pode ser substituído pelo domínio deletado para fornecer flexibi-lidade e liberdade de movimento para a região variável. Aqueles versados natécnica observarão que tais constructos são particularmente preferidos devi-do às propriedades regulatórias do domínio CH2 sobre a taxa catabólica doanticorpo.
Em certas modalidades, anticorpos modificados para uso nosmétodos descritos aqui são minicorpos. Minicorpos podem ser feitos usandométodos descritos na técnica (veja, por exemplo, patente U.S. 5.837.821 ouWO 94/09817A1).
Em outra modalidade, anticorpos modificados para uso nos mé-todos descritos aqui são anticorpos com domínio CH2 deletado que são co-nhecidos na técnica. Constructos com domínio deletado podem ser deriva-dos usando um vetor (por exemplo, de Biogen IDEC Incorporated) que codi-ficam um domínio constante humano de IgGI (veja, por exemplo, WO02/060955 A2 e WO 02/096948A2). Esse vetor exemplar foi manipulado pa-ra deletar o domínio CH2 e fornecer um vetor sintético que expressa umaregião constante de IgGI com domínio deletado;
Em uma modalidade, um anticorpo antagonista de NgR1, oufragmento deste, para uso nos métodos de tratamento descritos aqui, com-preende uma cadeia pesada de imunoglobulina que tem deleção ou substitu-ição de alguns ou mesmo um único aminoácido contanto que ela permita aassociação entre as subunidades monoméricas. Por exemplo, a mutação deum único aminoácido em áreas selecionadas do domínio CH2 pode ser sufi-ciente para reduzir substancialmente a ligação de Fc e assim aumentar alocalização do tumor. Similarmente, pode ser desejável simplesmente dele-tar aquela parte de um ou mais domínios da região constante que controlama função efetora (por exemplo, ligação de complemento) a ser modulada.Tais deleções parciais das regiões constantes podem melhorar característi-cas selecionadas do anticorpo (meia-vida sérica) enquanto deixam outrasfunções desejáveis associadas com o domínio da região constante em ques-tão intacto. Além disso, como mencionado acima, as regiões constantes dosanticorpos descritos podem ser sintéticas através da mutação ou substitui-ção de um ou mais aminoácidos, o que aumenta o perfil do constructo resul-tante. Em relação a isso, pode ser possível prejudicar a atividade fornecidapor um sítio de ligação conservado (por exemplo, ligação de Fc) enquanto semantém substancialmente a configuração e perfil imunogênico do anticorpomodificado. Outras modalidades ainda compreendem a adição de um oumais aminoácidos à região constante para aumentar as características dese-jáveis, tal como, função efetora ou fornecer mais ligação de citocina ou car-boidrato. Em tais modalidades pode ser desejável inserir ou replicar seqüên-cias específicas derivadas de domínios de regiões constantes selecionados.
A presente invenção também fornece o uso de anticorpos quecompreendem, consistem essencialmente em, ou consistem em, variantes(incluindo derivados) de moléculas de anticorpo (por exemplo, as regiões VHe/ou regiões VL) descritas aqui, cujos anticorpos ou fragmentos deste seligam imunoespecificamente a um polipeptídeo de NgR1. Metodologias usu-ais conhecidas daqueles versados na técnica podem ser usadas para intro-duzir mutações na seqüência de nucleotídeo que codifica uma molécula deligação, incluindo, mas não limitadas a, mutagênese sítio-direcionada e mu-tagênese mediada por PCR, o que resulta em substituições de aminoácido.Preferivelmente, as variantes (incluindo derivados) codificam menos do que50 substituições aminoácidos, menos do que 40 substituições de aminoáci-do, menos do que 30 substituições de aminoácido, menos do que 25 substi-tuições de aminoácido, menos do que 20 substituições de aminoácido, me-nos do que 15 substituições de aminoácido, menos do que 10 substituiçõesde aminoácido, ou menos do que 2 substituições de aminoácido em relaçãoà região VH de referência, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, região VL, VLC-DR1, VLCDR2, ou VLCDR3. Uma "substituição de aminoácido conservativa"é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de a-minoácido que tem uma cadeia lateral com uma carga similar. Famílias dosresíduos de aminoácido que têm cadeias laterais com cargas similares foramdefinidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias Iate-rais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas(por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares nãocarregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina,tirosina, cisteína), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina,leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias Iate-rais beta-ramifiçadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeiaslaterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).Alternativamente, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longode toda ou uma parte da seqüência codificante, tal como por mutagênesepor saturação, e os mutantes resultantes podem ser rastreados quanto àatividade biológica para identificar mutantes que retêm atividade.
Por exemplo, é possível introduzir mutações apenas em regiõesde estrutura principal ou apenas em regiões de CDR de uma molécula deanticorpo. Mutações introduzidas podem ser silenciosas ou mutações desentido invertido neutras, isto é, não têm efeito, ou têm pouco efeito sobreuma habilidade de um anticorpo se ligar ao antígeno. Esses tipos de muta-ções podem ser úteis para otimizar o uso de códon, ou melhorar a produçãode anticorpo do hibridoma. Alternativamente, mutações de sentido invertidonão neutras podem alterar a habilidade de um anticorpo se ligar ao antígeno.A localização da maioria das mutações silenciosas ou neutras é provavel-mente nas regiões de estrutura principal, enquanto que a localização damaioria das mutações de sentido invertido não-neutras é provavelmente nasCDRs, embora essa não seja uma condição absoluta. Um versado na técni-ca seria capaz de desenhar e testar moléculas mutantes com propriedadesdesejadas, tal como, nenhuma alteração na atividade de ligação de antígenoou alteração na atividade de ligação (por exemplo, aumento na atividade deligação de antígeno ou alteração na especificidade do anticorpo). Após amutagênese, a proteína codificada pode ser expressa rotineiramente e a ati-vidade funcional e/ou biológica da proteína codificada por ser determinadausando metodologias descritas aqui ou por metodologias de modificaçãorotineiras conhecidas na técnica.
Em resumo, um versado na técnica, munido com os ensinamen-tos dessa invenção, tem disponível uma variedade de métodos que podemser usados para alterar as propriedades biológicas dos anticorpos dessa in-venção, incluindo métodos que podem aumentar ou diminuir a estabilidadeou meia-vida, imunogenicidade, toxicidade, afinidade ou rendimento de umadada molécula de anticorpo, ou alterá-la de qualquer outra forma que possatorná-la mais adequada para uma aplicação particular.
Composições que compreendem, e usos dos anticorpos da pre-sente invenção são descritos abaixo.Polipeptídeos Solúveis de Receptor Noqo-1Proteína
O receptor Nogo-1 de extensão completa consiste em uma se-qüência de sinal, uma região N-terminal (NT), oito repetições ricas em Ieuci-na (LRR), uma região LRRCT (um domínio de repetição rico em Ieucina C-terminal das oito repetições ricas em leucina), uma região C-terminal (CT) euma âncora de GPI (veja a Figura 1).
As denominações dos domínios de NgR usadas aqui estão defi-nidas abaixo como o seguinte:
Tabela 1. Exemplos de domínios de NqR
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Algumas modalidades da invenção proporcionam um polipeptí-deo de receptor Nogo-1 solúvel. Polipeptídeos de receptor Nogo-1 solúveisda invenção compreendem um domínio NT; 8 LRRs e um domínio LRRCT enão têm uma seqüência de sinal e uma âncora de GPI funcional (isto é, nãotem âncora de GPI ou uma têm âncora de GPI que não possui habilidade dese associar eficientemente a uma membrana celular).
Em algumas modalidades, um polipeptídeo de receptor Nogo-1solúvel compreende uma LRR heteróloga. Uma LRR heteróloga significauma LRR obtida de uma proteína diferente do receptor Nogo-1. Proteínasexemplares a partir das quais uma LRR heteróloga pode ser obtida são re-ceptor toll-like (TLR1.2); proteína rica em repetições de Ieucina ativadora decélula T; deceorina; OM-gp; subunidade slit e robo ácido-lábil da proteína deligação ao fator de crescimento semelhante a insulina; e receptor 4 tipo con-trole ("toll-like receptor").
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptí-deo de receptor Nogo-1 solúvel de 319 aminoácidos (receptor Nogo-1 solú-vel 344, sNogoR1-344, ou sNogoR344) (resíduos 26 a 344 de SEQ ID NOs:6 e 8 ou resíduos 27 a 344 de SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, ainvenção proporciona receptor Nogo-1 solúvel de 285 aminoácidos (receptorNogo-1 solúvel 310, sNogoR1-310, ou sNogoR310) (resíduos 26 a 310 deSEQ ID NOs: 7 e 9 ou resíduos 27 a 310 de SEQ ID NO: 9). Veja Fig. 1.Tabela 1. Seqüências de Polipeptídeos de Receptor Nogo-1 de Humano ede Rato
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Em algumas modalidades da invenção, os polipeptídeos de re-ceptor Nogo-1 solúveis da invenção são usados para inibir a ligação de umligante a um receptor Nogo-1 e agem como um antagonista de Iigantes dereceptor Nogo-1. Em algumas modalidades da invenção, os polipeptídeos dereceptor Nogo-1 solúveis da invenção são usados para diminuir a inibição decrescimento e brotamento de neurito em um neurônio, tal como crescimentoaxonal, e para inibir o colapso do cone de crescimento mediado por mielinaem um neurônio. Em algumas modalidades, o neurônio é um neurônio doCNS.sNogoR310 e sNogoR344, surpreendentemente, bloqueiam aligação de Nogo A, NogoB, NogoC, MAG e OM-gp ao Receptor Nogo-1.
Em outra modalidade, a presente invenção proporciona umfragmento de polipeptídeo isolado de 60 resíduos ou menos, que compreen-de uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácidode referência, exceto por até uma, duas, três, quatro, dez ou vinte substitui-ções de aminoácido individuais, em que a dita seqüência de aminoácido dereferência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) aminoácidosχ a 344 de SEQ ID NO:49, (b) aminoácidos 309 a y de SEQ ID NO:49, e (c)aminoácidos χ a y de SEQ ID NO:49, em que χ é qualquer número inteiro de305 a 326, e y é qualquer número inteiro de 328 a 350; e em que o ditofragmento de polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neurito media-da pelo receptor Nogo. Em algumas modalidades, a invenção proporcionaum fragmento de polipeptídeo isolado de 60 resíduos ou menos, compreen-dendo uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoá-cido de referência, exceto por até uma, duas, três, quatro, dez ou vinte subs-tituições de aminoácidos individuais, em que a dita seqüência de aminoácidode referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) aminoáci-dos x' a 344 de SEQ ID NO:49, (b) aminoácidos 309 a y' de SEQ ID NO:49,e (c) aminoácidos x' a y' de SEQ ID NO:49, onde x1 é qualquer número intei-ro de 300 a 326, ey'é qualquer número inteiro de 328 a 360, e em que odito fragmento de polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neuritomediada pelo receptor Nogo.
Por "uma seqüência de aminoácido de referência de NgR1" ou"seqüência de aminoácido de referência" entende-se a seqüência especifi-cada sem a introdução de nenhuma substituição de aminoácidos. Como umversado na técnica pode compreender, se não há substituições, o "polipeptí-deo isolado" da invenção compreende uma seqüência de aminoácido que éidêntica à seqüência de aminoácido de referência.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um fragmentode polipeptídeo isolado de 60 resíduos ou menos, que compreende uma se-qüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de referên-cia, exceto por até uma, duas ou três substituições de aminoácido individu-ais, em que a dita seqüência de aminoácido de referência é selecionada apartir do grupo que consiste em: aminoácidos 309 a 335 de SEQ ID NO:49;aminoácidos 309 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 310 a 335 de SEQID NO:49; aminoácidos 310 a 344 de SEQ ID NO:49; aminoácidos 309 a 350de SEQ ID NO:49; aminoácidos 300 a 344 de SEQ EO NO:49; e aminoáci-dos 315 a 344 de SEQ ID NO:49.
Em uma modalidade, a invenção proporciona um fragmento depolipeptídeo isolado de 60 resíduos ou menos, que compreende uma se-qüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de referên-cia, exceto por até três substituições de aminoácido individuais, em que adita seqüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 309 a 344de SEQ ID NO:49.
Em uma modalidade, a invenção proporciona um fragmento depolipeptídeo isolado de 60 resíduos ou menos, que compreende uma se-qüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de referên-cia, exceto por até três substituições de aminoácido individuais, em que adita seqüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 309 a 335de SEQ ID NO:49.
Em uma modalidade, a invenção proporciona um polipeptídeoisolado que compreende: (a) uma seqüência de aminoácido idêntica a umaseqüência de aminoácido de referência exceto que o pelo menos um resíduode cisteína da dita seqüência de aminoácido de referência é substituído porum resíduo de aminoácido diferente, em que a dita seqüência de aminoácidode referência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) aminoáci-dos a até 445 de SEQ ID NO:49, (ii) aminoácidos 27 a b de SEQ BD NO:49,e (iii) aminoácidos a até b de SEQ ID NO:49, em que a é qualquer númerointeiro de 25 até 35, e b é qualquer número inteiro de 300 até 450; e (b) umpolipeptídeo heterólogo; em que dito polipeptídeo inibe a inibição de cresci-mento de neurito mediada pelo receptor Nogo.
Substituições de aminoácido exemplares para fragmentos depolipeptídeo de acordo com essa modalidade incluem substituições de resí-duos de cisteína individuais nos polipeptídeos de invenção por aminoácidosdiferentes. Qualquer aminoácido diferente pode ser substituído por uma cis-teína nos polipeptídeos da invenção. Que aminoácido diferente é usado de-pende de vários critérios, por exemplo, do efeito da substituição sobre a con-formação do fragmento de polipeptídeo, da carga do fragmento de polipeptí-deo, ou da hidrofilicidade do fragmento de polipeptídeo. Substituições deaminoácido para os aminoácidos dos polipeptídeos da invenção e da se-qüência de aminoácido de referência podem incluir aminoácidos com cadei-as laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeia lateraisácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais pola-res não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, tre-onina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina,valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadei-as laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e ca-deias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histi-dina). Aminoácidos típicos para substituir por cisteínas no aminoácido dereferência incluem aianina, serina, treonina, em particular, aianina. Fazer taissubstituições através de manipulação de um polinucleotídeo que codifica ofragmento de polipeptídeo está dentro da habilidade de um versado na téc-nica.
Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um poli-peptídeo isolado da invenção em que pelo menos um resíduo de cisteína ésubstituído por um aminoácido diferente. Resíduos de cisteína que podemser substituídos em NgR1 humana incluem C27, C31, C33, C43, C80, C140,C264, C266, C287, C309, C335, C336, C419, C429, C455 e C473. Resíduosde cisteína que podem ser substituídos em NgR1 de rato incluem C27, C31,C33, C80, C140, C264, C266, C287, C309, C335, C336, C419, C429, C455e C473. Resíduos de cisteína que podem ser substituídos em NgR1 de ca-mundongo incluem C27, C31, C33, C43, C80, C140, C264, C266, C287,C309, C335, C336, C419, C429, C455 e C473.
A presente invenção ainda proporciona um fragmento de poli-peptídeo isolado de 40 resíduos ou menos, onde o fragmento de polipeptí-deo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica aos aminoácidos309 a 344 de SEQ ID NO:49, exceto que: C309 é substituído, C335 é substi-tuído, C336 é substituído, C309 e C335 são substituídos, C309 e C336 sãosubstituídos, C335 e C336 são substituídos, ou C309, C335, e C336 sãosubstituídos.
Os resíduos de cisteína nos polipeptídeos da invenção podemser substituídos por qualquer aminoácido heterólogo. Em certas modalida-des, a cisteína é substituída por um pequeno aminoácido não carregado quemenos provavelmente alteraria a conformação tridimensional do polipeptí-deo, por exemplo, alanina, serina, treonina, preferivelmente alanina.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de receptor Nogo-1solúvel da invenção é um componente de uma proteína de fusão que aindacompreende um polipeptídeo heterólogo. Em algumas modalidades, o poli-peptídeo heterólogo é um domínio constante de imunoglobulina. Em algu-mas modalidades, o domínio constante de imunoglobulina é um domínioconstante de cadeia pesada. Em algumas modalidades, o polipeptídeo hete-rólogo é um fragmento Fe. Em algumas modalidades, o fragmento Fc é uni-do à extremidade C-terminal do polipeptídeo de receptor Nogo-1 solúvel dainvenção. Em algumas modalidades, a proteína de fusão do receptor Nogo-1é um dímero. A invenção ainda abrange variantes, análogos, ou derivadosde fragmentos de polipeptídeos descritos acima.
Em algumas modalidades a invenção proporciona um polipeptí-deo isolado que compreende: (a) uma seqüência de aminoácido idêntica auma seqüência de aminoácido de referência, exceto por até vinte substitui-ções de aminoácido individuais, em que a dita seqüência de aminoácido dereferência é selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) aminoácidos aaté 445 de SEQ ID NO:49, (ii) aminoácidos 27 até b de SEQ ID NO:49, e (iii)aminoácidos a até b de SEQ ID NO:49, em que a é qualquer número inteirode 1 a 35, e b é qualquer número inteiro de 300 até 450; e (b) um polipeptí-deo heterólogo; em que dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento deneurito mediada pelo receptor Nogo. Em algumas modalidades, o polipeptí-deo isolado são os aminoácidos 1 a 310 de SEQ ID NO:49, em que R269 eΑ310 são substituídos por um aminoácido diferente. Aminoácidos exempla-res que podem ser substituídos no polipeptídeo incluem aminoácidos comcadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeiaslaterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias Iate-rais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina,serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apolares (por exemplo,alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofa-no), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleu-cina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, tripto-fano, histidina). Em uma modalidade, o aminoácido diferente é triptofano.
Uma proteína de fusão NgR-Fc solúvel exemplar é NgRI(319)-Fchumana que compreende Fc unido à extremidade C-terminal dos aminoáci-dos 1 a 319 de SEQ ID NO:49.
Proteínas de fusão NgR-Fc solúveis exemplares com substitui-ções de cisteína são Ala-Ala- humano(h)NgR1(310)-Fc que compreende Fcunido à extremidade C-terminal de um polipeptídeo solúvel com a seqüênciade aminoácido de SEQ ID NO:58, Ala-Ala-rato(r)NgR1(310)-Fc que compre-ende Fc unido à extremidade C-terminal de um polipeptídeo solúvel com aseqüência de aminoácido de SEQ BD NO:59 e Ala-Ala-humano(h)NgRI(344)-Fc que compreende Fc unido à extremidade C-terminalde um polipeptídeo solúvel com a seqüência de aminoácido de SEQ IDNO:64.
Na presente invenção, um polipeptídeo pode ser composto deaminoácidos unidos um ou outro por ligações peptídicas ou ligações peptídi-cas modificadas, isto é, isosteres de peptídeo, e pode conter aminoácidosdiferentes dos 20 aminoácidos codificados por genes (por exemplo, aminoá-cidos que não ocorrem naturalmente). Os polipeptídeos da presente inven-ção podem ser modificados tanto por processos naturais, tal como proces-samento pós-traducional, como por metodologias de modificação químicaque são bem-conhecidas na técnica. Tais modificações estão descritas emtextos básicos e em monografias mais detalhadas, assim como em uma vo-lumosa literatura de pesquisa. Modificações podem ocorrer em qualquer Io-cal no polipeptídeo, incluindo o estrutura principal do peptídeo, as cadeiaslaterais dos aminoácidos, e nas terminações amino ou carbóxi. Será avalia-do que o mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo grau ouem graus variados em vários locais em um dado polipeptídeo. Ainda, umdado polipeptídeo pode conter muitos tipos de modificações. Polipeptídeospodem ser ramificados, por exemplo, como um resultado de ubiquitinação, eeles podem ser cíclicos, com ou sem ramificação. Polipeptídeos cíclicos,ramificados, e ramificados cíclicos podem resultar de processos naturais oupodem ser feitos por métodos sintéticos. Modificações incluem, mas não sãolimitadas a, acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação cova-Iente de flavina, ligação covalente de uma porção heme, ligação covalentede um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipí-dio ou um derivado de lipídio, ligação covalente de fosfatidilinositol, reticula-ção, ciclização, formação de ligação dissulfeto, desmetilação, formação deligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de pirogluta-mato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora deGPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação,processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoila-ção, sulfatação, adição de aminoácidos mediada por RNA de transferência aproteínas, tal como, arginilação, e ubiquitinação (veja, por exemplo, ProteinsStructure And Molecular Properties, 2- Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman& Company, Nova Iorque (1993); Posttranslational Covalent Modification ofProteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, Nova Iorque, pgs. 1-12 (1983);Seifter et al, Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al, Ann NYAcadSci 663:48-62 (1992)).
Polipeptídeos descritos aqui podem ser cíclicos. Ciclização dospolipeptídeos reduz a liberdade conformacional de peptídeos lineares e re-sulta em uma molécula mais restrita estruturalmente. Muitos métodos deciclização de peptídeo são conhecidos na técnica. Por exemplo, ciclização"estrutura principal a estrutura principal" pela formação de uma ligação deamida entre os resíduos de aminoácido N-terminais e C-terminais do peptí-deo. O método de ciclização "estrutura principal a estrutura principal" inclui aformação de ligações de dissulfeto entre dois resíduos de α-tio aminoácidos(por exemplo, cisteína, homocisteína). Certos peptídeos da presente inven-ção incluem modificações na terminação-N e -C do peptídeo para formar umpolipeptídeo cíclico. Tais modificações incluem, mas não são limitadas a,resíduos de cisteína, resíduos de cisteína acetilados, resíduos de cisteínacom uma porção de NH2 e biotina. Outros métodos de ciclização de peptí-deos são descritos em Li & Roller, Curr. Top. Med. Chem. 3:325-341 (2002)e Publicação de Patente U.S. 2005-0260626 A1, que estão incorporadasaqui por referência nas suas totalidades.
Em métodos da presente invenção, um polipeptídeo ou fragmen-to de polipeptídeo de NgR1 da invenção pode ser administrado diretamentecomo um polipeptídeo pré-formado, ou indiretamente através de um vetor deácido nucléico. Em algumas modalidades da invenção, um polipeptídeo oufragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção é administrado em um mé-todo de tratamento que inclui: (1) transformar ou transfectar uma célula hos-pedeira implantável com um ácido nucléico, por exemplo, um vetor, que ex-pressa um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção;e (2) implantar a célula hospedeira transformada em um mamífero, no localde uma doença, distúrbio ou lesão. Por exemplo, a célula hospedeira trans-formada por ser implantada no local de uma lesão crônica do MS. Em algu-mas modalidades da invenção, a célula hospedeira implantável é removidade um mamífero, cultivada temporariamente, transformada ou transfectadacom um ácido nucléico isolado que codifica um polipeptídeo ou fragmento depolipeptídeo de NgR 1 da invenção, e implantada de volta no mesmo mamí-fero do qual ela foi removida. A célula pode ser, mas não precisa ser, remo-vida do mesmo local no qual ela é implantada. Tais modalidades, algumasvezes conhecidas como terapia gênica ex vivo, podem fornecer um supri-mento contínuo do polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR1 dainvenção, localizado no local de ação, por um período limitado de tempo.
Polipeptídeos de NgR exemplares adicionais da invenção e mé-todos e matéria para obter estas moléculas para praticar a presente inven-ção são descritos abaixo.Proteínas de fusão e polipeptídeos conjugados
Algumas modalidades da invenção envolvem o uso de um poli-peptídeo de NgR1 que não é a proteína NgR1 de extensão completa, porexemplo, fragmentos de polipeptídeo de NgR1, fundidos a uma porção deum polipeptídeo heterólogo para formar uma proteína de fusão. Tais proteí-nas de fusão podem ser usadas para atingir vários objetivos, por exemplo,meia-vida sérica aumentada, biodisponibilidade melhorada, direcionamentoin vivo para um órgão ou tipo de tecido específico, eficácia de expressãorecombinante melhorada, secreção da célula hospedeira melhorada, facili-dade de purificação, e maior avidez. Dependendo do(s) objetivo(s) a ser(em)atingido(s), a porção heteróloga pode ser inerte ou biologicamente ativa. A-inda, ela pode ser escolhida para ser estavelmente fundida à porção do poli-peptídeo de NgR1 da invenção ou para ser clivável, in vitro ou in vivo. Por-ções heterólogas para atingir esses outros objetivos são conhecidas na téc-nica.
Em algumas modalidades da invenção, um fragmento de poli-peptídeo de NgR1 pode ser fundido a outro fragmento de polipeptídeo deNgR, por exemplo, um fragmento de polipeptídeo de NgR2 ou NgR3 juntocom Fc.
O polipeptídeo de NgR2 de humano é mostrado abaixo comoSEQ ID N0:60.
NgR2 de humano de extensão completa (SEQ ID N0:60):MLPGLRRLLQ APASACLLLM LLALPLAAPS CPMLCTCYSS PPTVSCQANNfssvplslpp stqrlflqnn LIRTLRP GTF gsnlltlwlf snnlstiypg tfrhlqaleeLDLGDNRHLR SLEPDTFQGL ERLQSLHLYR CQLSSLPGNIFRGLVSLQYLYLQENSLLHL QDDLFADLAN LSHLFLHGNR UtLLTEHVFR GLGSLDRLLLHGNRLQGVHR AAFRGLS RLTILYLFNNSLA SLPGEALADL PSLEFLRLNANPWACDCRAR PL W AWFQRAR VSSSDVTCAT PPERQGRDLR ALREADFQACPPAAPTKPGS RARGNSSSNH L YGVAEAGAP PADPSTLYRD LPAEDSRGRQGGDAPTEDDY WGGYGGEDQR GEQMCPGAAC QAPPDSRGPA LSAGLPSPLLCLLLLVPHHL
O polipeptídeo de NgR2 de camundongo é mostrado abaixo co-mo SEQ ID NO:61.
NgR2 de camundongo de extensão completa (SEQ ID NO:61):mlpglrrllq gpasaclllt llalpsvtps cpmlctcyss pptvscqannfssvplslpp stqrlflqnn lirslrpgtf gpnlltlwlf snnlshhpg tfrhlqaleeldlgdnrhlr slepdtfqgl erlqslhlyr cqlsslpgnifrglvslqylylqensllhl qddlfadlan lshlflhgnr lrlltehvfr glgsldrlllhgnrlqgvhr aafhglsrltilylfnnsla slpgealadl paleflrlnanpwacdcrar plwa wfqrar vsssdvtcat pperqgrjdlr alrdsdfqacppptptrpgs rargnsssnh lygvaeagap padpstlyrd lpaedsrgrqggdapteddy wggyggedqr geqtcpgaac qapadsrgpa lsaglrtpllcllplalhhl
O polipeptídeo de NgR3 de humano é mostrado abaixo comoSEQ ID NO:62.
NgR3 de humano de extensão completa (SEQ ID NO:62):mlrkgccvel llllvaaelp lgggcprdcv cypapmtvsc qahnfaaipegep vdservf lqnnrigllq pghfspamvt lwiysnnity ihpstfegfvhleeldlgdn rqlrtlapet fqglvklhal ylykcglsal pagvfgglhslqylylqdnh IEYLQDDffV dlvnlshlfl hgnklwslgp gtfrglvnldrlllhenqlq wvhhkafhdl rrlttlflfn nslselqgec laplgaleflrlngnpwdcg crarslwewl qrfrgsssav pcvspglrhg qdlkllraedfrnctgpasp hqikshtltt tdraarkehh sphgptrskg hphgprpghrkpgknctnpr nrnqiskaga gkqapelpdy apdyqhkfsf dimptarpkrkgkcarrtfirafsgvqqas sasslgasll AWTLGLAVTL r
O polipeptídeo de NgR3 de camundongo é mostrado abaixo co-mo SEQ ID NO:63.
NgR3 de camundongo de extensão completa (SEQ ID NO:63):mlrkgccvel lllllagelp lgggcprdcv cypapmtvsc qahnfaaipegipedserif lqnnritflq qghfspamvt lwiysnnitfiapntfegfv hleeldlgdnrqlrtlapet fqglvklhal ylykcglsal pagifgglhs lqylylqdnhieylqddifv dlvnlshlfl hgnklwslgq gifrglvnld rlllhenqlqwvhhkafhdl hrlttlflfn nsltelqgdc lapl v alefl rlngnawdcgcrarslwewl rrfrgsssav pcatpelrqg qdlkllrved frnctgpvsphqikshtltt sdraarkehh pshgasrdkg hphghppgsr s gykkagknc
tshrnrnqis kvssgkelte lqdyapdyqh kfsfdimpta rpkrkgkcar1q rtpirapsgv qqassgtalg apllawelgl avtlr
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um fragmentode polipeptídeo isolado que compreende um primeiro fragmento de polipep-tídeo e um segundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito primeiro frag-mento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica auma primeira seqüência de aminoácido de referência, exceto por até uma,duas, três, quatro, dez ou vinte substituições de aminoácido individuais, emque a dita primeira seqüência de aminoácido de referência é selecionada apartir do grupo que consiste em: (a) aminoácidos a até 305 de SEQ IDNO:49, (b) aminoácidos 1 até b de SEQ ID NO:49, e (c) aminoácidos a até bde SEQ ID NO:49, em que a é qualquer número inteiro de 1 a 27, e b équalquer número inteiro de 264 a 309; e em que o dito segundo fragmentode polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica umasegunda seqüência de aminoácido de referência, exceto por até uma, duas,três, quatro, dez ou vinte substituições de aminoácido individuais, em que adita segunda seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partirdo grupo que consiste em (a) aminoácidos c a 332 de SEQ ID N0:60, (b)aminoácidos 275 a d de SEQ ID N0:60, e (c) aminoácidos c a d de SEQ IDN0:60, em que c é qualquer número inteiro de 265 a 306, e d é qualquernúmero inteiro de 308 a 340; e; em que dito polipeptídeo inibe a inibição decrescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo.
Em uma modalidade, a invenção proporciona um polipeptídeoisolado que compreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e um se-gundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito primeiro fragmento de poli-peptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma primeiraseqüência de aminoácido de referência, exceto por até uma, duas, três, qua-tro, dez ou vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita pri-meira seqüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 1 a 274de SEQ ID NO:49 e em que o dito segundo fragmento de polipeptídeo com-preende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma segunda seqüênciade aminoácido de referência, exceto por até uma, duas, três, quatro, dez ouvinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita segunda se-qüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 275 a 311 de SEQID N0:60 e; em que dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neu-rito mediada pelo receptor Nogo.
Em uma modalidade, a invenção proporciona um polipeptídeoisolado que compreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e um se-gundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito primeiro fragmento de poli-peptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma primeiraseqüência de aminoácido de referência, exceto por até uma, duas, três, qua-tro, dez ou vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita pri-meira seqüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 1 a 274de SEQ ID NO:49 e em que o dito segundo fragmento de polipeptídeo com-preende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma segunda seqüênciade aminoácido de referência, exceto por até uma, duas, três, quatro, dez ouvinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita segunda se-qüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 275 a 332 de SEQID N0:60 e; em que dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neu-rito mediada pelo receptor Nogo.
Em uma modalidade, a invenção proporciona um polipeptídeoisolado que compreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e um se-gundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito primeiro fragmento de poli-peptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma primeiraseqüência de aminoácido de referência, exceto por até uma, duas, três, qua-tro, dez ou vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita pri-meira seqüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 1 a 305de SEQ ID NO:49 e em que o dito segundo fragmento de polipeptídeo com-preende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma segunda seqüênciade aminoácido de referência, exceto por até uma, duas, três, quatro, dez ouvinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita segunda se-qüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 306 a 311 de SEQID N0:60 e; em que dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neu-rito mediada pelo receptor Nogo.
Em uma modalidade, a invenção proporciona um polipeptídeoisolado que compreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e um se-gundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito primeiro fragmento de poli-peptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma primeiraseqüência de aminoácido de referência, exceto por até uma, duas, três, qua-tro, dez ou vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita pri-meira seqüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 1 a 305de SEQ ID NO:49 e em que o dito segundo fragmento de polipeptídeo com-preende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma segunda seqüênciade aminoácido de referência, exceto por até uma, duas, três, quatro, dez ouvinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita segunda se-qüência de aminoácido de referência são os aminoácidos 306 a 309 de SEQID N0:60 e; em que dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento de neu-rito mediada pelo receptor Nogo. Em outra modalidade, pelo menos um ami-noácido adicional é adicionado à terminação-C do segundo fragmento depolipeptídeo. Aminoácidos exemplares que podem ser adicionados ao poli-peptídeo incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo,lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspár-tico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo,glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeiaslaterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina,fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (porexemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por e-xemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Em uma modalidade, oaminoácido adicionado é triptofano. Em uma modalidade adicional, a argini-na na posição 269 de SEQ ID NO:49 é substituída por triptofano.
Em uma modalidade, a invenção proporciona um polipeptídeoisolado que compreende um primeiro fragmento de polipeptídeo e um se-gundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito primeiro fragmento de poli-peptídeo consiste nos aminoácidos 1 a 310 de SEQ ID NO:49, exceto poraté uma, duas, três, quatro, dez ou vinte substituições de aminoácido indivi-duais; e em que o dito segundo fragmento de polipeptídeo consiste nos ami-noácidos 311 a 318 de SEQ ID N0:60 exceto por até uma, duas, três, quatroou cinco substituições de aminoácido individuais; e em que o dito polipeptí-deo inibe a inibição de crescimento de neurito mediada pelo receptor Nogo.
Em algumas modalidades, os polipeptídeos da invenção com-preendem ainda um polipeptídeo heterólogo. Em algumas modalidades, opolipeptídeo heterólogo é um domínio constante de imunoglobulina. Em al-gumas modalidades, o domínio constante de imunoglobulina é um domínioconstante de cadeia pesada. Em algumas modalidades, o polipeptídeo hete-rólogo é um fragmento Fe. Em algumas modalidades o Fc é unido à extremi-dade C-terminal dos polipeptídeos da invenção. Em algumas modalidades afusão é um dímero. A invenção ainda abrange variantes, análogos, ou deri-vados de fragmentos de polipeptídeo conforme descrito acima.
Como uma alternativa para expressão de uma proteína de fusão,uma porção heteróloga escolhida podem ser pré-formada e conjugada qui-micamente à porção de polipeptídeo de NgR da invenção. Na maioria doscasos, uma porção heteróloga escolhida funcionará similarmente, quer fun-dida ou conjugada à porção do polipeptídeo de NgR. Portanto, na discussãoa seguir de seqüências de aminoácido heterólogas, a menos que observadode outra maneira, deve ser entendido que a seqüência heteróloga pode serunida à porção de polipeptídeo de NgR na forma de uma proteína de fusãoou como um conjugado químico.
Aptâmeros e anticorpos de NgR1 e fragmentos destes, para usonos métodos de tratamento descritos aqui também podem ser fundidos re-combinantemente a um polipeptídeo heterólogo na terminação -N ou -C ouconjugados quimicamente (incluindo conjugações covalentes e não covalen-tes) a polipeptídeos ou outras composições. Por exemplo, aptâmeros e anti-corpos antagonistas de NgRI1 e fragmentos destes podem ser fundidos ouconjugadas recombinantemente a moléculas úteis como marcadores em en-saios de detecção e moléculas efetoras tal como polipeptídeos heterólogos,fármacos, radionuclídeos, ou toxinas. Veja, por exemplo, as publicaçõesPCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; U.S. Patent No.5.314.995; e EP 396.387.
Polipeptídeos, aptâmeros e anticorpos antagonistas de NgR1, efragmentos destes, para uso nos métodos de tratamento descritos aqui in-cluem derivados que são modificados, isto é, pela ligação covalente de qual-quer tipo de molécula tal que a ligação covalente não impeça que o polipep-tídeo, aptâmero ou anticorpo iniba a função biológica de NgR1. Por exemplo,mas não como forma de limitação, os polipeptídeos, aptâmeros e anticorposantagonistas de NgR1, e fragmentos destes da presente invenção podemser modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosfi-lação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos proteto-res/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um Iigante ce-lular ou outra proteína, etc. qualquer uma de várias modificações químicaspodem ser realizadas por técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitadasa clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica detunicamicina, etc. Adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais ami-noácidos não clássicos.
Polipeptídeos, aptâmeros e anticorpos antagonistas de NgR1, efragmentos destes, para uso nos métodos de tratamento descritos aqui po-dem ser compostos de aminoácidos unidos uns aos outros por ligações pep-tídicas ou ligações peptídicas modificadas, isto é, isosteres de peptídeo, epodem conter aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos codificados porgenes. Polipeptídeos, aptâmeros e anticorpos antagonistas de NgR1, efragmentos destes, podem ser modificados por processos naturais, tal comoprocessamento pós-traducional, ou por metodologias de modificação quími-ca que são bem-conhecidas na técnica. Tais modificações estão descritasem textos básicos e em monografias mais detalhadas, assim como em umavolumosa literatura de pesquisa. Modificações podem ocorrem em qualquerlocal no polipeptídeo, aptâmero ou anticorpo antagonista de NgR1, ou frag-mentos destes, incluindo no estrutura principal do peptídeo, nas cadeias la-terais dos aminoácidos e nas terminações amino ou carboxila, ou em por-ções tais como carboidratos. Será avaliado que o mesmo tipo de modifica-ção pode estar presente no mesmo grau ou em graus variados em várioslocais em um dado polipeptídeo, aptâmero ou anticorpo antagonista de N-gR1, ou fragmentos destes. Ainda, um dado polipeptídeo, aptâmero ou anti-corpo antagonista de NgR1, ou fragmentos destes, podem conter vários ti-pos de modificações. Polipeptídeos, aptâmeros ou anticorpos antagonistasde NgR1, ou fragmentos destes podem ser ramificados, por exemplo, comoum resultado de ubiquitinação, e eles podem ser cíclicos, com ou sem rami-ficação. Polipeptídeos, aptâmeros ou anticorpos antagonistas de NgR1, oufragmentos destes cíclicos, ramificados e ramificados cíclicos podem resultarde processos naturais pós-traducionais ou podem ser feitos por métodossintéticos. As modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação,amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porçãoheme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, Iiga-ção covalente de um lipídio ou derivado de lipídio, ligação covalente de fos-fatidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação dissulfeto, desmeti-lação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, for-mação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, forma-ção de âncora de GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoilação, oxi-dação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, ra-cemização, selenoilação, sulfação, adição de aminoácidos mediada por RNAde transferência a proteínas, tal como arginilação, e ubiquitinação. (Veja, porexemplo, Proteins - Structure And Molecular Properties, Τ. E. Creighton, W.H. Freeman and Company1 Nova Iorque 2- Ed., (1993); Posttranslational Co-valent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, NovaIorque, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al, Meth Enzymol 182:626-646 (1990);Rattan et al, Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)).
O polipeptídeo heterólogo ao qual o polipeptídeo, aptâmero ouanticorpo antagonista de NgR1, ou fragmentos destes, é fundido é útil tera-peuticamente ou é útil para direcionar o polipeptídeo, aptâmero ou anticorpoantagonista de NgR1, ou fragmentos destes. Proteínas de fusão, aptâmerose anticorpos antagonistas de NgR1, ou fragmentos destes, podem ser usa-dos para atingir vários objetivos, por exemplo, meia-vida sérica aumentada,biodisponibilidade melhorada, direcionamento in vivo para um órgão ou tipode tecido específico, eficácia de expressão recombinante melhorada, secre-ção da célula hospedeira melhorada, facilidade de purificação, e maior avi-dez. Dependendo do(s) objetivo(s) a ser(em) atingido(s), a porção heterólo-ga pode ser inerte ou biologicamente ativa. Ainda, ela pode ser escolhidapara ser estavelmente fundida ao polipeptídeo, aptâmero ou anticorpo anta-gonista de NgR1, ou fragmentos destes, ou para ser clivável, in vitro ou invivo. Porções heterólogas para atingir esses outros objetivos são conhecidasna técnica.Como uma alternativa para expressão de polipeptídeo de fusão,aptâmero ou anticorpo antagonista de NgR1, ou fragmentos destes, umaporção heteróloga escolhida pode ser preformada e conjugada quimicamen-te ao polipeptídeo, aptâmero ou anticorpo antagonista. Na maioria dos ca-sos, uma porção heteróloga escolhida funcionará da mesma maneira, querfundida ou conjugada ao polipeptídeo, aptâmero ou anticorpo antagonista deNgR 1, ou fragmentos destes. Portanto, na seguinte discussão de seqüênciasde aminoácido heterólogas, a menos que observado de outra maneira, deveser entendido que a seqüência heteróloga pode ser unida ao polipeptídeo,aptâmero ou anticorpo antagonista de NgR1, ou fragmentos destes, na for-ma de uma proteína de fusão ou como um conjugado químico.
Polipeptídeos farmacologicamente ativos, tais como polipeptí-deos, aptâmeros ou anticorpos antagonistas de NgR1, ou fragmentos des-tes, podem exibir rápida depuração in vivo, precisando de grandes dosespara atingir concentrações terapeuticamente eficazes no corpo. Além disso,polipeptídeos menores do que cerca de 60 kDa potencialmente sofrem filtra-ção glomerular, o que algumas vezes leva à nefrotoxicidade. Fusão ou con-jugação de polipeptídeos relativamente pequenos, tais como fragmentos depolipeptídeo do domínio de sinalização de NgR pode ser empregada parareduzir ou evitar o risco de tal nefrotoxicidade. Várias seqüências de amino-ácido heterólogas, isto é, porções de polipeptídeo ou "veículos", para au-mentar a estabilidade in vivo, isto é, meia-vida sérica, de polipeptídeos tera-pêuticos, são conhecidas. Exemplos incluem albuminas séricas, como porexemplo, albumina sérica bovina (BSA) ou albumina sérica humana (HSA).
Devido a sua longa meia-vida, ampla distribuição in vivo, e faltade função enzimática ou imunológica, principalmente albumina sérica huma-na de extensão completa (HSA), ou um fragmento de HSA, é comumenteusada como uma porção heteróloga. Através da aplicação de métodos e ma-teriais tais como aqueles ensinados em Yeh et ai, Proc. Nati. Acad. Sei. U-SA1 59:1904-08 (1992) e Syed et ai, Blood 89.3243-52 (1997), HSA pode serusada para formar uma proteína de fusão ou conjugado de polipeptídeo queapresenta atividade farmacológica, devido ao polipeptídeo de NgR, enquantoapresenta estabilidade significativamente aumentada in vivo, por exemplo,10 vezes a 100 vezes maior. A terminação-C da HSA pode ser fundida àterminação-N da porção de NgR. Já que HSA é uma proteína secretada na-turalmente, a seqüência de sinal de HSA pode ser utilizada para se obter asecreção da proteína de fusão no meio de cultura da célula quando a proteí-na de fusão é produzida em um sistema eucariótico, por exemplo, de mamí-fero.
Em certas modalidades, polipeptídeos, aptâmeros, anticorposantagonistas de NgR1, ou fragmentos de anticorpos destes, para uso nosmétodos da presente invenção ainda compreendem uma porção de direcio-namento. Porções de direcionamento incluem uma proteína ou peptídeo quedireciona a localização para determinada parte do corpo, por exemplo, parao cérebro, ou compartimentos dele. Em certas modalidades, polipeptídeos,aptâmeros, anticorpos antagonistas de NgR1, ou fragmentos de anticorposdestes, para isso nos métodos da presente invenção são ligados ou fundidosa uma porção de direcionamento para o cérebro. As porções de direciona-mento para o cérebro são ligadas covalentemente (por exemplo, ligação di-reta, por fusão traducional, ou por ligação química, diretamente ou atravésde uma molécula espaçadora, que pode ser opcionalmente clivável) ou Iiga-das não-covalentemente (por exemplo, através de interações reversíveis, talcomo, avidina:biotina, proteína A:lgG, etc.). Em outras modalidades, polipep-tídeos, aptâmeros, anticorpos antagonistas de NgR1, ou fragmentos de anti-corpo destes, para uso nos métodos da presente invenção são ligados auma ou mais porções de direcionamento para o cérebro. Em modalidadesadicionais, a porção de direcionamento para o cérebro está ligada a umapluralidade de polipeptídeos, aptâmeros, anticorpos antagonistas de NgR1,ou fragmentos de anticorpo destes, para uso nos métodos da presente in-venção.
Uma porção de direcionamento para o cérebro associada comum polipeptídio, aptâmero, anticorpo antagonista de NgR1, ou fragmento deanticorpo destes, aumenta a liberação cerebral do tal polipeptídeo, anticorpoou fragmento de anticorpo deste. Foram descritos vários polipeptídeos quequando fundidos a uma proteína ou agente terapêutico, libera a proteína ouagente terapêutico através da barreia hemato-encefálica (BBB). Exemplosnão limitantes incluem o anticorpo de domínio único FC5 (Abulrob et al.(2005) J. Neurochem. 95, 1201-1214); mAB 83-14, um anticorpo monoclonalpara o receptor de insulina humano (Pardridge et al. (1995) Pharmacol. Res.12, 807-816); os peptídeos B2, B6 e B8 que se ligam ao receptor de transfer-rina humano (hTfR) (Xia et al. (2000) J. Viroi 74, 11359-11366); o anticorpomonoclonal 0X26 para o receptor de transferrina (Pardridge et al. (1991) J.Pharmacol. Exp. Ther. 259, 66-70); conjugados de toxina diftérica (veja, porexemplo, Gaillard et al., International Çongress Series 1277:185-198 (2005);e SEQ ID NOs: 1-18 da Patente U.S. No. 6.306.365. Os conteúdos das refe-rências acima são incorporados aqui por referência nas suas totalidades.
Liberação cerebral aumentada de uma composição de NgR1 édeterminada por vários meios bem estabelecidos na técnica. Por exemplo,administrar a um animal um polipeptídeo, aptâmero, anticorpo antagonistade NgR1, ou fragmento de anticorpo deste, marcado radioativamente, ligadoa uma porção de direcionamento cerebral; determinar a localização no cére-bro; e comparar a localização com um polipeptídeo, aptâmero, anticorpo an-tagonista de NgR1, ou fragmento de anticorpo deste, marcado radioativa-mente correspondente, que não está associado com uma porção de direcio-namento cerebral. Outros meios de determinar direcionamento aumentadosão descritos nas referências acima.
Algumas modalidades da invenção empregam uma porção depolipeptídeo de NgR fundida a uma região de dobradiça e uma Fc, isto é, aporção C-terminal de uma região constante de cadeia pesada de lg. Em al-gumas modalidades, aminoácidos na região de dobradiça podem ser substi-tuídos por aminoácidos diferentes. Substituições de aminoácido exemplarespara a região de dobradiça de acordo com essas modalidades incluem subs-tituições de resíduos de cisteína individuais na região de dobradiça por ami-noácidos diferentes. Qualquer aminoácido diferente pode ser substituído poruma cisteína da região de dobradiça. Substituições de aminoácidos para osaminoácidos dos polipeptídeos da invenção e a seqüência de aminoácido dereferência podem incluir aminoácidos com cadeias laterais básicas (por e-xemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, áci-do aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (porexemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína)cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina,prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramifiçadas(por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (porexemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Aminoácidos típicos parasubstituir por cisteínas no aminoácido de referência incluem, alanina, serina,treonina, em particular, serina e alanina. Fazer tais substituições através demanipulação de um polinucleotídeo que codifica o fragmento de polipeptídeoé bem-conhecido dentro da habilidade de rotina de um versado na técnica.
Potenciais vantagens de um polipeptídeo NgR-Fc de fusão in-cluem solubilidade, estabilidade in vivo, e multivalência, por exemplo, dimeri-zação. A região Fc usada pode ser uma região Fc (dobradiça-CH2-CH3) deIgA, IgD, ou IgG. Alternativamente, ela pode ser uma região Fc (dobradiça-CH2-CH3-CH4) de IgE ou IgM. Uma região Fc de IgG é geralmente usada,por exemplo, uma região Fc de IgGI ou uma região Fc de lgG4. Materiais emétodos para construir e expressar DNA que codifica fusões de Fc são co-nhecidos na técnica e podem ser aplicados para obter fusões sem experi-mentação excessiva. Algumas modalidades da invenção empregam umaproteína de fusão tal como aquela descrita em Capon et al, Patente U.S.Nos. 5.428.130 e 5.565.335.
A seqüência de sinal é um polinucleotídeo que codifica uma se-qüência de aminoácido que inicia o transporte de uma proteína através damembrana do reticulo endoplasmático. Seqüências de sinal úteis para cons-truir uma imunofusina incluem seqüências de sinal de cadeia leve do anti-corpo, por exemplo, anticorpo 14.18 (Gillies et al, J. Immunol. Meth.,125:191-202 (1989)), seqüências de sinal de cadeia pesada do anticorpo,por exemplo, a seqüência de sinal da cadeia pesada do anticorpo MOPC141(Sakano etal, Nature 286:5774 (1980)). Alternativamente, outras seqüênciasde sinal podem ser usadas. Veja, por exemplo, Watson, Nucl Acids fíes.72:5145 (1984). O peptídeo de sinal é geralmente clivado no lúmen do retí-culo endoplasmático por peptidases de sinal. Isso resulta na secreção deuma proteína de imunofusina contendo a região Fc e a porção do polipeptí-deo de NgR.
Em algumas modalidades, a seqüência de DNA pode codificarum sítio de clivagem proteolítica entre o cassete de secreção e a porção dopolipeptídeo de NgR. Tal sítio de clivagem pode gerar, por exemplo, a cliva-gem proteolítica da proteína de fusão codificada, separando assim o domínioFc da proteína-alvo. Sítios de clivagem proteolítica úteis incluem seqüênciasde aminoácido reconhecidas por enzimas proteolíticas tais como tripsina,plasmina, trombina, fator Xa, ou enteroquinase K.
O cassete de secreção pode ser incorporado em um vetor deexpressão replicável. Vetores úteis incluem ácidos nucléicos lineares, plas-mídeos, fagomídeos, cosmídeos e semelhantes. Um vetor de expressão épdC, no qual a transcrição do DNA de imunofusina é colocado sob o controlede intensificador e promotor do citomegalovírus humano. Veja, por exemplo,Lo et ai, Biochim. Biophys. Acta 7088:112 (1991); e Lo et ai, Protein Engine-ering 77:495-500 (1998). Uma célula hospedeira apropriada pode ser trans-formada ou transfectada com um DNA que codifica um polipeptídeo oufragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção e usada para a expressão esecreção do polipeptídeo. Células hospedeiras que são tipicamente usadasincluem células imortais de hibridoma, células de mieloma, células 293, célu-las de ovário de hamster Chinês (CHO), células HeLa, e células COS.
Regiões Fc selvagens completamente intactas apresentam fun-ções efetoras que normalmente são desnecessárias e indesejadas em umaproteína de fusão de Fc usada nos métodos da presente invenção. Portanto,certos sítios de ligação de Fc são tipicamente deletados da região Fe duran-te a construção do cassete de secreção. Por exemplo, já que a co-expressãocom a cadeia leve é desnecessária, o sítio de ligação para a proteína de Ii-gação da cadeia pesada, Bip (Hendershot et al, Immunol. Today 8:111-14(1987)), é deletado do domínio CH2 da região Fc de IgE, tal que esse sítionão interfira com a secreção eficaz da imunofusina. Seqüências do domíniotransmembrana, tais como aquelas presentes em IgM, também são geral-mente deletadas.
A região Fc de IgGI é a mais freqüentemente usada. Alternati-vamente, a região Fc das outras subclasses de imunoglobulina gama (gama-2, gama-3, e gama-4) pode ser usada no cassete de secreção. A região Fcde IgGI de imunoglobulina gama-1 é geralmente usada no cassete de se-creção e inclui pelo menos parte da região de dobradiça, a região CH2, e aregião CH3. Em algumas modalidades, a região Fc de imunoglobulina gama-1 é uma Fc com CH2 deletada, que inclui parte da região de dobradiça e aregião CH3, mas não a região CH2. Uma Fc com CH2 deletada foi descritapor Gillies et al, Hum. Antibod. Hybridomas 1:47 (1990). Em algumas moda-lidades, a região Fc de uma dentre IgA, IgD, IgE, ou IgM, é usada.
Proteínas de fusão NgR-polipeptídeo-porção-Fc podem serconstruídas em várias configurações diferentes. Em uma configuração aterminação-C da porção do polipeptídeo de NgR é fundida diretamente àterminação-N da porção de dobradiça de Fe. Em uma configuração um pou-co diferente, um polipeptídeo curto, por exemplo, 2 a 10 aminoácidos, é in-corporado na fusão entre a terminação-N da porção do polipeptídeo de NgRe a terminação-C da porção de Fe. Em uma configuração alternativa, o poli-peptídeo curto é incorporado na fusão entre a terminação-C da porção dopolipeptídeo de NgR e a terminação-N da porção de Fe. Uma modalidadeexemplar dessa configuração é NgR1(310)-2XG4S-Fc, que são os aminoá-cidos 26 a 310 de SEQ ID NO:49 ligados a (GIy-GIy-GIy-GIy-Ser)2 (SEQ IDNO:66) que é ligado a Fe. Tal Iigante fornece flexibilidade conformacional oque pode melhorar a atividade biológica em algumas circunstâncias. Se umaporção suficiente da região de dobradiça for mantida na porção Fc, a fusãoNgR-polipeptídeo-porção-Fc dimerizará, formando assim uma molécula diva-lente. Uma população homogênea de fusões de Fc monoméricas produzirádímeros bivalentes monoespecíficos. Uma mistura de duas fusões de Fcmonoméricas cada uma tendo uma especificidade diferente produzira díme-ros bivalentes biespecíficos.
Qualquer um dentre vários reticuladores que contêm um grupoamino-reativo e grupo um tiol-reativo correspondente pode ser usado paraligar um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção àalbumina sérica. Exemplos de Iigantes adequados incluem reticuladores deamina reativa que inserem uma maleimida tiol-reativa, por exemplo, SMCC1AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS1 e GMBS. Outros Iigan-tes adequados inserem um grupo haloacetato tiol-reativo, por exemplo,SBAP, SIA, SIAB. Ligantes que fornecem um tiol protegido ou não-protegidopara reação com grupos sulfidrila para produzir uma ligação reduzível inclu-em SPDP, SMPT1 SATA, e SATP. Tais reagentes são disponíveis comerci-almente (por exemplo, Pierce Chemical Company, Rockford, IL).
Conjugação não precisa envolver a terminação-N de um polipep-tídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção ou a porção tiol emalbumina sérica. Por exemplo, fusões de polipeptídeo de NgR-albumina po-dem ser obtidas usando técnicas de manipulação genética, em que a porçãode polipeptídeo de NgR é fundida ao gene da albumina sérica na sua termi-nação-N, terminação-C ou ambas.
Polipeptídeos de NgR da invenção podem ser fundidos a umsinalizador de polipeptídeo. O termo "sinalizador de polipeptídeo" como usa-do aqui, é entendido por significar qualquer seqüência de aminoácidos quepode ser unida a, ou conectada a, ou ligada a um polipeptídeo de NgR e quepode ser usada para identificar, purificar, concentrar ou isolar o polipeptídeode NgR. A ligação do sinalizador de polipeptídeo ao polipeptídeo de NgRpode ocorrer, por exemplo, por construir uma molécula de ácido nucléicoque compreende: (a) seqüência de ácido nucléico que codifica o sinalizadorde polipeptídeo, e (b) uma seqüência de ácido nucléico que codifica um poli-peptídeo de NgR. Sinalizadores de polipeptídeo exemplares incluem, porexemplo, seqüências de aminoácido que são capazes de ser modificadaspós-traducionalmente, por exemplo, seqüências de aminoácido que são bio-tiniladas. Outros sinalizadores de polipeptídeo exemplares incluem, por e-xemplo, seqüências de aminoácido que são capazes de ser reconhecidase/ou ligadas por um anticorpo (ou fragmento deste) ou outro reagente deligação específico. Sinalizadores de polipeptídeo que são capazes de serreconhecidos por um anticorpo (ou fragmento deste) ou outro reagente deligação específico incluem, por exemplo, aqueles que são conhecidos natécnica como "sinalizadores de epitopo". Um sinalizador de epitopo pode serum sinalizador de epitopo natural ou artificial. Sinalizadores de epitopo natu-rais e artificiais são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo epitoposartificiais tais como, peptídeos FLAG, Strep, ou polihistidina. PeptídeosFLAG incluem a seqüência Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ IDNO:74) ou Asp-Tyr-Lys-Asp-Glu-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO:75) (Einhauer, A.& Jungbauer, A., J. Biochem. Biophys. Methods 49: 1-3:455-465 (2001)). Oepitopo Strep tem a seqüência Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (SEQID NO:76). O epitopo VSV-G também pode ser usado e tem a seqüênciaTyr-Thr-Asp-He-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys (SEQ ID NO:77). Outro epito-po artificial é uma seqüência de poli-His que tem seis resíduos de histidina(His-His-His-His-His-His (SEQ ID NO: 78)). Epitopos que ocorrem natural-mente incluem a seqüência da hemaglutinina (HA) do vírus influenza Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala-He-Glu-Gly-Arg (SEQ ID NO: 79) reconhe-cida pelo anticorpo monoclonal 12CA5 (Murray et al, Anal. Biochem.229:170-179 (1995)) e a seqüência de onze aminoácidos de c-myc (Myc)humano reconhecida pelo anticorpo monoclonal 9E10 (Glu-Gln-Lys-Leu-Leu-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu-Asn (SEQ ID N0:80) (Manstein et al, Gene 762:129-134 (1995)). Outro epitopo útil é o tripeptídeo Glu-Glu-Phe que é reconheci-do pelo anticorpo monoclonal YL 1/2. (Stammers et al. FEBS Lett. 283:298-302(1991)).
Em certas modalidades, o polipeptídeo de NgR e o sinalizadorde polipeptídeo podem ser ligados através de uma seqüência de aminoácidode ligação. Como usado aqui, uma "seqüência de aminoácido de ligação"pode ser uma seqüência de aminoácido que é capaz de ser reconhecidae/ou clivada por uma ou mais proteases. Seqüências de aminoácido quepodem ser reconhecidas e/ou clivadas por uma ou mais proteases são co-nhecidas na técnica. Seqüências de aminoácido exemplares são aquelasque são reconhecidas pelas seguintes proteases: fator Vila, fator, IXa, fatorXa, APC, t-PA, u-PA, tripsina, quimiotripsina, enteroquinase, pepsina, catep-sina Β, Η, L, S, D, catepsina G, renina, enzima conversora de angiotensina,metaloproteases de matriz (colagenases, estromelisinas, gelatinases), elas-tase de macrófago, Cir1 e Cis. As seqüências de aminoácido que são reco-nhecidas pelas proteases mencionadas acima são conhecidas na técnica.
Seqüências exemplares reconhecidas por certas proteases podem ser en-contradas, por exemplo, na Patente U.S. No. 5.811.252.
Sinalizadores de polipeptídeo podem facilitar a purificação usan-do meios cromatográficos disponíveis comercialmente.
Em algumas modalidades da invenção, um constructo de fusãode polipeptídeo de NgR é usado para aumentar a produção de uma porçãode polipeptídeo de NgR em bactérias. Em tais constructos, uma proteínabacteriana, normalmente expressa e/ou secretada em um alto nível, é em-pregada como uma parceiro de fusão N-terminal de um polipeptídeo oufragmento de polipeptídeo de 1 NgR1 da invenção. Veja, por exemplo, Smithet al., Gene 67:31 (1988); Hopp et al, Biotechnology 6:1204 (1988); La Vallieet al, Biotechnology 11:187 (1993).
Por fundir uma porção de polipeptídeo de NgR às terminaçõesamino e carbóxi de um parceiro de fusão adequado, formas bivalentes outetravalentes de um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR1 po-dem ser obtidas. Por exemplo, uma porção de polipeptídeo de NgR pode serfundida às terminações amino e carbóxi de uma porção de Ig para produzirum polipeptídeo monomérico bivalente que contêm duas porções de polipep-tídeo de NgR. Mediante dimerização de dois desses monômeros, devido àporção de Ig, uma forma tetravalente de um polipeptídeo de NgR é obtida.Tais formas multivalentes podem ser fundidas para se obter afinidade deligação aumentada pelo alvo. Formas multivalentes de um polipeptídeo oufragmento de polipeptídeo de NgR da invenção também podem ser obtidaspor colocar porções de polipeptídeo de NgR aleatoriamente para formarconcatâmeros, que podem ser empregados sozinhos ou fundidos a um par-ceiro de fusão tal como Ig ou HSA.
Polímeros Conjugados (exceto polipeptídeos)
Algumas modalidades da invenção envolvem um polipeptídeo oufragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção em que um ou mais políme-ros são conjugados (ligados covalentemente) ao polipeptídeo de NgR. E-xemplos de polímeros adequados para tal conjugação incluem polipeptídeos(discutidos acima), polímeros de açúcar e cadeias de polialquileno glicol.
Tipicamente, mas não necessariamente, um polímero é conjugado ao poli-peptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção com o propósi-to de melhorar um ou mais dentre o seguinte: solubilidade, estabilidade oubiodisponibilidade.
A classe de polímero geralmente usada para conjugação a umpolipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção é um poli-alquileno glicol. Polietileno glicol (PEG) é o mais freqüentemente usado.Porções de PEG, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 polímeros de PEG, podem serconjugadas a cada polipeptídeo de NgR para aumentar a meia-vida sérica,quando comparado ao polipeptídeo de NgR sozinho. Porções de PEG sãonão-antigênicas e essencialmente inertes biologicamente. Porções de PEGusadas na prática da invenção podem ser ramificadas ou não ramificadas.
O número de porções de PEG ligadas ao polipeptídeo de NgR eo peso molecular das cadeias de PEG individuais podem variar. Em geral,quanto maior o peso molecular do polímero, menores as cadeias de políme-ros ligadas ao polipeptídeo. Geralmente, a massa total de polímero ligada aum polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de NgR é de 20 kDa a 40kDa. Assim, se uma cadeia de polímero está ligada, o peso molecular dacadeia é geralmente de 20 a 40 kDa. Se duas cadeias de polímero estãoligadas, o peso molecular de cada cadeia é geralmente de 10 a 20 kDa. Setrês cadeias estão ligadas, o peso molecular é geralmente de 7 a 14 kDa.
O polímero, por exemplo, PEG, pode estar ligado ao polipeptí-deo de NgR através de qualquer grupo reativo adequado exposto sobre opolipeptídeo. O(s) grupo(s) reativo(s) exposto(s) pode(m) ser, por exemplo,um grupo amino N-terminal ou o grupo amino épsilon de um resíduo internode lisina ou ambos. Um polímero ativado pode reagir e se ligar covalente-mente em qualquer grupo amino livre sobre o polipeptídeo de NgR. Gruposcarboxílicos livres, grupos carbonila adequadamente ativados, hidroxila,guanidila, imidazol, porções de carboidrato oxidado e grupos mercapto dopolipeptídeo de NgR (se disponíveis) também podem ser usados como gru-pos reativos para ligação de polímero.
Em uma reação de conjugação, de cerca de 1,0 a cerca de 10moles de polímero ativado por mol de polipeptídeo, dependendo da concen-tração de polipeptídeo, é tipicamente empregado. Geralmente, a proporçãoescolhida representa um equilíbrio entre maximizar a reação enquanto seminimiza as reações colaterais (geralmente inespecíficas) que podem preju-dicar a atividade farmacológica desejada da porção de polipeptídeo de NgR.Preferivelmente, pelo menos 50% da atividade biológica (como demonstra-do, por exemplo, em qualquer um dos ensaios descritos aqui ou conhecidosna técnica) do polipeptídeo de NgR é mantida e mais preferivelmente apro-ximadamente 100% é mantida.
O polímero pode ser conjugado ao polipeptídeo de NgR usandoquímica convencional. Por exemplo, uma porção de polialquileno glicol podeser acoplada a um grupo amino épsilon de Iisina do polipeptídeo de NgR. Aligação a uma cadeia lateral de iisina pode ser realizada com um éster ativode N-hidroxilsuccinimida (NHS) tal como succinimidil succinato (SS-PEG) esuccinimidil propionato (SPA-PEG) de PEG. Porções de polialquileno glicoladequadas incluem, por exemplo, carboximetil-NHS e norleucina-NHS, SC.Esses reagentes estão comercialmente disponíveis. Ligantes de PEG deamina reativa adicionais podem ser substituídos pela porção succinimidila.Esses incluem, por exemplo, isotiocianatos, nitrofenilcarbonatos (PNP), epó-xidos, carbonatos de benzotriazol, SC-PEG, tresilato, aldeído, epóxido, car-bonilimidazol e carbonato de PNP. As condições são geralmente otimizadaspara maximizar a seletividade e a extensão da reação. Tal otimização decondições de reação está dentro do conhecimento do versado na técnica.
A PEGuilação pode ser executada por qualquer uma das rea-ções de PEGuilação conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Focus onGrowth Factors, 3: 4-10, 1992 e pedidos de patente europeus EP 0 154 316e EP 0 401 384. A PEGuilação pode ser executada usando uma reação deacilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de polietileno glicolreativa (ou um polímero análogo solúvel em água reativo).
PEGuilação por acilação geralmente envolve reagir um derivadode éster ativo de polietileno glicol. Qualquer molécula de PEG reativa podeser empregada na PEGuilação. PEG esterificado para N-hidroxissuccinimida(NHS) é um éster de PEG ativado freqüentemente usado. Como usado aqui,"acilação" inclui, sem limitação, os seguintes tipos de ligações entre a prote-ína terapêutica e um polímero solúvel em água tal como PEG: amida, car-bamato, uretano e semelhantes. Veja, por exemplo, Bioconjugate Chem. 5:133-140, 1994. Os parâmetros da reação são geralmente selecionados paraevitar condições de temperatura, solvente e pH que possam danificar ou ina-tivar o polipeptídeo de NgR.
Geralmente, a ligação de conexão é uma amida e tipicamentepelo menos 95% do produto resultante é mono-, di- ou triPEGuilado. Entre-tanto, algumas espécies com graus mais elevados de PEGuilação podemser formadas em quantidades que dependem das condições específicas dereação usadas. Opcionalmente, espécies PEGuiIadas purificadas são sepa-radas da mistura, particularmente espécies não reagidas, por métodos con-vencionais de purificação, incluindo, por exemplo, diálise, precipitação porsalificação, ultrafiltração, cromatografia de troca de íon, cromatografia defiltração em gel, cromatografia de troca hidrofóbica e eletroforese.
PEGuilação por alquilação geralmente envolve reagir um deriva-do de aldeído terminal de PEG com um polipeptídeo ou fragmento de poli-peptídeo de NgR1 da invenção na presença de um agente redutor. Alémdisso, pode-se manipular as condições de reação para favorecer a PEGuiIa-ção substancialmente apenas no grupo amino N- terminal do polipeptídeo deNgR, isto é, uma proteína mono-PEGuilada. Em cada um dos casos de mo-no-PEGuilação ou poli-PEGuilação, os grupos de PEG estão tipicamenteligados à proteína através de um grupo -CH2-NH-. Com referência particularao grupo -CH2-, este tipo de ligação é conhecida como uma ligação "alquila".
Derivatização através de alquilação redutiva para produzir umproduto monoPEGuilado N-terminalmente direcionado explora a reatividadediferencial de diferentes tipos de grupos amino primários (lisina versus oterminal-N) disponíveis para derivatização. A reação é realizada em um pHque permite tirar vantagem das diferenças de pKa entre os grupos épsilon-amino dos resíduos de lisina e aquele do grupo amino N-terminal da proteí-na. Por tal derivatização seletiva, a ligação de um polímero solúvel em águaque contém um grupo reativo, tal como um aldeído, a uma proteína é contro-lada: a conjugação com o polímero ocorre predominantemente na termina-ção-N da proteína e não ocorre modificação significativa de outros gruposreativos, tais como os grupos amino das cadeias laterais de lisina.
As moléculas de polímero usadas tanto nas abordagens de aci-lação como de alquilação são selecionadas entre polímeros solúveis em á-gua. O polímero selecionado é tipicamente modificado para ter um únicogrupo reativo, tal como um éster ativo para acilação ou um aldeído para al-quilação, tal que o grau de polimerização pode ser controlado conforme for-necido nos presentes métodos. Um aldeído de PEG reativo exemplar é pro-pionaldeído de polietileno glicol, que é estável em água, ou derivados monoC1-C10 aicóxi ou ariióxi deste (veja, por exemplo, Harris ei ai, Pat. U.S. No.5.252.714). O polímero pode ser ramificado ou não-ramifiçado. Para as rea-ções de acilação, o(s) polímero(s) selecionado(s) tem(têm) tipicamente umúnico grupo de éster reativo. Para alquilação redutiva, o(s) polímero(s) sele-cionado(s) tem(têm) tipicamente um único grupo aldeído reativo. Geralmen-te, o polímero solúvel em água não será selecionado a partir dos resíduos deglicosila que ocorrem naturalmente, porque esses são geralmente feitosmais convenientemente por sistemas de expressão recombinante de mamí-feros.
Métodos para preparar polipeptídeos de NgR PEGuiIados dainvenção geralmente incluem as etapas de (a) reagir um polipeptídeo ou umfragmento de polipeptídeo de NgR1 da invenção com polietileno glicol (talcomo um éster ou aldeído reativos derivados de PEG) sob condições pelasquais a molécula se torna ligada a um ou mais grupos de PEG e (b) obtero(s) produto(s) de reação. Em geral, as condições ótimas de reação para asreações de acilação serão determinadas caso a caso com base em parâme-tros conhecidos e o resultado desejado. Por exemplo, uma maior proporçãode PEG para proteína geralmente leva a um percentual maior de produtopoli-PEGuilado.
Alquilação redutiva para produzir uma população substancial-mente homogênea de monopolímero/polipeptídeo de NgR geralmente incluias etapas de: (a) reagir um polipeptídeo ou um fragmento de polipeptídeo deNgR1 da invenção com uma molécula de PEG reativa sob condições de al-quilação redutiva, em um pH adequado para permitir a modificação seletivado grupo amino N-terminal de NgR; e (b) obter o(s) produto(s) de reação.
Para uma população substancialmente homogênea de mono-polímero/polipeptídeo de NgR, as condições de reação da alquilação reduti-va são aquelas que permitem a ligação seletiva da porção solúvel em águado polímero à terminação-N de um polipeptídeo ou fragmento de polipeptí-deo de NgR1 da invenção. Tais condições de reação geralmente fornecemdiferenças de pKa entre os grupos amino da cadeia lateral de Iisina e o gru-po amino N-terminal. Para os propósitos da presente invenção, o pH é ge-ralmente na faixa de 3 a 9, tipicamente 3 a 6.
Polipeptídeos de NgR da invenção podem incluir um sinalizador,por exemplo, uma porção que pode ser subseqüentemente liberada por pro-teólise. Assim, a porção de Iisina pode ser modificada seletivamente primei-ro, por reagir um sinalizador de His (His-tag) modificado com um Iigante debaixo peso molecular, tal como, reagente de Traut (Pierce Chemical Com-pany, Rockford, IL) que reagirá com a Iisina e com a terminação-N e entãoliberar o sinalizador de His. O polipeptídeo conterá então um grupo SH livreque pode ser seletivamente modificado com um PEG contendo um grupocabeça tiol-reativo tal como um grupo de maleimida, um grupo vinilsulfona,um grupo haloacetato ou uma SH livre ou protegida.
O reagente de Traut pode ser substituído por qualquer Iiganteque ativar um sítio específico para a ligação de PEG. Por exemplo, o rea-gente de Traut pode ser substituído por SPDP, SMPT, SATA ou SATP (Pier-ce Chemical Company, Rockford, IL). Similarmente, pode-se reagir a proteí-na com um Iigante de amina reativa que insere uma maleimida (por exemplo,SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, ou GMBS), umgrupo haloacetato (SBAP, SIA, SIAB) ou um grupo vinilsulfona e reagir oproduto resultante com um PEG que contém uma SH livre.
Em algumas modalidades, a porção de polialquileno glicol estáacoplada um grupo de cisteína do polipeptídeo de NgR. O acoplamento po-de ser efetuado usando, por exemplo, um grupo maleimida, um grupo vinil-sulfona, um grupo haloacetato ou um grupo tiol.
Opcionalmente, o polipeptídeo de NgR é conjugado à porção depolietileno glicol através de uma ligação lábil. A ligação lábil pode ser cliva-da, por exemplo, em hidrólise bioquímica, proteólise ou clivagem de sulfidri-la. Por exemplo, a ligação pode ser clivada sob condições in vivo (fisiológi-cas).
As reações podem ocorrer por qualquer método adequado usa-do para reagir materiais biologicamente ativos com polímeros inertes, geral-mente em pH de cerca de 5 a 8, por exemplo, pH 5, 6, 7 ou 8, se os gruposreativos estão sobre o grupo alfa amino na terminação-N. Geralmente o pro-cesso envolve preparar um polímero ativado e depois reagir a proteína como polímero ativado para produzir a proteína solúvel adequada para a formu-lação.
Os polipeptídeos de NgR da invenção, em certas modalidades,são polipeptídeos solúveis. Métodos para fazer um polipeptídeo solúvel oumelhorar a solubilidade de um polipeptídeo são bem-conhecidos na técnica.Moléculas de Ácido Nucléico da Presente Invenção
A presente invenção proporciona um ácido nucléico que codificaum polipeptídeo da invenção, incluindo os polipeptídeos de qualquer umadas SEQ ID Nos: 1 a 9, 26 a 27, 29 a 37 e 41 a 45. Em algumas modalida-des, o ácido nucléico codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupoque consiste nos resíduos de aminoácido 26 a 344 do receptor Nogo-1 comomostrado nas SEQ ID Nos: 6 e 8 ou resíduos de aminoácido 27 a 344 doreceptor Nogo-1 como mostrado na SEQ ID NO: 8. Em algumas modalida-des, a molécula de ácido nucléico codifica um polipeptídeo selecionado apartir do grupo que consiste nos resíduos de aminoácido 26 a 310 do recep-tor Nogo-1 como mostrado nas SEQ ID Nos: 7 e 9 ou resíduos de aminoáci-do 27 a 310 do receptor Nogo-1 como mostrado na SEQ ID NO: 9. Comousado aqui, "ácido nucléico" significa DNA genômico, cDNA, mRNA e molé-culas anti-sentido, assim como ácidos nucléicos baseados em estruturasprincipais alternativos ou que incluem bases alternativas tanto derivados defontes naturais quanto sintetizados. Em algumas modalidades, o ácido nu-cléico ainda compreende um promotor transcricional e opcionalmente umaseqüência de sinal, cada qual operativamente ligado à seqüência de nucleo-tídeos que codifica o polipeptídeo da invenção.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um ácido nu-cléico que codifica uma proteína de fusão do receptor Nogo-1 da invenção,incluindo uma proteína de fusão que compreende um polipeptídeo selecio-nado do grupo que consiste nos resíduos de aminoácido 26 a 344 do recep-tor Nogo-1 como mostrado nas SEQ ID Nos: 6 e 8 ou resíduos de aminoáci-do 27 a 344 de SEQ ID NO:8 e resíduos de aminoácido 26 a 310 do receptorNogo-1 como mostrado nas SEQ ID Nos: 7 e 9 ou resíduos de aminoácido27 a 310 de SEQ ID NO:9. Em algumas modalidades, o ácido nuciéico codi-fica uma proteína de fusão do receptor Nogo-1 que compreende polipeptí-deos selecionados a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 26 a 27,29 a 37 e 41 a 45. Em algumas modalidades, o ácido nucléico que codificauma proteína de fusão do receptor Nogo-1 ainda compreende um promotortranscricional e opcionalmente uma seqüência de sinal. Em algumas modali-dades, a seqüência de nucleotídeos ainda codifica uma região constante deimunoglobulina. Em algumas modalidades, a região constante de imunoglo-bulina é uma região constante de cadeia pesada. Em algumas modalidades,a seqüência de nucleotídeos ainda codifica uma região constante de cadeiapesada de imunoglobulina ligada a uma região de dobradiça. Em algumasmodalidades, o ácido nucléico ainda codifica Fe. Em algumas modalidades,as proteínas de fusão do receptor Nogo-1 compreendem um fragmento deFe.
Os ácidos nucléicos codificantes da presente invenção podemainda ser modificados a fim de conter um marcador detectável para fins dediagnóstico e sonda. Uma variedade de tais marcadores são conhecidos natécnica e podem ser facilmente empregados com as moléculas codificantesdescritas aqui. Marcadores adequados incluem, mas não são limitados abiotina, nucleotídeos radiomarcados e semelhantes. O versado ma técnicapode empregar qualquer um dos marcadores conhecidos na técnica paraobter uma molécula de ácido nucléico marcada.
A presente invenção também inclui polinucleotídeos que hibridi-zam sob condições moderadamente estringentes ou de alta estringência àfilamento não codificante, ou complemento, de um polinucleotídeo que codi-fica qualquer um dos polipeptídeos da invenção. Condições estringentes sãoconhecidas daqueles versados na técnica e podem ser encontradas emCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons,N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.
O polinucleotídeo do receptor Nogo-1 humano é mostrado abai-xo como SEQ ID N0:81.
O receptor Nogo-1 humano de extensão completa é codificadopelo nucleotídeo 166 ao nucleotídeo 1587 de SEQ ID N0:81:ageccageca gagecgggcg gageggagcg cgccgagcct cgtcccgcggccgggccggg gccgggccgt agcggcggcg cctggatgcg gacccggccgcggggagacg ggcgcccgcc ccgaaacgac tttcagtccc cgacgcgccccgcccaaccc ctacgatgaa gagggcgtcc gctggaggga gccggctgctggcatgggtg ctgtggctgc aggcctggca ggtggcagcc ccatgcccaggtgcctgcgt atgctacaat gagcccaagg tgacgacaag ctgcccccagcagggcctgc aggctgtgcc cgtgggcatc cctgctgcca gccagcgcatcttcctgcac ggcaaccgca tctcgcatgt gccagctgcc agcttccgtgcctgccgcaa cctcaccatc ctgtggctgc actcgaatgt gctggcccgaattgatgcgg ctgccttcac tggcctggcc ctcctggagc agctggacctcagcgataat gcacagctcc ggtctgtgga ccctgccaca ttccacggcctgggccgcct acacacgctg cacctggacc gctgcggcct gcaggagctgggcccggggc tgttccgcgg cctggctgcc ctgcagtacc tctacctgcaggacaacgcg ctgcaggcac tgcctgatga caccttccgc gacctgggcaacctcacaca cctcttcctg cacggcaacc gcatctccag cgtgcccgagcgcgccttcc gtgggctgca cagcctcgac cgtctcctac tgcaccagaaccgcgtggcc catgtgcacc cgcatgcctt ccgtgacctt ggccgcctcatgacactcta tctgtttgcc aacaatctat cagcgctgcc cactgaggccctggcccccc tgcgtgccct gcagtacctg aggctcaacg acaacccctgggtgtgtgac tgccgggcac gcccactctg ggcctggctg cagaagttccgcggctcctc ctccgaggtg ccctgcagcc tcccgcaacg cctggctggccgtgacctca aacgçctagc tgccaatgac ctgcagggct gcgctgtggccaccggccct taccatceea tctggaccgg cagggccacc gatgaggagccgctggggct tcccaagtgc tgccagccag atgccgctga caaggcctcagtactggagc ctggaagacc agcttcggca ggcaatgcgc tgaagggacgcgtgccgccc ggtgacagcc cgccgggcaa cggctctgge ccacggcacatcaatgacte accctttggg actctgcctg gctctgctga gcccccgctcactgcagtgc ggeccgaggg ctccgagcca ccagggttcc ceacctcgggccctcgccgg aggccaggct gttcacgcaa gaaccgcacc cgcagccactgccgtctggg ccaggcaggc agegggggtg gcgggactgg tgactcagaa.ggctcaggtg ccctacccag cctcacctgc agcctcaccc ccctgggcctggcgctggtg ctgtggacag tgcttgggcc ctgctgaccc ccagcggacaeaagagegtg ctcagcagcc aggtgtgtgt acatacgggg tctctctccacgccgccaag ccagccgggc ggccgacccg tggggcaggc caggccaggtcctccctgat ggacgcctg
O polinucleotídeo do receptor Nogo-1 de rato é mostrado abaixocomo SEQ ID NO:82 e tem número de acesso NM_053613 no GenBank.
atgaagaggg cgtcctccgg aggaagccgg ctgccgacat gggtgttatg
gctacaggcc tggagggtag caacgccctg ccctggtgcc tgtgtgtgctacaatgagcc caaggfccaca acaagccgcc
gtacccgctg gcatcccagc ctccagccag
ccgaatctct tacgtgccag ccgccagctt
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ttctgcatgg caaccgtatc cccagtgttc
ttgcacagtc ttgaccgtct cctcttgcac
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tctctgcagt acctgcgact eaatgacaac
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aggccggcgt ctgttggaaa tgcactcaag
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cctgccctgg cctgcagcct tgctcctctg
gacagtgctt gggccctgct ga
O polinucleotídeo do receptor Nogo-1 de camundongo é mostra-do abaixo como SEQ ID NO:83 e tem número de acesso NM_022982 noGenBank.
agccgcagcc cgcgagccca gcccggcccg gtagagcgga gcgccggagcctcgtcccgc ggccgggccg ggaccgggcc ggagcagcgg cgcctggatgcggacccggc cgcgcgcaga cgggcgcccg ccccgaagcc gcttccagtgcccgacgcgc cccgctcgac cccgaagatg aagagggcgt cctccggaggaagcaggctg ctggcatggg tgttatggct acaggcctgg agggtageaacaccatgccc tggtgcttgt gtgtgctaca atgagcccaa ggtaacaacaagctgccccc agcagggtct gcaggctgtg cccactggca tcccagcctctagccagcga atcttcctgc atggcaaccg aatctctcac gtgocagctgcgagcttcca gtcatgccga aafcctcacta tcctgtggct gcactctaatgcgctggctc ggatcgatgc tgctgccttc actggtctga ccctcctggagcaactagat cttagtgata atgcacagct tcatgtcgtg gaccctaccacgttccacgg' cctgggccac ctgcacacac tgcacctaga ccgatgtggcctgcgggagc tgggtccegg cctattccgt ggactagcag ctctgcagtacctctaccta caagacaaca atctgcaggc actccctgac aacacctttcgagacctggg caacctcacg catctctttc tgcatggcaa ccgtatccccagtgtgcctg agcacgcttt ccgtggcctg cacagtcttg accgcctccfccttgcaccag aaccatgtgg ctcgtgtgca cccacatgcc ttccgggaccttggccgcct catgaccctc tacctgtttg ccaacaacct ctccatgctgcctgcagagg tcctaatgcc cctgaggtct ctgcagtacc tgcgactcaatgacaacccc tgggtgtgtg actgccgggc acgtccactc tgggcctggctgcagaagtt ccgaggttcc tcatcagagg tgccctgcaa cctgccccaacgcctggcag accgtgatct taagcgcctc gctgccagtg acctagagggctgtgctgtg gcttcaggac ccttccgtcc catccagacc agtcagctcactgatgagga gctgctgagc ctccccaagt gctgccagcc agatgctgcagacaaagcct cagtactgga acccgggagg ccagcttctg ccggaaacgocctcaaggga cgtgtgcctc ccggtgacac tccaccaggc aatggctcaggccctcggca catcaatgac tctccatttg gaactttgcc cagctctgcagagcccccac tgactgccct gcggcctggg ggttccgagc caccaggact'tcccaccact ggtccccgca ggaggccagg ttgttcccgg aagaatcgcacccgcagcca ctgccgtctg ggccaggcgg gaagtggggc cagtggaaca
cccagcagggagaatcttccccagtcatgcccgggattgagatcttagtgtggcctgggcagctggggccctacaagacagggcaacctcctgagcacgccagaaccatgactcatgaccaggtccfcagtccctgggtgtgttccgaggtcaggccgtgagtggcttcggggagctgctgcctcagtactggacgtgtgcgcacatcaatcactgactgcacgggcccccccactgccgtcagaaggttcggccttgcac
cctgcaggcttgcacggeaacggaatctcatgccgcggccacaatgcacacacctgcacatggcctattcacaacctgcaacgcatctcttttccgtggctggctcgtgtctctacctgtgcccctgagggtgactgcagtcctcatccgtctgaagcgcggcccttccgggcctccccaggaacccgggctcccggtgagactctccatcctgcggcctgcaggaggccctgggccagggggggccetgtggtactttgggggacgcagtcctctgggccagccaccagccagccagagcagatgcctcgggttccgggcggtatatagcgtggaataa
agggttcaggcttgcactggccaccaggtgccagggacagoccaccagccggtggcgtttagatatgaatagagctcttt
ggctctgccttactttggactgtgtacatagctctgagggcacccccatcgttccagaactttattttactcttaaaaaa
gctctggcctagtgcttgggtggggtctccgcaggccaggtccaccccatgccacctcccttgtgtaaaaaaaaaaaaaa
gcagccttgcccctgctgacctccacgccgccctccctgacatgtttacaacccggatcgtatcggatgaaa
O polinucleotídeo do receptor Nogo-2 humano é mostrado abai-xo como SEQ ID NO:84 e é o número de acesso BK001302 no GenBank.
atgctgcccg ggctcaggcg cctgctgcaa gctcccgcct cggcctgcctcctgctgatg ctcctggccc tgcccctggc ggcccccagc tgccccatgctctgcacctg ctactcatcc ccgcccaccg tgagctgcca ggccaacaacttctcctctg tgccgctgtc cctgccaccc agcactcagc gactcttcctgcagaacaac ctcatccgca cgctgcggcc aggcaccttt gggtccaacctgctcaccct gtggctcttc tccaacaacc tctccaccat ctacccgggcactttccgcc acttgcaagc cctggaggag ctggacctcg gtgacaaccggcacctgcgc tcgctggagc ccgacacctt ccagggcctg gagcggctgcagtcgctgca tttgtaccgc tgccagctca gcagcctgcc cggcaacatcttccgaggcc tggtcagcct gcagtacctc tacctccagg agaacagcctgctccaccta caggatgact tgttcgcgga cctggccaac ctgagccacctcttcctcca cgggaaccgc ctgcggctgc tcacagagca cgtgtttcgcggcctgggca gcctggaccg gctgctgctg cacgggaacc ggctgcagggcgtgcaccgc gcggccttcc gcggcctcag ccgcctcacc atcctctacctgttcaacaa cagcctggcc tcgctgcccg gcgaggcgct cgccgacctgccctcgctcg agttcctgcg gctcaacgct aacccctggg cgtgcgactgccgcgcgcgg ccgctctggg cctggttcca gcgcgcgcgc gtgtccagctccgacgtgac ctgcgccacc cccccggagc gccagggccg agacctgcgcgcgctccgcg aggccgactt ccaggcgtgt ccgcccgcgg cacccacgcggccgggcagc cgcgcccgcg gcaacagctc ctccaaccac ctgtacggggtggccgaggc cggggcgccc ccagccgatc cctccaccct ctaccgagatctgcctgccg aagactcgcg ggggcgccag ggcggggacg cgcctactgaggacgactac tgggggggct acgggggtga ggaccagcga ggggagcagatgtgccccgg cgctgcctgc caggcgcccc cggactcccg aggccctgcgctctcggccg ggctccccag ccctctgctt tgcctcctgc tcctggtgccccaccacctc tga
O polinucleotídeo do receptor Nogo-2 de camundongo é mostra-do abaixo como SEQ ID NO:85 e é o número de acesso NM_199223 noGenBank.
atgctgcccg ggctccggcg cctgctgcaa ggtcctgcct cagcctgcctactgctgaca ctcctggccc ttccttccgt gacccccagc tgtcctatgctctgcacctg ctactcctcc ccgcccaccg tgagctgcca ggccaacaacttctcctcag tgccgctgtc cttgccaccc agtacaeaga gactcttcttgcagaacaac ctcatccgct cactgcggcc aggcaccttt gggcccaacctgctcaccct gtggctcttc tccaacaacc tctccaccat ccaccctggcaccttccgcc acctgcaggc cctagaagaa ctggacctcg gtgacaaccggcacctgcgc tccctggagc ccgacacctt ccagggtctg gagaggctgcagtcactaca cctgtatcgt tgccagctca gcagcctgcc tggcaacattttccgaggct tggtcagcct acagtacctc tacctccagg agaacagcctgctccatcta caggatgact tgttcgcgga cctggccaac ctgagccacctcttcctcca cgggaaccgc ctgcggctgc tcacggagca cgtgttccgcggcttgggca gcctggaccg. gctgttgctg cacgggaacc ggctgcagggcgtgcaccgc gcggctttcc acggcctcag ccgcctcacc atcctctacctgttcaacaa cagcctggcc tcgctgccgg gagaggcgct ggccgacctgccggcgctcg agttcctgcg gctcaacgcc aacccctggg cgtgcgactgccgcgctcgg ccgctctggg cttggttcca gcgcgcgcgg gtgtccagctccgacgtgac ctgcgccacc ccgcccgagc gccagggccg ggacctgcgcgcgctgcgcg actccgattt ccaagcgtgc ccgccgccca cgcccacgcggccgggcagc cgcgcccgcg gcaacagctc ttccaaccac ctgtacggcgtggccgaggc tggcgctccc cccgcagacc cgtccacgct ctaccgagatctgcccgccg aggactcgcg ggggcgccag ggcggggacg cgcccaccgaggacgactac tgggggggct acggcggcga ggatcagcgg ggcgagcagacgtgtcccgg ggccgcgtgc caggcgcccg cagactcgcg tggccccgcgctctcggccg ggctgcgcac ccctctgctc tgcctcttgc ccctggcgctccatcacctctga
O polinucleotídeo do receptor Nogo-3 humano é mostrado abai-xo como SEQ ID NO:86 e é o número de acesso BK001305 no GenBank.
atgcttcgca aagggtgctg tgtggagttg ctgctgctgt tggtagctgcggagctgccc ctgggtggtg gctgcccacg ggactgtgtg tgctacccggcgcccatgac ggtcagctgc caggcgcaca actttgcagc catcccggagggcatccccg tggacagcga gcgcgtcttc ctgcagaaca accgcatcggcctcctccag cccggccacfc tcagccccgc catggtcacc ctgtggatctactcgaacaa catcacctac atccacccca gcaccttcga gggcttcgtgcacctggagg agctggacct cggcgacaac cggcagctgc ggacgctggcacccgagacc ttccagggcc tggtgaagct tcacgccctc tacctctacaagtgtgggct cagcgccttg ccggccggcg tctttggcgg cctgcacagccfcgcagtacc tctacctgoa ggacaaccac atcgagtacc tccaggacgacatcttcgtg gacctggtca acctcagcca cctgtttctc cacggcaacaagctgtggag tctgggcccg ggcaccttcc ggggcctggt gaacctggaccgtottfctgc tgcacgagaa ccagctgcag tgggtccacc acaaggcattccàcgacctc cgcaggctga ccaccctctt cctcttcaac aacagcctctcggagctgca gggtgagtgc ctggccccgc tgggggccct ggagttcctccgcctcaatg gcaacccctg ggactgtggt tgtcgcgcgc gctccctgtgggaatggctg cagaggttcc ggggctccag ctccgctgtc ccctgtgtgtcccctgggct gcggcacggc caggacctga agctgctgag ggccgaggacttccggaact gcacgggacc agcgtccccg caccagatca agtcacacacgctcaccacc accgacaggg ccgcccgcaa ggaaeaccac tcaccccacggccccaccag gagcaagggc cacccgcacg gcccccggcc cggccacaggaagccgggga agaactgcac caaccccagg aaccgcaatc agatctctaaggcgggcgcc gggaaacagg cccccgagct gccagactat gccccagactaccagcacaa gttcagtttt gacatcatgc ctacggcccg gcccaagaggaagggcaagt gtgcccgcag gacccccatc cgtgccccca gcggggtgcagcaggcctcc tcggccagtt ccctgggggc ctccctcctg gcctggacactggggctggc ggtcactctc cgctga
O polinucleotídeo do receptor Nogo-3 de camundongo é mostra-do abaixo como SEQ ID NO:87 e é o número de acesso BK001304 no Gen-Bank.atgcttcgca aagggtgctg tgtggaattg ctgctgttgc tgctcgctggagagctacct ctgggtggtg gttgtcctcg agactgtgtg tgctaccctgcgcccatgac tgtcagctgc caggcacaca actttgctgc catcccggagggcatcccag aggacagtga gcgcatcttc ctgcagaaca atcgcatcaccttcctccag cagggccact tcagccccgc catggtcacc ctctggatctactccaacaa catcactttc attgctccca acaccttcga gggotttgtgcatctggagg agctagacct tggagacaac cgacagctgc gaacgctggcacccgagacc ttccaaggcc tggtgaagct tcacgccctc tacctctataagtgtggact gagcgccctg cccgcaggca tctttggtgg cctgcacagcctgcagtatc tctacfctgca ggacaaccat atcgagtacc tccaagatgacacctttgtg gaccCggtca atctcagtca cttgtttctc catggtaacaagctatggag cctgggccaa ggcatcttcc ggggcctggt gaacctggaccggttgctgc tgcatgagaa ccagctacag tgggttcacc acaaggctttccatgacctc cacaggctaa ccaccctctt tctcttcaac aacagcctcactgagctgca gggtgactgt ctggcccccc tggtggcctt ggagttccttcgcctcaatg ggaatgcttg ggactgtggc tgccgggcac gttccctgtgggaatggctg cgaaggttcc gtggctctag ctctgctgtc ccctgcgcgacccccgagct gcggcaaggc caggatctga agctgctgag ggtggaggacttccggaact gcacaggacc agtgtctcct caccagatca agtctcacacgcttaccacc tctgacaggg ctgcccgcaa ggagcaccat ccgtcccatggggcctccag ggacaaaggc cacccacatg gccatccgcc tggctccaggtcaggfctaca agaaggcagg caagaactgc accagccaca ggaaccggaaccagatctct aaggtgagct ctgggaaaga gcttaccgaa ctgcaggactatgcccccga ctatcagcac aagttcagct ttgacatcat gcccaccgcacgacccaaga ggaagggcaa gtgtgctcgc aggaccccca tccgtgcccccagtggggtg cagcaggcat cctcaggcac ggcccttggg gccccactcctggcctggat actggggctg gcagtcactc tccgctga
Antagonistas do Polinucleotídeo de NgR1
Modalidades específicas compreendem antagonistas do polinu-cleotídeo de NgR1 que impedem a expressão de NgR1 (atenuação). Anta-gonistas do polinucleotídeo de NgR1 incluem, mas não são limitados a mo-léculas anti-sentido, ribozimas, siRNA, shRNA e RNAi. Tipicamente tais mo-léculas de ligação são administradas separadamente ao animal (veja, porexemplo, O'Connor, J. Neurochem. 56:560 (1991), mas tais moléculas deligação também podem ser expressas in vivo a partir de nucleotídeos absor-vidos por uma célula hospedeira e expressos in vivo. Veja também Oligode-oxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Bo-ca Raton, FL (1988).
A expressão do gene de NgR pode, em algumas modalidades,ser inibida pelo uso de interferência de RNA ("RNAi"). RNAi refere-se a ex-pressão de um RNA que interfere com a expressão do mRNA alvo. RNAi éum fenômeno no qual a introdução de um RNA duplo-filamento (dsRNA) emuma célula causa a degradação do mRNA homólogo. Descoberto primeira-mente no nematódio Caenorhabditis elegans, foi descoberto então que RNAiocorre em uma ampla variedade de organismos. Um "ácido nucléico deRNAi" como usado aqui é uma seqüência de ácido nucléico geralmente me-nor do que 50 nucleotídeos de extensão que causa o silenciamento gênicoao nível do mRNA.
Por exemplo, em células de mamíferos, a introdução de um ds-RNA longo (> 30 nucleotídeos) pode iniciar uma resposta antiviral potente,exemplificada pela inibição inespecífica de síntese de proteína e degradaçãode RNA. Interferência de RNA fornece um mecanismo de silenciamento gê-nico ao nível de mRNA. Recentemente, RNAi tornou-se uma técnica de si-lenciamento gene-específica endógena e potente que usa RNAs duplo-filamento (dsRNA) para marcar um transcrito particular para degradação invivo. Ela também oferece uma abordagem eficiente e amplamente aplicávelpara repressão (knock-out) gênica. Além disso, a tecnologia de RNAi podeser usada para fins terapêuticos. Por exemplo, RNAi direcionado para apop-tose mediada por Fas mostrou proteger camundongos de hepatite fulminan-te. A tecnologia de RNAi foi descrita em várias publicações, tais como Pat.U.S. Nos. 5.919.619, 6.506.559 e Publicações PCT Nos. W099/14346,WO01/70949, W001/36646, WOOO/63364, WOOO/44895, W001/75164,W001/92513, WO01/68836 e W001/29058.
Especificamente, o RNAi silencia um gene alvo através de inte-ração com o mRNA específico (por exemplo NgR1) através de um siRNA(pequeno RNA de interferência). O complexo de dsRNA é então marcadopara degradação pela célula. Moléculas de RNAi adicionais incluem peque-no RNA em forma de grampo (shRNA); também pequeno RNA em forma degrampo de interferência (short interfering hairpin). A molécula de shRNAcontém seqüências senso e anti-sentido de um gene alvo conectadas porum loop. O shRNA é transportado do núcleo para o citoplasma, é degradadojunto com o mRNA. Promotores Pol Ill ou U6 podem ser usados para ex-pressar RNAs para RNAi. Uma seqüência capaz de inibir a expressão gêni-ca por interferência de RNA pode ter qualquer extensão. Por exemplo, a se-qüência pode ter pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100 ou maisnucleotídeos consecutivos. A seqüência pode ser dsRNA ou qualquer outrotipo de polinucleotídeo, contanto que a seqüência possa formar um comple-xo de silenciamento funcional para degradar o transcrito de mRNA alvo.
RNAi é mediada por moléculas de RNA de duplo filamento (ds-RNA) que têm homologia seqüência-específica aos seus mRNAs "alvos"(Caplen et al, Proc Natl Acad Sci USA 98:9742-9747, 2001). Estudos bio-químicos em Iisados livres de célula de Drosophila indicam que os mediado-res do silenciamento gênico dependente de RNA são dúpleces de RNA "deinterferência pequeno" (siRNAs) de 18 a 25 nucleotídeos. Conseqüentemen-te, moléculas de siRNA podem ser vantajosamente usadas nos métodos dapresente invenção. siRNAs podem ser produzidos endogenamente pela de-gradação de moléculas de dsRNA mais longas por uma nuclease relaciona-da à RNase Ill chamada Dicer. (Bernstein et al., Nature 409:363-366, 2001).siRNAs também podem ser introduzidos em uma célula exogenamente oupor transcrição de um constructo de expressão. Uma vez formados, os siR-NAs unem-se a complexos de proteína em complexos que contêm endorri-bonuclease conhecidos como complexos de silenciamento induzidos porRNA (RISCs). Uma desespiralização do siRNA gerada por ATP ativa osRISCs, que por sua vez atingem o transcrito de mRNA complementar porpareamento de base de Watson-Crick. Sem desejar estar preso a nenhumateoria em particular, acredita-se que um RISC é guiado para um mRNA alvo,onde o dúplex de siRNA interage de forma seqüência-específica para mediara clivagem de uma forma catalítica (Bernstein et al, Nature 409.363-366,2001; Boutla et al, Curr Biol J 7 7:1776-1780, 2001). A clivagem do mRNAocorre próximo do meio da região ligada pela filamento de siRNA. Essa de-gradação de mRNA seqüência-específica resulta no silenciamento gênico.
RNAi tem sido usada para analisar a função gênica e para identi-ficar genes essenciais em células de mamíferos (Elbashir et al, Methods26:199-213, 2002; Harborth et al, J CeIISei 7 74:4557-4565, 2001), incluindocomo forma de exemplos não Iimitantes os neurônios (Krichevsky et al, ProcNatl Aead Sei USA 99:11926-11929, 2002). RNAi também está sendo avali-ada para modalidades terapêuticas, tal como inibir ou bloquear infecção, re-plicação e/ou crescimento de vírus, incluindo sem limitação, poliovírus (Gitlinet al, Nature 470:379-380, 2002) e HIV (Capodici et al, J Immunol 769:5196-5201, 2002), e reduzir a expressão de oncogenes (por exemplo, o gene bcr-abl; Scherr et al, Blood 26 Set. epub ahead of prínt, 2002). RNAi foi usadapara modular a expressão gênica em embriões de mamíferos (camundongo)e anfíbios (Xenopus) (respectivamente, Calegari et al, Proc Natl Acad SciUSA 99. 14236-14240, 2002; e Zhou, et al, Nucleic Aeids Res 30:1664-1669,2002), e em camundongos após o nascimento (Lewis et al, Nat Genet32: 107-108, 2002) e para reduzir a expressão de transgene em camundon-gos transgênicos adultos (McCaffrey et al, Nature 418:38-39, 2002). Foramdescritos métodos para determinar a eficácia e especificidade de siRNAs emcultura celular e in vivo (veja, por exemplo, Bertrand et al, Bioehem BiophysRes Commun 296: 1000-1004, 2002; Lassus et al, Sei STKE2002(147):PL13, 2002; e Leirdal et al, Bioehem Biophys Res Commun295:744-748, 2002).
Moléculas que mediam RNAi, incluindo sem limitação siRNA,podem ser produzidas in vitro por síntese química (Hohjoh, FEBS Lett521:195-199, 2002), hidrólise de dsRNA (Yang etal, Proe NatIAeadSei USA99:9942-9947, 2002), por transcrição in vitro com RNA polimerase T7 (Don-zeet et al, Nueleie Aeids Res 30:e46, 2002; Yu et al, Proe NatIAead Sei USA99:6047-6052, 2002) e por hidrólise de RNA de duplo filamento usando umanuclease tal como RNase Ill de E. coli (Yang et al., Proe Natl Aead Sei USA99:9942-9947, 2002).
Moléculas de siRNA também podem ser formadas pelo anela-mento de dois oligonucleotídeos um ao outro, tendo tipicamente a seguinteestrutura geral, que inclui tanto porções de duplo filamento como de filamen-to simples:
<formula>formula see original document page 122</formula>
Em que Ν, X e Y são nucleotídeos; X pontes de hidrogênio a Y;":" significa uma ponte de hidrogênio entre duas bases; χ é um número intei-ro natural que tem um valor entre 1 e cerca de 100; e m e η são númerosinteiros que têm, independentemente, valores entre O e cerca de 100. Emalgumas modalidades, Ν, X e Y são, independentemente A, G, C e T ou U.Bases e nucleotídeos que não ocorrem naturalmente podem estar presen-tes, particularmente no caso de siRNA sintético (isto é, o produto de anela-mento de dois oligonucleotídeos). A seção central de filamento dupla é cha-mada "núcleo" e tem pares de bases (bp) como unidades de medida; as por-ções de filamento simples são projeções que tem nucleotídeos (NT) comounidades de medida. As projeções mostradas são projeções 3', mas molécu-las com projeções 5' também estão dentro do escopo da invenção. Dentrodo escopo da invenção também estão moléculas de siRNA sem projeções(isto é, m = 0 e η = 0) e aquelas que tem uma projeção de um lado do centromas não do outro (por exemplo, m = 0 e η > 1 ou vice-versa).
Inicialmente, a tecnologia de RNAi não pareceu ser facilmenteaplicável a sistemas de mamíferos. Isso por que, em mamíferos, dsRNA ati-va a proteína quinase (PKR) ativada por dsRNA resultando em cascata a-poptótica e morte celular (Der et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA 94:3279-3283, 1997). Além disso, há muito se sabe que dsRNA ativa a cascata deinterferon em células de mamíferos, o que também pode levar a fisiologiacelular alterada (Colby et al., Annu. Rev. Microbiol. 25:333, 1971; Klein-schmidt et al., Annu. Rev. Biochem. 41:517, 1972; Lampson et al., Proc.Nati Acad. Sei. USA 58-.L782, 1967; Lomniczi et ai, J. Gen. Viroi 5:55,1970; e Younger et al, J. Bacteriol. 92.862, 1966). Entretanto, a ativaçãomediada por dsRNA da PKR e cascatas de interferon requer dsRNAs maio-res do que cerca de 30 pares de bases. Em contraste, dsRNAs menores doque 30 pares de bases de extensão demonstraram causar RNAi em célulasde mamíferos (Caplen et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA 98:9742-9747,2001). Assim, é esperado que efeitos indesejáveis, inespecíficos associadoscom moléculas de dsRNA mais longas possam ser evitados pelo preparo deRNA curto que é substancialmente livre de dsRNAs mais longos.
Referências que se referem a siRNA: Bernstein et ai, Nature409·.363-366, 2001; Boutla et al, CurrBioI 77:1776-1780, 2001; Cullen, Natlmmunol. 3:597-599, 2002; Caplen et al, Proc Natl Acad Sci USA 98:9742-9747, 2001; Hamilton et al, Science 286:950-952, 1999; Nagase et al, DNARes. 6:63-70, 1999; Napoli et al, Plant Cell 2:279-289, 1990; Nicholson etal,Mamm. Genome 13:67-73, 2002; Parrish etal, Mol Cell 6:1077-1087, 2000;
Romano et al, Mol Microbiol 6:3343-3353, 1992; Tabara et al, Cell 99:123-132, 1999; e Tuschl, Chembiochem. 2:239-245, 2001.
Paddison etal (Genes & Dev. 76:948-958, 2002) usaram peque-nas moléculas de RNA dobradas em forma de grampo como um meio derealizar RNAi. Conseqüentemente, tais pequenas moléculas de RNA emforma de grampo (shRNA) também são vantajosamente usadas nos méto-dos da invenção. A extensão da haste e Ioop de shRNAs varia: as extensõesda haste (stem) podem variar em qualquer lugar entre cerca de 25 a cercade 30 nt e o tamanho da Ioop pode variar entre 4 a cerca de 25 nt sem afetara atividade de silenciamento. Apesar de não desejar estar preso a nenhumateoria em particular, acredita-se que esses shRNAs se pareçam com os pro-dutos de dsRNA da RNase DICER e, em qualquer evento, tenham a mesmacapacidade de inibir a expressão de um gene específico.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona que siRNA oushRNA inibe a expressão de NgR1. Em algumas modalidades, a invençãoainda proporciona que o siRNA ou shRNA é pelo menos 80%, 90%, ou 95%idêntico à seqüência de nucleotídeos que compreende: CUACUUCUCCCG-CAGGCG (SEQ DD NO: 52) ou CCCGGACCGACGUCUUCAA (SEQ ID NO:54) ou CUGACCACUGAGUCUUCCG (SEQ ID NO: 56). Em outras modali-dades, a seqüência de nucleotídeos de siRNA ou shRNA é CUACUU-CUCCCGCAGGCG (SEQ ID NO: 52) ou CCCGGACCGACGUCUUCAA(SEQ ID NO: 54) ou CUGACCACUGAGUCUUCCG (SEQ ID NO: 56).
Em algumas modalidades, a invenção ainda proporciona que aseqüência de nucleotídeo do siRNA ou shRNA é complementar ao mRNAproduzido pela seqüência de nucleotídeo GATGAAGAGGGCGTCCGCT(SEQ ID NO: 53) ou GGGCCTGGCTGCAGAAGTT (SEQ ID NO: 55) ouGACTGGTGACTCAGAG AAGGC (SEQ ID NO: 57).
Em algumas modalidades da invenção, o shRNA é expresso apartir de um vetor lentiviral como descrito no Exemplo 26.
Sintetizar quimicamente moléculas de ácido nucléico com modi-ficações (base, açúcar e/ou fosfato) pode impedir sua degradação por ribo-nucleases séricas, o que pode aumentar sua potência (veja, por exemplo,Eckstein et al, Publicação Internacional No. WO 92/07065; Perrault etal, Na-ture 344:565 (1990); Pieken etal, Science 253:314 (1991); Usman & Ceder-gren, Trends in Biochem. Sei. 17:334 (1992); Usman et al, Publicação Inter-nacional No. WO 93/15187; e Rossi et al, Publicação Internacional No. WO91/03162; Sproat, Pat. U.S. No. 5.334.711; Gold et al,. Pat U.S.. No.6.300.074; e Burgin et al, supra; todas as quais estão incorporadas aqui porreferência). Todas as referências acima descrevem várias modificaçõesquímicas que podem ser feitas às porções de base, fosfato e/ou açúcar dasmoléculas de ácido nucléico descritas aqui. Modificações que aumentam suaeficácia nas células e remoção de bases de moléculas de ácido nucléico pa-ra encurtar os tempos de síntese de oligonucleotídeos e reduzir as necessi-dades químicas são desejadas.
Existem vários exempios na técnica que descrevem modifica-ções no açúcar, base e fosfato que podem ser introduzidas em moléculas deácido nucléico com aumento significativo de sua estabilidade e eficácia denuclease. Por exemplo, oligonucleotídeos são modificados para aumentar aestabilidade e/ou aumentar a atividade biológica pela modificação com gru-pos resistentes a nuclease, por exemplo, 2'-amino, 2'-C-alila, 2'-flúor, 2'-0-metila, 2'-0-alila, 2'-H modificações de base de nucleotídeo (para uma revi-são veja Usman & Cedergren, TIBS. 17:34 (1992); Usman et al, Nucleic A-cids Symp. Ser. 31:163 (1994); Burgin et al, Biochemistry 35:14090 (1996)).Modificações de açúcar de moléculas de ácido nucléico têm sido amplamen-te descritas na técnica (veja Eckstein et al, Publicação Internacional PCT No.WO 92/07065; Perrault et al, Nature 344: 565-568 (1990); Pieken et al, Sci-ence 253: 314-317 (1991); Usman & Cedergren, Trends in Biochem. Sei. 17:334-339 (1992); Usman et al, Publicação Internacional PCT No. WO93/15187; Sproat, Pat. U.S. No. 5.334.711 e Beigelman etal, J. Bioi Chem.270:25702 (1995); Beigelman et al, Publicação Internacional PCT No. WO97/26270; Beigelman et al, Pat. U.S. No. 5.716.824; Usman et al, Pat. U.S.No. 5.627.053; Woolf et al, Publicação Internacional PCT No. WO 98/13526;Karpeisky et al, 1998, Tetrahedron Lett. 39:1131 (1998); Earnshaw & Gait1Biopolymers (Nucleic Acid Sciences) 48:39-55 (1998); Verma & Eckstein,Annu. Rev. Biochem. 67:99-134 (1998); e Burlina et al, Bioorg. Med. Chem.5:1999-2010 (1997); todas as referências estão incorporadas aqui por refe-rência, nas suas totalidades). Tais publicações descrevem métodos e estra-tégias gerais para determinar a localização de incorporação de modificaçõesde açúcar, base e/ou fosfato e semelhantes em moléculas de ácido nucléicosem modular a catálise e estão incorporadas aqui por referência. Conside-rando tais ensinamentos, modificações similares podem ser usadas comodescrito aqui para modificar as moléculas de ácido nucléico de siRNA dapresente invenção contanto que a habilidade de siRNA de estimular RNAiem células não seja significativamente inibida.
A invenção apresenta moléculas de siRNA modificadas, commodificações na estrutura principal de fosfato que compreendem uma oumais substituições de fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosfotries-ter, morfolino, amidato, carbamato, carboximetila, acetamidato, poliamida,sulfonato, sulfonamida, sulfamato, formacetal, tioformacetal e/ou alquisila.Para uma revisão de modificações do estrutura principal de oligonucleotí-deos veja Hunziker & Leumann, Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Pro-perties, in Modern Synthetic Methods, VCH, 331-417 (1995), e Mesmaekeret al, Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, in CarbohydrateModifications in Antisense Research, ACS, 24-39 (1994).
Embora modificação química de ligações internucleotídeo deoligonucleotídeos com ligações de fosforotioato, ligações de fosforotioatoe/ou 5'-metilfosfonato melhore a estabilidade, modificações químicas exces-sivas podem causar alguma toxicidade ou atividade diminuída. Portanto,quando se projeta moléculas de ácido nucléico, a quantidade dessas Iiga-ções internucleotídeo deve ser minimizada. A redução na concentração des-sas ligações deve diminuir a toxicidade, resultando em eficácia aumentada emaior especificidade dessas moléculas.Moléculas de siRNA que têm modificações químicas que man-têm ou aumentam a atividade são fornecidas. Tal ácido nucléico também égeralmente mais resistente a nucleases do que um ácido nucléico não modi-ficado. Conseqüentemente, a atividade in vitro e/ou in vivo não deve ser sig-nificativamente diminuída. Em casos nos quais a modulação é a meta, molé-culas terapêuticas de ácido nucléico liberadas exogenamente devem serotimamente estáveis dentro da célula até que a tradução do RNA alvo tenhasido modulada o suficiente para reduzir os níveis da proteína indesejável.Esse período de tempo varia entre horas a dias dependendo do estado dedoença. Melhoras na síntese química de RNA e DNA (Wincott et al, NucleicAcids Res. 23:2677 (1995); Caruthers et al, Methods in Enzymotogy 211:2-19 (1992) (incorporados aqui por referência) expandiram a habilidade demodificar moléculas de ácido nucléico pela introdução de modificações denucleotídeo para aumentar sua estabilidade a nuclease, como descrito acima.
Polinucleotídeos da presente invenção podem incluir um ou mais(por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, δ, 9, 10 ou mais) nucieotídeos "G-clamp". Um nucleotídeo "G-clamp" é um análogo de citosina modificado noqual as modificações conferem ao hidrogênio a habilidade de se ligar tantoàs faces Watson-Crick e Hoogsteen de uma guanina complementar dentrode um dúplex, veja, por exemplo, Lin & Matteucci, J. Am. Chem. Soe.720:8531 - 8532 (1998). Uma única substituição de análogo "G-clamp" dentrode um oligonucleotídeo pode resultar pode resultar em estabilidade térmicahelicoidal substancialmente aumentada e discriminação de não pareamentosquando hibridizado a oligonucleotídeos complementares. A inclusão de taisnucieotídeos em polinucleotídeos da invenção resulta em afinidade e especi-ficidade aumentadas a alvos, seqüências complementares ou filamentosmolde de ácidos nucléicos. Polinucleotídeos da presente invenção tambémpodem incluir um ou mais (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10ou mais) nucieotídeos de "ácido nucléico bloqueado" LNA tal como um nu-cleotídeo 2,,4'-C metileno biciclo (veja, por exemplo, Wengel et al, Publica-ção Internacional PCT No. WO 00/66604 e WO 99/14226).A presente invenção também apresenta conjugados e/ou com-plexos de moléculas de siRNA da invenção. Tais conjugados e/ou comple-xos podem ser usados para facilitar a liberação de moléculas de siRNA emum sistema biológico, tal como uma célula. Os conjugados e complexos for-necidos pela presente invenção podem conferir atividade terapêutica portransferir compostos terapêuticos através das membranas celulares, alteran-do a farmacocinética e/ou modulando a localização das moléculas de ácidonucléico da invenção. A presente invenção abrange o desenho e a síntesede novos conjugados e complexos para a liberação de moléculas, incluindo,mas não limitadas a pequenas moléculas, lipídios, fosfolipídios, nucleosí-deos, nucleotídeos, ácidos nucléicos, anticorpos, toxinas, polímeros negati-vamente carregados e outros polímeros, por exemplo, proteínas, peptídeos,hormônios, carboidratos, polietileno glicóis ou poliaminas, através das mem-branas celulares. Em geral, os transportadores descritos são projetados paraserem usados tanto individualmente quanto como parte de um sistema demúltiplos componentes, com ou sem Iigantes degradáveis. Espera-se queesses compostos melhorem a liberação e/ou localização de moléculas deácido nucléico da invenção em vários tipos de células que se originam dediferentes tecidos, na presença ou ausência de soro (veja Sullenger & Cech,Pat. U.S. No. 5.854.038). Conjugados das moléculas descritas aqui podemser ligadas a moléculas biologicamente ativas através de Iigantes que sãobiodegradáveis, tal como moléculas Iigantes de ácido nucléico biodegradá-veis.
Polinucleotídeos terapêuticos (por exemplo, moléculas de SiR-NA) liberadas exogenamente são otimamente estáveis dentro das célulasaté que a transcrição reversa do RNA tenha sido modulada o suficiente parareduzir os níveis do transcrito de RNA. As moléculas de ácido nucléico sãoresistentes às nucleases a fim de funcionar como agentes terapêuticos intra-celulares eficazes. As melhorias na síntese química de moléculas de ácidonucléico descritas na presente invenção e na técnica expandiram a habilida-de de modificar moléculas de ácido nucléico pela introdução de modificaçõesde nucleotídeos para aumentar sua estabilidade a nuclease como descritoacima.
A presente invenção também proporciona moléculas de siRNAque têm modificações químicas que mantêm ou aumentam a atividade en-zimática de proteínas envolvidas em RNAi. Tais ácidos nucléicos tambémsão mais resistentes às nucleases do que ácidos nucléicos não modificados.Assim, a atividade in vitro e/ou in vivo não deve estar significativamente di-minuída.
O uso das moléculas baseadas no polinucleotídeo da invençãolevará a um tratamento melhor da progressão de doença por fornecer a pos-sibilidade de terapias de combinação (por exemplo, múltiplas moléculas desiRNA direcionadas para genes diferentes; moléculas de ácido nucléico aco-pladas com moduladores de pequenas moléculas conhecidos; ou tratamentointermitente com combinações de moléculas, incluindo motivos diferentese/ou outras moléculas químicas ou biológicas). O tratamento de indivíduoscom moléculas de siRNA também pode incluir combinações de tipos diferen-tes de moléculas de ácido nucléico, tal como moléculas enzimáticas de ácidonucléico (ribozimas), alozimas, anti-sentido, 2,5-A oligoadeniladas, "decoys",aptâmeros, etc.
Em outro aspecto, uma molécula de siRNA da invenção podecompreender uma ou mais estruturas 5'- e/ou 3'-cap, por exemplo apenassobre a filamento de siRNA senso, filamento de siRNA anti-sentido ou emambas as filamentos de siRNA.
Por "estrutura cap" entende-se modificações químicas, que fo-ram incorporadas em qualquer terminação do oligonucleotídeo (veja, porexemplo, Adamic et ai, Pat. U.S. No. 5.998.203, incorporada aqui por refe-rência). Essas modificações terminais protegem a molécula de ácido nucléi-co da degradação por exonuclease e pode auxiliar na liberação e/ou locali-zação dentro de uma célula. O cap pode estar presente na terminação 5" (51-cap) ou na terminação 3' (3'-cap) ou pode estar presente em ambas as ter-minações. Em exemplos não limitantes: 5'-cap é selecionado a partir do gru-po que compreende um resíduo abásico invertido (porção); 4,,5'-metilenonucleotídeo; 1 -(beta-D-eritrofuranosil) nucleotídeo, 4'-tio nucleotídeo; núcleo-tídeo carbocíclico; 1,5-anidroexitol nucleotídeo; L-nucleotídeos; alfa-nucleotídeos; nucleotídeo com base modificada; ligação de fosforoditioato;treo-pentofuranosil nucleotídeo; 3',4'-sec nucleotídeo acíclico; 3,4-diidroxibutil nucleotídeo acíclico; 3,5-diidroxipentil nucleotídeo acíclico, 3'-3'-porção de nucleotídeo invertida; 3'-3'-porção abásica invertida; 3'-2'-porçãode nucleotídeo invertida; 3'-2'-porção abásica invertida; fosfato de 1,4-butanodiol; 3'-fosforamidato; hexilfosfato; fosfato de aminoexila; 3'-fosfato; 3'-fosforotioato; fosforoditioato; ou porção de metilfosfonato Iigante ou não Ii-gante.
O 3'-cap pode ser selecionado a partir do grupo que compreende4',5'-metileno nucleotídeo; l-(beta-D-eritrofuranosil) nucleotídeo; 4'-tio nucleo-tídeo, nucleotídeo carbocíclico; 5'-amino-alquil fosfato; 1,3-diamino-2-propilfosfato; 3-aminopropil fosfato; 6-aminoexil fosfato; 1,2-aminododecil fosfato;hidroxipropil fosfato; 1,5-anidroexitol nucleotídeo; L-nucleotídeo; alfa-nucleotídeo; nucleotídeo com base modificada; fosforoditioato; treo-pentofuranosil nucleotídeo; 3',4'-seco nucleotídeo acíclico; 3,4-diidroxibutilnucleotídeo; 3,5-diidroxipentiÍ nucleotídeo, S^S^porção de nucleotídeo inver-tida; 5'-5'- porção abásica invertida; 5'-fosforamidato; 5'-fosforotioato; fosfatode 1,4-butanodiol; 5'-amino; 5'-fosforamidato Iigante e/ou não ligante, fosfo-rotioato e/ou fosforoditioato, metilfosfonato ligante ou não ligante e porções5'-mercapto (para maiores detalhes veja Beaucage & lyer, Tetrahedron49:1925 (1993); incorporado aqui por referência).
Várias modificações à estrutura de ácido nucléico de siRNA po-dem ser feitas para aumentar a utilidade dessas moléculas. Tais modifica-ções aumentarão a vida útil, meia-vida in vitro, estabilidade e facilidade deintrodução de tais oligonucleotídeos no sítio alvo, por exemplo, para aumen-tar a penetração de membranas celulares e conferir habilidade de reconhe-cer e se ligar a células alvo.
A tecnologia anti-sentido pode ser usada para controlar a ex-pressão gênica através de DNA ou RNA anti-sentido ou através da formaçãode tripla hélice. Técnicas anti-sentido são discutidas, por exemplo, em Oka-no, J. Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense In-hibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988). A formaçãode tripla hélice é discutida, por exemplo, em Lee et ai., Nucleic Acids Rese-arch 6:3073 (1979); Cooney et ai, Science 241:456 (1988); e Dervan et ai,Science 257:1300 (1991). Os métodos são baseados na ligação de um poli-nucleotídeo a um DNA ou RNA complementar.
Por exemplo, a porção codificante 5' de um polinucleotídeo quecodifica NgR1 pode ser usada para desenhar um oligonucleotídeo de RNAanti-sentido de cerca de 10 a 40 pares de bases de extensão. Um oligonu-cleotídeo de DNA é designado para ser complementar a uma região do geneenvolvido na transcrição impedindo dessa forma a transcrição e a produçãoda proteína-alvo. O oligonucleotídeo de RNA anti-sentido hibridiza com omRNA in vivo e bloqueia a tradução da molécula de mRNA no polipeptídeoalvo.
Em uma modalidade, ácidos nucléicos anti-sentido específicospara o gene de NgR1 são produzidos intracelularmente pela transcrição apartir de uma seqüência exógena. Por exemplo, um vetor, ou uma porçãodeste, é transcrito produzindo um ácido nucléico anti-sentido (RNA). Tal ve-tor pode permanecer epissomal ou se tornar integrado ao cromossomo, con-tanto que ele possa ser transcrito para produzir o RNA anti-sentido desejado.Tais vetores podem ser construídos por métodos de tecnologia de DNA re-combinante usuais na técnica. Vetores podem ser plasmídeo, viral ou outrosconhecidos na técnica, usados para replicação e expressão em células devertebrados. A expressão da molécula anti-sentido pode ser por qualquerpromotor conhecido na técnica para atuar em células de vertebrados, prefe-rivelmente células humanas, tais como aquelas descritas aqui em outro lu-gar.
Complementaridade absoluta de uma molécula anti-sentido, a-pesar de preferida, não é necessária. Uma seqüência complementar a pelomenos uma porção de um RNA que codifica NgR1, significa uma seqüênciaque tem complementaridade suficiente para ser capaz de hibridizar com oRNA, formando um dúplex estável; ou a formação de tríplex pode ser testa-da. A habilidade de hibridizar dependerá do grau de complementaridade eda extensão do ácido nucléico anti-sentido. Geralmente, quanto maior o áci-do nucléico hibridizante, mais pareamentos de base errados ele pode contere ainda formar um dúplex estável (ou tríplex se for o caso). O versado natécnica pode determinar um grau tolerável de pareamentos errados pelo usode procedimentos padronizados para determinar o ponto de fusão do com-plexo hibridizado.
Oligonucleotídeos que são complementares à extremidade 5' deum RNA mensageiro, por exemplo, à seqüência 5' não traduzida até, e inclu-indo, o códon de início AUG, deveriam funcionar de forma mais eficaz nainibição da tradução. Entretanto, seqüências complementares às seqüências3' não traduzidas de mRNAs também se mostraram eficazes na inibição datradução de mRNAs. Veja, Wagner, R., Nature 372:333-335 (1994). Assim,oligonucleotídeos complementares a qualquer uma das regiões 5' ou 3' não-traduzidas, não-codificantes poderiam ser usados em uma abordagem anti-sentido para inibir a tradução de NgR1. Oligonucleotídeos complementares àregião 5' não-traduzida do mRNA devem incluir o complemento do códon deinício AUG. Oligonucleotídeos anti-sentido complementares às regiões codi-ficantes de mRNA são inibidores menos eficazes da tradução mas poderiamser usados de acordo com a invenção. Ácidos nucléicos anti-sentido devemter pelo menos seis nucleotídeos de extensão e são preferivelmente oligonu-cleotídeos que variam de cerca de 6 a cerca de 50 nucleotídeos de exten-são. Em aspectos específicos, o oligonucleotídeo tem pelo menos 10 nucleo-tídeos, pelo menos 17 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos ou pelomenos 50 nucleotídeos.
Polinucleotídeos para uso nos métodos terapêuticos descritosaqui, incluindo os aptâmeros descritos abaixo, podem ser de DNA ou RNAou misturas quiméricas ou derivados ou versões modificadas destes, de fi-lamento simples ou filamento duplo. O oligonucleotídeo pode ser modifica-ção na porção de base, porção de açúcar ou estrutura principal de fosfato,por exemplo, para melhorar a estabilidade da molécula, hibridização, etc. Ooligonucleotídeo pode incluir outros grupos anexos tais como peptídeos (porexemplo, para atingir receptores de células hospedeiras in vivo), ou agentesque facilitam o transporte através da membrana celular (veja, por exemplo,Letsinger et ai, Proc. NatL Acad. Sci U.S.A. 84:6553-6556 (1989); Lemaitreet al, Proc. Nati Acad. Sci 84:648-652 (1987)); publicação PCT No.W088/09810, publicada em 15 de dezembro de 1988) ou da barreira hema-to-encefálica (veja, por exemplo, publicação PCT No. W089/10134, publica-da em 25 de abril de, 1988), agentes de clivagem ativados pela hibridização,(veja, por exemplo, Krol et a!., BioTechniques 6:958-976 (1988)) ou agentesintercalantes. (Veja, por exemplo, Zon, Pharm. Res. 5:539-549(1988)). Paraessa finalidade, o oligonucleotídeo pode ser conjugado a outra molécula, porexemplo, um peptídeo, agente de reticulação ativado por hibridização, agen-te de transporte, agente de clivagem ativado por hibridização, etc.
Um oligonucleotídeo anti-sentido para uso nos métodos terapêu-ticos descritos aqui pode compreender pelo menos uma porção de base mo-dificada que é selecionada a partir do grupo que inclui, mas não é limitado a,5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-clorouracil, 5-iodouracil, hipoxantina, xantina,4-acetilcitosine, 5-(carboxiidroxilmetil) uracil, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5- carboximetilaminometiluracil, diidrouracil, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N-6- isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2- metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, Ν-6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracil, 5-metoxiaminometil-2-tiouracil, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracil, 5-metoxiuracil, 2-metiltio-N-6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), vibutoxosina, pseudouracil,queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracil, 2- tiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, metilester de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacetico(v), 5-metil-2-tiouracil, 3(3-amino-3-N2-carboxipropil) uracil, (acp3)w, e 2,6-diaminopurina.
Um oligonucleotídeo anti-sentido para uso nos métodos terapêu-ticos descritos aqui também pode compreender pelo menos uma porção deaçúcar modificada que é selecionada a partir do grupo que inclui, mas não élimitado a arabinose, 2-fluoroarabinose, xilulose e hexose.
Ainda em outra modalidade, um oligonucleotídeo anti-sentidopara uso nos métodos terapêuticos descritos aqui compreende pelo menosum estrutura principal de fosfato modificado selecionado a partir do grupoque inclui, mas não é limitado a, um fosforotioato, um fosforoditioato, um fos-foramidotioato, um fosforamidato, um fosforodiamidato, um metilfosfonato,um alquil fosfotriester e um formacetal ou análogos desses.
Ainda em outra modalidade, um oligonucleotídeo anti-sentidopara uso nos métodos terapêuticos descritos aqui é um oligonucleotídeo a-anomérico. Um oligonucleotídeo α-anomérico forma híbridos de filamentodupla específicos com RNA complementar nos quais, ao contrário da situa-ção comum, as filamentos se encontram paralelas umas as outras (Gautieret al., Nucl. Acids Res. 75:6625-6641(1987)). O oligonucleotídeo é um 2'-0-metilrribonucleotídeo (Inoue et al., Nucl. Acids Res. 75:6131 -6148(1987)), ouum análogo quimérico de RNA-DNA (Inoue et ai., FEBS Lett. 215:327-330(1987)).
Polinucleotídeos da invenção, incluindo aptâmeros podem sersintetizados por métodos usuais conhecidos na técnica, por exemplo, pelouso de um sintetizador automático de DNA (tal como são comercialmentedisponibilizados por Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como exemplos,oligonucleotídeos de fosforotioato podem ser sintetizados pelo método deStein et al., Nucl. Acids Res. 76:3209 (1988), oligonucleotídeos de metilfos-fonato podem ser preparados pelo uso de suportes de polímero de vidro comporo controlado (Sarin et al., Proc. NatL Acad. Sci U.S.A. 85:7448-7451(1988)), etc.
Composições de polinucleotídeo para uso nos métodos terapêu-ticos descritos aqui incluem ainda RNA cataiítico ou uma ribozima (veja, porexemplo, Publicação Internacional PCT WO 90/11364, publicada em 4 deoutubro de 1990; Sarver et al., Science 247:1222-1225 (1990). O uso de ri-bozimas em forma de "cabeça de martelo" é preferido. Ribozimas em cabe-ça de martelo clivam mRNAs em localizações ditadas pelas regiões flanque-adoras que formam pares de bases complementares com o mRNA alvo. Oúnico requisito é que o mRNA alvo tenha a seguinte seqüência de duas ba-ses: 5'-UG-3'. A construção e a produção de ribozimas em cabeça de marte-lo são bem-conhecidas na técnica e estão descritas mais completamente emHaseloff & Gerlach1 Nature 334:585-591 (1988). Preferivelmente, a ribozimaé manipulada tal que o sítio de reconhecimento de clivagem está localizadopróximo da terminação 5' do mRNA; isto é, para aumentar a eficiência e mi-nimizar o acúmulo intracelular de transcritos não funcionais de mRNA.
Como na abordagem anti-sentido, ribozimas para uso nos méto-dos de diagnóstico e terapêuticos descritos aqui podem ser compostas poroligonucleotídeos modificados (por exemplo, para melhorar a estabilidade,direcionamento, etc.) e podem ser liberadas a células que expressam NgR1in vivo. Constructos de DNA que codificam a ribozima podem ser introduzi-dos na célula da mesma maneira descrita acima para a introdução de DNAanti-sentido codificante. Um método preferido de liberação envolve usar umconstructo de DNA "codificante" da ribozima sob o controle de um promotorconstitutivo forte, tal como, por exemplo, promotor de pol Ill ou pol II, tal queas células transfectadas produzirão quantidades suficientes da ribozima paradestruir mensagens de NgR1 endógenas e inibir a tradução. Como as ribo-zimas, ao contrário das moléculas anti-sentido, são catalíticas, é necessáriauma menor concentração para eficácia.Aptâmeros
Em outra modalidade, o antagonista de NgR1 para uso nos mé-todos da presente invenção é um aptâmero. Um aptâmero pode ser um nu-cleotídeo ou polipeptídeo que tem uma seqüência única, tem a propriedadede se ligar especificamente a um alvo desejado (por exemplo, um polipeptí-deo) e é um Iigante específico de um dado alvo. Aptâmeros de nucleotídeoda invenção incluem moléculas de DNA de filamento dupla e RNA de fila-mento simples que se ligam a NgR1.
Aptâmeros de ácido nucléico são selecionados usando métodosconhecidos na técnica, por exemplo, através do processo Evolução Sistemá-tica de Ligantes por Enriquecimento Exponencial (SELEX). SELEX é um mé-todo para evolução in vitro de moléculas de ácido nucléico com ligação alta-mente específica a moléculas alvo, como descrito, por exemplo, nas Pat.U.S. Nos. 5.475.096, 5.580.737, 5.567.588, 5.707.796, 5.763.177, 6.011.577e 6.699.843, incorporadas aqui por referência em sua totalidade. Outro mé-todo de rastreamento para identificar aptâmeros é descrito na Pat. U.S. No.5.270.163 (também incorporada por referência). O processo SELEX é base-ado na capacidade de ácidos nucléicos para formar uma variedade de estru-turas bi- e tridimensionais, assim como na versatilidade química disponíveldentro dos monômeros de nucleotídeo para agir como Iigantes (formar paresde ligação específicos) sem virtualmente nenhum composto químico, sejamonomérico ou polimérico, incluindo outras moléculas de ácido nucléico epolipeptídeos. Moléculas de qualquer tamanho ou composição podem servircomo alvos.
O método SELEX envolve a seleção a partir de uma mistura deoligonucleotídeos candidatos e repetições em etapas de ligação, separaçãoe amplificação, usando o mesmo esquema geral de seleção, para se obter aafinidade e a seletividade de ligação desejadas. Partindo de uma mistura deácidos nucléicos, preferivelmente compreendendo um segmento de umaseqüência randomizada, o método SELEX inclui as etapas de colocar a mis-tura em contato com o alvo sob condições favoráveis para ligação; separaros ácidos nucléicos não-ligados daqueles ácidos nucléicos que se ligaramespecificamente às moléculas alvo; dissociar ao complexos de ácido nucléi-co-alvo; amplificar ao ácidos nucléicos dissociados dos complexos de ácidonucléico-alvo para se obter uma mistura enriquecida de Iigantes de ácidosnucléicos. As etapas de ligação, separação, dissociação e amplificação sãorepetidas por tantos ciclos quanto desejado para gerar Iigantes de ácidosnucléicos altamente específicos com alta afinidade à molécula alvo.
Aptâmeros de nucleotídeos podem ser usados, por exemplo,como ferramentas de diagnóstico ou como inibidores específicos para cortaras vias de sinalização e transporte intracelular (James (2001) Curr. Opin.Pharmacol. 1:540-546). As alta afinidade e especificidade de aptâmeros denucleotídeos fazem deles bons candidatos para a descoberta de fármacos.Por exemplo, antagonistas de aptâmero para a toxina ricina foram isolados etêm valores de IC50 na faixa de nanomolar (Hesselberth JR et ai (2000) JBiol Chem 275:4937-4942). Aptâmeros de nucleotídeos podem ser usadostambém contra doença infecciosa, malignidade e proteínas de superfície vi-ral para reduzir a infectividade celular.
Aptâmeros de nucleotídeos para uso nos métodos da presenteinvenção podem ser modificados como descrito aqui para outros polinucleo-tídeos (por exemplo, pela modificação do estrutura principal ou de bases ouconjugado a peptídeos).
Usando a estrutura da proteína de NgR1, o rastreamento de ap-tâmeros que atuam sobre NgR1 usando o processo SELEX pode permitir aidentificação de aptâmeros que inibem processos mediados por NgFM (porexemplo, inibição da regeneração axonal mediada por NgR1).
Aptâmeros de polipeptídeos para uso nos métodos da presenteinvenção são peptídeos aleatórios selecionados por sua habilidade de seligar e dessa maneira bloquear a ação de NgR1. Aptâmeros de polipeptídeospodem incluir um pequeno domínio de peptídeo variável acoplado a ambasas extremidades de uma estrutura de proteína. Essa limitação estrutural du-pla aumenta grandemente a afinidade de ligação do aptâmero de peptídeoem níveis comparáveis aos de um anticorpo (faixa de nanomoiar). Veja, porexemplo, Hoppe-Seyler F et al. (2000) J Mol Med 78(8):426-430. A extensãodo peptídeo variável curto é de tipicamente cerca de 10 a 20 aminoácidos ea estrutura pode ser qualquer proteína que tenha boas propriedades de so-lubilidade e compacidade. Um exemplo não Iimitante de uma estrutura deproteína é a proteína bacteriana Tioredoxin-A. Veja, por exemplo, Cohen BAetal. (1998) PNAS 95(24): 14272-14277.
Aptâmeros de polipeptídeo são peptídeos ou pequenos polipep-tídeos que agem como inibidores dominantes da função da proteína. Aptâ-meros de peptídeo se ligam especificamente a proteínas-alvo, bloqueandosuas habilidades funcionais (Kolonin et al. (1998) Proc. Nati Acad. Sei. 95:14.266-14.271). Aptâmeros de peptídeo que se ligam com alta afinidade eespecificidade a uma proteína-alvo podem ser isolados por uma variedadede técnicas conhecidas. Aptâmeros de peptídeo podem ser isolados a partirde bibliotecas de peptídeo aleatórias pelo rastreamento de duplo-híbrido emlevedura (Xu, C.W., etal. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci 94:12.473-12.478) oupor apresentação de ribossomo (Hanes et ai (1997) Proc. Natl. Acad. Sei.94:4937-4942). Eles também podem ser isolados de bibliotecas de fagos(Hoogenboom, H.R., et aí. (1998) Immunotechnology 4:1-20) ou de bibliote-cas de peptídeo geradas quimicamente. Adicionalmente, aptâmeros de poli-peptídeo podem ser selecionados usando a seleção de Aptâmeros de Peptí-deo Regulados por Ligante (Ligand Regulated Peptide Aptamers (LiRPAs)).Veja, por exemplo, Binkowski BF et ai, (2005) Chem & Biol 12(7): 847-855,incorporado aqui por referência. Embora a dificuldade dos meios pelos quaisos aptâmeros de peptídeo são sintetizados tome seu uso mais complexo doque os aptâmeros de polinucleotídeo, eles têm diversidade química ilimitada.Aptâmeros de polinucleotídeo são limitados porque eles utilizam apenas asquatro bases de nucleotídeo enquanto que aptâmeros de peptídeo podemter um repertório muito maior (isto é, 20 aminoácidos).
Aptâmeros de peptídeo usados nos métodos da presente inven-ção podem ser modificados (por exemplo, conjugados a polímeros ou fundi-dos a proteínas) conforme descrito aqui para outros polipeptídeos.Composições
Em algumas modalidades, a invenção proporciona composiçõesque compreendem um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que con-siste em SEQ ID NOs: 1 -5, 26-27, 29-37 e 41 -45.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona composiçõesque compreendem um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou um fragmento deligação de antígeno deste, ou um polipeptídeo solúvel ou proteína de fusãodo receptor Nogo-1 da presente invenção.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma compo-sição que compreende um polinucleotídeo da presente invenção.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona composiçõesque compreendem um polipeptídeo da presente invenção e um agente anti-inflamatório.
Em algumas modalidades, a presente invenção pode conter veí-culos adequados farmaceuticamente aceitáveis que compreendem excipien-tes e auxiliares que facilitam o processamento dos compostos ativos empreparações que podem ser usadas farmaceuticamente para liberação nolocal de ação. Formulações adequadas para administração parenteral inclu-em soluções aquosas dos compostos ativos em forma solúvel em água, porexemplo, sais solúveis em água. Além disso, suspensões dos compostosativos como suspensões injetáveis oleosas apropriadas podem ser adminis-tradas. Solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos,por exemplo, óleo de gergelim, ou ésteres de ácido graxo sintéticos, por e-xemplo, oleato de etila ou triglicerídeos. Suspensões aquosas injetáveis po-dem conter substâncias que aumentem a viscosidade da suspensão e inclu-em, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e dextran. Opcio-nalmente, a suspensão também pode conter estabilizantes. Lipossomastambém podem ser usados para encapsular as moléculas dessa invençãopara liberação dentro da célula. Exemplares de "veículos farmaceuticamenteaceitáveis" são todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revesti-mentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retar-dadores de absorção e semelhantes que são fisiologicamente compatíveis,água, salina, salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e se-melhantes, assim como combinações destes. Em algumas modalidades, acomposição compreende agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliál-coois tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio. Em algumas modalida-des, as composições compreendem substâncias farmaceuticamente aceitá-veis tais como umectantes ou pequenas quantidades de substâncias auxilia-res tais como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes ou tam-pões, que aumentam a vida útil ou a eficácia dos anticorpos, fragmentos deligação de antígeno, receptores solúveis ou proteínas de fusão de Nogo dainvenção.
As composições da invenção podem estar em uma variedade deformas, incluindo, por exemplo, formas de dosagem líquida, semi-sólida esólida, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis ou parainfusão), dispersões ou suspensões. A forma preferida depende do modo deadministração pretendido e aplicação terapêutica. Em uma modalidade, ascomposições estão na forma de soluções injetáveis ou para infusão, taiscomo composições similares àquelas usadas para imunização passiva dehumanos com outros anticorpos.
A composição pode ser formulada como uma solução, microe-mulsão, dispersão, Iipossoma ou outra estrutura ordenada adequada paraalta concentração de fármaco. Soluções injetáveis estéreis podem ser prepa-radas por incorporar um anticorpo anti-receptor Nogo-1 na quantidade ne-cessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingre-dientes enumerados acima, como necessário, seguido por esterilização porfiltração. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporar o com-posto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico eos outros ingredientes necessários a partir daqueles enumerados acima. Nocaso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, osmétodos preferidos de preparação são a secagem a vácuo e liofilização queproduz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional dese-jado a partir de uma solução previamente esterilizada por filtração da mes-ma. A fluidez apropriada de uma solução pode ser mantida, por exemplo,pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanhoda partícula requerido no caso de uma dispersão e pelo uso de tensoativos.A absorção prolongada de composições injetáveis pode ser conseguida pelainclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo,sais de monoestearato e gelatina.
Em algumas modalidades, o composto ativo pode ser preparadocom um veículo que protegerá o composto contra a liberação rápida, tal co-mo uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastrostransdérmicos e sistemas de liberação microencapsulados. Polímeros bio-degradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tal como, acetato de etilenovinil, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poli-ortoésteres e ácido poli-lático. Vários métodos para a preparação de tais formulações são patentea-dos ou geralmente conhecidos por aqueles versados na técnica. Veja, porexemplo, See e.g., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Sys-tems, J. R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque (1978).
Compostos ativos suplementares também podem ser incorpora-dos nas composições. Em algumas modalidades, um anticorpo do receptorNogo-1 ou um fragmento de ligação de antígeno deste, ou polipeptídeos so-lúveis ou proteínas de fusão do receptor Nogo-1 da invenção são co-formulados com e/ou co-administrados com um ou mais agentes terapêuti-cos adicionais, incluindo, por exemplo, um agente antiinflamatório. Em umamodalidade, o agente antiinflamatório é um agente antiinflamatório não este-roidal. Em outra modalidade, o agente antiinflamatório é agente antiinflama-tório esteroidal. Em uma modalidade particular, o agente antiinflamatório émetilprednisolona.
Em uma modalidade, a presente invenção é direcionada para ouso de um antagonista do receptor Nogo em combinação com um agenteantiinflamatório não esteroidal (NSAID), ésteres de pró-fármaco ou sais far-maceuticamente aceitáveis desses. Exemplos de NSAIDs que são bem-conhecidos na técnica incluem derivados do ácido propiônico (por exemplo,alminoprofeno, benoxaprofeno, ácido buclóxico, carprofeno, fenbufeno, fe-noprofeno, fluprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indoprofeno, cetoprofeno,miroprofeno, naproxeno, oxaprozin, pirprofeno, pranoprofeno, suprofeno,ácido tiaprofenico e tioxaprofeno), derivados do ácido acético (por exemplo,indometacina, acemetacina, alclofenaco, clidanaco, diclofenaco, fenclofena-co, ácido fenclózico, fentiazaco, furofenaco, ibufenaco, isoxepaco, oxpinaco,sulindaco, tiopinaco, tolmetina, zidometacina e zomepiraco), derivados doácido fenâmico (por exemplo, ácido flufenâmico, ácido meclofenâmico, ácidomefenâmico, ácido niflúmico e ácido tolfenâmico), derivados de ácido bifenil-carboxílico (por exemplo, diflunisal e flufenisal), oxicams (por exemplo, isoxi-cam, piroxicam, sudoxicam e tenoxicam), salicilatos (por exemplo, ácido ace-til salicílico e sulfasalazina) e as pirazolonas (por exemplo, apazona, bezpi-perilona, feprazona, mofebutazona, oxifenbutazona e fenilbutazona).NSAIDs estruturalmente relacionados que têm propriedades analgésicas eantiinflamatórias similares aos NSAIDs também são pretendidos para serenglobados por esse grupo.
Em outra modalidade, a presente invenção é direcionada para ouso de um antagonista do receptor Nogo em combinação com qualquer umou mais agentes antiinflamatórios não esteroidais tais como corticosteróides,ésteres de pró-fármaco ou sais farmaceuticamente aceitáveis destes. Exem-plos não Iimitantes de tais agentes esteroidais incluem hidrocortisona ecompostos derivados de hidrocortisona, tais como 21-acetoxipregnenolona,alclomerasona, algestona, amcinonida, beclometasona, betametasona, vale-rato de betametasona, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, propionatode clobetasol, clobetasona, butirato de clobetasona, clocortolóna, cloprednol,corticosterona, cortisona, cortivazol, deflazacona, desonida, desoximeraso-na, dexametasona, diflorasona, diflucortolona, difluprednato, enoxolona, flu-azacort, flucloronida, flumetasona, pivalato de flumetasona, flunisolida, fluci-nolona acetonida, fluocinonida, fiuorocinolona acetonida, fluocortin butila,fluocortolona, hexanoato de fluorocortolona, valerato de diflucortolona, fluo-rometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednidene, fluprednisolo-na, flurandenolide, formocortal, halcinonida, halometasona, acetato de halo-predona, hidrocortamato, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, butiratode hidrocortisona, fosfato de hidrocortisona, hidrocortisona 21- succinato desódio, tebutato de hidrocortisona, mazipredona, medrisona, meprednisona,metilprednisolona, furoato de mometasona, parametasona, prednicarbato,prednisolona, prednisolona 21-diedriaminoacetato, prednisolona fosfato desódio, prednisolona succinato de sódio, prednisolona 21-m-sulfobenzoato desódio, prednisolona 21-estearoglicolato de sódio, tebutato de prednisolona,prednisolona 21 -trimetilacetato, prednisona, prednival, prednilideno, 21- die-tilaminoacetato de prednilideno, tixocortol, triamcinolona, triamcinolona ace-tonida, triamcinolona benetonida e triamcinolona hexacetonida. Corticoste-róides estruturalmente relacionados que têm propriedades analgésicas eantiinflamatórias similares também são pretendidos serem englobados poresse grupo. Em uma modalidade particular, o antagonista do receptor Nogoé usado em combinação com metilprednisolona.
As composições farmacêuticas da invenção podem incluir uma"quantidade terapeuticamente eficaz" ou "uma quantidade profilaticamenteeficaz" de um anticorpo, fragmento de ligação de antígeno, polipeptídeo(s)ou proteína de fusão da invenção. Uma "quantidade terapeuticamente efi-caz" refere-se a uma quantidade eficaz, em doses e por períodos dé temponecessários, para se obter o resultado terapêutico desejado. Uma quantida-de terapeuticamente eficaz do anticorpo para o receptor Nogo-1 ou fragmen-to de ligação de antígeno deste, polipeptídeo solúvel do receptor Nogo-1 ouproteína de fusão do receptor Nogo pode variar de acordo com fatores taiscomo estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo. Uma quantidadeterapeuticamente eficaz também é aquela na qual quaisquer efeitos tóxicosou prejudiciais do anticorpo, fragmento de ligação de antígeno, polipeptídeosolúvel do receptor Nogo-1 ou proteína de fusão do receptor Nogo são supe-rados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilati-camente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em doses e por períodosde tempo necessários, para se obter o resultado profilático desejado. Tipi-camente, como uma dose profilática é usada em indivíduos antes ou em umestágio precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menordo que a quantidade terapeuticamente eficaz.
Regimes de dosagens podem ser ajustados para fornecer a res-posta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profiiática).Por exemplo, uma massa única pode ser administrada, várias doses dividi-das podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser reduzi-da ou aumentada proporcionalmente conforme indicado pelas exigências dasituação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições pa-renterais em forma de dosagem unitária para facilitar a administração e uni-formidade da forma de dosagem unitária como usado aqui refere-se a uni-dades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para indiví-duos mamíferos a ser tratados, cada unidade contendo uma quantidade pre-determinada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêuticodesejado em associação com o veículo farmacêutico necessário. A especifi-cação para as formas de dosagem unitária da invenção são ditadas e de-pendem diretamente de (a) características únicas do anticorpo, fragmento deligação de antígeno e polipeptídeo solúvel do receptor 1 ou proteína de fu-são do receptor Nogo e do efeito terapêutico ou profilático particular a serobtido, e (b) as limitações inerentes na técnica de combinar tal anticorpo,fragmento de ligação de antígeno e polipeptídeo solúvel do receptor 1 ouproteína de fusão do receptor Nogo para o tratamento de sensibilidade emindivíduos. Em algumas modalidades, uma faixa de dose terapeuticamenteeficaz para anticorpos do receptor Nogo-1 ou fragmentos de ligação de antí-geno destes é de 0,2-4 mg/kg por dia. Em algumas modalidades, uma faixade dose terapeuticamente eficaz para anticorpos do receptor Nogo-1 oufragmentos de ligação de antígeno destes é de 0,2 mg/kg por dia.
Nos métodos da invenção, os antagonistas de NgR1 são geral-mente administrados diretamente no sistema nervoso central, intracerebro-ventricularmente ou intratecalmente, por exemplo, em uma lesão crônica deMS. Composições para administração de acordo com os métodos da inven-ção podem ser formuladas tal que uma dosagem de 0,001-10 mg/kg de pesocorporal por dia do antagonista de NgR1 seja administrada. Em algumasmodalidades da invenção, a dosagem,é de 0,01-1,0 mg/ kg de peso corporalpor dia. Em algumas modalidades, a dosagem é de 0,001-0,5 mg/ kg de pe-so corporal por dia.
Para o tratamento com um antagonista de NgRI da invenção, adosagem pode variar, por exemplo, de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e maiscomumente 0,01 a 5 mg/kg (por exemplo, 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5mg/kg, 0,75 mg/kg, I mg/kg, 2 mg/kg, etc.) do peso corporal do hospedeiro.Por exemplo, as dosagens podem ser de 1 mg/kg de peso corporal ou 10mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1-10 mg/kg, preferivelmentepelo menos 1 mg/kg. Doses intermediárias nas faixas acima também sãopretendidas para estar dentro do escopo da invenção. Indivíduos podem sertratados com tais doses diariamente, em dias alternados, semanalmente oude acordo com qualquer outro esquema determinado por análise empírica.Um tratamento exemplar envolve a administração em múltiplas dosagensdurante um período prolongado, por exemplo, de pelo menos seis meses.Regimes de tratamento exemplares adicionais envolvem a administraçãouma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 ou6 meses. Esquemas de dosagem exemplares incluem 1-10 mg/kg ou 15mg/kg em dias consecutivos, 30 mg/kg em dias alternados ou 60 mg/kg se-manalmente.
Em alguns métodos, dois ou mais antagonistas de NgR1 sãoadministrados simultaneamente, em cujo caso a dosagem de cada antago-nista administrado está dentro das faixas indicadas. Compostos ativos su-plementares também podem ser incorporados nas composições usadas nosmétodos da invenção. Por exemplo, um antagonista de NgR1 pode ser co-formulado e/ou co-administrado com um ou mais agentes terapêuticos adi-cionais, tal como um agente antiinflamatório, por exemplo, metilprednisolona.
A invenção abrange qualquer método de liberação adequadopara um antagonista de NgR1 a um tecido alvo selecionado, incluindo inje-ção em bolo de uma solução aquosa ou implante de um sistema de libera-ção controlada. O uso de um sistema de liberação controlada reduz a ne-cessidade de injeções repetidas.
Os antagonistas de NgR1 usados nos métodos da invenção po-dem ser infundidos diretamente no cérebro. Vários implantes para infusãocerebral direta de compostos no cérebro são conhecidos e são eficazes naliberação de compostos terapêuticos a pacientes humanos que sofrem dedistúrbios neurológicas. Esses incluem a infusão crônica no cérebro usandouma bomba, estereotaticamente implantada, cateteres intersticiais temporá-rios, implantes de cateter intracraniano permanente e implantes biodegradá-veis implantados cirurgicamente. Veja, por exemplo, Gill et al, supra; Schar-fen et al, "High Activity lodine-125 Interstitial Implant For Gliomas,"-Int. J.Radiation Oncology Bioi Phys. 24{4):583-91 (1992); Gaspar et al., "Perma-nent 1251 Implants for Recurrent Malignant Gliomas," Int. J. Radiation Oncol-ogy Bioi Phys. 43(5):977-82 (1999); capítulo 66, páginas 577-580, Bellezzaet al, "Stereotactic Interstitial Brachytherapy," em Gildenberg et al, Textbookof Stereotactic and Functional Neurosurgery, McGraw-HiII (1998); e Brem etal, "The Safety of Interstitial Chemotherapy with BCNU-Loaded Polymer Fol-lowed by Radiation Therapy in the Treatment of Newly Diagnosed MalignantGliomas: Phase I Trial," J. Neuro-Oncology 26:111-23 (1995).
As composições também podem compreender um antagonistade NgR1 da invenção disperso em um material transportador biocompatívelque funciona como um sistema de liberação ou suporte adequado para oscompostos. Exemplos adequados de veículos de liberação sustentada inclu-em matrizes semipermeáveis de polímero na forma de objetos moldados taiscomo supositórios ou cápsulas. Matrizes de liberação sustentada implantá-veis ou microcapsulares incluem polilactídeos (Pat. U.S. No. 3.773.319; EP58 481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato Sidmanet al., Biopolymers 22.547-56 (1985)); poli(2-hidroxietil-metacrilato), etilenovinil acetato (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981); Lan-ger, Chem. Tech. 72:98-105 (1982)) ou ácido poli-D-(-)-3hidroxibutirico (EP133.988).
Em algumas modalidades, um antagonista de NgR1 da invençãoé administrado a um paciente por infusão direta em uma região apropriadado cérebro. Veja, por exemplo, Gill et al., "Direct brain infusion of glial cellline-derived neurotrophic factor in Parkinson disease," Nature Med. 9:589-95(2003). Técnicas alternativas estão disponíveis e podem ser aplicadas paraadministrar um antagonista de NgR1 de acordo com a invenção. Por exem-plo, a colocação estereotáxica de um cateter ou implante pode ser conse-guida usando a unidade de Riechert-Mundinger e a unidade Iocalizadoramulti funcional ZD (Zamorano-Dujovny). Uma tomografia computadorizadaintensificada por contraste (CT), injetando 120 ml de omnipaque, 350 mg/mlde iodo, com corte de 2 mm de espessura podem permitir o planejamento dotratamento multiplanar tridimensional (STP, Fischer, Freiburg, Alemanha).Esse equipamento permite o planejamento com base nos estudos de ima-gem de ressonância magnética, unindo as informações de CT e MRI para aconfirmação clara do alvo.
O sistema estereotáxico de Leksell (Downs Surgical, Inc., Deca-tur, GA) modificado para uso com um scanner GE CT (General ElectricCompany, Milwaukee, Wl) assim como o sistema estereotáxico de Brown-Roberts-Wells (BRW) (Radionics, Burlington, MA) podem ser usados paraesse propósito. Assim, na manhã do implante, o aro de base circular da es-trutura estereotáxica BRW pode ser fixado ao crânio do paciente. Cortes se-riados de CT podem ser obtidos em intervalos de 3 mm por toda a região(tecido alvo) com uma placa de localização com hastes de grafite fixada nabase. Um programa de planejamento de tratamento computadorizado podeser executado em um computador VAX 11/780 (Digital Equipment Corporati-on, Maynard, Mass.) usando as coordenadas de CT das imagens da hastede grafite para mapear entre o espaço de CT e o espaço de BRW.
Usos dos Anticorpos, Fragmentos de Ligação de Antígeno, Re-ceptores Solúveis, Proteínas de Fusão, Polinucleotídeos e Composições
Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos parainibir a atividade do receptor Nogo-1 pela administração de anticorpos anti-receptor Nogo-1, fragmentos de ligação de antigeno de tais anticorpos, poli-peptídeos solúveis do receptor Nogo-1 ou proteínas de fusão que compre-endem tais polipeptídeos a um mamífero que necessite dos mesmos.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um métodode inibir a ligação do receptor Nogo-1 a um ligante, compreendendo a etapade colocar o receptor Nogo-1 em conato com um anticorpo ou fragmento deligação de antígeno dessa invenção. Em algumas modalidades o ligante éselecionado a partir do grupo que consiste em NogoA, NogoB, NogoC, MAGe OM-gp.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um métodopara inibir o colapso do cone de crescimento em um neurônio, compreen-dendo a etapa de colocar o neurônio em contato com um anticorpo ou frag-mento de ligação de antígeno dessa invenção. Em algumas modalidades, ainvenção proporciona um método para diminuir a inibição do crescimento oubrotamento de neuritos em um neurônio, compreendendo a etapa de colocaro neurônio em contato com um anticorpo ou fragmento de ligação de antíge-no dessa invenção. Em algumas modalidades, o neurônio é um neurônio doCNS. Em alguns desses métodos, o crescimento ou brotamento ou de neuri-to é crescimento axonal.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um métodopara promover a sobrevivência de um neurônio em um mamífero, cujo neu-rônio está em risco de morrer, compreendendo (a) fornecer uma célula hos-pedeira cultivada que expressa (i) um anticorpo anti-receptor Nogo-1 oufragmento de ligação de antígeno deste; ou (ii) um polipeptídeo solúvel doreceptor Nogo-1; e (b) introduzir a célula hospedeira no mamífero no local,ou próximo do local, do neurônio. Almudena Ramon-Cueto, M Isabel Corde-ro, Fernando F Santos-Benito & Jesus Avila (2000) Functional recovery ofparalegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactoryensheathing cells. Neuron 25, 425-435.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um métodode terapia gênica de promover a sobrevivência de um neurônio em risco demorrer, cujo neurônio está em um mamífero, compreendendo administrar nolocal, ou próximo do local, do neurônio um vetor viral que compreende umaseqüência de nucleotídeos que codifica (a) um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou fragmento de ligação de antígeno deste; ou (b) um polipeptídeo de re-ceptor Nogo-1 solúvel, em que o anticorpo anti-receptor Nogo-1, fragmentode ligação de antígeno ou polipeptídeo de receptor Nogo-1 solúvel é expres-so a partir da seqüência de nucleotídeos no mamífero em uma quantidadesuficiente para promover a sobrevivência do neurônio. Vetores virais e mé-todos úteis para essas modalidades estão descritos em, por exemplo, Noelet al, Human Gene Therapy, 73:1483-93 (2002).
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um métodode inibir a ligação do receptor Nogo-1 a um ligante, compreendendo a etapade colocar o ligante em contato com o polipeptídeo de receptor Nogo-1 solú-vel ou proteína de fusão do receptor Nogo-1 da invenção.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um métodopara modular uma atividade de um ligante do receptor Nogo-1, compreen-dendo a etapa de colocar o ligante do receptor Nogo- em contato com umpolipeptídeo solúvel do receptor Nogo-1 ou proteína de fusão do receptorNogo-1 da invenção.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um métodopara inibir o colapso do cone de crescimento em um neurônio, compreen-dendo a etapa de colocar um ligante do receptor Nogo-1 em contato com umpolipeptídeo solúvel do receptor Nogo-1 ou proteína de fusão do receptorNogo-1 dessa invenção. Em algumas modalidades, a invenção fornece ummétodo para diminuir a inibição do crescimento ou brotamento de neuritosem um neurônio, compreendendo a etapa de colocar um ligante do receptorNogo-1 em contato com o polipeptídeo solúvel do receptor Nogo-1 ou a pro-teína de fusão do receptor Nogo-1 dessa invenção. Em algumas modalida-des, o neurônio é um neurônio do CNS. Em algumas modalidades o liganteé selecionado a partir do grupo que consiste em NogoA, NogoB1 NogoC,MAG e OM-gp. Em algumas modalidades, o crescimento ou brotamento deneurito é crescimento axonal.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um métodopara promover o crescimento de neuritos que compreende colocar um neu-rônio em contato com um polipeptídeo, um polinucleotídeo ou uma composi-ção da invenção. Em algumas modalidades, o polipeptídeo, polinucleotídeoou composição inibe a inibição do crescimento de neurito. Em algumas mo-dalidades, o neurônio é de um mamífero. Em algumas modalidades, o mamí-fero é um ser humano.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um métodopara inibir a tradução de sinai peio complexo de sinalização de NgR1, com-preendendo colocar um neurônio em contato com uma quantidade eficaz deum polipeptídeo, um polinucleotídeo ou uma composição da invenção. Emalgumas modalidades, o neurônio é de um mamífero. Em algumas modali-dades, o mamífero é um ser humano.
Em algumas modalidades, a invenção proporciona um métodopara tratar uma doença, distúrbio ou lesão do sistema nervoso central (CNS)em um mamífero, que compreende administrar a um mamífero que precisade tratamento uma quantidade eficaz de um polipeptídeo, um polinucleotídeoou uma composição da presente invenção. Em algumas modalidades, a do-ença, distúrbio ou lesão é esclerose múltipla, ALS, doença de Huntington,doença de Alzheimer, doença de Parkinson, neuropatia diabética, acidentevascular cerebral, lesões traumáticas do cérebro, lesão da medula espinhal,neurite óptica, glaucoma, perda de audição e Ieucodistrofia adrenal.
Qualquer um dos tipos de anticorpos ou receptores descritosaqui pode ser usado terapeuticamente. Em algumas modalidades, o anticor-po anti-receptor Nogo-1 é um anticorpo humano. Em algumas modalidades,o mamífero é um paciente humano. Em algumas modalidades, o anticorpoou fragmento de ligação de antígeno deste é administrado a um mamíferonão-humano que expressa um receptor Nogo-1 com o qual o anticorpo fazreação cruzada (por exemplo, um primata, um macaco cinomolgus ou rhe-sus) com propósitos veterinários ou como um modelo animal de doença hu-mana. Tais modelos animais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêu-tica de anticorpos dessa invenção.
Em algumas modalidades, a administração de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou fragmento de ligação de antígeno deste, ou polipeptídeosolúvel ou proteína de fusão do receptor Nogo-1 é usada para tratar umalesão de medula espinhal para facilitar o crescimento neuronal por todo olocal lesado.
Os anticorpos anti-receptor Nogo-1, ou fragmentos de ligação deantígeno destes, ou polipeptídeos solúveis ou proteínas de fusão do receptorNogo-1 da presente invenção podem ser fornecidos sozinhos ou em combi-nação, ou em combinação seqüencial com outros agentes que modulam umprocesso patológico em particular. Por exemplo, agentes antiinflamatóriospodem ser co-administrados após acidente vascular cerebral como um meiopara bloquear o dano neuronal adicional e inibição de regeneração axonal.Como usado aqui, os anticorpos do receptor Nogo-1, fragmentos de ligaçãode antígeno destes, polipeptídeos solúveis ou proteínas de fusão do receptorNogo-1 são ditos serem administrados em combinação com um ou mais a-gentes terapêuticos adicionais quando os dois são administrados simultane-amente, consecutivamente ou independentemente.
Os anticorpos de receptor Nogo-1, fragmentos de ligação de an-tígeno destes, polipeptídeos solúveis de receptor Nogo-1 ou proteínas defusão do receptor Nogo-1 da presente invenção podem ser administradospelas vias parenteral, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitone-al, transdérmica, por inalação ou bucal. Por exemplo, um agente pode seradministrado localmente em um local de lesão através de microinfusão. Lo-cais típicos incluem, mas não são limitados a áreas danificadas da medulaespinhal resultando de lesão. A dosagem administrada será dependente daidade, saúde e peso do receptor, tipo de tratamento concomitante, se hou-ver, freqüência de tratamento e natureza do efeito desejado.
Os compostos dessa invenção podem ser utilizados in vivo, co-mumente em mamíferos, tais como humanos, ovelhas, cavalos, gado, por-cos, cães, gatos, ratos e camundongos ou in vitro.
Vetores da Invenção
Em algumas modalidades, a invenção propociona moléculas deDNA recombinante (rDNA) que contêm uma seqüência codificante. Comousado aqui, uma molécula de rDNA é uma molécula de DNA que foi subme-tida a manipulação molecular. Métodos para gerar moléculas de rDNA sãobem-conhecidos na técnica, por exemplo, veja Sambrook et ai, MolecularCloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).Em algumas moléculas de rDNA, uma seqüência codificante de DNA é ope-rativamente ligada a seqüências de controle de expressão e seqüências devetores.
Em aigumas modalidades, a invenção proporciona vetores quecompreendem ácidos nucléicos que codificam os polipeptídeos da invenção.A escolha do vetor e das seqüências de controle de expressão às quais osácidos nucléicos dessa invenção são operativamente ligados depende dire-tamente, como é bem-conhecido na técnica, das propriedades funcionaisdesejadas (por exemplo, expressão de proteína e a célula hospedeira a sertransformada). Um vetor da presente invenção pode ser capaz pelo menosde direcionar a replicação ou inserção no cromossomo hospedeiro e, preferi-velmente, também a expressão, do gene estrutural incluído na molécula derDNA.
Elementos de controle de expressão que são usados para regu-lar a expressão de uma seqüência codificante de proteína operativamenteligada são conhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados a, pro-motores induzíveis, promotores constitutivos, sinais de secreção e outroselementos reguladores. Preferivelmentel o promotor induzível é facilmentecontrolado, tal como sendo responsivo a um nutriente no meio da célulahospedeira.
Em uma modalidade, o vetor que contém uma molécula de ácidonucléico codificante incluirá um replicon procariótico, isto é, uma seqüênciade DNA que tem a habilidade de direcionar a replicação autônoma e a ma-nutenção da molécula de DNA recombinante extra-cromossomicamente emuma célula hospedeira procariótica, tal como uma célula hospedeira bacteri-ana, transformada com ele. Tais replicons são bem-conhecidos na técnica.Além disso, vetores que incluem um replicon procariótico também podemincluir um gene cuja expressão confere um marcador detectável ou selecio-nável tal como resistência a fármaco. Genes típicos de resistência bacteria-na a fármacos são aqueles que conferem resistência a ampicilina ou tetraci-clina.
Vetores que incluem um replicon procariótico podem incluir ain-da um promotor procariótico ou de bacteriófago capaz de direcionar a ex-pressão (transcrição e tradução) das seqüências gênicas codificantes emuma célula hospedeira bacteriana, tal como E. coli. Um promotor é um ele-mento de controle de expressão formado por uma seqüência de DNA quepermite a ligação da RNA polimerase e a ocorrência de transcrição. Seqüên-cias promotoras compatíveis com hospedeiros bacterianos são tipicamentefornecidas em vetores de plasmídeo que contêm os sítios de restrição con-venientes para inserção de um segmento de DNA da presente invenção.Exemplos de tais vetores de plasmídeo são pUC8, pUC9, pBR322 e pBR329(Bio-Rad® Laboratories), pPL e pKK223 (Pharmacia). Qualquer hospedeiroprocariótico adequado pode ser usado para expressar uma molécula deDNA recombinante que codifica a proteína da invenção.
Vetores de expressão compatíveis com células eucarióticas, pre-ferivelmente aqueles compatíveis com células de vertebrados, também po-dem ser usados para formar moléculas de rDNA que contêm uma seqüênciacodificante. Vetores de expressão de célula eucariótica são bem-conhecidosna técnica e estão disponíveis a partir de várias fontes comerciais. Tipica-mente, tais vetores são fornecidos contendo sítios de restrição convenientespara a inserção do segmento de DNA desejado. Exemplos de tais vetoressão pSVL e pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1, pML2d (International Biotechno-logies), pTDTI (ATCC® 31255) e outros vetores de expressão eucarióticos.
Vetores de expressão de células eucarióticas usados para cons-truir as moléculas de rDNA da presente invenção podem ainda incluir ummarcador selecionável que é eficaz em uma célula eucariótica, preferivel-mente um marcador de seleção de resistência a fármaco. Um marcador deresistência a fármaco preferido é o gene cuja expressão resulta em resistên-cia a neomicina, isto é, o gene de neomicina fosfotransferase (neo). (Sou-thern et ai, J. Mol. Anal. Genet. 7:327-341 (1982)). Alternativamente, o mar-cador selecionável pode estar presente em um plasmídeo separado, os doisvetores introduzidos por co-transfecção da célula hospedeira e os transfec-tantes selecionados pelo cultivo no fármaco apropriado para o marcador se-lecionável.
Para expressar os anticorpos, ou porções de anticorpo da inven-ção, DNAs que codificam cadeias leves e pesadas parciais ou de extensãocompleta são inseridos em vetores de expressão tal que os genes sejamoperativameníe iigaaos a seqüências de controie transcricional e traducional.Vetores de expressão incluem plasmídeos, retrovírus, cosmídeos, YACs,epissomas derivados de EBV e semelhantes. O gene do anticorpo é ligadoem um vetor tal que as seqüências de controle transcricional ou traducionaldentro do vetor realizam sua função pretendida de regular a transcrição etradução do gene do anticorpo. O vetor de expressão e as seqüências decontrole de expressão são escolhidos para ser compatíveis com a célulahospedeira de expressão usada. O gene da cadeia leve do anticorpo e ogene da cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vetores sepa-rados. Em algumas modalidades, ambos os genes são inseridos no mesmovetor de expressão. Os genes do anticorpo são inseridos no vetor de ex-pressão por métodos usuais (por exemplo, ligação de sítios de restriçãocomplementares no fragmento do gene do anticorpo e vetor, ou ligação deextremidade cega, se sítios de restrição não estiverem presentes).
Um vetor conveniente é um que codifica uma seqüência de imu-noglobulina de Ch ou Cl humana funcionalmente completa, com sítios derestrição apropriados manipulados de forma que qualquer seqüência de Vhou Vl possa ser facilmente inserida e expressa, como descrito acima. Emtais vetores, o "splicing" geralmente ocorre entre o sítio doador de splice naregião J inserida e o sítio receptor de splice anterior à região C humana etambém nas regiões de splice que ocorrem dentro dos exons de Ch huma-nos. Poliadenilação e a terminação da transcrição ocorrem em sítios cro-mossômicos nativos a jusante das regiões codificantes. O vetor de expres-são recombinante também pode codificar um peptídeo de sinal que facilita asecreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene da ca-deia de anticorpo pode ser clonado em um vetor de forma que o peptídeo desinal esteja ligado in frame com a terminação amino do gene da cadeia doanticorpo. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglobu-lina ou um peptídeo de sinal heterólogo (isto é, um peptídeo de sinal de umaproteína não imunoglobulina).
Além dos polipeptídeos imunogênicos, anticorpos anti-receptorNogo-1, fragmentos de ligação antígeno, polipeptídeos de receptor de Nogo-1 solúveis e proteína de fusão do receptor Nogo-1 da presente invenção, osvetores de expressão da invenção carregam seqüências regulatórias quecontrolam sua expressão em um célula hospedeira. Será apreciado por a-queles versados na técnica que o desenho do vetor de expressão, incluindoa seleção de seqüências regulatórias pode depender de fatores tais como aescolha da célula hospedeira a ser transformada, do nível de expressão daproteína desejada, etc. Seqüências regulatórias preferidas para expressãoem célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que direcionamaltos níveis de expressão de proteína em células de mamíferos, tais comopromotores e/ou intensificadores derivados de LTRs retrovirais, citomegalo-vírus (CMV) (tal como o promotor/intensificador de CMV), Vírus Símio 40(SV40) (tal como o promotor/intensificador de SV40), adenovírus (por exem-plo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)), promotores de poli-oma e fortes de mamíferos tais como promotores de imunoglobulina nativa eactina. Para descrição adicional de elementos regulatórios virais e seqüên-cias desses, veja, por exemplo, Pat. U.S. No. 5.168.062 por Stinski, Pat.U.S. No. 4.510.245 por Bell et ale Pat. U.S. No. 4.968.615 por Schaffher etal.
Em uma modalidade, um vetor de expressão de propriedade deBiogen IDEC, Inc., referido como NEOSPLA (Patente U.S. 6.159.730) podeser usado. Esse vetor contém o promotor/intensificador de citomegalovírus,o promotor principal de beta globina de camundongo, a origem de replicaçãode SV40, a seqüência de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino,éxon 1 e éxon 2 de neomicina fosfotransferase, o gene e a seqüência líderde diidrofolato redutase. Foi descoberto que esse vetor resulta em um nívelde expressão muito alto após a transfecção em células CHO, seguida porseleção em meio contendo G418 e amplificação com metotrexato. Logica-mente, qualquer vetor de expressão que é capaz de produzir expressão emcélulas eucarióticas pode ser usado na presente invenção. Exemplos de ve-tores adequados incluem, mas não são limitados aos plasmídeos pcDNA3,pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFI/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, p-TRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXI, e pZeoSV2 (disponibilizados por Invi-trogen, San Diego, CA), e plasmídeo pCI (disponibilizado por Promega, Ma-dison, Wl). Vetores de expressão de células eucarióticas adicionais são co-nhecidos na técnica e são disponíveis comercialmente. Tipicamente, taisvetores contêm sítios de restrição convenientes para inserção do segmentode DNA desejado. Vetores exemplares incluem pSVL e pKSV- 10 (Pharma-cia), pBPV-1, pml2d (International Biotechnologies), pTDTI (ATCC 31255),vetor de expressão retroviral pMIG e pLL3.7, vetor "shuttle" de adenovíruspDC315 e vetores AAV. Outros sistemas de vetor exemplares estão descri-tos, por exemplo, na Pat. U.S. 6.413.777.
Outras modalidades da invenção usam um vetor Ientiviral paraexpressão dos polinucleotídeos da invenção, por exemplo, polinucleotídeosantagonistas de NgR, por exemplo moléculas de siRNA. Lentivírus podeminfectar células que não estão ciclando e células pós-mitóticas, e tambémfornecem a vantagem de não serem silenciados durante o desenvolvimentopermitindo a geração de animais transgênicos através de infecção de célulastronco embrionárias. Milhavet et a/., Pharmacological Rev. 55:629-648(2003). Outros vetores virais que expressam polinucleotídeo podem serconstruídos baseados, mas se limitando a, vírus adenoassociados, retroví-rus, adenovírus ou alfavírus.
A transcrição de polinucleotídeos da invenção, por exemplo, se-qüências de moléculas de siRNA pode ser direcionada por um promotor paraRNA polimerase I (pol I), RNA polimerase Il (pol II) ou RNA polimerase Ill(pol III) eucarióticas. Transcritos dos promotores pol Il ou pol Ill são expres-sos em níveis elevados em todas as células; os níveis de um dado promotorde pol Il em um dado tipo de célula depende da natureza das seqüênciasregulatórias do gene (intensificadores, silenciadores, etc.) presentes ao lado.Promotores procarióticos de RNA polimerase também são usados, fazendocom que a enzima RNA polimerase procariótica seja expressa nas célulasapropriadas (Elroy-Stein & Moss, Proc. Natl. Acad. Sci USA 87:6743-7(1990); Gao & Huang, Nucleic Acids Res. 21:2867-72 (1993); Lieber et al,Methods Enzymol. 217:47-66 (1993); Zhou et al, Mol Cell. Biol 70:4529-37(1990)). Vários investigadores demonstraram que polinucleotídeos expres-sos a partir de tais promotores podem funcionar em células de mamíferos(por exemplo, Kashani-Sabet et al, Antisense Res. Dev. 2:3-15 (1992); Oj-wang et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 10802-6 (1992); Chen et al., Nucle-ie Aeids Res. 20:4581 -9 (1992); Yu et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6340-4 (1993); L1HuiIIier et al, EMBO J. 7 7:4411-8 (1992); Lisziewicz et al, Proc.Natl. Acad. Sci U.S.A 90:8000-4 (1993); Thompson et al, NucIeicAcids Res.23:2259 (1995); Sullenger & Cech, Science 262:1566 (1993)). Mais especifi-camente, unidades de transcrição tais como aquelas derivadas de genesque codificam U6 nuclear pequena (snRNA), RNA de transferência (tRNA) eVA RNA de adenovírus são úteis na geração de altas concentrações dasmoléculas de RNA desejadas, tal como siRNA, em células (Thompson et al,supra; Couture & Stinchcomb, 1996, supra; Noonberg et al, Nucleic AcidRes. 22:2830 (1994); Noonberg et al, Pat U.S.. No. 5.624.803; Good et al,Gene Ther. 4:45 (1997); Beigelman et al, Publicação Internacional PCT No.WO 96/18736. As unidades de transcrição de siRNA podem ser incorpora-das em uma variedade de vetores para introdução em células de mamíferos,incluindo mas não restritos a vetores de DNA de plasmídeo, vetores de DNAviral (tais como adenovírus ou vetores de vírus adenoassociado), ou vetoresde RNA viral (tais como vetores retrovirais ou de alfavírus) (para revisão vejaCouture & Stinchcomb, 1996, supra).
Além dos genes heterólogos e seqüências regulatórias, os veto-res de expressão recombinantes da invenção podem carregar seqüênciasadicionais, tais como seqüências que regulam a replicação do vetor em célu-las hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadoresselecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de célulashospedeiras nas quais o vetor tenha sido introduzido (veja, por exemplo, Pat.U.S. Nos 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas de Axel et a!). Por exem-plo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a fárma-cos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeirana qual o vetor tenha sido introduzido. Genes marcadores selecionáveis pre-feridos incluem o gene da diidrofolato redutase (DHFR) (para uso em célulashospedeiras dhfr" com seleção/amplificação por metotrexato) e o gene neo(para seleção com G418).
Células Hospedeiras e Métodos Para Produzir Proteína da Invenção Re-combinantemente
Moléculas de ácido nucléico da invenção que codificam anticor-pos anti-receptor Nogo-1, peptídeos imunogênicos, polipeptídeos solúveis doreceptor Nogo-1, proteínas de fusão do receptor Nogo-1 dessa invenção evetores que compreendem essas moléculas de ácido nucléico podem serusados para transformação de uma célula hospedeira adequada. A trans-formação pode ser por qualquer um método conhecido para introduzir poli-nucleotídeos em uma célula hospedeira. Métodos para introdução de polinu-cleotídeos heterólogos em células de mamífero são bem-conhecidos na téc-nica e incluem transfecção mediada por dextran, precipitação de fosfato decálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplasto, eletropora-ção, encapsulação do(s) polinucleotídeo(s) em Iipossomos e microinjeçãodireta do DNA nos núcleos. Além disso, moléculas de ácido nucléico podemser introduzidas em células de mamíferos por vetores virais.A transformação de células hospedeiras apropriadas com umamolécula de rDNA da presente invenção é obtida por métodos bem-conhecidos que dependem tipicamente do tipo de vetor usado e do sistemade hospedeiro empregado. Com relação à transformação de células hospe-deiras procarióticas, a eletroporação e métodos de tratamento com sal po-dem ser empregados (veja, por exemplo, Sambrook et ai, Molecular Cloning- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Cohenetal, Proc. NatL Acad. Sci USA 69:2110- 2114 (1972)). Com relação a trans-formação de células de vertebrados com vetores que contêm rDNA, eletro-poração, métodos de tratamento com lipídeo catiônico ou sal podem ser em-pregados (veja, por exemplo, Graham et ai, Virology 52:456-467 (1973);Wigler etal, Proc. NatL Acad. Sei. USA 76: 1373-1376 (1979)).
Células transformadas com sucesso, isto é, células que contêmuma molécula de rDNA da presente invenção, podem ser identificadas portécnicas bem-conhecidas incluindo a seleção por um marcador selecionável.Por exemplo, células que resultam da introdução de um rDNA da presenteinvenção podem ser cionadas para produzir colônias únicas. Células destascolônias podem ser coletadas, Iisadas e seu conteúdo de DNA examinadoquanto a presença do rDNA usando um método tal como o descrito por Sou-thern, J. MoL BioL 98:503-517 (1975) ou as proteínas produzidas pela célulapodem ser testadas por um método imunológico.
Células hospedeiras para expressão de um polipeptídeo ouanticorpo da invenção para uso em um método da invenção podem ser pro-carióticas ou eucarióticas. Linhagens celulares de mamífero disponíveis co-mo hospedeiros para expressão são bem-conhecidas na técnica e incluemvárias linhagens celulares imortalizadas disponibilizadas pela American TypeCulture Collection (ATCC®). Essas incluem, inter alia, célula de ovário dehamster chinês (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células de rim defilhote de hamster (BHK), células de rim de macaco (COS), células de hepa-tocarcinoma humano (por exemplo, Hep G2), células A549 e diversas outraslinhagens celulares. Linhagens celulares de preferência particular são sele-cionadas através da determinação de quais linhagens celulares têm altosníveis de expressão. Outras células hospedeiras eucarióticas úteis incluemcélulas de planta. Outras linhagens celulares que podem ser usadas sãolinhagens celulares de inseto, tais como as células Sf9. Células hospedeirasexemplares procarióticas são E. colie Streptomyces.
Quando vetores de expressão recombinante que codificam ospolipeptídeos imunogênicos, anticorpos anti-receptor Nogo-1 ou fragmentosde ligação de antígeno, polipeptídeos solúveis do receptor Nogo-1, proteínasde fusão do receptor Nogo-1 da invenção são introduzidos em células hos-pedeiras de mamífero, eles são produzidos pelo cultivo de células hospedei-ras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticor-po, polipeptídeo e polipeptídeo de fusão nas células hospedeiras ou, maispreferivelmente, secreção dos polipeptídeos imunogênicos, anticorpos anti-receptor Nogo-1 ou fragmentos de ligação de antígeno, polipeptídeos solú-veis do receptor Nogo-1, proteínas de fusão do receptor Nogo-1 da invençãono meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Polipeptí-deos imunogênicos, anticorpos anti-receptor Nogo-1 ou fragmentos de liga-ção de antígeno, polipeptídeos solúveis do receptor Nogo-1, proteínas defusão do receptor Nogo-1 da invenção podem ser recuperados do meio decultura usando métodos padronizados de purificação de proteína.
Além disso, polipeptídeos imunogênicos de expressão, anticor-pos anti-receptor Nogo-1 ou fragmentos de ligação de antígeno, polipeptí-deos solúveis do receptor Nogo-1, proteínas de fusão do receptor Nogo-1 dainvenção (ou outras porções deles) a partir de produção em linhagens celu-lares podem ser aumentados usando inúmeras técnicas conhecidas. Porexemplo, o sistema de expressão do gene de glutamina sintetase (o sistemaGS) é uma abordagem comum para aumentar a expressão sob certas con-dições. O sistema GS está descrito como um todo ou em parte nas PatentesEuropéias Nos. 0 216 846, 0 256 055, e 0 323 997 e Pedido de Patente Eu-ropeu No. 89303964.4.
Células Hospedeiras
A presente invenção ainda proporciona células hospedeirastransformadas com uma molécula de ácido nucléico que codifica um anticor-po anti-receptor Nogo-1, fragmento de ligação de antígeno, polipeptídeo so-lúvel do receptor Nogo-1 e/ou proteína de fusão do receptor Nogo-1 da in-venção. A célula hospedeira pode ser procariótica ou eucariótica. Célulaseucarióticas úteis para expressão de uma proteína da invenção não são Iimi-tadas, contanto que a linhagem celular seja compatível com os métodos decultura e compatíveis com a propagação do vetor de expressão e expressãodo produto gênico. Células hospedeiras eucarióticas preferidas incluem, masnão são limitadas a levedura, célula de inseto e mamíferos, preferivelmentecélulas de vertebrados como aquelas de camundongo, rato, macaco ou Ii-nhagem celular humana. Exemplos de células hospedeiras eucarióticas úteisincluem células de ovário de hamster chinês (CHO) disponibilizadas pelaATCC® como CCL61, células de embrião de camundongo NIH suíço NIH-3T3 disponibilizadas pela ATCC® como CRL 1658, células de rim de filhotede hamster (BHK) e as linhagens celulares de cultura de tecido eucarióticosemelhantes.
Outras linhagens celulares eucarióticas úteis incluem células depianta. Outras iinhagens que podem ser usadas são linhagens celulares deinseto, tais como células Sf9. Células hospedeiras procarióticas exemplaressão E. coli e Streptomyces.
Produção de Proteínas Recombinantes usando uma Molécula de rDNA
A presente invenção ainda proporciona métodos para produçãode um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou fragmento de ligação de antígeno,polipeptídeo solúvel do receptor Nogo-1 e/ou proteína de fusão do receptorNogo-1 da invenção usando moléculas de ácido nucléico descritas aqui. Emtermos gerais, a produção de uma forma recombinante de uma proteína en-volve tipicamente as seguintes etapas:
Primeiro, é obtida uma molécula de ácido nucléico que codificauma proteína da invenção. Se a seqüência codificante não for interrompidapor introns, ela é diretamente adequada para expressão em qualquer hos-pedeiro.
A molécula de ácido nucléico é então opcionalmente colocadaem ligação operativa com seqüências de controle adequadas, como descritoacima, para formar uma unidade de expressão que contém a fase aberta deleitura da proteína. A unidade de expressão é usada para transformar umhospedeiro adequado e o hospedeiro transformado é cultivado sob condi-ções que permitem a produção da proteína recombinante. Opcionalmente, aproteína recombinante é isolada do meio ou das células; a recuperação epurificação pode não ser necessária em alguns casos onde algumas impure-zas podem ser toleradas.
Cada uma das etapas anteriores pode ser feita por uma varieda-de de maneiras. Por exemplo, as seqüências codificantes desejadas podemser obtidas a partir de fragmentos genômicos e usadas diretamente noshospedeiros apropriados. A construção de vetores de expressão que sãooperáveis em uma variedade de hospedeiros é obtida usando replicons eseqüências de controle apropriadas, conforme descrito acima. As seqüên-cias de controle, vetores de expressão e métodos de transformação depen-dem do tipo de célula hospedeira usada para expressar o gene e foram dis-cutidos em detalhes anteriormente. Sítios de restrição adequados podem, senão disponíveis normalmente, ser adicionados às extremidades da seqüên-cia codificante a fim de fornecer um gene removível para inserir nesses veto-res. Um versado na técnica pode facilmente adaptar qualquer sistema dehospedeiro/expressão conhecido na técnica para uso com as moléculas deácido nucléico da invenção para produzir proteína recombinante.
Ficará imediatamente claro para um versado nas técnicas rele-vantes que outras modificações e adaptações adequadas aos métodos eaplicações descritas aqui são óbvias e podem ser feitas sem se afastar doescopo da invenção ou de qualquer modalidade desta. Com o objetivo deque essa invenção possa ser melhor compreendida, são descritos os seguin-tes exemplos. Esses exemplos têm o propósito apenas de ilustração e nãodevem ser considerados como Iimitantes do escopo da invenção de qualquermaneira.
EXEMPLO 1
PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAISANTI-RECEPTOR NOGO-1 DE MURINOAnticorpos anti-receptor Nogo-1 que se ligam especificamente aum polipeptídeo imunogênico do receptor Nogo-1 da invenção foram feitosusando os seguintes métodos e procedimentos.
Imunizações:
Duas abordagens de imunização foram usadas:
1. Células ou Membranas Celulares de COS-7 Contendo o Re-ceptor Nogo-1 (NogoR-1) como o Imunógeno
O gene do receptor Nogo-1 de rato (GenBank™ No. AF 462390)foi subclonado no vetor de expressão de mamífero pEAG1256 (Biogen®) quecontinha o promotor de CMV e o gene de resistência à geneticina para sele-ção por fármaco. O plasmídeo recombinante foi transfectado em célulasCOS-7 usando Superfect (Qiagen®). Os transfectantes foram selecionadosusando geneticina (Gibco™, 2 mg/ml), clonados e verificados quanto à ex-pressão de proteína de receptor Nogo-1 de superfície por FACS. Membra-nas de COS-7 foram preparadas a partir dessas células de acordo com pro-cedimentos descritos [Wang et al., J. Neurochem. 75:1155-1161 (2000)] comduas lavagens e armazenados a 1 mg/ml [concentração de proteína] em gii-cerol 10% a -70°C.
Camundongos RBF fêmeas de oito semanas de idade (JacksonLabs, Bar Harbor, ME) foram imunizados intraperitonealmente com uma e-mulsão contendo 50 pg de membranas de COS-7-receptor Nogo-1 ou comcélulas COS-7 inteiras expressando receptor Nogo-1 sobre a superfície e 50μl de adjuvante RIBI MPL+TDM+CWS (Sigma® Chemical Co., St. Louis, MO)uma vez a cada duas semanas (Lipman et al, 1992). Soros dos camundon-gos imunizados foram coletados antes da primeira imunização, 7 dias após asegunda e terceira imunizações e 38 dias após a terceira imunização e ostítulos de anticorpo anti-receptor Nogo-1 foram medidos por ELISA comodescrito abaixo.
2. Peptídeos de receptor Nogo-1 Específicos como o Imunógeno
A seqüência do gene do receptor Nogo-1 de rato foi submetida aanálises de antigenicidade usando o programa Vector NTi™ (Fig. 2). Peptí-deos antigênicos identificados nas análises foram conjugados com Hemoci-anina de Keyhole Limpet (KLH) usando procedimentos com glutaraldeídousuais.
Camundongos RBF fêmeas de oito semanas de idade (JacksonLabs, Bar Harbor, ME) foram imunizados intraperitonealmente com uma e-mulsão contendo 50 μg de peptídeos conjugados com KLH e 50 μl de adju-vante de Freund completo (Sigma® Chemical Co., St. Louis, MO) uma vez acada duas semanas.
Soro dos camundongos imunizados foi coletado antes da primei-ra imunização e 1 semana após a segunda e terceira imunizações e os títu-los de anticorpo anti-receptor Nogo-1 foram medidos. Uma dose de reforçofoi dada após a terceira imunização. Três dias após a dose de imunizaçãode reforço, os experimentos de fusão foram iniciados.
Produção e rastreamento de Hibridoma
Soros de camundongos imunizados com peptídeos antigênicosde receptor Nogo-1 foram rastreados por ELISA enquanto que soros de ca-mundongos imunizados com células COS-7 expressando receptor Nogo-1foram rastreadas por citometria de fluxo. Camundongos que eram positivospara anticorpos que se ligavam especificamente a células COS-7-receptorNogo-1 foram identificados por citometria de fluxo e foram sacrificados. Es-plenócitos foram isolados dos camundongos e fundidos ao mieloma FL653(um derivado de APRT de um mieloma de camundongo Balb/c lg-/HGPRT-,mantido em DMEM contendo 10% de FBS, glicose 4500 mg/L, L-glutamina 4mM e 8-azaguanina 20 mg/ml) como descrito (Kennett et al, Monoclonal An-tibodies: A New Dimension in Biological Analysis, Plenum Press, Nova Ior-que (1993)). As células fundidas foram plaqueadas em placas de 24 ou 48cavidades (Corning Glass Works, Corning, NY), e nutridas com meio e cultu-ra contendo adenina, aminopterina e timidina. Culturas resistentes a AATforam rastreadas por ELISA ou citometria de fluxo quanto à ligação a célulasCOS-7-receptor Nogo-1 ou ao peptídeo antigênico de receptor Nogo-1, con-forme descrito abaixo. As células nas cavidades positivas foram ainda sub-clonadas por diluição limitante.
Para rastrear a ligação do anticorpo a um peptídeo antigênico dereceptor Nogo-1, os peptídeos que foram usados como imunógenos foramconjugados com BSA. 0,5 pg de peptídeo conjugado em 50 μΙ de tampão debicarbonato de sódio 0,1 M, pH 9.9 foram adicionados a cada cavidade deuma placa MaxiSorp™ de 96 cavidades (Nunc™). A placa foi então incubadaa 37°C por 1 hora ou 4°C por 16 horas e os sítios de ligação inespecíficaforam bloqueados usando HEPES 25 mM, pH 7.4 contendo BSA 0,1%, oval-bumina 0,1%, blotto 0,1% e azida 0,001%. O sobrenadante do hibridoma foiadicionado e incubado a 25°C por 1 hora. Após lavar três vezes com PBS,50 μl de uma diluição 1:10.000 de anticorpo secundário de cabra anti-camundongo conjugado com peroxidase de rábano silvestre (Jackson Imr-nunoResearch Inc.) foram adicionados a cada cavidade e incubados por 1hora adicional. Após três lavagens, a coloração foi desenvolvida por TMB(Pierce) e paralisada com ácido sulfúrico 2M. A intensidade da cor foi moni-torada em um espectrofotômetro a 450 nm.
Os anticorpos foram rastreados quanto à ligação ao receptorNogo-1 de extensão completa como segue. Células COS-7 foram marcadascom CellTracker™ Green CMFDA 0,1 uM (Molecular Probes, Eugene, OR)como descrito pelo fornecedor. Volumes iguais de células de controle mar-cadas com CellTracker™ foram misturados com células COS-7-receptor No-go-1 lavadas antes da incubação com soros de teste anti-receptor Nogo-1.Cinqüenta microlitros da mistura de célula foram dispensados em cada cavi-dade de uma placa de poliestireno de 96 cavidades com fundo em V (Cos-tar® 3877, Corning, NY) e 100 μΙ de sobrenadante de hibridoma ou de anti-corpo anti-receptor Nogo-1 de controle foram adicionados. Após a incubaçãoa 4°C por 30 minutos, as células foram lavadas e incubadas com 50 μΙ deanticorpo secundário gama-específico de fragmento F(ab')2 purificado porafinidade de cabra anti-Fc de IgG de camundongo conjugado com ficoeritrina(1:200, Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove, PA) em PBS. Nofinal da incubação, as células foram lavadas duas vezes com PBS e suspen-sas em 200 μl de PBS contendo FBS 1% e submetidas a análise por FACS.Alternativamente, células COS-7-receptor Nogo-1 foram misturadas comsobrenadante de hibridoma e tratadas com anticorpo secundário de cabraanti-camundongo conjugado com R-ficoeritrina e submetidos diretamente aanálises de FACS usuais.
Foram gerados 25 anticorpos anti-receptor Nogo-1 usando umavariedade de imunógenos. Foram gerados, dois anticorpos, 7E11 e 5B10,usando uma seqüência de peptídeo correspondendo aos resíduos 110-125de receptor Nogo-1 de rato como o imunógeno. Foram gerados três anticor-pos, 1H2, 3G5 e 2F7, usando membranas preparadas de células COS-7transfectadas com receptor Nogo-1 de extensão completa de rato como oimunógeno. Foram gerados 13 anticorpos usando sNogoR310-Fc como oimunógeno (1D9.3, 1E4.7, 1B4.3, 2C4.3, 1F10.3, 2H1 .4, 1H3.3, 1G4.1.1E4.1, 2G7.1, 2C4.1, 2F11.1, e 1H4.1) e 7 anticorpos usando uma seqüên-cia de peptídeo que corresponde aos resíduos 423-434 de receptor Nogo-1de rato como o imunógeno (2E8.1, 2G11.2, e 1B5.1).
Análise da Seqüência de Anticorpos Monoclonais 7E11 e 5B10
Foi extraído o RNA total usando o mini kit Qiagen® RNeasy® egeramos cDNA do RNA isolado. Foi amplificada a seqüência da cadeia levepor PCR usando os iniciadores 5'- TGAGGAGACGGT-GACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3' (SEQ ID NO: 12) e 5'- AGGTS-MARCTGCAGSAGTCWGG-3' (SEQ ID NO: 25). Foi amplificada a seqüên-cia da cadeia pesada por PCR usando os iniciadores 5'-GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3' (SEQ IDNO:13) e 5'-GGGGATATCCACCATGAGGKCCCCWGCTCAGYTYCTKGGA-3 '(SEQ ID NO: 14). Esses iniciadores compreendem nucleotídeos degenera-dos como segue: S representa G ou C; M representa A ou C, R representa Gou A; W representa A ou Τ; K representa G ou T; e Y representa T ou C. Fo-ram clonados os fragmentos de PCR em um vetor de seqüenciamento e de-terminados a seqüência de DNA das CDRs por terminação de cadeia dide-sóxi usando iniciadores específicos para o vetor de seqüenciamento. Foramtraduzidos conceitualmente as seqüências de DNA e as seqüências parciaisde aminoácidos das regiões de CDR das cadeias pesada e leve dos anticor-pos monoclonais 7E11 e 5B10 como mostrado na Tabela 2. As 3 CDRs dascadeias pesada e leve dos mAbs estão sublinhadas na Tabela 2. As cadeiasleves de 7E11 e 5B10 têm 94% de identidade de seqüência de aminoácido eas cadeias pesadas têm 91% de identidade de seqüência de aminoácido.mAbs 7E11, 5B10, e 1H2 são do isotipo de IgGI e mBbs 3G5 e 2F7 são doisotipo de lgG2a. Cada um desses cinco mAbs tem uma cadeia leve do iso-tipo kappa. Foi analisada a seqüência dos outros anticorpos monoclonais poressa abordagem.
TABELA 2. SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIPOS DE MABS 7E11 E 5B10
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Mapeamento de Epitopo de Anticorpo Monoclonal 7E11
mAb 7E11 se liga tanto a NgR1 de rato como de humano. Paradeterminar o epitopo responsável pela ligação de 7E11, foram gerados frag-mentos e peptídeos sintéticos de NgR1 de rato e testados quanto à ligação a7E11.
Um fragmento recombinante de NgR1 de rato que contém todosos 8 domínios de LRR e os caps NeC terminais (sNgR310) foi tratado comácido ou com brometo de cianogênio (CNBr) e os fragmentos separados poreletroforese em gel. sNgR310 não-tratado migra com um peso molecularaparente de 42 kDa. O tratamento com ácido de sNgR310 produziu doisprodutos de clivagem principais de 15 kDa (aa 27-aa 122) e 30 kDa (aa 123-aa 310). O tratamento com CNBr gerou três fragmentos, um par de 33/35kDa (aa 27-aa 229), que pode representar fragmentos com glicosilação hete-rogênea, um produto de 10 kDa (aa 241-aa 310) e um fragmento com 11aminoácidos (aa 230-aa 240), que não é retido no gel. Um western blot dogel foi testado por marcação com 7E11 e demonstrou que ele se ligou a N-gR1 de rato intacto (aa 27-aa 310), ao fragmento de ácido de 15 kDa (aa 27-aa 122) e ao fragmento de CNBr de 35 kDa (aa 27- aa 229). 7E11 não seligou ao fragmento de ácido de 30 kDa (aa 123- aa 310) nem ao fragmentode 10 kDa de CNBr (aa 241-aa 310). Tanto o fragmento de ácido de 15 kDacomo o fragmento de CNBr de 35 kDa continham a seqüência LDLSDNA-QLRWDPTT (SEQ ID NO: 1), em concordância com a ligação de 7E11 a umúnico epitopo sobre NgR1.
O sítio de ligação de 7E11 foi analisado ainda por testar os di-gestos de peptídeo tríptico de sNgR310. A análise por HPLC mostrou váriosfragmentos, indicando que havia vários resíduos de Iisina e arginina sensí-veis à tripsina na seqüência de NgR1. 7E11 ligou-se apenas a um único di-gesto de peptídeo tríptico, fornecendo evidência adicional de que 7E11 seliga a um único epitopo sobre NgR1. Espectroscopia de massa subseqüente(MS) e análises de seqüência identificaram o peptídeo ligado como sendoAAAFTGLTLLEQLDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 26).
O peptídeo LDLSDNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 1) foi submetidoà análise de mapeamento adicional. O peptídeo foi digerido com tripsina, oque gerou dois fragmentos principais, LDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 27) eWDPTT (SEQ ID NO: 28), e habilidade de 7E11 de se ligar a eles foi testa-da. A análise de MS revelou que o anticorpo se ligou ao peptídeo LDLSD-NAQLR (SEQ ID NO: 27) e, portanto, esse peptídeo contém o epitopo deligação para 7E11. Dentro dessa fração de peptídeo, a análise de MS deta-lhada identificou vários peptídeos misturados que também se ligaram a7E11, incluindo peptídeos com desaminação em Asn 115 e Gln 117, adiçãode Alanina em 112 ou 113 ou adição de Serina em 114 (Tabela 3). Essesdados indicam que vários resíduos de aminoácido localizados nesse frag-mento de peptídeo podem não ser críticos para a ligação de 7E11.
TABELA 3. PEPTÍDEOS MUTANTES LIGADOS POR 7E11
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O peptídeo LDLSDNAQLRVVDPTT (SEQ ED NO:1) também foidigerido com a endoprotease Asp-N e a ligação de 7E11 foi testada. A en-doprotease Asp-N clivou o peptídeo em 3 fragmentos de peptídeo, L, DLS eDNAQLRWDPTT (SEQ ED NO: 36). Desses produtos, 7E11 ligou-se aopeptídeo DNAQLRWDPTT (SEQ DD NO: 36). Tomados juntos, os dados declivagem com tripsina e Asp-N ainda localizaram o epitopo de ligação de7E11 na seqüência compartilhada entre eles, DNAQLR (SEQ ED NO: 37).
As seqüências de aminoácidos de NgRI, NgR2, e NgR3 de vá-rias espécies foram analisadas para prever os resíduos críticos no epitopode ligação de 7E11 com base na observação de que 7E11 se ligou a NgR1de rato e de humano mas não a NgR1 de camundongo, NgR2 humano eNgR3 de camundongo. Alinhamento de seqüência revelou que os aminoáci-dos 110-125 de NgR1 de rato e a seqüência correspondente de NgR1 hu-mano são idênticos e que a seqüência de NgR1 de camundongo difere ape-nas em um aminoácido na posição 119 (Arg 119 em NgR1 de rato e humanoe His 119 em NgR1 de camundongo; Tabela 4).
TABELA 4. ALINHAMENTO DE SEQÜÊNCIA DE NGRS DE DIFERENTESESPÉCIES
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Arg119 em NgR1 contribui para a ligação de 7E11 porque ele seliga bem a NgR1 de rato e humano mas fracamente a NgR1 de camundon-go. Similarmente, como 7E11 não se liga bem a NgR3, Ala 116 está envolvi-da no epitopo por que dentro da seqüência DNAQLR (SEQ ID NO: 37) NgR3difere de NgR1 apenas por uma Arginina na seqüência correspondente.Dentro da seqüência DNAQLR (SEQ ID NO: 37), 4 dos 6 resíduos em NgR2são idênticos aos de NgR1 de rato. Ala116 e Gln117 são substituídos porArginina e Histidina, respectivamente. Isso confirma que Ala116 é um resí-duo de aminoácido importante que contribui para a ligação de 7E11 mas nãonecessariamente exclui o envolvimento de Glnl 17.
Para verificar esses pontos de contato, diversos peptídeos con-tendo mutações pontuais dentro da seqüência LDLSDNAQLR (SEQ ID NO:27) foram gerados e testados para a ligação com 7E11. Os peptídeos foramimobilizados em uma placa MaxiSorp™ (Nunc™) e diluições seriadas de7E11 foram aplicadas. Os valores de EC5O resultantes estão mostrados naTabela 5. 7E11 se ligou aos mutantes Leu110Ala e Asp111Ala com valoresde EC5O similares aos do peptídeo original. Quando Glnl 17Ala foi testado, aEC5O aumentou 30 vezes e quando Argl 19His foi testadp, a ÈC5o aumentou25 vezes. A alteração mais significativa na EC50 foi observada quandoArgl 19 foi mutada para Alanina.
TABELA 5. 7E11 SE LIGA A PEPTÍDEOS MUTANTES COM EC50 DIFE-RENTE
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A posição do epitopo de ligação de 7E11 também foi determina-da na estrutura cristalina recentemente determinada de sNgR310. Comoesperado, a estrutura mostra que o epitopo de 7E11 está exposto sobre asuperfície da molécula. Os resíduos Argl 19, Glnl 17, Alai 16 e Aspl 14 proje-tam-se para fora da estrutura enquanto que Leu118 e Asn115 estão Iocali-zados internamente. O epitopo se localiza em cima de uma área ácida den-tro da superfície côncava da estrutura e uma superfície básica que está defrente para um dos lados.
Inibição da Ligação do Liqante ao Receptor Nogo-1 Solúvel pelo AnticorpoMonoclonal anti-receptor Noqo-1
Anticorpos monoclonais anti-receptor Nogo-1 produzidos comodescrito acima foram testados para determinar se eles inibiram a ligação doligante ao receptor Nogo-1.
0,5 pg de uma proteína de fusão de receptor Nogo-1 solúvelcompreendendo os resíduos de aminoácido 26-344 do receptor Nogo-1 derato e a dobradiça e região Fc da molécula de IgGI de rato (sNogoR344-Fc)produzida como descrito abaixo foram imobilizados em 250 pg de esferas deSPA conjugadas com proteína A ou aglutinina de germe de trigo (AmershamPharmacia Biotech) por 2 horas a 25°C. Esferas de SPA acopladas com Fc-sNogoR-1, mAb anti-receptor Nogo-1 e 1μΙ de 125l-Nogo66 (Amersham, 2000Ci/mmol, 1nM) em 50 μΙ de meio de incubação tamponado com HEPES(HEPES 10 mM, pH 7.4, albumina sérica bovina 0,1%, ovalbumina 0,1%,MgCl2 2 mM, CaCfe 2 mM e inibidores de protease) foram adicionadas a ca-da cavidade de amostra. Após 16 horas, a radioatividade foi medida em a-mostras quadruplicadas usando um TopCount® (Packard). Valores de IC50foram calculados a partir de uma análise de ajuste de curva (Fig. 3) (PRISM,GraphPad Software, NJ). Em alguns experimentos, foram também usadosconjugados de AP-Iigante (por exemplo, AP-Nogo66) e detectados a ligaçãopelo monitoramento da atividade de fosfatase alcalina. Foi também testada ahabilidade dos mAbs de bloquear a ligação dos Iigantes MAG-Fc e AP-OM-gp ao receptor Nogo-1.
Todos os anticorpos monoclonais 7E11, 5B10, 1H2, 3G5 e 2F7inibiram a ligação de Nogo66, MAG e OM-gp a sNogoR344-Fc. A IC50 calcu-lada de Nogo66 para 7E11 e 1H2 foi de 400 nM e 60 nM, respectivamente.Os dados de ELISAs que monitoraram a inibição da ligação mediada pormAb dos três Iigantes ao receptor Nogo-1 estão resumidos na Tabela 6.
TABELA 6. MABS INIBEM A LIGAÇÃO DE N0G066. MAG E OM-GP AORECEPTOR NOGO-1<table>table see original document page 171</column></row><table>
O percentual de deslocamento é mostrado com anticorpo em 30nM e a EC5O para certos mAbs determinada por análise de ajuste de curvacomo descrito. " — " indica nenhuma atividade detectável e "ND" indica nãodeterminado.
EXEMPLO 2
PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-RECEPTOR NOGO-1 FAB-FAGO
Anticorpos anti-receptor Nogo-1 Fab-fago que se ligam especifi-camente a um polipeptídeo de receptor Nogo-1 imunogênico da invençãotambém foram feitos por rastreamento de uma biblioteca de Fab-fago comosegue.
A biblioteca de Fab-fago MorphoSys HuCAL® GOLD foi rastrea-da contra proteína recombinante solúvel de rato sNogoR310-Fc e célulasCOS-7 expressando o receptor Nogo-1 de rato. Fab-fagos que se ligaramespecificamente ao receptor Nogo-1 foram purificados e caracterizados. Acadeia pesada de 14D5 é derivada do gene VH2 e a cadeia leve é derivadado gene V«1. As seqüências de aminoácidos das CDRs da cadeia pesada ecadeia leve de um desses fagos Fab-fagos, 14D5, são mostradas na Tabela 7.
TABELA 7. SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDO DE CDRS DE 14D5
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14D5 se liga ao receptor Nogo-1 de rato tanto nas formas mono-valente como bivalente. Além disso, 14D5 se liga ao receptor Nogo-1 de ca-mundongo e humano e ao receptor Nogo-2 de humano, mas não ao receptorNogo-3 de camundongo.
EXEMPLO 3
IMUNOPRECIPITACÃO DE RECEPTOR NOGO-1 POR ANTICORPOSMONOCLONAIS ANTI-RECEPTOR NOGO-1
Para realizar a imunoprecipitação, 100 μl de células lisadas ou50 μl de células tratadas com PiPLC foram misturados com 400 ou 450 μΙ detampão de extração [Tris-HCI 10 mM, pH 7.2, Tween-20™ 0,5%, PMSF 0,2mM] ou tampão RIPA, respectivamente na presença de 30 μl de Proteína Aou G e 1-2 μg de anticorpo. A mistura foi incubada em um agitador a 4°C por16 horas.
Amostras foram cuidadosamente centrifugadas para precipitaras esferas acopladas com Proteína A ou G. As esferas foram lavadas trêsvezes com 1 ml de tampão de lavagem (Tris-HCI 10 mM, pH 7.2, Tween-20™ 0,1%). A lavagem final foi realizada usando 10% do tampão de lava-gem original.
As esferas foram ressuspensas em 100 μl de SDS 2X com beta-mercaptoetanol 10%. As amostras foram incubadas em temperatura ambien-te antes de serem corridas em um gel de Tris-Glicina 4-20% para SDS-PAGE. Como determinado pela análise em gel de SDS-PAGE, os anticorposmonoclonais 3G5 e 2F7 imunoprecipitaram o receptor Nogo-1.
EXEMPLO 4
DETERMINAÇÃO DA ESPECIFICIDADE DO ANTICORPO POR ELISA
Para determinar a especificidade dos anticorpos monoclonal eFab-fago produzidos nos Exemplos 1 e 2, foi realizado um ELISA usando umpainel de polipeptídeos de receptor Nogo-1. O painel consistiu em sNo-goR310-Fc (uma proteína de fusão que compreende os aminoácidos 26-310do receptor Nogo-1 de rato e um fragmento Fc de rato), sNogoR344-Fc (vejaacima), polipeptídeo p-617 (SEQ ID NO:1), polipeptídeo p-618 (um polipeptí-deo de 19 aminoácidos da região LRR7 do receptor Nogo-1 de rato; Fig. 2;SEQ ID NO:11) e os polipeptídeos p-4 e p-5 (polipeptídeos das regiõesLRR5 e LRRCT do receptor Nogo-1, respectivamente). Ovalbumina e BSAforam usados como controles. Como mostrado na Fig.4, mAbs 1H2, 3G5 e2F7 se ligaram especificamente a sNogoR344-Fc. Em experimentos simila-res, estes anticorpos também se ligaram especificamente a um polipeptídeoque consiste nos aminoácidos 310-344 de receptor Nogo-1 de rato (SEQ IDNO: 3) e mAbs 7E11 e 5B10 se ligaram especificamente ao polipeptídeo p-617 (SEQ ID NO:1).
Dez dos anticorpos 1D9.3, 1E4,7, 1B4,3, 2C4,3, 1F10.3, 2H1,4,1H3,3, 1G4,1, 1E4.1, e 2G7,1) da imunização com sNogoR310-Fc desloca-ram uns aos outros pela ligação, indicando que eles reconhecem epitopossimilares ou superpostos sobre sNogoR310-Fc. Os outros três anticorpos daimunização com sNogoR310-Fc (2C4.1, 2F11.1, e 1H4.1) reconheceramepitopos diferentes localizados nos resíduos de aminoácido 26-310.
Foram também realizados ensaios de ligação ELISA usando oFab-fago 14D5. Onde os Iigantes AP-Nogo66, AP-OM-gp e MAG-Fc foramdeixados se ligar a sNogoR344-Fc imobilizado, 1 μΜ de 14D5 inibiu comple-tamente a ligação de Nogo e MAG. Foram necessários 10 μΜ de 14D5 parainibir completamente a ligação de OM-gp a sNogoR344-Fc.
EXEMPLO 5
ENSAIO DE CRESCIMENTO DE NEURITOPara testar a habilidade dos anticorpos monoclonal e Fab-fagoproduzidos acima em diminuir o efeito inibitório de mielina do CNS sobreneurônios, lâminas para cultura Lab-Tek® (4 cavidades) foram revestidascom 0,1 mg/ml de poli-D-lisina (Sigma®). Mielina do CNS ou PBS foi coloca-da como gotas de 3 μl. Microesferas fluorescentes (Polysciences) foram adi-cionadas à mielina/PBS para permitir a identificação posterior das gotas(Grandpre et al, Nature 403:439-444 (2000)). As lâminas Lab-Tek® foramentão enxaguadas e cobertas com 10 Mg/ml de laminina (Gibco™). Gângliosda raiz dorsal (DRGs) de filhotes de ratos Sprague Dawley P3-4 foram dis-sociados com 1 mg/ml de colagenase tipo 1 (Worthington), triturados compipetas Pasteur com ponta polida a fogo, pré-plaqueados para enriquecerem células neuronais e finalmente plaqueados em 23.000 células/cavidadesobre as lâminas para cultura Lab-Tek® pré-revestidas. O meio de cultura foiF12 contendo 5% de soro de cavalo doador inativado por calor, 5% de sorofetal bovino inativado por calor e 50 ng/ml de mNGF e incubação a 37°C e5% de CO2 por 6 horas. Quinze pg/ml de mAb 7E11 foram adicionados ime-diatamente após o plaqueamento.
As lâminas foram fixadas por 20 minutos com paraformaldeído4% contendo sacarose 20% e coradas para o marcador neuronal anti-beta-llltubulina (Covance TUJ1) diluído 1:500. Como anticorpo secundário antica-mundongo Alexa Fluor® 594 (Molecular Probes) foi diluído a 1:300 e as lâmi-nas foram cobertas com Gel/Mount™ (Biomeda™). Imagens digitais com am-pliação de 5x foram obtidas com o programa OpenLab™ e analisadas pelouso do programa MetaMorph® para quantificação do crescimento de neuritos.
MAb 7E11 protegeu os neurônios de DRG da inibição mediadapor mielina do crescimento de neurito (Fig. 5). Resultados similares foramobservados com mAbs 1H2 e 3G5.
Em um ensaio de proteção de crescimento de neurito onde neu-rônios de DRG de rato P7 foram cultivados em um substrato de mielina deCNS, 14D5 bivalente também promoveu o crescimento de neurito de formaeficaz.EXEMPLO 6
IMUNOHISTOQUÍMICA COM 7E11 EM CÉLULAS TRANSFECTADAS COMRECEPTOR NOGO-1
Para caracterizar adicionalmente as propriedades de ligação demAbs anti-receptor Nogo-1 produzidos como descrito no Exemplo 1, nóscomparamos a ligação às células COS-7 ou 293 fixadas e vivas expressan-do receptor Nogo-1 de rato ou humano.
Células Fixadas
Células transfectadas ou não-transfectadas com receptor Nogo-1 foram plaqueadas em lâminas para cultura Lab-Tek® de 8 cavidades, fixa-das com paraformaldeído 4% por 15 minutos, bloqueadas com soro de cabranormal 10%, Triton X-100 0,1% em PBS por 1 hora. mAb 7E11 foi adiciona-do a 15 pg/ml e 1,5 pg/ml em solução bloqueadora e incubado por 2 horasem temperatura ambiente; anticorpo secundário anti-camundongo conjugadocom Alexa® (Molecular Probes) foi incubado em uma diluição de 1:3000 emsolução bloqueadora por 1 hora; DAPI foi adicionado a 5 pg/ml ao anticorposecundário para marcar todos os núcleos.
Células Vivas:
Células transfectadas e não-transfectadas foram plaqueadas emlâminas para cultura Lab-Tek de 8 cavidades, bloqueadas com tampão deFACS (contendo soro de cavalo doador 4%) por 30 minutos a 4°C, incuba-das com 15 Mg/ml de 7E11 e 1,5 Mg/ml de tampão de FACS por 1 hora a4°C, enxaguadas e incubadas com anticorpo secundário anti-camundongoAlexa® (1:300 em tampão de FACS) por 30 minutos a 4°C.
Experimentos de mancha imunohistoquímica demonstraram quetodas os mAbs se ligaram a células expressando o receptor Nogo-1 de rato.mAbs 7E11, 2G7.1 e 2C4.1 se ligaram tanto às células fixadas como às vi-vas expressando o receptor Nogo-1 humano.
EXEMPLO 7
MODELO DE CAMUNDONGO DE LESÃO CONTUSA DA MEDULA ESPINHAL
Para testar o efeito de mAbs anti-receptor de Nogo-1 produzidosno Exemplo 1 sobre neurônios in vivo, foi usado um modelo de camundongode lesão contusa da medula espinhal.
Camundongos fêmeas (18-22 g) são tratados profilaticamentecom analgésicos e agentes antibióticos. Os camundongos são anestesiadose colocados em um equipamento estereotáxico com fixação na coluna verte-bral sob um estereomicroscópico. O trauma à medula espinhal é introduzidopor uma versão modificada do método de queda de peso (M. Li et al, Neu-roscience 99.333-342 (2000).
Resumidamente, uma Iaminectomia de T9 e T10 é feita e a co-luna vertebral é estabilizada usando um par de pinças transversais para ca-mundongo dando suporte aos processos transversos de T9-T10 bilateral-mente. Uma haste de impacto de aço inoxidável com um diâmetro de 1,4mm e peso de 2 g, é elevada a 2,5 cm acima da dura e deixada cair sobre amedula espinhal no nível de T10. Durante a cirurgia, os camundongos sãomantidos sobre uma manta aquecida a 37°C e 1 ml de solução salina estérilaquecida é administrado subcutaneamente a cada camundongo após a ci-rurgia para evitar a desidratação. A bexiga é manualmente esvaziada umavez por dia até que o controle reflexo da bexiga seja readquirido.
Todos os animais recebem analgesia pós-operatória a cada 8-12horas após a cirurgia e tratamento com antibiótico duas vezes por dia por 7dias após o procedimento. Os animais têm livre acesso a alimento e águadurante o estudo. Anticorpos anti-receptor Nogo-1 são liberados no local dalesão através de injeção intratecal por 28 dias como descrito abaixo para omodelo de transecção de medula espinhal de rato.
EXEMPLO 8
CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO SOLÚVEIS DE RECEP-TOR NOGO-1
Para caracterizar polipeptídeos solúveis de receptor Nogo-1(sNogoR-1) e proteínas de fusão (Fc-sNogoR-1) foi realizado o seguinte ex-perimento.
Três pg de receptores Nogo solúveis (sNogoR310-Fc e sNo-goR344-Fc) foram imobilizados sobre 250 pg de esferas WGA-SPA e rece-beram 0,5 μL de Iigante radioativo (concentração final de 0,5 nM) em umvolume final de 100 μL de tampão de ligação (HEPES 20 mM, pH 7.4, Ca2mM, Mg 2mM, BSA 0,1%, ovalbumina 0,1% e inibidores de protease). Osligantes incluíram Nogo66 10 μΜ, 125I- Nogo40 10 μΜ (aminoácidos de 1-40de Nogo A) e 10 μΙ de sobrenadante de anticorpo anti-receptor de Nogo-1para cada grupo de ligantes. As três tirosinas de Nogo40 foram separada-mente iodadas e designadas como Nogo40-A, -B e -C respectivamente. Osvalores médios de triplicatas estão apresentados como % de radioatividadeligada normalizada (Figs. 6, 7 e 8). Barras de erro indicam SEM. A radioati-vidade ligada na ausência de inibidores foi tomada como 100% e a radioati-vidade ligada mais baixa na presença de 10 μΜ de Nogo40 foi tomada como0% para os dados de normalização.
EXEMPLO 9
INIBIÇÃO DA LIGAÇÃO DO LIGANTE DE PROTEÍNA DE FUSÃO SOLÚVEL DE RECEPTOR NOGO-1
Um ensaio de ligação similar ao ensaio de ligação do Exemplo 8foi usado para testar a habilidade de dois mAbs produzidos no Exemplo 1inibirem a ligação de l25l-Nogo66 a sNogoR344-Fc. Mabs 2F7 e 3G5 inibirama ligação de l25l-Nogo66 a sNogoR344-Fc.
EXEMPLO 10
ENSAIO DE CRESCIMENTO DE NEURITO
Lâminas para cultura Lab-Tek® (4 cavidades) foram revestidascom 0,1 mg/ml de poli-D-lisina (Sigma®). Mielina de CNS sozinha ou mistu-rada com sNogoR310, proteína de fusão sNogo310-Fc1 mAb 5B10 ou PBSde controle foram separadamente colocadas como gotas de 3 μl. Microsfe-ras fluorescentes (PoIysciences) foram adicionadas à mielina/PBS para per-mitir a identificação posterior das gotas (Grandpre et al, Nature 403:439-444(2000)). Lâminas Lab- Tek® foram então enxaguadas e cobertas com 10μg/ml de laminina (Gibco™).
Gânglios da raiz dorsal (DRGs) de filhotes de ratos Sprague-Dawley P3-4 foram dissociados com 1 mg/ml de colagenase tipo 1 (Wor-thington), triturados com pipetas Pasteur com ponta polida a fogo , pré-plaqueados para enriquecer em células neuronais e finalmente plaqueadosem 23.000 células/cavidade sobre as lâminas para cultura Lab-Tek® pré-revestidas. O meio de cultura foi F12 contendo 5% de soro de cavalo doadorinativado pelo calor, 5% de soro fetal bovino inativado pelo calor e 50 ng/mlde mNGF e incubação a 37°C e 5% de C02por 6 horas.
As lâminas foram fixadas por 20 minutos com paraformaldeído4% contendo sacarose 20% e coradas para o marcador neuronal anti-beta-llltubulina (Covance TUJI) diluído em 1:500. Como anticorpo secundário anti-camundongo Alexa Fluor® 594 (Molecular Probes) foi diluído em 1:300 e aslâminas foram cobertas com Gel/Mount™ (Biomeda™). Imagens digitais comamplificação de 5x foram obtidas com o programa OpenLab™ e analisadaspelo uso do programa MetaMorph para quantificação de crescimento de neurito.
sNogoR310, sNogoR310-Fc e mAb 5B10 protegeram os neurô-nios de DRG da inibição mediada por mielina de crescimento de neurito (Fig.9-11). sNogoR310 foi usado em um ensaio similar usando neurônios de pin-to e foi descoberto como sendo protetor.
Foi também testado o efeito neuro-protetor de receptores Nogosolúveis pela realização de experimentos com cultivo de células na presençae ausência de laminina. O crescimento celular neuronal nos meios sem Ia-minina é pobre e reproduz condições de estresse neuronal.
DRGs foram dissecados de filhotes de rato com 6-7 dias pós-nascimento (P6-7), dissociados em células isoladas e plaqueados em placasde 96 cavidades pré-revestidas com poli-D-lisina como descrito acima. Emalgumas cavidades, 2 pg/ml de laminina foram adicionados por 2-3 horas eenxaguados antes das células serem plaqueadas. Após uma incubação de18-20 horas as placas foram fixadas com paraformaldeído 4%, coradas comanticorpo anti-Beta-lll-tubulina de coelho diluído a 1:500 (Covance®) e anti-HuC/D diluído em 1:100 (Molecular Probes) e anticorpos secundários fluo-rescentes (Molecular Probes) foram adicionados em uma diluição 1:200. Ar-rayScan® Il (Cellomics®) foi usado para capturar imagens digitais com ampli-ação de 5x e para quantificar o crescimento de neurito como a média decrescimento de neurito/neurônio por cavidade, pelo uso do aplicativo paracrescimento de neurito. Nove imagens de 5x de 3 cavidades/condição foramanalisadas.
Em alguns experimentos, um sub-clone de células PC12 (Neuroscreen™) foi usado (Cellomics®). As células Neuroscreen™ foram pré-diferenciadas por 7 dias com 200 ng/ml de NGF, desprendidas e re-plaqueadas em placas de 96 cavidades pré-cobertas com poli-D-lisina. Emalgumas cavidades, 5 pg/ml de laminina foram adicionados por 2-3 horas eenxaguados antes das células serem plaqueadas. Após 2 dias de incubação,as placas foram fixadas com paraformaldeído 4%, coradas com anticorpoanti-Beta-lll-tubulina de coelho diluído a 1:500 (Covance®) e Hoescht (man-cha nuclear). ArrayScan® π foi usado para quantificar o crescimento de neu-rito da mesma forma que nas células de DRG.
sNogoR344-Fc ou IgG de rato foram adicionados em solução aneurônios de DRG P6-7 e às células Neuroscreen™ diferenciadas no mo-mento do plaqueamento.
O efeito neuroprotetor de sNogoR344-Fc foi observado com 1μΜ e 10 μΜ quando neurônios de DRG P6 foram cultivados na ausência delaminina. A quantificação do crescimento de neurito mostrou um aumentodependente da dose com a adição de sNogoR344-Fc. A adição de sNo-goR344-Fc nas mesmas concentrações a neurônios de DRG cultivados so-bre um substrato de laminina, não produziu nenhum efeito incomum, indi-cando que sNogoR344-Fc é ativo apenas sobre células estressadas. O efei-to neuro-protetor de sNogoR344-Fc nas mesmas concentrações na ausênciade laminina também foi visto com células Neuroscreen™.
EXEMPLO 11
PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA DE FUSÃO FC-SNOGOR-1
Um constructo de cDNA codificando os aminoácidos 1-310 dereceptor Nogo-1 de rato foi fundido com uma Fc de IgG1 de rato contido emum vetor de expressão de mamífero e esse vetor foi eletroporado em célulasde ovário de hamster chinês (CHO) (DG44). As células foram mantidas emalfa-MEM suplementado com soro fetal bovino dialisado 10%, glutamina 2mM e reagentes antibióticos-antimicóticos. Dois dias após a transfecção, omeio condicionado foi coletado e analisado por Western blot sob condiçõesredutoras. Uma banda de proteína de cerca de 60 kDa foi detectada usandoum anticorpo policlonal anti-receptor Nogo-1 de coelho. As células foramexpandidas e classificadas usando um anticorpo de cabra anti-lgG de ratoconjugado com R-PE. Após a segunda classificação, as células foram pla-queadas com uma densidade de uma célula/cavidade em placas de 96 cavi-dades. Os níveis secretados de proteína solúvel de receptor Nogo-1 de cavi-dades individuais foram testados e comparados usando um ELISA sanduí-che. A placa de ELISA foi coberta com anticorpo de cabra específico anti-Fck de IgG de rato. O meio condicionado foi aplicado. A proteína solúvel dereceptor Nogo-1 ligada foi detectada por anticorpo de jumento anti- Fab deIgG de rato Fc-específico conjugado com HRP. O clone 4C12 teve o nível desecreção mais alto. 4C12 foi expandido e cultivado em meio CHO-M7 emfrasco rotatório. O nível de secreção foi de cerca de 10 mg/L a 37°C.
Células CHO expressando a proteína de fusão sNogoR310-Fcforam cultivadas larga escala. 1,7 L de meio condicionado concentrado fo-ram obtidos a partir de um cultivo em um biorreator de 10L. O pH foi elevadopela adição de um décimo de volume de Tris-HCI 1,0 M, pH 8.9. Cloreto desódio sólido e glicina foram adicionados em 3,0 M e 1,5 M, respectivamente.Uma coluna de proteína A-Sepharose™ de 60 mL equilibrada com Tris-HCI10 mM, cloreto de sódio 3 M, glicina 1,5 M, pH 8.9 foi preparada. Meio con-dicionado concentrado foi aplicado à coluna em 1,5 ml/min usando umabomba peristáltica. A coluna foi lavada com 300 ml de Tris-HCI 10 mM, clo-reto de sódio 3M, glicina 1,5 M, pH 8.9, seguido por 120 ml de Tris-HCI 5mM, cloreto de sódio 3M, pH 8.9. A proteína foi eluída com fosfato de sódio25 mM, cloreto de sódio 100 mM, pH 2.8. Frações de 10 ml foram coletadasem tubos contendo 1,0 ml de HEPES 1,0 M, pH 8.5. Frações de proteínaforam reunidas e dialisadas contra 3 χ 2 L de fosfato de sódio 5mM, NaCI300 mM, pH 7.4.
EXEMPLO 12
ENSAIO DE TRANSECCÃO DE MEDULA ESPINHALPara testar sua habilidade em promover a recuperação funcionalin vivo, uma proteína de fusão de sNogoR-1 foi testada em um ensaio detransecção de medula espinhal de rato.
Bombas osmóticas Alzet® foram carregadas com solução de tes-te (sNogoR310-Fc em PBS) feita recentemente no dia do uso. A concentra-ção de carga foi calculada para ser 5 e 50 μΜ. As bombas foram condicio-nadas para uso por >40 horas a 37°C antes do implante nos animais. Ratosfêmeas Long Evans receberam analgesia pré-operatória e tranqüilizantes eforam anestesiados com isoflurano (3% em O2).
Os ratos foram colocados em uma estrutura estereotáxica e ocórtex motor foi exposto para infusão do agente traçador BDA (10.000 MW)bilateralmente. Os ratos foram então submetidos a hemissecção dorsal damedula espinhal em T5-T6 seguida pelo implante de cateter intratecal e dosistema de bomba para liberar o composto de teste (n=11 por grupo).
Os ratos foram deixados se recuperar e sobreviver por até 28dias após a cirurgia. A avaliação comportamental usando o sistema BBB foiregistrada por 28 dias após a indução da lesão, pouco antes do término dafase "em vida" do estudo. Depois da perfusão e fixação, as medulas espi-nhais foram removidas, crio-protegidas, secionadas, coradas e as contagensde axônios realizadas.
A escala de classificação Iocomotora de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) (Basso et ai, Neurotrauma 13:343-359 (1996)), o teste doplano inclinado e o teste de caminhada sobre grade inclinada (Li & Strittmat-ter, J Neurosci. 23:4219-27 (2003)) foram monitorados em ratos e camun-dongos após a lesão. Para o teste do plano inclinado, foi medido o ângulomáximo no qual uma placa de 50 cm χ 60 cm poderia ser inclinada por 5 segsem que o camundongo escorregasse. Para a caminhada sobre grade incli-nada, os camundongos foram treinados a escalar uma grade de arame (35cm de comprimento com quadrados de 2,54 cm) em uma inclinação de 45graus. O número de vezes nas quais a pata traseira caiu abaixo do plano dagrade foi registrado para cada excursão da base ao topo. Para o teste com-portamental do rato, a escala Iocomotora de BBB, caminhada na grade eanálise de impressão plantar foram realizadas. Para a caminhada na grade,os ratos foram treinados a andar sobre uma grade de arame (70 cm de com-primento com quadrados de 2,54 cm) e o número de vezes nas quais a patatraseira caiu abaixo do plano da grade foi contado. Para análise de impres-são plantar, os padrões de marcha das patas traseiras do rato foram regis-trados com tinta durante uma locomoção contínua ao longo de uma pista de90 cm e o comprimento da passada de cada lado e a largura da passadaforam calculados (Metz et ai, Brain Res. 883:165-177 (2000)). Todos essestestes comportamentais foram realizados em pelo menos dois indivíduos.Durante toda a cirurgia, teste comportamental e análise histológica, os pes-quisadores não estavam a par da identidade do composto na minibomba.
sNogoR310-Fc promoveu recuperação funcional (Fig. 12).
EXEMPLO 13
ENSAIO DE CONTUSÃO DE MEDULA ESPINHAL DE RATO
O efeito de polipeptídeos e proteínas de fusão solúveis do recep-tor Nogo-1 sobre os neurônios in vivo são testados em um ensaio de contu-são de medula espinhal de rato.
Ratos fêmeas Long Evans hooded (170-190 g) são tratados pro-filaticamente com agentes analgésicos e antibióticos. Dez minutos antes dacirurgia, os animais são tranqüilizados com 2,5 mg/kg de Midazolam i.p. eanestesiados com isoflurano 2-3% em O2. Os ratos são então raspados, lim-pos com álcool e betadina e um lubrificante ocular é aplicado aos seus o-Ihos. Depois, uma incisão é feita abaixo da linha média e as vértebras de T7a T12 são expostas.
Uma laminectomia dorsal é realizada em T9 Vz e T10 para expora medula. O rato é colocado sobre o lmpactor. Os segmentos de T7 e T8são primeiro pinçados e então os segmentos T11 e T12 são ligados à pinçacaudal. Um material macio é colocado debaixo do tórax do rato. A haste doImpactor é ajustada na posição zero e o grampo de aterramento elétrico éligado na borda da lesão. A haste do Impactor é então elevada para 25,0mm e ajustada apropriadamente para uma posição diretamente acima damedula espinhal exposta. A seguir, a haste do Impactor é liberada para atin-gir a medula exposta e a haste do Impactor é imediatamente elevada.
O rato é então retirado do aparalho e Gelfoam®é colocado sobrea lesão. O músculo sobre a lesão é suturado e a incisão é fechada cirurgi-camente. Os animais são colocados em uma incubadora até que eles serecuperem da anestesia. São dados antibióticos, analgésicos e solução sali-na, se necessário, aos ratos. As bexigas são esvaziadas a cada manhã etarde até que a função seja recuperada.
Proteína de fusão solúvel do receptor Nogo-1 (por exemplo,sNogoR310-Fc) é administrada intratecalmente como descrito no modelo detransecção de medula espinhal de rato acima. A avaliação de BBB é realiza-da um dia após a cirurgia, e então a cada semana até 4 a 6 semanas.
EXEMPLO 14
EXPRESSÃO DE SNOGOR31Q EM CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOS
Foram produzidos camundongos transgênicos que expressam aproteína de receptor Nogo-1 solúvel para testar seu efeito quando expressain vivo.
Foi clonado o cDNA sNogoR310 de camundongo (correspon-dendo aos aminoácidos de 1-310 do receptor Nogo-1) no sítio de NotI dovetor C-3123. Nesse vetor, a expressão de sNogoR310 está sob o controledos elementos regulatórios do gene da proteína ácida fibrilar da glia (gfap),que permitem alto nível de expressão com secreção aumentada dos astróci-tos reativos no local da lesão. Foi digerido o vetor resultante seqüencialmen-te com AatW e Sffl e o constructo gf/ap::sNogoR310 em um fragmento de 3,4kb. Foi microinjetado esse fragmento em embriões para gerar camundongostransgênicos. Foi verificado por PCR que o transgene tinha se integrado eidentificados cinco linhagens originais. Foram cruzados machos heterozigo-tos das duas linhagens originais com os níveis mais altos de expressão comfêmeas de camundongos C57BL/6J. Foi confirmado que as células positivaspara GFAP expressam e secretam sNogoR310 em camundongos transgêni-cos heterozigotos por análise de Western blot usando o anticorpo criadocontra o receptor Nogo-1.
Foi homogeneizado o córtex e a medula espinhal em soluçãosalina tamponada com Tris suplementada com inibidores de protease (Ro-che) e centrifugado o material homogeneizado a 40.000 rpm por 20 min a4°C. Foi tratado o sobrenadante com paraformaldeído 4% por 20 min paraaumentar a especificidade do anticorpo e dialisado antes do immunoblotting.
Foi homogeneizada a fração particulada por sonicação em tampão RIPA(Triton® X-100 1%, desoxicolato de sódio 0,5%, SDS 0,1% em PBS), centri-fugado o material homogeneizado resultante e tratados esse sobrenadante(fração particulada solúvel em detergente) como acima. Foram analisados20 pg de proteína de cérebro ou medula espinhal por immunoblot usandoanti-soro de coelho criado contra o receptor Nogo-1 em diluição de 1:2000.Foi visualizada a imunorreatividade pela incubação com IgG anti-coelho con-jugada com AP e substratos de AP NBT/BCIP.
Foi detectada sNogoR310 de 37 kDa secretada nos extratos so-lúveis livres de detergente de córtex e medula espinhal de duas linhagenstransgênicas Tg08 e Tg01, mas pouca proteína de receptor de Nogo-1 solú-vel com 37 ou 81 kDa está presente nos camundongos selvagens (WT) daprole. O exame das frações particuladas demonstrou que havia níveis com-paráveis de receptor Nogo-1 endógeno em ambos os camundongos WT etransgênico.
EXEMPLO 15
EXPRESSÃO DE SNOGOR31Q EM CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOSAPÓS LESÃO
Foi testado o efeito da lesão do CNS sobre a expressão de sNo-goR310 em camundongos transgênicos pela realização de uma lesão dehemissecção dorsal. Nós obtivemos animais transgênicos e não-transgênicos para sNogoR310 de controle pelo cruzamento de machos hete-rozigotos com fêmeas C57/BL6 como descrito no Exemplo 14.
Foram anestesiados profundamente camundongos fêmeas adul-tas trasngênicas heterozigotas ou WT da prole (10-16 semanas de idade) erealizamos uma Iaminectomia completa, expondo completamente a partedorsal da medula espinhal nos níveis de T6 e T7. Foi realizada uma hemis-secção dorsal em T6 com uma agulha de 30 gauge e um par de microtesou-ras para separar completamente os tratos corticoespinhais (CSTs) dorsal edorsolateral. Foi passada uma agulha marcada por toda a parte dorsal damedula espinhal diversas vezes para assegurar que a lesão estava em umaprofundidade de 1,0 mm. Foram suturadas as camadas musculares sobre aslaminectomias e fechadas a pele do dorso com grampos cirúrgicos. Parasinalizar os tratos corticoespinhais, foi feita uma trepanação sobre o córtexcerebral do lado direito do crânio 14 dias após a lesão da medula espinhal.Foi aplicado o traçador BDA (MW 10.000, PBS 10%) (Molecular Probes, Eu-gene, OR) em 4 sítios de injeção em uma profundidade de 0,7 mm a partirda superfície cortical. Quatro semanas após a lesão, os camundongos foramperfundidos transcardialmente com PBS1 seguido por paraformaldeído 4%.Camundongos usados para experimentos de expressão de sNogoR310 nãoreceberam nenhuma injeção de traçador.
Para os camundongos usados na análise de Western blot, amedula espinhal no nível entre T3 e L3 foi coletada sem perfusão 14 diasapós a lesão. Camundongos usados para coloração imunohistoquímica dereceptor Nogo-1 foram perfundidos com paraformaldeído 4% 10 dias após ahemissecção e a medula espinhal lesada foi removida para realização decortes. Para examinar a expressão de sNogoR310 no cérebro lesado decamundongos transgênicos e WT, uma lesão perfurante no córtex foi reali-zada com uma lâmina de bisturi número 11 presa em um aparelho estereo-táxico (David Kopf, Tujunga, CA). Um corte parassagital de 4 mm foi feito,0,5 mm posterior ao Bregma, 1,5 mm lateralmente à linha média e com pro-fundidade de 3,5 mm.
Foram detectados níveis aumentados de sNogoR310 em extra-tos solúveis de medulas espinhais dez dias após a lesão em camundongostransgênicos mas não em camundongos WT, de forma compatível com aregulação positiva após a lesão de GFAP em torno da lesão. Para confirmarque isso não era devido à regulação positiva compensatória de Nogo-A, foitestada sua expressão e descoberto que ela era similar no córtex e medulaespinal intactos ou Iesionados tanto de camundongos transgênicos comoWT.Foi examinada a expressão celular de sNogoR310 no CNS lesi-onado por imunomanchamento do cérebro e medula espinhal Iesionadoscontendo a área de lesão com anticorpos contra receptor Nogo-1 e GFAP. Amorfologia geral da glia astrocítica não difere entre camundongos WT etransgênicos, mas a densidade corada para o receptor Nogo-1 nos espaçosintra e extracelular é acentuadamente maior nos camundongos transgênicospara gfap::sNogoR310 do que em camundongos WT, indicando expressãoaumentada de sNogoR310 em torno da lesão em camundongos transgêni-cos. A proteína do receptor Nogo-1 está co-localizada com o marcador as-trocítico de GFAP apenas em camundongos transgênicos. Também há umacoloração não-celular difusa bastante aumentada nas amostras transgêni-cas, o que é compatível com sNogoR310 no espaço extracelular. A colora-ção do receptor Nogo-1 do corpo da célula neuronal é detectada tanto noscamundongos WT como transgênicos.
EXEMPLO 16
SNOGOR31Q SECRETADO INDUZ BROTAMENTO DE CST EM CAMUN-DONGOS TRANSGÊNICOS
Foi testado se a expressão aumentada de sNogoR310 em tornodá lesão em camundongos transgênicos resulta na regeneração de axônioslesados.
Foi investigada a integridade dos tratos corticoespinhais des-cendentes (CST) por injetar traçador anterógrado biotina dextran amina(BDA) no córtex motor direito como descrito em Li & Strittmatter, J. Neurosci.23:4219-27 (2003). Em camundongos WT da prole, o CST dorsal (dCST)proeminente está bem compactado em sentido rostral à lesão e algumasfibras dorsolaterais do CST são visíveis ipsilateralmente. Um pequeno núme-ro de brotos colaterais curtos marcados com BDA projeta-se na matéria cin-zenta. Particularmente, na medula ventral, mas o brotamento é amplamenteconfinado ao lado da medula contralateral a injeção do traçador. Entretanto,os cortes da hemissecção rostral até dorsal de camundongos transgênicossNogoR310 Iesionados indicam um padrão de marcação com BDA muitodiferente. Uma grande densidade de fibras de CST rotuladas com BDA éobservada do lado de fora do dCST proeminente em todos os camundongostransgênicos da linhagem Tg08 ou linhagem Tg01. Fibras ectópicas esten-dem-se através da área da substância cinzenta e algumas fibras alcançam asubstância branca lateral e dorsolateral. Várias fibras (4-12 brotamentos porcorte transversal) são vistas sobre o lado oposto da medula espinhal (ipsila-teral ao sítio de injeção do traçador). Medida microdensitométrica dos bro-tamentos colaterais indica um aumento de aproximadamente dez vezes nadensidade de brotamento em camundongos transgênicos sNogoR310. Oexame de cortes longitudinais parasagitais de 1 a 4 mm rostral à lesão reve-la que as fibras de dCST estendem em um grande número de brotamentosramificados para dentro da área da substância cinzenta ventral em camun-dongos transgênicos sNogoR310, ao contrário dos animais WT da prole.Geralmente, o padrão e a extensão de brotamento rostral à lesão em ca-mundongos transgênicos são similares àqueles observados nos camundon-gos tratados sistemicamente com o peptídeo antagonista de receptor Nogo-1NEP1-40 (Li & Strittmatter1 J. Neurosci, 23:4219-27 (2003)).
Esses resultados demonstram que sNogoR310 secretado induzbrotamento no CST em camundongos transgênicos.
EXEMPLO 17
REGENERAÇÃO DE AXÔNIOS DE CST CONTORNANDO O SÍTIO DA LE-SÃO NA MEDULA ESPINHAL DISTAL EM CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOS SNOGOR31Q
Foi isolada medula espinhal 4 mm rostral e 4 mm caudal ao sítioda lesão (8 mm de extensão no total) de camundongos transgênicos e inclu-ida em uma matriz de albumina polimerizada com glutaraldeído e cortadaparasagitalmente em um vibrátomo (espessura de 30 μιη). Foram coletadoscortes transversais (50 μιτι) da medula espinhal entre 5-7 mm rostral e 5-7mm caudal ao local da lesão. Para experimentos de injeção de sNogoR310-Fc em ratos, a medula espinhal que se estende de 10 mm rostral a 10 mmcaudal ao local da lesão foi cortada parasagitalmente (50 μιη) em um micró-tomo vibratório. Cortes transversais foram coletados da medula espinhal en-tre 11-16 mm rostral e 11-16 mm caudal ao local da lesão. Foram incubadosos cortes com complexo avidina-biotina-peroxidase e visualizados o traçadorBDA por uma reação de HRP com diaminobenzidina intensificada por níquel(Grandpre, Nature 417:547-551 (2002)). Foram processados alguns cortespara imunohistoquímica para serotonina (anticorpo anti-5-ΗΤ) por imunofluo-rescência indireta. Para visualizar a área de lesão, foram corados duplamen-te alguns cortes com anticorpos direcionados contra GFAP (Sigma®, St.Louis, MO). Foram montados, desidratados e cobertos os cortes com meiode montagem.
Foi testado se as fibras induzidas por sNogoR310 expresso emcamundongos transgênicos após a lesão (veja Exemplo 16) cruzam a áreade lesão na medula espinhal caudal para fornecer recuperação funcional.
Cortes parasagitais consecutivos ao longo do local da lesão de-lineadas em câmera lúcida apresentam o padrão de distribuição global dasfibras de CST em regeneração a alguns milímetros da lesão. Cortes prove-nientes de camundongos WT não mostram fibras de CST se estendendoalém do local da lesão. Cortes similares provenientes de camundongostransgênicos sNogoR310 apresentam várias fibras de CST que cruzam aárea de corte transversal e se projetam para dentro das áreas de substânciacinzenta e branca distais em um padrão altamente ramificado. Imediatamen-te rostral à hemiseção, uma alta densidade de brotamentos de CST marca-dos com BDA originados de dCST proeminente projeta-se na área de lesão,mas a maioria dos brotos de CST não conseguem passar pela área do cortetransversal onde a formação de cicatriz e cavitação tecidual são importantes.Uma fração pequena, mas altamente significativa de axônios em regenera-ção ultrapassa o local da lesão através de pontes de tecido remanescentedas substâncias cinzenta e branca ventrais e ventrolaterais. Além disso, al-gumas fibras de CST parecem cruzar a área de corte transversal em si atra-vés da medula espinhal Iesionada dorsal e dorsolateral para dentro de regi-ões distais. Nas proximidades da lesão, o curso de fibras em regeneraçãoera tipicamente tortuoso e muito distinto das fibras retas normais no CSTrostral. Fibras colaterais e arborizadas são mais freqüentemente vistas naárea da substância cinzenta da medula espinhal distai. As reconstruçõesdemonstram 5 a 15 fibras em regeneração marcadas com BDA passando noeixo rostral-caudal em qualquer nível 1 a 4 mm caudal à lesão em cada ca-mundongo transgênico. Para os cortes transversais 5-7 mm caudal à hemi-seção dorsal, axônios de CST marcados com BDA são vistos tanto nas á-reas de substância cinzenta como de substância branca em cada camun-dongo transgênico.
EXEMPLO 18
EXPRESSÃO TRANSGÊNICA DE SNOGOR31Q MELHORA A RECUPERAÇÃO LOCOMOTORA
A análise com traçador e da fibra serotoninérgica de axônios deCST indica que o sNogo310 liberado dos astrócitos em camundongos trans-gênicos estimula intensa regeneração anatômica de axônios descendenteslésionados na medula espinhal. Nós realizamos vários testes de comporta-mento como descrito no Exemplo 12 para determinar se essas fibras regene-radas beneficiam a recuperação funcional.
Como avaliado pelo teste de BBB1 os camundongos WT recupe-ram parcialmente a função Iocomotora durante um período de sobrevivênciade 4 semanas. 4 semanas após a lesão, a maioria dos camundongos WT serecuperou a um nível caracterizado por passada plantar regular com suportede peso consistente, mas eles exibiam coordenação dos membros dianteirose traseiros apenas ocasional a freqüente, com uma rotação da posição pre-dominante da pata ao fazer o contato inicial com a superfície. Ao contrário,os escores de BBB de camundongos transgênicos sNogoR310 de ambas aslinhagens Tg08 e TgOI são significativamente maiores do que o grupo decontrole ao longo de um período de observação de 7 a 28 dias (Figs. 13A e13B). 28 dias após a lesão, a maioria dos camundongos transgênicos mostracoordenação dos membros dianteiros e traseiros consistente e o posiciona-mento predominante da pata é paralelo ao corpo.
Foram empregados mais dois testes de comportamento paracaracterizar adicionalmente o desempenho de camundongos transgênicossNogoR310. Primeiro, foi medido o ângulo máximo no qual uma placa pode-ria ser inclinada sem que um camundongo perdesse sua firmeza dentro de 5seg. Antes da lesão de hemiseção dorsal, tanto os camundongos transgêni-cos como WT podem sustentar sua postura sobre uma placa inclinada em55 graus. Nos dias 7 a 28 após a lesão, o ângulo sustentável está reduzidoem todos os camundongos, mas os ângulos sustentáveis pelos camundon-gos transgênicos são significativamente maiores do que aqueles para o gru-po de controle (Fig. 13C). No outro teste de comportamento, os camundon-gos escalaram uma grade colocada em um ângulo de 45 graus com a verti-cal e as excursões dos membros posteriores abaixo do plano da grade foramcontadas (Metz et aí., Brain Res. 883:165-177 (2000)). Nenhum camundon-go cometeu erros nesse teste durante o treinamento pré-lesão. Há várioserros de falha da colocação do pé com melhora apenas mínima em camun-dongos WT durante o período de 2 a 6 semanas após a lesão. Ao contrário,os camundongos transgênicos sNogoR310 exibem uma melhora progressivana escalada da grade durante esse período, com a maior parte da melhoriaocorrendo entre 1 a 3 semanas após a lesão (Fig. 13D). Assim, camundon-gos transgênicos que secretam sNogoR310 de astrócitos exibem regenera-ção de CST, brotamento da rafe espinhal e função motora melhorada apóshemiseção de medula espinhal torácica.
EXEMPLO 19
ADMINISTRAÇÃO INTRATECAL DE PROTEÍNA SNOGOR31Q-FC INDUZBROTAMENTO DE CST
Como um segundo teste do benefício de promoção de cresci-mento de receptor Nogo-1 solúvel após trauma espinhal, a proteína purifica-da intratecalmente foi administrada.
O domínio de ligação do Iigante (27 a 310) de receptor Nogo-1de rato com o domínio de Fc de IgGI de rato foi fundido para promover aestabilidade e purificação. A proteína foi transfectada a partir de células CHOestavelmente transfectadas. Essa proteína bloqueia Nogo-66, MAG e a açãoda mielina in vitro, como mostrado anteriormente para sNogoR310-Myc Hisde camundongo (Fournier et al., J Neurosci. 22:8876-8883 (2002); Liu et ai,Science 297:1190-1193 (2002)). A proteína sNogoR310-Fc foi liberada intra-tecalmente a ratos com uma lesão de hemissecção dorsal médio-torácicaatravés de uma minibomba osmótica. Durante um período de sobrevivênciade quatro semanas após a lesão, 1,2 mg de proteína sNogoR310-Fc foramadministrados localmente em cada rato. Nos ratos que recebem tratamentocom veículo (1,2 mg de IgG de rato), os cortes rostrais à hemiseção mos-tram o CST dorsal proeminente bem compactado e muito poucas fibras deCST ectópicas marcadas com BDA acima do local da lesão. Os cortes ros-trais à lesão de ratos Iesionados que recebem a proteína sNogoR310-Fcexibem um padrão bem diferente de marcação. Várias fibras ectópicas bro-tando do CST marcado com BDA são observadas a partir de cortes trans-versais e parassagitais. Em alguns casos, as projeções cruzam a área dodCST próxima a linha média até a circunferência da medula, tornando-seentremeadas com o CST dorsolateral. Os brotamentos axonais se estendematravés da substância cinzenta por uma extensão maior do que na substân-cia branca. Uma medida de brotamentos de fibras ectópicas (>100 μm emcortes transversais, >200 μιτι em cortes sagitais) adjacentes ao dCST revelaum grande aumento nos ratos tratados com sNogoR310-Fc.
EXEMPLO 20
AXÔNIOS DE CST SE REGENERAM NA MEDULA ESPINHAL DORSALEM RATOS TRATADOS COM SNOGOR31Q-FC
Os ratos Sprague-Dawley fêmeas foram anestesiados profun-damente (190 a 250 g) e conduzidos Iaminectomias nos níveis medulares deT6 a 17, expondo a medula espinhal. A metade dorsal da medula espinhalfoi cortada com uma agulha de 30 gauge e um par de microtesouras paraseparar as partes dorsais dos tratos de CSGT e garantiu-se a profundidadeda lesão (1,8 mm) pela passagem da parte afiada de uma lâmina número 11ao longo da metade dorsal da medula (Grandpre et al, Nature 417:547-551(2002)). Uma minibomba osmótica (Alzet® 2ML4, volume de 2 ml, 2,5 μΙ/h,liberação por 28 dias), que foi preenchida com 1,2 mg de IgG de rato emPBS ou 1,2 mg de proteína de fusão sNogoR310-Fc em PBS, foi suturadaaos músculos sob a pele no dorso dos animais. Um cateter conectado à saí-da da minibomba foi inserido no espaço intratecal da medula espinhal nonível de T7 a T8 através de um pequeno orifício na dura máter.A infusão da proteína antagonista de receptor Nogo-1 induziuintenso brotamento rostral a uma hemiseção de rato, mas uma questão maiscrítica é se as fibras de CST brotando projetam-se para a medula espinhaldistai e contribuem para a recuperação locomotora. Cortes longitudinais a-través do local da lesão de ratos tratados com veículo não apresentam ouapresentam um número muito pequeno de fibras ventrais de CST marcadascom BDA abaixo do nível da lesão (Grandpre et al, Nature 477:547-551(2002); Weidner et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 98:3513-3518 (2001)). Oscortes similares de ratos tratados com sNogoR310-Fc demonstram muitasfibras marcadas com BDA contornando o local de transecção e se projetan-do para a medula espinhal caudal amplamente através de pontes teciduaisde medula espinhal ventral e ventrolateral. A imunocoloração para o marca-dor astrocítico GFAP mostra que a extensão da transecção chegou maisfundo do que a área do canal central. Diferente do perfil linear das fibras ros-trais no CST dorsal proeminente, as fibras regeneradas do CST geralmenteseguem uma trajetória altamente ramificada na medula espinhal distai, parti-cularmente na área da substância cinzenta. Essas fibras são detectadas emdiversas regiões da medula espinhal, mas elas são mais facilmente vistas naparte central e na metade dorsal da medula espinhal por toda a medula es-pinhal. Contagens de fibras de CST dos cortes sagitais indicam aproxima-damente 20 axônios marcados com BDA 1 a 2 mm caudal à lesão e 15 axô-nios traçados 7 a 8 mm distai à lesão de cada rato tratado com sNogoR310-Fc.
Geralmente, o padrão de ramificação dessas fibras é similar à-quele observado nos animais tratados com o peptídeo NEP 1-40 local, masmais ramificações colaterais em cada brotamento são vistas a partir dos cor-tes tratadas com a proteína sNogoR310-Fc. Uma medida dos brotamentosda medula espinhal distai demonstra que o comprimento colateral total decada brotamento em ratos tratados com sNogoR310-Fc é duas vezes maiordo que aquele dos animais tratados com NEP 1-40. O número de brotamen-tos (>200 pm de comprimento) localizados 1 a 10 mm caudal à medula espi-nhal em ambos os grupos tratados com antagonista de receptor Nogo-1 éaproximadamente 20 a 40 vezes maior do que nos grupos de controle. Maisbrotamentos são vistos em ratos tratados com sNogoR310-Fc do que com otratamento local com NEP 1-40 (-50 vs. 25 brotamentos /rato), mas essadiferença não é estatisticamente significativa (p=0,1713, teste-t).
Axônios de CST em regeneração são observados em cortestransversais de medula espinhal 11 a 15 mm caudal à hemiseção em ratosque recebem tratamento com sNogoR310-Fc. Essas fibras são detectadastanto na substância cinzenta como na substância branca da medula espi-nhal. As fibras detectadas na substância cinzenta exibem freqüentementemais ramificações colaterais do que na área da substância branca. Em con-traste, em cortes transversais do grupo tratado com veículo, marcações comBDA apenas ocasionais são vistas na área da substância branca ventral, deforma compatível com os axônios de CST ventral não lesionados. No nívelmais distai da medula espinhal, o número médio de fibras do CST marcadascom BDA em ambos os grupos tratados com antagonista de receptor Nogo-1[sNogoR310-Fc e NEP 1-40] é aproximadamente 20 vezes maior do que ode ratos tratados com veículo. Tomados juntos, ambos os antagonistas dereceptor Nogo, proteína sNogoR310-Fc e peptídeo NEP 1-40, resultam emregeneração dramática de axônios do CST na medula espinhal distai, mas obrotamento induzido pelos anteriores exibe um padrão mais altamente rami-ficado.
EXEMPLO 21
SNOGOR31Q-FC LOCAL INDUZ BROTAMENTO DE AXÔNIOS RUBRO-ESPINHAIS E SEROTONINÉRGICOS EM MEDULA ESPINHAL NÃO LESI-ONADA DE RATO
Quatorze dias após a hemiseção, foi feita uma trepanação decada lado do crânio sobre o córtex senso-motor dos membros inferiores parasinalizar fibras do CST. O traçador neuronal anterógrado BDA (10% emPBS, 3,5 μΙ por córtex) foi aplicado em sete sítios de injeção em uma pro-fundidade de 1,5 mm da dura máter de cada lado (Grandpre et ai, Nature477:547-551 (2002)). Para o traçamento do trato rubroespinhal em ratos, otraçador BDA (1 μΙ; MW 10.000; 10% em PBS) foi injetado no núcleo rubrodo lado esquerdo (5,8 mm posterior ao bregma, 0,7 mm lateral, 7,0 mm ven-tral à superfície do crânio). Duas semanas após a injeção de BDA, essesanimais foram perfundidos com PBS, seguido por paraformaldeído 4% e otecido foi coletado para histologia.
O reparo das fibras lesadas do trato rubroespinhal (RST) contri-bui para melhorias funcionais após lesão de medula espinhal (Liu et ai, J.Neurosci., 19:4370-4387 (1999)). A distribuição disseminada de receptorNogo-1 em neurônios do CNS (Wang et ai, J. Neurosci. 22:5505-5515(2002)) torna possível que a inibição de receptor Nogo-1 com seu antagonis-ta possa resultar em crescimento de axônios de RST após lesão. Para testaros efeitos de sNogoR310-Fc sobre RST lesionado, a integridade dessa viafoi traçada por injetar BDA no núcleo rubro esquerdo. No nível da medulaespinhal, as fibras de RST estão localizadas normalmente na área da subs-tância branca dorsolateral da medula espinhal e são cortadas transversal-mente pelas hemiseções dorsais desse estudo. Nos cortes transversais 11 a15 mm rostral à lesão dos ratos de controle, um pequeno número de fibrascurtas marcadas com BDA é visto entre RST proeminente e a substânciacinzenta do corno dorsal. Cortes no mesmo nível em ratos tratados comsNogoR310-Fc exibem muitas fibras de ligação entre o RST principal e asubstância cinzenta do corno dorsal. Cortes transversais 11 a 15 mm distaiao SCI, não exibem fibras de RST marcadas com BDA em ratos tratadoscom veículo. Em contraste, cortes no mesmo nível recebendo tratamentocom sNogoR310-Fc apresentam várias fibras de RST marcadas com BDAtanto na substância cinzenta como branca contralateral à injeção do traça-dor. Alguns brotamentos com um padrão de ramificação são vistos na subs-tância cinzenta ipsilateral à injeção de BDA.
Fibras rufe-espinhais também foram examinadas em ratos commedula Iesionada tratados com sNogoR310-Fc. Imunomanchamento de-monstrou que a densidade de fibras serotoninérgicas 11 a 15 mm rostral àlesão é similar entre grupos tratados com veículo e com sNogoR310-Fc. Noscortes 11 a 15 mm abaixo da lesão, as fibras serotoninérgicas em ratos tra-tados com sNogoR310-Fc são duas vezes mais numerosas do que aquelasdo grupo de controle. Esses resultados demonstram que a responsividade àinibição do receptor Nogo-1 pela proteína sNogoR310-Fc não é limitada àfibras de CST e que outros tratos descendentes, tais como os axônios ru-broespinhais e serotoninérgicos, também são responsivos ao antagonismodo receptor Nogo-1.
EXEMPLO 22
TRATAMENTO LOCAL COM SNOGOR31Q-FC MELHORA A RECUPER-CÃO FUNCIONAL EM RATOS
Administração intratecal de proteína sNogoR310-Fc estimula aregeneração de axônios em várias vias descendentes após lesão traumáticada medula espinhal. Foi testado se a proteína também melhora a recupera-ção funcional na medula espinhal lesada.
Duas semanas após a hemiseção, a avaliação Iocomotora deBBB em ratos tratados com veículo atinge um nível estável de 12 (Fig. 14A).Quatro semanas após a lesão, a maioria dos controles (6 de um total de 7)tem passos plantares com suporte de peso de freqüência regular e coorde-nação de membros anteriores e posteriores de freqüência regular, mas elestêm uma rotação do posicionamento predominante da pata ao fazer o conta-to inicial com a superfície. Ao contrário, em ratos que estavam receberendotratamento com proteína sNogoR310-Fc, a avaliação Iocomotora continua amelhorar mesmo entre 2 a 4 semanas após o trauma. Quatro semanas apósa lesão, todos os 9 animais tratados com sNogoR310-Fc tinham uma coor-denação de membros anteriores e posteriores regular e um posicionamentodas patas paralelo no contato inicial com a superfície do teste.
Caminhada na grade foi usada para avaliar os déficits no contro-le motor fino descendente após lesão da medula espinhal (Metz et al, BrainRes. 883:165-177 (2000)). Esse desempenho requer coordenação dosmembros anteriores e posteriores e controle de movimento voluntário medi-ado pelas fibras ventrolaterais, corticoespinhais e rubroespinhais. Durante otreinamento pré-lesão, todos os ratos colocaram seus membros posteriorescorretamente sobre as barras da grade. 2 a 4 semanas após a lesão, os ra-tos de controle fazem 8 a 9 erros por sessão com apenas uma melhora mi-nima com o tempo. Ao contrário, os ratos tratados com sNogoR310-Fc exi-bem uma melhora progressiva ao caminhar na grade e fazem significativa-mente menos erros (4 a 7 por sessão em média). A maioria da melhora ocor-re 2 a 3 semanas após a lesão. Análise das pegadas das patas traseiras nogrupo de controle mostra que a distância entre os passos é significativamen-te reduzida e a largura dos passos é aumentada 4 semanas após a hemi-seção, em comparação com ratos não lesados ou animais lesados que esta-vam recebendo tratamento com sNogoR310-Fc (Fig 14C). Portanto, essesmúltiplos testes comportamentais demonstram que o bloqueio da função doreceptor Nogo-1 com a injeção local de proteína antagonista melhora a re-cuperação Iocomotora após lesão.
EXEMPLO 23
LIGAÇÃO DE UM ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-NGR1, 1D9, AO RE-CEPTOR NOGO 310 (SNGR310) SOLÚVEL DE RATO
Análises estruturais realizadas no complexo co-cristalino do Fabde 1D9 e um fragmento solúvel de NgR1 de rato (srNgR310) mostra queesse anticorpo se liga próximo à junção do cap N-terminal e domínio de re-petição rica em Ieucina em NgR1 de rato. Figura 15. 1D9 se liga a NgR1 derato e não reconhece NgR1, NgR2 nem NgR3 de humano ou camundongo.Para cristalização de srNgR310-Fc com Fab de 1D9, cada macromoléeculafoi clivada com papaína e purificada a partir da porção Fc e armazenada emHepes 10mM, ph 7, NaCI 50mM. O complexo foi preparado a 80μΜ cada, emisturados em uma proporção de volume de 2:1 com uma solução de reser-va consistindo em 14% de Peg3350, Acetato de Zinco 0,4M, Cloreto deMagnésio 0,1 Μ. A solução foi incubada a 20°C por 1 hr e centrifugada a12.000 χ g por 3 minutos para remover o precipitado. Os cristais foram for-mados por colocar 3-5 μί do sobrenadante sobre cavidades contendo 50% a100% da solução de reserva a 20°C. Finos cristais semelhantes a uma placaforam formados durante um período de 1 semana a 20 °C. Os cristais foramcrioprotegidos por transferi-los rapidamente para Acetato de Zinco 0,2M, 8%de Peg3350, 25% de etileno glicol por 2 min. e então congelados por transfe-rência rápida para nitrogênio líquido.Cristais com aproximadamente 10 pm de espessura difratarampara 3,2Á em linha de luz X25 na Fonte Nacional de Luz Síncroton (Upton,NY). Processamento dos dados com o pacote de programas HKL v. 1.97(Otwinowski, Z., & Minor1 W., Methods Enzymol 276:307-326 (1997)) revelouque os cristais pertencem a um grupo espacial P21212 e têm dimensões decélula aproximadas iguais a a=90,6 Á, b= 188,6Á, c=125,5Â e α=β=τ^90, deforma compatível com 2 complexos Fab-NgRI por unidade assimétrica.
A estrutura cristalina foi solucionada pela utilização da informa-ção em experimentos de substituição isomórfica múltipla em cristais satura-dos para identificar sítios de mercúrio comuns ligados ao NgR junto comsubstituição molecular. O grupo espacial foi identificado por inspeção demapas de Patterson de diferença isomórfica do mercúrio e do ouro nos quaisum pico de 5 sigma consistente foi identificado na construção de Harker dew=0. Substituição molecular com MOLREP (Vagin, A., & Teplyakov, A., J.Appi Cryst. 30:1022-1025 (1997)) utilizando um modelo de homologia deNgR de rato baseado na estrutura de NgR1 humano (código de pdb 10ZN)(He, X.L. et al, Neuron 38:111 (2003)) e um modelo de homologia para Fabde 1D9 levou a localização de uma molécula de NgR1, uma de Fab e umasegunda de NgR1 com um fator-R resultante de 48% e densidade clara paraas regiões de CDR do FAb. A localização do modelo foi confirmada pelomapeamento dos sítios de mercúrio identificados a partir de diferenças nosmapas de Patterson sobre posições equivalentes em ambas as moléculasde NgR1 próximo de Asp138 e His182. Nenhum fragmento Fab adicional foiclaramente identificado na densidade. O refinamento dos dois NgR1 e 1 Fabusando CNX (Brunger, A. T. et al., Acta Crystattogr D Biol Crystallogr54:905-921 (1998)) para uma resolução de 3,2 Á ocorreu com um fator-Rcorrente de 42% e Rlivre de 46%.
A tabela 8 mostra os contatos entre Fab de 1D9 e NgR1 de rato.Os contatos nos quais os átomos de Fab estão dentro de uma distância de3,9 Â dos átomos em NgR1 de rato estão listados e aqueles contatos quepoderiam formar uma ponte de hidrogênio com a cadeia principal ou com acadeia lateral têm um asterisco associado (*).Tabela 8
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* indica interações de ponte de H
EXEMPLO 24
RASTREAMENTO DE RNAI DE NGR POR TRANSFECCÃO TRANSITÓRIA
Três constructos de RNAi foram desenhados contra o transcritode NogoRI humano (Figura 16A). RNAi-1 e RNAi-3 atingem especificamenteo gene de NgR humano. RNAi-2 foi desenhado para atingir os genes de NgRde humano, camundongo e rato. Pares de oligonucleotídeos DNA foram sin-tetizados e construídos em um vetor de expressão de RNAi baseado nopromotor de Pollll, pU6 que continha o promotor de U6 humano, o gene deresistência kar, e um sítio de clonagem Pacl. Nogor 2m foi.desenhado paracarregar dois pareamentos errados à seqüência alvo e serve como um con-trole negativo. As seqüências de nucleotídeo desses oligonucleotídeos sãomostradas na Figura 16B.
Os constructos de RNAi foram rastreados inicialmente por co-transfectar o vetor de expressão de NgR humano junto com os plasmídeosde expressão de RNAi (phl)6NgR-RNAi-1 , 2 e 3) em células L de camun-dongo. Células L de camundongo foram plaqueadas em placas de cultura de6 cavidades e então transfectadas com plasmídeo repórter de GFP de con-trole sozinho ou com vetor de RNAi contra GFP1 pU6GFPRNAi (raias 2 e 3).A expressão de GFP foi monitorada como um controle para o silenciamentodo gene de GFP. Células L de camundongo foram transfectadas com 0,5, 1ou 2 pg de vetor de expressão de hNgR (raias 4 a 6). A quantidade de DNAem cada cavidade foi ajustada para um total de 4 pg de DNA por adicionarplasmídeo pUC19. A proporção RNAi:alvo foi de 4:1. Cinco microgramas devetor de hNgR foram co-transfectados com 2 pg de plasmídeo de RNAi-1, 2,3 ou 2m de NgR (raias 7 a 10). Quarenta e oito horas após a transfecção, ascélulas foram colhidas em tampão de corrida de SDS e submetidas à SDS-PAGE. A expressão de hNgR foi analisada por Western blot usando soro decoelho contra anticorpo de hNgR policlonal R150 (painel A) ou anticorpomonoclonal 7E11 (painel B).
Silenciamento eficaz da expressão de NgR foi observado emcélulas transfectadas com phU6NgR-RNAi-1 e -2 e, Western blot usando osanticorpos de NgR 7E11 (monoclonal) e R150 (policlonal de coelho). Os re-sultados são mostrados na figura 17. a expressão de NgR foi reduzida paraníveis basais em células transfectadas com RNAi -1 e -2 de NgR. Em con-traste, RNAi-3 de NgR não mostrou nenhuma redução significativa de NgR,o que foi semelhante ao controle, RNAi-2m de NgR mutante. Portanto, RNAi-1 e -2 de NgR são eficazes no silenciamento do gene de hNgR. Os resulta-dos de transfecção transitória demonstraram >90% de inibição da expressãode NgR.
EXEMPLO 25
CONFIRMAÇÃO DO SILENCIAMENTO DE NGR HUMANO
Embora os sinais detectados sejam específicos para hNgR (a-penas em células transfectadas com cDNA de hNgR) com dois tipos de anti-corpos (Figura 17), o MW aparente das bandas detectadas (-50 kD) foi me-nor do que o esperado. Apesar de não estar preso pela teoria, isso é prova-velmente devido à glicosilação alterada de NgR humano em células L decamundongo. A fim de confirmar a observação sobre a discrepância no MWde NgR, transfecção de cDNA de hNgR foi realizada novamente em célulasSKN humanas e células 293 usando Lipofectina. Quarenta e oito horas apósa transfecção, as células foram colhidas em tampão de corrida de SDS esubmetidas as SDS-PAGE. A expressão de NgR foi detectada por Westernblot usando tanto 7E11 como R150, como descrito acima. Nenhum sinal es-pecífico de hNgR foi detectado nas células SKN ou 293 parentais e o MWaparente de hNgR detectado com R150 é o esperado em ambas as célulasSKN e 293, > 65kD (Figura 18).
O silenciamento de hNgR mediado por RNAi foi confirmado emcélulas SKN. As células SKN foram plaqueadas em placas de cultura de 6cavidades e então transfectadas com plasmídeo repórter de GFP de controlesozinho ou com vetor de RNAi contra GFP, pU6GFPRNAi (raias 2 e 3). Aexpressão de GFP foi monitorada como um controle para o silenciamento dogene de GFP. Células SKN foram transfectadas com 2 pg de vetor de ex-pressão de hNgR (raia 4). A quantidade de DNA em cada cavidade foi ajus-tada para um total de 4 μ de DNA por adicionar DNA de plasmídeo pUC19.0,5 pg de vetor de hNgR foi co-transfectado com 2 pg de plasmídeo deRNAi-1, 2, 3 ou 2m de NgR (raias 5 a 8). Quarenta e oito horas após a trans-fecção, as células foram colhidas em tampão de corrida de SDS e submeti-das a SDS-PAGE. A expressão de hNgR foi analisada por Western blot u-sando soro de coelho contra R150 de hNgR. Novamente, mais do que 90%de inibição de NgR foi demonstrada em todos os RNAi- 1 e 2 de NgR, masmenos eficiente de RNAi-3 e 2m de NgR (Figura 19).
EXEMPLO 26
ATENUAÇÃO DE NGR EM CÉLULAS NEUROSCREEN
Células NeuroScreen expressando NgR foram obtidas de Cello-mics Inc. para análise de função de NgR. A fim de obter atenuação estávelde NgR em células NeuroScreen1 todos os constructos de RNAi foram con-vertidos em vetores Ientivirais em estruturas principais de beta-gal ou deGFP. Uma representação esquemática do vetor Ientiviral é mostrada na Fi-gura 20. Vetores Ientivirais foram gerados por transecção de células 293com plasmídeos de empacotamento (Invitrogen). Para construir o vetor Ienti-viral para expressão estável de RNAi de NgRI1 os cassetes de RNAi consis-tindo no promotor hU6 que direciona a expressão das moléculas em formade grampo (isto é, Nogo-1, Nogo-2, Nogo-2m, e Nogo-3) foram retirados dovetor phU6 (descrito no Exemplo 24) por digestão com Pacl e clonados noúnico sítio de Pacl de plasmídeos SSM007. Veja, por exemplo, métodosdescritos em Robinson et al, Nature Genetics 33:401-406 (2003). Para sina-lizar a transdução do vetor lentiviral, um cassetete de expressão de CBA-GFP ou um cassete de expressão de CMV-LacZ foram inseridos no plasmí-deo SSM007 no sítio de Xbal, e os constructos resultantes foram chamadosSSM007-BFGW e SSM007-BFZW, respectivamente.
Após converter os constructos de RNAi de NgR1 em estruturaprincipal de SSM007-BFGW e SSM007-BFZW, os vetores foram co-transfectados com plasmídeos de empacotamento, pLPI, pLP2 e pLP/VSVGem células FT293 para produção do vetor lentiviral (Viropower kit, Invitro-gen). pLPI é um constructo de 8889bp que contém a seqüência gag/pol deHIV-1 e o elemento de resposta rev (RRE) expressos a partir de um promo-tor de CMV e com uma poli-A de β-globina; pLP2 é um constructo de 4180bp que expressa Rev a partir do promotor de RSV e com uma poli A de HIV-1 para terminar o transcrito; pLP/VSVG é um plasmídeo de 5821 bp e ex-pressa glicoproteína G do vírus da estomatite vesicular a partir do promotorde CMV e poli A de β-globina.
Devido ao efeito auto-limitante da interferência de RNAi ao títulolentiviral, todas as titulações dos estoques virais eram menores do que osvetores Ientivirais regulares, na faixa de 4 a 5x105 unidades de transduçãono meio de cultura. Lentivetores de RNAi de NgR (RNAi LV-NgR) foram u-sados para transduzir células NeuroScreen em moi (multiplicidade de infec-ção) de 1. A eficiência da transdução foi de cerca de 1% como indicado porexpressão de GFP ou marcação de beta-galactosidase.
Devido ao fato de RNAi-2 de NgR ter demonstrado ser eficaz nosilenciamento de NgR e atingir todos os NgR de humano, camundongo erato, RNAi-2 LV-NgR foi escolhido para transduzir as células NeuroScreen.
As células transduzidas foram clonadas por diluição limitada em placas de96 cavidades. Clones positivos para beta-galactosidase ou GFP foram identi-ficados e expandidos para análise de expressão de NgR adicional.
Cerca de 20 linhagens celulares clonadas foram analisadasquanto à expressão de NgR por Western blot usando o anticorpo monoclonal7E11. O resultado de um Western blot típico é mostrado na Figura 21. GAP-DH foi usado como controle para normalização da quantidade aplicada. Aexpressão de NgR em todos os clones foi quantificada por densitometria dasbandas de NgR no western blot e normalizados para os níveis de GAPDH. Arazão de NgR vs. GAPDH foi usada para medir os níveis de expressão deNgR. Dos 12 clones rastreados, 11 deles diminuíram a expressão de NgR(usando o clone que expressa menos NgR em células transduzidas com LV-GFP, 1E9, como referência). Ao contrário, todos os 4 clones que transduzi-ram LV-GFP têm níveis de NgR comparáveis às células NeuroScreen nai-ves. Figura 22. Os resultados demonstram que linhagens celulares estáveisforam estabelecidas com expressão de NgR reduzida.
EXEMPLO 27
ANÁLISE FUNCIONAL DE CÉLULAS COM RNAI DE LV-NGR
Quatro clones a partir das células transduzidas com RNAi de LV-NgR para análises de função foram selecionados. Usando os níveis de NgRde células NeuroScreen naives como referência, os níveis de NgR dessesquatro clones são de aproximadamente 10% para 3c12b, 20% para 3c4b,30% para 5d12 e 60% para 4a12 das células naives, respectivamente (Figu-ra 23).
EXEMPLO 28
MUTAÇÕES DE ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-NGR1. 1D9, PERMI-TEM O RECONHECIMENTO DE NGR1 HUMANO
Por modelagem computacional foi mostrado que mutações noanticorpo 1D9 permitem o reconhecimento de NgR1 humano. N56 da cadeiapesada de 1D9, através de modelagem computacional, pode ser mutadopara serina, ácido glutâmico, ácido aspártico ou glutamina para interagir comR78 de NgR1 humano. Além disso, R33 da cadeia leve pode ser mutadaatravés de modelagem computacional para alanina ou serina para evitar osimpactos eletrostáticos e estéricos com R95 de NgR1 humano.
EXEMPLO 29
ECTO-DOMÍNIO DO NGR1 DE RATO (27 A 310) FUNDIDO A UMA IGG DERATO MAS NÃO A METILPREDNISOLONA REVERTEU O EFEITO INIBI-DOR DO CRESCIMENTO DE NEURITO DA MIELINA EM CÉLULAS DOGÂNGLIO DA RAIZ DORSAL
Ao investigar o tratamento combinado com metilprednisolona(MP) e NgR(310)ecto-Fc para lesão da medula espinhal (SCI), foi buscadoverificar se esses reagentes têm mecanismos independentes de ação. Re-sumidamente, mielina foi seca durante a noite em placas pré-revestidas compoli-L-lisina (Becton Dickinson, Bedford, MA, USA) a 80 ou 400 ng/cavidade(2,5 e 12,7 ng/mm2, respectivamente). As cavidades foram então revestidascom 10 Mg/ml de Iaminina (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) por 1 hora atemperatura ambiente (22 a 24°C). Neurônios do gânglio da raiz dorsal deembriões de pintos com 13 dias foram dissociados e plaqueados por 6 a 8horas conforme descrito anteriormente (GrandPre etal., 2000; Fournier etal,2001). Os neurônios foram tratados com NgR(310)ecto-Fc 8 μΜ na presençaou ausência de MP (Pharmacia, Kalamazoo, Ml, USA) 10 pg/nl por todo operíodo de crescimento. Os neurônios foram então fixados e corados comanticorpo para βΙΙΙ tubulina (Covance, Princeton, NJ, USA) e o crescimentodos neuritos foi quantificado usando um sistema automatizado de aquisiçãode imagem celular e análise (Axon lnstrument, Union City, CA, USA). Ocrescimento dos neuritos por célula foi normalizado para a média de cavida-des de controle em duplicata para cada experimento (n=3). A atividade deNgR(310)ecto-Fc se baseia na sua capacidade de reverter a inibição docrescimento axonal pela mielina. Figuras 24 A-B. Em contraste, MP sozinhonão teve efeito sobre o crescimento de neuritos dos neurônios do gânglio daraiz dorsal sobre um substrato de mielina e a presença de MP não alterou oestímulo de crescimento dos axônios por NgR(310)ecto-Fc. Esses dadosindicam que MP não influenciou diretamente a inibição do crescimento deneurito induzida por mielina e que MP e NgR(310)ecto-Fc têm ações inde-pendentes. Esses dados in vitro suportam a hipótese de que MP e N-gR(310)ecto-Fc aumentarão a recuperação de SCI de uma forma seqüenci-almente eficaz.
EXEMPLO 30
TRATAMENTO COM ECTO-DOMÍNIO DO NGR DE RATO (27 A 310)FUNDIDO A UMA IGG DE RATO E METILPREDNISOLONA TIVERAM UMEFEITO TEMPORALMENTE DISTINTO SOBRE A RECUPERAÇÃO FUN-CIONAL APÓS TRANSECCÂO DA MEDULA ESPINHAL
Ambos os tratamentos com MP e NgR(310)ecto-Fc tiveram umefeito temporalmente distinto sobre a recuperação funcional após transecçãode medula espinhal. Resumidamente, ratos Long Evans fêmeas (7 semanasde idade; Charles River, Wilmington, MA, USA) foram anestesiados usandomidazolam 25 mg/kg i.p. (Abort Laboratories, Chicago, IL, USA) e 2-3% defluotano (Baxter, Deerfield, IL, USA) em O2 e uma Iaminectomia dorsal reali-zada no nível espinhal de T6 e T7. Anestesia geral foi mantida em 1,5-2% defluotano em O2. Uma hemiseção dorsal foi realizada interrompendo comple-tamente os componentes do trato corticoespinhal (CST) dorsomedial maior edorsolateral menor. Um microbisturi foi usado para cortar transversalmenteestereotaxicamente a medula em uma profundidade de 1,8 mm a partir dasuperfície da medula. Imediatamente após a transecção de CST, um cateterintratecal foi inserido no espaço subaracnóide em T7 e conectado a umaminibomba osmótica condicionada inserida no espaço subcutâneo. As mini-bombas osmóticas liberaram proteína de controle isotípico de IgG de rato ousolução salina tamponada com fosfato (PBS) (5 mg/ml, n=8) ou N-gR(310)ecto-Fc (50μΜ, n=19) em uma taxa de 0,25 pL/h. Uma coorte deratos tratados com NgR(310)ecto-Fc (n=8) foi tratada também com MP(Pharmacia; 30 mg/kg iv) e uma coorte separada tratada apenas com MP(30 mg/kg iv) imediatamente após a lesão e novamente 4 e 8 horas depois.A recuperação funcional foi avaliada usando o método de avaliação de cam-po aberto de BBB (Basso et al, J. Neurotrauma 72:1-21 (1995)) no dia se-guinte e semanalmente a partir disso. Os animais de controle recuperaram afunção dos membros posteriores ao longo do curso do estudo atingindo umscore de BBB médio de 12 ± 0,87 após 4 semanas. Escores de BBB médiospara os grupos tratados no mesmo ponto de tempo foram MP, 14,9 ± 0,23;NgR(310)ecto-Fc, 14,8 ± 0,24 e NgR(310)ecto-Fc mais MP, 15,63 ± 0,18.Todos os grupos de tratamento mostraram escores de BBB melhorados emcomparação com os controles ao longo do curso do estudo. P < 0/05 vs con-trole, ANOVA bidirecional para medidas repetidas com teste post-hoc de Tu-key. (Figura 25A). Um aumento estatisticamente significativo no score deBBB foi observado em ratos tratados com MP e MP mais NgR(310)ecto-Fcum dia após a cirurgia em comparação com animais de controle ou animaistratados apenas com NgR(310)ecto-Fc. O score de BBB foi significativamen-te melhorado em ratos tratados com MP 2 dias após SCI. P < 0/05 vs contro-le, ANOVA bi-direcional para medidas repetidas com teste post-hoc de Tu-key (Figura 25B). Essa observação indicou em efeito precoce do tratamentocom MP sobre a recuperação. Dado esse efeito muito precoce de MP, osescores de BBB foram normalizados para o dia 2 para subtrair esse efeitoprecoce de MP (Figura 25C) ilustrando assim o início mais tardio do efeito deNgR(310)ecto-Fc. Os escores de BBB normalizados para o dia 2 para ani-mais individuais ilustram uma melhora significativa na recuperação funcionalem ratos tratados com NgR(310)ecto-Fc ± MP 2, 3 e 4 semanas após SCI. P< 0/05 vs controle, ANOVA bi-direcional para medidas repetidas com testepost-hoc de Tukey (Figura 25C). No grupo de tratamento de combinação osescores de BBB normalizados anularam o efeito intensificador de MP sobreo tratamento com NgR(310)(ecto)-Fc ilustrando que (i) no grupo de trata-mento combinado o efeito de MP ocorreu precocemente após SCI e (ii) porsubtrair esse efeito a taxa e extensão de recuperação funcional no grupo detratamento combinado e no grupo de NgR(310)ecto-Fc foram idênticos emais pronunciados do que o tratamento com MP sozinho.
Um ponto de discriminação no score de BBB é um score de 14,correspondendo a passos plantares com suporte de peso consistente e co-ordenação consistente de membros anteriores e posteriores. Freqüência depassada plantar consistente e coordenação de membros anteriores e poste-riores, ilustrando a proporção de ratos em cada grupo que atingiram um sco-re de 14 ou mais 3 e 4 semanas após SCI. Conseqüentemente, os resulta-dos foram expressos como a freqüência com a qual os ratos atingiram umscore de 14 ou mais; 50% de ratos de controle atingiram um score de 14 oumais por 4 semanas após a lesão (Figura 25D). O tratamento combinadocom NgR(310)ecto-Fc e MP melhorou significativamente a taxa de recupera-ção funcional. P < 0/05 vs controle, teste exato de Fischer. Todos os ratos(100%) tratados com NgR(310)ecto-Fc ou MP ou terapia combinada de-monstraram passada plantar consistente e movimento coordenado por 4semanas. A terapia de combinação aumentou a taxa de recuperação de fun-ção coordenada já que uma proporção significativamente maior desse grupode tratamento atingiu um score de 14 ou mais por 3 semanas em compara-ção com controles ou NgR(310)ecto-Fc ou tratamento apenas com MP (Fi-gura 25D). Recuperação funcionai melhorada também foi demonstrada co-mo comprimento de passada significativamente melhorado nos grupos trata-dos com NgR(310)ecto-Fc e NgR(310)ecto-Fc mais MP em comparaçãocom os controles (Figura 25E). O tratamento com MP não melhorou signifi-cativamente o comprimento da passada medido 4 semanas após SCI. P <0/05, ANOVA unidirecional com teste post-hoc de Dunnett.
EXEMPLO 31
TRATAMENTO COM ECTO-DOMÍNIO DO NGR1 DE RATO (27 A 310)FUNDIDO A UMA IGG DE RATO E METILPREDNISOLONA AUMENTOU APLASTICIDADE/REGENERAÇÃO AXONAL APÓS TRANSECCÃO DE ME-DULA ESPINHAL
O tratamento com NgR(310)ecto-Fc ou tratamento combinadocom MP e NgR(310)ecto-Fc aumentou a plasticidade/regeneração axonalapós transecção de medula espinhal. Resumidamente, para traçamento his-tológico dos CSTs, 2 semanas após a transecção de CST os animais foramre-anestesiados e foi feita uma incisão no escalpo. A área em volta da inci-são na pele foi injetada com um anestésico local, o córtex senso-motor es-querdo foi exposto através de craniotomia e 7 μί de biotina dextran amina(BDA; 10,000 MW; Molcular Probes, Eugene, OR1 USA) 10% em PBS inje-tados usando um injetor de nanolitros e um micro controlador em 12 pontos0 a 3,5 mm posterior ao Bregma e 0 a 2,5 mm lateral à linha mediai em umaprofundidade de 1 mm abaixo da superfície do córtex. Em alguns casos, oCST foi marcado bilateralmente usando o mesmo procedimento.
28 dias após a transecção de CST, os ratos foram anestesiadoscom inactina (100-110 mg/kg i.p.) e perfundidos transcardialmente com solu-ção salina heparinizada (100 ml, 10 iu de heparina) seguido por paraformal-deído 4% (150 ml). As medulas espinhais foram removidas, pós-fixadas emparaformaldeído 4% e então impregnadas com sacarose 30% por 48 horas;comprimentos de 25 mm de medula espinhal, 10 mm rostral e 15 mm caudaldo local de transecção, foram incluídos em composto de temperatura de cor-te ótima (OCT) com segmentos transversais de medula tomados 10 a 15 mmrostral e 15 a 20 mm caudal à lesão.
Cortes congelados (50 Mm) foram cortados seriadamente e co-rados com AlexaFluor-594 (1:200; Molecular Probes) conjugada com estrep-tavidina para visualizar os axônios de CST. As contagens dos axônios foramrealizadas em cortes transversais tirados 10 e 15 mm caudal ao local detransecção. Todas as medidas foram realizadas de forma cega. Cada oitavocorte, isto é, cortes 400 μηι distantes, foi contado para cada animal em cadanível da medula e os valores foram expressos como o número médio de a-xônios por corte.
Tratamento com NgR(310)ecto-Fc ou tratamento combinadocom MP e NgR(310)ecto-Fc resultou em números significativamente maioresde axônios marcados com biotina dextran amina (BDA) contados 15 mmcaudal ao local da lesão (Figura 26A). Axônios marcados com BDA parece-ram brotar a partir das colunas dorsais para dentro da substância cinzentado corno dorsal e CDT ventral poupado, projetando-se para dentro da subs-tância cinzenta ventral. As contagens de axônios em regiões distintas damedula revelaram o maior aumento no número de axônios na substânciacinzenta. O maior aumento nos números de axônios foi observado na maté-ria substância (GM) em comparação com a substância branca ventral (vWM)e substância branca dorsal (dWM) (Figura 26B). P < 0/05, ANOVA unidire-cional com teste post-hoc de Dunnett. Esses dados sugerem que o trata-mento com NgR(310)ecto-Fc com ou sem MP promove plasticidade na me-dula espinhal após lesão.
EXEMPLO 32
TRATAMENTO COMBINADO COM ECTO-DOMÍNIO DO NGR1 DE RATO(27 A 310) FUNDIDO A UMA IGG DE RATO E METILPREDNISOLONAAUMENTOU O NÚMERO DE CONEXÕES AXONAIS ENTRE FIBRAS DOTRATO CORTICOESPINHAL MARCADAS COM BIOTINA DEXTRAN AMI-NA E NEURÔNIOS MOTORES LOMBARES
Anticorpo antitransportador de glutamato vesicular 1 (vGLUTI)(diluição 1:2500) foi usado para marcar corpos celulares neuronais e neurô-nios a- e γ-motores em lâmina 9 e foram identificados por seu tamanho emorfologia. O número de axônios em contato com neurônios a- ou γ-motoresfoi significativamente aumentado no grupo tratado com MP + NgR(310)ecto-Fc em comparação com animais de controle, com o efeito mais acentuado esignificante observado em animais recebendo tratamento combinado comNgR(310)ecto-Fc e MP (Figura 27). P < 0/05, ANOVA unidirecional com tes-te post-hoc de Dunnett.
Depósitos biológicos
Hibridomas HB 7E11 (No. de Acesso ATCC® PTA-4587), HB1H2 (No. de Acesso ATCC® PTA-4584), HB 3G5 (No. de Acesso ATCC®PTA-4586), HB 5B10 (No. de Acesso ATCC® PTA- 4588) e HB 2F7 (No. deAcesso ATCC® PTA-4585) foram depositados na American Type CultureCollection ("ATCC®"), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA, em 9 de agosto de 2002.
Como aqueles versados na técnica perceberão, várias altera-ções e modificações podem ser feitas às modalidades preferidas da inven-ção sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Pretende-se que todasas variações estejam dentro do escopo da invenção.

Claims (127)

1. Fragmento de polipeptídeo isolado de 60 resíduos ou menos,que compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüênciade aminoácido de referência, exceto por até três substituições de aminoáci-do individuais, em que a dita seqüência de aminoácido de referência é sele-cionada a partir do grupo que consiste em:(a) aminoácidos χ até 344 de SEQ ID NO: 49, e(b) aminoácidos 309 até y de SEQ ID NO: 49,em que χ é qualquer número inteiro de 305 até 326, e y é qual-quer número inteiro de 328 até 350; eem que o dito fragmento de polipeptídeo inibe a inibição de cres-cimento de neurito mediado pelo receptor nogo.
2. Fragmento de polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1,em que χ é um número inteiro de 300 até 326, e y é qualquer número inteirode 328 até 360.
3. Fragmento de polipeptídeo de acordo com a reivindicação 2,em que a dita seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partirdo grupo que consiste em:(i) aminoácidos 309 até 335 de SEQ ID NO: 49;(ii) aminoácidos 309 até 344 de SEQ ID NO: 49;(iii) aminoácidos 310 até 335 de SEQ ID NO: 49;(iv) aminoácidos 310 até 344 de SEQ ID NO: 49;(v) aminoácidos 309 até 350 de SEQ ID NO: 49;(vi) aminoácidos 300 até 344 de SEQ ID NO: 49; e(vii) aminoácidos 315 até 344 de SEQ ID NO: 49.
4. Fragmento de polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3,em que a dita seqüência de aminoácido de referência são os aminoácidos- 309 até 335 de SEQ ID NO: 49.
5. Fragmento de polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3,em que o dito aminoácido de referência são os aminoácidos 309 até 344 deSEQ ID NO: 49.
6. Fragmento de polipeptídeo isolado de 60 resíduos ou menos,que compreende os aminoácidos χ até y de SEQ ID NO: 49,em que χ é qualquer número inteiro de 300-310, e y é qualquernúmero inteiro de 340-360; eem que o dito fragmento de polipeptídeo inibe a inibição de cres-cimento de neurito mediada pelo receptor nogo.
7. Polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindica-ções 1-6, em que o dito polipeptídeo é cíclico.
8. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 7, em que o ditopolipeptídeo cíclico ainda compreende uma primeira molécula ligada à ter-minação-N e uma segunda molécula ligada à terminação-C; em que a ditaprimeira molécula e a dita segunda molécula são unidas uma a outra paraformar a dita molécula cíclica.
9. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 8, em que as di-tas primeira e segunda moléculas são selecionadas a partir do grupo queconsiste em: uma molécula de biotina, um resíduo de cisteína, e um resíduode cisteína acetilado.
10. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 9, em que a ditaprimeira molécula é uma molécula de biotina ligada à terminação-N e a ditasegunda molécula é um resíduo de cisteína ligado à terminação-C do ditopolipeptídeo.
11. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 9, em que ditaprimeira molécula é um resíduo de cisteína acetilado ligado à terminação-Ne a dita segunda molécula é um resíduo de cisteína ligado à terminação-Cdo dito polipeptídeo.
12. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 10 ou reivindica-ção 11, em que a dita cisteína C-terminal tem uma porção NH2 ligada.
13. Polipeptídeo isolado que compreende um primeiro fragmentode polipeptídeo e um segundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito pri-meiro fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácidoidêntica a uma seqüência de aminoácido de referência, exceto por até vintesubstituições de aminoácido individuais, em que a dita primeira seqüência deaminoácido de referência é selecionada a partir do grupo que consiste em:(a) aminoácidos a até 445 de SEQ ID NO: 49,(b) aminoácidos 27 até b de SEQ ID NO: 49, e(c) aminoácidos a até b de SEQ ID NO: 49,em que a é qualquer número inteiro de 25 até 35, e b é qualquernúmero inteiro de 300 até 450; eem que o dito segundo fragmento de polipeptídeo compreendeuma seqüência de aminoácido idêntica a uma segunda seqüência de amino-ácido de referência, exceto por até vinte substituições de aminoácidos indivi-duais, em que a dita segunda seqüência de aminoácido de referência é se-lecionada a partir do grupo que consiste em(a) aminoácidos c até 445 de SEQ ID NO: 49,(b) aminoácidos 27 até d de SEQ TD NO: 49, e(c) aminoácidos c até d de SEQ ID NO: 49,em que c é qualquer número inteiro de 25 até 35, e d é qualquernúmero inteiro de 300 até 450; e; em que o dito polipeptídeo inibe a inibiçãode crescimento de neurito mediada pelo receptor nogo.
14. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 13, em que adita primeira seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partirdo grupo que consiste em(a) aminoácidos 27 até 310 de SEQ ID NO: 49 e(b) aminoácidos 27 até 344 de SEQ ID NO: 49.
15. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 13, em que adita segunda seqüência de referência é selecionada a partir do grupo queconsiste em(a) aminoácidos 27 até 310 de SEQ ID NO: 49 e(b) aminoácidos 27 até 344 de SEQ ID NO: 49.
16. O polipeptídeo da reivindicação 13, em que o dito primeirofragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 27 até 310 de SEQID NO: 49 e em que o dito segundo fragmento de polipeptídeo compreendeos aminoácidos 27 até 310 de SEQ ID NO: 49.
17. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 13, em que odito primeiro fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 27 até- 344 de SEQ ID NO: 49 e em que o dito segundo fragmento de polipeptídeocompreende os aminoácidos 27 até 310 de SEQ ID NO: 49.
18. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 13, em que odito primeiro fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 27 até- 344 de SEQ ID NO: 49 e em que o dito segundo fragmento de polipeptídeocompreende os aminoácidos 27 até 344 de SEQ ID NO: 49.
19. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 13, em que odito primeiro fragmento de polipeptídeo está situado à montante do dito se-gundo fragmento de polipeptídeo.
20. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 13, compreen-dendo ainda a Iigante de peptídeo situado entre o dito primeiro fragmento depolipeptídeo e o dito segundo fragmento de polipeptídeo.
21. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 20, em que odito ligante de peptídeo compreende SEQ ID NO: 65 (G4S)3.
22. Polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindica-ções 1-21, em que pelo menos um resíduo de cisteína da dita seqüência deaminoácido de referência, da dita primeira seqüência de aminoácido de refe-rência ou a dita segunda seqüência de aminoácido de referência é substituí-do por um aminoácido diferente.
23. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 22, em que odito pelo menos um resíduo de cisteína é C266.
24. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 22, em que odito pelo menos um resíduo de cisteína é C309.
25. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 22, em que odito pelo menos um resíduo de cisteína é C335.
26. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 22, em que odito pelo menos um resíduo de cisteína está em C336.
27. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 22, em que odito aminoácido diferente é selecionado a partir do grupo que consiste em:alanina, serina e treonina.
28. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 27, em que odito aminoácido diferente é alanina.
29. Polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindica-ções 1-28, fundido a um polipeptídeo heterólogo.
30. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 29, em que odito polipeptídeo heterólogo é albumina sérica.
31. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 29, em que odito polipeptídeo heterólogo é uma região Fc.
32. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 29, em que odito polipeptídeo heterólogo é um peptídeo de sinal.
33. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 29, em que odito polipeptídeo heterólogo é um sinalizador (tag) de polipeptídeo.
34. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 31, em que adita Fc região é selecionada a partir do grupo que consiste em: uma regiãoFc de IgA; uma região Fc de IgD região; uma região Fc de IgG, uma regiãoFc de IgE; e uma região Fc de IgM.
35. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 33, em que odito polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em: sinaliza-dor FLAG; sinalizador Strep; sinalizador de polihistidina; sinalizador VSV-G;sinalizador de hemaglutinina (HA) de vírus influenza; e sinalizador de c-Myc.
36. Polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindica-ções 1-35, em que o dito polipeptídeo é ligado a uma ou mais porções depolialquileno glicol.
37. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 36, em que adita uma ou mais porções de polialquileno glicol é uma porção de polietilenoglicol (PEG)
38. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 37, em que odito polipeptídeo é ligado a 1 a 5 porções de PEG.
39. Polipeptídeo isolado que compreende:(a) uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência deaminoácido de referência exceto que pelo menos um resíduo de cisteína dadita seqüência de aminoácido de referência é substituído com um aminoáci-do diferente, em que a dita seqüência de aminoácido de referência é sele-cionada a partir do grupo que consiste em:(i) aminoácidos a até 445 de SEQ ID NO: 49,(ii) aminoácidos 27 até b de SEQ ID NO: 49, e(iii) aminoácidos a até b de SEQ ID NO: 49,em que a é qualquer número inteiro de 25 até 35, e b é qualquernúmero inteiro de 300 até 450; e (b) um polipeptídeo heterólogo.em que o dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento deneurito mediada pelo receptor nogo.
40. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 38, em queC266 da dita seqüência de aminoácido de referência é substituído com umaminoácido diferente.
41. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 39, em queC309 da dita seqüência de aminoácido de referência é substituído com umaminoácido diferente.
42. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 39, em queC335 da dita seqüência de aminoácido de referência é substituído com umaminoácido diferente.
43. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 39, em queC266 e C309 da dita seqüência de aminoácido de referência são substituí-dos com aminoácidos diferentes.
44. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 39, em queC309 e C335 da dita seqüência de aminoácido de referência são substituí-dos com aminoácidos diferentes.
45. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 39-44, em que o dito aminoácido diferente é alanina.
46. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 39, em que odito polipeptídeo heterólogo é selecionado a partir do grupo que consiste em:(a) albumina sérica,(b) uma região Fc,(c) um peptídeo de sinal,(d) um sinalizador de polipeptídeo, e(e) uma combinação de dois ou mais dos ditos polipeptídeos he-terólogos.
47. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 46, em que adita região Fc é selecionada a partir do grupo que consiste em: uma regiãoFc de IgA; uma região Fc de IgD; uma região Fc de IgG, uma região Fc deIgE; e uma região Fc de IgM.
48. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 47, em que adita região Fc é uma região Fc de IgG.
49. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 46, em que odito sinalizador de polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consisteem: sinalizador FLAG; sinalizador Strep; sinalizador de polihistidina; sinali-zador VSV-G; sinalizador de hemaglutinina (HA) de vírus influenza; e sinali-zador de c-Myc.
50. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 39-49, em que o dito polipeptídeo é ligado a uma ou mais porções depolialquileno glicol.
51. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 50, em que adita uma ou mais porções de polialquileno glicol é uma porção de polietilenoglicol (PEG).
52. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 51, em que odito polipeptídeo é ligado a 1 a 5 porções de PEG.
53. Polipeptídeo isolado que compreende:(a) uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência deaminoácido de referência, exceto por até vinte substituições de aminoácidoindividuais, em que a dita seqüência de aminoácido de referência é selecio-nada a partir do grupo que consiste em:(i) aminoácidos a até 445 de SEQ ID NO: 49,(ii) aminoácidos 27 até b de SEQ ID NO: 49, e(iii) aminoácidos a até b de SEQ JD NO: 49,em que a é qualquer número inteiro de 25 até 35, e b é qualquernúmero inteiro de 300 até 450; e (b) um polipeptídeo heterólogo;em que o dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento deneurito mediada pelo receptor nogo.
54. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 53, em que odito polipeptídeo heterólogo é selecionado a partir do grupo que consiste em:(a) albumina sérica,(b) uma região Fc1(c) um peptídeo de sinal,(d) um sinalizador de polipeptídeo, e(e) uma combinação de dois ou mais dos ditos polipeptídeos he-terólogos.
55. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 54, em que adita região Fc é selecionada a partir do grupo que consiste em: uma regiãoFc de IGA; uma região Fc de IgD; uma região Fc de IgG, uma região Fe deIgE; e uma região Fc de IgM.
56. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 55, em que adita região Fc é uma região Fc de IgG.
57. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 56, compreen-dendo ainda um Iigante de peptídeo situado entre a dita seqüência de ami-noácido e a dita região Fc de IgG.
58. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 57, em que odito Iigante de peptídeo compreende SEQ ID NO: 66 (G4S)2.
59. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 54, em que odito sinalizador de polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consisteem: sinalizador FLAG; sinalizador Strep; sinalizador de polihistidina; sinali-zador VSV-G; sinalizador de hemaglutinina (HA) de vírus influenza; e sinali-zador de c-Myc.
60. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 53-59, em que o dito polipeptídeo é ligado a uma ou mais porções depolialquileno glicol.
61. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 60, em que adita uma ou mais porções de polialquileno glicol é uma porção de polietilenoglicol (PEG).
62. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 61, em que odito polipeptídeo é ligado a 1 a 5 porções de PEG.
63. Polipeptídeo isolado que compreende um primeiro fragmentode polipeptídeo e um segundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito pri-meiro fragmento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácidoidêntica a uma primeira seqüencia de aminoácido de referência, exceto poraté vinte substituições de aminoácido individuais, em que a dita primeira se-qüência de aminoácido de referência é selecionada a partir do grupo queconsiste em:(a) aminoácidos a até 305 de SEQ ID NO: 49,(b) aminoácidos 1 até b de SEQ ID NO: 49, e(c) aminoácidos a até b de SEQ ID NO: 49,em que a é qualquer número inteiro de 1 até 27, e b é qualquernúmero inteiro de 264 até 309; e em que o dito segundo fragmento de poli-peptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma segun-da seqüência de aminoácido de referência, exceto por até vinte substituiçõesde aminoácido individuais, em que a dita segunda seqüência de aminoácidode referência é selecionada a partir do grupo que consiste em:(a) aminoácidos c até 332 de SEQ ID NO: 60,(b) aminoácidos 275 até d de SEQ ID NO: 60, e(c) aminoácidos c até d de SEQ ID NO: 60,em que c é qualquer número inteiro de 265 até 306, e d é qual-quer número inteiro de 308 até 340; eem que o dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento deneurito mediada pelo receptor nogo.
64. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 63, em que adita primeira seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partirdo grupo que consiste em:(a) aminoácidos 1 -274 de SEQ ID NO: 49; e(b) aminoácidos 1 -305 de SEQ ID NO: 49.
65. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 63, em que adita segunda seqüência de aminoácido de referência é selecionada a partirdo grupo que consiste em:(a) aminoácidos 275-311 de SEQ ID NO: 60;(b) aminoácidos 275-332 de SEQ ID NO: 60;(c) aminoácidos 306-311 de SEQ ID NO: 60;(d) aminoácidos 306-308 de SEQ ID NO: 60; e(e) aminoácidos 306-309 de SEQ ID NO: 60.
66. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 63, em que odito primeiro fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 1-274de SEQ ID NO: 49 e em que o dito segundo fragmento de polipeptídeo com-preende os aminoácidos 275-311 de SEQ ID NO: 60.
67. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 63, em que odito primeiro fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 1-274de SEQ ID NO: 49 e em que o dito segundo fragmento de polipeptídeo com-preende os aminoácidos 275-332 de SEQ ID NO: 60.
68. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 63, em que odito primeiro fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 1-305de SEQ ID NO: 49 e em que o dito segundo fragmento de polipeptídeo com-preende os aminoácidos 306-311 de SEQ ID NO: 60.
69. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 63, em que odito primeiro fragmento de polipeptídeo compreende os aminoácidos 1-305de SEQ ID NO: 49 e em que o dito segundo fragmento de polipeptídeo com-preende os aminoácidos 306-309 de SEQ ID NO: 60.
70. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 69, em que pelomenos um aminoácido adicional é adicionado à terminação-C do dito segun-do fragmento de polipeptídeo.
71. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 70, em que odito pelo menos um aminoácido adicional é triptofano.
72. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 71, em queA269 do dito primeiro fragmento de polipeptídeo é substituído com um ami-noácido diferente.
73. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 72, em que odito aminoácido diferente é triptofano.
74. Polipeptídeo isolado que compreende um primeiro fragmentode polipeptídeo e um segundo fragmento de polipeptídeo, em que o dito pri-meiro fragmento de polipeptídeo consiste nos aminoácidos 1-310 de SEQ IDNO: 49, exceto por até vinte substituições de aminoácido individuais; e emque o dito segundo fragmento de polipeptídeo consiste nos aminoácidos 311até 318 de SEQ ID NO: 60, exceto por até cinco substituições de aminoácidoindividuais; e em que o dito polipeptídeo inibe a inibição de crescimento deneurito mediada pelo receptor nogo.
75. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 63-74, fundido a um polipeptídeo heterólogo.
76. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 75, em que odito polipeptídeo heterólogo is albumina sérica.
77. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 75, em que odito polipeptídeo heterólogo is uma região Fc.
78. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 75, em que odito polipeptídeo heterólogo é um peptídeo de sinal.
79. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 75, em que odito polipeptídeo heterólogo é um sinalizador de polipeptídeo.
80. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 77, em que adita região Fc é selecionada a partir do grupo que consiste em: uma regiãoFc de IgA; uma região Fc de IgD; uma região Fc de IgG, uma região Fc deIgE; e uma região Fc de IgM.
81. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 79, em que odito sinalizador de polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consisteem: sinalizador FLAG; sinalizador Strep; sinalizador de polihistidina; sinali-zador VSV-G; sinalizador de hemaglutinina (HA) de vírus influenza; e sinali-zador de c-Myc.
82. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 63-81, em que o dito polipeptídeo é ligado a uma ou mais porções depolialquileno glicol.
83. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 82, em que adita uma ou mais porções de polialquileno glicol é uma porção de polietilenoglicol (PEG).
84. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 83, em que odito polipeptídeo é ligado a 1 a 5 porções de PEG.
85. Polinucleotídeo isolado que compreende uma seqüência denucleotídeo que codifica um polipeptídeo como definido em qualquer umadas reivindicações 1 -84.
86. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 85, em que adita seqüência de nucleotídeo é operativamente ligada a um elemento decontrole de expressão.
87. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 86, em que odito elemento de controle de expressão é selecionado a partir do grupo queconsiste em: um promotor induzível; um promotor constitutivo; e um sinal desecreção.
88. Polinucleotídeo isolado selecionado a partir do grupo queconsiste em:(i) um polinucleotídeo anti-sentido;(ii) uma ribozima;(iii) um pequeno RNA de interferência (siRNA); e(iv) um pequeno RNA em forma de grampo (shRNA).
89. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 88, em que odito polinucleotídeo é um polinucleotídeo anti-sentido que compreende pelomenos 10 bases complementares à porção codificante do mRNA de NgR1.
90. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 88, em que odito polinucleotídeo é uma ribozima.
91. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 88, em que odito polinucleotídeo é um siRNA.
92. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 88, em que odito polinucleotídeo é um shRNA.
93. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 91 ou 92, emque o dito siRNA ou shRNA inibe a expressão de NgR1.
94. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 93, em que odito siRNA ou shRNA é pelo menos 90% idêntico a seqüência de nucleotí-deo que compreende: CUACUUCUCCCGCAGGCG (SEQ ID NO: 52).
95. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 93, em que odito siRNA ou shRNA compreende a seqüência de nucleotídeo: CUACUU-CUCCCGCAGGCG (SEQ ID NO: 52).
96. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 93, em que odito siRNA ou shRNA compreende uma seqüência de nucleotídeo comple-mentar ao mRNA produzido por um polinucleotídeo que compreende a se-qüência: GATGAAGAGGGCGTCCGCT (SEQ ID NO: 53).
97. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 93, em que odito siRNA ou shRNA é pelo menos 90% idêntico à seqüência de nucleotí-deo que compreende: CCCGGACCGACGUCUUCAA (SEQ ID NO: 54).
98. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 93, em que odito siRNA ou shRNA compreende a seqüência de nucleotídeo: CCCG-GACCGACGUCUUCAA (SEQ ID NO: 54).
99. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 93, em que odito siRNA ou shRNA compreende uma seqüência de nucleotídeo comple-mentar ao mRNA produzido por um polinucleotídeo que compreende a se-qüência: GGGCCTGGCTGCAGAAGTT (SEQ ID NO: 55).
100. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 93, em que odito siRNA ou shRNA é peio menos 90% idêntico à seqüência de nucleotí-deo que compreende: CUGACCACUGAGUCUUCCG (SEQ ID NO: 56).
101. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 93, em que odito siRNA ou shRNA compreende a seqüência de nucleotídeo: CUGACCA-CUGAGUCUUCCG (SEQ ID NO: 56).
102. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 93, em que odito siRNA ou shRNA compreende uma seqüência de nucleotídeo comple-mentar ao mRNA produzido por um polinucleotídeo que compreende a se-qüência: GACTGGTGACTCAGAGAAGGC (SEQ ID NO: 57).
103. Vetor que compreende o polinucleotídeo como definido emqualquer uma das reivindicações 85-102.
104. Célula hospedeira que compreende o vetor de acordo coma reivindicação 103.
105. Composição que compreende o polipeptídeo como definidoem qualquer uma das reivindicações 1-84 e um veículo farmaceuticamenteaceitável.
106. Composição que compreende o polinucleotídeo como defi-nido em qualquer uma das reivindicações 85-102 e um veículo farmaceuti-camente aceitável.
107. Composição que compreende o vetor como definido na rei-vindicação 103 ou a célula hospedeira como definido na reivindicação 104 eum veículo farmaceuticamente aceitável.
108. Composição que compreende os aminoácidos 27-310 deSEQ ID NO: 7 e um agente antiinflamatório.
109. Composição de acordo com a reivindicação 108, em que odito agente antiinflamatório é selecionado a partir do grupo que consiste emum agente antiinflamatório esteroidal e um agente antiinflamatório não este-roidal.
110. Composição de acordo com a reivindicação 109, em que odito agente antiinflamatório esteroidal é selecionado a partir do grupo queconsiste em hidrocortisona, 21-acetoxipregnenolona, alclomerasona, alges-tona, amcinonida, beclometasona, betametasona, valerato de betametasona,budesonida, cloroprednisona, clobetasol, propionato de clobetasol, clobeta-sona, butirato de clobetasona, clocortolona, cloprednol, corticosterona, corti-sona, cortivazol, deflazacon, desonida, desoximerasona, dexametasona,diflorasona, diflucortolona, difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida,flumetasona, pivalato de flumetasona, flunisolida, acetonida de flucinolona,fluocinonida, acetonida de fluorocinolona, butil fluocortin, fluocortolona, he-xanoato de fluorocortolona, valerato de diflucortolona, fluorometolona, aceta-to de fluperolona, acetato de fluprednidano, fluprednisolona, flurandenolida,formocortal, halcinonida, halometasona, acetato de halopredona, hidrocor-tamato, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona,fosfato de hidrocortisona, 21-succinato de sódio de hidrocortisona, tebutatode hidrocortisona, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilprednisolo-na, furoato de mometasona, parametasona, prednicarbato, prednisolona, 21-diedriaminoacetato de prednisolona, fosfato de sódio de prednisolona, succi-nato de sódio de prednisolona, 21-m-sulfobenzoato de sódio de prednisolo-na, 21-estearoglicolato de sódio de prednisolona, tebutato de prednisolona,- 21-trimetilacetato de prednisolona, prednisona, prednival, prednilidano, 21-dietilaminoacetato de prednilidano, tixocortol, triancinolona, acetonida detriancinolona, benetonida de triamcinolona e hexacetonida de triancinolona.
111. Composição de acordo com a reivindicação 110, em que odito agente antiinflamatório esteroidal é metilprednisolona.
112. Composição de acordo com a reivindicação 109, em que odito agente antiinflamatório não esteroidal é selecionado a partir do grupoque consiste em alminoprofeno, benoxaprofeno, ácido buclóxico, carprofeno,fenbufeno, fenoprofeno, fluprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indoprofeno,cetoprofeno, miroprofeno, naproxeno, oxaprozin, pirprofeno, pranoprofeno,suprofeno, ácido tiaprofênico, tioxaprofeno, indometacina, acemetacina, al-clofenaco, clidanaco, diclofenaco, fenclofenaco, ácido fenclózico, fentiazaco,furofenaco, ibufenaco, isoxepaco, oxpinaco, sulindaco, tiopinaco, tolmetina,zidometacina, zomepiraco, ácido flufenâmico, ácido meclofenâmico, ácidomefenâmico, ácido niflúmico, ácido tolfênamico, diflunisal, flufenisal, isoxi-cam, piroxicam, sudoxicam, tenoxicam, ácido acetil salicílico, sulfasalazina,apazona, bezpiperilon, feprazona, mofebutazona, oxifenbutazona e íeniibu-tazona.
113. Composição que compreende os aminoácidos 27-310 deSEQ ID NO: 9 e um agente antiinflamatório.
114. Composição de acordo com a reivindicação 113, em que odito agente antiinflamatório é selecionado a partir do grupo que consiste emum agente antiinflamatório esteroidal e um agente antiinflamatório não este-roidal.
115. Composição de acordo com a reivindicação 114, em que odito agente antiinflamatório esteroidal é selecionado a partir do grupo queconsiste em hidrocortisona, 21-acetoxipregnenolona, alclomerasona, alges-tona, amcinonida, beclometasona, betametasona, valerato de betametasona,budesonida, cloroprednisona, clobetasol, propionato de clobetasol, clobeta-sona, butirato de clobetasona, clocortolona, cloprednol, corticosterona, corti-sona, cortivazol, deflazacon, desonida, desoximerasona, dexametasona,diflorasona, diflucortolona, difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida,flumetasona, pivalato de flumetasona, flunisolida, acetonida de flucinolona,fluocinonida, acetonida de fluorocinolona, butil fluocortin, fluocortolona, he-xanoato de fluorocortolona, valerato de diflucortolona, fluorometolona, aceta-to de fluperolona, acetato de fluprednidano, fluprednisolona, flurandenolida,formocortal, halcinonida, halometasona, acetato de halopredona, hidrocor-tamato, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona,fosfato de hidrocortisona, 21-succinato de sódio de hidrocortisona, tebutatode hidrocortisona, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilprednisolo-na, furoato de mometasona, parametasona, prednicarbato, prednisolona, 21-diedriaminoacetato de prednisolona, fosfato de sódio de prednisolona, succi-nato de sódio de prednisolona, 21-m-sulfobenzoato de sódio de prednisolo-na, 21-estearoglicolato de sódio de prednisolona, tebutato de prednisolona,- 21-trimetilacetato de prednisolona, prednisona, prednival, prednilidano, 21-dietilaminoacetato de prednilidano, tixocortol, triancinolona, acetonida detriancinolona, benetonida de triamcinolona e hexacetonida de triancinolona.
116. Composição de acordo com a reivindicação 115, em que odito agente antiinfiamatório esteroidai é metiiprednisoiona.
117. Composição da reivindicação 114, em que o dito agenteantiinfiamatório esteroidai é selecionada a partir do grupo que consiste emalminoprofeno, benoxaprofeno, ácido buclóxico, carprofeno, fenbufeno, fe-noprofeno, fluprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indoprofeno, cetoprofeno,miroprofeno, naproxeno, oxaprozina, pirprofeno, pranoprofeno, suprofeno,ácido tiaprofenóico, tioxaprofeno, indometacina, acemetacina, alclofenaco,clidanaco, diclofenaco, fenclofenaco, ácido fenclózico, fentiazaco, furofena-co, ibufenaco, isoxepaco, oxpinaco, sulindaco, tiopinaco, tolmetina, zidome-tacina, zomepiraco, ácido flufenâmico, ácido meclofenâmico, ácido mefenâ-mico, ácido niflúmico, ácido tolfenâmico, diflunisal, flufenisal, isoxicam, piro-xicam, sudoxicam, tenoxicam, ácido acetil salicílico, sulfasalazina, apazona,bezpiperilon, feprazona, mofebutazona, oxifenbutazona e fenilbutazona.
118. Composição de qualquer uma das reivindicações 108-117,em que os ditos aminoácidos 27-310 de SEQ ID NO: 7 ou 9 são fundidos aum polipeptídeo heterólogo.
119. Composição de acordo com a reivindicação 118, em que odito polipeptídeo heterólogo é Fc.
120. Método de promover crescimento de neurito que compre-ende colocar um neurônio em contato com um agente selecionado a partirdo grupo que consiste em:(a) o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindi-cações 1 -84;(b) o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivin-dicações 85-102; e(c) a composição como definida em qualquer uma das reivindi-cações 108-119.em que o dito agente inibe a inibição de crescimento de neurito.
121. Método de acordo com a reivindicação 120, em que o ditoneurônio está em um mamífero.
122. Método de acordo com a da reivindicação 121, em que odito mamífero é um ser humano.
123. Método de inibir a transdução de sinai pelo complexo desinalização de NgR1, que compreende colocar um neurônio em contato comuma quantidade eficaz de um agente selecionado a partir do grupo que con-siste em:(a) o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindi-cações 1 -84;(b) o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivin-dicações 85-102; e(c) a composição como definido em qualquer uma das reivindi-cações 108-119.
124. Método de acordo com a reivindicação 123, em que o ditoneurônio está em um mamífero.
125. Método de acordo com a reivindicação 124, em que o ditomamífero é um humano.
126. Método de tratar uma doença, distúrbio ou lesão do sistemanervoso central (CNS) em um mamífero, que compreende administrar a ummamífero que necessita de tratamento uma quantidade eficaz de um agenteselecionado a partir do grupo que consiste em:(a) o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindi-cações 1-84;(b) o polinucleotídeo como defindio em qualquer uma das reivin-dicações 85-102; e(c) a composição como definido em qualquer uma das reivindi-cações 108-119.
127. Método de acordo com a reivindicação 126, em que a ditadoença, distúrbio ou lesão é selecionada a partir do grupo que consiste emesclerose múltipla, ALS, doença de Huntington, doença de Alzheimer, doen-ça de Parkinson, neuropatia diabética, acidente vascular cerebral, lesõescerebrais traumáticas, lesão da medula espinhal, neurite óptica, glaucoma,perda de audição, e Ieucodistrofia adrenal.
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