KR20210124180A - NF-κB 억제제의 엑소솜 기반 전달의 사용 - Google Patents

NF-κB 억제제의 엑소솜 기반 전달의 사용 Download PDF

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Abstract

본 개시 내용은, NF-κB 억제제를 함유하는 엑소솜을 사용하여 급성 신장 손상을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시 내용은, NF-κB 억제제를 함유하는 엑소솜을 사용하여 패혈증에 의해 유발된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

NF-κB 억제제의 엑소솜 기반 전달의 사용
본 개시 내용은, NF-κB의 억제제를 함유하는 엑소솜(exosome)을 사용하여 급성 신장 손상(acute kidney injury)을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시 내용은, NF-κB 억제제를 함유하는 엑소솜을 사용하여 패혈증(sepsis)에 의해 유발된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
AKI는 단기적 부작용에 기여할 뿐만 아니라, 생존자들은 만성 신장(CKD) 및 말기 신장 질환(ESRD)을 앓을 수 있다. 병인의 가장 중요한 구성 요소 중의 하나로서, NF-κB의 체계적 억제는 AKI의 중증도에 영향을 미친다. 엽산에 의해 유도된 질환 모델에서, NF-κB의 억제는 RelA 및 NF-κB2 활성화를 감소시켜 AKI-손상을 경감시킨다.
800개 초과의 합성 및 천연 재료는, NF-κB의 활성화의 조절에 부분적으로 관여하는 것으로 공지되어 있다. 몇몇 연구는, 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템(RAAS) 차단 또는 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 차단제 등의 NF-ĸB 신호전달 차단이 신장 손상을 경감시킬 수 있음을 나타내었다. 그러나, 이들의 작용 메커니즘은 다면적이고, 특이성을 결여한다. 나노-기술의 최근의 진보는, NF-ĸB 신호전달을 표적화하는 특정 유전자 서열 또는 나노입자를 생산할 수 있게 하였다. 그러나, NF-ĸB 억제제는 아직 인간 사용을 위해 상업적으로 승인되지 않았다.
통제되지 않은 염증은 패혈증 반응의 현저한 특징이다. Toll-유사 수용체(TLR)에 의해 매개되는 숙주-병원체 상호작용은, 염증유발성(pro-inflammatory) 사이토카인, 케모카인 및 면역-활성화 분자의 생성을 자극한다. 이 염증유발성 반응 후에, 면역 세포의 다양한 정량적 및 기능적 결함을 포함하는 보상 면역억제 반응이 수반된다. 병원체에 의해 유도된 세포 변형은, 이러한 변화를 조절할 때에 중추적 역할을 하는 핵 인자 카파-B(NF-κB) 전사 인자를 사용하여, 숙주 유전자 발현의 현저한 변화를 수반한다. 종양 괴사 인자(TNF)-α 및 인터류킨(IL)-1을 포함하여 NF-κB의 조절 제어하에 몇몇 사이토카인은, 이 전사 인자의 추가 활성화를 유도하여 염증 반응과 패혈성 쇼크를 강화할 수 있다. 또한, NF-κB는, 주로 Bcl-xL, A1 및 A20 등의 항아폽토시스 유전자의 전사를 증강시키는 것을 통해, 아폽토시스 반응에 관여한다. 따라서, NF-κB 활성화와 관련된 염증은, 2개 상호작용 메커니즘, 즉 염증유발성 매개인자의 발현 증가 및 호중구 등의 세포 모집단의 수명 연장에 의해 악화될 수 있고, 이는 활성화되어 염증유발성 분자를 생성하고 급성 염증 프로세스에서 직접 관여한다.
패혈증에 의해 유발되는 폐렴(pneumonia), 사이토카인 폭풍 증후군(cytokine storm syndrome), 호흡 곤란 증후군(respiratory distress syndrome) 및 장기 부전(organ failure) 등의 다양한 질환이 있다. 패혈증은, 급성 미생물 감염으로 인한 선천성 면역계의 활성화에 의해 유발되는 전신 염증 증후군이고, 집중 치료 단위의 사망률의 주요 원인이다. 더욱이, 광범위하게 상이한 증상을 갖는 패혈증에 의해 유발된 다양한 질환이 있고, 이중 일부는 치명적이다. 불행하게도, 패혈증에 대한 일반적 치료법(즉, 항생제)은, 사이토카인 증후군 또는 손상된 장기 등의 패혈증에 의해 유발된 상이한 질환을 치료하는데 효과적이지 않을 수 있다. 현재, 패혈증에 의해 유발된 질환에 대한 임상적 사용이 가능한 치료법은 없다. 따라서, 효과적인 대체 요법의 개발이 시급하다. 700개 이상의 억제제가 NF-κB에 대해 보고되었지만, 현재까지 치료제로 승인된 억제제는 없다. 추가로, 다양한 스테로이드성 및 비스테로이드성 항염증제는 NF-κB를 차단하는 것으로 공지되어 있지만, 이들의 효과는 NF-κB를 억제하는데 특이적이지 않다.
성공적 유전자 및 약물 전달은, 수용자에게 악영향을 미치지 않으면서, 표적 분자를 작용 부위에 안정적으로 전달하기 위한 적절한 벡터의 선택을 필요로 한다. 재조합 아데노 바이러스, 리포좀, 리간드-접합된 나노입자 및 초음파 미세 기포를 포함한 다양한 유형의 벡터는, 이들의 안정성 및 높은 로딩(loading) 용량으로 인해 약물 전달에 효율적인 것으로 보고되어 있다. 그러나, 특정 우려 및 제한이 이들의 사용과 연관되었다. 이들은 망상내피 시스템에 의해 신속하게 인식되고 제거되었지만, 불균일한 입자 크기 및 비특이적 흡수 패턴은 생물-담체로서의 사용을 제한했다. 아데노 바이러스 벡터의 높은 면역원성은, 투여 후에 면역 반응을 유발할 수 있고, 바이러스 자체는 고용량에서 독성일 수 있다. 리포좀의 사용은 또한, 유해 면역원성 및 비-IgE-매개된 과민 반응을 유도할 수 있다.
치료용 단백질을 전달하기 위한 현재의 종래 전략은, 합성 나노입자 내의 단백질의 엔벨로핑(enveloping)을 포함한다. 가장 바람직한 단백질 전달 시스템은 리포좀 및 고분자 나노입자(PNP)이다. 리포좀은, 수성 환경 중의 다양한 크기 및 형상으로 자가-조립하는 인지질 막을 갖는 합성 소포이다. PNP는, 10 내지 1000nm의 크기를 갖는 고체 콜로이드 입자이고, 카고(cargo) 단백질이 나노입자 매트릭스(nanoparticle matrix)에 포획(entrapping), 캡슐화(encapsulating) 또는 부착될 수 있는 생분해성 고분자(biodegradable polymer)로 구성되어 있다. 그러나, 리포좀은 서로 융합 또는 응집되는 경향이 있고, 그 결과, 경시적으로 리포좀 카고의 조기 방출을 초래한다. PNP는 리포좀보다 안정성이 보다 양호할 수 있지만, 생체적합성 및 장기간 잠재적 안전성은 여전히 문제이다. 또한, 단백질을 리포좀 및 PNP로 캡슐화하는 것은, 합성 또는 재조합 단백질의 생성 및 생체 외 캡슐화 프로세스를 필요로 하고, EXPLOR 기술은, 천연 엑소솜 생합성을 통해 카고-로딩 엑소솜을 생성할 수 있는 안정한 세포의 생성 및 유지를 필요로 한다. 또한, 엑소솜은 생체적합성, 고유한 독성의 최소화 또는 부재, 순환 중의 긴 반감기, 조직을 표적화하는 고유한 능력 등의 이상적 단백질 전달 시스템의 다수의 바람직한 특징을 갖고 있다.
최근, 엑소솜은, 유전자/약물 전달을 위한 신규의 바이오-담체로서 상당한 주목을 받았다. 엑소솜은, 생물활성 물질을 수용자 세포로 전달하거나 표적 세포의 신호전달 경로에 영향을 미침으로써 세포 간 통신에서 중요한 역할을 하는 세포 외 소포(EV)이다. 엑소솜은, 다른 생물활성제보다 저장하기 쉽고 보다 큰 안정성을 나타낸다. 엑소솜은, 생물학적 장벽을 극복할 수 있는 높은 능력을 갖고 있고, 특정 세포 유형을 표적화하는 표면 분자를 운반할 수 있으며, 따라서 오프-표적 효과(off-target effect)를 보다 적게 유발한다.
본 개시 내용은, NF-κB 억제제를 포함하는 엑소솜을 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 환자에서 급성 신장 손상(AKI)을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시 내용은 또한, NF-κB 억제제를 포함하는 엑소솜을 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 패혈증에 의해 유발된 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
도 1. HEK293T로부터 생산된 조작된 엑소솜의 특성화
(A) 슈퍼-리프레서(super-repressor) IκB 로딩 엑소솜(엑소-srIκB)(상부)의 생산에 사용되는 DNA 작제물의 개략도, 및 광 가역적 단백질-단백질 상호작용을 사용하는 카고 단백질-보유 엑소솜의 생합성, 소위 EXPLOR 기술(하부). (B) 엑소-나이브 및 엑소-srIκB의 대표적 TEM 이미지. 스케일 바: 100nm. (C) 엑소-나이브(상부) 및 엑소-srIκB(하부)의 농도 및 크기 분포는 제타뷰(Zetaview) 기구에 의해 결정되었다. (D) 표적 단백질(srIκB, mCherry, CD9 및 GFP), 엑소솜 양성 마커(CD63, TSG101, Alix 및 GAPDH) 및 엑소솜 음성 마커(세포 소기관 마커; 프로히비틴, 칼넥신, GM130 및 뉴클레오포린 p62)의 발현을 분석하기 위한 HEK293T 세포 및 HEK203T 세포-유래 엑소솜의 면역블롯팅. 나이브 세포 및 엑소-나이브는 엑소-srIκB의 음성 대조군으로 사용되었다.
도 2. 신장 IRI 후의 엑소-srIκB의 신장 보호 효과.
(A) 신장 IRI 수술 및 엑소솜 전달의 실험 도식. 각 마우스 그룹에 3×109pn의 엑소-나이브 또는 엑소-srIκB를 1시간 간격으로 3회(총 9×109pn) 복강 내 주사했다. IRI 수술 후 24시간 또는 48시간 후에 마우스를 희생시키고, 추가 평가를 위해 혈청 및 조직을 수집했다. (B-D) 처리 유형(엑소-나이브 대 엑소-srIκB), 약물 전달 시기(전처리 대 후처리) 및 추적 시점에 따라 상이한 그룹 간의 BUN, 크레아티닌 및 NGAL의 혈청 수준(24시간 및 48시간), 이는 엑소-srIκB 처리의 신장 보호 효과를 나타낸다(전처리 24-h, n=10; 전처리 48-h, n=4-5; 후처리 24-h, n=5-10; 후처리 48-h, n=4-11). (E) 좌측: 각 그룹의 신장 절편에서 피질 관 세포(cortical tubular cell)의 대표적 PAS 염색 이미지. 통상의 근위 관 솔 가장자리(brush border)(*) 또는 솔 가장자리의 손실(o); 크로마틴 응축(흑색 화살표); 노출된(denuded) 기저막(흑색 화살표); 액포화(vacuolization)(황색 화살표); 스케일 바, 100μM. 우측: 병리학적 관 손상; 각 그룹으로부터의 다수의 신장 샘플은, 엑소-나이브 처리에 의한 것보다 엑소-srIκB 처리에 의한 관 손상이 보다 적음을 나타낸다(전처리 24-h, n=5; 후처리 24-h, n=5). 그룹 사이의 비교는, 본페로니(Bonferroni) 사후 시험과 함께 일방향 ANOVA를 사용하여 평가했다. 데이터는 평균±SD 값으로 제시되었다. ***P <0.001, 엑소-나이브-허위 및 엑소-나이브-IRI 수술 그룹 비교시. #P<0.05 및 ###P<0.001, 엑소-나이브-IRI 및 엑소-srIκB-IRI 수술 그룹 비교시.
도 3. 엑소-srIκB 처리후 IRI 유도된 NF-κB 활성화의 억제.
(A) 각각의 실험 마우스 그룹으로부터의 신장 핵 추출물을 사용하여 NF-ĸB p65 발현의 웨스턴 블롯 분석. 핵 추출물을 세포질 분획으로부터 생화학적으로 분리하고, NF-ĸB p65 및 라민 B1 발현을 웨스턴 블롯팅을 통해 분석했다. IRI-유도된 NF-ĸB 신호전달의 활성화는, 수술 전후 엑소-srIĸB 처리로 유의하게 억제되었다. (B) 신장 IRI 후의 NF-ĸB p65의 증가된 DNA 결합 활성은, 수술 전후 엑소-srIĸB 처리로 억제되었다. (C) 좌측: 각 처리 그룹으로부터의 NF-κB p65 항체를 사용한 대표적 IHC 이미지. 스케일 바, 50μM. 우측: 각 실험 그룹에서 NF-ĸB p65의 면역조직화학 검출을 나타내는 그래프 표시. 엑소-srIĸB에 의한 처리는, 대조군 그룹과 비교하여, NK-ĸB 발현을 감소시켰다(전처리 24-h, n=5-8; 전처리 48시간, n=4-5; 후처리 24-h, n=5-10; 후처리 48-h, n=4-11). 그룹 사이의 비교는, 본페로니(Bonferroni) 사후 시험과 함께 일방향 ANOVA를 사용하여 평가했다. 데이터는 평균±SD 값으로 표시되었다. **P<0.01, ***P<0.001, 엑소-나이브-허위 및 엑소-나이브-IRI 수술 그룹 비교시. #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001, 엑소-나이브-IRI 수술 그룹 및 엑소-srIκB-IRI 수술 그룹 비교시.
도 4. 염증유발성 사이토카인/케모카인 및 접착 분자의 발현은 국소적으로 및 전신적으로 엑소-srIĸB 처리에 의해 악영향을 받는다.
(A) 각 실험 그룹으로부터 전체 신장 용해물을 qRT-PCR에 사용하여, IL-1β, IL-6, Tnf-α, Ccl2, Ccl5, 및 Cxcl2를 포함하여 염증유발성 사이토카인의 발현 수준을 측정했다. 이러한 유전자의 mRNA 수준은 신장 중의 IR 손상 후에 유의하게 증가했고, 이 효과는 엑소-srIĸB 처리로 경감되었다(전처리 24-h, n=5-8; 전처리 48-h, n=4-5; 후처리 24-h, n=5-10; 후처리 48-h, n=4-11). (B) 각 실험 그룹의 혈청을 사용한 다중 사이토카인 연구는 또한 엑소-srIĸB 처리에 의한 허혈후 마우스 그룹에서 염증유발성 사이토카인 수준의 유사한 감소 경향을 나타냈다. (C) qRT-PCR 데이터는, 허혈후 엑소-나이브 처리 그룹에서 Icam-1 mRNA의 증가된 수준 및 엑소-srlĸB 처리에 의한 Icam-1 mRNA의 유의한 감소를 나타낸다. (D) 각 그룹으로부터의 전체 신장 용해물의 웨스턴 블롯 분석 결과는 엑소-srIĸB 처리로 IR 손상 신장에서 ICAM-1의 감소된 발현을 입증했다. (E) ICAM-1 IHC 염색(좌측) 및 ICAM-1 IHC의 그래프 표시(우측)을 나타내는 대표적 신장 절편은, 엑소-srIĸB 처리가 C57BL/6J 마우스의 허혈후 신장에서 ICAM-1 발현을 감소시켰음을 나타낸다. 스케일 바, 50μM(B-E: 전처리 24-h, n=5; 전처리 48-h, n=4-5; 후처리 24-h, n=5; 후처리 48-h, n=3-6). 그룹 사이의 비교는 본페로니(Bonferroni) 사후 시험과 함께 일방향 ANOVA를 사용하여 평가했다. 데이터는 평균±SD 값으로 표시되었다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 엑소-나이브-허위 및 엑소-나이브-IRI 수술 그룹 비교시. #P<0.05, ##P<0.01, ###P <0.001, 엑소-나이브-IRI 및 엑소-srIκB-IRI 수술 그룹 비교시.
도 5. 엑소-srIκB 처리는 IR 유도된 신장 아폽토시스를 개선한다.
(A) 좌측: 각 실험 그룹으로부터의 신장에서 절단된 카스파제-3과 절단된 PARP 단백질의 발현을 비교한 웨스턴 블롯 분석 결과. 우측: 그래프 표시는, 엑소-srIκB 처리가, 엑소-나이브 처리와 비교하여, 절단된 카스파제-3 수준 및 절단된 PARP를 저하시켰음을 나타낸다. (B) 좌측: TUNEL 염색의 대표적 이미지(FITC 표지)가 제시되어 있다. 아폽토시스 세포는 녹색(백색 화살표)이고, DAPI는 대비염색으로 사용했다. 스케일 바, 50μM. 우측: 각 그룹으로부터의 신장 절편에서 TUNEL 양성 세포를 나타내는 막대 그래프. 엑소-srIκB 처리는 보다 적은 수의 아폽토시스 세포를 유도했다(전처리 24-h, n=5, 전처리 48-h, n=4-5, 후처리 24-h, n=5, 후처리 48-h, n=3-6). 그룹 사이의 비교는, 본페로니(Bonferroni) 사후 시험과 함께 일방향 ANOVA을 사용하여 평가했다. 데이터는 평균±SD 값으로 표시했다. ***P<0.001, 엑소-나이브-허위 및 엑소-나이브-IRI 수술 그룹 비교시. #P<0.05, ##P<0.01 및 ###P<0.001, 엑소-나이브-IRI 및 엑소-srIκB IRI 수술 그룹 비교시.
도 6. 신장 허혈-재관류 손상후 엑소솜의 생체분포
(a) 생체 내 이미징 및 엑소솜 전달의 실험 도식. (b) 순차적 생체 내 이미징은 DiD-표지된 엑소솜(녹색)의 정맥 엑소-srIκB로 처리된 허혈후 신장에서 호중구(Ly6G+, 적색) 및 대식세포(F4/80+, 청색)로의 흡수를 나타낸다. 백색 화살표는 면역 세포에 포함된 DiD-표지된 엑소솜을 나타낸다. 백색 파선은 신장 간질을 나타낸다. (c) 신장 IRI 수술후의 비장에서 DiD-표지된 엑소솜(녹색)의 생체분포는 외부 실질(parenchyma)에서 호중구(Ly6G+, 적색) 및 대식세포(F4/80+, 청색)로의 엑소솜 흡수를 나타낸다. 경과 시간이 표시된다. 스케일 바, 20μm.
도 7. 엑소-srIκB 처리는 IR-유도된 AKI 후의 신장 면역 세포 모집단을 조절한다.
(A) 수술 후 24시간에서 마우스를 희생시켰다. KMNC는, 효소 소화, 기계적 파괴 및 퍼콜(Percoll) 밀도 구배를 사용하여 농후화시켰다. 이러한 방법을 사용하여 결정된 총 신장 세포 수는, 실험 그룹 사이에서 통계적 차이를 나타내지 않았다. (B) 유세포 분석의 그래프 표시는, 효소 소화, 기계적 파괴 및 퍼콜 밀도 구배를 사용하여, 단리된 신장 세포 중에서 IRI 후에 보다 높은 비율의 신장 CD45+ 세포를 나타냈다. 엑소-srIκB 처리는 신장 면역 세포의 허혈후 급증(surge)을 경감시켰다. (C) 추가의 면역 세포 마커를 사용하여 추가로 염색한 결과는, 농후화된 KMNC 중의 호중구(CD45+Ly6G+), 염증유발성/항-염증성 단핵 식세포 세포(CD45+Ly6C+/CD45+F4/80+), T 세포(CD45+CD3+)를 포함한 다계통 면역 세포의 빈도가 또한 허혈후 신장에서 엑소-srIκB 처리로 감소했음을 나타냈다. (D-F) Ly6G, Ly6C 및 F4/80을 표적화하는 각 실험 그룹의 허혈후 신장에 대해 면역형광 연구를 수행했다. Alexa Fluor 647과 접합된 2차 항체를 모든 면역형광 실험에 사용했다. 데이터는, 엑소-srIκB 처리 후의 허혈후 신장에서 Alexa Fluor 647 염색 세포(백색 화살표)의 감소된 빈도를 나타냈고, 이는 엑소-srIκB 처리된 신장에 보다 적은 호중구(Ly6G+) 및 엑소-srIκB 프로/항-염증성 단핵 식세포(Ly6C+/F4/80+)가 있었음을 시사한다. 근위 관 세포를 LTL(녹색)로 염색하고, DAPI를 대비염색으로 사용했다. 스케일 바, 50μM. (실험 그룹당 n=5). 그룹 사이의 비교는, 본페로니 사후 시험과 함께 일방향 ANOVA을 사용하여 평가했다. 데이터는 평균±SD 값으로 표시했다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 엑소-나이브-허위 및 엑소-나이브-IRI 수술 그룹 비교시. #P<0.05, ##P<0.01, 엑소-나이브-IRI 및 엑소-srIκB-IRI 수술 그룹 비교시.
도 8. 엑소-srIκB의 정맥 내 전달은 허혈성 AKI 모델에서 복강 내 전달과 비교하여 유사한 생물학적 효과를 나타낸다.
(a) 신장 IRI 수술 및 엑소솜 전달의 실험 도식. 각 마우스 그룹에, 재관류 1시간 후 9×109pn의 엑소-나이브, 엑소-srIκB 또는 PBS를 정맥 내 주사했다. IRI 수술후 24시간 또는 48시간에 마우스를 치사시키고, 추가 평가를 위해 혈청 및 조직을 수집했다. (b-d) 치료 유형(PBS 대 엑소-나이브 대 엑소-srIκB) 및 추적 관찰 시점(24-h 및 48-h)에 따라 상이한 그룹 사이의 BUN, 크레아티닌 및 NGAL의 혈청 수준, 이는 엑소-srIκB 처리의 신장 보호 효과(실험 그룹당 n=5)를 나타낸다. (e) 각 실험 마우스 그룹으로부터의 신장 핵 추출물을 사용하여 NF-ĸB p65 발현의 웨스턴 블롯 분석. 핵 추출물을 세포질 분획으로부터 생화학적으로 분리하고, NF-ĸB p65 및 라민 B1 발현은 웨스턴 블롯팅을 통해 분석했다. NF-ĸB 신호전달의 IRI-유도된 활성화는 수술후 엑소-srIĸB 처리로 유의하게 억제되었다. (f) 신장 IRI 후의 NF-ĸB p65의 상승된 DNA 결합 활성은 수술후 엑소-srIĸB 처리로 억제되었다. (g) qRT-PCR 데이터는, 허혈후 엑소-나이브 처리 그룹에서 Icam-1 mRNA의 증가된 수준 및 엑소-srlĸB 처리로 Icam-1 mRNA의 현저한 감소를 나타낸다. (h) 각 그룹으로부터의 총 신장 용해물의 웨스턴 블롯 분석 결과는, 엑소-srIĸB 처리로 IR-손상된 신장에서 ICAM-1의 감소된 발현을 입증했다. 그룹 사이의 비교는 본페로니 사후 시험으로 일방향 ANOVA를 사용하여 평가했다. 데이터는 평균±SD 값으로 표시했다. ns; 유의하지 않음, **P<0.01, ***P <0.001. PBS-허위 및 엑소-나이브-IRI 수술 그룹 비교시. #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001, 엑소-나이브-IRI 및 엑소-srIκB-IRI 수술 그룹 비교시.
도 9(1). 조작된 엑소솜의 생성 및 특성화
(A) 슈퍼-리프레서 IκB-로딩된 엑소솜(엑소-srIκB)(상부)의 생산에 사용되는 DNA 작제물의 개략도. 융합 단백질 및 제안된 활동을 나타내는 개략도(하부). (B) 투과 전자 현미경(TEM)을 통한 엑소-나이브 및 엑소-srIκB의 형태학적 특성 화. (C) mCherry 또는 srIκB를 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포 및 이들 HEK293T 세포로부터의 엑소솜을 용해시키고, 지시된 단백질에 대해 면역 블롯팅했다.
도 10(2). 내독소혈증 및 맹장 결찰 및 천공(CLP)-유도된 패혈증에서 엑소-srIκB의 보호 효과
(A) 인산염 완충 식염수(PBS)-처리된, 엑소-나이브 및 엑소-srlκB-처리된 패혈증 마우스의 생존 곡선. 리포폴리사카라이드(LPS) C57BL/6 마우스(n=5-6/그룹), LPS BALB/c 마우스(n=10/그룹) 및 CLP C57BL/6 마우스(n=14-15/그룹). **p<0.01, *p<0.05 PBS 처리된 패혈증 그룹과 비교. (B) 엑소솜 처리된 마우스의 혈장에서 종양 괴사 인자(TNF)-α, 인터류킨(IL)-6, IL-1β 및 CCL4/대식세포 염증 단백질(MIP)-1β의 수준을 LPS 주사 또는 CLP후 24시간에서 측정했다. **p<0.01, *p<0.05 PBS 처리된 패혈증 그룹과 비교. †p<0.05 엑소-나이브 처리된 패혈증 그룹과 비교. (C) 허위(sham), PBS를 갖는 CLP, 엑소-나이브를 갖는 CLP, 엑소-srlκB를 갖는 CLP로부터의 신장 절편의 피질 관 세포의 대표적 이미지, 근위 관의 정상적 솔 가장자리(*) 또는 솔 가장자리 손실(○); 크로마틴 응축(백색 화살표); 노출된 기저막(백색 화살촉); 액포화(황색 화살표); 스케일 바, 100μM. (D) 각 그룹의 대표적 신장 샘플의 병리학적 신장 손상 점수(score). *p<0.05 PBS 처리된 패혈증 그룹과 비교. †p<0.05 엑소-나이브 처리된 패혈증 그룹과 비교.
도 11(3). LPS 주사 마우스에서 엑소솜의 생체분포
(A) 허위 마우스의 간에서 호중구(LysMgfp/+, 녹색; Ly6G+, 청색) 내로 mCLING 표지된 엑소솜(적색) 흡수의 생체 내 이미징. (B) LPS 처리된 C57BL/6 마우스에서 간의 Ly6G+ 호중구 세포(녹색) 내부의 mCLING 표지된 엑소솜(적색)의 대표적 저속 촬영(time-lapse) 이미징. (C) 허위 및 LPS 처리된 LysMGFP/+ 마우스의 비장 내부에서 mCLING-표지된 엑소솜(적색)의 흐름의 순차적 이미지. 경과 시간이 표시된다. 자홍색, 자가 형광; 스케일 바, 50μm.
도 12(4). 시험관 내에서 핵 인자-카파-B(NF-κB) 신호전달에 미치는 엑소-srIκB의 억제 효과
(A) HEK293-NF-κB-루시퍼라제 세포(2×104 세포)를, 엑소-나이브 또는 엑소-srIκB 2×105 입자와 함께 배양했다. 24시간 후, 세포를 추가 18시간 동안 0.5ng/ml TNF-α로 처리했다. 루시퍼라제 활성을 측정하고 정규화했다. (B) 엑소-srIκB는 NF-κB-루시퍼라제 세포에서 용량 의존적으로 NF-κB 활성화를 억제했다. (C) THP-1 세포(5×105 세포)를 1㎍/ml LPS로 자극시키고, 엑소-srIκB 5×106 입자로 처리했다. 상청액을 수집하고, TNF-α 및 단핵구 화학유인성 단백질(monocyte chemoattractant protein; MCP)-1의 생성에 대해 검정했다. JSH-23(50μM)을 양성 대조군으로 사용했다. **p<0.01 (D) mCLING-표지된 엑소-srIκB와 함께 배양된 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 면역형광. 대표적 이미지가 제시되어 있다. 핵은 Hoechst로 표지했다. (E) HUVEC를 300ng/ml LPS로 24시간 동안 자극했다. 세포를 단일 세포 현탁액으로 수확하고, 인간 세포 간 세포 부착 분자(ICAM)-1에 대한 특정 피코에리트린(PE)-접합된 항체를 사용하여 유세포 분석을 통해 평가했다.
도 13(S1). 엑소솜 특성화
(A) 조작된 엑소솜을 생성하기 위해 사용되는 절차의 개략도. (B) 엑소-나이브, 엑소-mCherry 및 엑소-srIκB의 희석된 샘플에서 유사한 크기 분포를 입증하는 나노입자 추적 분석(NTA)의 대표적 그래프.
도 14(S2). 패혈증의 마우스 모델에서 엑소-srIκB의 억제 효과
(A) 체온 변화는 야생형 및 LPS 처리된 C57BL/6 마우스에게 지시된 엑소솜을 주사한 후에 모니터링했다. **p<0.01 PBS 처리된 LPS 그룹과 비교. (B) LPS 및 PBS(좌측), 엑소-나이브(중간) 및 엑소-srIκB(우측)으로 처리한 C57BL/6(상부 패널) 및 BALB/c(하부 패널) 마우스의 절편에서 신장 피질 영역의 대표적 이미지. 근위 관의 정상 솔 가장자리(*) 또는 솔 가장자리 손실(○); 크로마틴 응축(적색 화살표); 노출된 기저막(적색 화살표); 액포화(청색 화살표); 스케일 바, 100μM. (C) LPS-유도된 패혈증 마우스의 엑소-나이브와 엑소-srIκB 처리된 그룹 사이의 각 장기에서 침윤된 Ly6G+ 세포의 수의 비교. (D) IL-10의 수준은 PBS-, 엑소-나이브- 및 엑소-srIκB 처리된 패혈증 마우스의 혈장에서 측정했다. NS, 유의하지 않음.
도 15(S3). LPS 챌린지의 존재 또는 부재하의 마우스에서 엑소솜의 생체분포
(A) LPS의 정맥 내 투여 후에 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 신장에서 검출된 mCLING-표지된 엑소솜의 분석.
도 16(S4). HUVEC에서 LPS-유도된 염증 반응에 대한 엑소-srIκB의 억제 효과
(A) HUVEC(7×104 세포)를 24시간 동안 엑소-srIκB 1×107 입자와 함께 배양하고, 이어서 36ng/㎖ LPS로 자극했다. 24시간 후에 상청액을 수집하고, 각각 IL-8(좌측) 및 MCP-1(우측)의 생산을 분석했다. JSH-23(50μM)을 양성 대조군으로 사용했다. ***p<0.001 디메틸 설폭사이드(DMSO)와 비교. #p<0.05 LPS 단독으로 처리된 세포와 비교. (B) HUVEC를 24시간 동안 엑소-srIκB로 전처리하고, 이어서 36ng/ml의 LPS 자극을 1시간 동안 수행했다. 웨스턴 블롯팅을 사용하여 p65 및 IκBα의 단백질 수준을 평가했다. GAPDH 및 히스톤 H3(HH3)을 각각 세포질 세포 용해물 및 핵 분획에 대한 내인성 대조군으로 사용했다(좌측). 이의 표적 DNA 서열, 5'-GGGACTTTCC-3'에 대한 핵 NF-κB의 결합은 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)을 통해 측정했다(우측).
도 17 내지 20. LPS-유도된 패혈증에서 폐 손상에 대한 엑소-srIκB의 보호 효과
도 17은, (1) 폐포; (2) 모세관; (3) 호중구; (4) 폐포 대식세포; (5) 울혈; (6) 출혈; (7) 괴사를 나타내는 H&E 염색을 도시한다.
도 18은, 허위, 나이브 엑소솜, 엑소-srIκB 처리된 패혈증 마우스의 생존 곡선을 도시한다.
도 19는, 엑소-srIκB-처리된 패혈증 마우스의 혈장 중의 TNF-α의 수준을 도시한다.
도 20은, (1) 중앙 정맥 및 (2) 면역 세포의 침윤을 나타내는 H&E 염색을 도시한다.
본 개시 내용은 EXPLOR 기술[참조: Yim et al., Nature Communications 7, 12277 (2016)]를 제공하고, 이는, 허혈성 AKI 과정에 미치는 이들의 영향을 평가하기 위해, srIĸB를 엑소솜에 로딩하고 엑소-srIĸB를 전신적으로 전달하기 위해 사용되었다. 2개의 재조합 단백질, CIBN-EGFP-CD9 및 srIĸB-mCherry-CRY2를 생산한 인간 배아 신장(HEK) 293T 세포주를, 청색광 조명을 사용하여 CRY2 및 CIBN의 일시적 도킹을 유도함으로써 srIĸB 함유 엑소솜(엑소-srIĸB)을 생산하기 위해 사용했다(도 1A). 대조군 엑소솜(엑소-나이브)은 무손상 HEK293T 세포에서 생성했다. 결과는, 광유전학적으로 조작된 엑소솜이 치료제로 활용될 수 있고, 엑소-srIĸB가 면역 반응 조절 및 아폽토시스를 통해 IR-유도된 신장 손상을 경감시킬 수 있음을 확인했다.
본 개시 내용(특히 특허청구의 범위의 문맥에서)을 설명하는 맥락에서 사용되는 용어 단수 표현("a", "an", "the") 및 유사한 지시어는, 본원에서 달리 명시되거나 문맥에 의해 모순되지 않는 한, 단수 및 복수를 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위를 인용하는 것은, 단지 범위 내에 있는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 단축 방법으로 기능하는 것으로 단순히 의도된다. 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 각각의 개별 값은, 각각이 본원에서 개별적으로 언급된 것과 같이 본 명세서에 도입된다. 본원에 기재된 모든 방법은, 본원에서 달리 지시되거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예 또는 예시적 언어(예: "예를 들면")의 사용은, 단지 본 개시 내용을 보다 잘 설명하기 위한 것이며, 달리 청구된 개시 내용의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서의 어떤 언어도, 본 개시 내용의 실시에 필수적인 임의의 비청구 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은, 예를 들면, 뉴클레오티드 서열의 길이, 오차 정도, 치수, 조성물 중의 성분 양, 농도, 용적, 프로세스 온도, 프로세스 시간, 수율, 유속, 압력 및 이와 유사한 값 및 이의 범위의 변형을 의미하고, 예를 들면, 화합물, 조성물, 농축물 또는 사용 제형을 제조하기 위해 사용되는 전형적 측정 및 취급 절차를 통해; 이 절차에서 부주의한 오류를 통해; 이들 방법을 수행하기 위해 사용되는 출발 물질 또는 성분의 제조, 공급원 또는 순도의 차이를 통해; 및 고려 사항 등을 통해 발생할 수 있는 수량의 변동을 지칭한다. 용어 "약"은 또한, 예를 들면, 특정 초기 농도 또는 혼합물을 갖는 조성물, 제형 또는 세포 배양물의 노화로 인해 상이한 양, 및 특정 초기 농도 또는 혼합물을 갖는 조성물 또는 제형의 혼합 또는 처리로 인해 상이한 양을 포함한다. 용어 "약"에 의해 수정되더라도, 첨부된 특허청구범위는 이러한 양에 대한 등가물을 포함한다. 용어 "약"은, 언급된 기준 값과 유사한 값의 범위를 추가로 지칭할 수 있다. 특정 실시형태에서, 용어 "약"은 언급된 기준 값의 50, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% 이하에 속하는 값의 범위를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는, 인간 또는 비인간 동물(예, 마우스, 래트, 래빗, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)를 지칭한다.
AKI
NF-ĸB 신호 전달에 의한 면역 반응은 AKI에 관여할 수 있고, 엑소-srIĸB는 패혈증으로 인한 신장 손상에서 신장 손상을 개선하는 효과를 발휘할 수 있다. 본원의 일부 실시예에서는, 억제제의 투여가 허혈성 AKI 과정을 경감시킬 수 있는지의 여부를 평가했다. 본원의 실시예에서는 EXPLOR 기술을 사용하여 IRI 수술 전후에 SrIĸB를 마우스에 전달하고, 그 결과를 대조군과 비교했다. 그 결과, 엑소-srIĸB-처리된 마우스는, 대조군 그룹과 비교하여, 보다 낮은 수준의 혈청 BUN 및 크레아티닌 수치를 나타냈고, 이에 의해 IR-유도된 AKI로부터 예방 및 치료 효과를 발휘함을 확인했다. 한편, 엑소-srIĸB의 투여가 신장의 NF-ĸB 신호에 국소적으로 영향을 미치는지의 여부를 확인한 결과, 엑소-srIĸB는, 대조군 그룹과 비교하여, NF-ĸB의 핵 전좌 및 핵 결합 활성을 현저히 감소시키는 것으로 밝혀졌다. NF-ĸB 경로는 면역 반응 프로세스에서 중요한 역할을 할 수 있다. 엑소-srIĸB 치료 그룹과 대조군 그룹, IL-1β, IL-6에서 Pan-염증성 사이토카인/케모카인의 유전자 발현을 비교한 결과, CCL2, CCL5, CXCL2 및 TNF-α를 포함한 다수의 염증 매개인자의 현저한 감소가 확인되었다. 마지막으로, 본원의 실시예에서는, NF-ĸB 억제제 처리가 신장 면역 세포 모집단에 영향을 미치는지의 여부를 비교하기 위해 유세포 분석을 수행했으며, 호중구, 단핵구/대식세포 및 T 세포를 포함한 다중 면역 세포 모집단의 빈도가 현저하게 감소하는 것으로 관찰되었다.
IRI는 염증성 캐스케이드 및 산화 스트레스를 유도하고, 사이토카인 폭풍을 유발하고, 아폽토시스 및 인접 조직에 대한 구조적 손상을 유도한다. NF-ĸB 신호전달 경로는 IRI 자극, 특히 저산소증/재관류의 초기 단계 동안 손상된 세포로부터의 높은 수준의 신속한 반응으로 세포 생존 및 염증을 조절할 수 있다. 예를 들면, 이동성 그룹 box 1(HMGB1), 열 충격 단백질(HSP) 및 병원체/손상 연관된 분자 패턴(PAMP/DAMP) 등의 다수의 내인성 인자가 방출된다. 이들 내인성 분자는 IL-1R 등의 Toll-유사 수용체(TLR) 및 패턴 인식 수용체(PRP)를 자극할 수 있다. TLR 및 IL-1R은 동일한 세포 내 도메인을 공유하고, 억제 단백질 IĸB 잔기를 인산화화하고, IĸB 키나제(IKK)를 활성화하고, 이는 궁극적으로 프로테아좀에 의한 IĸB의 분해를 유도한다. 이 프로세스는, 헤테로이량체(예: p50/p65)가 세포질로부터 핵으로 이동하는 것을 가능하게 하고, 이는 DNA에 결합하고, TNF-α, IL-1, IL-6 및 IL-8을 포함한 염증성 매개인자의 전사를 촉진하고, NF-ĸB 신호전달을 가속화한다. 이 염증유발성 캐스케이드는, 아폽토시스를 유도하고 IRI에 노출된 신관 세포에서 백혈구 이동/활성화 촉진함으로써 주변 미세환경을 조절할 수 있다. 본 개시 내용의 허혈성 AKI 모델은 또한 NF-ĸB 신호전달의 활성화를 유도할 수 있고, 이는 거짓 수술 그룹과 비교하여 신장 면역 세포 모집단에 유의적으로 영향을 미치는 다수의 염증성 사이토카인/케모카인 유전자의 발현을 유도한다. 최근 연구에는, TLR 길항제, 사이토카인 길항제, IKK 복합체 길항제, 프로테아좀 억제제, 특정 NF-ĸB 복합체에 특이적인 디코이 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), 및 다양한 기관에서 Rel 단백질 번역을 억제하는 ODN이 포함된다. 이는, 다양한 약리학적 억제제를 사용하여 NF-ĸB 신호전달을 억제함으로써 IRI에서 NF-ĸB를 차단하는 효과를 나타낸다. 세린 잔기 32 및 36에 돌연변이를 갖는 IĸBα 단백질은 인산화되지 않고, 따라서 세포질에서 NF-ĸB와의 다량체로서 존재하고, 분해되지 않기 때문에, NF-ĸB 핵 전좌(translocation)를 보류(holding)한다. 이 비분해성 IĸBα, 소위 슈퍼-리프레서 IĸBα(srIĸB)는 아폽토시스를 유도하여 항-종양 효과를 갖는 것으로 공지되어 있다.
본 개시 내용에서, 엑소-srIĸB의 치료 효과는 급성 신염을 나타내는 신장 IRI 모델에서 제시된다. 엑소-srIĸB는, 백혈구 이동/활성화를 제한할 수 있는 염증유발성 매개인자의 생산을 하향-조절하고 염증 세포의 조기 아폽토시스를 유도하여 염증 단계의 조기 종결을 유도함으로써 AKI의 프로세스를 조절한다. 본 개시 내용에서, 엑소-srIĸB의 투여는 신장 내 면역 세포 모집단의 빈도에만 영향을 미치고, 비장 내 면역 세포 모집단의 빈도에는 영향을 미치지 않음을 확인했다. 이러한 결과는, 엑소-srIĸB가 세포 증식을 선택적으로 억제하거나, 신장 상주 면역 세포에서 아폽토시스를 촉진한다는 것을 나타낸다. 한편, 엑소-srIĸB의 생체 내 전달은, 손상된 신장으로의 비장 면역 세포의 유출을 차단하는 것으로 해석될 수 있다. 본 개시 내용에서, 엑소-srIĸB는 NF-ĸB 신호의 활성을 억제함으로써 마우스에서 IR-유도된 AKI를 경감시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, 엑소-srIĸB의 생체 내 전달은, 염증유발성 유전자의 발현을 감소시키고 호중구, 단핵구/대식세포 및 T 세포를 포함하는 신장 면역 세포 모집단을 감소시킴으로써 신장의 전체 염증 상태를 개선할 수 있다. 따라서, 한 가지 측면에서, 본 개시 내용은, srIκB가 탑재된 엑소솜에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 srIκB가 탑재된 엑소솜에 관한 것이다. 이하, srIκB는 카고 단백질로 표현될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 AKI는 허혈-재관류(IR)-유도된 AKI, 리포폴리사카라이드(LPS)-유도된 AKI 또는 패혈증-유도된 AKI이지만, 이들로 한정되지 않는다. 허혈-재관류(IR)-유도된 급성 신장 손상(AKI)은, 대상체가 전신성 저관류를 앓고 있고 이어서 혈류 및 재-산소화의 회복을 수반하는 경우에 발생할 수 있는 비교적 일반적이지만 중증의 의학적 상태이다. 가장 일반적 임상 예는, 신장 이식 또는 심장 수술을 받은 환자, 및 패혈증, 외상 또는 심근경색을 갖는 환자를 포함한다. 신장 IR 손상(IRI)은 높은 이환율/사망률과 관련이 있고, 심장, 폐 및 간을 포함한 다른 원위 기관에서 기능장애를 유발하는 것으로 공지되어 있다. IR-유도된 AKI에서, 저산소증 및 재관류는 활성 산소 종(ROS)을 생성하고, 이어서 아폽토시스 및 염증을 포함한 캐스케이드 반응, 및 후속적으로 신부전을 발생시킨다. 면역학적 반응은, 신장 IRI 및 수복에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 사이토카인 생산 및 세포 생존을 조절하는 핵 인자(NF)-ĸB 신호전달은 IR-유도된 AKI에 유의적으로 관여하고, 이의 억제는 허혈성 AKI를 완화시킬 수 있다.
EXPLOR, 외과적으로 조작된 엑소솜 기술을 사용하여, NF-ĸB(엑소-srIĸB)의 엑소솜 슈퍼-리프레서 억제제를 엑소솜에 로딩하고, 본원의 실시예에 제시된 바와 같이 신장 IR 수술 후/전에 B6 WT 마우스에게 투여했다. 결과는 대조군 엑소솜(엑소-나이브) 주사 그룹의 결과와 비교했다. 엑소-srIĸB 처리는, 엑소-나이브 처리 그룹보다 허혈후 마우스에서 보다 낮은 수준의 혈청 혈중 우레아 질소, 크레아티닌 및 호중구 젤라티나제 연관 리포칼린을 초래했다. 엑소-srIĸB의 전신 전달은 허혈후 신장에서 NF-ĸB 활성을 감소시켜 아폽토시스 수준을 저하시켰다. 허혈후 신장은, 대조군과 비교하여, 엑소-srIĸB 처리로 염증유발성 사이토카인 및 부착 분자의 유전자 발현 감소를 나타냈다. 엑소-srIĸB 처리는 또한, 허혈후 신장 면역 세포 모집단에 유의적으로 영향을 미쳐, 대조군과 비교하여 호중구, 단핵구/대식세포 및 T 세포 빈도를 저하시켰다. 따라서, 엑소솜 전달을 통한 NF-ĸB 신호전달의 조절은 IR-유도된 AKI를 포함한 AKI에 대한 신규한 치료 방법으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 엑소솜은, 슈퍼-리프레서(SR) IκB(srIκB, 서열번호 1)로서 불리우는 NF-κB의 생물학적 억제제의 돌연변이 형태를 함유하도록 조작된다[참조: N. Yim et al., Nature Communications 7, 12277 (2016)].
하기 실시예에 제시된 바와 같이, 안정하게 형질감염된 세포에서 엑소솜에 다량의 srIκB의 로딩을 위해, 광유전학적으로 조작된 엑소솜 시스템(EXPLOR)을 사용했다. 하기 실시예는, 정제된 srIκB-로딩된 엑소솜(엑소-srIκBs)의 복강 내 주사가 패혈성 마우스 모델에서 사망률과 전신 염증을 약화시킨다는 것을 확인한다. 형광 염료로 표지된 엑소솜을 사용한 생체분포 연구에서, 엑소-srIκB는 마우스의 비장 및 간에서 주로 호중구에서 및 보다 적은 정도의 단핵구에서 관찰되었다. 더욱이, 실시예는 엑소-srIκB가, 지질 다당류(LPS) 또는 종양 괴사 인자(TNF)-α에 반응하여, 단핵구 THP-1 세포 및 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에서 염증 반응을 경감시킨다는 것을 확인한다. 이러한 결과는, 엑소-srIκB가 NF-κB 활성화를 억제함으로써 전신성 염증 및 패혈증-유도된 사망으로부터 보호할 수 있음을 확인한다.
본 개시 내용은, 이를 필요로 하는 대상체에서 급성 신장 손상(AKI)을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 NF-κB 억제제를 포함하는 엑소솜을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, NF-κB의 억제제는 NF-κB 억제 단백질, 이의 단편 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
상기 조성물은 엑소솜의 생리학적으로 허용되는 수계 용액 또는 현탁액이다.
NF-κB 억제제는 NF-κB 억제 약물, NF-κB 억제 단백질 또는 이의 단편, 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다.
바람직하게는, NF-κB 억제제는 슈퍼-리프레서 IκB, IκB-α, IκB-β, IκB-ε, BCL-3, 이들의 돌연변이체(mutant), 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 개시 내용의 또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 개시 내용의 엑소솜은, 슈퍼-리프레서(SR) IκB(srIκB, 서열번호 1)로 불리우는 NF-κB의 돌연변이 형태의 생물학적 억제제를 함유한다.
본 개시 내용의 한 가지 실시형태에서, srIκB는, Ala로 치환된 IκB(서열번호 2)의 Ser32 및 Ser36을 갖는다.
서열번호 1 호모 사피엔스, 슈퍼-리프레서-IκB(srIκB)
MFQAAERPQEWAMEGPRDGLKKERLLDDRHDAGLDAMKDEEYEQMVKELQEIRLEPQEVPRGSEPWKQQLTEDGDSFLHLAIIHEEKALTMEVIRQVKGDLAFLNFQNNLQQTPLHLAVITNQPEIAEALLGAGCDPELRDFRGNTPLHLACEQGCLASVGVLTQSCTTPHLHSILKATNYNGHTCLHLASIHGYLGIVELLVSLGADVNAQEPCNGRTALHLAVDLQNPDLVSLLLKCGADVNRVTYQGYSPYQLTWGRPSTRIQQQLGQLTLENLQMLPESEDEESYDTESEFTEFTEDELPYDDCVFGGQRLTL
서열번호 2, 호모 사피엔스, IκB-α
MFQAAERPQEWAMEGPRDGLKKERLLDDRHDSGLDSMKDEEYEQMVKELQEIRLEPQEVPRGSEPWKQQLTEDGDSFLHLAIIHEEKALTMEVIRQVKGDLAFLNFQNNLQQTPLHLAVITNQPEIAEALLGAGCDPELRDFRGNTPLHLACEQGCLASVGVLTQSCTTPHLHSILKATNYNGHTCLHLASIHGYLGIVELLVSLGADVNAQEPCNGRTALHLAVDLQNPDLVSLLLKCGADVNRVTYQGYSPYQLTWGRPSTRIQQQLGQLTLENLQMLPESEDEESYDTESEFTEFTEDELPYDDCVFGGQRLTL
서열번호 3 재조합 srIκBα 펩티드
DRHDAGLDAMKDE
일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는, 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 85% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 86% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 87% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 88% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 89% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 91% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 92% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 93% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 94% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1로 표시된다.
일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 86% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 87% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 88% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 89% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 91% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 92% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 93% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 94% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1로 표시된다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2로 표시된다.
본 개시 내용의 특정 실시형태에서, 엑소솜은, 광-특이적 결합 단백질(photo-specific binding protein)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 광-특이적 결합 단백질은, 조사시에 서로 가역적으로 상호작용하는 제1 광-특이적 결합 단백질 및/또는 제2 광-특이적 결합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질은 엑소솜 특이적 마커에 접합하여 제1 융합 단백질(융합 단백질 I)을 형성한다. 일부 실시형태에서, 제2 광-특이적 결합 단백질은 NF-κB 억제 단백질에 접합하여 제2 융합 단백질(융합 단백질 II)을 형성한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질 I 및 융합 단백질 II는, 제1 광-특이적 결합 단백질 및 제2 광-특이적 결합 단백질을 통해 가역적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질은, 엑소솜의 내측을 향한 방향으로 위치되도록 엑소솜 특이적 마커에 접합된다.
추가의 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질 및 제2 광-특이적 결합 단백질은, CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 그룹으로부터 선택된다.
추가의 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질은 CIB 또는 CIBN이고, 제2 광-특이적 결합 단백질은 CRY 또는 PHR이거나; 제1 광-특이적 결합 단백질은 CRY 또는 PHR이고, 제2 광-특이적 결합 단백질은 CIB 또는 CIBN이다.
추가의 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질은 PhyB이고, 제2 광-특이적 결합 단백질은 PIF이거나, 제1 광-특이적 결합 단백질은 PIF이고, 제2 광-특이적 결합 단백질은 PhyB이다.
추가의 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질은 GIGANTEA이고, 제2 광-특이적 결합 단백질은 FKF1이거나, 제1 광-특이적 결합 단백질은 FKF1이고, 제2 광-특이적 결합 단백질은 GIGANTEA이다.
일부 실시형태에서, 엑소솜의 특이적 마커는, CD9, CD63, CD81 또는 CD82을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 그룹으로부터 선택된다. 추가의 실시형태에서, 엑소솜 특이적 마커는 CD9이다. 추가의 실시형태에서, 엑소솜 특이적 마커는 CD63이다. 추가의 실시형태에서, 엑소솜 특이적 마커는 CD81이다. 추가의 실시형태에서, 엑소솜 특이적 마커는 CD82이다.
일부 실시형태에서, 엑소솜은 약 50nm 내지 약 200nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 엑소솜은 약 50nm 내지 약 75nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 엑소솜은 약 75nm 내지 약 100nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 엑소솜은 약 100nm 내지 약 125nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 엑소솜은 약 125nm 내지 약 150nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 엑소솜은 약 150nm 내지 약 175nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 엑소솜은 약 175nm 내지 약 200nm의 직경을 갖는다. 실시형태에서, 엑소솜은 약 50nm 내지 약 150nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 엑소솜은 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150 이상의 직경 및/또는 약 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 이하의 직경을 갖는다.
모든 세부 사항을 기재하지 않고서, 미국 특허 제10702581호 및 한국 특허 제10-2100420호의 내용은, 본 개시 내용의 NF-κB 억제제를 함유하는 엑소솜을 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공하기 위해 참조에 의해 본원에 도입된다.
본 개시 내용은 또한, 치료학적 유효 약물의 지속 방출을 제공하지만, 종래의 지속 효과는 치료제의 반복 투여를 필요로 한다.
본 개시 내용은 또한, NF-κB 억제제를 담지하는 세포 외 소포(엑소솜) 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 담체들을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
IR-유도된 AKI의 병태생리학을 이해하는데 있어서 최근의 주목할만한 진보에도 불구하고, 허혈성 AKI를 치료하기 위한 임상적 효능 및 안전성이 입증된 약물은 개발되지 않았고; 따라서 관련 사망률 및 이환율 수준이 중요하다. NF-ĸB 신호전달은 IR-유도된 AKI의 과정에 깊이 관여하기 때문에, 엑소솜을 사용한 NF-ĸB 억제제의 전신 전달이 허혈성 AKI 과정을 경감시킬 수 있는지를 평가했다. EXPLOR 기술을 사용하여 광학적으로 제어된 엑소솜의 생합성을 통해, 엑소-srIĸB를 IRI 수술 전후에 마우스에 전달하고, 결과를 대조군 그룹의 결과와 비교했다. 그 결과는, 엑소-srIĸB 처리를 제공받은 마우스 그룹이 IR-유도된 AKI로부터 보호되었음을 나타냈고; 이는, 대조군 그룹보다 양호한 생화학적 및 조직학적 결과를 나타냈다. 엑소-srIĸB의 전신 전달은 허혈후 신장에서 NF-ĸB 신호전달을 억제했고, 이는 염증유발성 사이토카인/케모카인 및 부착 분자의 발현을 감소시키고, 아폽토시스를 경감시켰다. 마지막으로, NF-ĸB 처리는 신장 면역 세포 모집단에 영향을 미쳤고, 유세포 분석 및 면역형광 분석을 통해, 호중구, 단핵구/대식세포 및 T 세포를 포함한 복수 면역 세포 모집단 빈도의 현저한 감소가 관찰되었다.
IRI의 초기 과정에서, 염증유발성 캐스케이드 및 산화 스트레스는 NF-ĸB 경로 활성화를 초래하고, 이어서 세포 생존 및 염증의 조절을 유도한다. 저산소증/재관류의 초기 단계에서 높은 이동성 그룹 box 1, 열 충격 단백질 및 병원체-/손상-연관된 분자 패턴을 포함한 복수의 내인성 인자가 방출되고, 이러한 분자는 Toll 유사 수용체(TLR) 및 인터류킨-1 수용체(IL-1R) 등의 패턴 인식 수용체를 자극한다. 이 프로세스는 이후에 IĸB 키나제(IKK)를 활성화시켜 프로테아좀에 의한 IĸB 분해를 유도한다. 이어서, 헤테로이량체(예: p50/p65)는 사이토졸에서 핵으로 이동하고, 이들은 TNF-α, IL-1, IL-6 및 IL-8을 포함한 염증 매개인자의 전사를 촉진하고, 또한 NF-ĸB 신호전달을 추가로 촉진한다. 이들 염증유발성 캐스케이드는, IRI에 제공된 세뇨관 세포에서 아폽토시스를 유도하고 백혈구 이동/활성화를 촉진시킴으로써 주변 미세환경을 조절한다. 본 실험적 허혈성 AKI 모델은, 신장 IRI 후의 NF-ĸB 신호전달의 활성화를 재현할 수 있고, 이는 신장 면역 세포 모집단에 유의적으로 영향을 미치는 다발성 염증성 사이토카인/케모카인 및 조직 아폽토시스의 증가된 발현을 유도할 수 있다.
최근 실험 연구는, TLR 길항제, 사이토카인 길항제(33), IKK 복합체 길항제, 프로테아좀 억제제 및 다양한 기관에서 특정 NF-ĸB 복합체에 특이적인 디코이 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하여, NF-ĸB 신호전달의 선택적 약리학적 억제제를 사용하여, IRI에 대한 NF-ĸB 차단의 효과에 관한 보다 상세한 증거를 나타냈다. srIĸB는, 세린 잔기 32 및 36에 돌연변이를 갖는 비-분해성 IĸBα 단백질이다. 이 단백질은 NF-ĸB 핵 전좌 및 후속 NF-ĸB 신호전달을 방지한다. srIĸB는, 호중구 침윤 및 폐 부종을 감소시켜 폐 IRI 모델에서 보호 효과를 입증하고, 또한 화학저항성을 감소시켜 항-종양 효과를 갖는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 신장 손상의 과정에서 srIĸB 처리의 효과는 완전히 평가되지 않았다. 생명공학 엑소솜을 벡터로서 사용함으로써, 최 등(Choi et al)은, 최근 패혈성 AKI 모델에서 srIĸB 처리의 치료적 이점을 나타냈다. 하기 실시예는 또한, 신장 IRI 모델에서 엑소-srIĸB 처리의 보호 효과를 입증하고, 다양한 유형의 AKI에서 엑소솜을 통해 srIĸB 전달의 치료적 잠재력을 확장한다.
염증 프로세스 조절은, 허혈성 AKI의 분야에서 중요한 치료적 고찰이었다. 비장절제술 및 항-TNF-α 제제, 인플릭시맙의 사용은, 염증성 사이토카인 발현 및 대식세포/단핵구 축적을 저하시켜 실험적 허혈성 AKI 모델에서 보호 효과를 나타냈다. 백혈구 및 대식세포의 이동을 억제하는 것은 신장 기능을 보존하고, 세포 사멸을 경감시켰다. 제공된 예는, 엑소-srIĸB 처리가 염증유발성 사이토카인/케모카인 및 접착 분자의 발현을 하향조절하고, 아폽토시스를 감소시키며, IR-손상된 신장에서 다계통 면역 세포 축적을 경감시킨다는 것을 나타냈다. 이러한 결과는, 엑소-srIĸB가 염증유발성 캐스케이드 하향조절을 통해 허혈성 AKI의 과정을 변형시켜, 후속 백혈구 이동/활성화를 제한하고 아폽토시스를 방지한다는 것을 시사한다.
엑소솜은, 다른 유형의 벡터를 컨베이어로서 사용하는 것보다 몇가지 이점를 갖는다. 첫째, EV는 순환 중의 분해로부터 자연적으로 보호되고, 자가 사용되는 경우에 비-면역원성이다. 엑소솜은 또한, 이들의 고유한 세포 표적화 특성을 통해, 혈액-뇌 장벽 등의 천연 장벽을 극복할 수 있다. 추가로, 엑소솜은, 흡수, 세포 내 운송 및 표적 세포로의 카고의 최종 전달의 과정에서 수용자 세포의 고유한 메커니즘을 사용한다. 이러한 특성을 유지하면서, EXPLOR 기술은, 엑소솜으로부터 제어가능한 가역적 분리를 통해 카고 단백질의 세포 내 수준을 현저히 증가시킬 수 있었다. 치료 단백질의 세포 내 전달에는 낮은 정제 효율, 숙주에 대한 면역 반응의 유도 및 한정된 사이토졸 전달을 포함하여 몇 가지 기술적 장애가 있고, EXPLOR 기술을 사용한 이러한 신규한 엑소솜 전달 방법은, 이전 기술의 것과 비교하여, 엑소솜 로딩 성능, 전달 효율 및 순도를 현저히 개선시켰다. 하기의 실시예는, EXPLOR 기술을 사용한 엑소-srIĸB의 효율적 전달이 실험적 IRI 후에 신장 결과에 유의한 개선을 가져올 수 있음을 나타낸다.
전신 엑소-srIĸB 처리는, 신장 내의 면역 세포 모집단 빈도에만 영향을 미치지만, 비장 내의 것에는 영향을 미치지 않는다. 이는, 증식을 경감시키거나 아폽토시스를 촉진하는 신장 상주 면역 세포에 선택적으로 작용하거나, 손상된 신장으로의 비장 면역 세포의 유출을 차단하는 엑소-srIĸB의 전신 전달에 선택적으로 작용하는 엑소-srIĸB에 관여할 수 있다. 신장 상주 면역 세포 및 림프 기관으로부터의 면역 세포는, 상이한 기원, 표현형 및 기능적 특성을 갖는 것으로 공지되어 있다. 키메라 마우스 또는 생체 내 이미징을 사용한 추가 연구는, 체류 신장 면역 세포를 순환 면역 세포와 구별할 수 있고, 전신 엑소-srIĸB 처리에 의해 영향을 받는 면역 세포 모집단에 대한 보다 많은 정보를 제공할 수 있다.
활성 치료제의 카고를 전달하기 위한 담체로서 엑소솜을 사용하는 것은, IR-유도된 AKI 모델로 srIĸB를 전달하는 안전하고 효율적인 방법이다. 엑소-srIĸB 처리는, NF-ĸB 신호전달을 하향조절하고 허혈성 손상된 신장에서 염증 및 아폽토시스를 개선함으로써 마우스에서 IR-유도된 AKI를 경감시킨다. 엑소솜을 사용하여 표적 세포에 대한 면역억제 단백질의 직접 세포 내 전달은, IR-유도된 AKI의 유망한 치료 도구이고, 인간 신장 IRI에서 엑소-srIĸB의 치료 가능성은 추가로 탐색되어야 한다.
패혈증에 의해 유발된 질환
패혈증은, 다수의 장기 부전 및 과다한 염증 반응을 수반하고, 복잡한 병태생리학적 특징을 갖고, 모든 증상을 효과적으로 치료할 수 있는 치료제를 개발하는 것은 용이하지 않다. 패혈증은, 선천성 면역계의 강력한 활성화를 통해 개시되고, 병원체에 의한 패턴 인식 수용체(PRR)의 활성화에 의해 매개되어, 보체 시스템, 응고 시스템 및 혈관 내피의 활성화를 유도하여 정상적 항상성이 곤란하다.
본원의 실시예에서 제시된 바와 같이, 엑소-srIκB의 효과는, 패혈증 마우스 모델에서 NF-κB 활성의 억제를 통해 염증 반응을 해결하고 장기 손상을 감소시킬 수 있었다. srIκB는, NF-κB가 핵으로 유입되고 전사 인자로 작용하는 것을 방지하는 분해-불가능한 형태의 IκBα이다. 예를 들면, srIκB가 로딩된 면역억제성 엑소솜을 생성하기 위해, 기능성 단백질을 엑소솜에 탑재할 수 있는 최근 기술이 활용되었다. 패혈증 마우스 모델(예를 들면, 전신 전달)에서 엑소-srIκB를 전신에 전달함으로써, 본원의 실시예는, 엑소솜이 호중구 및 대식세포로 전달되고, 이는 패혈증 염증 반응의 주요 참가자인 것을 확인했다. 또한, 본 실시예의 양쪽 마우스 패혈증 모델에서, 엑소-srIκB 처리는, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 염증유발성 마커를 유의적으로 감소시켰지만, 항-염증성 사이토카인 IL-10을 감소시키지 않았다. 엑소솜을 LPS 주사 1시간 후에 주사한 경우에도, 엑소-srIκB의 유의한 치료 효과가 관찰되었다. 따라서, 엑소-srIκB에 의한 처리는 면역 억제 상태로 전환되기 전에 패혈증의 초기 단계에도 적용될 수 있다.
염증유발성 사이토카인은 패혈증에 의해 유발된 급성 신장 손상(AKI)에서 중요한 역할을 할 수 있다. 본원의 실시예에서 CLP 수술 또는 LPS 주사에 의해 유발된 AKI를 갖는 마우스 모델에서, 조직병리학적 검사의 결과로서, 사구체 구조가 파괴되고, 세뇨관 상피 세포가 축퇴되고, 중증 세포 내 부종 및 울혈이 패혈증-유도된 그룹의 세뇨관에서 발생했음을 확인했다. 그러나, 엑소-srIκB 투여는 병변의 중증도, 신장 손상 및 염증 세포의 침윤을 감소시켰다.
호중구의 조직 침윤은, 패혈증에서 주요한 프로세스일 수 있다. 예를 들면, 호중구를 고갈시키고 호중구의 동원을 억제하기 위한 특이적 부착 분자를 표적화하는 일부 연구에서는, 패혈증에서 조직 손상을 감소시킬 수 있고, 보호될 수 있는 것으로 보고되었다. TNF-α 및 IL-1β는, MCP-1 및 IL-8 등의 케모카인의 발현을 위한 주요 매개인자이고, 이는 염증 반응 동안 호중구 및 단핵구/대식세포에 대한 중요한 화학유인제이다. 이러한 케모카인은 활성화 후의 단핵구/대식세포의 국소 침윤을 개시한다. 그러나, HUVEC에서, 엑소-srIκB는 LPS-유도된 MCP-1 및 IL-8의 방출을 감소시키고, 이에 의해 단핵구/대식세포 침윤을 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 데이터는, 본원의 생체 내 연구에서 수득된 결과와 일치한다. 본 실시예에서, 엑소-srIκB 처리는 패혈증 동물 모델의 비장, 신장, 폐 및 간에서 호중구 침윤을 유의적으로 감소시켰다. 패혈증의 병태생리학에서 호중구의 중요한 역할을 고려할 때, 엑소-srIκB의 조직 보호 효과는, 적어도 신장에서 호중구의 침윤의 감소와 관련될 수 있다.
일부 실시형태에서, 비장은, 신장 및 간 등의 다른 장기와 비교하여, 높은 수준의 호중구를 나타낸다. 염증유발성 사이토카인은 비장에서 발생할 수 있고, 다른 장기에 영향을 미칠 수 있다. 염증유발성 사이토카인을 코딩하는 대부분의 유전자는, LPS에 의해 유발된 패혈성 염증 반응에서 중요한 전사 인자 중의 하나인 NF-κB의 조절하에 있을 수 있다. 엑소-srIκB 처리의 존재 또는 부재에 따라 NF-κB 반응 리포터 단백질의 발현을 본원의 실시예에서 조사했고, p65의 전좌를 확인했다. 엑소-srIκB는, NF-κB 아단위 p65의 핵 전좌를 차단함으로써 NF-κB 신호 활성화를 억제했다.
일부 실시형태에서, 엑소솜은, 패혈증 마우스 모델에서 면역억제 단백질의 치료적 전달을 위한 메커니즘으로서 사용될 수 있다. 엑소솜은, srIκB를 세포에 전달할 수 있는 우수한 담체일 수 있고, 패혈증의 치료를 위한 새로운 옵션을 제공할 수 있다. 면역억제 단백질을 생체 내에서 표적 세포에 직접 전달하는 방법은, 이전에 확립되지 않았지만, 본 개시 내용에 따른 엑소-srIκB는 NF-κB의 억제제로 작용하고, 이에 의해 염증-관련 유전자의 발현 및 직접 염증 반응을 억제한다. 본원의 실시예는, 이를 억제하여 패혈증의 염증유발성 사이토카인 폭풍 및 그로 인한 장기 손상을 경감시킬 수 있다.
지질다당류(LPS; 내독소 모델) 또는 맹장 결찰 및 천공(CLP, 다균성 모델) 중의 어느 하나에 의해 유도된 패혈증의 동물 모델에서 최근 연구는, 다양한 화학적 특성과 작용 메커니즘을 갖는 NF-κB 억제제가 패혈성 치사로부터 동물을 보호한다는 것을 입증했다. 700개 이상의 NF-κB 억제제가 보고되었지만, 현재까지 인간이 사용할 수 있도록 승인된 NF-κB 차단제는 없다. 다양한 스테로이드 및 비-스테로이드성 항-염증제가 NF-κB를 차단하는 것으로 밝혀졌지만, 이들의 효과는 매우 다면적(pleiotropic)이고 특이성을 결여한다. NF-κB 활성화 경로에서 핵심 요소의 특이적 억제를 목적으로 하는 신규한 치료 전략은 최근 개발 중에 있고, 패혈증에 의해 유발된 하나 이상의 질환에 대한 패혈증 치료 및 치료로서의 잠재적 효능에 대한 기대가 높다. 인산화 부위를 갖지 않는 조작된 IκBα 단백질을 발현하는 유전적 작제물, 슈퍼-리프레서 IκB(srIκB)도 또한 사용되었다. 특정 인산화 부위에서 IκBα 돌연변이(Ser32 및 Ser36이 Ala로 대체됨)는 연장된 반감기를 갖는 IκBα의 우성 활성 형태를 초래한다. 이러한 srIκB는 IκBα의 안정한 세포질 풀을 유도하고, 이에 의해 핵 NF-κB 활성화를 방지한다.
여기서, 엑소솜은, srIκB를 치료용 표적에 전달하는 치료용 컨베이어로서 이용되었다. 엑소솜은, 다양한 단백질 및 조절 유전자를 표적 세포로 이동시키는 강력한 치료 매개인자로서 인식되어 왔다. 이들은 비-면역원성 나노소포로 기능하고, 혈청 프로테아제 및 면역 반응으로부터 이들의 카고를 보호할 수 있다. 가용성 단백질을 엑소솜에 로딩하는 것은 EXPLOR로서 불리우는 기술에 의해 가능해졌고, 이는 자연적 엑소솜 생합성 프로세스 및 광유전학에 의해 제어되는 가역적 단백질-단백질 상호작용을 이용한다. 특정 표적 단백질을 엑소솜에 로딩하기 위해, 2개의 재조합 단백질, CIBN-EGFP-CD9 및 srIκB-mCherry-CRY2를 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포주가 생성되었다(도 1A). 이전 연구와 일치하여, EXPLOR 기술을 사용하여, srIκB 로딩된 엑소솜을 생산했다. srIκB 로딩 엑소솜은 엑소-srIκB로서 지정되었고, 무손상 HEK293T 세포로부터 생성된 엑소솜은 엑소-나이브로 지정되었다. 치료 목적으로 엑소-srIκB를 패혈증 모델에 적용함으로써, 패혈증-유도된 장기 손상은 개선되고, 염증유발성 사이토카인의 분비를 억제하고, 이에 의해 패혈증 환자의 전반적 생존율을 개선시켰다.
본 개시 내용은, 이를 필요로 하는 대상체에서 패혈증에 의해 유발된 질환을 치료하는 방법으로서, NF-κB 억제제를 포함하는 엑소솜을 포함하는 조성물의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.
실시형태에서, 질환은 폐렴, 사이토카인 폭풍 증후군, 호흡 곤란 증후군 및 장기 부전으로 이루어진 그룹으로부터 선택되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 질환은 폐렴이다. 일부 실시형태에서, 질환은 사이토카인 폭풍 증후군이다. 일부 실시형태에서, 질환은 호흡 곤란 증후군이다. 일부 실시형태에서, 질환은 장기 부전이다.
실시형태에서, NF-κB의 억제제는 NF-κB 억제 단백질, 이의 단편 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 실시형태에서, NF-κB 억제제는 슈퍼-억제제(SR)-IκB(srIκB), IκB-α, IκB-β, IκB-ε, BCL-3, 이들의 돌연변이체 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 실시형태에서, NF-κB 억제제는 슈퍼-리프레서(SR)-IκB(srIκB)이다.
실시형태에서, 조성물은 경구, 경피, 복강 내, 정맥 내, 근육 내, 피하 또는 혼합 경로를 통해 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 경구 경로를 통해 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 경피 경로를 통해 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 복강 내 경로를 통해 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 정맥 내 경로를 통해 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 근육 내 경로를 통해 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 피하 경로를 통해 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 혼합 경로를 통해 투여된다.
실시형태에 있어서, 방법은 항-염증제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
실시형태에 있어서, NF-κB 억제제를 포함하는 엑소솜은 광-특이적 결합 단백을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 86% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 87% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 88% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 89% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 91% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 92% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 93% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 94% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1로 표시된다.
일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 86% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 87% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 88% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 89% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 91% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 92% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 93% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 94% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2와 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 1로 표시된다. 일부 실시형태에서, NF-κB 억제제는 서열번호 2로 표시된다.
일부 실시형태에서, 광-특이적 결합 단백질은 제1 광-특이적 결합 단백질 및/또는 제2 광-특이적 결합 단백질이다. 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질은 엑소솜 특이적 마커에 접합되어 융합 단백질 I을 형성하고; 제2 광-특이적 결합 단백질은 NF-κB 억제제에 접합되어 융합 단백질 II를 형성한다. 실시형태에서, 융합 단백질 I 및 융합 단백질 II는 제1 광-특이적 결합 단백질 및 제2 광-특이적 결합 단백질을 통해 가역적으로 연결된다. 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질은 엑소솜 내측을 향한 방향으로 위치되도록 엑소솜 특이적 마커에 접합된다.
일부 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질 및 제2 광-특이적 결합 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 및 PHR로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질은 CIB이고, 제2 광-특이적 결합 단백질은 CRY이다. 일부 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질은 CIBN이고, 제2 광-특이적 결합 단백질은 CRY이다. 일부 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질은 CIB이고, 제2 광-특이적 결합 단백질은 PHR이다. 일부 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질은 CIBN이고, 제2 광-특이적 결합 단백질은 PHR이다.
일부 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질은 CRY 또는 PHR이고, 제2 광-특이적 결합 단백질은 CIB 또는 CIBN이다. 일부 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질은 CRY이고, 제2 광-특이적 결합 단백질은 CIB이다. 일부 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질은 CRY이고, 제2 광-특이적 결합 단백질은 CIBN이다. 일부 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질은 PHR이고, 제2 광-특이적 결합 단백질은 CIB이다. 일부 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질은 PHR이고, 제2 광-특이적 결합 단백질은 CIBN이다.
일부 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질은 PhyB이고, 제2 광-특이적 결합 단백질은 PIF이다. 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질은 PIF이고, 제2 광-특이적 결합 단백질은 PhyB이다.
일부 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질은 GIGANTEA이고, 제2 광-특이적 결합 단백질은 FKF1이다. 실시형태에서, 제1 광-특이적 결합 단백질은 FKF1이고, 제2 광-특이적 결합 단백질은 GIGANTEA이다.
일부 실시형태에서, 엑소솜 특이적 마커는 CD9, CD63, CD81 및 CD82로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 엑소솜 특이적 마커는 CD9이다. 일부 실시형태에서, 엑소솜 특이적 마커는 CD63이다. 일부 실시형태에서, 엑소솜 특이적 마커는 CD81이다. 일부 실시형태에서, 엑소솜 특이적 마커는 CD82이다.
일부 실시형태에서, 엑소솜은 약 50nm 내지 약 200nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 엑소솜은 약 50nm 내지 약 75nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 엑소솜은 약 75nm 내지 약 100nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 엑소솜은 약 100nm 내지 약 125nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 엑소솜은 약 125nm 내지 약 150nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 엑소솜은 약 150nm 내지 약 175nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 엑소솜은 약 175nm 내지 약 200nm의 직경을 갖는다. 실시형태에서, 엑소솜은 약 50nm 내지 약 150nm의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 엑소솜은 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150 이상의 직경 및/또는 약 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 이하의 직경을 갖는다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 생리학적으로 허용되는 담체 또는 담체들을 추가로 포함하는 약제학적 조성물이다.
EXPLOR ® 기술
최근, 엑소솜은, 유전자/약물 전달을 위한 신규한 바이오-담체로서 중요한 주목을 받았다. 엑소솜은, 생물활성 물질을 수용자 세포로 전달하거나, 표적 세포의 신호전달 경로에 영향을 미침으로써 세포 간 통신에서 중요한 역할을 하는 세포 외 소포(EV)이다. 엑소솜은 저장이 보다 용이하고 보다 큰 안정성을 나타낸다. 엑소솜은, 생물학적 장벽을 극복할 수 있는 높은 용량을 갖고, 특정 세포 유형을 표적화하는 표면 분자를 운반할 수 있으며, 따라서 오프-표적 효과가 보다 적다. 그러나, 엑소솜의 임상적 적용에서, 다량의 순수한 엑소솜을 수득하고 가용성 단백질을 엑소솜에 로딩하는 것은 중대한 과제였다. 임 등(Yim et al.)에 의해 개발된 신규한, 광유전학적으로 조작된 엑소솜 기술인 "광 가역적 단백질-단백질 상호작용을 통한 단백질 로딩을 위한 엑소솜"(EXPLOR)을 사용하여, 엑소솜의 생산 효율 및 생물학적 호환성에서 현저한 발전이 이루어졌다. 이 EXPLOR 기술은 최근 최 등(Choi et al.)에 의해 실험적 패혈증 모델에 채택되었고; 이들은 슈퍼-리프레서 IĸB(srIĸB)를 함유하는 엑소솜을 마우스에 전달했다. 이것은 NF-ĸB의 핵 전좌를 방지하는 카파 B(IĸB) 억제제의 비-분해성 형태였다. 이들의 연구는 엑소-srIĸB 처리가 마우스 패혈증 모델에서 전신 염증 반응 및 후속하는 장기 기능장애를 개선시켰음을 나타냈다.
실시예
동물: 수컷 C57BL/6J 마우스를, 연세 의료 센터의 중앙 동물 시설에서 특정 병원체 비함유 조건(specific pathogen-free condition)에서 사육시켰다. 모든 실험에 6-7주령의 수컷 마우스를 사용했다. 또한, C56BL/6, C57BL/6N, BALB/c 마우스는, 오리엔트바이오(Orientbio)(대한민국 성남)에서 구입했다. 호중구 및 대식세포에서 GFP를 본질적으로 발현하는 LysMGFP/+ 마우스는, Dr. M. Kim(University of Rochester, Rochester, NY, USA)에 의해 관대하게 제공되었다.
엑소솜 단리: 2개의 재조합 단백질, CIBN-EGFP-CD9 및 srIĸB-mCherry-CRY2를 발현하는 HEK293T 세포주를 사용하여 srIĸB 로딩된 엑소솜을 생산했다. 무손상 HEK293T 세포를 엑소-나이브의 생산에 사용했다. 안정한 세포를 37℃에서 24시간 동안 T175 플라스크에 파종했다. 배지를 제거한 후, 세포를 세척하고, 엑소솜 고갈된 배지에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 CO2 인큐베이터에서 460nm 발광 다이오드의 연속 청색광 조명에 노광시켰다. 72시간 후, 세포 배양 상청액을 회수하고, 원심분리하여 세포와 파편을 제거하고, 0.22μm 폴리에테르 설폰 필터를 통해 여과하고; 접선 유동 여과 및 크기 배제 크로마토그래피의 조합을 사용하여 엑소솜을 단리했다. 일부 실시예에서, 엑소-srIκB를 생산하기 위해, 안정한 세포를 T175 플라스크에 파종했다. 1일 후, 배지를 주의하여 제거하고, 세포를 PBS로 세정하고, 엑소솜 고갈된 배지를 첨가했다. 이어서, 세포를 CO2 인큐베이터에서 460nm 발광 다이오드의 연속 청색광 조명에 노광시켰다. 72시간 후, 세포 배양 상청액을 회수하고, 1,000g에서 15분 동안 원심분리하여 세포 및 세포 파편을 제거하고, 이어서 0.22㎛ 폴리에테르설폰(PES) 필터를 통해 여과하여 거대 입자를 제거했다. 엑소솜을 분자량 컷오프(MWCO) 기반 막 여과를 사용하여 단리했다. 단리된 엑소솜을 SEC로 정제했다.
투과 전자 현미경: TEM을 통해 EV의 형태를 관찰하기 위해, 5μL의 EV를 15초 동안 탄소-코팅된 구리 그리드(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)에 흡수시켰다. 과량의 액체를 제거한 후, 샘플을 2% 우라닐 아세테이트(Electron Microscopy Sciences)로 음성으로 염색했다. TEM 이미지는, 200kV에서 작동하는 Tecnai G2 Retrofit 전자 현미경(FEI company, Hillsboro, OR)을 사용하여 수득했다. 세포 외 소포(EV)는 음성 염색을 통해 형태학적으로 평가했다. 먼저, PBS에 현탁된 5μl의 EV를 글로우-방전 탄소-코팅된 구리 그리드(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA)에 로딩했다. 3 내지 5초 동안 샘플을 흡착한 후, 그리드를 여과지로 블로팅하고, 2% 우라닐 아세테이트(UA)로 염색했다. 이어서, 건조기를 사용하여 샘플을 20초 동안 건조시켰다. EV는 200kV의 전압에서 Tecnai G2 Retrofit(FEI Company, Hillsboro, OR, USA)으로 관찰했다.
나노입자 추적 분석: EV의 입자 수 및 크기 분포는 488nm 레이저가 내장된 제타뷰(Zetaview) 장치(PMX120, Particle Metrix, Germany)를 사용하여 NTA에 의해 측정했다. 제조업자의 지시에 따라서, 입자 비함유 PBS에서 샘플을 희석했다(혈청 1:100 내지 1:10000). 샘플을 25℃에서 카메라 레벨 78 및 셔터 80으로 일정한 유동 조건에서 분석했다. NTA에 의해 결정된 크기 분포는, 현탁액에서 EV의 유체역학적 직경에 상응한다. 브라운 운동 속도로부터 입자 수를 계산하고, 입자 운동 속도를 기반으로 2차원 스토크-아인슈타인 방정식을 사용하여 크기를 결정했다. 특정 샘플을 0.2μM 여과된 PBS에서 1:100 내지 1:10,000로 희석했다. EV 농도는 프레임당 50 내지 200개 입자 수를 기반으로 측정되었다. 각 측정에 대해, 11개 셀 위치에서 2사이클의 스캐닝을 하기 설정으로 수행했다: 초점, 자동 초점; 모든 샘플에 대한 카메라 감도, 78.0; 셔터, 70; 및 셀 온도, 25℃. EV 농도는 ml당 입자 수(pn/ml)로 표시했다.
면역 블롯팅: 세포를 Halt™ 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일(100X)(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 함유하는 RIPA 완충액에 용해시키고, 신장을 트리톤 X-100 용해 완충액에 용해시켰다. 용해물을 4℃에서 10-20분 동안 9,000 내지 16,000×g에서 원심분리시키고, 상청액을 후속 면역블롯팅을 위해 -70℃에 보관했다. 단백질 농도는, BCA 검정(Pierce™ BCA Protein Assay, Thermo Scientific TM)을 사용하여 측정했다. 단백질 추출물을 Laemmli 샘플 완충액(Bio-Rad, Hercules, CA)에 용해시키고, 100℃에서 5분 동안 가열했다. 단백질을 아크릴아미드 변성 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하여 니트로셀룰로오스(NC) 막으로 옮겼다. 트랜스퍼 막을 차단 완충액 A(PBS, 0.1% Tween-20 및 5% 무지방 밀크)에서 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션(incubation)한 다음, srIκB에 대한 1차 항체(맞춤형 항체, Abclon, 서울, 대한민국), mCherry, Alix, TSG101, GM130, 칼넥신(Abcam, Cambridge, UK), CD9, CD63(SBI, Tokyo, Japan), GAPDH(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX), 프로히비틴(NOVUSBIO, Centennial, CO), 뉴클레오포린 p62(BD bioscience, San Jose, CA), NF-κB(클론 8242S, Cell signalling technology, Danvers, MA), Lamin B1(Clone ab133741), ICAM-1(Clone AF796, R&D Systems), 절단된 카스파제-3(Clone 9661L, 세포 신호전달 기술), 절단된 PARP(클론 9544S, 세포 신호전달 기술) 및 β-액틴(A5441, Sigma-Aldrich)과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션했다. 막을 특정 2차 항체로 세척하고 인큐베이션한 후, 이들을 화학발광제[Clarity 및 Clarity Max ECL Western Blotting Substrates(Bio-Rad) 또는 West-Q Pico Dura ECL 용액(GenDEPOT, Katy, TX)]를 사용하여 발색시켰다. 이미지(Image) J 소프트웨어(NIH)를 사용하여 각 그룹에 대한 밴드의 상대적 광학 밀도를 측정했다.
마우스 신장 허혈-재관류 모델: 마우스를, 틸레타민/졸라제팜(Zoletil®)-자일라진(Rompun®) 혼합물(1mg/kg)의 복강 내 투여를 통해 마취시키고, 가열된 수술용 패드(37℃)에 위치시켰다. 양측 IRI는 배측 접근법을 사용하여 수행했다. 신장의 페디클을 해부하고, 마이크로 클램프(Jeungdo Bio & Plant, 서울, 대한민국)를 각 신장 페디클에 30분 동안 위치시켰다. 허위 동물은, 마취 및 양측 배측 절개를 단독으로 제공받았다. 수술 중, 마우스를 따뜻한 보통의 생리식염수 1ml로 수화시켜 탈수를 방지했다. 허혈 30분 후, 양 클램프를 모두 제거하고, Autoclip® 창상 폐쇄 시스템(Harvard apparatus, 매사추세츠주 홀리스턴)으로 창상을 폐쇄하기 전에 혈류 회복을 확인했다. 동물에게 음식 및 물에 자유롭게 접근시켜 회복시켰다. 마우스를 IRI 수술의 24시간 또는 48시간 후에 희생시켰다. 추가 분석을 위해 각 마우스에서 혈청, 비장 및 신장을 수집했다. Cobas C502 자동 분석기(Roche diagnostics, Basel, Switzerland)를 사용하여 혈청 BUN 및 크레아티닌 수치를 분석했다.
효소-결합 면역흡착 검정(ELISA): 샘플을 1:100 내지 1000배로 희석한 후에 제조업자의 프로토콜(마우스 리포칼린-2/NGAL 정량적 ELISA 키트)(R&D Systems, Minneapolis, MN)에 따라, 마우스 ELISA 키트를 사용하여 혈청 NGAL 수준을 측정했다.
THP-1 및 HUVEC 배양물에서 수집된 상청액의 TNF-α, IL-8 및 MCP-1 수준은, 시판 ELISA 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 측정했고, HUVEC에서 NF-κB 활성은 트랜스 AM NF-κB p65 키트(Active Motif, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 측정했다. 고급 CLP 절차 후에 지시된 시점에서 심장 천공을 통해 수집된 마우스 혈장 중의 TNF-α, CCL-4/대식세포 염증 단백질(MIP)-1β, IL-6 및 IL-1β 수준은 마우스 자기 루미넥스 이스크리닝 검정 키트(Magnetic Luminex eScreening Assay kit)(R&D Systems)를 사용하여 측정했다. 검정은 제조업자의 지시에 따라 수행했다. 모든 샘플 및 표준은, 루미넥스(Luminex) 200TM 시스템(Merck Millipore, Darmstadt, Germany)을 사용하여 이중으로 검정했다. 지시된 시점에서 혈청 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 CCL4를 측정하기 위해, LPS 내독소혈증 절차 후의 심장 천공을 통해 혈액 샘플을 수집하고, 실온에서 2시간 동안 응혈시키고, 이어서 4℃에서 20분 동안 2,000g으로 원심분리했다.
NE-PER 핵 및 세포질 추출: 신장을 수집하고, 소편으로 절단하고, PBS로 세정하고, 신장 중량에 따라 NE-PER 핵 및 세포질 추출 시약 키트(ThermoFisher, Waltham, MA)로부터 수득된 특정 용적의 세포질 추출 시약(CER) 1에서 비드로 균질화했다. 15초의 격렬한 와동 및 10분간의 빙상에서의 인큐베이션 후, CER II를 각 신장 샘플에 첨가한 다음, 빙상에서 1분 동안 인큐베이션하고, 16,000×g에서 5분 동안 원심분리했다. 상청액을 세포질 추출물로 수집하고, 불용성 분획을 핵 추출 시약에 현탁시켰다. 16,000×g에서 10분 동안 원심분리한 후, 모든 상청액을 수집하여 핵 추출물로서 사용했다.
신장 손상 점수 및 면역조직화학의 조직병리학적 평가: 포르말린-고정된 및 파라핀-포매된 신장 조직 샘플의 5마이크로미터 두께의 절편을 헤마톡실린-에오신(HE) 및 IHC 염색을 통해 처리했다. 조직학적으로 신장 손상을 평가하기 위해, 각 슬라이드를 HE로 염색했다. 신장 병리학자(JIY)는, 맹목적으로 피질 부위의 전체 관 중의 괴사 관의 비율을 점수화했다. 신장 손상은, 총 관 중의 손상된 관의 비율에 따라 점수화했다: 0, 정상; 1, <25% 손상; 2, 25 내지 50% 손상; 3, 50 내지 75% 손상, 4, 75 내지 90% 손상; 및 5, >90% 손상. 손상된 관에 대한 조직학적 기준은, 관 솔 가장자리의 손실, 액포화, 크로마틴 응축, 및 노출된 관 기저막을 포함했다. 일반적으로, 50-100개 관을 포함하는 5개의 랜덤으로 선택된 고출력 영역에서 세뇨관을 평가하고 점수화했다.
IHC의 경우, 조직 절편을 탈파라핀화하고, 에틸 알코올로 재수화하고, 수돗물로 세척했다. 블랙 앤 덱커(Black & Decker) 식물성 기선을 사용하여, 항원을 20분 동안 10mM 시트르산 나트륨 완충액에서 검색했다. 슬라이드를 22℃에서 30분 동안 10% 당나귀 혈청으로 차단하고, PBS를 사용하여 세척했다. NF-κB(Clone 8242S, Cell signalling technology, Danvers, MA) 및 ICAM-1(Clone AF796, R&D Systems)에 대한 1차 항체를, 소 혈청 알부민 중의 2% 카제인을 사용하여 적절한 농도로 희석하고, 슬라이드에 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션했다. 세척 후, 2차 항체(Dako, Carpinteria, CA)를 22℃에서 1시간 동안 적용했다. 디아미노벤지딘을 2분 동안 첨가하고, 헤마톡실린을 사용하여 슬라이드를 대조염색했다. 염색 강도의 반정량적 점수는, 400배의 배율하에 디지털 이미지 분석(MetaMorph version 4.6r5, Universal Imaging Corp., Downingtown, PA)를 통해 각 절편에서 적어도 5개의 필드를 조사하여 수득했다.
NF-κB의 DNA 결합 활성의 측정: 20㎍의 신장 핵 추출물을 사용하여, TransAM NF-κB 검정 키트(ActiveMotif, Carlsbad, CA)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 DNA에 대한 p65/c-Rel(NF-κB)의 결합 활성을 측정했다.
정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응: 전체 신장 RNA 추출의 확립된 방법을 사용했다. 간단히 말해서, 전체 신장 샘플을 700μl의 RNAiso 시약(Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, Japan)으로 균질화시켰다. 이어서, 160μl의 클로로포름을 신장 세포의 균질화된 샘플에 첨가했다. 이어서, 혼합물을 30초 동안 격렬하게 진탕시키고, 22℃에서 3분 동안 유지하고, 4℃에서 16,000×g에서 15분 동안 원심분리했다. 3개 상 상부에 위치한 수성 상을, 다른 상과의 오염을 방지하기 위해, 신선한 튜브로 주의하여 옮겼다. 400μl의 이소프로판올을 첨가하여 추출된 RNA를 침전시키고, 4℃에서 30분 동안 16,000×g에서 원심분리했다. RNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척하고, 2분 동안 공기 건조하고, 멸균된 디에틸 피로카보네이트 처리된 증류수에 용해시켰다. 추출된 RNA의 양 및 품질은 260 및 280nm의 파장에서 분광광도 측정으로 평가했다. 단리된 RNA를 cDNA 합성 키트(Takara Bio Inc, Shiga Prefecture, Japan)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 각 cDNA의 5μl를 10μl의 SYBR Green PCR 마스터 믹스(Master Mix)(Applied Biosystems, Foster City, CA) 및 5pmol의 센스/안티센스 프라이머와 혼합했다. 프라이머 농도는, 각 프라이머에 대한 최적 농도를 확인하는 예비 실험 후에 결정했다. IL-1α, IL-1β, Il-2, Il-4, Il-6, Il-10, Il-17α, Ccl2, Ccl3, Ccl5, Cxcl2, Ifn-γ, Tnf-α 및 Icam-1의 발현 수준은 ABI PRISM 7700 서열 검출 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 측정했다. PCR 조건은 다음과 같다: 초기 가열 단계는 95℃에서 9분 동안 수행한 다음, 94.5℃에서 30분 동안 35사이클의 변성, 60℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 1분 동안 신장, 72℃에서 7분 동안 최종 확장. 각 프라이머의 서열 데이터는 표 1에 제시되어 있다.
프라이머 서열
유전자 프라이머 유형 프라이머 서열 (5'에서 3' 방향으로)
Il-1α 전방 CCCGTCCTTAAAGCTGTCTG
역방 AATTGGAATCCAGGGGAAAC
Il-1β 전방 GCCCATCCTCTGTGACTCAT
역방 AGGCCACAGGTATTTTGTCG
Il-2 전방 CCCACTTCAAGCTCCACTTC
역방 ATCCTGGGGAGTTTCAGGTT
Il-4 전방 CCTCACAGCAACGAAGAACA
역방 ATCGAAAAGCCCGAAAGAGT
Il-6 전방 AGTTGCCTTCTTGGGACTGA
역방 TCCACGATTTCCCAGAGAAC
Il-10 전방 TGCTATGCTGCCTGCTCTTA
역방 TCATTTCCGATAAGGCTTGG
Il-17a 전방 TCCAGAAGGCCCTCAGACTA
역방 AGCATCTTCTCGACCCTGAA
Ccl2 전방 AGGTCCCTGTCATGCTTCTG
역방 TCTGGACCCATTCCTTCTTG
Ccl3 전방 CCTCTGTCACCTGCTCAACA
역방 GATGAATTGGCGTGGAATCT
Ccl5 전방 CCCTCACCATCATCCTCACT
역방 GAGCACTTGCTGCTGGTGTA
Cxcl2 전방 AGTGAACTGCGCTGTCAATG
역방 TCCAGGTCAGTTAGCCTTGC
Ifn- γ 전방 AAGACTGTGATTGCGGGGTT
역방 GCACCAGGTGTCAAGTCTCT
Tnf-α 전방 TATGGCTCAGGGTCCAATC
역방 CTCCCTTTGCAGAACTCAGG
Icam-1 전방 TTCACACTGAATGCCAGCTC
역방 GTCTGCTGAGACCCCTCTTG
18S 전방 CGCTTCCTTACCTGGTTGAT
역방 GGCCGTGCGTACTTAGACAT
각 샘플을 분리 튜브 중에서 삼중으로 실행하고, cDNA를 포함하지 않는 음성 대조군을 각 검정에 병행하여 실행했다. 실시간 PCR 후, 온도를 2℃/min의 속도로 60℃에서 95℃로 증가시켜 용융 곡선을 작성했다. 각각의 유전자의 발현 값을 18S rRNA의 값에 대해 정규화하고, 2-△△CT와의 비교 CT 방법을 사용하여 상대 배수 발현 값을 계산했다.
혈청 중의 다중 사이토카인 검정: IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, CCL2, CCL3, CCL5, CXCL2, IFN-γ 및 TNF-α를 포함하는, 13개 염증성 사이토카인 및 케모카인은, 1:2 희석된 혈청을 사용하여, 제조업체의 프로토콜(EMD Millipore, Billerica, MA)에 따라 밀리플렉스 마우스 사이토카인/케모카인 자기 비드 패널(Milliplex Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic bead Panel)-멀티플렉스 검정 키트를 사용하여 분석했다. 정량화는, 루미넥스(Luminex) 200 마이크로플레이트 판독기(EMD Millipore)를 사용하여 수행했다.
말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉-말단 표지 검정: 세포 사멸을, 시판 키트(S7110, Merck, Millipore, Billerica, MA)를 사용하여 FITC-표지된 TUNEL 검정으로 평가했다. 포르말린-고정된 신장 조직의 TUNEL-양성 세포는, 400배 확대로 디지털 이미지 분석(MetaMorph version 4.6r5, Universal Imaging Corp.)에서 각 섹션의 최소 5개 필드를 조사하여 확인했다.
마우스로부터의 신장 단핵 세포 및 비장 세포의 단리: KMNC는 확립된 프로토콜에 따라 단리했다. 양쪽 신장을 방혈 후에 제거하고, 탈캡슐화하고, 미세하게 다지고, 37℃에서 30분 동안 콜라게나제 유형 I(1mg/ml)(Worthington Biochemical, Lakewood, NJ)에서 인큐베이션했다. 효소 소화 후, 70μm 스트레이너(BD bioscience, San Jose, CA)를 통한 조직의 기계적 파괴에 의해 단일-세포 신장 현탁액을 달성했다. 제조업자의 지시에 따라, 등장성 퍼콜 밀도 구배(GE Healthcare, Chicago, IL)(브레이크 오프 모드에서 30분 동안 1,500×g)를 사용하여 RT에서 원심분리한 후에 KMNC를 수집했다. 수집된 세포를 세척하고, 5% FBS를 포함하는 RPMI 배지에 재현탁하고, Countess® II FL 자동화 세포 계수기(Life Technologies, Waltham, MA)를 사용하여 자동적으로 계수했다.
비장 세포는 70㎛의 스트레이너(BD bioscience)를 사용하여 비장의 기계적 파괴를 통해 수집하고, RBC 용해 용액(Qiagen, Hilden, Germany)과 함께 3분 동안 인큐베이션하여, 적혈구를 제거한다.
신장 CD4+ T 세포의 FACS 선별: FACS 선별을 위해, KMNC를 항-CD16/CD32 Fc 블럭(클론 93, Biolegend, San Diego, CA)와 함께 빙상에서 10분 동안 사전-인큐베이션하고, 모노클로날 Ab 항-CD45(APC, Clone 30-F11, Biolegend), 항-Ly6G(APC-Fire750, Clone 1A8, Biolegend), 항-Ly6C(FITC, Clone HK1.4, Biolegend), 항-F4/80(PerCP -Cy5.5, Clone BM8, Biolegend) 및 항-CD3(PE, Clone 17A2, Biolegend)로 4℃에서 30분 동안 염색했다. FACS 완충액(5% FBS를 포함하는 PBS)에서 세척 및 재현탁 후, FACS Diva 소프트웨어(BD Biosciences) 및 FlowJo 소프트웨어(버전 10.2)를 사용하여 염색된 세포를 LSRII로 분석했다. 파편/치사 세포 및 이중선을 제거한 후, 각 샘플을 CD45, Ly6G, Ly6C, F4/80 및 CD3 발현에 기초하여 분석했다. OneComp eBeads(ThermoFisher)를 보정에 사용했다.
면역형광: 탈파라핀화, 재수화 및 항원 검색을 수행한 후, 슬라이드를 22℃에서 30분 동안 10% 염소 혈청으로 차단하고, 인산염 완충 식염수를 사용하여 Tween-20으로 세척했다. Ly-6G(Clone ab25377, Abcam, Cambridge, UK), Ly-6C(Clone ab15627, Abcam), F4/80(Clone ab6640, Abcam) 및 플루오레세인(FITC)-접합된 로투스 테스라고놀로부스 렉틴(LTL)(Clone FL-1321, Vector laboratories, Burlingame, CA)에 대한 1차 항체를 소 혈청 알부민 중의 2% 카제인을 사용하여 적절한 농도로 희석하고, 슬라이드에 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션했다. 세척 후, 염소 항-랫트 IgG Alexa Fluor 647(ab150167, Abcam)을 22℃에서 1시간 동안 적용했다. 이어서, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(MBD0015, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 사용하여 슬라이드를 대비염색했다. 염색 강도는, 디지털 이미지 분석(MetaMorph version 4.6r5, Universal Imaging Corp.)을 통해 400배 배율로 각 섹션에서 최소 5개 필드를 조사하여 반-정량적으로 점수화했다.
통계: 데이터는, 평균치±표준 편차(SD) 값으로 표시했다. 통계적 차이는, Prism 8(GraphPad, San Diego, CA)을 사용한 본페로니 사후 시험을 사용한 일방향 ANOVA를 사용하여 분석했다. P<0.05의 경우, 결과는 통계학적으로 유의한 차이를 나타냈다.
LPS의 내독소혈증 모델: LPS 내독소혈증의 마우스 모델을 생성하기 위해, 에스케리키아 콜라이(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, USA)로부터 유래하는 LPS를 수컷 마우스에게 주사했다.
고급 CLP 패혈증 모델 및 치료 섭생: ORIENTBIO(대한민국 경기도 성남시)에서 구입한 수컷 C57BL/6 마우스는, 작은 변경을 수반하는 이전에 기재된 절차를 사용하여 9-10주령에서 고급 CLP에 제공했다. 모든 마우스를 수용하고, 국제 실험 동물 관리 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)에 의해 승인된 연세대학교 의과대학 생의학 연구소의 특정 병원체-비함유 지역에서 실험을 수행했다. 마우스를, 모든 절차 전에, 80mg/kg 케타민 및 10mg/kg 자일라진 혼합물의 ip 주사를 통해 마취했다. 마취 후, 복막을 무균 방식으로 개봉하고, 맹장을 원위 말단에서 4-0 검은색 명주 실 1cm를 사용하여 결찰하고, 23게이지(gauge) 니들로 천공했다. 천공 후, 니들을 제거하고, 양쪽 천공을 통해 소량의 대변을 압출하여 개통성을 확보했다. 이어서, 맹장을 복강 내에 다시 넣고, 복부의 절개부를 6-0 나일론 봉합사로 봉합하고, 스테인리스 스틸 제거가능한 창상 클립을 피부에 사용했다. 이 절차 후, 체중 20g당 예열된 식염수 1ml를 피하 투여했다. 허위 처리된 마우스는, 맹장의 결찰 및 천공을 제외하고는 동일한 절차를 거쳤다. 이 절차 후, 1.0×109 입자의 엑소-나이브 또는 엑소-srIκB를 0, 6, 12 및 18시간에서 ip 주사를 통해 마우스에게 투여했다. 대조군으로서, 동일 용적의 인산염 완충액(PBS)을 동일한 방식으로 주사했다. 동물을 CLP후 초기 48시간 동안은 2시간마다 평가하고, 이어서 5일 동안은 4시간마다 평가했다. 샘플을 수집하여, CLP후 18시간 이내에 절차의 결과를 평가했다.
생체 내 이미징: 레이저-스캐닝 생체 내 공초점 현미경(IVM-C; IVIM Technology, 대전, 대한민국)을 사용하여, 엑소-srIκB의 생체분포 및 항-부패 효과를 가시화했다. 생체 내 이미징 동안, 호모에오써믹 제어기(homoeothermic controller)를 사용하여 마우스 체온을 37℃로 유지했다. 마우스를 졸레틸(30mg/kg) 및 자일라진(10mg/kg)의 근육 내 주사로 마취시켰다. 간, 비장 및 신장을 포함한 내부 장기에 접근하기 위해, 피부 및 복막 모두에 10mm의 작은 절개를 수행했다. 노출된 장기는, 이미징 중에 식염수를 반복적으로 적용하여 수화 상태로 유지했다. 엑소솜의 생체분포를, 엑소-나이브 또는 엑소-srIκB 주사 전후에 광역 z-스택(stack) 이미징을 통해 가시화했다. 생체 내에서 C57BL/6N 마우스의 호중구를 형광 표지하기 위해, Alexa Fluor 555(A20009; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)와 접합된 항-Ly6G 항체(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 정맥 내 주사했다. mCLING ATTO 647N(Synaptic System, Gottingen, Germany)으로 표지된 나이브 또는 srIκB 엑소솜을 꼬리 정맥 카테터 또는 31-G 인슐린 주사기를 통해 정맥 내 주사했다. 패혈증 모델을 생성하기 위해, 이미징 전에 1 내지 16시간 고용량 LPS(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 정맥 내 주사했다.
공초점 현미경검사: 엑소솜 흡수 분석을 위해, 엑소솜을 둘베코 PBS(DPBS) 0.5㎖로 희석했다. 이어서, 제조자의 지시에 따라, 현탁액을 647N-표지된 mCLING-ATTO(시냅틱 시스템)와 함께 인큐베이션했다. 이어서, 원심분리를 통해 혼합물의 펠렛을 수득하고, 300μl의 재현탁된 펠렛을 HUVEC와 함께 인큐베이션했다. 24시간 후, 세포를 DPBS로 세척하고, 4% 파라포름알데히드 용액에 고정시켰다. Hoechst는 핵 염색에 사용되었다. 자이쯔(Zeiss) 710 공초점 현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 이미지를 기록했다.
루시페라아제 검정: HEK293 세포를, NF-κB의 반응 요소(SL-0012; Signosis, Santa Clara, CA, USA)하에 조절된 루시퍼라제 수용체 작제물로 안정하게 형질감염시키고, 제조업자의 지시에 따라 성장시켰다. 세포를 37℃에서 24시간 동안 엑소솜으로 처리하고, SpectraMax ID3 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정했다(E1501; Promega, Madison, WI, USA).
유세포 분석: HUVEC 상에서 발현된 표면 마커의 수준을 유세포 분석을 이용하여 평가했다. 세포를 분리하고, 원심분리를 통해 수확하고, 인간 ICAM-1(BD Biosciences)에 특이적인 피코에리트린(PE)-접합된 항체로 암 상태에서 30분 동안 빙상에서 표지하고, 이어서 광범위하게 세척했다. 모든 샘플을 BD Celesta 유세포 분석기(BD Biosciences)로 분석했다. 데이터는 BD FACSDiva 소프트웨어를 사용하여 분석했다. IgG1κ(BD Biosciences)에 특이적인 PE-접합된 항체를 이소형 대조군으로 사용했다.
실시예 1. 조작된 엑소솜의 특성화 및 분석
엑소솜의 제조, 회수 및 정제는, 도 13에 도시된 바와 같이, 이전 연구에서 완전히 기재되어 있다. 입자의 크기는 대부분 30 내지 120nm이고, 평균 크기는 101nm이다. 투과 전자 현미경(TEM)은, 나노입자 추적 분석(NTA) 결과에 따라 크기를 갖는 무손상 컵 형상의 막 소포를 나타냈다(도 1, B 및 C). 엑소-srIκB에 대한 면역블롯팅 분석 결과는, CD63, TSG101, Alix 및 GAPDH 등의 양성 엑소솜 마커를 갖는 srIκB, mCherry, CD9 및 GFP를 포함한 표적 단백질의 강력한 발현을 나타냈다. 엑소-srIκB는, 프로히비틴, 칼넥신, GM130 및 뉴클레오포린 p62를 포함한 세포 소기관 마커의 발현을 결여했다. 엑소-나이브는 엑소솜 마커를 제외한 어떤 마커도 발현하지 않았다(도 1D).
실시예 2. 엑소-srIĸB의 주사는 신장 허혈-재관류 손상을 개선한다
먼저, 신장 IRI 과정에서 엑소-srIĸB의 역할을 조사했다. 각 실험 그룹을 3×109 pn의 엑소-srIκB 또는, 신장 IRI의 전후에, 엑소-나이브를 1시간 간격(합계 9×109 pn)으로 3회 복강 내 주사했다. (전처리: IRI 수술 전에 3, 2 및 1시간, 후처리: IRI 수술 후에 1, 2 및 3시간). 마우스를 수술 24 또는 48시간 후에 희생시켰다(도 2A).
흥미롭게도, 엑소-srIĸB를 제공받은 마우스 그룹은, 전처리 및 후처리 모델(24-h/48-h BUN 및 양 모델에서 크레아티닌, P<0.001) 둘 다에서, IRI 수술 후에 엑소-나이브 주사 그룹보다 혈청 혈액 우레아 질소(BUN) 및 크레아티닌의 현저히 보다 낮은 수준을 나타냈다(도 2B 및 2C). 혈청 호중구 젤라티나제-연관된 리포칼린(NGAL) 수준은, 엑소-나이브 그룹과 비교하여, 전처리 및 후처리 모델의 엑소-srIĸB 주사 그룹에서 유의적으로 감소했다(P<0.001)(도 2D). 조직학적 평가 결과는 또한, 전/후 처리 모델에서, 엑소-나이브 그룹과 비교하여, 엑소-srIĸB 치료를 제공받은 마우스 그룹에서 보다 낮은 관 손상 점수를 나타냈다(P<0.05 대 엑소-나이브 주사 그룹)(도 2E). 종합적으로, 이러한 데이터는 엑소-srIĸB의 전신 전달이 허혈성 AKI의 진행을 직접 예방한다는 것을 나타낸다.
실시예 3. 전신 엑소-srIĸB 처리는 IR-손상된 신장에서 신장 NF-ĸB 신호전달을 억제한다.
전신 엑소-srIĸB 처리가 IR-유도된 AKI 과정에 영향을 미치는 근본적 메커니즘을 이해하기 위해, 엑소-srIĸB의 전신 전달을 먼저 연구하여, 신장에서 국소 NF-ĸB 신호전달을 억제하는지의 여부를 결정했다. 각 상이한 실험 그룹의 신장 핵 추출물 중의 NF-ĸB p65 단백질의 발현은 웨스턴 블롯팅을 통해 측정했다. 9×109 pn의 엑소-srIĸB를 사용한 전신 처리는, 엑소-나이브-처리 그룹에서 발견된 것과 비교하여, IRI 전(IRI 24시간 후, P<0.05; 48시간, P<0.01) 및 IRI 후(IRI 24-/48시간 후, P<0.01)(도 3A) 처리 모델에서 IR-유도된 NF-ĸB 핵 전좌를 감소시켰다. 이 발견은, 각 실험 그룹의 신장 핵 추출물을 사용하여 p65의 DNA 결합 활성을 측정함으로써 재확인되었다. 엑소-srIĸB 처리는, 처리 시점(전처리: IRI 24-/48-시간 후, P<0.05; 후처리: IRI 2-/48-시간, P<0.01)과 무관하게, 엑소-나이브 그룹과 비교하여, 신장 IRI 후에 NF-ĸB의 DNA 결합 활성을 유의적으로 하향조절했다(도 3B). NF-ĸB 면역조직화학(IHC) 염색을 통한 추가 검증은, 대조군 처리 그룹과 비교하여, 엑소-srIĸB 처리 그룹에서 NK-ĸB의 발현이 유의적으로 감소한 것으로 나타났다(전처리: IRI 24시간 후, P<0.05; 48-h, P<0.001 및 후처리: IRI 24-/48-h 후, P<0.05)(도 3C). 따라서, 전신 엑소-srIĸB 처리는 IR 후의 신장에서 신장 NF-ĸB 신호전달을 감소시킬 수 있다.
실시예 4. 엑소-srIκB는 허혈후 신장의 염증을 개선한다.
전신성 엑소솜 srIκB 처리가 신장 IRI-유도된 염증을 국소 경감시키는지의 여부를 추가로 조사하기 위해, 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)을 통해 IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, Il-10, Il-17 α, Ccl2, Ccl3, Ccl5, Cxcl2, Ifn-γ 및 Tnf-α를 포함하는 중추 염증성 매개인자의 유전자 발현 수준을 결정했다. IRI 전에 엑소-srIĸB의 9×109 pn을 사용한 처리는, IR-손상된 신장에서 Ex-나이브-처리된 그룹의 것과 비교하여, Il-1β, Il-6, Tnf-α, Ccl2, Ccl5 및 Cxcl2의 발현 수준을 유의적으로 억제시켰다(도 4A). 다중 사이토카인 분석은 또한, 상이한 실험 그룹의 혈청을 사용하여 수행했다. 결과는 신장 전사 데이터보다 유의적이지 않았지만, 대조군 그룹에서의 것과 비교하여, 엑소-srIκB 처리 그룹에서 IL-6, TNF-α, CCL2, CCL5 및 CXCL2를 포함한 염증성 사이토카인의 발현이 감소하는 명백한 경향이 있었다(도 4B).
추가로, 부착 분자의 발현에 대한 엑소솜 srIκB의 처리의 효과는, 처리 그룹 중에서 전사/번역 세포 내 부착 분자 1(ICAM-1) 수준을 비교함으로써 평가했다. qRT-PCR 결과는, 전/후-처리의 모델 모두에서 엑소-srIκB 처리 그룹에서 엑소-나이브 처리보다 유의적으로 낮은 수준의 Icam-1 발현을 나타냈다(도 4C). 이 결과는, 웨스턴 블롯팅 및 IHC 염색을 통해 번역 수준에서 재현되었다(도 4, D 및 E). 따라서, 전신 엑소-srIĸB 전달은, IR-유도된 AKI에서 염증유발성 사이토카인/케모카인 및 부착 분자의 발현을 하향조절할 수 있다.
실시예 5. 엑소-srIκB는 허혈후 신장에서 아폽토시스를 경감한다.
프로그램 세포 치사를 조절할 때에 NF-ĸB의 공지된 역할에 기초하여, 엑소-srIĸB가 허혈후 신장에서 아폽토시스에 어떻게 영향을 미쳤는지를 조사했다. 신장 IRI 수술은 신장 세포에서 유의한 아폽토시스를 유도했고, 이는 웨스턴 블롯 분석에서 절단된 카스파제-3 및 절단된 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제(PARP) 수준의 급격한 증가를 나타냈다. 손상 전/후에 엑소-srIĸB의 전신 전달은, 절단된 카스파제-3 및 절단된 PARP의 발현 수준을 실질적으로 하향조절할 수 있고, 이는 엑소-srIĸB가 허혈후 신장에서 아폽토시스에 대한 보호 효과를 갖는 것을 시사한다(도 5A). 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉-말단 표지(TUNEL) 염색을 사용하여 신장 세포 손상의 정도를 결정했다. 대조군과 비교하여, 엑소-srIĸB 처리된 신장은 전/후-처리 모델에서 유의적으로 적은 수의 TUNEL 양성 세포를 나타냈다(도 5B).
실시예 6. 신장 허혈-재관류 손상 후의 엑소솜의 생체분포
신장 IRI 모델에서 엑소-srIĸB의 생체분포는, 세포 유형이 허혈후 신장에서 엑소-srIĸB의 보호 효과를 조율하는 것을 보다 잘 이해하기 위해 조사했다. 마우스에게, IRI 수술 1시간 전에 플루오로크롬-표지된 Ly6G 및 F4/80 항체를 정맥 내 주사하고, 재관류 1시간 후에 9×109 pn의 엑소-srIκB를 정맥 내 주사했다. 생체 내 이미징은 재관류후 10분, 5시간 및 24시간에 수행했다(도 6A). 호중구를 가시화하기 위한 항-Ly6G 항체(Fluor 555) 및 대식세포를 가시화하기 위한 항-F4/80 항체(Fluor 488) 뿐만 아니라, DiD-표지된 엑소솜 주사후의 생체 내 이미징은 엑소-srIĸB 및 엑소-나이브 모두 허혈후 신장에서 호중구(Ly6G+) 및 대식세포(F4/80+)에 의해 흡수된다는 것을 확인했다(도 6B). 본 발명자들은, IRI 후의 세뇨관에서 DiD(녹색) 신호의 경미한 증가를 관찰하고, 세뇨관 세포에 의한 엑소솜 흡수 가능성을 높였지만, 신호 강도는 DiD-표지된 엑소솜 주사전의 것과 유의적으로 상이하지 않았다(데이터는 제시되지 않음). 비장은 동시에 관찰되고, 이는 외부 실질 영역의 호중구 및 대식세포에서 엑소솜 흡수를 나타냈다(도 6C). 내부 실질 영역은 유의한 흡수를 나타내지 않았다(데이터는 제시되지 않음).
실시예 7. 엑소-srIĸB의 전신 전달은 신장 IRI 후에 신장 면역 세포 모집단에 영향을 미친다
면역 세포는, 허혈성 AKI의 과정에서 중요한 역할을 제공하는 것으로 공지되어 있고; 따라서, IRI 수술 전에 엑소솜 srIĸB 처리를 제공하는 것이 각 면역 세포 유형의 모집단에 영향을 미치는지를 평가했다. 허혈성 AKI의 24시간 후, 실험 그룹 사이의 기계적 파괴, 효소 분해 및 퍼콜 밀도 구배 방법의 복수의 단계를 통해 단리된 신장 세포의 총 수에 대한 차이는 없었지만, 엑소-srIĸB 처리 그룹은, 엑소-Niave-처리된 그룹의 것보다 신장 단핵 세포(KMNC)의 유의적으로 낮은 빈도를 가졌다(P<0.05)(도 7, A 및 B). 추가 분석은, 엑소-srIĸB 주사 그룹이 엑소-나이브 주사 그룹의 것보다 총 KMNC 중의 호중구(CD45+Ly6G+)(P<0.01), 프로/항-염증성 단핵 식세포(CD45+Ly6C+/CD45+F4/80+)(각각 P<0.01/P<0.05), 및 T 세포(CD45+CD3+) (P<0.05)의 유의적으로 낮은 빈도를 갖는 것을 나타냈다(도 7C). IR 손상 신장의 면역형광의 결과는 또한, 엑소-srIĸB 주사 신장에서 호중구 및 단핵 식세포 빈도의 감소를 나타냈다(도 7D). 그러나, 엑소-srIĸB 처리는, 허혈성 AKI 후의 비장의 총 면역 세포 수 또는 빈도에 유의한 영향을 미치지 않았다. 엑소-srIĸB 및 엑소-나이브 처리 그룹 사이에서 T 세포(CD45+CD3+)를 제외하고, 총 면역 세포(CD45+), 호중구(CD45+Ly6G+), 프로/항-염증 단핵 식세포(CD45+Ly6C+/CD45+F4/80+)의 총 세포 수 및 빈도의 차이는 없었다. 이는, 허혈성 AKI의 전에 전신 엑소-srIĸB 처리가 신장 면역 세포 증식/수송에 현저한 국소적 영향을 미치지만, 비장 면역 세포에는 현저한 국소적 영향을 갖지 않는 것을 확인한다.
실시예 8. 엑소-srIκB의 정맥 내 전달
복강 내 엑소솜 전달에서 유사한 보호 효과가 정맥 내 전달로 발견되는지의 여부를 검증하기 위해, 정맥 내 주사 방식을 사용하여 일부 실험을 반복했다. 개선된 생화학적 결과, 게다가 엑소-srIĸB의 정맥 내 전달에 의한 NF-ĸB 신호전달 및 ICAM-1 발현의 감소된 수준은 도 8에 도시된 바와 같이 재현되었다. 따라서, 엑소-srIκB 결과의 정맥 내 전달도 허혈성 AKI 모델에서 복강 내 전달과 비교하여 유사한 생물학적 효과를 초래한다.
실시예 9. srIκB-로딩된 엑소솜의 추가 특성화 및 분석
충분한 엑소솜을 생산하기 위해, 각각의 세포 유형으로부터 배양 배지를 수집했다.
HUVEC는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 10% 태아 소 혈청(FBS; Atlas Biologicals, Fort Worth, CO, USA), 헤파린(Sigma-Aldrich), 내피 세포 성장 보충제(BD Biosciences) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Thermo Fisher)을 포함하는 F-12K 배지(ATCC)에서 배양했다. 제3 내지 제6 계대배양 사이의 HUVEC를 모든 실험에 사용했다. 인간 단핵구(THP-1)를 ATCC로부터 구입하고, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 0.05mM 2-머캅토에탄올(Sigma-Aldrich)가 첨가된 RPMI 1640 배지(Welgene, Daegu, Korea)에서 배양했다.
접선 유동 여과(TFF) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)의 조합을 사용하여 엑소솜을 단리했다(도 13A). 결합 능력을 초과하는 불순물이 SEC 컬럼에 로딩되는 위험을 감소시키기 위해, 샘플을 TFF를 통해 정용 여과(diafiltration) 및 농축시켰다. TFF 후, 농축된 배지를 추가 정제를 위해 SEC 컬럼에 로딩했다. 이어서, 제2 TFF를 수행하여 엑소솜을 농축시켰다. 순차적 정제를 통해 단리된 각 유형의 엑소솜은 나노입자 추적 분석(NTA)을 통해 분석되었으며, 이로써 엑소솜의 크기 및 농도를 특성화했다(도 13B). 직경이 30~120nm인 입자가 모든 입자의 80% 이상을 차지하며 평균 크기는 101nm으로 나타났고, 이는 엑소솜의 특징적 크기 범위(30~120nm)와 일치한다. 또한, 투과 전자 현미경(TEM)은, 엑소-나이브 및 엑소-srIκB로부터 수득된 NTA 결과에 상응하는 크기를 갖는 무손상 컵-형상의 막 소포(intact cup-shaped membrane vesicles)를 나타냈다(도 9B). 본 발명의 제제에서 엑소솜을 추가로 특성화하기 위해, 2개의 일반적 엑소솜 마커를 조사했다. 이들은 웨스턴 블롯팅을 통해 테트라스파닌 CD63 및 TSG101이었다.
이전 연구에서 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯팅을 수행했다. 하기 단백질을 표적화하는 항체를 사용했다: IκBα(CST4812; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), p65(CST6956S; Cell Signaling Technology), CD9(NBP2-22187; NOVUSBIO, Centennial, CO, USA), CD63(EXOAB -CD63A-1; SBI, Tokyo, Japan), TSG101(ab228013; Abcam, Cambridge, UK), GM130(ab52649; Abcam), GAPDH(sc-47724; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), Histone H3(ab1791; Abcam), mCherry(ab125096; Abcam) 및 GFP(CST2555; Cell Signaling Technology).
CD63 및 TSG101의 존재는 샘플에서 명확하게 관찰되는 반면, 골지 유래 오염물질 GM130은 세포 용해물에서만 검출되었다(도 9C). 엑소솜 제제의 이러한 분석은 이들이 엑소솜의 특성을 나타내는 것을 보여준다. 또한, srIκB 안정한 세포주로부터 단리된 엑소솜에 srIκB-mCherry-CRY2(130kDa)가 강력하게 로딩되는 것을 관찰했다.
실시예 10. 엑소-srIκB는 패혈증 마우스에서 생존을 개선시키고 급성 기관 손상을 완화시킨다
엑소-srIκB의 복강 내(i.p.) 주사가 내독소 충격(endotoxic shock)으로부터 보호하는 효과가 있는지의 여부를 조사했다. 동물에 치사량의 LPS(C57BL/6의 경우 40mg/kg 체중, BALB/c의 경우 20mg/kg 체중)로 단일 i.p 주사 후, 엑소-srIκB를 단일 i.p. 주사했다(6시간 간격). LPS-유도된 패혈증으로 인한 사망률이 100%인 대조군 C57BL/6 마우스와 비교하여, 엑소-srIκB로 처리된 마우스는 LPS-유도 사망률에 현저하게 내성을 나타내고; 마우스 대부분은 패혈증에서 치유(rescue)되어 연장된 생존을 나타냈다(도 10A, 상부). 엑소-srκB-매개 효과는 LPS-유도된 온도 강하로부터 적당한 보호와 관련이 있었다(도 14A). BALB/c 마우스를 사용하여 LPS-유도된 패혈증의 마우스 모델을 개발했다. 엑소-srIκB 처리는 BALB/c 마우스에서 LPS-유도된 패혈증의 생존율을 유의적으로 개선시켰다(도 10A, 중간). 이어서, 복부 패혈증의 표준화된 마우스 모델로 CLP-유도된 패혈증 모델을 이용하여, 생존에서 엑소-srIκB의 역할을 조사했다. 동물은 7일 모니터링 기간 동안 생존하였으며, 이는 엑소-srIκB가 패혈증 사망률에 대해 지속적 보호를 제공함을 나타낸다(도 10A, 하부). 엑소-srIκB 처리가 패혈증에 의해 유도된 염증을 완화시키는지의 여부를 추가로 조사하기 위해, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)을 사용하여 혈청에서 주요 염증 인자의 농도를 결정했다. LPS-유도된 패혈증을 갖는 엑소-srIκB 처리 그룹에서 염증유발성 사이토카인 TNFα, IL-1β 및 IL-6 및 케모카인 사염화탄소(CCL4)의 발현 수준이 유의적으로 감소하는 것이 관찰되었다(도 10B, 상부). 또한, CLP 그룹에서 TNF-α 및 CCL4의 혈청 수준이 허위 조작 대조군 마우스의 혈청 수준보다 유의적으로 높게 관찰되었으나, CLP 및 엑소-srIκB 모두가 처리된 마우스에서는 상승하지 않았다(도 10B, 하부). 이러한 결과는 엑소-srIκB가 LPS 또는 CLP에 의해 유도된 염증을 완화시키고 급성 염증 프로세스로부터 패혈증 마우스를 보호한다는 것을 시사한다.
다수의 연구는, 급성 신손상(AKI)이 패혈증의 빈번하고 심각한 합병증으로, 패혈증의 50% 이상의 사례에서 발생하며, 사망률이 매우 높은 것으로 밝혀냈다. 패혈증 마우스 모델에서 CLP-유도된 AKI에서 엑소-srIκB의 역할을 결정하기 위해, 신장 조직학적 검사를 수행했다. 허위 수술을 수행한 그룹과 비교하여, 인산염 완충된 식염수(PBS)로 처리된 마우스 및 엑소-나이브 마우스의 세뇨관 세포는 액포화, 솔 가장자리의 상실, 및 관 상피 세포의 핵 응축과 관련하여 상당한 손상을 나타냈다(도 10C). 특히, 엑소-srIκB 처리는 관 부위에 대한 손상을 현저히 감소시켰으며, 근위 관을 보존하여, 패혈증-유도된 신장 손상에 대한 엑소-srIκB의 치료 가능성을 입증했다. 이러한 결과는 LPS-유도된 AKI의 결과와 일치한다(도 14B). 조직학적 신장 손상의 중증도를 추가로 정량한 결과, 엑소-srIκB 처리는 양 패혈증 모델에서 손상 점수를 약 50%까지 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났다(도 10D). 엑소-srκB는, 비록 일부 손상된 부위가 발견되었지만, 세뇨관에서 퇴행성 변화를 개선시켰다. 이러한 데이터는 패혈증 마우스에서 신장 생리학적 구조 및 기능을 개선하는데 엑소-srIκB의 중대한 중요성을 시사한다.
실시예 11. LPS 주사후 엑소솜의 생체분포
LPS-주사된 패혈증 마우스 모델에서 엑소솜 생체분포의 변화를 조사했다. 생체 내 생체분포는 주문 제작된 생체 내 비디오-레이트 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템(custom-made intravital video-rate laser scanning confocal microscopy system)을 사용하여 분석했다. 호중구(녹색 형광 단백질[GFP] 및 Alexa 555) 및 대식세포(GFP)를 가시화하기 위해 항-Ly6G 항체가 이미 주사된 LysMgfp/+ 트랜스제닉 C57BL/6 마우스에 mCLING 형광 염료-표지된 엑소솜을 정맥 내 주사했다. 대부분의 엑소솜이 신속하게, 즉 정맥 내 엑소솜 주사 후 수분 이내에 호중구 및 대식세포에 의해 흡수되는 것을 관찰했다(도 11A).
엑소솜은 주로 간의 호중구로 전달되었고(도 11B), LPS-유도된 마우스의 비장에서, 호중구 및 대식세포의 동원 증가 및 엑소솜의 섭취(uptake) 증가가 관찰되었다(도 11C). mCLING-표지된 엑소솜은 또한 LPS-주사된 마우스의 신장에서 호중구로 전달되었다(도 15A). 이러한 관찰은, 패혈증 마우스 모델에서 치료용 엑소솜이 호중구 및 대식세포를 표적으로 30분 이내에 성공적으로 전달되었음을 시사한다.
실시예 12. 엑소-srIκB은 패혈증 연관 염증을 완화시킨다
시험관 내 엑소-srIκB의 표적 특이성 및 효율을 확인했다. 엑소-srIκB는 NF-κB 루시퍼라제 리포터 유전자를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에서 TNF-α 유도된 NF-κB 활성화를 유의적으로 차단했지만, 엑소-나이브는 차단하지 않았다(도 12A). 엑소-srIκB의 양을 증가시키는 것은 용량-의존적 방식으로 NF-κB 리포터 활성을 감소시켰으며, 이는 엑소솜으로부터 방출된 srIκB가 NF-κB 전사 활성을 방지하는 것을 나타낸다(도 12B).
모든 패혈증-반응성 세포 중에서, 단핵구/대식세포는 면역 반응을 촉진시키는데 가장 중요한 역할을 하며, 패혈증 마우스에서 이들 세포의 고갈은 사망률을 증가시킨다. THP-1 세포는 세포 배양 모델에서 단핵구로써 광범위하게 사용된다. THP-1 세포가 LPS로 자극되었을 때, 엑소-나이브와 비교하여, 엑소-srIκB에 의한 처리는 NF-κB 전사 조절하에 있는 염증성 사이토카인 TNF-α 및 단핵구 화학유인성 단백질(MCP)-1의 분비를 감소시켰다(도 12C). 또한, 엑소-srIκB의 효과를, NF-κB의 표적 DNA 결합을 방해하는, 일반적으로 사용되는 NF-κB 억제제 JSH-23의 효과와 비교했다. 예시적 데이터는, 엑소-srIκB 및 JSH-23이 THP-1 세포에서 LPS-유도된 NF-κB 활성화 및 사이토카인 생성의 억제와 관련하여 필적하는 효과를 갖는 것을 나타냈다(도 12C, 레인(lane) 4 대 레인 6).
패혈증은 내피에 대한 단핵구 부착을 특징으로 한다. 정상적 조건에서, 내피 세포는 휴지(quiescent)이고, 단핵구와 상호작용하지 않는다. 그러나, 염증 환경에서, 활성화된 내피 세포는 단핵구에 결합하는 세포 간 세포 접착 분자(intercellular cell adhesion molecule, ICAM)-1 등의 접착 분자를 발현한다. 접착 분자의 발현은 패혈증의 발생 동안 활성화되는 것으로 광범위하게 상정된다.
인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에서 세포 부착 분자의 발현에 대한 엑소-srIκB의 효과를 연구하기 위해, 실시예는 먼저 엑소-srIκBs가 세포에 내재화되어 있는지의 여부를 조사했다. mCLING-표지된 엑소-srIκB는 HUVEC에서 검출되었고, 24시간 후에 최대 내재화가 관찰되었다(도 12D). 또한, HUVEC에서 ICAM-1 발현이 엑소-srIκB 처리에 의해 유의적으로 억제됨을 확인했다(도 12E). IL-8 및 MCP-1은 또한 혈관 내피에 대한 단핵구의 이동 및 부착을 유발하고, 이들 세포가 주변 조직으로 혈관 외 유출되도록 유도했다. IL-8 및 MCP-1의 발현은 세균 및 바이러스 감염에 의한 급성 염증 동안 다양한 조직에서 이전에 관찰되었고, 중증 패혈증과 관련이 있다. 엑소-srIκB는 HUVEC에서 NF-κB의 전사 활성을 억제시킴으로써(도 16B) LPS-유도된 IL-8 및 MCP-1 생산을 억제시킨 것으로 밝혀졌다(도 16A). 이러한 결과는 엑소-srIκB가 패혈증에서 NF-κB-매개된 염증 반응을 감소시킴을 확인한다.
실시예 13. LPS-유도된 패혈증에서 폐 손상에 대한 엑소-srIκB의 보호 효과
동물은, 치사량의 LPS(30mg/kg 체중)으로 30분 동안 단일 복강 내 주사, 이어서 10시간 동안 엑소-srIkB(1×1010)의 단일 정맥 내 주사를 제공받았다. 폐 조직을 도 17에 제시된 바와 같이 H&E 염색으로 분석했다. 10시간 동안 LPS를 주사한 그룹은, 호중구 침윤 및 폐포 대식세포의 증식, 폐포 내 및 폐포 외 충혈을 나타냈고, 출혈이 진행되었다. 폐포 내피 세포의 손상, 게다가 치조골 괴사가 관찰된다. 엑소솜 투여는, 울혈이 약간 관찰되는 경우에도, 폐포 벽 확장, 호중구 침윤 및 폐포 대식세포 증식을 경감시켰다.
30mg/kg LPS를, 1그룹당 10마리의 마우스로 이루어진 LPS 투여 그룹(음성 대조군) 및 3-용량 엑소-srIkB 투여 그룹에 투여했다. 투여 30분 후, 엑소-srIkB를 i.v로 1회 투여하고, 도 18에 제시된 바와 같이 72시간 생존율을 평가했다. 대조군 C57BL/6 마우스와 비교하여, 고용량의 엑소-srIκB로 처리된 마우스는 LPS-유도된 사망률에 내성이 있었고, 연장된 생존율을 나타냈다.
30mg/kg LPS을, 1그룹당 5마리의 마우스로 이루어진 LPS 투여 그룹(음성 대조군) 및 3-용량 엑소-srIkB 투여 그룹에 투여했다. 투여 30분 후, 엑소-srIkB를 i.v로 1회 투여하고, 각 시점에서 부검하여 혈장을 수득했다. 수득된 TNF-α의 혈장 수준은 ELISA 방법으로 측정했다(도 19). 염증유발성 사이토카인 TNF-α의 발현 수준은 LPS-유도된 패혈증을 갖는 엑소-srIκB 처리 그룹에서 시간 의존적 방식으로 감소되었다.
동물은 치사량의 LPS(30mg/kg 체중)으로 30분 동안 단일 복강 내 주사, 이어서 엑소-srIkB(1×1010)의 단일 정맥 내 주사를 제공받았다. 간 조직을 H&E 염색으로 분석했다(도 20). LPS 투여 1시간 후, 중앙 정맥 주위의 Kupffer 및 면역 세포의 침윤이 약간 관찰되었으나, 엑소솜 투여 그룹에서는 염증 세포의 침윤이 경감되었다. LPS 투여 10시간 후, Kupffer 및 중앙 정맥 주변의 면역 세포의 침윤이 유의적으로 증가하고, 간 세포 사이의 결합 조직 손상이 관찰되었다. 엑소솜 투여 그룹에서는 침윤이 감소하였으나, 간세포의 괴사 및 부종 프로세스는 점차 경감될 것으로 예상되었다. 따라서, 엑소솜의 반복 투여는 보호 효과를 증강시킬 것으로 기대된다.
AKI를 치료하기 위한 실시형태
실시형태 1. 이를 필요로 하는 대상체에서 급성 신장 손상(AKI)을 치료하기 위한 방법으로서, NF-κB 억제제를 포함하는 엑소솜을 포함하는 조성물의 유효량을 상기 대상체에 투여하는, 방법.
실시형태 2. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, NF-κB의 억제제가 NF-κB 억제 단백질, 이의 단편, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 3. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, NF-κB 억제제가 슈퍼-리프레서(SR)-IκB(srIκB), IκB-α, IκB-β, IκB-ε, BCL-3, 이들의 돌연변이체 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 4. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, NF-κB 억제제가 슈퍼-리프레서(SR)-IκB(srIκB)인, 방법.
실시형태 5. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, 조성물이 경구, 경피, 복강 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 또는 혼합 경로를 통해 투여되는, 방법.
실시형태 6. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, 대상체가 인간인, 방법.
실시형태 7. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 대상체에게 항염증제를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 8. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, NF-κB 억제제를 포함하는 엑소솜이 광-특이적 결합 단백질을 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 9. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, NF-κB 억제제가 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
실시형태 10. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, NF-κB 억제제가 서열번호 1로 표시되는, 방법.
실시형태 11. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, NF-κB 억제제가 서열번호 2로 표시되는, 방법.
실시형태 12. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, 상기 광-특이적 결합 단백질이 제1 광-특이적 결합 단백질 및/또는 제2 광-특이적 결합 단백질이고; 제1 광-특이적 결합 단백질이 엑소솜 특이적 마커에 접합되어 융합 단백질 I을 형성하고; 제2 광-특이적 결합 단백질이 NF-κB 억제제에 접합되어 융합 단백질 II를 형성하는, 방법.
실시형태 13. 상기 실시형태 12에 있어서, 융합 단백질 I 및 융합 단백질 II가 제1 광-특이적 결합 단백질 및 제2 광-특이적 결합 단백질을 통해 가역적으로 결합되는, 방법.
실시형태 14. 상기 실시형태 12 또는 13에 있어서, 제1 광-특이적 결합 단백질이 엑소솜 내측을 향한 방향으로 위치되도록 엑소솜 특이적 마커에 접합되어 있는, 방법.
실시형태 15. 상기 실시형태 12 내지 14 중의 어느 하나에 있어서, 제1 광-특이적 결합 단백질 및 제2 광-특이적 결합 단백질이 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 및 PHR로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 16. 상기 실시형태 15에 있어서, 제1 광-특이적 결합 단백질이 CIB 또는 CIBN이고, 제2 광-특이적 결합 단백질이 CRY 또는 PHR인, 방법.
실시형태 17. 상기 실시형태 15에 있어서, 제1 광-특이적 결합 단백질이 CRY 또는 PHR이고, 제2 광-특이적 결합 단백질이 CIB 또는 CIBN인, 방법.
실시형태 18. 상기 실시형태 15에 있어서, 제1 광-특이적 결합 단백질이 PhyB이고, 제2 광-특이적 결합 단백질이 PIF인, 방법.
실시형태 19. 상기 실시형태 15에 있어서, 제1 광-특이적 결합 단백질이 PIF이고, 제2 광-특이적 결합 단백질이 PhyB인, 방법.
실시형태 20. 상기 실시형태 15에 있어서, 제1 광-특이적 결합 단백질이 GIGANTEA이고, 제2 광-특이적 결합 단백질이 FKF1인, 방법.
실시형태 21. 상기 실시형태 15에 있어서, 제1 광-특이적 결합 단백질이 FKF1이고, 제2 광-특이적 결합 단백질이 GIGANTEA인, 방법.
실시형태 22. 상기 실시형태 12 내지 21에 있어서, 엑소솜 특이적 마커가 CD9, CD63, CD81 및 CD82로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 23. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, 엑소솜이 약 50nm 내지 약 200nm의 직경을 갖는, 방법.
실시예 24. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, 엑소솜이 약 50nm 내지 약 150nm의 직경을 갖는, 방법.
실시형태 25. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, 조성물이 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물인, 방법.
실시형태 26. AKI을 치료하기 위한 실시형태 1 내지 16에 기재된 NF-κB 억제제를 추가로 포함하는 엑소솜을 포함하는 조성물.
실시형태 27. AKI을 치료하기 위한 실시형태 1 내지 16에 기재된 NF-κB 억제제를 포함하는 엑소솜을 포함하는 조성물의 용도.
다른 질환을 치료하기 위한 실시형태
실시형태 1. 이를 필요로 하는 대상체에서 패혈증에 의해 유발된 질환을 치료하는 방법으로서, NF-κB 억제제를 포함하는 엑소솜을 포함하는 조성물의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 2. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, 질환이 폐렴, 사이토카인 폭풍 증후군, 호흡 곤란 증후군, 및 장기 부전으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법. 일부 실시형태에서, 질환은 폐렴이다. 일부 실시형태에서, 질환은 사이토카인 폭풍 증후군이다. 일부 실시형태에서, 질환은 호흡 곤란 증후군이다. 일부 실시형태에서, 질환은 장기 부전이다.
실시형태 3. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, NF-κB 억제제가 NF-κB 억제 단백질, 이의 단편, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 4. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, NF-κB 억제제가 슈퍼-리프레서(SR)-IκB(srIκB), IκB-α, IκB-β, IκB-ε, BCL-3, 이들의 돌연변이 체 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 5. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, NF-κB 억제제가 슈퍼-리프레서(SR)-IκB(srIκB)인, 방법.
실시형태 6. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, 조성물이 경구, 경피, 복강 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 또는 혼합 경로를 통해 투여되는, 방법.
실시형태 7. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, 대상체가 인간인, 방법.
실시형태 8. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 대상체에게 항염증제를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 9. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, NF-κB 억제제를 포함하는 엑소솜이 광-특이적 결합 단백질을 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 10. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, NF-κB 억제제가 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
실시형태 11. 상기 실시형태 10에 있어서, NF-κB 억제제가 서열번호 1로 표시되는, 방법.
실시형태 12. 상기 실시형태 10에 있어서, NF-κB 억제제가 서열번호 2로 표시되는, 방법.
실시형태 13. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, 상기 광-특이적 결합 단백질이 제1 광-특이적 결합 단백질 및/또는 제2 광-특이적 결합 단백질이고; 제1 광-특이적 결합 단백질이 엑소솜 특이적 마커에 접합되어 융합 단백질 I을 형성하고; 제2 광-특이적 결합 단백질이 NF-κB 억제제에 접합되어 융합 단백질 II를 형성하는, 방법.
실시형태 14. 상기 실시형태 13에 있어서, 융합 단백질 I 및 융합 단백질 II가 제1 광-특이적 결합 단백질 및 제2 광-특이적 결합 단백질을 통해 가역적으로 결합되는, 방법.
실시형태 15. 상기 실시형태 13 또는 14에 있어서, 제1 광-특이적 결합 단백질이 엑소솜 내측을 향한 방향으로 위치되도록 엑소솜 특이적 마커에 접합되어 있는, 방법.
실시형태 16. 상기 실시형태 13 내지 15 중의 어느 하나에 있어서, 제1 광-특이적 결합 단백질 및 제2 광-특이적 결합 단백질이 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 및 PHR로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 17. 상기 실시형태 16에 있어서, 제1 광-특이적 결합 단백질이 CIB 또는 CIBN이고, 제2 광-특이적 결합 단백질이 CRY 또는 PHR인, 방법.
실시형태 18. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, 제1 광-특이적 결합 단백질이 CRY 또는 PHR이고, 제2 광-특이적 결합 단백질이 CIB 또는 CIBN인, 방법.
실시형태 19. 상기 실시형태 16에 있어서, 제1 광-특이적 결합 단백질이 PhyB이고, 제2 광-특이적 결합 단백질이 PIF인, 방법.
실시형태 20. 상기 실시형태 16에 있어서, 제1 광-특이적 결합 단백질이 PIF이고, 제2 광-특이적 결합 단백질이 PhyB인, 방법.
실시형태 21. 상기 실시형태 16에 있어서, 제1 광-특이적 결합 단백질이 GIGANTEA이고, 제2 광-특이적 결합 단백질이 FKF1인, 방법.
실시형태 22. 상기 실시형태 16에 있어서, 제1 광-특이적 결합 단백질이 FKF1이고, 제2 광-특이적 결합 단백질이 GIGANTEA인, 방법.
실시형태 23. 상기 실시형태 13 내지 22에 있어서, 엑소솜 특이적 마커가 CD9, CD63, CD81 및 CD82로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 24. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, 엑소솜이 약 50nm 내지 약 200nm의 직경을 갖는, 방법.
실시예 25. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, 엑소솜이 약 50nm 내지 약 150nm의 직경을 갖는, 방법.
실시형태 26. 상기 실시형태 중의 어느 하나에 있어서, 조성물이 생리학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물인, 방법.
실시형태 27. 패혈증에 의해 유발된 질환을 치료하기 위한 실시형태 1 내지 16에 기재된 NF-κB 억제제를 포함하는 엑소솜을 포함하는 조성물.
실시형태 28. 패혈증에 의해 유발된 질환을 치료하기 위한 실시형태 1 내지 16에 기재된 NF-κB 억제제를 포함하는 엑소솜을 포함하는 조성물의 용도.
본 개시 내용은, 다양한 특정 재료, 과정 및 실시예를 참조하여 본원에서 기재 및 설명되었지만, 본 개시 내용은, 그 목적을 위해 선택된 재료 및 과정의 특정 조합으로 한정되지 않는 것으로 이해된다. 이러한 상세의 다수의 변형이 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 암시될 수 있다. 본 명세서 및 실시예는 단지 예시로서만 고려되는 것으로 의도되며, 본 개시 내용의 진정한 범위 및 정신은 하기 특허청구범위에 의해 제시된다. 본원에서 언급된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다.

Claims (10)

  1. 급성 신장 손상(acute kidney injury; AKI)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 급성 신장 손상을 치료하는 방법으로서,
    NF-κB 억제제를 포함하는 엑소솜(exosome)을 포함하는 조성물의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, NF-κB 억제제가 NF-κB 억제 단백질, 이의 단편 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, NF-κB 억제제가 슈퍼-리프레서(super-repressor; SR)-IκB(srIκB) , IκB-α, IκB-β, IκB-ε, BCL-3, 이들의 돌연변이체(mutant) 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 경구, 경피, 복강 내, 정맥 내, 근육 내, 피하 또는 혼합 경로를 통해 투여되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 항-염증제를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, NF-κB 억제제를 포함하는 엑소솜이 광-특이적 결합 단백질(photo-specific binding protein)을 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, NF-κB 억제제가 서열번호 1 또는 서열번호 2에 대해 적어도 85% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, NF-κB 억제제를 포함하는 엑소솜이 제1 광-특이적 결합 단백질 및/또는 제2 광-특이적 결합 단백질을 추가로 포함하고,
    제1 광-특이적 결합 단백질이 엑소솜 특이적 마커에 접합되어 융합 단백질 I을 형성하고;
    제2 광-특이적 결합 단백질이 NF-κB 억제제에 접합되어 융합 단백질 II를 형성하는, 방법.
  9. 패혈증(sepsis)에 의해 유발된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 패혈증에 의해 유발된 질환을 치료하는 방법으로서,
    NF-κB 억제제를 포함하는 엑소솜을 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 질환이 폐렴(pneumonia), 사이토카인 폭풍 증후군(cytokine storm syndrome), 호흡 곤란 증후군(respiratory distress syndrome) 및 장기 부전(organ failure)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
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