JP7076103B2 - 中枢神経腫瘍の処置 - Google Patents

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技術分野
本発明は、腫瘍の進行に関与するガレクチン－１の遺伝子サイレンシングのためのｓｉＲＮＡをカプセル封入しているナノ粒子に関する。本発明はさらに、そのようなナノ粒子の鼻腔内送達による、多形性膠芽細胞腫（ＧＢＭ）などの神経脳腫瘍の処置に関する。
背景技術
ガレクチン－１（Ｇａｌ－１）は、多形性膠芽細胞腫（ＧＢＭ）中で過剰発現される、天然に存在するガラクトース結合レクチンである。このレクチンは腫瘍の進行に関連しており、腫瘍微小環境における強力な免疫抑制因子である。
ＧＢＭ中のＧａｌ－１を阻害するために、限られた全身作用で、中枢神経系腫瘍に到達する有効な治療が必要とされている。
神経膠腫は最も一般的な種類の内因性脳腫瘍であり、年間１００，０００人あたり５～１０人が冒される。膠芽細胞腫（ＧＢＭ）は星細胞起源の最も頻繁な神経膠腫であり、世界保健機関によってグレード４腫瘍として分類されている［Ｌｏｕｉｓ，Ｄ．Ｎ．ら（２００７）、Ａｃｔａ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１１４、９７～１０９（非特許文献１）］。現在の処置様式ではＧＢＭ患者を救うことができない。最適な治療レジメンは、最大限の外科的切除、続いて化学療法および放射線療法からなる。この多様式の処置は１４．６カ月の全生存中央値をもたらす［Ｓｔｕｐｐ，Ｒ．ら（２００９）、Ｔｈｅ ｌａｎｃｅｔ ｏｎｃｏｌｏｇｙ １０、４５９～４６６（非特許文献２）］。この予後不良により、過去何年にもわたって多くの新規処置が探索されてきた。しかし、臨床的有効性に達したものは非常にわずかである。
ＧＢＭ患者の生存をさらに改善させるための新規手法としての、免疫療法の潜在性が調査されている。免疫療法は、ＧＢＭに対する患者自身の免疫系を利用する。再発した悪性神経膠腫患者では、相当数であるがそれでも控えめな人数の長期生存者が報告されており、再手術および樹状細胞ワクチン接種の後に２４カ月を超えて生存している［Ｄｅ Ｖｌｅｅｓｃｈｏｕｗｅｒ Ｓ．（２００８）、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１４、３０９８～３１０４（非特許文献３）；Ｄｅ Ｖｌｅｅｓｃｈｏｕｗｅｒ，Ｓ．（２０１２）、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６１、２１０５～２１１２（非特許文献４）］。新たに診断されたＧＢＭ患者では、組み込まれた手術後の放射化学免疫療法手法の場合に１８．３カ月の生存期間中央値が報告されており、長期分析データによると患者の４２％を超える二年生存率が報告されている。この臨床的実現可能性にもかかわらず、多くの患者の最終的な転帰は免疫療法で変化しないままである。ＧＢＭ腫瘍は、免疫標的化療法を逃れる性質を有する、非常に強力な免疫回避腫瘍であるという総意が生じている［Ｗｅａｔｈｅｒｓ Ｓ．Ｐ．およびＧｉｌｂｅｒｔ Ｍ．Ｒ．（２０１５）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ ｏｎｃｏｌ．１２３、３３１～３３７（非特許文献５）；Ｇｒａｕｅｒ，Ｏ．Ｍ．ら（２００９）、Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １９、６７４～６９３（非特許文献６）］。
現在、この免疫回避腫瘍微小環境を生じる媒介物質が集中的に調査されている。ガレクチン－１（Ｇａｌ－１）が、ＧＢＭ中で優先的に上方制御される、天然に存在する強力な免疫抑制分子として同定されている［Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒ Ｍ．ら（２０１０）、Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ２０、１７～２７（非特許文献７）；Ｔｏｕｓｓａｉｎｔ，Ｌ．Ｇ． ３ｒｄら（２０１２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ １１、３２（非特許文献８）］。
ガレクチン－１は、活性ＣＤ８＋Ｔ細胞においてアポトーシスを誘導することができ、Ｔ細胞シグナル伝達を拮抗することができ、炎症誘発性サイトカイン分泌をブロッキングすることができる［Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｎ．ら（２００４）、Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ５、２４１～２５１（非特許文献９）；Ｇａｒｉｎ，Ｍ．Ｉ．ら（２００７）、Ｂｌｏｏｄ １０９、２０５８～２０６５（非特許文献１０）］。ＧＬ２６１ネズミ膠芽細胞腫モデルにおいて、Ｇａｌ－１の枯渇がＤＣに基づく免疫療法の有効性を増加させることができることが、以前に実証されている［Ｖｅｒｓｃｈｕｅｒｅ，Ｔ．ら（２０１４）、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１３４、８７３～８８４（非特許文献１１）］。これらのデータから、Ｇａｌ－１は強力な免疫調節因子である（ＧＢＭ中で）とみなされている。Ｇａｌ－１は、ＧＢＭの進行の免疫抑制に関与しているだけでなく、いくつかの他の主要な特長もこのレクチンに起因すると考えられている［Ｃａｍｂｙ，Ｉ．ら（２００６）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １６１、３７Ｒ～１５７Ｒ（非特許文献１２）］。Ｇａｌ－１の上方制御は、ＧＢＭ細胞の運動性の増加と相関づけられている。アクチン骨格の再編成を介して、Ｇａｌ－１はＧＢＭ細胞に遊走性の表現型を導入することができる。さらに、Ｇａｌ－１は腫瘍微小環境において血管形成を促進することが証明されている。ＧＢＭ細胞だけでなく、腫瘍に関連する内皮細胞もＧａｌ－１を過剰発現する場合がある。血管内皮成長因子の成熟のモジュレーターとして機能するＧａｌ－１は、血管成長を促進することができる。さらに、Ｇａｌ－１は、ＧＢＭにおいて最も一般的に使用されている化学療法剤であるテモゾマイドに対するＧＢＭ細胞の化学耐性における媒介物質として見出されている。Ｇａｌ－１は、テモゾマイド処置下で細胞生存を促進するように小胞体のストレスを調節することができる［Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒ，Ｍ．ら（２００８）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘ Ｎｅｕｒｏｌ ６７、４５６～４６９（非特許文献１３）；Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒ，Ｍ．ら（２００８）、Ｔｏｘｉｃｏｌ ａｐｐｌ．ｐｈａｒｍ．２２９、１７２～１８３（非特許文献１４）；Ｃｒｏｃｉ，Ｄ．Ｏ．ら（２０１４）、Ｃｅｌｌ １５６、７４４～７５８（非特許文献１５）］。要約すると、Ｇａｌ－１は多くのＧＢＭ促進現象のインターフェースにおける重要な媒介物質であり、したがって標的の理想的な候補である。
Ｇａｌ－１を標的とするために多くの戦略が使用されている。特に、Ｄａｖａｎａｔ（登録商標）、ＯＴＸ－００８（Ａｎｇｉｎｅｘ）などの小分子は、様々ながんにおいて有効性が証明されている［Ａｓｔｏｒｇｕｅｓ－Ｘｅｒｒｉ，Ｌ．ら（２０１４）、Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ５０、２４６３～２４７７（非特許文献１６）］。小分子以外では、抗体もＧａｌ－１に立ち向かうために設計されている。Ｇａｌ－１を抑制する際には、Ｇａｌ－１の細胞内および細胞外画分の両方の標的化と、抑制の特異性という２つの大きな壁にぶつかる。一部のガレクチンは腫瘍退行特性を有し得るため、他のガレクチンとの干渉は依然として議論の余地がある。これらの要件を満たすために、ＲＮＡ干渉に基づく分子の設計は非常に魅力的な手法である。短い二本鎖の低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）をＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ複合体）内に積載し、Ｇａｌ－１をコードするｍＲＮＡを選択的に破壊することができる［Ｓｃｈｕｔｚｅ Ｎ．（２００４）、Ｍｏｌ．ｃｅｌｌ ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２１３，１１５～１１９（非特許文献１７）］。いくつかの論文が、ＧＢＭ細胞においてＧａｌ－１を標的とするｓｉＲＮＡの有効性を既に実証している［Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒら、２００８、どちらも上記に引用］。ｓｉＲＮＡの有効性が問題となることはほとんどないが、腫瘍部位で臨界濃度に達することは大きな懸念点である。この文献中で言及されている最も魅力的な方法は、脳室内注射を介してＧＢＭ腫瘍に到達することであり、浸透圧ミニポンプを用いてｓｉＲＮＡ分子を注入する［Ｔｈａｋｋｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら（２００４）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１、１７２７０～１７２７５（非特許文献１８）］。臨床設定では、対流を強化させた送達系を、脳腫瘍の状況における脳内注射に使用する［Ｄｅｂｉｎｓｋｉ，Ｗ．およびＴａｔｔｅｒ，Ｓ．Ｂ．（２００９）、Ｅｘｐ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒ．９、１５１９～１５２７（非特許文献１９）］。有望な臨床成績をもっても、この侵襲性技法には合併症が伴う。感染症、出血、創傷治癒の問題、および信頼できない分布容積がしばしば観察される。特に、長期にわたって慢性的に投与する必要がある薬物では、ＣＥＤは魅力的でないと考えられる。
近年、鼻腔内経路が非侵襲性の代替投与方法を表し得ることの、ますます増えていく一連の証拠が集められている［Ｉｌｌｕｍ，Ｌ．（２０００）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１１、１～１８（非特許文献２０）；Ｍｉｓｔｒｙ，Ａ．ら（２００９）、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．３７９、１４６～１５７（非特許文献２１）］。鼻腔内輸送は、鼻腔から中枢神経系に向かう直接経路として記載されている。この経路に沿った分子の輸送は、鼻腔の嗅覚器および呼吸器の粘膜上皮を通る、細胞外および経細胞の輸送を含む。嗅糸（ｆｉｌｉａ ｏｌｆａｃｔｏｒｉａ）に沿って嗅球に向かう血管周囲および神経周囲の輸送ならびに三叉神経に沿って脳幹に向かう輸送が最も重要であると考えられるＬｏｃｈｈｅａｄ Ｊ．Ｊ．およびＴｈｏｒｎｅ，Ｒ．Ｇ．（２０１２）、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６４、６１４～６２８（非特許文献２２）。そこから、ＣＮＳ内への迅速な拡大が起こる場合がある。鼻から脳への直接輸送は、自己送達によるより良好な患者コンプライアンス、（多すぎる）全身吸収を回避すること、および血液脳関門（ＢＢＢ）を避けることなどの多くの利点を有する［Ｇｒｏｏｔｈｕｉｓ，Ｄ．Ｒ．（２０００）、Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ．２、４５～５９（非特許文献２３）］。この関門は、高い親油性または受容体標的化なしでは越えることができず、たとえば、トランスフェリンおよび排出ポンプの高い発現は通過を回避する。鼻腔内経路の活用が成功すると、ＧＢＭおよび他の脳疾患を処置するための多くの治療分子にとって絶好の機会が開ける［Ｋｉｍ，Ｉ．Ｄ．ら（２０１２）、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０、８２９～８３９（非特許文献２４）；Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ，Ｒ．ら（２００８）、Ｎｅｕｒｏ－ｏｎｃｏｌ．１０、１１２～１２０（非特許文献２５）］。文献的概説は、鼻から脳への輸送をさらに強化するための医薬的側面を記載しており［ｖａｎ Ｗｏｅｎｓｅｌ，Ｍ．ら（２０１３）、Ｃａｎｃｅｒｓ ５、１０２０～１０４８（非特許文献２６）］、輸送を改善させ、活性薬物を保護し、それによってＣＮＳ中での活性化合物の全体的な生体利用度を増加させる、医薬配合物の設計がコメントされている。この点において、ナノ粒子状の配合物は興味深い新しい多用途のプラットフォームを提供できる可能性がある。鼻から脳への輸送の改善のために、キトサンナノ粒子が迅速に関心を集めている。キトサンは、グリコシド結合を介して連結された、β－（１－４）結合のＤ－グルコサミンおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン分子である［Ｂｅｒｎｋｏｐ－Ｓｃｈｎｕｒｃｈ，Ａ．およびＤｕｎｎｈａｕｐｔ、（２０１２）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．８１、４６３～４６９（非特許文献２７）］。生分解性であり、生体適合性であり、緩和な免疫原性であり、わずかな毒性があるポリマーとして、キトサンはヒトにおける将来の医薬的使用に必要な理想的な特徴を提示する。さらに、この賦形剤は粘膜接着および浸透強化特性を有しており、鼻から脳への輸送をさらに強化するための理想的な候補であると考えられる。キトサンは、上皮細胞の間に密着帯を一過的に開けることによって浸透を促進する［Ｂｏｎｆｅｒｏｎｉ，Ｍ．Ｃ．ら（２００９）、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．６、９２３～９３９（非特許文献２８）；Ｄａｖｉｓ，Ｓ．Ｓ．およびＩｌｌｕｍ，Ｌ．（２００３）、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．４２、１１０７～１１２８（非特許文献２９）；Ｓｏａｎｅ，Ｒ．Ｊ．ら（２００１）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２１７、１８３～１９１（非特許文献３０）］。キトサンナノ粒子の生成プロセスは広く記載されている。イオン性ゲル化が、製造の容易さおよび有害な試薬の回避が理由で最も有名な方法の１つである。また、キトサンは、そのトランスフェクションの潜在性、特にエンドソーム逃避が理由でサイトゾル中のｓｉＲＮＡ送達についても広く調査されている［Ｋａｔａｓ，Ｈ．およびＡｌｐａｒ，Ｈ．Ｏ．ら（２００６）、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ １５、２１６～２２５（非特許文献３１）］。
Ｄａｎｈｉｅｒら（２０１５）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．４８１、１５４～１６１（非特許文献３２）は、５ｋＤａのＭｒを有するキトサンから作製した、抗ガレクチン－１および抗ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡを積載した脂質－キトサン粒子を開示している。
ＵＳ７９６４５７５（特許文献１）は、がんを処置するための抗ガレクチン－１標的化ｓｉＲＮＡの使用を開示しており、経鼻吸入を介した送達を記述しており、送達のための粒子に関するさらなる記述はない。
Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒら（２００８）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．６７、４５６～４６９は、浸透圧ミニポンプを介した脳への抗ガレクチン－１ ｓｉＲＮＡの投与を開示している。
Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒら（２００８）、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２９、１７２～１８３は、ガレクチンｓｉＲＮＡをヒト腫瘍細胞中にトランスフェクションし、続いてこれをマウスに移植することを開示している。
Ｖａｎ Ｗｏｅｎｓｅｌ（２０１３）、Ｃａｎｃｅｒｓ ５、１０２０～１０４８（非特許文献３３）は、鼻腔内送達のための配合物を総説しており、医薬活性化合物を有するキトサンナノ粒子を記述している。
ＵＳ２０１３０３３７０６７（特許文献２）は、脳への鼻腔内送達のための小さなＭｒ（７～１０ｋＤａ）を有するナノ粒子および腹腔内送達のためのより大きなＭｒ（５０～１９０ｋＤａ）を有するナノ粒子を開示している。
ＵＳ２０１１００３３５４７（特許文献３）は様々な種類のキトサン粒子を開示しており、具体的な施用経路の指導はない。
Ｍａｌｈｏｔｒａ（２０１３）、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１３、論文８１２３８７（非特許文献３４）は、鼻腔内送達のための、１０ｋＤａのキトサンを有するキトサン粒子を開示している。
Ｍａｌｈｏｔｒａ、２０１３は、同様に、２０ｋＤａのＭｒを有するキトサンから作製した５～１０ｎｍのキトサン粒子を開示している。
ＵＳ７９６４５７５ ＵＳ２０１３０３３７０６７
Ｌｏｕｉｓ，Ｄ．Ｎ．ら（２００７）、Ａｃｔａ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１１４、９７～１０９ Ｓｔｕｐｐ，Ｒ．ら（２００９）、Ｔｈｅ ｌａｎｃｅｔ ｏｎｃｏｌｏｇｙ １０、４５９～４６６ Ｄｅ Ｖｌｅｅｓｃｈｏｕｗｅｒ Ｓ．（２００８）、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１４、３０９８～３１０４ Ｄｅ Ｖｌｅｅｓｃｈｏｕｗｅｒ，Ｓ．（２０１２）、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６１、２１０５～２１１２ Ｗｅａｔｈｅｒｓ Ｓ．Ｐ．およびＧｉｌｂｅｒｔ Ｍ．Ｒ．（２０１５）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ ｏｎｃｏｌ．１２３、３３１～３３７ Ｇｒａｕｅｒ，Ｏ．Ｍ．ら（２００９）、Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １９、６７４～６９３ Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒ Ｍ．ら（２０１０）、Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ２０、１７～２７ Ｔｏｕｓｓａｉｎｔ，Ｌ．Ｇ． ３ｒｄら（２０１２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ １１、３２ Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｎ．ら（２００４）、Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ５、２４１～２５１ Ｇａｒｉｎ，Ｍ．Ｉ．ら（２００７）、Ｂｌｏｏｄ １０９、２０５８～２０６５ Ｖｅｒｓｃｈｕｅｒｅ，Ｔ．ら（２０１４）、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１３４、８７３～８８４ Ｃａｍｂｙ，Ｉ．ら（２００６）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １６１、３７Ｒ～１５７Ｒ Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒ，Ｍ．ら（２００８）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘ Ｎｅｕｒｏｌ ６７、４５６～４６９ Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒ，Ｍ．ら（２００８）、Ｔｏｘｉｃｏｌ ａｐｐｌ．ｐｈａｒｍ．２２９、１７２～１８３ Ｃｒｏｃｉ，Ｄ．Ｏ．ら（２０１４）、Ｃｅｌｌ １５６、７４４～７５８ Ａｓｔｏｒｇｕｅｓ－Ｘｅｒｒｉ，Ｌ．ら（２０１４）、Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ５０、２４６３～２４７７ Ｓｃｈｕｔｚｅ Ｎ．（２００４）、Ｍｏｌ．ｃｅｌｌ ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２１３，１１５～１１９ Ｔｈａｋｋｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら（２００４）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１、１７２７０～１７２７５ Ｄｅｂｉｎｓｋｉ，Ｗ．およびＴａｔｔｅｒ，Ｓ．Ｂ．（２００９）、Ｅｘｐ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒ．９、１５１９～１５２７ Ｉｌｌｕｍ，Ｌ．（２０００）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１１、１～１８ Ｍｉｓｔｒｙ，Ａ．ら（２００９）、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．３７９、１４６～１５７ Ｌｏｃｈｈｅａｄ Ｊ．Ｊ．およびＴｈｏｒｎｅ，Ｒ．Ｇ．（２０１２）、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６４、６１４～６２８ Ｇｒｏｏｔｈｕｉｓ，Ｄ．Ｒ．（２０００）、Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ．２、４５～５９ Ｋｉｍ，Ｉ．Ｄ．ら（２０１２）、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０、８２９～８３９ Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ，Ｒ．ら（２００８）、Ｎｅｕｒｏ－ｏｎｃｏｌ．１０、１１２～１２０ ｖａｎ Ｗｏｅｎｓｅｌ，Ｍ．ら（２０１３）、Ｃａｎｃｅｒｓ ５、１０２０～１０４８ Ｂｅｒｎｋｏｐ－Ｓｃｈｎｕｒｃｈ，Ａ．およびＤｕｎｎｈａｕｐｔ、（２０１２）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．８１、４６３～４６９ Ｂｏｎｆｅｒｏｎｉ，Ｍ．Ｃ．ら（２００９）、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．６、９２３～９３９ Ｄａｖｉｓ，Ｓ．Ｓ．およびＩｌｌｕｍ，Ｌ．（２００３）、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．４２、１１０７～１１２８ Ｓｏａｎｅ，Ｒ．Ｊ．ら（２００１）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２１７、１８３～１９１ Ｋａｔａｓ，Ｈ．およびＡｌｐａｒ，Ｈ．Ｏ．ら（２００６）、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ １５、２１６～２２５ Ｄａｎｈｉｅｒら（２０１５）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．４８１、１５４～１６１ Ｖａｎ Ｗｏｅｎｓｅｌ（２０１３）、Ｃａｎｃｅｒｓ ５、１０２０～１０４８ Ｍａｌｈｏｔｒａ（２０１３）、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１３、論文８１２３８７
発明の概要
本発明は、腫瘍の進行に関与するガレクチン－１の遺伝子サイレンシングのためのＲＮＡｉ技術を使用するためのｓｉＲＮＡをカプセル封入しているナノ粒子を含有する新しい配合物に関する。より詳細には、本発明は、抗ガレクチン１ ｓｉＲＮＡ分子をカプセル封入しているキトサンナノ粒子に関し、前記ナノ粒子は、鼻腔内投与の後に前記ｓｉＲＮＡ分子を脳へ送達するのに適している。本発明によるナノ粒子は、特に脳腫瘍の処置、より詳細には中枢神経腫瘍、特に多形性膠芽細胞腫（ＧＢＭ）を処置するのに適する。
本発明の一態様は、多形性膠芽細胞腫などの中枢神経腫瘍の処置において使用するための、ガレクチン１を標的とするｓｉＲＮＡ（抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ）を含むキトサンナノ粒子に関し、ナノ粒子は鼻腔内送達を介して投与し、ナノ粒子中のキトサン分子は、３０～２００ｋＤａの間、３０～１００ｋＤａの間、３０～６０ｋＤａの間、４５～５５ｋＤａの間のＭｒを有する。
典型的には、分子はトリポリリン酸ナトリウムを介して架橋されている。
一般に、抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡは、核酸配列５’ＧＣＵＧＣＣＡＧＡＵＧＧＡＵＡＣＧＡＡ３’（配列番号１）と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
典型的な実施形態では、粒子の流体力学的径（ｚ－平均）は１００～２００ｎｍの間である。
典型的な実施形態では、粒子の多分散性指数は０．１５～０．４０である。
典型的な実施形態では、キトサン分子の少なくとも一部が、１つもしくは複数のポリ－エチレングリコール単位、または１つもしくは複数のガラクトース単位を保有している。
ナノ粒子は、スクロースまたはトレハロースなどの凍結乾燥保護剤をさらに含むことができる。
本発明の別の態様は、患者における中枢神経腫瘍の処置のための方法であって、患者に、鼻腔内送達を介して、ガレクチン１を標的とするｓｉＲＮＡ化合物（抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ）を含むキトサンナノ粒子を有効（ａｆｆｅｃｔｉｖｅ）量で投与するステップを含み、ナノ粒子中のキトサン分子が３０～２００ｋＤａの間のＭｒを有する、方法に関する。
第２の医薬的使用クレームについて上述した実施形態が、これらの処置方法に同様に適用可能である。
本発明の別の態様は、ガレクチン１を標的とするｓｉＲＮＡ化合物（抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ）を含むキトサンナノ粒子と、鼻腔内送達に適した賦形剤とを含み、ナノ粒子中のキトサン分子が３０～２００ｋＤａの間のＭｒを有する、経鼻送達のための医薬組成物に関する。
第２の医薬的使用クレームについて上述した実施形態が、これらの医薬組成物に同様に適用可能である。
本発明の別の態様は、上記医薬組成物を含む鼻腔内送達系に関する。
本発明の別の態様は、キトサンナノ粒子の調製のための方法に関する。これらの方法は、
１）３０～２００ｋＤａの間の分子量を有するキトサンポリマーを酢酸溶液に溶かすステップと、
２）抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡを、キトサンポリマーを架橋するのに適した負荷電の化合物の溶液に溶かすステップと、
３）抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡおよび架橋するための化合物を含む溶液を、合わせた溶液を撹拌または混合しながらステップ１）のキトサンポリマーの溶液に加えて、抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡを含む懸濁キトサンナノ粒子の形成を得るステップと、
４）濾過、遠心分離、または懸濁ナノ粒子を単離するための他の適切な技法を使用してキトサンナノ粒子を収集するステップと
を含む。
本明細書中において、抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡは、典型的には、核酸配列５’ＧＣＵＧＣＣＡＧＡＵＧＧＡＵＡＣＧＡＡ３’（配列番号１）と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
キトサンポリマーは３０～６０ｋＤａの間または４５～５５ｋＤａの間の分子量を有する。
典型的には、キトサンポリマーの脱アセチル化の度合は少なくとも７０％である。
一般に、１ｍｇのキトサンあたり３０～６０μｇの間の抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡを加える。
架橋化合物は、典型的にはトリポリリン酸ナトリウムである。
典型的には、キトサン対トリポリリン酸ナトリウムの重量比は２．５～３．０の間である。
具体的な実施形態では、ステップ４）で収集したキトサンナノ粒子を凍結乾燥保護剤と合わせ、続いて凍結乾燥させる。凍結乾燥保護剤の例はスクロースまたはトレハロースである。
本研究では、本発明者らは、最大限に濃縮されたキトサンナノ粒子が、どのようにｓｉＲＮＡ分子を鼻腔内投与の数時間以内に中枢神経系内に送達することができるかを初めて報告する。これらのナノ粒子は、Ｇａｌ－１を標的とするｓｉＲＮＡを高い百分率でカプセル封入することができ、これらを分解から保護する。さらに、抗Ｇａｌ－１ ｓｉＲＮＡの送達の成功は、ネズミおよびヒトＧＢＭ細胞のどちらにおいてもＧａｌ－１の発現の減少をもたらす。本発明は、鼻腔内経路が、ＧＢＭの処置においてＧａｌ－１標的化ｓｉＲＮＡ療法を送達するための有効な輸送経路であることを示す。
本発明の目的は、Ｇａｌ－１標的化に特異的なｓｉＲＮＡをカプセル封入し、保護するキトサンナノ粒子を、鼻腔内投与の後に脳へと提供することである。本発明者らは、ネズミおよびヒトのＧＢＭ細胞系統におけるそのトランスフェクションの潜在性を検査した。さらに、本発明者らは、配合物が上皮層上の密着帯を開くことの評価を行った。また、本発明者らは、鼻腔内点滴注入後の中枢神経系における、フルオロフォアをタグ付けしたｓｉＲＮＡ－配合物の迅速な発生も調査し、嗅球および後脳に優先的な分布があり、これは嗅覚経路および三叉神経経路を介した部分的輸送を示唆している。
本発明は以下を開示する。
１．中枢神経腫瘍、特に、多形性膠芽細胞腫の処置における使用のための、ガレクチン１を標的とするｓｉＲＮＡ化合物（抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ）を含むキトサンナノ粒子。
２．前記抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡが、核酸配列５’ＧＣＵＧＣＣＡＧＡＵＧＧＡＵＡＣＧＡＡ３’［配列番号１］と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、記述１に記載のキトサンナノ粒子。好ましくは、前記抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡは、核酸配列５’ＧＣＵＧＣＣＡＧＡＵＧＧＡＵＡＣＧＡＡ３’［配列番号１］と少なくとも８０％、たとえば、少なくとも８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸配列を有する。
３．前記粒子の流体力学的径（ｚ－平均）が１００～３００ｎｍの間、好ましくは１００～２００ｎｍの間で変動する、記述１または２に記載のキトサンナノ粒子。
４．前記粒子の多分散性指数が０．１５～０．４０の間で変動する、記述１から３に記載のキトサンナノ粒子。
５．キトサン分子の少なくとも一部が１つまたは複数のポリ－エチレングリコール単位を保有している、記述１から４に記載のキトサンナノ粒子。
６．キトサン分子の少なくとも一部が１つまたは複数のガラクトース単位を保有している、記述１から４に記載のキトサンナノ粒子。
７．凍結乾燥保護剤をさらに含む、記述１から６に記載のキトサンナノ粒子を含む医薬調製物。
８．前記凍結乾燥保護剤がスクロースであり、キトサンナノ粒子対スクロースの比が、典型的には１／２～１／１６の間または１／４～１／１２の間で変動し、たとえば約１／８である、記述７に記載の医薬調製物。
９．前記凍結乾燥保護剤がトレハロースであり、キトサンナノ粒子対スクロースの比が、典型的には１／８～１／２８の間または１／１０～１／２０の間で変動し、たとえば約１／１４である、記述７に記載の医薬調製物。
１０．その経鼻投与に適した賦形剤を含む、記述８または９に記載の医薬調製物。
１１．記述１から６のうちのいずれかに記載のキトサンナノ粒子を含む鼻腔内送達系。
１２．記述１から６に記載のキトサンナノ粒子の調製のための方法であって、
ｉ．３０～２００ｋＤａの間の分子量を有するキトサンポリマーを酢酸溶液に溶かすステップと、
ｉｉ．抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡを、キトサンポリマーを架橋するのに適した負荷電の化合物の溶液に溶かすステップと、
ｉｉｉ．抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡおよびキトサン架橋化合物を含む溶液を、前記合わせた溶液を撹拌または混合しながらステップ（ｉ）のキトサン溶液に加えて、懸濁抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ含有キトサンナノ粒子の形成を得るステップと、
ｉｖ．濾過、遠心分離、または懸濁ナノ粒子を単離するための他の適切な技法を使用して、前記抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ含有キトサンナノ粒子を収集するステップと
を含む、方法。
１３．前記キトサンポリマーが３０～６０ｋＤａの間の分子量を有する、記述１２に記載の方法。
１４．前記キトサンポリマーの脱アセチル化の度合が少なくとも７０％である、記述１２または１３に記載の方法。
１５．１ｍｇのキトサンあたり３０～６０μｇの間の抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡを加える、記述１２から１４に記載の方法。
１６．前記キトサン架橋化合物がトリポリリン酸ナトリウムである、記述１２から１５に記載の方法。
１７．キトサン対トリポリリン酸ナトリウムの重量比が２．５～３．０の間である、記述１６に記載の方法。
１８．ステップ（ｉｖ）で収集したキトサンナノ粒子を凍結乾燥保護剤と合わせ、続いて凍結乾燥させる、記述１２から１７に記載の方法。
１９．前記凍結乾燥保護剤がスクロースである、記述１８に記載の方法。
２０．前記凍結乾燥保護剤がトレハロースである、記述１８に記載の方法。
経鼻送達において使用するためのナノ粒子は、一方ではｓｉＲＮＡを分解から遮蔽するために十分大きいべきであり、他方では、鼻腔から脳へと容易に輸送され、その薬物積載を十分に素早く粒子から放出するために十分小さいべきである。小さなナノ粒子を低いＭｒのキトサンで使用する、経鼻薬物送達のためのナノ粒子に関する現在の見解に反して、本発明の実施例は、より大きなキトサンＭｒの粒子もやはり効率的であることを例示しており、これは、粒子が標的部位に到達し、ＲＮＡｓｅ分解に耐えられ、ｓｉＲＮＡが十分に素早く放出されることを示している。
その結果、本発明において開示する粒子は、脳中の他の標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡにも同様に使用することができる。さらに、実施例において記載する腫瘍マウスモデルは、キトサンナノ粒子の物理的パラメータをさらに最適化するのに適している。
２０ｋＤａまたは５０ｋＤａのキトサンを使用して調製した抗Ｇａｌ－１を積載したナノ粒子の存在下で培養した細胞におけるＧａｌ－１発現を示す図である。（Ａ）それぞれ、２０ｋＤａおよび５０ｋＤａのキトサンを用いて生成したＧａｌ－１ ｓｉＲＮＡを積載したナノ粒子を使用したトランスフェクションの４日後および７日後の、ＧＬ２６１細胞の細胞溶解液におけるＧａｌ－１のウエスタンブロット分析の写真である。 ２０ｋＤａまたは５０ｋＤａのキトサンを使用して調製した抗Ｇａｌ－１を積載したナノ粒子の存在下で培養した細胞におけるＧａｌ－１発現を示す図である。（Ｂ）この実験を３回繰り返し、ＩｍａｇｅＪ分析によって定量した。 ５０ｋＤａのＭＷを有するキトサン分子を含むキトサンナノ粒子における、積載能力およびＲＮａｓｅからの保護を示す図である。ｓｉＲＮＡは非常に高い百分率まで取り込まれ、遊離ｓｉＲＮＡの遊走は目視確認されなかった。さらに、ｓｉＲＮＡは、様々な共インキュベーション時間（３時間、２時間、１時間、および０．５時間）の間、ＲＮａｓｅから保護されていた。遊離ｓｉＲＮＡは迅速に分解された。ＣＳ ＮＰ：キトサンナノ粒子、ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム。 キトサンナノ粒子とＧＢＭ細胞の相互作用を示す図である。ネズミ（Ａ、Ｂ、およびＣ）またはヒトの膠芽細胞腫細胞系統（Ｄ、Ｅ、Ｆ）の分析。ナノ粒子とインキュベーションした２時間後の、ＧＬ２６１（Ａ）細胞およびヒト初代ＧＢＭ培養物（Ｄ）の免疫蛍光写真を示し（グレースケールで表す）、背景はそれぞれ明視野またはＤＡＰＩである。これらの写真は、細胞上への配合物の迅速な付着を示している。 キトサンナノ粒子とＧＢＭ細胞の相互作用を示す図である。ネズミ（Ａ、Ｂ、およびＣ）またはヒトの膠芽細胞腫細胞系統（Ｄ、Ｅ、Ｆ）の分析。（Ｂ）ＧＬ２６１で処置した細胞に対する相対的Ｇａｌ－１／ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ分析により、Ｇａｌ－１の有意な低下が明らかとなっている（黒バー：ｓｉＲＮＡあり、白バー：ｓｉＲＮＡなし、平均およびＳＤとして表す、二元ａｎｏｖａ）。 キトサンナノ粒子とＧＢＭ細胞の相互作用を示す図である。ネズミ（Ａ、Ｂ、およびＣ）またはヒトの膠芽細胞腫細胞系統（Ｄ、Ｅ、Ｆ）の分析。（Ｃ）処置したＧＬ２６１細胞のトランスフェクション後４日目および７日目でのウエスタンブロットにより、Ｇａｌ－１の低下がタンパク質レベルで確認される。 キトサンナノ粒子とＧＢＭ細胞の相互作用を示す図である。ネズミ（Ａ、Ｂ、およびＣ）またはヒトの膠芽細胞腫細胞系統（Ｄ、Ｅ、Ｆ）の分析。ナノ粒子とインキュベーションした２時間後の、ＧＬ２６１（Ａ）細胞およびヒト初代ＧＢＭ培養物（Ｄ）の免疫蛍光写真を示し（グレースケールで表す）、背景はそれぞれ明視野またはＤＡＰＩである。これらの写真は、細胞上への配合物の迅速な付着を示している。 キトサンナノ粒子とＧＢＭ細胞の相互作用を示す図である。ネズミ（Ａ、Ｂ、およびＣ）またはヒトの膠芽細胞腫細胞系統（Ｄ、Ｅ、Ｆ）の分析。（Ｅ）トランスフェクション後４日目および７日目での６つの独立した初代ヒトＧＢＭ培養物の定量により、Ｇａｌ－１の有意な低下が示される（ｎ＝６、対応のあるｔ－検定、片側）。 キトサンナノ粒子とＧＢＭ細胞の相互作用を示す図である。ネズミ（Ａ、Ｂ、およびＣ）またはヒトの膠芽細胞腫細胞系統（Ｄ、Ｅ、Ｆ）の分析。（Ｆ）トランスフェクション後４日目および７日目でのヒト初代ＧＢＭのブロットのうちの１つの例である。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。 ＧＬ２６１細胞における遊走分析の引っかき創傷アッセイを示す図である。引っかきを導入した４８時間後の引っかき面積の定量により、Ｇａｌ－１が低下したＧＬ２６１細胞は、引っかき内への遊走が弱いことが示される（ｎ＝１２、平均＋ＳＥＭとして表す、ボンフェローニ多重比較検定を用いた一元ａｎｏｖａ、時間＝０からの％として計算）＊ｐ＜０．０５。 キトサンナノ粒子と上皮細胞の相互作用を示す図である。（Ａ）Ｃａｌｕ－３単層の免疫蛍光写真のグレースケールでの表示であり、核：グレースケールでの表示内のグレーの点として同定可能（元の色：青色）、チューブリン：グレースケールでは目視確認できない（元の色：黄色）、ナノ粒子：グレースケールでの表示内の明るい点／領域として同定可能（元の色：緑色）であり、インキュベーションの２時間後に迅速な付着を示している。 キトサンナノ粒子と上皮細胞の相互作用を示す図である。（Ｂ）キトサンナノ粒子とのインキュベーションの２時間後でのＴＥＥＲ測定を示し、耐性の有意な一過性の減少を示しており、時間＝０でのベースラインＴＥＥＲについて補正されている。（ｎ＝９、平均＋ＳＤとして表す、ダン多重比較検定を用いた一元ＡＮＯＶＡ）。 キトサンナノ粒子と上皮細胞の相互作用を示す図である。（Ｃ）Ｃａｌｕ－３単層を通るＦＤ４の通過を示し、経時的な％流動の増加として表し、キトサンナノ粒子の施用後にＦＤ４の通過の増加を示唆している（ｎ＝６、平均＋ＳＥＭとして表す）。 キトサンナノ粒子と上皮細胞の相互作用を示す図である。（Ｄ）ＺＯ－１の局在化のための免疫蛍光写真を示し、インキュベーションの２時間後に密着帯の一過性の撹乱を示唆している（画像は、ＺＯ１染色に対応する緑色チャネルのグレースケールを表す）。＊＊ｐ＜０．０１。 腫瘍微小環境における分布／局所指向性の蛍光顕微鏡観察を示す図である。（Ａ）フルオレセインで標識したｓｉＲＮＡを積載したナノ粒子の最後の投与の４時間後での、処置したマウスのＢＦＰ－ＧＬ２６１腫瘍の腫瘍中心の共焦点写真を示す。個々の色チャネルを上部に示す。この写真は、一部の血管に関連している、全身循環による分布を示唆している。 腫瘍微小環境における分布／局所指向性の蛍光顕微鏡観察を示す図である。（Ｂ）フルオレセインで標識したｓｉＲＮＡを積載したナノ粒子の最後の投与の４時間後での、処置したマウスのＢＦＰ－ＧＬ２６１腫瘍の腫瘍境界の共焦点写真を示す。個々の色チャネルを上部に示す。この写真は、腫瘍環境における局所的濃縮を示唆している。 Ｇａｌ－１の特異的ノックダウンを示す図である。（Ａ）抗Ｇａｌ－１療法で処置した、または未処置のマウスのウエスタンブロットを示す。ブロットを、Ｇａｌ－１および追加の腫瘍関連タンパク質としてＧａｌ－３について行った。 Ｇａｌ－１の特異的ノックダウンを示す図である。（Ｂ）ＩｍａｇｅＪ強度計算によるウエスタンブロットの定量を示す。この分析により、処置したマウスにおけるＧａｌ－１およびより低い程度でＧａｌ－３の特異的ノックダウンが明らかとなっている。（対応のない片側ｔ－検定、ｎ＝１０／群、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、２つの独立した実験に属するブロットを示す）。 Ｇａｌ－１の相対的ノックダウンを示す図である。（Ａ）抗Ｇａｌ－１療法で処置した、または未処置のマウスのＲＴ－ｑＰＣＲ分析。この分析により、処置したマウスにおけるＧａｌ－１のノックダウンの示唆が明らかとなっている。（対応のない片側ｔ検定、ｎ＝１０／群、ｐ＝０．１４） ＧＬ２６１腫瘍接種後の生存分析を示す図である。マウスに０．５×１０６個のＧＬ２６１ネズミ腫瘍細胞を頭蓋内注射した。続いて、マウスを未処置のままにした、または腫瘍接種後５日目、８日目、１２日目、および１５日目に、抗Ｇａｌ－１ ｓｉＲＮＡを積載したキトサンナノ粒子で処置した。Ｇａｌ－１の低下は、処置したマウスの生存を有意に増加させた（ｎ＝１５／群、ログランク検定、＊＊ｐ＜０．０１）。 免疫蛍光によるＧａｌ－１のノックダウンの確認を示す図である。（Ａ）４匹の抗Ｇａｌ－１ ｓｉＲＮＡマウス対５匹の未処置のコントロールマウスの定量を示す。（マン－ホイットニー検定、＊ｐ＜０．０５）、（Ｂ）それぞれ処置したマウスおよび未処置のマウスの腫瘍領域の代表的な免疫蛍光の例示のグレースケール写真を示す。
定義
本発明の状況内において、「キトサン」は、グリコシド結合を介して連結された、β－（１－４）結合のＤ－グルコサミンおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン分子である。本発明の状況において、キトサンはイオン性ゲル化によって調製する。前記ナノ粒子の調製において出発物質として使用するキトサン分子は、３０～２００ｋＤａの間、または３０～１００ｋＤａの間、たとえば３０～６０ｋＤａの間、または４５～５５Ｋｄａの間（たとえば５０ｋＤａ）の分子量を有する。
本発明の状況内において、「キトサンナノ粒子」とは、たとえばリポリリン酸ナトリウム（ＴＰＰ）などの適切な架橋分子を使用したイオン性ゲル化によって調製したナノ粒子をいう。キトサンナノ粒子を使用して抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ分子をカプセル封入する。ｓｉＲＮＡ分子のカプセル封入は、たとえば、ナノ粒子形成前のｓｉＲＮＡおよびＴＰＰのプレインキュベーションによって得ることができる。本発明によるナノ粒子は、典型的には１００～３００ｎｍの間または１００～２００ｎｍの間の流体力学的径を有する。さらに、ナノ粒子のサイズ分布の測度である多分散指数は、典型的には０．１５～０．４０の間、より好ましくは０．２～０．３０の間で変動する。
キトサン粒子は「未修飾の」粒子であり得、またはたとえばＰＥＧもしくはガラクトースでさらに修飾することができる。
本発明の状況内において、「抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ」とは、ガレクチン－１の翻訳をサイレンシングするｓｉＲＮＡ構築物をいう（２０１４年５月１６日に最後に修正されたｕｎｉｐｒｏｔ登録事項Ｐ０９３８２を参照。）抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡ構築物は、核酸配列５’ＧＣＵＧＣＣＡＧＡＵＧＧＡＵＡＣＧＡＡ３’［配列番号１］と少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、配列同一性を有する核酸配列を有する（たとえば、ヌクレオチド配列中に３、２、または１個の相違）。
本発明の実施例中に例示するように、１つの遺伝子に対して１つのｓｉＲＮＡが使用されている。ガレクチン－１に対して異なるｓｉＲＮＡを使用できることが予想され、さらに、中枢神経腫瘍に関与する別の遺伝子に対する１つまたは複数のｓｉＲＮＡを使用することができる。
本発明の状況内において、用語「中枢神経腫瘍」とは、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ、２００７年８月、１１４（２）、９７～１０９に記載されているようにＷＨＯによって分類された腫瘍のうちの任意のものをいう。本発明は特に、星細胞腫瘍などの神経上皮組織の腫瘍、より詳細には多形性膠芽細胞腫などの膠芽細胞腫瘍に関する。
「多分散指数」、すなわち［Ｄ］は、分子質量［ＤＭ］または重合度合［ＤＸ］のどちらかをいうことができる。これは、方程式ＤＭ＝Ｍｗ／Ｍｎ（式中、Ｍｗは重量平均モル質量であり、Ｍｎは数平均モル質量である）を使用して計算することができる。また、これは重合度合によっても計算することができ、ここで、ＤＸ＝Ｘｗ／Ｘｎ（式中、Ｘｗは重量平均重合度合であり、Ｘｎは数平均重合度合である）。
粒子のサイズ分布はそのような粒子の流体力学的径によって記載され、ここで、記述「ｘ ｎｍ～ｙ ｎｍの間」とは、集団内で粒子の少なくとも６０、７５、８０、９０、または９５％がその範囲内の流体力学的径を有することを示す。
本発明の状況における「処置」とは、患者の健康の改善の指標となる任意のパラメータに関する。本発明の状況において、これは、処置後の生存率、腫瘍組織の大きさまたは質量の部分的または全体的な低下、患者の愁訴（発作、嘔気、嘔吐、頭痛、記憶喪失、半身麻痺、進行性記憶欠損、性格の変化、または神経学的欠損等）の減少などのパラメータに関する。
「鼻腔内送達のための賦形剤」は、たとえばＵＳ２０１３／０３３７０６７に記載されており、医薬的に許容される希釈剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／または担体が含まれる。そのような組成物は、液体または凍結乾燥もしくは他の様式で乾燥させた配合物であり、様々な緩衝液内容物（たとえば、トリス－ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤、表面への吸収を防止するためのアルブミンまたはゼラチンなどの添加剤、ならびに界面活性剤（たとえば、Ｔｗｅｅｎ２０（商標）、Ｔｗｅｅｎ８０（商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（商標）、胆汁酸塩）が含まれる。医薬組成物は、医薬的に許容される可溶化剤（たとえば、グリセロール、ポリエチレングリコール）、抗酸化剤（たとえば、アスコルビン酸、メタ亜硫酸水素ナトリウム）、保存料（たとえば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、増量剤物質、または等張性改質剤（たとえば、ラクトース、マンニトール）を含むことができる。
「鼻腔内送達」とは、鼻腔から脳への、嗅覚器および呼吸器の粘膜上皮を通る、細胞外および経細胞の輸送をいう。この生理的プロセスは、上記に引用したＶａｎ Ｗｏｅｎｓｅｌら（２０１３）に詳述されている。鼻腔内送達のための装置は市販されており、Ｖｉａｎａｓｅ（Ｋｕｒｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）、ＤｉｒｅｃｔＨａｌｅｒ（デンマーク）、またはＯｐｔｉＭｉｓｔ（ノルウェー）の商品名の下で知られている。
ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）とは、標的遺伝子のｍＲＮＡと結合する、遺伝子ノックダウンのための短いＲＮＡ分子をいう。これらは典型的には２０～２４個の間のヌクレオチドであり、一本鎖分子として投与することができるが、体内で一本鎖分子へと処理されるより長い二本鎖分子（たとえばヘアピンＲＮＡ）としても投与することができる。
材料および方法
２０℃で１％の酢酸中１％で１０ｍＰａｓの粘度と測定された、５０ｋＤａの明確に定義された分子量のキトサン（Ｈｅｐｐｅ Ｍｅｄｉｃａｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ、ドイツ）を入手した。脱アセチル化の度合は８５．２％に達した。トリポリリン酸ナトリウム（ＴＰＰ）、スクロース、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、およびＦＩＴＣ－デキストラン（ＦＤ４）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（２３８５０３、Ｓ ９３７８、７１７２７、４６９４４、米国Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）。抗Ｇａｌ－１（ヒト：５’ＧＣＵＧＣＣＡＧＡＵＧＧＡＵＡＣＧＡＡｄＴｄＴ３’［配列番号２］、マウス：５’ＡＣＣＵＧＵＧＣＣＵＡＣＡＣＵＵＣＡＡｄＴｄＴ３’［配列番号３］、およびスクランブルｓｉＲＮＡ（５’ＧＧＡＡＡＵＣＣＣＣＣＡＡＣＡＧＵＧＡｄＴｄＴ３’［配列番号４］をＧＥ Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入し、必要な場合はフルオレセインまたは５’－色素５４７で標識した（ｃｕｓｔｏｍ ｄｅｓｉｇｎ、米国Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）。
メチルコラントレンで誘導したネズミＣ５７ＢＬ／６Ｊの同系のＧＬ２６１神経膠腫細胞はエルランゲン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｒｌａｎｇｅｎ）、ドイツ）のユーポグル（Ｅｙｕｐｏｇｌｕ）博士から提供を受け、Ｍａｅｓ，Ｗ．ら（２０１３）、Ｃｌｉｎ．＆Ｄｅｖ．ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１３、記事ＩＤ９５２４６９に記載のように培養した。
一部の実験では、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を発現するＧＬ２６１細胞を使用した。レンチウイルスのトランスダクションによってＢＦＰ産生を挿入した。
初代膠芽細胞腫培養物を、インフォームドコンセントの後に患者からの切除検体から得た。手短に述べると、コラゲナーゼＤおよびＤＮａｓｅと共に３７℃で３０分間インキュベーションすることによって、腫瘍検体を解離させた。続いて、単核細胞をＦｉｃｏｌｌ勾配で単離し（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、ＡｘｉｓＳｈｉｅｌｄ、ノルウェー）、細胞を２０％のＦＣＳ条件下でＲＰＭＩ培地に播種した。Ｃａｌｕ－３細胞系統をアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＡＴＣＣ ＨＴＢ－５５から購入し、Ｖｌｌａｓａｌｉｕ，Ｄ．ら（２０１０）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．４００、１８３～１９３に記載のものと同じ条件下で培養した。
８～１０週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスをＨａｒｌａｎ（オランダＨｏｒｓｔ）から購入した。マウスを慣用の無菌条件下で維持した。すべての実験は、国際指針に従うルーヴェンカトリック大学（ＫＵ Ｌｅｕｖｅｎ）の生命倫理委員会によって認可されていた。
ナノ粒子の調製。ナノ粒子をイオン性ゲル化によって得た。キトサンポリマーを０．１Ｍの酢酸バッファ（ｐＨ４．５）に溶かすことによって正に帯電させた。キトサンポリマーを相互接続させるための架橋剤としてＴＰＰを選択した。ＴＰＰおよびｓｉＲＮＡのリン酸基がどちらも負電荷であるため、キトサンナノ粒子が自発的に形成された［ＫａｔａｓおよびＡｌｐａｒ、上記に引用］。一定の撹拌下でＴＰＰ（１ｍｇ／ｍｌ）をキトサン（０．７ｍｇ／ｍｌ）に加え、キトサン対ＴＰＰの重量比は２．６２５／１であった。ナノ粒子形成前のｓｉＲＮＡおよびＴＰＰのプレインキュベーションによってｓｉＲＮＡ分子のカプセル封入が達成され、１ｍｌのナノ粒子あたりのｓｉＲＮＡの総量は２４μｇであった。ナノ粒子を３０分間、室温で撹拌した。続いて、４００００×ｇ、２０分間の超遠心分離によって粒子を収集した。ペレットを０．０７５Ｍの酢酸バッファ（ｐＨ４．５）に溶かし、上清を２回、再度遠心分離した。３つのペレットをプールし、スクロースを凍結乾燥保護剤として用いて、ナノ粒子／凍結乾燥保護剤の重量比を１／８で凍結乾燥させた。
ナノ粒子の特徴づけ：大きさ、電荷、および安定性。ナノサイズの配合物の流体力学的径（Ｚ－平均）、多分散指数（ＰＤＩ）、およびゼータ電位は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国）を使用して、動的レーザー散乱およびレーザードップラー電気泳動によって測定した。測定は、０．０７５Ｍの酢酸バッファ（ｐＨ４．５）での１：１０希釈の後に、３７℃、３連で行った。ナノ粒子の安定性は、４℃のデシケーター中での保存によって評価した。
ナノ粒子の特徴づけ：ｓｉＲＮＡカプセル封入効率。ｓｉＲＮＡカプセル封入の百分率はＳＹＢＲグリーンアッセイを使用して決定した［Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｗ．Ｍ．（２００７）、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ １２、５４～６１］。この選択的色素は、ｓｉＲＮＡ分子のヘリックス内に結合された場合にのみ蛍光を発することができる。粒子を調製し、３０分間撹拌した。続いて、粒子をＳＹＢＲグリーンと共に３０分間インキュベートした。遊離ｓｉＲＮＡを使用して検量線を調製し、黒色９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）中、４８０ｎｍ（励起）および５２０ｎｍ（発光）で、蛍光プレートリーダーによって検出した。陽性のコントロールとして、イオン性複合体形成を破壊するために０．１％のＳＤＳを加えた。並行して、蛍光性の未結合のｓｉＲＮＡを測定することによって、遠心分離後の上清中の遊離ｓｉＲＮＡの百分率も評価した。
ナノ粒子の特徴づけ：ｓｉＲＮＡ分解に対する保護。リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）によるｓｉＲＮＡ分解の保護をゲル遅延アッセイによって評価した。手短に述べると、キトサンナノ粒子を０．０７％の組換えＲＮａｓｅＡ（１２０１９－０２１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に３７℃でインキュベートした。次に、粒子を、トリス／ホウ酸／ＥＤＴＡバッファ（１０×Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ＴＢＥ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて調製した４％のアガロースゲルに載せた。可視化をより良好にするため、粒子をゲルに載せる前に０．１％のＳＤＳによって解離させた。また、等量の遊離ｓｉＲＮＡもＲＮａｓｅＡと共にインキュベートし、ゲルに載せた。５５Ｖを２時間かけることによってｓｉＲＮＡの遊走を強制した。ゲルを臭化エチジウムで３０分間染色することによって可視化が達成された。
神経膠腫細胞との相互作用。ネズミＧＬ２６１神経膠腫細胞およびヒト初代培養膠芽細胞腫の細胞をどちらもガラス製カバーガラス上で成長させた。次に、フルオレセインをタグ付けしたｓｉＲＮＡを積載させた粒子を、細胞と共にインキュベートした。定期的な時間間隔でガラス製カバーガラスを洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドで１０分間固定した。ヒト初代培養の場合は、その核を４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ、ｓｉｇｍａ）で染色した追加の免疫蛍光染色を行った。
トランスフェクションアッセイ。ＧＬ２６１細胞およびヒト初代膠芽細胞腫の細胞を、完全コンフルエンスの最大６０％の密度まで培養した。キトサンナノ粒子を、無血清培養条件下で、終夜、２０ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度まで加えた。細胞をＰＢＳで広範囲に洗浄し、血清条件培地に戻した。この細胞集団から、膠芽細胞腫の細胞を播種して、通し時間でトランスフェクションの効率を評価した。
トランフェクションアッセイ：ｍＲＮＡ。処置した細胞をトランスフェクション後の様々な日数で収集し、ＲＮＡを単離し（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ、Ｑｉａｇｅｎ）、分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって品質管理した。続いて、逆ポリメラーゼ反応（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってｃＤＮＡ鋳型を作製し、これらの試料でリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を行った。以下のプライマー対を使用して、ガレクチン－１およびハウスキーピング遺伝子としてのＧＡＰＤＨを検出した（表１）。未処置の細胞中のＧａｌ－１／ＧＡＰＤＨの比を１００％のベースラインとして使用した。
Figure 0007076103000001
トランスフェクションアッセイ：タンパク質。処置した細胞をトランスフェクション後の様々な日数で収集し、タンパク質を単離した（組織タンパク質抽出試薬（Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。タンパク質濃度を比色アッセイ（ＢＣＡキット、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって決定した。等量の全タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、二フッ化ポリビニリデン膜に移した。膜を一次抗体であるウサギ抗ガレクチン－１（１：１０００、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カナダＱｕｅｂｅｃ）と共に終夜インキュベートした。タンパク質積載コントロールとして、すべてのブロットをウサギ抗β－アクチン（１：５０００、Ａｂｃａｍ）で染色した。使用した二次抗体はペルオキシダーゼとコンジュゲートさせたヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：５０００、Ｄａｋｏ）であった。可視化は化学発光（ｗｅｓｔｅｒｎ ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって行った。バンドの定量はＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて行った。
トランスフェクションアッセイ：遊走アッセイ。トランスフェクションの４日後、ＧＬ２６１細胞を６ウェルプレート内に播いた。細胞を終夜付着させ、単層へと成長させた。２００μｌのピペットチップを用いて、プレートのコーティングに影響を与えずにスクラッチを導入した。３枚の独立した写真をこのスクラッチから撮影し、実験を４連で行った。写真はスクラッチを導入した１２時間後、２３時間後、および４８時間後に撮影した。表面積をソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ）によって計算し、ベースライン表面積と比較した％として計算した。
上皮関門の完全性。Ｃａｌｕ－３細胞を２５０，０００個の細胞／インサートで播種し、１２ウェルのｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート（０．４μｍの半透明ポリエステル、Ｇｒｅｉｎｅｒ）上で単層へと成長させた。１４日後に、安定した経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を示した単層が形成された。密な単層、および配合物の単層上への接着を確認するために、免疫蛍光染色を行った。固定後、細胞を、トリス／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎバッファ（ＴＮＴ）中、ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を用いて透過処理し、およびウサギ抗チューブリン（１／１００、ａｂ１５２４６、Ａｂｃａｍ）一次抗体を加えた。細胞を徹底的に洗浄し、ロバ抗ウサギＩｇＧ－ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５５５を加えた（１／２００、Ａ３１５７２、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。その後、核染色のためにＤＡＰＩを加えた。密着帯を評価する場合、本発明者らは抗ＺＯ－１抗体を一次抗体として使用した（１／１００、３３－９１０、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＴＥＥＲ測定値は、一対の箸状電極が設定されているＥＶＯＭ電圧抵抗計（ｖｏｌｔｈｏｍｍｅｔｅｒ）（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して得た。キトサンナノ粒子が上皮関門の完全性を一過的に撹乱させる能力を評価するために、キトサンナノ粒子をＣａｌｕ－３細胞の単層上でインキュベートした。ベースラインＴＥＥＲ測定値を１００％として表した。さらに、高分子透過性を、上皮関門の完全性を評価するための代替パラメータとして測定した。ＦＤ４を、細胞と細胞の間の空間を移動する可能性が最も高い親水性モデル薬物として使用した。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与および評価。ｉｎ ｖｉｖｏ分布研究のために、投与期間の間マウスを３％のイソフルランで麻酔した。それぞれのマウスに、８回の３μｌの液滴を、それぞれの液滴の間を３分間の時間間隔で投与した。投与は連続した３日間の間に１回または３回のどちらかで行い、最後の投与の４時間後、Ｎｅｍｂｕｔａｌの腹腔内注射によってマウスを屠殺し、冷ＰＢＳで灌流し、続いて４％のホルムアルデヒドで灌流した。鼻粘膜および脳を注意深く単離し、４％のホルムアルデヒドでさらに１２時間固定した。鼻粘膜は、メスによる切片作製および５μｍの古典的なパラフィン－ミクロトーム切片作製のために調製した。脳検体は、４％のアガロースに包埋することによって、２００μｍのビブラトーム切片のために調製した。切片は、染色および可視化まで０．０１％のアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中で保存した。すべての検体は、バックグラウンド構造として核のためにＤＡＰＩを用いて染色した。血管を可視化するために、本発明者らは２つの染色技法を使用した。ｉｎ ｖｉｖｏ血管染色のためには、本発明者らは５０μｇのイソレクチン－４８８を屠殺の２時間前に静脈内注射した（Ｉ２１４１１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ビブラトーム切片の血管を染色するためには、本発明者らはブロッキング試薬（ＦＰ１０１２、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を含有するＴＮＴでブロッキングし、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で透過処理し、ウサギ抗ＧＬＵＴ－１一次抗体（１／１００、０７－１４０１、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と共に終夜インキュベートした。ＴＮＴで広範囲に洗浄した後、ロバ抗ウサギＩｇＧ－ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５５５を終夜加え（１／２００、Ａ３１５７２、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、切片を乗せた（Ｄａｋｏ封入剤）。スライドの可視化は共焦点顕微鏡観察（ＳＰ８、Ｌｅｉｃａ）で行った。画像はＩｍａｇｅＪソフトウェアによって処理した。
腫瘍接種および鼻腔内投与。以前に記載のように、マウスにＧＬ２６１－ＷＴまたはＧＬ２６１－ＢＦＰ腫瘍細胞を頭蓋内注射した［Ｖｌｌａｓａｌｉｕ，Ｄ．（２０１０）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．４００、１８３～１９３］。手短に述べると、定位フレーム（Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カリフォルニア州Ｔｕｊｕｎｇａ）を使用することによって、０．５×１０６個の腫瘍細胞を十字縫合から２ｍｍ外側および２ｍｍ後方に、硬膜の３ｍｍ下の深さで注射した。定位接種は無菌条件下で行った。頭蓋内腫瘍が３週間以内に発生し、マウスを体重および神経学的欠損のスケールスコア付けについて週に３回モニタリングした。鼻腔内投与を２．５％のイソフルランの麻酔下で行った。１匹の動物の１日の１回用量は前述の２４μｌの最大に濃縮されたキトサンナノ粒子からなっており、８滴の３μｌの液滴を３分間の時間間隔で与えた。すべての動物実験は、実験動物福祉に関するルーヴェンカトリック大学の倫理委員会の許可を伴って行った。
免疫蛍光分析。分布実験の最初の一組には、本発明者らはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｉ２１４１１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とコンジュゲートさせたイソレクチンを、動物を屠殺する２時間前に注射し、これは血管、より具体的には腫瘍関連血管の染色をもたらす。色素－５４７で標識した抗Ｇａｌ－１ ｓｉＲＮＡを屠殺の４時間後または８時間後に鼻腔内投与した。腫瘍接種の１４日後に、マウスを致死的Ｎｅｍｂｕｔａｌ注射によって屠殺し、ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ、ベルギー）で灌流し、続いて心臓灌流によって４％のパラホルムアルデヒドを灌流した。脳を取り出し（ｐｒｅｌｅｖａｔｅ）、４％のパラホルムアルデヒドと共にさらに終夜インキュベーションして固定した。脳を広範囲に洗浄し、４％の寒天溶液中で固定した。続いて、２００μｍのビブラトーム切片を調製し、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ、ベルギー）を用いて核染色を２０分間行った。切片を乗せ、蛍光封入剤（Ｄａｋｏ、ベルギー）で閉じた。
配合物がＧＬ２６１腫瘍細胞に入ることができるかどうかを識別するために、本発明者らは並行して分布実験も行った。これらの実験では、０．５×１０６個のＢＦＰ陽性腫瘍細胞を接種し、腫瘍を１４日間進行させた。フルオレセインを積載した抗Ｇａｌ－１ ｓｉＲＮＡナノ粒子を連続した３日間、１回の用量で投与し、最後の投与の４時間後に屠殺し、続いて上述のものと同じ処理を行った。血管構造の染色を、ＴＮＢバッファ（０．１Ｍのトリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のブロッキング試薬、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ）中、２時間、ＲＴでブロッキングした。組織を、ＴＮＢで希釈したウサギ抗マウス－ＧＬＵＴ－１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と共に終夜、４℃でインキュベートし、ＴＮＴ（０．１Ｍのトリス、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ、１５０ｍＭ、０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）で洗浄し、ＴＮＢで希釈した抗ウサギ二次抗体ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に終夜、４℃でインキュベートした。
Ｇａｌ－１ノックダウンの評価。マウスは、４回の鼻腔内投与による抗Ｇａｌ－１ ｓｉＲＮＡを積載したナノ粒子を、腫瘍接種の５日後、８日後、１２日後、および１５日後に受けた。２０日目に、またはマウスが大規模な腫瘍負荷の臨床的徴候を発生した場合はそれより早くに、マウスを屠殺し、ＰＢＳで灌流した。未処置のマウスでは、これは多くの場合２０日目より前であった一方で、抗Ｇａｌ－１ ｓｉＲＮＡで処置したマウスでは、これは２０日目であった。脳を取り出し、２ｍｌの組織タンパク質抽出バッファ（７８５１０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中でホモジナイズした。細片を取り除き、上清を比色タンパク質分析（ＢＣＡキット、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびウエスタンブロット分析に使用した。Ｇａｌ－１では、本発明者らはウサギ抗Ｇａｌ－１（１／１０００、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を使用し、Ｇａｌ－３ではウサギ抗Ｇａｌ－３（１／１０００、Ａｂｃａｍ）を使用した。タンパク質積載コントロールとして、すべてのブロットをウサギ抗β－アクチン（１／５０００、Ａｂｃａｍ）で染色した。二次ペルオキシダーゼとコンジュゲートさせた抗ウサギＩｇＧヤギ（１／５０００、Ｄａｋｏ）を使用し、可視化は化学発光（ｗｅｓｔｅｒｎ ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって行った。定量はＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて行った。ｍＲＮＡ分析には、腫瘍の小片を収集し（＜３０ｍｇ）、ホモジナイズした。続いて、ＲＮＡを単離し、前述のようにＲＴ－ｑＰＣＲのために調製した。並行して、本発明者らは免疫蛍光染色によってＧａｌ－１のノックダウンも評価した。手短に述べると、Ｇｌｕｔ１について上述した染色プロトコルによって、２００μｍのビブラトーム（ｖｉｂｒａｔｏｍ）切片をＧａｌ－１について染色した（ＡＦ１１６３、Ｒ＆Ｄ）。蛍光強度の定量をＩｍａｇｅＪによって測定し、それぞれの群の１つの代表的なものを示す（図１０）。
生存分析。３０匹のマウスにＧＬ２６１－ＷＴ細胞を接種し、２つの群へとランダムに分けた。１つ目の群は未処置のままにしたが、イソフルラン麻酔を受けさせ、２つ目の群は４回の用量の抗Ｇａｌ－１ ｓｉＲＮＡを積載したキトサンナノ粒子を腫瘍接種後５、８、１２、および１５日目に受けさせた。長期生存は、コントロールマウスの生存期間中央値の３倍として定義される。
統計学。すべてのデータをＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ５．０（カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）で分析した。２つの群を比較するために、スチューデントｔ検定を行った。抗Ｇａｌ－１ ｓｉＲＮＡと比較する場合は、片側分析を行った。生存分析はログランク検定を用いて比較した。
実施例１ 粒子の特徴づけ
最適な配合物を選択するために、最も重要ないくつかのパラメータについて徹底的な評価プロセスを準備した。最初の選択基準はナノ粒子の大きさであった。したがって、本発明者らは、キトサンポリマーの分子量、キトサンの濃度、および撹拌速度の、ナノ粒子の流体力学的サイズ（Ｚ－平均）に対する影響を評価した（表２）。より低い分子量、より速い撹拌速度、およびより低いキトサン濃度が最も小さい粒子をもたらし、平均サイズは１４７ｎｍ、多分散性指数は０．２７であった（表３）。キトサンのさらなる希釈（＜０．７ｍｇ／ｍｌ）は粒子の形成をもたらさなかった（データ示さず）。ゼータ電位はこれらのパラメータによって影響を受けず、＋３２ｍＶであると決定された。さらなる研究のために、５０ｋＤａのキトサンを用いて製造し、１３００ＲＰＭで撹拌し、０．７ｍｇ／ｍｌで溶かした、最も小さいナノ粒子を選択した。生成後、粒子を超遠心分離によって収集し、粒子の大きさおよびゼータ電位の変更なしに凍結乾燥させた（表２）。さらに、これらの粒子の保存は、４℃のデシケーター中で少なくとも８週間の間、安定性を示した（データ示さず）。
キトサン鎖の分子量、粒子調製の撹拌速度、およびキトサンの濃度は、調製したナノ粒子に対して顕著な効果を有していた。ナノ粒子はスクロースを用いた凍結乾燥の後に影響されなかった。
Figure 0007076103000002
Figure 0007076103000003
この表は、ｚｅｔａ ｓｉｚｅｒおよびＳＹＢＲグリーン分析によって測定した最終ナノ粒子調製物を記載している。ナノ粒子はｓｉＲＮＡを大量にカプセル封入し、界面活性剤と接触した際に即時に放出する。
結論：本実施例中に示す研究により、ｓｉＲＮＡ分子をカプセル封入することができるキトサンナノ粒子をイオン性ゲル化によって作製する実現可能性が確認される。粒子は、粒子の調製中にｓｉＲＮＡの分解を防止する緩和な条件下で生成する。より詳細には、本発明者らは、ポリマーの長さ、撹拌速度、およびキトサンの溶解などの臨界パラメータを変化させた際に粒子がどのような挙動を示すかを記載した（表２）。したがって、本発明者らは、ナノ粒子を高い度合まで濃縮させる、最適化されたプロトコルを記載した。ナノ粒子の濃度は鼻から脳への輸送を活用するために最も重要である。本発明者らは様々な濃度の様々な凍結乾燥保護剤を試験し、ナノ粒子の溶解度および保護に基づいて、スクロースを最適な凍結乾燥保護剤として選択した。
抗Ｇａｌ－１を積載したナノ粒子を調製するために使用したキトサン分子の分子量の関連性をさらに評価するために、培養ＧＬ２６１細胞をトランスフェクトすることの有効性を、２０ｋＤａまたは５０ｋＤａのポリマーのどちらかを用いて調製した２０ｎＭのｓｉＲＮＡを含有するキトサンナノ粒子について調査した。ＧＬ２６１細胞をそれぞれの抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡキトサンナノ粒子でトランスフェクトした後４日目および７日目に、細胞を収集し、溶解した。続いて、細胞中のＧａｌ－１発現を、それぞれの細胞溶解液のウエスタンブロット分析によって評価した。図１に示すように、４日目では、５０ｋＤａのキトサンを用いて調製したキトサンナノ粒子のみがＧＬ２６１細胞中でＧａｌ－１発現の抑制をもたらした一方で、７日目では、Ｇａｌ－１発現は、５０ｋＤａおよび２０ｋＤａのキトサンナノ粒子で処置した細胞でそれぞれ同様の度合まで抑制されていた。全体的に、Ｇａｌ－１発現に対する５０ｋＤａのナノ粒子のより即時型の効果は、５０ｋＤａのキトサンの使用は、２０ｋＤａのキトサンを使用するよりも高いトランスフェクション効率を有する抗Ｇａｌ－１ ｓｉＲＮＡを積載したナノ粒子の生成を可能とすることを示唆している。これらの実験により、膠芽細胞腫を処置するためのそのようなナノ粒子の鼻腔内投与のｉｎ ｖｉｖｏ研究において使用する、抗Ｇａｌ－１ ｓｉＲＮＡを積載したナノ粒子を調製するための５０ｋＤａのキトサンの具体的な選択がさらに確認された（以下の実施例を参照）。
実施例２ ｓｉＲＮＡのカプセル封入および分解からの保護
キトサンナノ粒子のｓｉＲＮＡ担体能力を、ＳＹＢＲグリーンアッセイを使用することによって評価した。ｓｉＲＮＡの損失を回避するために、最大積載能力である２４μｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡをさらなる研究のために選択した。本発明者らは、この条件下でｓｉＲＮＡの８１％がナノ粒子中にカプセル封入されたことを観察した。カプセル封入効率の急な損失によって示されるように、配合されたｓｉＲＮＡは、０．１％のＳＤＳと共にインキュベーションした際に即時に放出された（表３）。さらに、本発明者らは、超遠心分離濃縮プロセスによる高いカプセル封入効率も確認した。本発明者らは、３回の遠心分離サイクルの後、蛍光ｓｉＲＮＡの８５％がペレット内にあることを測定した（データ示さず）。
さらに、分解からのｓｉＲＮＡの保護を分解アッセイで評価した（図２）。ｓｉＲＮＡを積載したナノ粒子をＲＮａｓｅと共に３７℃でいくつかの期間の間インキュベートした場合に、ｓｉＲＮＡの分解は観察されなかった。より良好な可視化のために、粒子をゲル上に載せる直前にＳＤＳを加えることによって、粒子が即座に破壊された。対照的に、遊離ｓｉＲＮＡは迅速に分解され、観察できなかった。これらの結果により、ｓｉＲＮＡの非常に高い百分率が粒子内にカプセル封入されること、およびこれらの粒子が分解からの優れた保護を提供することが確認される。
結論：キトサンナノ粒子内に取り込まれたｓｉＲＮＡはしっかりと複合体形成しており、ＲＮａｓｅとのインキュベーション後に分解を示さなかった。
実施例３ 腫瘍細胞上でのナノ粒子の挙動
ネズミＧＢＭ細胞系統であるＧＬ２６１およびヒト初代ＧＢＭ培養物の両方において、配合物の付着を試験した。どちらの場合でも、無血清培地中での同時インキュベーションの２時間後に、腫瘍細胞への迅速な付着が観察された（図３Ａ＋Ｄ）。ＧＬ２６１腫瘍細胞上への粒子の付着がＧａｌ－１の抑制も誘導したかどうかを評価するために、ｍＲＮＡおよびタンパク質分析を行った（図３Ｂ＋Ｃ）。ＧＬ２６１細胞では、強力かつ特異的なＧａｌ－１ ｍＲＮＡ分解がトランスフェクション後に迅速に観察された。１週間後、Ｇａｌ－１ ｍＲＮＡは回復していた。タンパク質レベルでは、トランスフェクション後４日目に開始されて少なくとも７日目まで、強力な減少が観察された。並行して、初代培養物のＧａｌ－１分解を分析した（図３Ｅ＋Ｆ）。６つの独立した初代ＧＢＭ培養物において、強力な減少はトランスフェクション後の４日目から７日目まで顕著であった。
Ｇａｌ－１抑制の生物学的意義をさらに調査するために、スクラッチ創傷アッセイによって細胞運動性の評価を行った。スクラッチを導入した４８時間後、このアッセイにより、Ｇａｌ－１が低下していた場合にＧＬ２６１細胞の有意により低い運動性プロファイルが明らかとなった（図４）。スクラッチを導入した２３時間後は同様のパターンを示したが、相違は未だ有意ではなかった（データ示さず）。Ｇａｌ－１が抑制されたＧＬ２６１腫瘍細胞は、スクラッチによって引き起こされた表面積を再度定植させるためにより長い時間が必要であった。
結論：本実施例は、キトサン粒子をＧＢＭ細胞に施用する場合の、細胞への迅速な付着を示す（図３）。粒子がＧＢＭ細胞によっても取り込まれるかどうかを評価するために、本発明者らは、ネズミ細胞系統ではｍＲＮＡおよびタンパク質レベルで、６つの個々の腫瘍細胞系統ではタンパク質レベルで、Ｇａｌ－１を検査した。すべての場合において、本発明者らは、Ｇａｌ－１の阻害を観察した。これは、粒子の単回投与後に数日間持続したが、ＧＢＭ細胞は迅速に分裂する細胞である。コントロールとして、本発明者らは、ｓｉＲＮＡの特異性をガレクチン－３ウエスタンブロットによって調べ、本発明者らは、ここではＧａｌ－３の減少を観察しなかった。キトサンポリマーからのｓｉＲＮＡ放出の機構は、プロトンスポンジ効果に依存している可能性が最も高く、キトサンポリマーの第一級アミンによってＨ＋を捕捉することによってリソソーム損傷を生じる［Ｎｅｌ，Ａ．Ｅ．ら（２００９）、Ｎａｔｕｒｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ８、５４３～５５７］。さらに、本発明者らは、Ｇａｌ－１が低下した場合の、ＧＢＭ細胞の遊走に対する効果を確認することができた（図４）［Ｃａｍｂｙ Ｉ．ら（２００２）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．６１、５８５～５９６］。
実施例４ 配合物媒介性の上皮の調節
キトサンに基づく配合物による密着帯の調節を、Ｃａｌｕ－３単層を用いて評価した。まず、本発明者らは、Ｃａｌｕ－３単層の頂端側のキトサンナノ粒子の分散分布を可視化した（図５Ａ）。０．０６％のキトサンナノ粒子の濃度で、投与の２時間後に、単層にわたって抵抗の有意な減少が観察された。この抵抗の減少は一過性であり、最も遅くて粒子のインキュベーションの２４時間後までには回復した（データ示さず）。この抵抗の減少は、小さな親水性プローブ、たとえばＦＤ４について単層の透過性がより高くなる傾向をもたらした（図５Ｂ＋Ｃ）。文献の報告に一致して、この単層にキトサンを投与した後に密着帯の内部移行が観察された（図５Ｄ）。本発明者らは、単層をＺＯ－１タンパク質について染色することによってモニタリングして、インタクトな単層の撹乱を観察した。
鼻腔内投与、およびＣＮＳに到達する目的のために、上皮層を一過的に撹乱させることが必要である。生理的条件下では、粘膜層は密着帯を介して密に相互接続している。本発明者らは、キトサン配合物を０．０６％で施用した場合にＣａｌｕ－３細胞系統の単層において抵抗の顕著な降下を観察した（図５）。配合物を取り除いた際、抵抗は穏やかに回復し、最大でも２４時間後に抵抗はベースラインまで戻った。また、本発明者らは、培地条件において一貫した抵抗の降下が存在することにも注目し、これは、抵抗測定を行うために必要な温度、湿度、およびＣＯ２、Ｏ２含有量の変化に起因していると考えられる。抵抗の降下が関門を横切る分子の通過の増加にもつながるかどうかを評価するために、本発明者らは、単層をナノ粒子およびＦＤ４と共にインキュベートした。本発明者らは、ＦＤ４の通過がより高い傾向にあることを観察した。しかし、興味深いことに、０．０３％の濃度は抵抗の効果をもたらさなかった。本発明者らは、キトサンナノ粒子内に取り込まれた蛍光ｓｉＲＮＡの通過の評価を試みた。本発明者らはキトサン粒子がポリエステルに対して高い親和性を示すことを観察し、粒子はインサート孔径（０．４μｍ）よりも小さかったが、細胞をインサート上に播種しなかった場合でも非常に低い通過を観察することができた（データ示さず）。本発明者らは、免疫蛍光染色によって密着帯の開口を検出できるかどうかを検査した。本発明者らは、０．０３％および０．０６％の条件のどちらにおいても、キトサン粒子を施用した場合に２時間後にＺＯ－１分子の消失を観察し、これは、ＦＤ４の通過の増加を説明している可能性がある。これらの結果は、キトサン刺激した際の密着帯の内部移行を示唆している。
実施例５ 中枢神経系への輸送
最初の入口の関門として、鼻粘膜を、コントロールの未処置のマウスならびに色素－５４７で標識したｓｉＲＮＡを含むキトサンナノ粒子を鼻腔内投与した４時間後および８時間後のそれぞれに屠殺したマウスの鼻粘膜のプレパラートにおける、赤色色素－５４７で標識したｓｉＲＮＡの外見の共焦点顕微鏡観察によって評価した。コントロールの未処置のマウスでは、赤色シグナルは観察できなかった。処置したマウスでは、本発明者らは投与の４時間後および８時間後に鼻粘膜内に赤色ナノ粒子を観察することができた。上皮層を通る通過をさらに詳細に描写するために、本発明者らは、赤色色素－５４７で標識したｓｉＲＮＡを積載したキトサンナノ粒子をマウスに連続した３日間鼻腔内投与し、最後の投与の４時間後のものを屠殺して、古典的なパラフィン切片へと処理した。色素－５４７で標識したｓｉＲＮＡの強い存在が鼻粘膜上で検出された。特に粘液層上で強い濃度が存在しているが、円柱上皮を越えて固有層内への上の輸送も見られる。鼻粘膜を横切る輸送は、中枢神経系に到達するための根本要件である可能性が非常に高い。ＣＮＳに向かう輸送をさらに評価するために、中枢神経系に向かう十分に記載されている侵入点である嗅球および後脳を、ｓｉＲＮＡの存在について評価した。前記輸送における嗅球の役割はコントロールの未処置のマウスならびに色素－５４７で標識したｓｉＲＮＡを含むキトサンナノ粒子を鼻腔内投与した４時間後および８時間後のそれぞれに屠殺したマウスの嗅球のプレパラートにおける、赤色色素－５４７で標識したｓｉＲＮＡの外見の共焦点顕微鏡観察を使用して評価した。嗅球の徹底的な評価により、コントロールの未処置のマウスにおいて蛍光が存在しないことが示されている。しかし、処置したマウスでは、本発明者らは、投与の４時間後に嗅球の先端に蛍光シグナルを観察している。本発明者らは、８時間の投与で、色素－５４７で標識したｓｉＲＮＡのより拡散された分布を観察している。嗅球での侵入に関する長期的効果を評価するために、本発明者らは、３日間にわたって３回の投与を受け、最後の投与の４時間後に屠殺したマウスもモニタリングした。ここで、本発明者らは、嗅球の球状層における強い分布、および外網状層へのより拡散された分布を観察している。さらに、本発明者らは、抗ＦＩＴＣ－ＦＩＴＣとコンジュゲートさせた抗体を用いた、フルオレセインで標識したｓｉＲＮＡの増幅を含む、同様の共焦点顕微鏡観察技法によって、嗅球および後脳への輸送も評価した。この技法を使用した場合、フルオレセイン－ｓｉＲＮＡを積載したナノ粒子をマウスに投与した４時間後および２４時間後のどちらの嗅球においても、フルオレセイン－ｓｉＲＮＡが観察できた。しかし、ｓｉＲＮＡは、嗅球側だけでなく、フルオレセイン－ｓｉＲＮＡを積載したナノ粒子をマウスに投与した４時間後および２４時間後のどちらの後脳においても存在していた。どちらの部位も前述の経路を示唆している。また、三叉神経も検査したが、蛍光ｓｉＲＮＡの明白な存在は観察できなかった（データ示さず）。
ｉｎ ｖｉｖｏ評価において、本発明者らは鼻粘膜を横切る輸送の妥当性を確認した。本発明者らは鼻粘膜において４時間後に既に配合物の迅速な拡大を観察した一方で、コントロールの未処置のマウスでは、フルオロフォアは観察されなかった。輸送様式の識別は困難である。しかし、一部の写真は血管に沿った輸送を示唆しており、ＣＮＳ内への血管周囲の輸送が確認されている。また、血管構造の周りの密な蓄積も迅速な全身への分布の源であり得る。また、８時間後に、本発明者らは、鼻粘膜上に依然として蛍光が存在していることも観察している。粘膜に対する長期的効果を観察するために、本発明者らは、色素－５４７で標識したｓｉＲＮＡを積載したキトサンナノ粒子を連続した３日間鼻腔内投与した後、最後の投与の４時間後にマウスを屠殺した、分布実験を行った。これらの切片をパラフィン包埋によって処理し、固有層中に大きなシグナルが明らかとなった。また、粘液層は色素－５４７で標識したｓｉＲＮＡについて陽性に染まり、円柱上皮細胞を通る通過も観察できた。予備分布実験では、本発明者らは、６時間後に血漿および肝臓中でフルオロフォアをタグ付けしたｓｉＲＮＡの増加を観察した（データ示さず）。嗅球が主な侵入経路であるため、ＣＮＳ内への分布を評価するために、本発明者らはまず嗅球に注目した。嗅球をその全範囲まで解剖した場合に、ＤＡＰＩ核染色によって、本発明者らは、著名な円形の組織によって特徴づけられた球状層を明白に識別することができた。本発明者らは、単回投与の４時間後および８時間後に強力かつ漸増的な色素－５４７ ｓｉＲＮＡのシグナルを観察した。さらに、３回の１日１回の投与の後、このシグナルは嗅球の全領域にわたってより豊富となっていた。これらの観察は、嗅覚経路を介した鼻腔から中枢神経系への直接輸送の重要性および実現可能性を明白に強調している。次に、本発明者らは、三叉神経を介したＣＮＳへの代替経路として、後脳におけるｓｉＲＮＡの存在を見出すことにも関心があった。本シグナルをさらに増幅するために、本発明者らは、フルオレセインで標識したｓｉＲＮＡを、ＦＩＴＣとカップリングさせた抗フルオレセイン抗体で染色した。これらの実験では、血管は、イソレクチン染色によっては検出されず、ＧＬＵＴ－１染色によって検出された。本発明者らは、これらの実験において嗅覚領域における存在を確認したが、単回投与の４時間および２４時間後に、後脳におけるｓｉＲＮＡの明白なシグナルも見出した。上述の観察を例示するカラー写真はＶａｎ Ｗｏｅｎｓｅｌら、（２０１６）、Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２２７、７１～８１で利用可能である。
実施例６ 腫瘍微小環境内での分布
本発明者らが以前に実証したように、キトサンナノ粒子を用いた抗Ｇａｌ－１ ｓｉＲＮＡ配合物は中枢神経系に効率的に到達することができる。中枢神経系腫瘍に到達することができるかどうかの疑問に取り組むために、本発明者らは、マウスにＧＬ２６１－ＷＴ細胞を接種し、腫瘍を１４日間、固体塊が存在するまで成長させた。コントロールの未処置のマウスならびに色素－５４７で標識したｓｉＲＮＡを含むキトサンナノ粒子を鼻腔内投与した４時間後および８時間後のそれぞれに屠殺したマウスの腫瘍環境における、赤色色素－５４７で標識したｓｉＲＮＡの外見の共焦点顕微鏡観察を使用した。腫瘍関連血管のイソレクチン染色によって、本発明者らは切片上の腫瘍領域を明白に定義することができた。血管は明らかに拡張しており、組織構造を欠いているように見え、これは、血流および酸素供給が損なわれていることを示唆している。未処置のコントロールマウスでは、ｓｉＲＮＡ関連フルオロフォアを検出することはできなかった。実験群では、本発明者らは、赤色に対応する色素－５４７を積載した抗Ｇａｌ－１ ｓｉＲＮＡをマウスに鼻腔内注射した。単回投与後、本発明者らは既に腫瘍微小環境内に豊富なシグナルがあることに気づいた。４時間後、このシグナルはより粒子状であり、８時間後にはより拡散していた。この観察は、鼻腔内経路を介して腫瘍微小環境に到達する実現可能性を明らかに実証している。血管およびマクロファージ以外に神経膠腫中でＧａｌ－１を産生する主要な細胞集団である、抗Ｇａｌ－１ ｓｉＲＮＡも腫瘍細胞に到達できるかという疑問が残った。したがって、本発明者らは、共焦点顕微鏡観察下で検出することができるＧＬ２６１－ＢＦＰ陽性腫瘍細胞を注射した（図６）。腫瘍中心（図６Ａ）および腫瘍境界（図６Ｂ）のどちらにおいても、本発明者らは、フルオレセイン－ｓｉＲＮＡを積載したナノ粒子の鼻腔内投与の４時間後に抗Ｇａｌ－１フルオレセイン－ｓｉＲＮＡシグナルを見出すことができた。さらに、本発明者らは、灌流したにもかかわらず血管に関連する強力なシグナルを観察することができ、これは内皮細胞における存在を示唆している。
全体的に、これらの結果は、キトサンナノ粒子状送達形態を使用して、抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡが鼻腔内投与の後に腫瘍細胞に到達することを明らかに示している。上述の観察を例示するカラー写真はＶａｎ Ｗｏｅｎｓｅｌら（２０１６）、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．ｒｅｌｅａｓｅ ２２７、７１～８１で利用可能である。
実施例７ Ｇａｌ－１の腫瘍内低下
上記では、本発明者らは腫瘍微小環境における抗Ｇａｌ－１ ｓｉＲＮＡの存在を観察した。ＲＮＡ干渉分子の機能性をさらに調査するために、本発明者らはＧａｌ－１の量を決定する必要があった。以前のｉｎ ｖｉｔｒｏ結果では、本発明者らはトランスフェクションの４～７日後にＧａｌ－１の強力な減少を観察した。この生物学的Ｇａｌ－１代謝回転は、抗Ｇａｌ－１ ｓｉＲＮＡの腫瘍内注射後にも観察された（データ示さず）。したがって、本発明者らは、腫瘍接種後１５日目まで抗Ｇａｌ－１ ｓｉＲＮＡを積載したナノ粒子を投与し、その後、腫瘍接種後２０日目にマウスを屠殺した。２つの独立した実験で、本発明者らは、コントロールの未処置のマウスと比較して、処置したマウスにおいてＧａｌ－１の強力な減少を観察した。さらに、本発明者らは、Ｇａｌ－１だけでなく、やはり腫瘍促進特性を示すガレクチン－３（Ｇａｌ－３）も低下していたことに気づいた。Ｇａｌ－１の減少はＧａｌ－３の減少よりもかなり大きかったが、有意ではなかった（ｐ＝０．０９）。また、本発明者らは、腫瘍接種後２０日目の腫瘍の小片（＜３０ｍｇ）でＲＴ－ｑＰＣＲも行った。これにより、処置した動物においてＧａｌ－１の少ないが有意ではない減少が明らかとなった。本発明者らの以前のｉｎ ｖｉｔｒｏの発見に基づいて、投与の５日後では、ｍＲＮＡはタンパク質レベルよりも低下の程度が低いと予想された（図７および８）。
本発明者らは、処置したマウスにおいてＧａｌ－１の強力かつ有意な減少を観察し、これは特異的ノックダウンを示唆している。驚くべきことに、かつｉｎ ｖｉｔｒｏの発見とは対照的に（実施例３を参照）、ｉｎ ｖｉｖｏでは、本発明者らはＧａｌ－３の有意な減少を見出さなかった。これは、Ｇａｌ－１とＧａｌ－３との間の生物学的相互作用を示唆している。
さらに、本発明者らは、免疫蛍光染色によってＧａｌ－１の減少を確認した（図１０）。
実施例８ 処置したマウスの生存の増加
マウスにＧＬ２６１－ＷＴを接種し、２つの群へとランダムに分けた。本発明者らは、鼻腔内抗Ｇａｌ－１ ｓｉＲＮＡ配合物で処置したマウスの長期生存を観察した。生存期間中央値は、コントロールでは１９日間から処置したマウスでは２３日間へとシフトしていた。疾患進行の初期ではわずかな延命効果しか観察されなかったが、後に曲線の差が大きくなる。また、本発明者らは、マウスの処置群で長期生存者を観察したが、対照的に、未処置のマウスはすべて死亡した（図９）。さらに、本発明者らは空の粒子（ｓｉＲＮＡを含有しない）が腫瘍保有マウスの生存に効果をもたなかったことに注目し、これは、腫瘍の進行の停止または遅延におけるＧａｌ－１の重要性を強調している。

Claims (16)

  1. ｓｉＲＮＡおよび架橋されたキトサンを含むキトサンナノ粒子であって、前記ｓｉＲＮＡは前記キトサンナノ粒子に封入され、前記ナノ粒子中の前記キトサン分子が３０～６０ｋＤａの間のＭｒを有し、前記ナノ粒子の流体力学的径（ｚ－平均）が１００～２００ｎｍの間である、キトサンナノ粒子。
  2. 前記ナノ粒子中の前記キトサン分子が４５～５５ｋＤａの間のＭｒを有する、請求項１に記載のキトサンナノ粒子。
  3. 前記粒子の多分散性指数が０．１５～０．４０の間である、請求項１または２に記載のキトサンナノ粒子。
  4. 前記キトサンナノ粒子が鼻腔内送達のために配合されている、請求項１～３のいずれか１項に記載のキトサンナノ粒子。
  5. 前記ｓｉＲＮＡは脳内の遺伝子を標的とする、請求項１～４のいずれか１項に記載のキトサンナノ粒子。
  6. 前記遺伝子がガレクチン１であり、前記ｓｉＲＮＡがガレクチン１を標的とする抗ガレクチン１（抗Ｇａｌ１） ｓｉＲＮＡである、請求項５に記載のキトサンナノ粒子。
  7. 前記抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡが核酸配列５’ＧＣＵＧＣＣＡＧＡＵＧＧＡＵＡＣＧＡＡ３’（配列番号１）と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項６に記載のキトサンナノ粒子。
  8. 前記キトサンナノ粒子が脳疾患の処置のためのものである、請求項１～７のいずれか１項に記載のキトサンナノ粒子。
  9. 前記脳疾患が中枢神経腫瘍である、請求項８に記載のキトサンナノ粒子。
  10. 前記中枢神経腫瘍が多形性膠芽細胞腫である、請求項９に記載のキトサンナノ粒子。
  11. 請求項１～１０のいずれか１項に記載のキトサンナノ粒子と、鼻腔内送達に適した賦形剤とを含む、経鼻送達のための医薬組成物。
  12. 前記ｓｉＲＮＡは脳内の遺伝子を標的とするものであり、前記遺伝子がガレクチン１であり、前記ｓｉＲＮＡがガレクチン１を標的とする抗ガレクチン１（抗Ｇａｌ１） ｓｉＲＮＡである、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 請求項１～１０のいずれか１項に記載のキトサンナノ粒子の調製のための方法であって、
    １）３０～６０ｋＤａの間の分子量を有するキトサンポリマーを酢酸溶液に溶かすステップと、
    ２）ｓｉＲＮＡを、キトサンポリマーを架橋するのに適した負荷電の化合物の溶液に溶かすステップと、
    ３）前記ｓｉＲＮＡおよび架橋するための前記化合物を含む前記溶液を、撹拌または混合しながらステップ１）のキトサンポリマーの溶液に加えて、前記ｓｉＲＮＡを含む懸濁キトサンナノ粒子の形成を得るステップと、
    ４）濾過、遠心分離、または前記懸濁ナノ粒子を単離するための他の適切な技法を使用して前記キトサンナノ粒子を収集するステップと
    を含む、方法。
  14. 前記ｓｉＲＮＡが抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記ｓｉＲＮＡが核酸配列５’ＧＣＵＧＣＣＡＧＡＵＧＧＡＵＡＣＧＡＡ３’（配列番号１）と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む抗Ｇａｌ１ ｓｉＲＮＡである、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. １ｍｇのキトサンあたり３０～６０μｇの間のｓｉＲＮＡを加える、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
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