EA038254B1 - Лечение опухолей центральной нервной системы - Google Patents

Лечение опухолей центральной нервной системы Download PDF

Info

Publication number
EA038254B1
EA038254B1 EA201891026A EA201891026A EA038254B1 EA 038254 B1 EA038254 B1 EA 038254B1 EA 201891026 A EA201891026 A EA 201891026A EA 201891026 A EA201891026 A EA 201891026A EA 038254 B1 EA038254 B1 EA 038254B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
chitosan
sirna
nanoparticles
brain
tumor
Prior art date
Application number
EA201891026A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201891026A1 (ru
Inventor
Стивен Де Влеешоувер
Маттиас Ван Военсель
Карим Амигхи
Натали Ваутхоз
Реми Розьер
Original Assignee
Католике Университет Лёвен
Университе Либре Де Брюссель
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Католике Университет Лёвен, Университе Либре Де Брюссель filed Critical Католике Университет Лёвен
Publication of EA201891026A1 publication Critical patent/EA201891026A1/ru
Publication of EA038254B1 publication Critical patent/EA038254B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6939—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being a polysaccharide, e.g. starch, chitosan, chitin, cellulose or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5192—Processes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение в общем относится к новому составу, содержащему наночастицы, инкапсулирующие миРНК для применения технологии РНК-интерференции для сайленсинга гена галектина-1, вовлеченного в прогрессирование опухоли. Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению молекул РНК-интерференции для лечения злокачественной опухоли центральной нервной системы, более конкретно, для лечения мультиформной глиобластомы (GBM).

Description

Область техники настоящего изобретения
Изобретение относится к наночастицам, инкапсулирующим миРНК, для сайленсинга гена галектина-1, вовлеченного в прогрессирование опухолей. Настоящее изобретение дополнительно относится к лечению опухолей головного мозга, таких как мультиформная глиобластома (GBM), с помощью интраназальной доставки таких наночастиц.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Галектин-1 (Gal-1) представляет собой встречающийся в природе связывающий галактозу лектин, который избыточно экспрессируется в мультиформной глиобластоме (GBM). Этот лектин ассоциирован с прогрессированием опухоли, и является сильным иммунным супрессором в микроокружении опухоли.
Для ингибирования Gal-1 в GBM необходима эффективная терапия, которая достигает опухоли центральной нервной системы с ограниченными системными эффектами.
Глиомы представляют собой наиболее распространенный тип первичной опухоли головного мозга, поражающий 5-10 лиц на 100000 в год. Глиобластома (GBM) представляет собой наиболее часто встречающуюся глиому астроцитарного происхождения, которую Всемирная организация здравоохранения классифицирует как опухоль 4 степени [Louis, D.N. et al. (2007) Acta Neuropathol. 114, 97-109]. Современные способы лечения не могут вылечить пациентов с GBM. Оптимальная схема лечения состоит из максимальной хирургической резекции с последующей химиотерапией и лучевой терапией. Это мультимодальное лечение дает в результате общую медианную выживаемость, составляющую 14,6 месяцев [Stupp, R. et al. (2009) The Lancet Oncology 10, 459-466]. Плохой прогноз спровоцировал за последние годы поиски многих новых методов лечения. Тем не менее, очень немногие достигли клинической эффективности.
Исследовали потенциал иммунотерапии в качестве нового подхода для дополнительного улучшения выживаемости пациентов с GBM. Иммунотерапия будет использовать возможности собственной иммунной системы пациента в отношении GBM. Среди пациентов с рецидивирующей злокачественной глиомой сообщалось о значимом, хотя и умеренном количестве выживших в течение длительного времени, которые выжили более чем через 24 месяца после повторной операции и вакцинации дендритных клеток [De Vleeschouwer S. (2008) Clin. Cancer Res. 14, 3098-3104; De Vleeschouwer, S. (2012) Cancer Immunol Immunother. 61, 2105-2112]. У недавно диагностированных пациентов с GBM сообщалось о средней выживаемости, составляющей 18,3 месяцев, в случае интегрированного послеоперационного радиохимиоиммунотерапевтического подхода и об уровне двухлетней выживаемости у более 42% пациентов в соответствии с данными долгосрочного анализа. Несмотря на эту клиническую выполнимость, с использованием иммунотерапии конечный результат для многих пациентов остается неизменным. Появляется общее мнение о том, что опухоли GBM являются опухолями, очень эффективно ускользающими от иммунного надзора, предрасположенными к обходу таргетных видов иммунотерапии [Weathers S.P. & Gilbert M.R. (2015) J. Neuro Oncol. 123, 331-337; Grauer, O.M. et al. (2009) Brain Pathol 19, 674-693].
В настоящее время всесторонне исследуют медиаторы, которые создают это ускользающее от иммунного надзора микроокружение опухоли. Галектин-1 (Gal-1) идентифицировали в качестве высокоактивной встречающейся в природе иммуносупрессорной молекулы, подвергающейся преимущественно положительной регуляции в GBM [Le Mercier M. et al (2010) Brain Pathol 20, 17-27, Toussaint, L.G, 3rd et al. (2012) Molecular Cancer 11, 32].
Галектин-1 может индуцировать апоптоз в активированных CD8+ Т-клетках, противодействует Тклеточной передаче сигналов и блокирует секрецию провоспалительных цитокинов [Rubinstein, N. et al. (2004) Cancer cell 5, 241-251; Garin, M.I. et al. (2007) Blood 109, 2058-2065]. Ранее было продемонстрировано в GL261, модели глиобластомы на мышах, что истощение Gal-1 может увеличивать эффективность иммунотерапии на основе DC [Verschuere, Т. et al. (2014) Int J Cancer. 134, 873-884]. Ha основании указанных данных считают, что Gal-1 представляет собой высокоактивный иммунный регулятор (в GBM). Gal-1 вовлечен не только в иммунную супрессию для прогрессирования GBM, но этому лектину также были приписаны несколько других ключевых признаков [Cam by, I. et al. (2006) Glycobiology 161, 37R157R]. Положительная регуляция Gal-1 коррелирует с повышенной подвижностью клеток GBM. Посредством перестройки скелета актина Gal-1 может вводить в клетки GBM мигрирующий фенотип. Более того, было доказано, что Gal-1 стимулирует ангиогенез в микроокружении опухоли. Избыточно экспрессировать Gal-1 могут не только клетки GBM, но также эндотелиальные клетки, ассоциированные с опухолью. Функционируя в качестве модулятора для созревания фактора роста эндотелия сосудов, Gal-1 может стимулировать рост сосудов. Более того, было обнаружено, что Gal-1 функционирует в качестве медиатора химиорезистентности клеток GBM по отношению к темозоломиду, наиболее часто используемому химиотерапевтическому средству при GBM. Gal-1 может регулировать стресс эндоплазматического ретикулума для стимуляции выживаемости клеток при лечении темозоломидом [Le Mercier, M. et al. (2008) J. Neuropathol. Ex Neurol 67, 456-469; Le Mercier, M. et al. (2008) Toxicol Appl. Pharm, 229, 172183; Croci, D.O. et al. (2014) Cell 156, 744-758.] Обобщенно, Gal-1 представляет собой решающий медиатор на стыке многих стимулирующих GBM явлений и, следовательно, представляет собой идеального кандидата для нацеленного воздействия.
Многие стратегии использовали для нацеленного воздействия на Gal-1. В частности, малые молеку- 1 038254 лы, такие как Davanat®, OTX-008 (Anginex), характеризуются доказанной эффективностью при различных злокачественных опухолях [Astorgues-Xerri, L. et al. (2014) Eur J Cancer 50, 2463-2477]. Кроме малых молекул также были разработаны антитела для блокировки Gal-1. Два основных препятствия встречаются при супрессии Gal-1: нацеленное воздействие как на внутриклеточную, так и на внеклеточную фракцию Gal-1, и специфичность супрессии. Все еще обсуждается интерференция в отношении других галектинов, поскольку некоторые галектины могут характеризоваться регрессирующими опухоль свойствами. Для удовлетворения указанных требований разработка молекул на основании РНК-интерференции представляет собой очень перспективный подход. Короткие двухцепочечные молекулы малой интерферирующей РНК (миРНК) можно загрузить в индуцируемый РНК комплекс сайленсинга (комплекс RISC) и селективно разрушать иРНК, кодирующую Gal-1 [Schutze N. (2004) Mol. Cell Endocrinol. 213, 115-119]. В некоторых статьях уже продемонстрировали эффективность нацеленного воздействия миРНК на Gal-1 в клетках GBM [Le Mercier et al. 2008, оба процитированы выше]. Хотя эффективность миРНК редко бывает проблемой, главной трудностью является достижение критической концентрации в месте локализации опухоли. Наиболее перспективный способ, упомянутый в литературе, представляет собой достижение опухоли GBM посредством интравентрикулярной инъекции, при которой молекулы миРНК инфузируют с помощью осмотического мининасоса [Thakker, D.R. et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101, 1727017275]. В клинических условиях системы конвекционной доставки используют для интрацеребральных инъекций в отношении опухолей головного мозга [Debinski, W.& Tatter, S.B. (2009) Exp. Rev. Neurother.9, 1519-1527]. Даже с перспективными клиническими результатами этой инвазивной технике присущи осложнения. Часто наблюдаются инфекции, кровоизлияния, проблемы заживления ран и ненадежные объемы распределения. В частности, для лекарственных средств, которые необходимо вводить постоянно в долгосрочной перспективе, CED представляется бесперспективным.
В последние годы накопилось множество доказательств того, что интраназальный путь может представлять собой неинвазивный альтернативный способ введения [Ilium, L. (2000) Eur. J. Pharm. Sci. 11, 118; Mistry, A. et al. (2009) Int J Pharm, 379, 146-157]. Интраназальный транспорт был описан как прямой путь от носовой полости к центральной нервной системе. Транспорт молекул по этому пути включает в себя экстра- и трансцеллюлярный транспорт через обонятельный и респираторный слизистый эпителий носовой полости. Периваскулярный и периневральный транспорт вдоль обонятельных пучков по направлению к обонятельной луковице и транспорт вдоль тройничных нервов к стволу головного мозга, вероятно, имеет первостепенное значение [Lochhead J.J. & Thorne, R.G. (2012) Adv. Drug Deliv. Rev.64, 614-628]. Оттуда может произойти быстрое распространение в ЦНС. Прямой транспорт от носа к головному мозгу имеет много преимуществ, такие как лучшее соблюдение пациентом предписанного режима лечения посредством самостоятельной доставки, избежание (слишком большой) системной абсорбции и обход гематоэнцефалического барьера (ВВВ) [Groothuis, D.R. (2000) Neuro Oncol, 2, 45-59]. Этот барьер не может быть пересечен без высокой липофильности, или нацеленного воздействия на рецептор, например, трансферрина, и высокая экспрессия эффлюксного насоса предотвратит прохождение. Успешное использование интраназального пути откроет благоприятную возможность использования многих терапевтических молекул для лечения GBM и других заболеваний головного мозга [Kim, I.D. et al. (2012) Mol. Ther, 20, 829-839; Hashizume, R. et al. (2008) Neuro-oncol. 10, 112-120]. Обзор литературы описывает фармацевтические аспекты для дополнительного улучшения транспорта от носа к головному мозгу [van Woensel, M. et al. (2013) Cancers 5, 1020-1048], с комментариями в отношении разработки фармацевтических составов, которые улучшают транспорт, защищают активное лекарственное средство и тем самым увеличивают общую биодоступность активного соединения в ЦНС. В этом отношении составы в виде наночастиц могут предложить интересную новую многофункциональную платформу. Для улучшения транспорта от носа к головному мозгу быстро завоевывают интерес хитозановые наночастицы. Хитозан представляет собой молекулу в-(1-4)-связанного D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина, которые связаны посредством гликозидных связей [Bernkop-Schnurch, А. & Dunnhaupt, (2012) Eur. J. Pharm. Biopharm. 81, 463-469]. В качестве биоразлагаемого, биосовместимого, мягкого иммуногенного и малотоксичного полимера хитозан представляет идеальные характеристики, которые необходимы для будущего фармацевтического применения у людей. Более того, с мукоадгезивными и усиливающими проникновение свойствами это вспомогательное вещество кажется идеальным кандидатом для дополнительного усиления транспорта из носа в головной мозг.
Хитозан стимулирует проникновение путем временного открытия плотных контактов между эпителиальными клетками [Bonferoni, M.C. et al. (2009) Expert Opin. Drug Deliv. 6, 923-939; Davis, S.S. & Ilium, L. (2003J Clin. Pharmacokinet. 42, 1107-1128; Soane, R.J. et al. (2001) Int. J. Pharm. 217, 183-191]. Широко описаны способы получения хитозановых наночастиц. Ионное гелеобразование является одним из самых популярных способов из-за простоты производства и избегания вредных реагентов. Хитозан также широко исследовали в отношении его трансфекционного потенциала, в частности для доставки миРНК в цитозоле из-за эндосомального высвобождения [Katas, Н. & Alpar, H.O. et al. (2006) J. Control. Release 15, 216-225].
В Danhier et al. (2015) Int. J. Pharm. 481, 154-161 раскрыты нагруженные миРНК против галектина-1
- 2 038254 и против EGFR липидно-хитозановые частицы, полученные из хитозана с относительной молекулярной массой, составляющей 5 кДа. В патенте США № US 7964575 раскрыто применение нацеленной против галектина-1 миРНК для лечения злокачественной опухоли и обсуждается доставка посредством назальной ингаляции без дополнительного обсуждения частиц для доставки.
В Le Mercier et al. (2008) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 67, 456-469 раскрыто введение миРНК против галектина-1 в головной мозг посредством осмотических мининасосов.
В Le Mercier et al. (2008) Toxicol. Appl. Pharmacol. 229, 172-183 раскрыта трансфекция миРНК галектина в опухолевых клетках человека, которые впоследствии имплантировали мышам.
В Van Woensel (2013) Cancers 5, 1020-1048 представлен обзор составов для интраназальной доставки и обсуждаются хитозановые наночастицы с фармацевтическими активными соединениями.
В US 20130337067 раскрыты наночастицы с малой молекулярной массой (7-10 кДа) для интраназальной доставки в головной мозг и с большей молекулярной массой (50-190 кДа) для интраперитонеальной доставки. В US 20110033547 раскрыты различные типы хитозановых частиц без указания конкретных путей применения.
В Malhotra (2013) J. Pharmacol, 2013, статье 812387 раскрыты хитозановые частицы с хитозаном с молекулярной массой, составляющей 10 кДа, для интраназальной доставки.
В Malhotra 2013 помимо этого раскрыты хитозановые частицы размером 5-10 нм, полученные из хитозана с молекулярной массой, составляющей 20 кДа.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к новым составам, содержащим наночастицы, инкапсулирующие миРНК, для применения технологии РНК-интерференции для сайленсинга гена галектина-1, вовлеченного в прогрессирование опухоли. Более конкретно, настоящее изобретение относится к хитозановым наночастицам, инкапсулирующим молекулы миРНК против галектина-1, причем указанные наночастицы являются подходящими для доставки указанных молекул миРНК в головной мозг после интраназального введения. Наночастицы согласно настоящему изобретению являются особенно подходящими для лечения опухолей головного мозга, более конкретно для лечения опухолей центральной нервной системы, в частности мультиформной глиобластомы (GBM). Один аспект настоящего изобретения относится к хитозановым наночастицам, содержащим миРНК, нацеленно воздействующую на галектин-1 (анти-Gal1 миРНК) для применения в лечении опухолей центральной нервной системы, таких как мультиформная глиобластома, причем наночастицы вводят посредством интраназальной доставки, и при этом молекулы хитозана в наночастицах характеризуются относительной молекулярной массой, составляющей 30-200 кДа, 30-100 кДа, 30-60 кДа, 45-55 кДа.
Как правило, молекулы поперечно сшиты посредством триполифосфата натрия.
Как правило, анти-GaH миРНК содержит последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере с 80% идентичностью последовательности относительно последовательности нуклеиновой кислоты 5'GCUGCCAGAUGGAUACGAA3' (SEQ ID NO: 1).
Согласно типичным вариантам осуществления гидродинамический диаметр (z-average) частиц составляет от 100 до 200 нм.
Согласно типичным вариантам осуществления коэффициент полидисперсности частиц составляет от 0,15 до 0,40.
Согласно типичным вариантам осуществления по меньшей мере часть молекул хитозана несут одно или несколько звеньев полиэтиленгликоля или одно или несколько звеньев галактозы.
Наночастицы могут дополнительно содержать лиопротектор, такой как сахароза или трегалоза. Другой аспект настоящего изобретения относится к способам лечения опухолей центральной нервной системы у пациента, предусматривающим стадию введения пациенту посредством интраназальной доставки эффективного количества хитозановых наночастиц, содержащих соединения миРНК, нацеленно воздействующие на галектин-1 (анти-Gal1 миРНК), причем молекулы хитозана в наночастицах характеризуются относительной молекулярной массой, составляющей 30-200 кДа.
Варианты осуществления, описанные выше для пункта формулы на второе медицинское применение, в равной степени применимы к указанным способам лечения.
Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтическим композициям для назальной доставки, содержащим хитозановые наночастицы, содержащие соединения миРНК, нацеленно воздействующие на галектин-1 (анти-Gal1 миРНК), и вспомогательное вещество, подходящее для интраназальной доставки, причем молекулы хитозана в наночастицах характеризуются относительной молекулярной массой, составляющей 30-200 кДа. Варианты осуществления, описанные выше для пункта формулы на второе медицинское применение, в равной степени применимы к указанным фармацевтическим композициям.
Другой аспект настоящего изобретения относится к системам интраназальной доставки, содержащим упомянутые выше фармацевтические композиции.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способам получения хитозановых наночастиц. Указанные способы предусматривают следующие стадии:
1) растворение полимеров хитозана, характеризующихся молекулярной массой, составляющей 30-
- 3 038254
200 кДа в уксуснокислом растворе;
2) растворение анти-Gall миРНК в растворе отрицательно заряженного соединения, подходящего для поперечного сшивания полимеров хитозана;
3) добавление раствора, содержащего анти-Gal1 миРНК и соединение для поперечного сшивания, к раствору полимеров хитозана согласно стадии 1) при перемешивании или смешивании комбинированных растворов для получения образования суспендированных хитозановых наночастиц, содержащих анти-GaH миРНК;
4) сбор хитозановых наночастиц с использованием фильтрования, центрифугирования или другой подходящей техники для выделения суспендированных наночастиц.
В настоящем документе анти-GaH миРНК, как правило, содержит последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере с 80% идентичностью последовательности относительно последовательности нуклеиновой кислоты 5'GCUGCCAGAUGGAUACGAA3' (SEQ ID NO: 1).
Полимеры хитозана характеризуются молекулярной массой, составляющей 30-60 кДа или 45-55 кДа.
Как правило, степень деацетилирования полимеров хитозана составляет по меньшей мере 70%.
Как правило, 30-60 мкг анти-GaH миРНК добавляют на мг хитозана.
Поперечно-сшивающее соединение, как правило, представляет собой триполифосфат натрия.
Как правило, массовое отношение хитозана к триполифосфату натрия составляет 2,5 -3,0.
Согласно конкретным вариантам осуществления хитозановые наночастицы, собранные на стадии 4), комбинируют с лиопротектором и впоследствии лиофилизируют. Примеры лиопротекторов представляют собой сахарозу или трегалозу.
В настоящем исследовании авторы настоящего изобретения впервые сообщают о том, как максимально концентрированные хитозановые наночастицы могут доставлять молекулы миРНК в центральную нервную систему в пределах часов после интраназального введения. Указанные наночастицы могут инкапсулировать миРНК, нацеленно воздействующую на Gal-1, в высоком процентном отношении, и защищать их от разложения. Более того, успешная доставка анти-GaH миРНК приводит к сниженной экспрессии Gal-1 в клетках GBM как мыши, так и человека. Настоящее изобретение показывает, что интраназальный путь представляет собой эффективный транспортный путь для доставки видов терапии на основе миРНК, нацеленно воздействующих на Gal-1, в лечении GBM.
Цель настоящего изобретения состоит в получении хитозановых наночастиц, которые инкапсулируют и защищают миРНК, специфические для нацеленного воздействия на Gal-1 в головном мозге после интраназального введения. Авторы настоящего изобретения исследовали их трансфекционный потенциал в клеточных линиях GBM мыши и человека. Более того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что настоящий состав открывает плотные контакты на эпителиальном слое, авторы настоящего изобретения также исследовали быстрое появление меченного флуорофором состава миРНК в центральной нервной системе после интраназальной инстилляции, с преимущественным распределением на обонятельной луковице и заднем мозге; что указывает на частичный транспорт через обонятельный путь и путь тройничных нервов.
Согласно настоящему изобретению раскрыто следующее:
1. Хитозановые наночастицы, содержащие соединения миРНК, нацеленно воздействующие на галектин-1 (анти-GaH миРНК) для применения в лечении опухолей центральной нервной системы, в частности мультиформной глиобластомы.
2. Хитозановые наночастицы согласно утверждению 1, в которых указанная анти-GaH миРНК содержит последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере с 70% идентичностью последовательности относительно последовательности нуклеиновой кислоты 5'GCUGCCAGAUGGAUACGAA3' [SEQ ID NO: 1]. Предпочтительно указанная анти-GaH миРНК характеризуется последовательностью нуклеиновой кислоты по меньшей мере с 80%, например, по меньшей мере с 85, 90 или 95% идентичностью последовательности относительно последовательности нуклеиновой кислоты 5'GCUGCCAGAUGGAUACGAA3' [SEQ ID NO: 1].
3. Хитозановые наночастицы согласно утверждению 1 или 2, причем гидродинамический диаметр (z-average) указанных частиц варьирует от 100 до 300 нм, предпочтительно от 100 до 200 нм.
4. Хитозановые наночастицы согласно утверждениям 1-3, причем коэффициент полидисперсности указанных частиц варьирует от 0,15 до 0,40.
5. Хитозановые наночастицы согласно утверждениям 1-4, в которых по меньшей мере часть молекул хитозана несет одно или несколько звеньев полиэтиленгликоля.
6. Хитозановые наночастицы согласно утверждениям 1-4, в которых по меньшей мере часть молекул хитозана несет одно или несколько звеньев галактозы.
7. Фармацевтический препарат, содержащий хитозановые наночастицы согласно утверждениям 1-6, причем указанный препарат дополнительно содержит лиопротектор.
8. Фармацевтический препарат согласно утверждению 7, в котором указанный лиопротектор представляет собой сахарозу, и причем отношение хитозановой наночастицы к сахарозе, как правило, варьирует от 1/2 до 1/16 или от 1/4 до 1/12, например, составляет приблизительно 1/8.
- 4 038254
9. Фармацевтический препарат согласно утверждению 7, в котором указанный лиопротектор представляет собой трегалозу, и причем отношение хитозановой наночастицы к сахарозе, как правило, варьирует от 1/8 до 1/28 или от 1/10 до 1/20, например, составляет приблизительно 1/14.
10. Фармацевтический препарат согласно утверждениям 8 или 9, причем указанный фармацевтические препарат содержит вспомогательные вещества, подходящие для его назального введения.
11. Система интраназальной доставки, содержащая хитозановые наночастицы согласно любому из утверждений 1-6.
12. Способ получения хитозановых наночастиц согласно утверждениям 1-6, причем указанный способ предусматривает следующие стадии:
i) растворение полимеров хитозана, характеризующихся молекулярной массой, составляющей 30200 кДа, в уксуснокислом растворе;
ii) растворение анти-Gal1 миРНК в растворе отрицательно заряженного соединения, подходящего для поперечного сшивания полимеров хитозана;
iii) добавление раствора, содержащего анти-Gal1 миРНК и поперечно-сшивающее хитозан соединение, к раствору хитозана согласно стадии (i) при перемешивании или смешивании указанных комбинированных растворов для получения образования суспендированных содержащих анти-Gal1 миРНК хитозановых наночастиц;
iv) сбор указанных содержащих анти-Gal1 миРНК хитозановых наночастиц с использованием фильтрования, центрифугирования или другой подходящей техники для выделения суспендированных наночастиц.
13. Способ согласно утверждению 12, в котором указанные полимеры хитозана характеризуются молекулярной массой, составляющей 30-60 кДа.
14. Способ согласно утверждениям 12 или 13, в котором степень деацетилирования указанных полимеров хитозана составляет по меньшей мере 70%.
15. Способ согласно утверждениям 12-14, в котором 30-60 мкг анти-Gal1 миРНК добавляют на мг хитозана.
16. Способ согласно утверждениям 12-15, в котором указанное поперечно-сшивающее хитозан соединение представляет собой триполифосфат натрия.
17. Способ согласно утверждению 16, в котором массовое отношение хитозана к триполифосфату натрия составляет 2,5-3,0.
18. Способ согласно утверждениям 12-17, в котором хитозановые наночастицы, собранные на стадии (iv), комбинируют с лиопротектором и впоследствии лиофилизируют.
19. Способ согласно утверждению 18, в котором указанный лиопротектор представляет собой сахарозу.
20. Способ согласно утверждению 18, в котором указанный лиопротектор представляет собой трегалозу.
Наночастицы для применения в трансназальной доставке, с одной стороны, должны являться достаточно большими, чтобы экранировать миРНК от разложения, и, с другой стороны, достаточно маленькими, чтобы легко транспортироваться из носовой полости к головному мозгу, и достаточно быстро высвобождать свое содержимое - лекарственное средство из частицы. В отличие от современного взгляда на наночастицы для трансназальной доставки лекарственного средства, при которой небольшие наночастицы используют с хитозаном с низкой относительной молекулярной массой, примеры согласно настоящему изобретению иллюстрируют, что частицы с большей относительной молекулярной массы хитозана все еще являются эффективными, что указывает на то, что частицы попадают на целевой сайт, что разложение РНКазой является допустимым и что миРНК высвобождается достаточно быстро.
Вследствие этого, частицы, раскрытые в настоящем изобретении, можно помимо этого использовать для миРНК против других целевых генов в головном мозге. Кроме того, модель опухоли на мышах, описанная в примерах, является подходящей для дополнительной оптимизации физических параметров хитозановых наночастиц.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Экспрессия Gal-1 в клетках, культивированных в присутствии загруженных анти-Gal1 наночастиц, полученных с использованием 20 кДа или 50 кДа хитозана. (А) Изображение анализа вестернблоттинга Gal-1 в клеточных лизатах клеток GL261 через 4 и 7 дней после трансфекции с использованием загруженных Gal-1 миРНК наночастиц, полученных с помощью 20 кДа и 50 кДа хитозана, соответственно. (В) Этот эксперимент повторяли 3 раза и количественно определяли с помощью анализа ImageJ.
Фиг. 2. Емкость загрузки и защита от РНКаз в хитозановых наночастицах, содержащих молекулы хитозана, характеризующиеся молекулярной массой, составляющей 50 кДа. миРНК включена в очень высоком процентном отношении, без визуальной миграции свободной миРНК; более того, миРНК была защищена от РНКаз во время различных временных интервалов совместной инкубации (3 ч, 2 ч, 1 ч и 0,5 ч). Свободная миРНК быстро разлагалась. CS NP: хитозановые наночастицы, SDS: додецилсульфат натрия.
Фиг. 3. Взаимодействие хитозановых наночастиц с клетками GBM. Анализ на клеточной линии
- 5 038254 глиобластомы мыши (А, В и С) или человека (D, E, F). Изображения иммунофлуоресценции (представленные в оттенках серого цвета) клеток GL261 (А) и первичной культуры GBM человека (D), соответственно, со светлым полем или DAPI в качестве фона, через 2 ч после инкубации с наночастицами. Указанные изображения показывают быстрое прикрепление состава на клетки; (В) Относительный анализ Gal-1/GAPDH иРНК на обработанных клетках GL261 выявил значимое снижение Gal-1 (темный столбик; с миРНК и белый столбик; без миРНК, выраженное как среднее + SD, двухфакторный дисперсионный анализ); (С) Вестерн-блоттинг обработанных клеток GL261 на 4 и 7 день после трансфекции подтверждает снижение Gal-1 на уровне белка; (Е) Количественное определение шести независимых первичных культур GBM человека на 4 и 7 день после трансфекции показывает значимое снижение Gal-1 (n=6, парный t-критерий, односторонний); (F) Пример одного из результатов вестерн-блоттинга первичной культуры GBM человека на 4 и 7 день после трансфекции. *p<0,05 и **p<0,01.
Фиг. 4. Анализ методом зарастания царапины для анализа миграции на клетках GL261. Количественное определение площади царапины через 48 ч после получения царапины показывает, что клетки GL261 со сниженным Gal-1 менее активно мигрируют в царапину (n=12, выраженное как среднее + SEM, однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественного сравнения Бонферрони, рассчитанное как % от времени = 0) *р<0,05
Фиг. 5. Взаимодействие хитозановых наночастиц с эпителиальными клетками. (А) Представление в оттенках серого цвета изображения иммунофлуоресценции монослоя Calu-3, ядра: идентифицируемые как темно-серые точки в представлении в оттенках серого цвета (исходный цвет: синий), тубулин: невидимый в оттенках серого цвета (исходный цвет: желтый), наночастицы: идентифицируемые как светлые пятна/области в представлении в оттенках серого цвета (исходный цвет: зеленый), через 2 ч после инкубации, демонстрируя быстрое прикрепление; (В) Измерение TEER через 2 ч после инкубации с хитозановыми наночастицами, указывает на значимое временное уменьшение устойчивости, скорректированное на исходный TEER в момент времени = 0. (n=9, выраженное как среднее + SD, однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественного сравнения Данна); (С) Прохождение FD4 на монослое Calu-3, выраженное как % увеличения потока с течением времени, подтверждает увеличенное прохождение FD4 после применения хитозановых наночастиц (n=6, выраженный как среднее + SEM); (D) Изображение иммунофлуоресценции в отношении локализации ZO-1, через 2 ч после инкубации подтверждает временное нарушение плотного контакта (изображение представляет канал зеленого с оттенках серого, соответствующий окрашиванию Z01). **р<0,01.
Фиг. 6. Флуоресцентная микроскопия распределения/локального тропизма в микроокружении опухоли. (А) Конфокальное изображение получившей лечение мыши через 4 ч после последнего введения нагруженных меченной флуоресцеином миРНК наночастиц в центре опухоли BFP-GL261; с представленными вверху отдельными каналами цветности; это изображение подтверждает распределение посредством системной циркуляции, ассоциированной с несколькими сосудами. (В) Конфокальное изображение получившей лечение мыши через 4 ч после последнего введения нагруженных меченной флуоресцеином миРНК наночастиц на границе опухоли BFP-GL261; с представленными вверху отдельными каналами цветности; это изображение подтверждает локальное обогащение в окружении опухоли.
Фиг. 7. Специфический нокдаун Gal-1. (А) Вестерн-блоттинг мышей, получивших лечение с помощью анти-Gal1 терапии или не получивших лечение. Вестерн-блоттинг проводили для Gal-1 и Gal-3 в качестве дополнительного опухолеассоциированного белка; (В) Количественное определение вестернблоттинга посредством расчета интенсивности ImageJ. Этот анализ выявляет специфический нокдаун Gal-1 у получивших лечение мышей, и в меньшей степени Gal-3. (непарный односторонний t-критерий; n=10/группа; **p<0,01, * **p<0,001, показанные результаты вестерн-блоттинга принадлежат двум независимым экспериментам).
Фиг. 8. Относительный нокдаун Gal-1. (А) Анализ RT-кПЦР мышей, получивших лечение с помощью анти-Gal1 терапии или не получивших лечение. Этот анализ выявляет подтверждение нокдауна Gal1 у получивших лечение мышей (непарный односторонний t-критерий; n=10/группа, p=0,14).
Фиг. 9. Анализ выживаемости после инокуляции опухоли GL261. Мышам интракраниально вводили инъекцию 0,5 х106 клеток опухоли мыши GL261. Впоследствии мышей оставляли без лечения или лечили с помощью нагруженных анти-Gal1 миРНК хитозановых наночастиц в дни 5, 8, 12 и 15 после инокуляции опухоли. Снижение Gal-1 значимо увеличивало выживаемость получивших лечение мышей (n=15/группа, логарифмический ранговый критерий, **p<0,01).
Фиг. 10. Подтверждение нокдауна Gal-1 посредством иммунофлуоресценции. (А) Количественное определение у 4 получивших лечение с помощью анти-Gal1 миРНК мышей по сравнению с 5 не получившими лечение контрольными мышами. (Критерий Манна-Уитни; *p<0,05), (В) Изображения в оттенках серого цвета репрезентативных иллюстраций иммунофлуоресценции области опухоли получившей и не получившей лечение мыши, соответственно.
Подробное раскрытие настоящего изобретения Определения
В контексте настоящего изобретения 'хитозан' представляет собой молекулу в-(1-4)-связанного D- 6 038254 глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина, которые связаны посредством гликозидных связей. В контексте настоящего изобретения хитозан получают путем ионного гелеобразования. Молекулы хитозана, используемые в качестве исходного материала в получении указанных наночастиц, характеризуются молекулярной массой, составляющей 30-200 кДа или 30-100 кДа, например, 30-60 кДа или 45-55 кДа (например, 50 кДа).
В контексте настоящего изобретения 'хитозановые наночастицы' относится к наночастицам, например, полученным с помощью ионного гелеобразования с использованием подходящей поперечносшивающей молекулы, такой как триполифосфат натрия (ТРР). Хитозановые наночастицы используют для инкапсулирования молекул анти-Gal1 миРНК. Инкапсулирование молекул миРНК, например, можно достичь путем предварительной инкубации миРНК и ТРР перед образованием наночастиц. Наночастицы согласно настоящему изобретению, как правило, характеризуются гидродинамическим диаметром, составляющим 100-300 нм или 100-200 нм. Кроме того, коэффициент полидисперсности, являясь величиной распределения наночастиц по размерам, как правило, варьирует от 0,15 до 0,40, более предпочтительно от 0,2 до 0,30.
Хитозановые частицы могут представлять собой немодифицированные частицы или могут являться дополнительно модифицированными, например, с помощью PEG или галактозы.
В контексте настоящего изобретения анти-Gal1 миРНК относится к конструкту миРНК, который подвергает сайленсингу трансляцию галектина-1 (см. идентификатор входа UniProt P09382, в последний раз модифицированный 16 мая 2014 г.) Конструкты анти-Gal1 миРНК характеризуются последовательностью нуклеиновой кислоты по меньшей мере с 70, 85, 90, 95% идентичностью последовательности относительно последовательности нуклеиновой кислоты 5'GCUGCCAGAUGGAUACGAA3' [SEQ ID NO: 1] (например, 3, 2 или 1 различие в нуклеотидной последовательности).
Как проиллюстрировано в примерах согласно настоящему изобретению, использовали одну миРНК против одного гена. Предусмотрено, что можно использовать различные миРНК против галектина-1, и, кроме того, что можно использовать одну или несколько миРНК против другого гена, вовлеченного в опухоли центральной нервной системы.
В контексте настоящего изобретения термин опухоли центральной нервной системы относится к любой из опухолей, классифицируемых ВОЗ, как описано в Acta Neuropathologica, August 2007, 114(2), 97-109. Настоящее изобретение, в частности, относится к опухолям нейроэпителиальной ткани, таким как астроцитарные опухоли, более конкретно, к опухолям - глиобластомам, таким как мультиформная глиобластома.
Коэффициент полидисперсности, [Θ], может относиться или к молекулярной массе [ΘΜ], или к степени полимеризации [ΘΧ] . Его можно рассчитать с использованием уравнения DM=Mw/Mn, где Mw представляет собой средневесовую молярную массу, и Мп представляет собой среднечисловую молярную массу. Также его можно рассчитать в соответствии со степенью полимеризации согласно ΘX=Xw/Xn, где Xw представляет собой средневесовую степень полимеризации, и Xn представляет собой среднечисловую степень полимеризации.
Распределение частиц по размеру описывается гидродинамическим диаметром таких частиц, причем утверждение от x нм до y нм указывает на то, что в пределах популяции по меньшей мере 60, 75, 80, 90 или 95% частиц характеризуются гидродинамическим диаметром в пределах указанного диапазона.
Лечение в контексте настоящего изобретения относится к любому параметру, который является показателем улучшения здоровья пациента. В контексте настоящего изобретения этот термин относится к таким параметрам, как уровень выживаемости после лечения, частичное или полное снижение размера или массы опухолевой ткани, уменьшение жалоб пациента (таких как припадок, тошнота, рвота, головная боль, потеря памяти, гемипарез, прогрессирующее расстройство памяти, изменение личности или неврологическое расстройство).
Вспомогательные вещества для интраназальной доставки описаны, например, в заявке на выдачу патента США № US 2013/0337067 и включают в себя фармацевтически приемлемые разбавители, консерванты, солюбилизаторы, эмульгаторы, адъюванты и/или носители. Такие композиции представляют собой жидкости или лиофилизированные или иным образом высушенные составы и включают в себя разбавители с различным буферным содержимым (например, Tris-HCI, ацетат, фосфат), pH и ионной силой, такие добавки, как альбумин или желатин, для предотвращения абсорбции к поверхностям и детергенты (например, Tween 20™, Tween 80™, Pluronic F68™, соли желчных кислот). Фармацевтическая композиция может содержать фармацевтически приемлемые солюбилизирующие средства (например, глицерин, полиэтиленгликоль), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метабисульфит натрия), консерванты (например, тиомерсал, бензиловый спирт, парабены), объемообразующие вещества или модификаторы тоничности (например, лактоза, маннит).
Интраназальная доставка относится к экстра- и трансцеллюлярному транспорту через обонятельный и респираторный эпителий слизистой оболочки из носовой полости в головной мозг. Этот физиологический процесс подробно описан в Van Woensel et al. (2013), процитированном выше. Устройства для
- 7 038254 интраназальной доставки являются коммерчески доступными и известны под торговыми названиями
Vianase (Kurve Technologies, США) DirectHaler (Дания) или OptiMist (Норвегия).
миРНК (малая интерферирующая РНК) относится к коротким молекулам РНК для нокдауна генов, которая связывается с иРНК целевого гена. Они, как правило, составляют 20-24 нуклеотидов в длину, и их можно вводить в виде одноцепочечных молекул, а также в виде более длинных двухцепочечных молекул (например, шпилечные РНК), которые процессируются в организме до одноцепочечных молекул.
Примеры
Материал и методы.
Хитозан (Heppe Medical Chitosan, Германия) получали с точно определенной молекулярной массой, составляющей 50 кДа, измеренной как вязкость 10 мПа как 1% в 1% уксусной кислоты при 20°C. Степень деацетилирования составляла 85,2%. Триполифосфат натрия (ТРР), сахароза, додецилсульфат натрия (SDS) и FITC-декстран (FD4) приобретали у Sigma-Aldrich (238503, S 9378, 71727, 46944, СентЛуис, США). Авmи-Gal1 миРНК человека: 5'GCUGCCAGAUGGAUACGAAdTdT3' [SEQ ID NO: 2], мыши: 5ACCUGUGCCUACACUUCAAdTdT3' [SEQ ID NO: 3] и скремблированную миРНК (5'GGAAAUCCCCCAACAGUGAdTdT3' [SEQ ID NO: 4] приобретали у GE Dharmacon и при необходимости метили с помощью флуоресцеина или 5'-красителя 547 (индивидуальный заказ, Лафейетт, США).
Индуцированные метилхолантреном клетки глиомы GL261 сингенных мышей C57BL/6J были любезно предоставлены Dr. Eyupoglu (University of Erlangen, Германия) и их культивировали, как описано в Maes, W. et al. (2013) Clin. & Dev. I Immunol., 2013 Article ID 952469.
В некоторых экспериментах использовали клетки GL261, которые экспрессировали синий флуоресцентный белок (BFP). Путем лентивирусной трансдукции вводили продукцию BFP.
Первичные культуры глиобластомы получали из полученного при резекции образца от пациентов после получения информированного согласия. Вкратце, образец опухоли диссоциировали посредством 30' инкубации с коллагеназой D и ДНКазой при 37°C. Впоследствии мононуклеары выделяли на градиент Ficoll (Lymphoprep, AxisShield, Норвегия, и клетки высеивали в среду RPMI при условиях 20% FCS. Клеточную линию Calu-3 приобретали в Американской коллекции типовых культур, /АТССНТВ-55, и культивировали при таких же условиях, как описано в Vllasaliu, D. et al. (2010) Int. J. Pharm. 400, 183-193.
8-10 недельных самок мышей C57BL/6J приобретали в Harlan (Horst, Нидерланды). Мышей содержали при общепринятых условиях при отсутствии патогенов. Все эксперименты одобрены комитетом по биоэтике KU Leuven, который следует международным нормам.
Получение наночастиц. Наночастиц получали с помощью ионного гелеобразования. Полимеры хитозана положительно заряжали путем растворения в буфере 0,1 М уксусной кислоты, pH 4,5. ТРР выбирали в качестве поперечно-сшивающего средства для соединения между собой полимеров хитозана. Вследствие отрицательного заряда как ТРР, так и фосфатов миРНК, хитозановые наночастицы образовывались спонтанно [Katas & Alpar, процитированный выше]. ТРР (1 мг/мл) добавляли к хитозану (0,7 мг/мл) при постоянном перемешивании, с массовым отношением хитозана к ТРР, составляющим 2,625/1. Инкапсулирование молекул миРНК достигали путем предварительной инкубации миРНК и ТРР перед образованием наночастиц, с общим количество, составляющим 24 мкг миРНК на 1 мл наночастиц. Наночастицы перемешивали в течение 30' при комнатной температуре. Впоследствии частицы собирали посредством ультрацентрифугирования при 40000xg в течение 20 мин. Осадок растворяли в буфере 0,075 М уксусной кислоты, рН 4,5 и супернатант центрифугировали снова дважды. Три осадка объединяли и лиофилизировали с помощью сахарозы в качестве лиопротектора с массовым отношением наночастица/лиопротектор, составляющим 1/8.
Определение характеристик наночастиц: Размер, заряд и стабильность. Гидродинамический диаметр (Z-average), коэффициент полидисперсности (PDI) и дзета-потенциал состава в виде наночастиц определяли с помощью динамического рассеяния лазерного излучения и лазерного допплеровского электрофореза с использованием Zetasizer nano ZS (анализатор размера частиц, молекулярной массы и дзетапотенциала) (Malvern Instruments, Великобритания). Измерения проводили после разведения 1:10 в буфере 0,075 М уксусной кислоты, рН 4,5, при 37°C в трех повторностях. Стабильность наночастиц оценивали путем консервирования при 4°C в сушильном шкафу.
Определение характеристик наночастиц: эффективность инкапсулирования миРНК. Инкапсулирование миРНК в % определяли с использованием анализа SYBR green [Pardridge, W.M. (2007) Drug Discov Today 12, 54-61]. Этот селективный краситель может излучать флуоресценцию только при связывании в спирали молекул миРНК. Частицы получали и перемешивали в течение 30'. Впоследствии частицы инкубировали с SYBR green в течение 30'. Свободную миРНК использовали для получения стандартной кривой и обнаруживали с помощью спектрофотометра для чтения планшетов для визуализации флуоресценции в черном 96-луночном планшете (Nunc), при 480 нм (длина волны возбуждения) и 520 нм (длина волны детекции). В качестве положительного контроля 0,1% SDS добавляли для разрушения ионных комплексов. В параллели процентное отношение свободной миРНК также оценивали в супернатанте после ультрацентрифугирования путем измерения флуоресцентной несвязанной миРНК.
Определение характеристик наночастиц: Защита от разложения миРНК. Защиту от разложения миРНК с помощью рибонуклеаз (РНКазы) оценивали с помощью анализа на замедление подвижности в
- 8 038254 геле. Вкратце, хитозановые наночастицы инкубировали с 0,07% рекомбинантной RNaseA (12019-021, Life Technologies) при 37°C. Далее частицы загружали на 4% агарозный гель, который получали с помощью буфера Tris/борат/EDTA (10х Ultrapure TBE, Life Technologies). Для лучшей визуализации частицы диссоциировали с помощью 0,1% SDS перед их загрузкой на гель. Равное количество свободной миРНК также инкубировали с RNaseA и загружали на гель. Миграцию миРНК усиливали путем приложения 55 В в течение 2 ч. Визуализации достигали путем окрашивания геля с помощью этидия бромида в течение 30'.
Взаимодействие с клетками глиомы. Как клетки глиомы GL261 мыши, так и клетки первичной культуры глиобластомы человека выращивали на покровном стекле. Далее частицы, нагруженные меченной флуоресцеином миРНК, инкубировали с клетками. С равными временными интервалами покровные стекла отмывали и фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 10'. В случае первичных культур человека дополнительное иммунофлуоресцентное окрашивание проводили, которое окрашивало их ядра с помощью 4',6-диамидино-2-фенилиндолдигидрохлорида (DAPI, Sigma).
Анализ трансфекции. Клетки GL261 и клетки первичной культуры глиобластомы человека культивировали вплоть до плотности, составляющей максимум 60% полной конфлюентности. Хитозановые наночастицы добавляли в условия бессывороточного культивирования в течение ночи вплоть до конечной концентрации миРНК, составляющей 20 нМ. Клетки тщательно отмывали с помощью PBS и помещали обратно в содержащие сыворотку кондиционные среды. Из этой клеточной популяции клетки глиобластомы высеивали для оценки эффективности трансфекции с течением времени.
Анализ трансфекции: иРНК. Обработанные клетки собирали в разные дни после трансфекции и выделяли РНК (Miniprep, Qiagen) и осуществляли контроль качества посредством спектрофотометра (Nanodrop, Thermo Scientific). Впоследствии матрицу кДНК создавали посредством обратной полимеразной реакции (Superscript II, Invitrogen) и количественную полимеразную реакцию в режиме реального времени (RT-кПЦР) проводили на указанных образцах. Представленные ниже пары праймеров использовали для детекции галектина-1 и GAPDH в качестве конститутивного гена (табл. 1). Отношение Gal-1/GAPDH в необработанных клетках использовали как 100% исходный уровень.
Таблица 1. Пары праймеров и зонды для RT-кПЦР. Последовательности для Gal-1 и GAPDH для количественного определения количества мышиной иРНК, кодирующей Gal-1.
Ген Праймер/зонд последовательность SEQ ID NO:
Галектин-1 прямой саа tea tgg cct gtg gtc tg 5
обратный etg tag gca cag gtt gtt get g 6
Taqman зонд teg cca gca ace tga ate tea aac ct 7
GAPDH прямой tea cca cca tgg aga agg c 8
обратный get aag cag ttg gtg gtg ca 9
Taqman зонд atg ccc cca tgt ttg tga tgg gtg t 10
Анализ трансфекции: Белок. Обработанные клетки собирали в разные дни после трансфекции и выделяли белки (Tissue Protein Extraction Reagent, Life Technologies). Концентрацию белка определяли посредством колориметрического анализа (набор ВСА, Life Technologies). Равные количества общего белка разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия и переносили на мембарну из поливинилидендифторида. Мембраны инкубировали в течение ночи с первичным антителом: кроличье антитело к галектину-1 (1:1000; Peprotech, Quebec, Канада). В качестве контроля белковой нагрузки все мембраны блоттинга окрашивали кроличьим антителом к Р-актину (1:5000; Abeam). Используемое вторичное антитело представляло собой конъюгированное с пероксидазой козье антитело к IgG кролика (1:5000; Dako). Визуализация проводили посредством хемилюминесценции (Western Lightening, Perkin Elmer). Количественное определение полос проводили с помощью программного обеспечения ImageJ.
Анализ трансфекции: Анализ миграции. Через 4 дня после трансфекции клетки GL261 помещали в 6-луночные планшеты. Клеткам позволяли прикрепиться в течение ночи и расти до монослоя. С помощью наконечника 200 мкл пипетки делали царапину, не нарушая покрытие планшета. Три независимых изображения получали от этой царапины и эксперимент проводили в четырех параллелях. Изображения получали через 12, 23 и 48 ч после получения царапины. Площадь поверхности рассчитывали посредством программного обеспечения (ImageJ) и рассчитывали как % по сравнению с исходным значением площади поверхности.
Целостность эпителиального барьера. Клетки Calu-3 высеивали с плотностью, составляющей 250000 клеток на вкладыш, выращивали до монослоя на 12-луночном вкладыше Transwell (0,4 мкм вкладыш из полупрозрачного сложного полиэфира, Greiner).
Через 14 дней формировался монослой, который проявлял стабильное трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER). Для подтверждения плотного монослоя и адгезии состава на монослое проводили иммунофлуоресцентное окрашивание. После фиксации клетки пермеабилизировали в буфере
- 9 038254
Tris/NaCl/Tween (TNT) с помощью triton-X 100 и добавляли кроличье первичное антитело к тубулину (1/100, abl5246, Abeam). Клетки тщательно отмывали и добавляли конъюгат ослиного антитела к IgG кролика с AlexaFluor 555 (1/200, A31572, Life Technologies). После чего добавляли DAPI для окрашивания ядер. В случае оценки плотного контакта авторы настоящего изобретения использовали антитело к ZO-1 в качестве первичного антитела (1/100, 33-910, Life technologies). Измерения TEER получали с использованием вольтомметра EVOM (World Precision Instruments), оснащенного парой стержневых электродов. Для оценки способности хитозановых наночастиц временно нарушать целостность эпителиального барьера хитозановые наночастицы инкубировали на монослое клеток Calu-3. Измерения исходного уровня TEER выражали как 100%. Кроме того, проницаемость для макромолекул измеряли в качестве альтернативного параметра для оценки целостности эпителиального барьера. FD4 использовали в качестве гидрофильного модельного лекарственного средства, которое, наиболее вероятно, перемещается в парацеллюлярных пространствах.
In vivo введение и оценка. Для in vivo исследований распределения мышам вводили анестезию с помощью 3% изофлурана в течение периода введения. Каждой мыши вводили 8 раз 3 мкл капли с временным интервалом, составляющим 3' между каждой каплей. Введения проводили или 1 раз, или 3 раза в течение 3 дней подряд и через 4 ч после последнего введения мышей умерщвляли путем интраперитонеальной инъекции нембутала и перфузировали с помощью холодного PBS с последующей перфузией с помощью 4% формальдегида. Слизистую носовой полости и головной мозг аккуратно удаляли и фиксировали в течение дополнительных 12 ч с помощью 4% формальдегида. Слизистую носовой полости получали для изготовления срезов с помощью скальпелей и классического изготовление срезов по 5 мкм из залитых парафином блоков на микротоме. Образцы головного мозга получали для получения 200 мкм срезов с помощью вибротома путем погружения в 4% агарозу. Срезы консервировали в PBS, содержащем 0,01% азид натрия, до окрашивания и визуализации. Все образцы окрашивали с помощью DAPI в отношении ядер в качестве исходного строения. Для визуализации сосудов авторы настоящего изобретения использовали техники окрашивания. Для in vivo окрашивания сосуда вводили с помощью инъекции 50 мкг изолектина-488 внутривенно за 2 ч до умерщвления (121411, Life Technologies). Для окрашивания кровеносных сосудов на вибротомных срезах авторы настоящего изобретения блокировали с помощью TNT, содержащего блокирующий реагент (FP1012, Perkin Elmer) и пермеабилизировали с помощью Triton-X 100, и инкубировали в течение ночи с первичным кроличьим антителом к GLUT-1 (1/100, 07-1401, Merck Millipore). После тщательного отмывания с помощью TNT ослиное антитело к IgG кролика, конъюгированное с AlexaFluor 555 добавляли в течение ночи (1/200, A31572, Life Technologies), и готовили срезы для микроскопического исследования (заливочная среда Dako). Визуализацию предметных стекол проводили с помощью конфокальной микроскопии (SP8, Leica). Изображения обрабатывали с помощью программного обеспечения ImageJ.
Инокуляция опухоли и интраназальное введение. Мышам вводили интракраниально с помощью инъекции GL261-WT или GL261-BFP опухолевые клетки, как описано ранее [Vllasaliu, D. (2010) Int. J. Pharm, 400, 183-193]. Вкратце, 0,5х106 опухолевых клеток вводили с помощью инъекции на 2 мм латерально и 2 мм назад от брегмы на глубину 3 мм ниже твердой мозговой оболочки с использованием стереотаксической рамки (Kopf Instruments, Tujunga, CA). Стереотаксическую инокуляцию проводили при стерильных условиях. Интракраниальные опухоли будут развиваться в пределах 3 недель, и мышей подвергали мониторингу три раза в неделю в отношении массы тела и оценки по шкале неврологических расстройств. Интраназальное введение проводили при анестезии с помощью 2,5% изофлурана. Одна доза для одного животного на один день составляла 24 мкл максимально концентрированных хитозановых наночастиц, как описано выше, которую вводили в виде 8 капель по 3 мкл с 3-минутными временными интервалами. Все эксперименты на животных проводили с разрешения Этического комитета KU Leuven по благосостоянию лабораторных животных.
Анализ иммунофлуоресценции. Для первой серии экспериментов по распределению авторы настоящего изобретения вводили с помощью инъекции изолектин, конъюгированный с AlexaFluor 488 (121411, Life Technologies) за 2 ч до умерщвления животного, что приводило к окрашиванию кровеносных сосудов и, более конкретно, ассоциированных с опухолью кровеносных сосудов. Меченные красителем Dye-547 анти-Gal1 миРНК интраназально вводили за 4 или 8 ч до умерщвления. Мышей умерщвляли посредством летальной инъекции нембутала и перфузировали с помощью PBS (Lonza, Бельгия) с последующей перфузией 4% параформальдегидом посредством кардиальной перфузии на 14 день после инокуляции опухоли. Головной мозг извлекали и фиксировали в течение дополнительной инкубации в течение ночи с 4% параформальдегидом. Головной мозг тщательно отмывали и фиксировали в 4% растворе агара. Впоследствии получали 200 мкм вибротомные срезы и окрашивание ядер проводили с помощью DAPI (Sigma, Бельгия) в течение 20'. Срезы готовили для микроскопического исследования и заливали с помощью флуоресцентной заливочной среды (Dako, Бельгия).
В параллели авторы настоящего изобретения также проводили эксперимент по распределению для определения того, проникает ли состав в клетки опухоли GL261. В указанных экспериментах инокулировали 0,5х106 BFP положительных опухолевых клеток и позволяли опухоли прогрессировать в течение 14
- 10 038254 дней. Нагруженные меченными флуоресцеином анти Gal-1 миРНК наночастицы вводили в течение 3 дней подряд с помощью одной дозы и умерщвляли через 4 ч после последнего введения с последующей обработкой, аналогичной описанной выше. Окрашивание архитектуры кровеносных сосудов блокировали в буфере TNB (0,1 М Tris, pH 7,4; NaCl 150 мМ; 0,5% блокирующий реагент, Perkin Elmer, Бостон) в течение 2 ч при КТ. Ткани инкубировали с кроличьим антителом к GLUT-1 мыши (Millipore), разбавленным в TNB, в течение ночи при 4°C, отмывали в TNT (0,1 М Tris, pH 7,4; NaCl, 150 мМ; 0,2% Triton Х100) и инкубировали со вторичным антителом к антителу кролика, конъюгированному с AlexaFluor-647 (Life Technologies), разбавленному в TNB в течение ночи при 4°C.
Оценка нокдауна Gal-1. Мыши получали за 4 интраназальных введений нагруженные анти-Gal1 миРНК наночастицы в день 5, 8, 12 и 15 после инокуляции опухоли. В день 20 или раньше, если у мышей развивались клинический признаки массивной опухолевой нагрузки, мышей умерщвляли и перфузировали с помощью PBS. Для не получивших лечение мышей зачастую умерщвление проводили до 20 дня, тогда как для получивших лечение с помощью анти-Gal1 миРНК мышей его проводили в день 20. Головной мозг выделяли и гомогенизировали в 2 мл буфера для экстракции белка из ткани (78510, Thermo Scientific). Дебрис удаляли и супернатант использовали для колориметрического анализа белка (набор ВСА, Pierce, Life Technologies) и анализа вестерн-блоттинг. Для Gal-1 авторы настоящего изобретения использовали кроличье антитело к Gal-1 (1/1000; Peprotech) и для Gal-3 кроличье антитело к Gal-3 (1/1000; Abeam). В качестве контроля белковой нагрузки все мембраны блоттинга окрашивали с помощью кроличьего антитела к Р-актину (1/5000; Abeam). Использовали вторичное конъюгированное с пероксидазой козье антитело к IgG кролика (1/5000; Dako) и визуализацию проводили посредством хемилюминесценции (Western Lightening, Perkin Elmer). Количественное определение проводили с помощью программного обеспечения ImageJ. Для анализа иРНК отбирали небольшой кусочек опухоли (<30 мг) и гомогенизировали. Впоследствии РНК выделяли и готовили для RT-кПЦР, как описано ранее. В параллели авторы настоящего изобретения также оценивали нокдаун Gal-1 посредством иммунофлуоресцентного окрашивания. Вкратце, 200 мкм вибротомные срезы окрашивали в отношении Gal-1 (AF1163, R&D) посредством протокола окрашивания, как описано выше для Glut 1. Количественное определение интенсивности флуоресценции измеряли посредством ImageJ и изображали 1 репрезентативный образец для каждой группы. (фиг. 10)
Анализ выживаемости. 30 мышам инокулировали клетки GL261-WT и случайным образом делили на 2 группы. Одну группу оставляли не получившей лечение, но которую также подвергли анестезии с помощью изофлурана, а вторая группа получала 4 дозы хитозановых наночастиц, нагруженных антиGal1 миРНК в день 5, 8, 12 и 15 после инокуляции опухоли. Длительную выживаемость определяли как 3-кратную от медианной выживаемости контрольных мышей.
Статистика. Все данные анализировали с помощью Graphpad Prism 5.0 (Сан-Диего, Калифорния). Для сравнения двух групп проводили t-критерий Стьюдента. В случае сравнения с анти-Gal1 миРНК проводили односторонний анализ. Анализ выживаемости сравнивали с логарифмическим ранговым критерием.
Пример 1. Определение характеристик частиц.
Для выбора оптимального состава посредством процесса оценки получали несколько параметров первостепенного значения. Первый критерий выбора представлял собой размер наночастиц. Следовательно, авторы настоящего изобретения оценивали влияние молекулярной массы полимера хитозана, концентрации хитозана и скорости перемешивания на гидродинамический размер (Z-average) наночастиц (табл. 2). Пониженная молекулярная масса, повышенная скорость перемешивания и пониженная концентрация хитозана давали в результате самые маленькие частицы со средним размером, составляющим 147 нм, и коэффициентом полидисперсности, составляющим 0,27 (табл. 3). Дополнительное разбавление хитозана (<0,7 мг/мл) не привело в результате к образованию частиц (данные не показаны). На дзетапотенциал не оказывали влияние указанные параметры, и определяли, что он составлял +32 мВ. Для последующего исследования отбирали самые маленькие наночастицы; получали их с помощью 50 кДа хитозана, перемешивали при 1300 об/мин и растворяли при 0,7 мг/мл. После получения частицы собирали с помощью ультрацентрифугирования и лиофилизировали без модификации размера и дзета-потенциала частиц (табл. 2). Более того, консервирование указанных частиц показало стабильность при 4°C в сушильном шкафу в течение по меньшей мере 8 недель (данные не показаны).
Молекулярная масса цепи хитозана, скорость перемешивания при получении частиц и концентрация хитозана оказывали значимый эффект на размер полученных наночастиц. Наночастицы являлись инертными после лиофилизации с сахарозой.
- 11 038254
Таблица 2. Критически важные параметры, которые влияют на ионное гелеобразование наночастиц
Переменная Размер (нм ± SD) Эффект (р-значение)
Молекулярная масса 50 к Да 162,7 ±6,7 Да, р= 0,01 *
90 кДа 181,5 ± 10,1
Скорость перемешивания 700 об/мин 177,8 ±2,5 Да, р= 0,009 *
1300 об/мин 137 ±4,6
Концентрация хитозана 0,7 мг/мл 128,8 ± 5,3 Да, р= 0,0027 *
2 мг/мл 306,1 ± 10,6
Процесс лиофилизации До 138,9 ±3,6 Нет, р= 1 *
После 140,6 ± 5,4
* критерий Манна-Уитни # Анализ линейной регрессии.
_____________ Таблица 3. Характеристики частиц
Размер частиц (нм) Дзетапотенциал (мВ) Нагрузка миРНК, введенной в состав (мкг/мл) Нагрузка миРНК (%) Нагрузка миРНК после SDS (%)
140,6 ±5,4 ±32 мВ 24 81 ±2,6 4,1 ±2,4
В этой таблице описан конечный препарат наночастиц, измеренный с помощью анализатора дзетапотенциала и анализа SYBR green. Наночастицы инкапсулируют миРНК в высоком количестве с немедленным высвобождением при контакте с детергентом.
Заключение: исследование, показанное в этом примере, подтверждает возможность осуществления получения хитозановых наночастиц с помощью ионного гелеобразования, которые инкапсулируют молекулы миРНК. Частицы получают при мягких условиях, которые предотвращают разложение миРНК во время получения частиц. Боле подробно, авторы настоящего изобретения описали, как частицы ведут себя при изменении критически важных параметров, например, длины полимера, скорости перемешивания и растворение хитозана (табл. 2). Следовательно, авторы настоящего изобретения описали оптимизированный протокол для концентрирования наночастиц до высокой степени. Концентрация наночастиц имеет первостепенное значение для использования транспорта из носовой полости в головной мозг. Авторы настоящего изобретения исследовали различные концентрации различных лиопротекторов и на основании растворимости и защиты в отношении наночастиц авторы настоящего изобретения выбрали сахарозу в качестве наиболее оптимального лиопротектора.
Для дополнительной оценки важности молекулярной массы молекул хитозана, используемых для получения нагруженных анти-Gal1 наночастиц эффективность трансфекции культивируемых клеток GL261 исследовали в отношении 20 нМ содержащих миРНК хитозановых наночастиц, полученных либо с помощью 20 кДа, либо с помощью 50 кДа полимера. В день 4 и день 7 после трансфекции клеток GL261 с помощью соответственных нагруженных анти-Gal1 миРНК хитозановых наночастиц клетки собирали и лизировали. Впоследствии, экспрессию Gal-1 в клетках оценивали с помощью анализа вестерн-блоттинг соответствующих клеточных лизатов. Как показано на фиг. 1, в день 4 только хитозановые наночастицы, полученные с помощью 50 кДа хитозана, обеспечивали супрессию экспрессии Gal-1 в клетках GL261, тогда как в день 7 наблюдали супрессию экспрессии Gal-1 до сходной степени в клетках, обработанных с помощью 50 кДа и 20 кДа хитозановых наночастиц, соответственно. В общем, более немедленный эффект 50 кДа наночастиц на экспрессию Gal-1 указывает на то, что применение 50 кДа хитозана обеспечивает возможность получения нагруженных анти-Gal1 миРНК наночастиц с повышенной эффективностью трансфекции, по сравнению с применением 20 кДа хитозана. Указанные эксперименты дополнительно подтвердили выбор именно 50кДа хитозана для получения нагруженных антиGal1 миРНК наночастиц для применения в in vivo исследовании интраназального введения таких наночастиц для лечения глиобластомы (см. последующие примеры).
Пример 2. миРНК инкапсулирование и защита от разложения.
Способность хитозановых наночастиц переносить миРНК оценивали с использованием анализа SYBR green. Во избежание потери миРНК максимальную емкость загрузки, составляющую 24 мкг/мл миРНК выбирали для дополнительных исследований: авторы настоящего изобретения обнаружили, что при этом условии 81% миРНК были инкапсулированы в наночастицы. Входящая в состав миРНК немедленно высвобождалась при инкубации с 0,1% SDS, на что указывала внезапная потеря эффективности инкапсулирования (табл. 3). Более того, авторы настоящего изобретения также подтвердили высокую эффективность инкапсулирования посредством процесса концентрирования с помощью ультрацентрифугирования. После трех циклов центрифугирования авторы настоящего изобретения измерили, что 85%
- 12 038254 флуоресцентной миРНК находились внутри осадка (данные не показаны).
Более того, защиту миРНК от разложения оценивали с помощью анализа разложения (фиг. 2). Наблюдали отсутствие разложения миРНК, когда нагруженные миРНК наночастицы инкубировали с РНКазами при 37°C в течение нескольких периодов времени. Для лучшей визуализации частицы немедленно разрушали с помощью добавления SDS непосредственно перед их загрузкой на гель. Напротив, свободная миРНК быстро разлагалась, и ее нельзя было наблюдать. Указанные результаты подтверждают, что очень высокое процентное отношение миРНК инкапсулировано в частицы, и что указанные частицы обеспечивают превосходную защиту от разложения.
Заключение: миРНК, которая была введена в хитозановые наночастицы, находилась в прочных комплексах и не демонстрировала разложение после инкубации с РНКазами.
Пример 3. Поведение наночастиц на опухолевых клетках.
Прикрепление состава исследовали на клеточной линии GBM мыши, GL261, а также на первичных культурах GBM человека. В обоих случаях через 2 ч после совместной инкубации в бессывороточных средах наблюдали быстрое прикрепление на опухолевые клетки (фиг. 3 А+D). Для оценки того, индуцирует ли прикрепление частиц на клетки опухоли GL261 также супрессию Gal-1, проводили анализ иРНК и белка (фиг. 3 В+С). Для клеток GL261 сильное и специфическое разложение иРНК Gal-1 наблюдали вскоре после трансфекции. Через 1 неделю иРНК Gal-1 восстанавливалась. На уровне белка наблюдали сильное снижение, начиная со дня 4 после трансфекции до по меньшей мере дня 7. В параллели анализировали разложение Gal-1 первичных культур (фиг. 3 Е+F). В шести независимых первичных культурах GBM было заметно сильное снижение со дня 4 до дня 7 после трансфекции.
Для дополнительного исследования биологической значимости супрессии Gal-1 оценку подвижности клеток проводили посредством анализа методом зарастания царапины. Через 48 ч после проведения царапины этот анализ выявил профиль значительно пониженной подвижности клеток GL261, когда снизили Gal-1 (фиг. 4), через 23 ч после проведения царапины проявился аналогичный профиль, хотя различие еще не было значимым (данные не показаны). Клеткам опухоли GL261 с подавленным Gal-1 было необходимо больше времени для заполнения площади поверхности, вызванную царапиной.
Заключение: Этот пример показывает быстрое прикрепление к клеткам при применении хитозановых частиц к клеткам GBM (фиг. 3). Для оценки того, поглощаются ли наряду с этим частицы клетками GBM, авторы настоящего изобретения исследовали Gal-1 на уровне иРНК и белка для мышиной клеточной линии и на ровне белка для 6 отдельных опухолевых клеточных линий. Во всех случаях авторы настоящего изобретения наблюдали ингибирование Gal-1, которое продолжалось в течение нескольких дней после однократного введения частиц, хотя клетки GBM представляют собой быстро делящиеся клетки. В качестве контроля авторы настоящего изобретения проверяли специфичность миРНК посредством вестерн-блоттинга галектина-3, при этом авторы настоящего изобретения не наблюдали снижения Gal-3. Механизм высвобождения миРНК из полимера хитозана, наиболее вероятно, основан на эффекте протонной губки, создающем повреждение лизосом путем захвата Н+ первичными аминами полимера хитозана [Nel, A.E. et al. (2009) Nature materials 8, 543-557]. Более того, авторы настоящего изобретения смогли подтвердить эффект на миграцию клеток GBM, при снижении Gal-1 (фиг. 4) [Camby I. et al. (2002) J. Neuropathol. Exp. Neurol,61, 585-596].
Пример 4. Опосредованная составом эпителиальная модуляция.
Модуляцию плотных контактов составами на основе хитозана оценивали с помощью монослоев Calu-3. Сначала авторы настоящего изобретения визуализировали дисперсное распределение хитозановых наночастиц на апикальной стороне монослоя Calu-3 (фиг. 5A). В концентрации, составляющей 0,06% хитозановых наночастиц, и через 2 ч после введения наблюдали значимое снижение сопротивления поверх монослоя. Это снижение сопротивления являлось временным и восстанавливалось не позднее чем через 24 ч после инкубации частиц (данные не показаны). Это снижение сопротивления приводило в результате к тенденции к повышенной проницаемости монослоя для небольших гидрофильных зондов, например, FD4 (фиг. 5 B+C). В соответствии с данными в литературе интернализацию плотных контактов наблюдали после введения хитозана на этот монослой (фиг. 5D). Авторы настоящего изобретения наблюдали нарушение интактного монослоя, что подвергали мониторингу с помощью окрашивания монослоя в отношении белка ZO-1.
С целью интраназального введения и достижения ЦНС необходимо временно нарушить эпителиальный слой. При физиологических условиях в слое слизистой существует тесная взаимосвязь за счет плотных контактов. Авторы настоящего изобретения наблюдали на монослое клеточной линии calu-3 значимое падение сопротивления при применении состава хитозана в концентрации 0,06 % (фиг. 5). При удалении состава сопротивление постепенно восстанавливалось и не больше чем через 24 ч сопротивление восстанавливалось до исходного уровня. Авторы настоящего изобретения отметили также, что наблюдалось устойчивое падение сопротивления в условиях среды, которое, как полагают авторы настоящего изобретения, может быть обусловлено изменением температуры, влажности и содержания CO2, O2, необходимым для проведения измерения сопротивления. Чтобы оценить, находит ли отражение падение сопротивления в увеличенном проходе молекул через барьер, авторы настоящего изобретения инкубировали монослой с наночастицами и FD4. Авторы настоящего изобретения наблюдали тенденцию к повы
- 13 038254 шенным проходам FD4. Интересно, что несмотря на это, 0,03% концентрация не приводила к падению сопротивления. Авторы настоящего изобретения попытались достичь прохода флуоресцентной миРНК, заключенной в хитозановые наночастицы. Авторы настоящего изобретения наблюдали, что хитозановые частицы показали высокую аффинность в отношении сложного полиэфира, и, хотя частицы были меньше, чем внутренний размер поры (0,4 мкм), можно было наблюдать очень низкое прохождение (данные не показаны), даже без высевания клеток на вкладыш. Авторы настоящего изобретения изучали, могут ли они обнаружить открытие плотных контактов посредством иммунофлуоресцентного окрашивания. Авторы настоящего изобретения наблюдали исчезновение молекулы ZO-1 при применении хитозановых частиц через 2 ч как в условиях 0,03%, так и 0,06%, что может объяснить увеличенное прохождение в случае FD4. Указанные результаты указывают на интернализацию плотных контактов под действием стимула хитозана.
Пример 5. Транспорт к центральной нервной системе.
В качестве первого барьера для входа слизистую носовой полости оценивали путем наблюдений с помощью конфокальной микроскопии в отношении появления меченных красным красителем 547 миРНК в препаратах слизистой носовой полости контрольной не получившей лечение мыши, и мышей, умерщвленных через 4 ч и 8 ч, соответственно, после интраназального введения хитозановых наночастиц, содержащий меченные красителем 547 миРНК. У контрольных не получивших лечение мышей не могли наблюдать красный сигнал. У получивших лечение мышей авторы настоящего изобретения могли наблюдать красные наночастицы в слизистой носовой полости через 4 ч и 8 ч после введения. Чтобы дополнительно очертить в деталях прохождение через эпителиальный слой, авторы настоящего изобретения интраназально вводили хитозановые наночастицы, нагруженные меченными красным красителем 547 миРНК, мышам в течение 3 дней подряд и их умерщвляли через 4 ч после последнего введения для обработки с получением классических парафиновых срезов. Заметное присутствие меченных красителем 547 миРНК обнаруживали на слизистой носовой полости. Особенно на слое слизи присутствовала заметная концентрация, а также заметен транспорт по призматическому эпителию, в собственную пластинку слизистой оболочки. Транспорт через слизистую носовой полости, очень вероятно, кажется первичным необходимым элементом для достижения центральной нервной системы. Для дополнительной оценки транспорта к ЦНС обонятельную луковицу и задний мозг, которые являются хорошо описанными точками входа в центральную нервную систему, оценивали в отношении присутствия миРНК. Роль обонятельной луковице в указанном транспорте оценивали с использованием данных конфокальной микроскопии в отношении появления меченной красным красителем 547 миРНК в препаратах обонятельной луковицы контрольной не получившей лечение мыши и мышей, умерщвленных через 4 ч и 8 ч, соответственно, после интраназального введения хитозановых наночастиц, содержащих меченную красителем 547 миРНК. Тщательная оценка обонятельной луковицы указывает на отсутствие флуоресценции у контрольных не получивших лечение мышей. Тем не менее, у получивших лечение мышей авторы настоящего изобретения наблюдали флуоресцентный сигнал на вершине обонятельной луковицы через 4 ч после введения. Авторы настоящего изобретения наблюдают более диффузное распределение меченной красителем 547 миРНК через 8 ч после введения. Для оценки длительного эффекта на вход на обонятельной луковице авторы настоящего изобретения также подвергали мониторингу мышей, которые получали три введения за три дня, и которых умерщвляли через 4 ч после последнего введения. В этом случае авторы настоящего изобретения наблюдают интенсивное распределение в клубочковом слое обонятельной луковицы и более диффузное распределение во внешнем плексиформном слое. Более того, авторы настоящего изобретения также оценивали транспорт к обонятельной луковице и заднему мозгу посредством сходной техники конфокальной микроскопии, которая включала в себя усиление меченной флуоресцеином миРНК с помощью конъюгированного с FITC-FITC антитела. При использовании этой техники флуоресцеин-миРНК можно наблюдать в обонятельной луковице как через 4 ч, так и через 24 ч после введения мышам нагруженных меченными флуоресцеином миРНК наночастиц. Тем не менее, присутствие миРНК наблюдали не только в области обонятельной луковицы, но также в заднем мозге как через 4 ч, так и через 24 ч после введения мышам нагруженных меченными флуоресцеином миРНК наночастиц. Оба места локализации указывают на вышеупомянутые пути. Тройничные нервы также исследовали, но не смогли обнаружить четкого присутствия флуоресцентной миРНК (данные не показаны).
В рамках in vivo оценки авторы настоящего изобретения подтвердили транспорт через слизистую носовой полости. Авторы настоящего изобретения наблюдали быстрое распространение состава уже через 4 ч в слизистую носовой полости, тогда как у контрольных, не получивших лечение мышей наблюдали отсутствие флуорофора. Сложно различить способ транспорта; тем не менее некоторые изображения указывают на транспорт по сосудам, подтверждая периваскулярный транспорт в ЦНС. Плотное накопление вокруг сосудистой сети может также быть источником быстрого систематического распределения. Также через 8 ч авторы настоящего изобретения все еще наблюдали флуоресценцию, присутствующую на слизистой носовой полости. Чтобы пронаблюдать длительные эффекты на слизистой оболочке авторы настоящего изобретения проводили эксперимент по распределению, в котором интраназально вводили хитозановые наночастицы, нагруженные меченной красителем 547 миРНК, в течение 3 дней подряд перед умерщвлением мыши через 4 ч после последнего введения. Указанные срезы обрабатывали путем
- 14 038254 заливки парафином, которая выявляла высокий уровень сигнала в собственной пластинке слизистой оболочки. Кроме того, слой слизи был окрашен положительно в отношении меченной красителем 547 миРНК, и также можно было наблюдать прохождение через клетки призматического эпителия. В предварительных экспериментах по распределению авторы настоящего изобретения не наблюдали увеличение меченной флуорофором миРНК в плазме и печени через 6 ч (данные не показаны). Для оценки распределения в ЦНС авторы настоящего изобретения сначала сфокусировались на обонятельной луковице, так как она представляет собой основной путь поступления. Посредством окрашивания ядер с помощью DAPI авторы настоящего изобретения смогли четко различить клубочковый слой, который характеризуется наличием глубоких структур круглой формы, если луковицу полностью разрезать. Авторы настоящего изобретения наблюдали сильный и увеличивающийся сигнал меченной красителем 547 миРНК через 4 ч и 8 ч после введения сигнала. Более того, после 3 ежедневных введений этот сигнал был более представлен по всей области обонятельной луковицы. Указанные наблюдения четко подчеркивают важность и осуществимость прямого транспорта от носовой полости к центральной нервной системе через обонятельный путь. Далее авторы настоящего изобретения также были заинтересованы в том, чтобы обнаружить присутствие миРНК в заднем мозге в качестве альтернативного пути к ЦНС через тройничные нервы. Чтобы дополнительно усилить сигнал авторы настоящего изобретения окрашивали меченные флуоресцеином миРНК с помощью конъюгированного с FITC антитела к флуоресцеину. В указанных экспериментах сосуды обнаруживали не посредством окрашивания изолектином, а посредством окрашивания с помощью GLUT-1. Авторы настоящего изобретения не только подтвердили в указанных экспериментах присутствие в обонятельной области, но также обнаружили четкий сигнал миРНК в заднем мозге через 4 ч и 24 ч после введения сигнала. Цветные изображения, иллюстрирующие вышеупомянутые наблюдения доступны в Van Woensel et al., (2016) J. Contr. Rel, 227, 71-81.
Пример 6. Распределение в микроокружении опухоли.
Как ранее продемонстрировали авторы настоящего изобретения, состав анmи-Gal1 миРНК с хитозановыми наночастицами может эффективно достигать центральной нервной системы. Чтобы ответить на вопрос, можно ли достичь опухоли центральной нервной системы, авторы настоящего изобретения инокулировали мышам клетки GL261-WT и позволяли опухолям расти в течение 14 дней, пока не появится твердая масса. Использовали наблюдение с помощью конфокальной микроскопии за появлением меченной красным красителем 547 миРНК в окружении опухоли контрольной не получившей лечение мыши и мышей, умерщвленных через 4 ч и 8 ч, соответственно, после интраназального введения хитозановых наночастиц, содержащих меченную красителем 547 миРНК. Посредством окрашивания изолектином в отношении ассоциированных с опухолью кровеносных сосудов авторы настоящего изобретения смогли четко определить площадь опухоль на срезе. Сосуды были явно расширены и, казалось, не имели организованной структуры, что указывало на нарушение кровообращения и подачи кислорода. У не получивших лечение контрольных мышей можно было обнаружить отсутствие ассоциированного с миРНК флуорофора. В экспериментальной группе интраназально вводили инъекцию мышам с нагруженными красителем 547 анти-Gal1 миРНК, что соответствовало красному цвету. После однократного введения уже заметили широко распространенный сигнал в микроокружении опухоли. Через 4 ч этот сигнал казался более точечным и через 8 ч более диффузным. Это наблюдение ясно продемонстрировало возможность достижения микроокружения опухоли посредством интраназального пути. Оставался вопрос, могла ли анти-Gal1 миРНК достичь также опухолевых клеток, которые помимо кровеносных сосудов и макрофагов, являются основными популяциями клеток, которые продуцируют Gal-1 в глиоме. Следовательно, авторы настоящего изобретения вводили инъекцию GL261-BFP положительных опухолевых клеток, которые можно обнаружить с помощью конфокальной микроскопии (фиг. 6). Как в центре опухоли (фиг. 6A), так и на границе опухоли (фиг. 6B) можно обнаружить сигнал меченной флуоресцеином анmи-Gal1 миРНК через 4 ч после интраназального введения нагруженных меченной флуоресцеином миРНК наночастиц. Более того, авторы настоящего изобретения также могли наблюдать сильный сигнал, ассоциированный с кровеносными сосудами, несмотря на перфузию, что указывало на присутствие в эндотелиальных клетках.
В общем, указанные результаты ясно показывают, что анmи-Gal1 миРНК достигает опухолевых клеток после интраназального введения с использованием формы доставки в виде хитозановых наночастиц. Цветные изображения, иллюстрирующие вышеупомянутые наблюдения доступны в Van Woensel et al. (2016) J. Contr. release 227, 71-81.
Пример 7. Снижение Gal-1 внутри опухоли.
Ранее авторы настоящего изобретения наблюдали присутствие анmи-Gal1 миРНК в микроокружении опухоли. Чтобы дополнительно исследовать функциональность молекул РНК-интерференции, авторы настоящего изобретения должны были определить количество Gal-1. В полученных ранее in vitro результатах авторы настоящего изобретения наблюдали сильное снижение Gal-1 с 4 по 7 день после трансфекции. Этот биологический метаболизм Gal-1 также наблюдали после внутриопухолевой инъекции (данные не показаны) анmи-Gal1 миРНК. Следовательно, авторы настоящего изобретения вводили нагруженные анmи-Gal1 миРНК наночастицы до 15 дня после инокуляции опухоли и затем умерщвляли мышей на день 20 после инокуляции опухоли. В двух независимых экспериментах авторы настоящего
- 15 038254 изобретения наблюдали сильное снижение Gal-1 у получивших лечение мышей по сравнению с контрольными, не получившими лечение мышами. Более того, авторы настоящего изобретения также указывают, что снижался не только Gal-1, но также галектин-3 (Gal-3), который также проявляет стимулирующие опухоль свойства. Снижение содержания Gal-1 было более значительным, чем снижение содержания Gal-3, но не являлось статистически значимым (p=0,09). Авторы настоящего изобретения также проводили RT-кПЦР на небольшом кусочке опухоли (<30 мг) в день 20 после инокуляции опухоли. Этот анализ выявил небольшое, но не значимое снижение Gal-1 у получивших лечение животных. На основании предыдущих in vitro данных предположили, что иРНК снижается меньше через 5 дней после введения, чем уровни белка. (фиг. 7 и 8)
Авторы настоящего изобретения наблюдали сильное значимое уменьшение Gal-1 у получивших лечение мышей, что указывало на специфический нокдаун. Неожиданно и в отличие от in vitro данных (см. пример 3) in vivo авторы настоящего изобретения не обнаружили значимое снижение в отношении Gal-3. Это указывает на биологическое взаимное влияние между Gal-1 и Gal-3.
Более того, авторы настоящего изобретения подтвердили снижение Gal-1 посредством иммунофлуоресцентного окрашивания (фиг. 10).
Пример 8. Увеличенная выживаемость у получивших лечение мышей.
Мышам инокулировали GL261-WT и случайным образом разделяли на две группы. Авторы настоящего изобретения наблюдали пролонгированную выживаемость мышей, получивших лечение с помощью интраназального состава анти-Gal1 миРНК. Медианная выживаемость сдвигалась с 19 дней у контролей на 23 дня у получивших лечение мышей. На ранних этапах при прогрессировании заболевания можно было наблюдать лишь небольшой благоприятный результат в отношении выживаемости, но позже различия в кривых становятся более выраженными. Авторы настоящего изобретения также наблюдали выживших с длительной выживаемостью в получившей лечение группе мышей, при этом, напротив, все не получившими лечение мыши умерли (фиг. 9). Более того, авторы настоящего изобретения отмечали, что пустые частицы (не содержащие миРНК) не характеризовались эффектом на выживаемость несущих опухоль мышей, подчеркивая важность Gal-1 в прекращении или замедлении прогрессирования опухоли.

Claims (36)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1) растворение полимеров хитозана, характеризующихся молекулярной массой, составляющей 3060 кДа, в уксуснокислом растворе;
1. Хитозановые наночастицы, содержащие миРНК и поперечно-сшитый хитозан, причем миРНК инкапсулированы в хитозановые наночастицы;
молекулы хитозана в указанных наночастицах характеризуются молекулярной массой, составляющей 30-60 кДа; и гидродинамический диаметр (z-average) указанных частиц хитозана составляет 100-200 нм.
2) растворение миРНК в растворе отрицательно заряженного соединения, подходящего для поперечного сшивания полимеров хитозана;
2. Хитозановые наночастицы по п.1, причем молекулы хитозана характеризуются молекулярной массой, составляющей 45-55 кДа.
3) добавление раствора, содержащего миРНК и указанное соединение для поперечного сшивания, к раствору полимеров хитозана согласно стадии 1) при перемешивании или смешивании указанных комбинированных растворов для получения образования суспендированных хитозановых наночастиц, содержащих миРНК;
3. Хитозановые наночастицы по п.1 или 2, причем коэффициент полидисперсности указанных частиц составляет 0,15-0,40.
4) сбор указанных хитозановых наночастиц с использованием фильтрования, центрифугирования или другой подходящей техники для выделения суспендированных наночастиц.
4. Хитозановые наночастицы по любому из пп.1-3, причем хитозановые наночастицы образованы для интраназальной доставки.
5. Хитозановые наночастицы по любому из пп.1-4, причем миРНК нацеленно воздействует на ген в головном мозге.
6. Хитозановые наночастицы по п.5, причем указанный ген представляет собой галектин 1 и указанная миРНК представляет собой антигалектин 1 (анти-gan) миРНК, нацеленно воздействующую на галектин 1.
7. Хитозановые наночастицы по п.6, причем указанная анти-gal1 миРНК содержит последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере с 80% идентичностью последовательности относительно последовательности нуклеиновой кислоты 5'GCUGCCAGAUGGAUACGAA3' (SEQ ID NO: 1).
8. Хитозановые наночастицы по любому из пп.1-7, причем хитозановые наночастицы предназначены для лечения нарушений в головном мозге.
9. Хитозановые наночастицы по п.8, причем нарушение в головном мозге представляет собой опухоль центральной нервной системы.
10. Хитозановые наночастицы по п.9, причем опухоль центральной нервной системы представляет собой мультиформную глиобластому.
11. Фармацевтическая композиция, предназначенная для назальной доставки, причем указанный состав содержит хитозановые наночастицы по любому из пп.1-10 и вспомогательное вещество, подходящее для интраназальной доставки.
12. Фармацевтическая композиция по п.11, причем молекулы хитозана характеризуются молекулярной массой, составляющей 45-55 кДа.
13. Фармацевтическая композиция по п.11 или 12, в которой коэффициент полидисперсности указанных частиц составляет 0,15-0,40.
14. Фармацевтическая композиция по любому из пп.11-13, в которой миРНК нацеленно воздействует на ген в головном мозге.
15. Фармацевтическая композиция по п.14, в которой указанный ген представляет собой галектин 1 и указанная миРНК представляет собой антигалектин 1 (анти-gal1) миРНК, нацеленно воздействующую на галектин 1.
16. Фармацевтическая композиция по п.15, в которой анти-gal1 миРНК содержит последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере с 80% идентичностью последовательности относительно последовательности нуклеиновой кислоты 5'GCUGCCAGAUGGAUACGAA3' (SEQ ID NO: 1).
- 16 038254
17. Фармацевтическая композиция по любому из пп.11-16, в которой указанная фармацевтическая композиция предназначена для лечения нарушений в головном мозге.
18. Фармацевтическая композиция по п.17, в которой нарушение в головном мозге представляет собой опухоль центральной нервной системы.
19. Фармацевтическая композиция по п.18, в которой опухоль центральной нервной системы представляет собой мультиформную глиобластому.
20. Способ получения хитозановых наночастиц по любому из пп.1-10, причем указанный способ предусматривает следующие стадии:
21. Способ по п.20, в котором указанные полимеры хитозана характеризуются молекулярной массой, составляющей 45-55 кДа,
22. Способ по п.20 или 21, в котором 30-60 мкг миРНК добавляют на мг хитозана.
23. Способ лечения нарушения у пациента, предусматривающий стадию введения указанному пациенту посредством интраназальной доставки эффективного количества хитозановых наночастиц по любому из пп.1-10.
24. Способ по п.23, при котором миРНК нацеленно воздействует на ген в головном мозге.
25. Способ по п.24, при котором указанный ген представляет собой галектин 1, и указанная миРНК представляет собой антигалектин 1 (анти-gal1) миРНК, нацеленно воздействующую на галектин 1.
26. Способ по п.25, при котором указанная анти-gal1 миРНК содержит последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере с 80% идентичностью последовательности относительно последовательности нуклеиновой кислоты 5'GCUGCCAGAUGGAUACGAA3' (SEQ ID NO: 1).
27. Способ по любому из пп.23-26, причем нарушение представляет собой нарушение в головном мозге пациента.
28. Способ по п.27, причем нарушение в головном мозге представляет собой опухоль центральной нервной системы.
29. Способ по п.28, причем опухоль центральной нервной системы представляет собой мультиформную глиобластому.
30. Применение хитозановых наночастиц по любому из пп.1-10 для интраназального лечения нарушения у пациента.
31. Применение по п.23, при котором миРНК нацеленно воздействует на ген в головном мозге.
32. Применение по п.24, при котором указанный ген представляет собой галектин 1 и указанная миРНК представляет собой антигалектин 1 (анти-gal1) миРНК, нацеленно воздействующую на галектин 1.
33. Применение по п.25, при котором указанная анти-gal1 миРНК содержит последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере с 80% идентичностью последовательности относительно последовательности нуклеиновой кислоты 5'GCUGCCAGAUGGAUACGAA3' (SEQ ID NO: 1).
34. Применение по любому из пп.23-26, причем нарушение представляет собой нарушение в головном мозге.
35. Применение по п.27, причем нарушение в головном мозге представляет собой опухоль центральной нервной системы.
36. Применение по п.28, причем опухоль центральной нервной системы представляет собой мультиформную глиобластому.
EA201891026A 2015-11-23 2016-11-23 Лечение опухолей центральной нервной системы EA038254B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1520600.6A GB201520600D0 (en) 2015-11-23 2015-11-23 Treatment of central nervous tumours
PCT/EP2016/078547 WO2017089392A1 (en) 2015-11-23 2016-11-23 Treatment of central nervous tumours

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201891026A1 EA201891026A1 (ru) 2018-12-28
EA038254B1 true EA038254B1 (ru) 2021-07-30

Family

ID=55133198

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201891026A EA038254B1 (ru) 2015-11-23 2016-11-23 Лечение опухолей центральной нервной системы

Country Status (10)

Country Link
US (1) US11007154B2 (ru)
EP (1) EP3380087B1 (ru)
JP (1) JP7076103B2 (ru)
CN (1) CN108472265A (ru)
AU (1) AU2016358718B2 (ru)
BR (1) BR112018010292A2 (ru)
CA (1) CA3005992C (ru)
EA (1) EA038254B1 (ru)
GB (1) GB201520600D0 (ru)
WO (1) WO2017089392A1 (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110396524B (zh) * 2019-05-31 2023-05-02 海南大学 一种用于蚊虫的RNAi纳米颗粒和制备方法及用途
CN112716971B (zh) * 2021-01-19 2022-01-25 苏州大学 lncRNA XR_595534.2在制备治疗或预防慢性疼痛的药物中的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2604288C (en) * 2005-04-12 2021-07-06 Universite Libre De Bruxelles Use of a galectin-1-targeted rnai-based approach for the treatment of cancer
WO2009006905A1 (en) 2007-07-06 2009-01-15 Aarhus Universitet Dehydrated chitosan nanoparticles
CA2820236C (en) 2012-06-15 2022-07-19 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Non-viral nanoparticle-based delivery system

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANHIER, FABIENNE; MESSAOUDI, KHALED; LEMAIRE, LAURENT; BENOIT, JEAN-PIERRE; LAGARCE, FREDERIC: "Combined anti-Galectin-1 and anti-EGFR siRNA-loaded chitosan-lipid nanocapsules decrease temozolomide resistance in glioblastoma: In vivo evaluation", INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS, ELSEVIER, NL, vol. 481, no. 1-2, 15 March 2015 (2015-03-15), NL, pages 154 - 161, XP002768151, ISSN: 0378-5173, DOI: 10.1016/j.ijpharm.2015.01.051 *
JAIN, KEWAL K.: "Drug Delivery System IN: Methods in Molecular Biology; ISSN 1064-3745; Vol. 1141", vol. 1141, 1 January 2014, HUMANA PRESS, US, ISBN: 978-1-4939-0362-7, article MALHOTRA MEENAKSHI; TOMARO-DUCHESNEAU CATHERINE; SAHA SHYAMALI; PRAKASH SATYA: "Intranasal Delivery of Chitosan-siRNA Nanoparticle Formulation to the Brain", pages: 233 - 247, XP008183668, DOI: 10.1007/978-1-4939-0363-4_15 *
KATAS, H. ; ALPAR, H.O.: "Development and characterisation of chitosan nanoparticles for siRNA delivery", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 115, no. 2, 10 October 2006 (2006-10-10), AMSTERDAM, NL, pages 216 - 225, XP024957660, ISSN: 0168-3659, DOI: 10.1016/j.jconrel.2006.07.021 *
VAN WOENSEL MATTHIAS; WAUTHOZ NATHALIE; ROSIÈRE RÉMI; MATHIEU VÉRONIQUE; KISS ROBERT; LEFRANC FLORENCE; STEELANT BRECHT; DILISSEN : "Development of siRNA-loaded chitosan nanoparticles targeting Galectin-1 for the treatment of glioblastoma multiforme via intranasal administration", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 227, 21 February 2016 (2016-02-21), AMSTERDAM, NL, pages 71 - 81, XP029466512, ISSN: 0168-3659, DOI: 10.1016/j.jconrel.2016.02.032 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20180344658A1 (en) 2018-12-06
CN108472265A (zh) 2018-08-31
US11007154B2 (en) 2021-05-18
EP3380087B1 (en) 2022-06-08
AU2016358718B2 (en) 2022-08-18
CA3005992A1 (en) 2017-06-01
BR112018010292A2 (pt) 2018-11-27
JP7076103B2 (ja) 2022-05-27
GB201520600D0 (en) 2016-01-06
CA3005992C (en) 2024-01-02
EP3380087A1 (en) 2018-10-03
AU2016358718A1 (en) 2018-06-07
JP2018534339A (ja) 2018-11-22
EA201891026A1 (ru) 2018-12-28
WO2017089392A1 (en) 2017-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Van Woensel et al. Development of siRNA-loaded chitosan nanoparticles targeting Galectin-1 for the treatment of glioblastoma multiforme via intranasal administration
Xie et al. Self-immolative nanoparticles for simultaneous delivery of microRNA and targeting of polyamine metabolism in combination cancer therapy
Uchida et al. Systemic delivery of messenger RNA for the treatment of pancreatic cancer using polyplex nanomicelles with a cholesterol moiety
US20210115083A1 (en) Rna nanoparticles for brain tumor treatment
US10415035B2 (en) Anionic polyplexes for use in the delivery of nucleic acids
US10781446B2 (en) RNA nanoparticle for treatment of gastric cancer
Yang et al. Glioma-derived exosomes hijack the blood–brain barrier to facilitate nanocapsule delivery via LCN2
US10272049B2 (en) Gene carrier using cell-derived nanovesicles and method for preparing the same
Ji et al. Targeted dual small interfering ribonucleic acid delivery via non‐viral polymeric vectors for pulmonary fibrosis therapy
Forti et al. A bridge to silencing: Co-assembling anionic nanoparticles of siRNA and hyaluronan sulfate via calcium ion bridges
EP3380087B1 (en) Treatment of central nervous tumours
US9872925B2 (en) Vitamin B6-coupled poly(ester amine) as gene carrier and application in cancer gene therapy
US20220031633A1 (en) Poly(amine-co-ester) polymeric particles for selective pulmonary delivery
US20230099345A1 (en) Nanometric pharmaceutical composition in the form of liposomes or nanoemulsion containing specific sequences of interference rna
Soleimani et al. CD73 Downregulation by EGFR-Targeted Liposomal CD73 siRNA Potentiates Antitumor Effect of Liposomal Doxorubicin (Doxil) in 4T1 Tumor-Bearing Mice
US10421968B2 (en) Amphiphilic dendrimers complexed with siRNA for treatment of cancer
Yu et al. siTGF-β1 and pirfenidone contained Ionizable-Liposomal nanodrug for enhanced treatment of Idiopathic pulmonary fibrosis
Van Woensel Author names and affiliations.
Van Woensel et al. ÔØ Å ÒÙ× Ö ÔØ
BR102018001541B1 (pt) composição farmacêutica nanométrica na forma de lipossomas ou nanoemulsão que contém sequências específicas de rna de interferência
Guo et al. RNA Nanoparticle for Treatment of Gastric Cancer