CN112716971B - lncRNA XR_595534.2在制备治疗或预防慢性疼痛的药物中的应用 - Google Patents

lncRNA XR_595534.2在制备治疗或预防慢性疼痛的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了lncRNA XR_595534.2在制备治疗或预防慢性疼痛的药物中的应用。本发明以大鼠眶下神经慢性压迫性损伤诱导的三叉神经痛为疼痛模型，筛选得到在模型中特异性、差异性高表达的长链非编码RNA基因lncRNA XR_595534.2，并提供治疗以lncRNA XR_595534.2为靶点的疾病的干扰RNA。本发明首次发现了在疼痛模型中特异性、差异性高表达的lncRNA XR_595534.2，定位注射干扰RNA可显著降低其表达，缓解疼痛行为反应，可用于制备以lncRNA‑XR595534.2为靶点的三叉神经痛、神经病理性痛、偏头痛及癌性疼痛的预防或治疗药物。

Description

lncRNA XR_595534.2在制备治疗或预防慢性疼痛的药物中的 应用
技术领域
本发明涉及生物技术及药物领域，尤其涉及lncRNA XR_595534.2在制备治疗或预防慢性疼痛的药物中的应用。
背景技术
慢性疼痛(如三叉神经痛、偏头痛、神经病理性痛、癌性疼痛等)是严重危害人类身心健康和生活质量的慢性疾病，被喻为“不死的癌症”，其反复疼痛发作、迁延难治的特征使患者长期遭受折磨，而且会诱发焦虑、抑郁和恐惧等恶性情绪或精神异常，甚至会引起个体产生自杀倾向，严重危害患者的生命及生活质量。在众多能缓解疼痛的制剂中，根据药理作用机制，主要可分为两类：非甾体抗炎镇痛药及阿片受体激动药。前者仅对轻中度疼痛有效，用药后容易出现胃出血等严重副作用；后者止痛效果强烈，但对慢性神经性痛疗效差，并伴随有呼吸抑制和便秘等，尤其患者长期使用后机体易对其止痛作用产生耐受，并可产生依赖和成瘾。因此，寻求新的安全有效的止痛药物，但又能避免严重副作用的新的制剂显得尤为迫切。
表观遗传学是研究基因表达发生了可遗传改变，但DNA序列并不发生改变的一门生物学分支，其是组织炎症、损伤和疾病状态等不良因素刺激导致慢性疼痛形成的重要机制。长链非编码RNA(lncRNA)在表观遗传学调控中扮演重要的角色，它们是一类转录本长度超过200个核苷酸的RNA分子，在表观遗传调控、转录水平及转录后调节等多种层面上实现对基因表达、细胞分化及功能的调控，进而广泛参与机体的生理和病理过程，如胚胎发育、炎症和疼痛疾病中有重要的调控作用。因而，加强疼痛(如三叉神经痛、神经病理性痛及偏头痛等)外周敏化神经生物学机制及其表观遗传学调控(如lncRNA)研究，将不仅有助于发现临床疼痛治疗药物的有益靶标，并且对于提高人类生活质量和健康水平具有重大意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明以大鼠眶下神经慢性压迫性损伤(CCI-ION)诱导的三叉神经痛为疼痛模型，筛选得到了在疼痛模型中特异性、差异性高表达的长链非编码RNA基因lncRNA XR_595534.2，并提供治疗以lncRNA XR_595534.2为治疗靶点的疾病的小干扰RNA(siRNA)。
本发明的第一个目的是提供lncRNA XR_595534.2在制备治疗或预防慢性疼痛的药物中的应用。
进一步地，所述的慢性疼痛包括三叉神经痛、偏头痛、神经病理性痛或癌性疼痛。
进一步地，所述的应用是以lncRNA XR_595534.2为治疗靶点，制备干扰lncRNAXR_595534.2表达的药物。
本发明的第二个目的是提供一种干扰RNA，所述的干扰RNA能够靶向干扰lncRNAXR_595534.2表达。
进一步地，所述的干扰RNA包含核苷酸序列CCGUGAACUGAAGCUUCAU(SEQ ID NO.1)。
进一步地，所述的干扰RNA正义链包含如下核苷酸序列：5’-CCGUGAACUGAAGCUUCAU-3’；所述的干扰RNA的反义链包含如下核苷酸序列：5’-AUGAAGCUUCAGUUCAC GG-3’(SEQ ID NO.2)。
进一步地，所述的干扰RNA包含悬挂碱基TT；所述的悬挂碱基位于所述的干扰RNA的正义链和反义链的3’末端。
进一步地，包含悬挂碱基TT的干扰RNA的正义链序列为：5’-CCGUGAACUGAAGCUUCAUTT-3’(SEQ ID NO.3)；反义链序列为：5’-AUGAAGCUUCAGUUCACGGTT-3’(SEQID NO.4)。
进一步地，所述的干扰RNA可采用胆固醇、磷酸化、巯基化中的一种或多种进行修饰。
本发明的第三个目的是提供一种治疗慢性疼痛的药物，所述的药物由0.1-100％的干扰RNA和0-99.9％的药用辅料组成。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明首次发现了在疼痛模型中特异性、差异性高表达的lncRNA基因lncRNA XR_595534.2，定位注射干扰RNA(序列CCGUGAACUGAAGCUUCAU)可显著降低lncRNA XR_595534.2表达，缓解疼痛行为反应，可用于制备以lncRNA-XR595534.2为靶点的三叉神经痛、神经病理性痛、偏头痛及癌性疼痛的预防或治疗药物。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
图1A为眶下神经慢性压迫性损伤(CCI-ION)模型大鼠机械性痛阈值图；
图1B为高通量测序结果显示CCI-ION模型大鼠TG组织差异性高表达的lncRNAs；
图2为荧光定量PCR检测CCI-ION模型大鼠TG组织lncRNA XR_595534.2表达显著升高；
图3为TG内定位注射siRNA干扰序列可有效降低CCI-ION模型大鼠TG组织lncRNAXR_595534.2的表达水平；
图4为动物行为学检测显示TG定位注射siRNA干扰序列显著翻转CCI-ION模型大鼠机械性痛敏反应；
图5A为TG内定位注射siRNA干扰序列能有效降低正常大鼠TG组织中慢病毒过表达的lncRNA XR_595534.2水平；
图5B为正常大鼠TG定位注射慢病毒过表达lncRNA XR_595534.2后，其机械痛阈值显著降低，TG内定位注射siRNA可显著翻转大鼠痛行为反应。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：高通量测序结果显示CCI-ION模型大鼠TG组织差异性高表达的lncRNAs
(1)眶下神经慢性压迫性损伤(CCI-ION)模型
成年雄性健康的Sprague-Dawley大鼠，体重180–250克，由苏州大学实验动物中心提供。动物中心的卫生级核定文件编号：SYXK(苏)2007-0035。实验前，让动物在饲养环境中适应三天，并进行适应性刺激训练。采用实验室常规做法建立模型：采用4％水合氯醛按照1毫升/100克的剂量以腹腔注射方式对大鼠进行麻醉，以仰卧位的姿势将大鼠固定在手术台上，于左上颌第一磨牙水平用无菌刀片划开，采用钝性弯曲的玻璃棒小心分离周围组织，直至暴露眶下神经。在其两端分别用5-0丝线进行结扎，间距为2毫米，力度不宜过大。手术结束后，用棉球擦拭血迹并涂抹青霉素钠防止感染。假手术组只需按上述方法钝性分离眶下神经，无需结扎。
(2)大鼠须垫部机械痛阈值测定
用von Frey细丝(Stoelting公司，型号NC12775)刺激大鼠须垫部，直至大鼠出现逃避行为视为阳性反应。从1克开始，连续刺激大鼠须垫部5次，若有三次出现阳性反应，则给予小一级的机械刺激；若未能出现阳性反应，则给予大一级的机械刺激。设定15克为最大的机械刺激强度，并且在双盲的条件下进行，将实验动物出现阳性反应的最小强度视为大鼠的机械痛阈值。最终痛阈值计算公式为：50％阈值(克)＝(10[Xf+Kδ])/10000。
(3)高通量测序
大鼠麻醉后断头置于冰上，暴露其TG，利用无菌手术刀及显微解剖镊取手术侧TG，尽量去除其纤维连接，立即置于1.5毫升灭菌离心管中，装在干冰中运输至公司。经过RNA提取、样品检测、文库构建、库检和上机测序，最后进行生物信息分析，筛选CCI-ION模型大鼠TG组织差异性表达的lncRNAs。测序过程由上海欧易公司完成。
如图1A所示，取SD大鼠16只，分为2组，每组8只。第一组为假手术组，第二组为CCI-ION模型组。与假手术组相比，CCI-ION模型组大鼠从14天开始须垫部机械痛阈值显著降低，并可持续至28天(***p<0.001vs.假手术组，N＝8)。如图1B所示，选取假手术组及CCI-ION模型组第14天大鼠各3只，TG进行高通量测序，筛选CCI-ION模型组大鼠TG组织差异性表达的lncRNAs。高通量测序结果显示，相对于假手术组大鼠，CCI-ION模型组大鼠TG组织差异性表达的前20个lncRNAs中lncRNA XR_595534.2升高最为显著(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001vs.假手术组，n＝3)。
实施例2：荧光定量PCR检测CCI-ION模型大鼠TG组织lncRNA XR_595534.2表达显著升高
(1)眶下神经慢性压迫性损伤(CCI-ION)模型的建立(同实施例1)
(2)实时荧光定量PCR
RNA提取：使用灭菌器械提取大鼠TG置于1.5毫升灭菌离心管中，加入1毫升Trizol，将组织破碎为匀浆，置于冰上静置30分钟。加入100微升三氯甲烷，于离心机中4度、12000转/分钟离心20分钟。将上层水相吸到新的离心管，加入等体积的异丙醇后置于冰箱-20度中静置20分钟。于离心机中4度，12000转/分钟离心15分钟，弃上清液，加入75％乙醇洗涤沉淀。4度，7500转/分钟离心5分钟，弃掉上清液，加入20微升DEPC水溶解沉淀。最后使用NanoDrop 2000测量RNA浓度。
荧光定量PCR：使用5×PrimeScript RT Master Mix将所提取的RNA逆转录成cDNA，参数为：逆转录温度为42度，15分钟；变性温度为85度，2分钟。随后进行荧光定量PCR检测，循环参数为：预变性温度为95度，15分钟；变性温度为94度，15秒；退火温度为60度，30秒；延伸温度为72度，30秒。循环次数为40次。实验结果以2-ΔΔCT进行计算。lncRNA XR_595534.2前引物序列：GGCTTGTCAGTATGAGCAGTTAGAA(SEQ ID NO.5)；后引物序列：AATTGTCCTGTGTTCCTGGTTC(SEQ ID NO.6)；GAPDH前引物序列：GTGCTGAGTATGTCGTGGAGT(SEQID NO.7)；后引物序列：CAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT(SEQ ID NO.8)，引物由锐博生物公司合成。Trizol购自Takara，逆转录试剂盒购自Takara，SYBR荧光染料购自Bimake。
如图2所示，选取假手术组及CCI-ION模型组大鼠各3只，分别提取假手术组、CCI-ION模型组7天、CCI-ION模型组14天、CCI-ION模型组21天及CCI-ION模型组28天大鼠TG组织RNA。荧光定量PCR检测结果显示，与假手术组相比，CCI-ION模型组14天后大鼠TG中lncRNAXR_595534.2表达显著升高，且可持续至术后第28天(**p<0.01，***p<0.001vs.假手术组,n＝3)。
实施例3：siRNA干扰序列可有效降低CCI-ION模型大鼠TG中lncRNA XR_595534.2的表达
(1)RNA提取(同实施例2)。
(2)实时荧光定量PCR(同实施例2)。
(3)大鼠TG立体定位注射siRNA干扰序列：将大鼠麻醉后固定于脑立体定位仪上，手术刀划开头皮，H2O2腐蚀组织，暴露冠状缝与矢状缝。以二者交点即前囟点为原点定位：前囟点向后3毫米，中线向左3毫米，颅骨表面以下11.7毫米。注射lncRNA XR_595534.2siRNA(lncRNA-siRNA)以及对照siRNA(NC-siRNA)(购自吉玛基因)，注射终浓度为50微摩尔/升，每只大鼠注射3微升，5分钟注射完，留针10分钟。
如图3所示，大鼠24只，分为4组，每组6只。第一组假手术组大鼠。第二组为CCI-ION模型组大鼠，定位注射生理盐水；第三组为CCI-ION模型组大鼠，TG定位注射NC-siRNA(siRNA的阴性对照)，第四组为CCI-ION模型组大鼠，TG定位注射lncRNA XR_595534.2siRNA的siRNA干扰序列(CCGUGAACUGAAGCUUCAU)(lncRNA-siRNA，Pubmed Blast结果显示siRNA序列具有特异性，由锐博生物公司化学合成，并经胆固醇修饰以增加膜通透性)。连续注射两天，分别取假手术组、CCI-ION模型组第14天、CCI-ION模型组+注射NC-siRNA和CCI-ION模型组+注射siRNA 3天后的大鼠TG组织进行荧光定量PCR检测。与对照组相比，siRNA注射3天后大鼠TG中lncRNA XR_595534.2表达显著降低(*p<0.05，**p<0.01vs.假手术组，##p<0.01vs.CCI-ION模型组+注射NC-siRNA)。以上结果表明，siRNA干扰序列(CCGUGAACUGAAGCUUCAU)能有效降低CCI-ION模型大鼠TG组织中lncRNA XR_595534.2表达。
实施例4：动物行为学检测显示TG定位注射该siRNA干扰序列显著翻转CCI-ION模型大鼠机械性痛敏反应
(1)眶下神经慢性压迫性损伤(CCI-ION)模型建立(同实施例1)。
(2)大鼠须垫部机械痛阈值测定(同实施例1)。
(3)大鼠TG立体定位注射siRNA干扰序列(同实施例3)。
如图4所示，取正常SD大鼠24只，分为4组，每组6只。第一组为假手术组+注射NC-siRNA。第二组为假手术组+注射siRNA；第三组为CCI-ION模型组+注射NC-siRNA，第四组为CCI-ION模型组+注射siRNA(序列同实施例3)。如图4所示，CCI-ION模型组大鼠注射siRNA后第3天，大鼠机械痛阈值显著回升，并可以持续至注射后第6天(***p<0.001vs.假手术组，##p<0.01，###p<0.001vs.CCI-ION模型组+注射NC-siRNA)。表明TG内定位注射siRNA干扰序列(CCGUGAACUGAAGCUUCAU)可以显著缓解CCI-ION模型诱导的大鼠疼痛行为反应，该siRNA具有明显的镇痛作用。
实施例5：正常大鼠TG定位注射慢病毒过表达lncRNA XR_595534.2后，其机械痛阈值显著降低，TG内定位注射siRNA可显著翻转大鼠痛行为反应
(1)大鼠须垫部机械痛阈值测定(同实施例1)。
(2)正常大鼠TG立体定位注射lncRNA XR_595534.2过表达慢病毒(LV-lncRNA组)以及对照组(LV-NC-lncRNA组，购自吉玛基因)，病毒滴度为1×108TU，每只大鼠注射3微升，5分钟注射完，留针10分钟。siRNA干扰序列注射方法同实施例1。
如图5A所示，大鼠各组6只，分别提取TG组织。正常大鼠TG立体定位注射lncRNAXR_595534.2过表达慢病毒(LV-lncRNA组)后，lncRNA XR_595534.2表达显著升高。TG定位注射siRNA干扰序列(CCGUGAACUGAAGCUUCAU)显著降低TG组织中lncRNA XR_595534.2的表达水平(**p<0.01vs.LV-NC-lncRNA组，###p<0.001vs.LV-lncRNA组。如图5B所示，取正常SD大鼠32只，分为4组，每组8只。第一组为正常大鼠TG定位注射siRNA干扰序列，第二组为大鼠TG定位注射lncRNA XR_595534.2的慢病毒空载体(LV-NC-lncRNA组)，第三组为大鼠TG定位注射lncRNA XR_595534.2慢病毒(LV-lncRNA组)，第四组为大鼠TG定位注射lncRNA XR_595534.2慢病毒第7天后，注射siRNA干扰序列，连续注射2天，行为学检测siRNA干扰序列注射后第2、3、4、5和6天大鼠须垫部机械痛阈值。结果显示，TG内定位注射lncRNA XR_595534.2慢病毒后大鼠机械痛阈值显著降低(第7天)。而siRNA注射后3天后大鼠机械痛阈值显著回升，并可以持续至注射后第6天。(**p<0.01，***p<0.001vs.LV-NC-lncRNA组，##p<0.01，###p<0.001vs.LV-lncRNA组)。以上结果表明，siRNA干扰序列(CCGUGAACUGAAGCUUCAU)对三叉神经痛的镇痛作用是通过特异性靶向抑制lncRNA XR_595534.2而实现的。
本发明通过高通量测序方法，在实施例1及实施例2中，研究了CCI-ION模型大鼠TG组织中lncRNA XR_595534.2表达发生了显著变化，发现lncRNA XR_595534.2在大鼠TG组织中表达，且CCI-ION造模后其表达水平明显升高。并在实施例3中，研究了siRNA干扰序列(CCGUGAACUGAAGCUUCAU)对大鼠TG中lncRNA XR_595534.2表达的影响，发现了siRNA干扰序列可靶向抑制大鼠TG中lncRNA XR_595534.2的表达。
本发明通过动物学实验，在实施例4及实施例5中，研究了siRNA干扰序列对CCI-ION诱导的三叉神经痛模型大鼠机械痛阈值的影响，发现三叉定位注射siRNA干扰序列可以缓解CCI-ION诱导的大鼠疼痛行为反应，具有镇痛作用。此外，研究了siRNA干扰序列对lncRNA XR_595534.2过表达慢病毒诱导的大鼠须垫部痛阈值的改变，发现三叉定位注射siRNA干扰序列可以缓解lncRNA XR_595534.2诱导的大鼠疼痛行为反应。证实了siRNA干扰序列的显著镇痛作用是通过靶向抑制lncRNA XR_595534.2所实现的。
本发明发现了siRNA干扰序列可通过靶向抑制lncRNA XR_595534.2的表达，显著翻转CCI-ION模型大鼠机械性痛敏反应，具有明显的镇痛作用。因此，该siRNA干扰序列还可应用在制备用于治疗和/或预防以lncRNA XR_595534.2为靶点的疾病药物中，所述疾病包括如三叉神经痛、神经病理性痛、偏头痛及恶性肿瘤等。
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 苏州大学
<120> lncRNA XR_595534.2在制备治疗或预防慢性疼痛的药物中的应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> （人工序列）
<400> 1
ccgugaacug aagcuucau 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> （人工序列）
<400> 2
augaagcuuc aguucacgg 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> （人工序列）
<400> 3
ccgugaacug aagcuucaut t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> （人工序列）
<400> 4
augaagcuuc aguucacggt t 21
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
ggcttgtcag tatgagcagt tagaa 25
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
aattgtcctg tgttcctggt tc 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
gtgctgagta tgtcgtggag t 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
cagtcttctg agtggcagtg at 22

Claims (6)

1.一种干扰RNA在制备治疗或预防三叉神经痛的药物中的应用，其特征在于，所述的干扰RNA能够靶向干扰lncRNA XR_595534.2的表达。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的干扰RNA为核苷酸序列CCGUGAACUGAAGCUUCAU。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的干扰RNA正义链为如下核苷酸序列：5’-CCGUGAACUGAAGCUUCAU-3’ ；所述的干扰RNA的反义链为如下核苷酸序列：5’-AUGAAGCUUCAGUUCACGG-3’ 。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的干扰RNA包含悬挂碱基TT；所述的悬挂碱基位于所述的干扰RNA的正义链和反义链的3’末端。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包含悬挂碱基TT的干扰RNA的正义链序列为：5’-CCGUGAACUGAAGCUUCAUTT-3’ ；反义链序列为：5’-AUGAAGCUUCAGUUCACGGTT-3’ 。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的干扰RNA可采用胆固醇、磷酸化、巯基化中的一种或多种进行修饰。
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