ES2662326T3 - Vesículas de suministro terapéutico - Google Patents

Vesículas de suministro terapéutico Download PDF

Info

Publication number
ES2662326T3
ES2662326T3 ES14723513.9T ES14723513T ES2662326T3 ES 2662326 T3 ES2662326 T3 ES 2662326T3 ES 14723513 T ES14723513 T ES 14723513T ES 2662326 T3 ES2662326 T3 ES 2662326T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
exosomes
polypeptide
therapeutic
cancer
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES14723513.9T
Other languages
English (en)
Other versions
ES2662326T5 (es
Inventor
Oscar WIKLANDER
Joel NORDIN
Edvard Smith
Karl-Henrik GRINNEMO
Oscar Simonson
Samir El Andaloussi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evox Therapeutics Ltd
Original Assignee
Evox Therapeutics Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=20296661&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2662326(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Evox Therapeutics Ltd filed Critical Evox Therapeutics Ltd
Publication of ES2662326T3 publication Critical patent/ES2662326T3/es
Application granted granted Critical
Publication of ES2662326T5 publication Critical patent/ES2662326T5/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F01—MACHINES OR ENGINES IN GENERAL; ENGINE PLANTS IN GENERAL; STEAM ENGINES
    • F01C—ROTARY-PISTON OR OSCILLATING-PISTON MACHINES OR ENGINES
    • F01C1/00—Rotary-piston machines or engines
    • F01C1/30—Rotary-piston machines or engines having the characteristics covered by two or more groups F01C1/02, F01C1/08, F01C1/22, F01C1/24 or having the characteristics covered by one of these groups together with some other type of movement between co-operating members
    • F01C1/34—Rotary-piston machines or engines having the characteristics covered by two or more groups F01C1/02, F01C1/08, F01C1/22, F01C1/24 or having the characteristics covered by one of these groups together with some other type of movement between co-operating members having the movement defined in group F01C1/08 or F01C1/22 and relative reciprocation between the co-operating members
    • F01C1/344—Rotary-piston machines or engines having the characteristics covered by two or more groups F01C1/02, F01C1/08, F01C1/22, F01C1/24 or having the characteristics covered by one of these groups together with some other type of movement between co-operating members having the movement defined in group F01C1/08 or F01C1/22 and relative reciprocation between the co-operating members with vanes reciprocating with respect to the inner member
    • F01C1/3441—Rotary-piston machines or engines having the characteristics covered by two or more groups F01C1/02, F01C1/08, F01C1/22, F01C1/24 or having the characteristics covered by one of these groups together with some other type of movement between co-operating members having the movement defined in group F01C1/08 or F01C1/22 and relative reciprocation between the co-operating members with vanes reciprocating with respect to the inner member the inner and outer member being in contact along one line or continuous surface substantially parallel to the axis of rotation
    • F01C1/3442—Rotary-piston machines or engines having the characteristics covered by two or more groups F01C1/02, F01C1/08, F01C1/22, F01C1/24 or having the characteristics covered by one of these groups together with some other type of movement between co-operating members having the movement defined in group F01C1/08 or F01C1/22 and relative reciprocation between the co-operating members with vanes reciprocating with respect to the inner member the inner and outer member being in contact along one line or continuous surface substantially parallel to the axis of rotation the surfaces of the inner and outer member, forming the working space, being surfaces of revolution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F01—MACHINES OR ENGINES IN GENERAL; ENGINE PLANTS IN GENERAL; STEAM ENGINES
    • F01C—ROTARY-PISTON OR OSCILLATING-PISTON MACHINES OR ENGINES
    • F01C21/00—Component parts, details or accessories not provided for in groups F01C1/00 - F01C20/00
    • F01C21/10—Outer members for co-operation with rotary pistons; Casings
    • F01C21/102—Adjustment of the interstices between moving and fixed parts of the machine by means other than fluid pressure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Fluid Mechanics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurology (AREA)

Abstract

Un exosoma de suministro terapéutico que comprende unido a su membrana un constructo polipeptídico, en el que el constructo polipeptídico comprende al menos un polipéptido transportador fusionado a al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico presente al menos parcialmente en el exterior del exosoma de suministro y en el que al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico es incompetente para señalización.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
imagen6
15
25
35
45
55
65
potencialmente una pluralidad considerable de constructos terapéuticos (que a su vez puede comprender una pluralidad de receptores señuelo del polipéptido terapéutico) que potencialmente conduce a una multivalencia del receptor que mejora la eficacia terapéutica y mejora los resultados del tratamiento.
En realizaciones preferidas, al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico puede estar parcial o completamente desprovisto de su dominio de señalización, para hacerlo incompetente para señalización. Esto puede lograrse truncando o mutando el polinucleótido que codifica el dominio de señalización, o eliminando completamente dicho polinucleótido, para bloquear cualquier señalización del receptor señuelo del polipéptido terapéutico. En una realización adicional, el dominio de señalización del receptor señuelo del polipéptido terapéutico puede reemplazarse parcial o completamente por el polipéptido transportador, para minimizar posiblemente el tamaño del constructo polipeptídico.
Los inventores se han dado cuenta de que, sorprendentemente, en algunos casos es preferible utilizar receptores señuelo de polipéptidos terapéuticos que son incompetentes para señalización, con el fin de evitar la generación de señales que de otro modo podrían tener un impacto negativo sobre la eficacia terapéutica.
En una realización de acuerdo con la presente invención, el polipéptido transportador puede estar localizado parcialmente dentro del exosoma de suministro terapéutico y/o parcialmente en la membrana del exosoma de suministro terapéutico y/o parcialmente fuera del exosoma de suministro terapéutico. En una realización preferible, el polipéptido transportador está presente sustancialmente en el interior del exosoma de suministro o en su membrana, mientras que el receptor señuelo del polipéptido terapéutico está presente al menos parcialmente en el exterior del exosoma de suministro, para poder ejercer su efecto terapéutico. Por lo tanto, el constructo polipeptídico puede estar presente preferiblemente en forma transmembrana (es decir, un constructo polipeptídico transmembrana), con el polipéptido transportador presente sustancialmente en el interior o en la membrana del exosoma y el receptor señuelo del polipéptido terapéutico presente sustancialmente en el exterior del exosoma de suministro (y el polipéptido transportador y/o el receptor señuelo del polipéptido terapéutico que se extiende a través de la membrana del exosoma de suministro). En una realización, puede usarse más de un polipéptido transportador, para mejorar la expresión del receptor señuelo del polipéptido terapéutico en la superficie (exterior) del exosoma de suministro terapéutico.
La ubicación del polipéptido transportador en la membrana puede variar dependiendo de la aplicación y del polipéptido terapéutico en cuestión; siendo la consideración principal que el receptor señuelo del polipéptido terapéutico sea capaz de interactuar con su compañero de interacción, normalmente un ligando circulante, que normalmente está presente extracelularmente, por ejemplo, en la sangre o en cualquier otro fluido corporal o en una célula objetivo circulante. En realizaciones adicionales, al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico puede fusionarse con el polipéptido transportador a través de un enlace químico seleccionado del grupo que comprende un enlace peptídico (amida), un enlace tioéter, un puente disulfuro y una interacción biotinaestreptavidina. La formación de un enlace peptídico (amida) puede conseguirse naturalmente mediante tecnología recombinante (es decir, mediante la expresión de un polinucleótido adecuado en una célula capaz de producir vesículas de suministro adecuadas), pero dicho enlace también puede generarse usando diversas estrategias de conjugación comúnmente empleadas en la técnica, por ejemplo, conjugación mediada por EDC/NHS, conjugación sulfo-NHS o cualquier otro tipo de enfoque de conjugación de amida (péptido). Sin embargo, otras metodologías para acoplar al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico y al menos un polipéptido transportador pueden comprender formar un puente disulfuro entre, por ejemplo, dos residuos de cisteína, o que utilizan la interacción natural entre biotina y estreptavidina para conectar el receptor señuelo del polimérico terapéutico y el polipéptido transportador. Una alternativa al uso de constructos de fusión y la formación de enlaces químicos es colocar una etiqueta lipídica en el receptor señuelo de polipéptidos terapéuticos y recubrir de manera no covalente la superficie del exosoma de suministro con el receptor señuelo de polipéptidos terapéuticos por medio de la intercalación simple de lípidos.
Dichas etiquetas de lípidos pueden incluir colesterol, estearilo, diestearilo, miristoilo, palmitoilo, decanoilo y otros lípidos adecuados conocidos por una persona experta en la técnica.
El polipéptido transportador puede seleccionarse del grupo que comprende Lamp2b, CD63, sindecano, sinaptotagmina, dominio ALIX (CHAMP 4), dominio de unión ALIX-sintenina, proteínas de ESCRT, PDGF, sintenina-PDZ, dominio de P6 y P9, CD81, CD9 y cualquier combinación de los mismos. De nuevo, la consideración principal detrás de seleccionar un polipéptido transportador apropiado se refiere a su capacidad de transportar eficazmente el receptor señuelo del polipéptido terapéutico a una ubicación exosomal apropiada (normalmente su superficie, o al menos a una parte de la membrana del exosoma de suministro terapéutico que le permite al receptor señuelo del polipéptido terapéutico interactuar y unirse al ligando, es decir, su compañero de interacción, para ejercer su efecto terapéutico). Además de acuerdo con la presente invención, el polipéptido transportador puede comprender la parte citoplásmica del sindecano. La parte citoplásmica del sindecano tiene un dominio de unión a PDZ que se une al complejo sintenina-ALIX, y el complejo sintenina-ALIX forma posteriormente un exosoma (el dominio PDZ, por lo tanto, guiaría esencialmente al receptor hacia el exosoma).
15
25
35
45
55
65
Al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico de acuerdo con la presente invención se puede seleccionar del grupo que comprende receptores, por ejemplo, de las siguientes familias de receptores: insulina, PDGF (SEQ ID NO: 15-16), FGF (SEQ ID NO: 36-39), EGF, NGF (SEQ ID NO: 32), VEGF, HGF, TRK, EPH, AXL, LTK, TIE, ROR, DDR, RET, KLG, RYK, MuSK, TGF Tipo I y Tipo II (SEQ ID NO: 33-35), activina y TNF, PTCH1 (SEQ ID NO: 44), interleuquinas (IL) 1, 6, 12, 17, 23 y otras (SEQ ID NO: 1-11), angiopoyetina, péptidos de presentación en fagos HER que se unen a ligandos para los receptores anteriores (y posiblemente también presentación en fago hacia los receptores para ocupar el espacio de unión a través del impedimento alostérico), receptores 7-TM, integrinas, selectinas (por ejemplo, selectinas E, P y L (SEQ ID NO: 19-21), ligandos de integrinas/selectinas, anticuerpo unidos a la membrana, receptores de células T, receptores de células NK, receptores tipo Toll, PAMP, etc. Además, los receptores modificados genéticamente que se unen a varios ligandos tales como VEGF y angiopoyetina (DAAP) están de acuerdo con la presente invención, y además todas las familias de receptores y receptores específicos mencionados anteriormente están en línea con la presente invención. Además de acuerdo con la presente invención, el constructo polipeptídico unido a los exosomas de suministro terapéutico puede comprender más de un receptor señuelo del polipéptido terapéutico, y también más de un polipéptido transportador, para optimizar, por ejemplo, los efectos terapéuticos o el transporte del receptor señuelo del polipéptido terapéutico a la membrana del exosoma de suministro (o su superficie).
El constructo polipeptídico de acuerdo con la presente invención puede formarse en consecuencia a partir de cualquier combinación de al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico y al menos un polipéptido transportador. Los ejemplos de realizaciones comprenden, por ejemplo, (i) al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico de la familia de TNF (por ejemplo TNFR1) combinado con un polipéptido transportador seleccionado de CD63 (SEQ ID NO: 14), Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina o cualquier otro polipéptido transportador adecuado capaz de transportar al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico a la superficie (o esencialmente cualquier ubicación adecuada en un exosoma de suministro terapéutico), (ii) al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico de la familia de VEGF (por ejemplo VEGFR) combinado con un polipéptido transportador seleccionado de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina o cualquier otro polipéptido transportador adecuado capaz de transportar al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico a la superficie (o esencialmente cualquier ubicación adecuada en un exosoma de suministro terapéutico), (iii) al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico de la familia de FGF combinado con un polipéptido transportador seleccionado de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina, o cualquier otro polipéptido transportador adecuado capaz de transportar al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico a la superficie (o esencialmente cualquier ubicación adecuada en un exosoma de suministro terapéutico), (iv) al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico de la familia de EGF combinado con un polipéptido transportador seleccionado de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina o cualquier otro polipéptido transportador adecuado capaz de transportar al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico a la superficie (o esencialmente cualquier ubicación adecuada en un exosoma de suministro terapéutico), (v) al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico de la familia de activina combinado con un polipéptido transportador seleccionado de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina,
(vi) al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico de la familia de receptores de interleuquina (por ejemplo, IL6R (SEQ ID NO: 1) o IL12R beta 1 (SEQ ID NO: 4) o IL1R tipo 1 (SEQ ID NO: 3)) combinado con un polipéptido transportador seleccionado, por ejemplo, de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina o cualquier otro polipéptido transportador adecuado capaz de transportar al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico a la superficie (o esencialmente cualquier ubicación adecuada en un exosoma de suministro terapéutico), o cualquier otro polipéptido transportador adecuado capaz de transportar al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico a la superficie (o esencialmente cualquier ubicación adecuada en un exosoma de suministro terapéutico).
En aún otra realización ventajosa de la presente invención, un polipéptido transportador adecuado (tal como CD63, Lamp2b, CD9, CD81, sinaptotagmina, o sindecano, etc.) se fusiona a PTCH1, creando un constructo polipeptídico capaz de secuestrar al erizo sónico (SHH), que es una importante molécula de señalización implicada en diversos cánceres. Los inventores han observado experimentalmente una disminución de la carga tumoral en ratones tratados con exosomas que comprenden diversos polipéptidos portadores acoplados a PTCH1 y a un dominio de unión a SHH específicamente seleccionado de PTCH1. Por ejemplo, en la configuración experimental reportada en la Figura 4, los exosomas que comprenden constructos polipeptídicos que comprenden CD63 o Lamp2b como el polipéptido transportador y PTCH1 como el receptor señuelo del polipéptido terapéutico mostraron una eficacia antitumoral similar como la de los constructos de sindecano-VEGFR mostrada en el gráfico en cuestión.
En realizaciones adicionales, el exosoma de suministro terapéutico de acuerdo con la presente invención puede comprender además al menos una entidad de direccionamiento presente. Dicha entidad de direccionamiento está normalmente presente al menos parcialmente en el exterior del exosoma de suministro, con el fin de permitir el direccionamiento de los exosomas a tejidos, tipos de células u órganos de interés, por ejemplo, para aumentar la concentración de exosomas de suministro localmente en el sitio donde la eficacia terapéutica debe ser lo más alta posible. La entidad de direccionamiento puede ser un péptido o un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo), pero también puede ser una molécula pequeña (tal como una vitamina), un carbohidrato, un ácido nucleico (tal como un aptámero) o cualquier otro tipo de molécula que pueda conferir propiedades de direccionamiento a exosomas de suministro terapéutico.
imagen7
15
25
35
45
55
65
arrugas, pliegues, crestas y/o pliegues de la piel. Los exosomas de suministro pueden exhibir efectos beneficiosos sin que esté presente el constructo polipeptídico, pero la presencia de un constructo polipeptídico adecuado puede potenciar adicionalmente la eficacia cosmética. En una realización, los exosomas de suministro de acuerdo con la presente invención pueden comprender una toxina botulínica (por ejemplo, Botox, por ejemplo, los tipos A-G de toxina botulínica) como receptor señuelo del polipéptido terapéutico (las toxinas botulínicas no sólo se pueden usar para aplicaciones cosméticas, sino también podrían ser aplicada, por ejemplo, para el tratamiento de dolores de cabeza por migraña y distonía). En una realización preferida, los exosomas de una célula adecuada productora de exosomas están comprendidos en una crema, loción o gel cosmético para uso en el tratamiento (que normalmente es para fines cosméticos) de arrugas, líneas, pliegues, crestas y/o arrugas de la piel.
Los exosomas de acuerdo con la presente invención comprenden un constructo polipeptídico terapéutico.
Los exosomas que comprenden un constructo polipeptídico terapéutico pueden mediar efectos antiinflamatorios, antiapoptóticos y proliferativos celulares que pueden mejorar la cicatrización de heridas y la regeneración de la piel. Los experimentos llevados a cabo utilizando (i) exosomas sin ningún constructo polipeptídico terapéutico y (ii) exosomas que comprenden un constructo polipeptídico terapéutico VEGFR1 (con CD63 o Lamp2b como polipéptido transportador) demuestran que ambas estrategias muestran una gran potencia cosmética para aliviar, por ejemplo, telangiectasias (pequeños vasos sanguíneos dilatados localizados cerca de la piel). También se demostró que los exosomas desprovistos de polipéptidos terapéuticos alivian problemas cosméticos tales como piel seca, arrugas, erupciones cutáneas, etc., y adicionalmente exosomas que comprenden, por ejemplo, polipéptidos terapéuticos que contienen TNFR son altamente potentes en el tratamiento de erupciones, descamación y potencialmente psoriasis y problemas relacionados con la psoriasis.
En realizaciones adicionales, los exosomas de suministro de acuerdo con la presente invención pueden comprender receptores señuelo de polipéptidos terapéuticos tales como colágeno, lamininas (por ejemplo, lamininas 111, 211, 511 y/o 521) y/o péptidos que penetran en la célula (CPP).
Opcionalmente, se pueden incluir glicosaminoglicanos (GAG) y/u otros tipos de carbohidratos en los exosomas de suministro, para aumentar adicionalmente los efectos relacionados con el mantenimiento de la integridad estructural de la piel.
En un aspecto de acuerdo con la presente invención, el constructo polipeptídico puede comprender un constructo polipeptídico que comprende prácticamente cualquier receptor señuelo del polipéptido terapéutico que se puede unir a un ligando circulante fusionado a prácticamente cualquier polipéptido transportador.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención son naturalmente adecuadas para su uso en medicina, y específicamente en la profilaxis y/o alivio y/o tratamiento de enfermedades y trastornos seleccionados del grupo que comprende enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática, psoriasis, síndrome periódico asociado al receptor del factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAPS), deficiencia del antagonista del receptor de la interleuquina 1 (DIRA), endometriosis, hepatitis autoinmune, esclerodermia y miositis, accidente cerebrovascular, lesión aguda de la médula espinal, vasculitis, síndrome de Guillain-Barré, infarto agudo de miocardio, ARDS, sepsis, meningitis, encefalitis, insuficiencia hepática, insuficiencia renal, enfermedad de injerto contra huésped, distrofia muscular de Duchenne y otras enfermedades musculares, caquexia inducida por cáncer, anorexia, diabetes mellitus tipo 2 y cáncer (por ejemplo, cánceres sensibles al EGF, VEGF, FGF).
Los exosomas de suministro terapéutico de acuerdo con la presente invención se pueden administrar a un sujeto humano o animal a través de varias rutas diferentes, por ejemplo administración auricular (ótica), bucal, conjuntival, cutánea, dental, electro-osmosis, endocervical, endosinusal, endotraqueal, enteral, epidural, extraamniótica, extracorpórea, hemodiálisis, infiltración, intersticial, intraabdominal, intraamniótico, intraarterial, intraarticular, intrabiliar, intrabronquial, intrabursal, intracardíaca, intracartilaginosa, intracaudal, intracavernosa, intracavitaria, intracerebral, intracisternal, intracorneal, intracoronal (dental), intracoronaria, cavernosa intracorpórea, intradérmica, intradiscal, intraductal, intraduodenal, intradural, intraepidérmica, intraesofágica, intragástrica, intragingival, intrabiliar, intralesional, intraluminal, intralinfática, intramedular, intrameningea, intramuscular, intraocular, intraovárica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrasinal, intraespinal, intrasinovial, intratendinoso, intratesticular, intratecal, intratorácica, intratubular, intratumoral, intratimpánica, intrauterina, intravascular, intravenosa, intravenosa en bolo, intravenosa por goteo, intraventricular, intravesical, intravítrea, iontoforesis, irrigación, laríngea, nasal, nasogástrica, técnica de vendaje oclusivo, oftálmica, oral, orofaríngea, otra, parenteral, percutánea, periarticular, peridural, perineural, periodontal, rectal, respiratoria (inhalación), retrobulbar, tejido blando, subaracnoideo, subconjuntival, subcutánea, sublingual, submucosa, tópica, transdérmica, administración transmucosal, transplacentaria, transtraqueal, transtimpánica, uretral, ureteral y/o vaginal, y/o cualquier combinación de las rutas de administración anteriores.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para producir un exosoma de suministro terapéutico, que comprende las etapas de (i) proporcionar al menos un constructo polinucleotídico que codifica al menos un constructo polipeptídico, donde el constructo polipeptídico comprende al menos una polipéptido
15
25
35
45
55
65
transportador fusionado a al menos un receptor señuelo del polipéptido terapéutico que se une a un ligando circulante, (ii) introducir dicho al menos un constructo polinucleotídico en una célula capaz de producir exosomas de suministro adecuados (mediante la traducción del constructo polinucleotídico en el constructo polipeptídico correspondiente), y (iii) recoger al menos un exosoma de suministro producido por la célula de la etapa (ii). El método puede comprender además una etapa de purificación, en la que el exosoma de suministro terapéutico se purifica mediante un procedimiento seleccionado del grupo que comprende cromatografía líquida (LC), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), filtración por centrifugación, filtración de flujo tangencial, centrifugación, inmunoprecipitación, etc., o cualquier combinación de los mismos.
Los inventores se han dado cuenta sorprendentemente de que la aplicación de una combinación secuencial de filtración (preferiblemente ultrafiltración (UF)) y cromatografía líquida de exclusión por tamaño (LC) da como resultado una purificación optimizada, que a su vez conduce a una eficacia terapéutica superior. Además, en comparación con la ultracentrifugación (UC), que se emplea rutinariamente para purificar exosomas, la cromatografía líquida de ultrafiltración secuencial (UF-LC) es considerablemente más rápida y posible para aumentar los volúmenes de fabricación, lo que es un inconveniente importante de la metodología UC actual. Sin embargo, como se describirá con mayor detalle a continuación, la implicación más ventajosa del uso de UF-LC en lugar de UC es el hecho de que los exosomas (y otras vesículas extracelulares a las que se aplica UF-LC) conservan sus propiedades biofísicas y biológicas, lo que da como resultado una menor acumulación en el tejido pulmonar tras la administración in vivo y, por lo tanto, mejora la eficacia terapéutica.
De acuerdo con el análisis por microscopía electrónica (EM), las vesículas de ambas preparaciones de UF y UC presentaban una morfología redondeada o en forma de copa. En la mayoría de los casos, el diámetro de la vesícula se midió en alrededor de 100 nm, y esto estaba de acuerdo con los resultados obtenidos a través del análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Sin embargo, es de notar que una fracción de vesículas en la muestra de UC se distorsionó claramente (se rompió o fusiono para formar vesículas un poco más grandes) y tales vesículas no se observaron en muestras de UF. Por lo tanto, estos resultados indican que la metodología UC tuvo un impacto negativo sobre la integridad vesicular.
Para verificar la presencia de agregados de vesículas en muestras de UC, los inventores examinaron a continuación los exosomas marcados con CD63-EGFP HEK293T directamente mediante microscopía de fluorescencia. De forma similar a los resultados de FCS, solo las muestras de UC mostraron agregados grandes visibles en el canal de fluorescencia, que no se observaron con las muestras de UF. Esto se corroboró usando los exomas marcados con colorante fluorescente DiOC6. Por lo tanto, el método de aislamiento de UF da como resultado la conservación de las propiedades biofísicas inherentes de las vesículas en comparación con la UC, lo que da como resultado la fusión / agregación y ruptura de las vesículas.
Los experimentos de UF de acuerdo con la presente invención se realizaron principalmente usando filtros con un corte de peso molecular de 100 kDa, 250 kDa y/o 500 kDa, o cualquier combinación secuencial de los mismos. En realizaciones preferidas, es preferible un corte de 100 kDa, pero dado el número de biomoléculas con mayor peso molecular, es posible que los componentes secretados por células/medio distintos de los exosomas estén atrapados en los filtros y el protocolo de UF se refinó adicionalmente usando cromatografía líquida de exclusión por tamaño altamente no convencional. Se cargaron muestras de UF entre otras en una columna de LC de exclusión por tamaño Sephacryl S-300 o Sephacryl S-500 en la que se recogieron dos fracciones distintas con base en la absorbancia de la celda de flujo de UV a 280 nm. NTA reveló que el 98% de las partículas se recuperaron en la fracción 1, donde el tamaño de partícula modal era consistente en las tres réplicas de UF-LC. La tinción de proteína total posterior en SDS-PAGE confirmó que muchas de las proteínas contaminantes originalmente observadas en la muestra de UF se eluyeron en la fracción 2 mientras que la fracción 1 no tenía ningún nivel detectable de proteína. Mediante el uso de transferencia Western (WB), los marcadores exosomales tales como Alix y CD9 solo se detectaron en la fracción 1 y no en la fracción 2, lo que indica que la fracción 1 contenía exosomas puros. Además, la velocidad de recuperación de vesículas después del fraccionamiento por LC fue de 70 +/-19%, por lo tanto, la LC no obstaculizó la ganancia en rendimiento de partículas conseguida por UF sola. WB corroboró estos datos, ya que los marcadores exosomales se expresaban más fuertemente en la fracción 1 de LC en comparación con las muestras purificadas por UC. Además, la proporción de proteína por vesícula fue mucho menor para UF-LC en comparación con las muestras de UC. EM también se realizó en la fracción 1 y 2, donde las vesículas intactas en forma de copa se detectaron solo en la fracción 1, mientras que los agregados proteicos se observaron en la fracción 2. Además, cuando los exosomas marcados con CD63-EGFP HEK293T purificados con UF-LC se visualizaron por microscopía fluorescente, las vesículas positivas para EGFP parecieron similares a las vesículas purificadas por UF, lo que indica que LC no afectó las propiedades biofísicas de las vesículas. Por lo tanto, los inventores han descubierto que el uso de un método de dos etapas que combina UF con LC posterior sorprendentemente permite un aislamiento altamente eficaz de altos rendimientos de exosomas biofísicamente intactos libres de contaminación proteica. El campo de los exosomas se basa actualmente completamente en la efectividad percibida del método de UC, que los presentes inventores han demostrado ser muy poco confiable.
El método de purificación por UF-LC de la presente invención y el método de UC convencional aislaron vesículas con contenidos proteicos similares, como se evidencia por el buen solapamiento proteómico entre los dos métodos.
imagen8
imagen9
15
25
35
45
55
65
metabólicos, glucólisis y/o proteínas ribosómicas. En una realización adicional, el método para obtener exosomas de suministro de acuerdo con la presente invención puede comprender una etapa en la que las células a partir de las cuales se obtienen los exosomas están expuestas a condiciones inductoras de estrés (por ejemplo, pero sin limitación, privación de oxígeno y/o falta de suero), con el fin de inducir el enriquecimiento de proteínas metabólicamente activas y/o proteínas antiapoptóticas para potenciar los efectos regeneradores de los exosomas. Cuando se comparan vesículas de control (sin ningún polipéptido terapéutico) cultivadas bajo condiciones de inducción de estrés con vesículas de control (sin ningún polipéptido terapéutico) cultivadas en condiciones normales, las vesículas extracelulares expuestas al estrés generan un efecto terapéutico claramente mejorado en varios modelos inflamatorios, lo que indica que las capacidades regenerativas de las vesículas extracelulares (notablemente exosomas) se han incrementado debido a las condiciones de cultivo que inducen estrés.
Un aspecto particularmente ventajoso de la presente invención se refiere a exponer células a partir de las cuales se deben obtener exosomas a una combinación tanto de inhibidores de autofagia como a condiciones inductoras de estrés, con el fin de (1) aumentar el rendimiento de exosomas y (2) aumentar la capacidad regenerativa de los exosomas así producidos. Los exosomas obtenidos a través de este enfoque combinatorio se pueden purificar usando el protocolo de UF-LC ventajoso de la presente invención, para garantizar verdaderamente que se optimiza la eficacia terapéutica de los exosomas.
Además, la presente invención se refiere a un método de tratamiento que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de exosomas de suministro terapéutico a un sujeto que lo necesita, en donde el método está dirigido a mejorar, aliviar y/o prevenir enfermedades tales como la enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática, psoriasis, síndrome periódico asociado al receptor del factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAPS), deficiencia del antagonista del receptor de la interleuquina 1 (DIRA), endometriosis, hepatitis autoinmune, esclerodermia, miositis, accidente cerebrovascular, lesión aguda de la médula espinal, vasculitis, síndrome de Guillain-Barré, infarto agudo de miocardio, ARDS, sepsis, meningitis, encefalitis, insuficiencia hepática, insuficiencia renal, enfermedad de injerto contra huésped, distrofia muscular de Duchenne y otras enfermedades musculares, enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, caquexia inducida por cáncer, anorexia, diabetes mellitus tipo 2 y cánceres (por ejemplo, cánceres sensibles al EGF, VEGF, FGF). Algunos de los tipos de cáncer de relevancia para la presente invención comprenden, por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitoma, carcinoma de cerebelo o cerebral de células basales, cáncer del conducto biliar, cáncer de vejiga, tumor óseo, glioma del tallo encefálico, cáncer cerebral, tumor cerebral (astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral / glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, glioma hipotalámico de las vías de la visión), cáncer de mama, adenomas / carcinoides bronquiales, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide (infantil, gastrointestinal), carcinoma primario desconocido, linfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso / glioma maligno, cáncer de cuello uterino, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, tumor de células redondas pequeñas desmoplásicas, cáncer endometrial, ependimoma, cáncer de esófago, tumor de células germinales extracraneales, tumor de células germinales extragonadales, cáncer de vías biliares extrahepáticas, cáncer de ojo (melanoma intraocular, retinoblastoma), cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales (extracraneales, extragonadales u ováricas), tumor trofoblástico gestacional, glioma (glioma del tronco encefálico, astrocitoma cerebral, glioma hipotalámico y del camino de la visión), carcinoide gástrico, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes (páncreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (cáncer de células renales), cáncer de laringe, leucemias ((linfoblástica aguda (también llamada leucemia linfocítica aguda), mieloide aguda (también llamada leucemia mielógena aguda), linfocítica crónica (también llamada leucemia linfocítica crónica), mielógena crónica (también llamada leucemia mieloide crónica), leucemia de células pilosas)), cáncer de cavidad labial y oral, liposarcoma, cáncer de hígado (primario), cáncer de pulmón (células no pequeñas, células pequeñas), linfomas ((linfoma relacionado con el SIDA, linfoma de Burkitt, linfoma cutáneo de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (una antigua clasificación de todos los linfomas excepto de Hodgkin), linfoma del sistema nervioso central primario)), meduloblastoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico con oclusión primaria, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple / neoplasia de células plasmáticas, micosis fungoide, enfermedades mielodisplásicas / mieloproliferativas, leucemia mielógena, leucemia mieloide crónica (aguda, crónica), mieloma, cáncer de la cavidad nasal y del seno paranasal, carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma / histiocitoma fibroso maligno de hueso, cáncer de ovario, cáncer de epitelio ovárico (tumor epitelial-estromal superficial), tumor de células germinales ováricas, tumor maligno potencial bajo de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de células de islotes pancreáticos, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, astrocitoma pineal, germinoma pineal, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, adenoma pituitario, blastoma pleuropulmonar, cáncer de próstata, cáncer rectal, carcinoma de células renales (cáncer de riñón), retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándula salival, sarcoma (tumores de la familia del sarcoma de Ewing, sarcoma de Kaposi, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma uterino), síndrome de Sézary, cáncer de piel (no melanoma, melanoma), cáncer de intestino delgado, cáncer de células escamosas, de
15
25
35
45
55
65
cuello de células escamosas, cáncer de estómago, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, cáncer de testículo, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de células transicionales de la pelvis renal y el uréter, cáncer de uretra, cáncer uterino, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenström y/o tumor de Wilm (cáncer de riñón).
A diferencia de muchas otras terapias, los exosomas y otras vesículas extracelulares tienen el potencial de cruzar la barrera hematoencefálica (BHE). Los exosomas de suministro terapéutico que comprenden receptores señuelo incompetentes para señalización, por ejemplo, para IL6, IL-1β y TNFα pueden modular por lo tanto los diversos trastornos del sistema nervioso central (SNC) y específicamente varias formas de neuroinflamación. La neuroinflamación es la inflamación del sistema nervioso, incluido el sistema nervioso central (SNC). La neuroinflamación puede ser aguda, por ejemplo, infección o eventos traumáticos, o crónica, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas (incluida la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y las enfermedades desmielinizantes, tales como la esclerosis múltiple (EM)). En el SNC, las células gliales, que incluyen microglia y astrocitos, tienen un papel importante en la inmunidad innata. Estas células, entre otros tipos de células en el cerebro, pueden producir citoquinas y quimioquinas que actúan como neuromoduladores. Las citoquinas más comunes en la neuroinflamación del SNC incluyen IL6, IL-1β y TNFα. La producción de estas citoquinas proinflamatorias puede causar neurotoxicidad y puede comprometer la integridad de la barrera hematoencefálica (BHE).
En un modelo in vivo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), los ratones tratados con exosomas de suministro terapéutico que comprenden diversos receptores señuelo del polipéptido terapéutico (como se describió anteriormente) mostraron un fenotipo de enfermedad notablemente mejorado, como se ilustra en la Figura 9. Por tanto, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a la administración de cualquier receptor adecuado (por ejemplo, IL-6R, TNFR1, IL-1βR, y/o cualquier combinación de los mismos) al SNC, para tratar esencialmente cualquier neuroinflamación.
Además, la presente invención se refiere adicionalmente a reactivos, kits, medios celulares y procesos de cultivo celular. Por ejemplo, los procesos de cultivo celular que utilizan los métodos para producir los exosomas de suministro terapéutico de la presente invención pueden emplearse en una variedad de líneas celulares adecuadas productoras de exosomas, tales como células mesenquimales, células madre adultas (por ejemplo, mioblastos), células madre pluripotentes inducidas (iPS), células madre del cordón umbilical, células madre embrionarias y/o células madre amnióticas, células derivadas de la sangre (por ejemplo, células B, macrófagos, células DC, células T, células NK, plaquetas, etc.), líneas celulares o células eucariotas inmortalizadas (por ejemplo, células de neuroblastoma NSC34, N2a y SHSY5Y, células HEK, células madre neuronales C17.2, células neuroendoteliales bEND3, células HeLa, células U2OS, etc.), o cualquier combinación de estas fuentes de células. En realizaciones adicionales, la presente invención se refiere al medio de cultivo celular, a cualquier reactivo adecuado para uso in vitro, y/o a un kit de partes que comprende los exosomas de suministro terapéutico. Los kits particularmente ventajosos pueden comprender, opcionalmente en contenedores separados, un medio celular para cultivar células productoras de exosomas e inhibidores de la autofagia, para aumentar el rendimiento de producción de exosomas. Los medios de cultivo celular de acuerdo con la presente invención se pueden adaptar para que contengan muy poco o nada de suero con el fin de garantizar que los exosomas producidos por las células expresen cantidades mayores de proteínas metabólicamente activas y antiapoptóticas, para aumentar su capacidad regenerativa inherente. Por ejemplo, en una realización preferida, la presente invención se refiere a un kit que comprende (i) medios de cultivo para cultivo celular en condiciones de falta de suero para potenciar los efectos regeneradores de los exosomas producidos, (ii) inhibidores de la autofagia tales como cloroquina, bafilomicina A, y/o 3-metiladenina, o cualquier combinación de los mismos para aumentar el rendimiento de producción de los exosomas, y células adecuadas para la producción de exosomas.
Debe entenderse que los aspectos que sirven como ejemplo, realizaciones y alternativas y variantes descritos anteriormente pueden modificarse sin apartarse del alcance de la invención, entre otros con respecto a los constituyentes y componentes descritos aplicados (por ejemplo, los receptores señuelo de polipéptidos terapéuticos, y los polipéptidos transportadores, etc.), materiales (por ejemplo, tipos de células, etc.) y parámetros del método (por ejemplo, técnicas de purificación, enfoques de conjugación, etc.). La invención se ejemplificará adicionalmente con los ejemplos adjuntos, que naturalmente también se pueden modificar sin apartarse del alcance de la invención.
Ejemplos
Producción de vesículas de suministro basadas en células
Un tipo de célula que produce una vesícula de suministro terapéutico adecuado, tal como un exosoma, una microvesícula o cualquier otro tipo de estructura derivada de células, se coloca en una placa / siembra con una densidad apropiada en un medio celular. En el caso de la producción de exosomas, un tipo de célula productora de exosomas se coloca en una placa / siembra con una densidad apropiada en un medio celular. El medio celular se elimina después de 24 horas y la placa se lava con PBS 3 veces. Se añade un nuevo medio fresco sin exosomas o un medio libre de suero. Los exosomas se purifican a partir de los medios acondicionados. El tiempo de incubación
15
25
35
45
55
65
antes de que los medios se tomen de las células usualmente varía de 48-72 horas dependiendo del tipo de célula, pero puede aumentar o disminuir bajo ciertas circunstancias.
El medio en el que se cultivan las células está siempre sin exosomas y micropartículas foráneas mediante ultracentrifugación a 110.000 g durante la noche antes de la incubación con las células. Alternativamente, se aplica en su lugar un medio sin suero, tal como OptiMEM o DMEM.
El medio acondicionado puede purificarse con diferentes técnicas; ultrafiltración con LC secuencial o purificación mediante cromatografía líquida de alta resolución, ultracentrifugación o kits comercialmente disponibles. Antes de la ultrafiltración o ultracentrifugación, el medio acondicionado se limpia de células y desechos celulares mediante centrifugación del medio a 300 g durante 5 minutos. El sobrenadante se centrifuga posteriormente a 1.500 g durante 15 minutos y se pasa a través de un filtro de 0,2 micrómetros. El medio acondicionado se limpia así de vesículas y agregados de más de 200 nanómetros de tamaño. La filtración a través de 0,2 micrómetros se puede intercambiar con una centrifugación a 15.000 g durante 30 minutos.
Mediante ultrafiltración o flujo tangencial, se concentra el medio acondicionado. El límite de MWCO es en ambos métodos usados de 100 kDa. El medio concentrado se purifica adicionalmente mediante LC o HPLC, usando una columna adecuada, tal como Sephacryl S-300. La primera fracción de LC / HPLC contiene los exosomas.
Mediante ultracentrifugación, el medio acondicionado se centrifuga a 110.000 g durante 70 minutos, se descarta el sobrenadante y el sedimento se resuspende en PBS y se centrifuga una vez más a 110.000 g durante 70 minutos. El sobrenadante se descarta y el sedimento se resuspende en PBS. Para purificar aún más los exosomas, la segunda etapa del proceso de purificación se puede realizar con una almohadilla de sacarosa al 30%. La almohadilla atrapa a los exosomas. Los exosomas se eluyen de la almohadilla de sacarosa mediante otra etapa de centrifugación en PBS a 110.000 g durante 70 minutos y luego el sedimento se resuspende en PBS.
La muestra del exosoma se puede analizar con una transferencia western, ELISA, NTA y microscopía electrónica. La cantidad de receptores señuelo en cada muestra se puede determinar por ELISA hasta un polipéptido de interés. La dosis administrada se calcula luego como la cantidad de polipéptido administrada a partir de la concentración obtenida del ELISA.
Producción de vesículas artificiales
También se pueden utilizar liposomas, estructuras de tipo lipídico, lipidoides y otros tipos de vesículas de suministro basadas en lípidos producidas artificialmente. Estas vesículas pueden producirse por técnicas conocidas en el arte y el constructo polipeptídico que comprende el polipéptido transportador y el receptor señuelo del polipéptido terapéutico pueden cargarse en las vesículas usando tecnología estándar, por ejemplo, marcación con lípidos, etc.
Validación del protocolo de purificación con UF-LC
Cultivo de células
Se cultivaron NSC-34, una fusión de células de médula espinal de ratón embrionarias enriquecidas con neuronas motoras con neuroblastoma de ratón, N2a, una línea celular de neuroblastoma de ratón, B16F10, una línea celular de melanoma de ratón y células de riñón embrionario humano (HEK293T) a 37°C con un 5% de CO2 en medio completo compuesto por medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen), complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS, Cellgro), y penicilina/estreptomicina (pen/estrep, 5.000 μg/mL, Cellgro). Para el aislamiento de exosomas, los medios se cambiaron 24 h después de la siembra por medio previamente centrifugado u OptiMEM. El medio previamente centrifugado es DMEM complementado con FBS al 10% que se había centrifugado previamente a 120.000 g durante 70 minutos antes de elaborar el medio desprovisto de vesículas. Tanto OptiMEM como el medio previamente centrifugado fueron complementados con pen/estrep. El medio acondicionado se recogió luego para el aislamiento del exosoma 48 h después de la incubación. Para experimentos a gran escala, los medios acondicionados recogidos de múltiples matraces se combinaron antes del aislamiento de los exosomas.
Transfección de células HEK293T
Se sembraron 6 millones de células un día antes de la transfección en una placa de cultivo de 15 cm con medio completo DMEM. La transfección del plásmido CD63-EGFP se realizó usando polietilenimina (PEI) a una relación de pADN:PEI de 1:4. Brevemente, se diluyeron 25 μg de plásmido y 100 μg de PEI en 500 μL de OptiMEM en tubos separados. Después de 5 min de incubación a temperatura ambiente (TA), las soluciones de pADN y PEI se combinaron y se incubaron durante 30 minutos más a temperatura ambiente para formar los complejos de DNA/PEI. Los complejos se añadieron gota a gota a las células. Después de 4 h, se eliminó el medio de cultivo celular que contenía los complejos; las células se lavaron con solución salina regulada con fosfato (PBS) y se añadió a las células OptiMEM fresco, complementado con antibióticos P/S. Después de 48 h de incubación, el medio acondicionado se recogió para el aislamiento del exosoma.
imagen10
imagen11
15
25
35
45
55
65
objetivo de 1 x 106 iones. Para la generación de espectros de fragmentación de HCD, se utilizó un tiempo máximo de inyección de iones de 500 ms y AGC de 1 x 105 antes de la fragmentación al 30% de energía de colisión normalizada, resolución de 17.500. Los precursores se aislaron con un ancho de 2 m/z y se colocaron en la lista de exclusión durante 70 s. Los estados de carga únicos y no asignados se rechazaron de la selección del precursor.
Se usó proteoma descubridor 1.3 con percolador de secuestro para la identificación de proteínas. La tolerancia de la masa del precursor se estableció en 10 ppm y para los fragmentos en 0,02 Da. La metionina oxidada se fijó como modificación dinámica y la carbamidometilación como modificación estática. Los espectros se emparejaron con una base de datos de un conjunto de 72 combinada de mus musculus y bos taurus, y los resultados se filtraron con FDR al 1%. Se consideró que las identificaciones en bos taurus se originaron en FBS y se eliminaron. El análisis de enriquecimiento del término de GO se realizó usando Panther.
Biodistribución de exosomas en ratones
Los sobrenadantes celulares acondicionados se filtraron a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm y se incubaron con DiR (yoduro de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindodicarbocianina) 1μM (Invitrogen). El medio acondicionado con DiR se ultracentrifugó luego a 110.000 g durante 70 minutos o se concentró con un filtro de centrifugación Amicon Ultra de 100 kDa (Millipore). El sedimento de UC se resuspendió y se centrifugó de nuevo en PBS para purificar el DiR o LC sin unir fraccionado como se describió anteriormente. Los exosomas purificados se cuantificaron con NTA y se inyectaron cantidades iguales de partículas de ambas preparaciones de UC y LC en la vena de la cola de ratones Balb/c (n = 5). Veinticuatro horas después de la inyección, se recolectaron los órganos y se sometieron a formación de imágenes en el espectro del sistema de imagenología in vivo (IVIS) (Caliper). El IVIS se configuró para registrar la fluorescencia durante 2 segundos (excitación 710, emisión 760) y los datos obtenidos se analizaron con el software de IVIS. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la Junta Local Sueca para Animales de Laboratorio. Los experimentos se realizaron de acuerdo con el permiso ético y se diseñaron para minimizar el sufrimiento y el dolor de los animales.
Tratamiento de la colitis utilizando exosomas que muestran CD63-sTNFR1 incompetente para señalización Se usó el modelo de colitis inducido por TNBS bien estudiado en ratones, simulando la tormenta de citoquinas, la diarrea, la disminución de peso y la inflamación intestinal observadas en pacientes con IBD. Se dividieron 24 ratones en cuatro grupos de tratamiento, con 6 ratones por grupo. Los ratones se sensibilizaron previamente aplicando 150 μL de una solución de acetato de aceite de oliva con 2% de TNBS sobre la piel, 1 semana antes de la inducción de la colitis. La colitis se indujo luego dando una infusión rectal de 100 μL de solución que contenía TNBS al 1,5% en etanol al 40%. Inmediatamente después de la inducción de colitis, se administraron 30 μg de exosomas en 200 μL por vía intravenosa en la vena de la cola. A los ratones se les administró exosomas señuelo TNFR1-CD63, incompetentes para señalización, exosomas no modificados, exosomas TNFR1-CD63 competentes para señalización, o PBS como tratamiento simulado, dependiendo del grupo de tratamiento asignado. Se registró diariamente el peso corporal.
Como puede verse a partir de la Figura 2, la administración de exosomas que comprenden el receptor señuelo de acuerdo con la presente invención conduce a un tratamiento exitoso de la colitis en ratones. Los exosomas señuelo incompetentes para señalización tratan satisfactoriamente la colitis inducida en pocos días con menos pérdida de peso corporal, mientras que los exosomas no modificados muestran un efecto moderado. Los receptores señuelo competentes para la señalización de hecho agravan la condición.
Transferencia Western de CD63-sTNFR1 en la superficie exosomal
Se realizó transferencia Western hacia la parte extracelular de TNFR1, para verificar la presencia del constructo polipeptídico CD63-sTNFR1 en la superficie exosomal. El peso molecular predicho para el constructo para CD63-TNFR1 es de 38,52 kDa, que se puede observar en la proximidad de la banda de referencia de 37 kDa, tanto en la muestra de lisado celular como en la muestra de exosoma. La proteína de fusión se carga sobre los exosomas con gran eficacia, ya que la banda es muy fuerte en la fracción del exosoma (la banda alrededor de 15 kDa es una banda inespecífica irrelevante).
Neutralización de la toxicidad mediada por TNFα
La actividad neutralizante de los exosomas CD63-TNFR1 incompetentes para señalización, los exosomas CD63-TNFR1 competentes para señalización y los exosomas de las células N2a contra TNF-α humano se midieron en la línea celular WEHI 164 de ratón tratada con actinomicina D como se describió previamente (Austgulen et al., 1986, Khabar et al., 1995), con el fin de verificar la afinidad de unión por TNFα. Brevemente, las células WHEI 164 se sembraron por triplicado a razón de 1x104 células/pozo en una placa de 96 pozos y se cultivaron en medio RPMI 1640 complementado con FBS al 10% (v/v) durante 20 h. Posteriormente, se añadieron exosomas diluidos en forma serial (concentración final: 0,5-100 µg/mL) en el medio que contenía 2 μg/mL de actinomicina D al cultivo celular junto con 0,1 ng/mL de TNF-α humano. Las células se incubaron durante 20 h adicionales a una temperatura de 37 grados centígrados y se analizó la viabilidad celular usando un kit colorimétrico de determinación de crecimiento
15
25
35
45
55
65
celular con base en MTT (Sigma, St. Louis, MO). El valor ED50 se calculó mediante análisis de regresión no lineal sigmoide complejo usando el software de gráfico Sigma (Systat software, Inc. Richmond, CA).
Eficacia antitumoral de exosomas y liposomas que muestran sindecano incompetente para señalización/CD63sVEGFR1
Se implantaron 30 ratones en 30 ratones con 1x106 células de melanoma B16/F10 en el flanco el día cero. Los ratones fueron divididos en cinco grupos de tratamiento, con 6 ratones por grupo. Después de una semana (día 7), los ratones recibieron inyecciones intravenosas de 30 μg de exosomas en 200 μL que se repitieron cada dos días durante dos semanas. A los ratones se les administró exosomas que comprenden sindecano-sVEGFR1 incompetentes para señalización, exosomas CD63-sVEGFR1 incompetentes para señalización, exosomas no modificados y exosomas que comprenden CD63-sVEGFR1 competente para señalización o PBS como tratamiento simulado dependiendo del grupo de tratamiento asignado. El volumen del tumor se midió cada dos días.
La flecha en la Figura 4 indica el inicio del tratamiento (día 7). Los ratones tratados con exosomas sVEGFR1 señuelo incompetentes para señalización (sindecan-sVEGFR1 EXO y CD63-sVEGFR1 EXO) mostraron la menor carga tumoral después del tratamiento. El tratamiento con exosomas no modificados tuvo un efecto moderado sobre el tamaño del tumor, mientras que el tratamiento con exosomas que comprende CD63-sVEGFR1 competente para señalización resultó en una condición agravada, en comparación con el grupo de control tratado de manera simulada.
Los experimentos anteriores también se repitieron con liposomas que comprenden el mismo conjunto de receptores señuelo polipeptídicos y se obtuvieron resultados similares.
Tratamiento de ratones MDX
Se sembraron células N2a a razón de 3 millones por matraz de 150 cm2 y se cultivaron en DMEM con FBS al 10%. Después de 24 horas, las células se transfectaron con PEI con plásmidos que codificaban activina sindecano incompetente para señalización o activina-sinaptotagmina incompetente para señalización. Cuatro horas después de la transfección, se cambió el medio por OptiMEM. Después de 72 horas del cambio del medio, los exosomas producidos por las células N2a se recogieron por ultrafiltración y purificación LC secuencial. Los exosomas se usaron inmediatamente o se almacenaron a -20. Los ratones MDX se obtuvieron a través de Charles River con un peso de alrededor de 18-19 gramos. Los ratones se asignaron en 4 grupos con 6 ratones en cada grupo. Los ratones recibieron inyecciones de exosomas o PBS dos veces a la semana durante 12 semanas. El peso se registró antes de cada inyección.
La Figura 5 muestra la eficacia del tratamiento en ratones MDX de exosomas que comprende el receptor señuelo del polipéptido terapéutico activina fusionado a las proteínas transportadoras sindecano (línea negra continua) o sinaptotagmina (línea gris discontinua larga). El tratamiento quincenal con los exosomas de suministro terapéutico anteriores dio como resultado un aumento de peso corporal considerablemente mayor que el tratamiento con exosomas no modificados y tratamiento simulado.
Los experimentos anteriores también se repitieron con quilomicrones y se obtuvieron resultados similares.
Tratamiento de neuroinflamación
En un modelo in vivo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), los ratones tratados con exosomas señuelo (como se describió anteriormente) mostraron un fenotipo de enfermedad notablemente mejorado, Figura X3. Se indujo EAE mediante inmunización de los ratones con neuroantígeno (proteína básica de mielina, MBP) y adyuvante completo de Freund (que contiene M. tuberculosis), seguido de la inyección de toxina pertussis para producir EAE grave y confiable. Se registró la progresión de la enfermedad con síntomas clínicos diariamente desde el inicio de la enfermedad (día 12-28). Se les asigna puntaje a los síntomas en función de la gravedad (0 = ratón normal, sin signos evidentes de enfermedad, 1 = cola flácida o debilidad de las extremidades posteriores, pero no ambos; 2 = cola flácida y debilidad de las extremidades posteriores; 3 = parálisis parcial de las extremidades posteriores; 4 = parálisis completa de las extremidades posteriores, 5 = estado moribundo, muerte por EAE: sacrificio por razones humanitarias), lo que resulta en una puntuación clínica media utilizada para evaluar el estado de la enfermedad. Es notable que los ratones, con y sin EAE inducida, tratados con exosomas derivados del origen neuronal dieron como resultado espasmos y muerte posterior, en comparación con el tratamiento de exosomas de otros orígenes celulares donde este fenómeno no estaba presente. La Figura 9 ilustra la eficacia de los siguientes exosomas de suministro:
 Exosomas señuelo que comprenden IL6R + TNFR1  Exosomas señuelo que comprenden IL6R  Exosomas señuelo que comprenden TNFR1  Exosomas señuelo comprendiendo IL-1βR

Claims (1)

  1. imagen1
ES14723513T 2013-04-12 2014-04-10 Vesículas de suministro terapéutico Active ES2662326T5 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE1300271 2013-04-12
SE1300271 2013-04-12
PCT/SE2014/000047 WO2014168548A2 (en) 2013-04-12 2014-04-10 Therapeutic delivery vesicles

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2662326T3 true ES2662326T3 (es) 2018-04-06
ES2662326T5 ES2662326T5 (es) 2021-08-04

Family

ID=20296661

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14723513T Active ES2662326T5 (es) 2013-04-12 2014-04-10 Vesículas de suministro terapéutico

Country Status (11)

Country Link
US (3) US11274139B2 (es)
EP (2) EP3335721A1 (es)
JP (3) JP6542197B2 (es)
AU (1) AU2014251388B2 (es)
CA (1) CA2910802A1 (es)
DK (1) DK2983721T4 (es)
ES (1) ES2662326T5 (es)
HK (1) HK1257101A1 (es)
PT (1) PT2983721T (es)
SG (1) SG11201508433TA (es)
WO (1) WO2014168548A2 (es)

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201202319D0 (en) 2012-02-10 2012-03-28 Orbsen Therapeutics Ltd Stromal stem cells
EP3335721A1 (en) 2013-04-12 2018-06-20 Evox Therapeutics Limited Therapeutic delivery vesicles
BR112015026258A2 (pt) 2013-04-16 2017-10-10 Orbsen Therapeutics Ltd composições e agentes terapêuticos e imunomoduladores, e usos dos mesmos
KR20170005854A (ko) 2014-05-18 2017-01-16 칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션 엑소솜과 관련된 방법 및 조성물
GB201418562D0 (en) 2014-10-20 2014-12-03 Univ London Queen Mary Peptides
EP3271396B1 (en) 2015-03-20 2022-03-16 Orbsen Therapeutics Limited Modulators of syndecan-2 and uses thereof
KR101912313B1 (ko) * 2016-09-30 2018-10-26 주식회사 셀렉스라이프사이언스 Cre 재조합 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 표적 유전자의 조건적 녹아웃 대립유전자를 생성하기 위한 조성물
WO2016178532A1 (ko) * 2015-05-04 2016-11-10 한국과학기술원 목적 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 엑소솜을 이용하여 목적 단백질을 세포질로 전달시키는 방법
KR101912315B1 (ko) * 2016-09-30 2018-10-26 주식회사 셀렉스라이프사이언스 Bax 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물
US10702581B2 (en) 2015-05-04 2020-07-07 Ilias Biologics Inc. Compositions containing protein loaded exosome and methods for preparing and delivering the same
KR101912310B1 (ko) * 2016-10-04 2018-10-26 주식회사 셀렉스라이프사이언스 페록시레독신 i 또는 ii 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 항산화용 약학적 조성물
KR101877010B1 (ko) * 2016-09-30 2018-08-09 한국과학기술원 super-repressor-IκB 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물
KR101900465B1 (ko) * 2016-10-13 2018-09-19 주식회사 셀렉스라이프사이언스 CRISPR-CAS family를 이용한 게놈 에디팅 툴을 엑소솜으로 전달하는 기술
KR20160130937A (ko) * 2015-05-04 2016-11-15 한국과학기술원 목적 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 엑소솜을 이용하여 목적 단백질을 세포질로 전달시키는 방법
MX2017015962A (es) 2015-06-10 2018-07-06 Univ Texas Uso de exosomas para el tratamiento de enfermedades.
WO2017054086A1 (en) * 2015-10-01 2017-04-06 Exerkine Corporation Treatment of genetic myopathies using bioengineered exosomes
WO2017054085A1 (en) * 2015-10-01 2017-04-06 University Of Ottawa Exosome packaging of nucleic acids
CN108697740A (zh) 2015-11-18 2018-10-23 佐治亚大学研究基金会 神经细胞细胞外囊泡
EP3922253A1 (en) * 2016-01-15 2021-12-15 Orbsen Therapeutics Limited Sdc-2 exosome compositions and methods of isolation and use
GB201609216D0 (en) * 2016-05-25 2016-07-06 Evox Therapeutics And Isis Innovation Ltd Exosomes comprising therapeutic polypeptides
GB2552301A (en) * 2016-07-11 2018-01-24 Evox Therapeutics Ltd Metabolic drug loading of EVs
GB2552460A (en) * 2016-07-11 2018-01-31 Evox Therapeutics Ltd CPP-Mediated EV Loading
GB2552774A (en) * 2016-07-12 2018-02-14 Evox Therapeutics Ltd EV-Mediated delivery of binding protein-small molecule conjugates
GB2552473A (en) 2016-07-21 2018-01-31 Evox Therapeutics Ltd Surface decoration of extracellular vesicles
JP2019528674A (ja) * 2016-09-30 2019-10-17 セレックス ライフ サイエンシズ，インコーポレーテッド タンパク質をロードしたエキソソームを含む組成物、並びにその調製及び送達のための方法
KR102120921B1 (ko) * 2017-02-10 2020-06-10 주식회사 일리아스바이오로직스 Gba 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 고셔병 예방 및 치료용 약학적 조성물
GB201702863D0 (en) 2017-02-22 2017-04-05 Evox Therapeutics Ltd Improved loading of EVs with therapeutic proteins
CA3056337A1 (en) 2017-03-21 2018-09-27 Exoprother Medical Ltd. Native cell derived vesicles containing tumor suppressor proteins for therapy
JP7395355B2 (ja) 2017-05-08 2023-12-11 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド 膜融合を促進するための組成物およびその使用
WO2018208670A1 (en) * 2017-05-08 2018-11-15 Trustees Of Tufts College EXTRACELLULAR VESICLES COMPRISING MEMBRANE-TETHERED TGF-β, COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
EP3652305A2 (en) 2017-07-14 2020-05-20 Orbsen Therapeutics Limited Cd39 stromal stem cells methods of isolation and use
CN111491655A (zh) 2017-08-07 2020-08-04 加利福尼亚大学董事会 用于生成安全细胞治疗剂的平台
KR20200040818A (ko) * 2017-08-15 2020-04-20 칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션 정제된 중간엽 줄기 세포 엑소좀 및 그의 용도
WO2019035057A2 (en) * 2017-08-17 2019-02-21 Cellex Life Sciences, Incorporated EXOSOMES FOR TARGET-SPECIFIC DELIVERY AND METHODS OF PREPARATION AND ADMINISTRATION THEREOF
CA3073162C (en) * 2017-08-17 2023-07-04 Ilias Biologics Inc. Exosomes for target specific delivery and methods for preparing and delivering the same
WO2019038533A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Resurgo Genetics Limited METHODS OF CHANGING TRANSCRIPTIONAL OUTPUT
GB201717446D0 (en) 2017-10-24 2017-12-06 Evox Therapeutics Ltd Affinity purification of engineering extracellular vesicles
TR201720642A2 (tr) * 2017-12-18 2019-07-22 Univ Yeditepe Güdümlü kafe yüklü mi̇krovesi̇küler kanser i̇laci ve bunun geli̇şti̇ri̇lmesi̇ yöntemi̇
JP7476102B2 (ja) 2017-12-22 2024-04-30 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス ホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチド
WO2019122277A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Novel thiophosphoramidites
JP7476101B2 (ja) 2017-12-22 2024-04-30 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス ホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むギャップマーオリゴヌクレオチド
GB201802163D0 (en) * 2018-02-09 2018-03-28 Evox Therapeutics Ltd Compositions for EV storage and formulation
CA3091478A1 (en) 2018-02-17 2019-08-22 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Compositions and methods for membrane protein delivery
US20210000895A1 (en) * 2018-03-01 2021-01-07 Rhode Island Hospital Exosome targeting of cd4+ expressing cells
GB201809622D0 (en) 2018-06-12 2018-07-25 Evox Therapeutics Ltd Engineering extracellular vesicles for affinity purification
SG11202100864VA (en) 2018-08-14 2021-02-25 Evercyte Gmbh Target-specific extracellular vesicles
US20220160870A1 (en) 2018-08-28 2022-05-26 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Neoantigen engineering using splice modulating compounds
US20230068547A1 (en) 2018-11-14 2023-03-02 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Compositions and methods for compartment-specific cargo delivery
US11119798B2 (en) 2018-11-15 2021-09-14 Sternum Ltd. Applying control flow integrity verification in intermediate code files
US20210379192A1 (en) * 2019-01-25 2021-12-09 Mantra Bio, Inc. Skeletal muscle targeting moieties and uses thereof
WO2020231700A1 (en) * 2019-05-11 2020-11-19 Youngsuk Yi Neurotoxin compositions and methods
JP2022537807A (ja) * 2019-06-21 2022-08-30 エンテレクソ バイオセラピューティクス インク． 治療送達用のプラットフォーム、組成物、および方法
WO2021034131A1 (ko) * 2019-08-20 2021-02-25 (주)메디톡스 표적 단백질로서 il-1 저해제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 세포로부터 유래한 세포외 소낭 및 그의 용도
JP2023514975A (ja) 2020-01-27 2023-04-12 マントラ バイオ，インコーポレイテッド キメラ小胞局在化部分を含む非天然発生の小胞、その産生方法、およびその使用
EP4099984A4 (en) 2020-02-05 2024-05-01 Diadem Biotherapeutics Inc ARTIFICIAL SYNAPSES
US20230160864A1 (en) * 2020-02-12 2023-05-25 President And Fellows Of Harvard College Methods of measuring and purifying extracellular vesicles
CA3175322A1 (en) * 2020-03-17 2021-09-23 Ohio State Innovation Foundation Designer extracellular vesicles for treating excitotoxicity
CN111529505B (zh) * 2020-03-25 2023-04-11 西安组织工程与再生医学研究所 功能性嵌合凋亡小体及其制备方法和应用
CN111529504B (zh) * 2020-03-25 2023-01-10 西安组织工程与再生医学研究所 功能性嵌合凋亡小体及其制备方法和应用
EP4127136A4 (en) * 2020-03-31 2024-04-03 Ilias Biologics Inc USE OF DELIVERY OF NF-KB INHIBITORS FROM EXOSOMES
KR102636371B1 (ko) * 2020-04-10 2024-02-19 한국과학기술연구원 신규 재조합 엑소좀 및 그의 용도
KR102341138B1 (ko) 2020-05-31 2021-12-21 주식회사 엑소코바이오 엑소좀의 막단백질 변이체를 포함하는 엑소좀 및 이의 제조방법
CN111588704B (zh) * 2020-07-01 2023-04-11 西安组织工程与再生医学研究所 靶向响应性释放系统及其制备方法和应用
CN111803617A (zh) * 2020-07-16 2020-10-23 卡杜兰(广州)生命基因工程科技有限公司 一种内载微囊的干细胞系统与制备方法
KR20220101559A (ko) 2021-01-11 2022-07-19 주식회사 엑소코바이오 과발현된 Fc 수용체 또는 이의 일부를 포함하는 엑소좀 및 이의 제조방법
KR20220106696A (ko) 2021-01-21 2022-07-29 주식회사 엑소코바이오 목적 단백질 또는 펩타이드가 융합가능한 Fc 수용체 또는 이의 일부를 포함하는 재조합 엑소좀 및 이의 용도
WO2022204955A1 (en) * 2021-03-30 2022-10-06 Shenzhen ChuangSheng XinKe Biotechnology Co., Ltd. Method for preparation of exosomes from ipscs and its derivatives for any clinical use thereof
EP4320234A2 (en) 2021-04-07 2024-02-14 Astrazeneca AB Compositions and methods for site-specific modification
KR20240004598A (ko) * 2021-04-23 2024-01-11 아불로션 아베 질병 치료를 위한 중간엽 간질 세포로부터의 세포외 소포
CN113616811B (zh) * 2021-08-18 2023-12-05 南京中医药大学 一种载脂蛋白修饰的融合型多功能纳米囊泡及其制备方法和应用
WO2023102550A2 (en) 2021-12-03 2023-06-08 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for efficient in vivo delivery
CN114848608B (zh) * 2022-05-17 2024-01-30 东南大学 一种蛋白或多肽递送载体及其制备方法与应用
EP4282951A1 (en) * 2022-05-25 2023-11-29 École Nationale Vétérinaire, Agroalimentaire et de l'Alimentation, Nantes-Atlantique (ONIRIS) Method for obtaining extracellular vesicles from beta cells
US20240018480A1 (en) * 2022-07-15 2024-01-18 ExoTop Theragnostics Inc. Enhancement of extracellular vesicle production by lysosome inhibitor
CN117802045A (zh) * 2022-09-30 2024-04-02 北京恩康医药有限公司 一种工程化细胞外囊泡的构建及其应用

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6326353B1 (en) † 1993-03-23 2001-12-04 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Enhanced circulation effector composition and method
JP3693209B2 (ja) * 1996-04-11 2005-09-07 三菱化学株式会社 閉鎖小胞の製造方法
IL138093A0 (en) * 1998-03-31 2001-10-31 Du Pont Pharm Co Pharmaceuticals for the imaging of angiogenic disorders
FR2788780B1 (fr) 1999-01-27 2001-03-30 Ap Cells Inc Procede de preparation de vesicules membranaires
US20040241176A1 (en) * 2000-04-27 2004-12-02 Ap Cells. Inc. Method of producing membrane vesicles
WO2003016522A2 (en) 2001-08-17 2003-02-27 Anosys, Inc. Methods and compounds for the targeting of protein to exosomes
ATE442444T1 (de) * 2001-10-13 2009-09-15 Asterion Ltd Glykosylphosphatidylinositolhaltige polypeptide
US8003779B2 (en) * 2005-01-20 2011-08-23 University Of Rochester Compositions and methods for studying and treating inflammatory diseases and disorders
JP2010516786A (ja) * 2007-01-26 2010-05-20 ユニバーシティー オブ ルイヴィル リサーチ ファウンデーション，インコーポレーテッド ワクチンとしての使用のためのエキソソーム成分の改変
CN102301002A (zh) 2008-11-12 2011-12-28 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 使用外来体来确定表现型的方法和系统
CA2748889A1 (en) 2009-03-18 2010-09-23 Armagen Technologies, Inc. Compositions and methods for blood-brain barrier delivery of igg-decoy receptor fusion proteins
US20130053426A1 (en) 2009-04-17 2013-02-28 Yiqi Seow Composition For Delivery Of Genetic Material
WO2011097633A2 (en) * 2010-02-08 2011-08-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Egf receptor mimicking peptides
US20140004601A1 (en) * 2010-12-20 2014-01-02 Agency For Science, Technology And Research Method of purifying exosomes
SG183579A1 (en) 2011-02-11 2012-09-27 Agency Science Tech & Res Methods of detecting therapeutic exosomes
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US20130028895A1 (en) * 2011-07-27 2013-01-31 Gerald Wulf Exosome inhibiting agents and uses thereof
GB201121069D0 (en) 2011-12-07 2012-01-18 Isis Innovation Delivery system
GB201121070D0 (en) * 2011-12-07 2012-01-18 Isis Innovation composition for delivery of biotherapeutics
EP3335721A1 (en) 2013-04-12 2018-06-20 Evox Therapeutics Limited Therapeutic delivery vesicles

Also Published As

Publication number Publication date
DK2983721T4 (da) 2021-02-01
JP2016516768A (ja) 2016-06-09
WO2014168548A2 (en) 2014-10-16
SG11201508433TA (en) 2015-11-27
WO2014168548A3 (en) 2014-12-04
CA2910802A1 (en) 2014-10-16
EP2983721B2 (en) 2021-01-20
EP3335721A1 (en) 2018-06-20
ES2662326T5 (es) 2021-08-04
WO2014168548A8 (en) 2015-01-29
US20160137716A1 (en) 2016-05-19
US20200207833A1 (en) 2020-07-02
US11274139B2 (en) 2022-03-15
PT2983721T (pt) 2018-03-13
AU2014251388B2 (en) 2017-03-30
HK1257101A1 (zh) 2019-10-11
JP6999601B2 (ja) 2022-02-04
JP2022058390A (ja) 2022-04-12
JP6542197B2 (ja) 2019-07-10
DK2983721T3 (en) 2018-03-19
EP2983721A2 (en) 2016-02-17
US11649272B2 (en) 2023-05-16
JP2019167378A (ja) 2019-10-03
US20230111666A1 (en) 2023-04-13
EP2983721B1 (en) 2018-02-21
AU2014251388A1 (en) 2015-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2662326T3 (es) Vesículas de suministro terapéutico
ES2899857T3 (es) Exosomas que comprenden terapias de ARN
JP7171965B2 (ja) 細胞透過性ペプチド（ｃｐｐ）を介したｅｖ充填
US20210238248A1 (en) Engineering Extracellular Vesicles for Affinity Purification
Wanjale et al. Peptides as a therapeutic avenue for nanocarrier-aided targeting of glioma
US20210403644A1 (en) Method For The Degradation Of Endogenous Protein