WO2021034131A1 - 표적 단백질로서 il-1 저해제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 세포로부터 유래한 세포외 소낭 및 그의 용도 - Google Patents

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Definitions

  • the target protein may be in the form of a signal peptide to which a signal peptide is linked, that is, a fusion protein of a signal peptide and a target protein.
  • the recombinant cell may be one that mounts the target protein in an increased amount on the extracellular vesicle.
  • the recombinant cell may have an increased extracellular vesicle (EV) loading capacity compared to a recombinant cell containing a polynucleotide encoding the target protein without a signal peptide.
  • the extracellular vesicle loading ability refers to the degree to which the target protein is contained in EV or the degree to which the target protein is expressed in EV.
  • the extracellular vesicle loading capacity may indicate the loading capacity for parental cells that do not contain a polynucleotide encoding a target protein.
  • the extracellular vesicles can be efficiently produced.
  • the skin tissue of each administration group was quantified using the method described in Peng et al. (Peng, Ge et al. Inflammation 41 (2017): 154-163.). Specifically, the number of eosinophils in the dermal tissue was confirmed.
  • 5 is a view showing the number of eosinophils in the skin obtained by applying EV containing IL-1Ra derived from Pichia pastoris to inflamed skin. As shown in FIG. 5, it was confirmed that eosinophil cells were migrated in the dermis due to the inflammatory reaction in the control group to which inflammation was induced with LPS and applied with PBS, or to which EV was applied without IL-1Ra.

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Abstract

표적 단백질로서 IL-1 저해제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 세포로부터 분리된 세포외 소낭 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

표적 단백질로서 IL-1 저해제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 세포로부터 유래한 세포외 소낭 및 그의 용도
표적 단백질로서 IL-1 저해제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 세포 유래 세포외 소낭 및 그의 용도에 관한 것이다.
세포외 소낭(Extracellular vesicle, EV)은 세포가 바깥으로 방출하는 생체막으로 둘러 싸인 작은 주머니 (vesicle)를 지칭하며 작게는 직경 약 20 nm부터 크게는 직경 약 5 μm를 갖는 막 구조 소낭체이다. 세포외 소낭은 그 크기와 구성에 있어서 이질성이 있고, 엑소좀(exosome, 약 30 내지 100 nm), 엑토좀(ectosome), 마이크로소낭(microvesicle, 약 100 내지 1,000 nm), 마이크로입자(microparticle), 외막소낭 (outer membrane vesicle) 등의 다수의 상이한 종을 포함한다. 공통적으로 생체막으로 둘러싸여 있으며 단백질, 핵산, 대사 산물 등 세포가 생산하는 물질들이 포함된다. 세포외 소낭은 원핵세포와 진핵세포를 가리지 않고 모든 세포가 분비한다. 대부분의 동물세포는 다양한 크기와 성분을 갖는 세포 내 기원의 세포외 소낭을 분비한다. 원핵생물 및 진핵생물은 모두 세포외 소낭을 분비한다고 알려져 있다. 원핵 생물 중의 일례로서 종래 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에서 유래된 세포외 소낭이 알려져 있었다(한국특허 공개 10-2011-0025603).
한편, 사이토카인 (cytokine)인 인터루킨 1 (IL-1)은 IL-1α와 IL-1β를 포함하며 면역 및 염증 반응에서 중요한 역할을 담당한다. IL-1은 주로 대식세포와 단핵구 등 주요 면역 세포에 의해 체내에서 생성되지만 섬유아세포(fibroblast), 상피세포(epithelial cells) 등에서도 반응하여 염증 반응을 일으키게 된다. 이 중 IL-1β의 경우 중요한 선천적 면역 방어체계의 하나인 인플라마좀에 의하여 성숙되며, 연쇄적 염증 반응을 매개하는 중요한 사이토카인이다. 따라서 IL-1은 여러 염증 질환을 조절하는 중요한 사이토카인이다. IL-1 또는 인플라마좀과 관련된 주요 염증 질환은 류마티스 관절염, 통풍, 다발성 경화증 등이 대표적이다. 피부 질환 중에서는 자가 염증성 피부질환에 속하는 질병들, 예를 들면 크리오피린-관련 주기적 증상 발생 증후군(Cryopyrin associated periodic syndrome, CAPS), 가족성 지중해열(Familial Mediterranean fever, FMF), 호중구성 피부증(Neutrophilic dermatoses), 화농성 한선염 (Hidradenitis suppurativa; Acne inversa) 등과 더불어 건선, 여드름, 감염성 피부염 등이 IL-1 또는 인플라마좀의 영향을 받는다고 알려져 있다. 이에 대한 치료제로 지금까지 IL-1 저해제(blockade) 생물학적 제제가 개발되었다. 가장 대표적인 경우가 재조합 IL-1Ra (anakinra) 이며, 이는 IL-1의 수용체에 대한 길항체(antagonist)로서 2001년 류마티스 관절염 치료제로 최초 허가되었다. 그 외에도 수용체 데코이(Receptor decoy)인 릴로나셉트 (Rilonacept), 항체형인 카나키누맙 (Canakinumab) 등이 치료제로 허가되었다.
일 목적은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 세포로부터 유래된 세포외 소낭으로서, 상기 표적 단백질은 IL-1 저해제인 것인 세포외 소낭을 제공한다.
다른 목적은 상기한 재조합 세포 유래의 세포외 소낭 및 담체를 유효 성분으로 포함하는 IL-1 매개된 질환 또는 증상을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 목적은 상기 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 IL-1 매개된 질환 또는 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다.
다른 목적은 상기한 재조합 세포를 배양하여 배양물을 얻는 단계; 및 상기 배양물로부터 세포외 소낭을 분리하는 단계를 포함하는, 세포외 소낭을 생산하는 방법을 제공한다.
제1 양상은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 세포로부터 유래된 세포외 소낭으로서, 상기 표적 단백질은 IL-1 저해제인 것인 세포외 소낭을 제공한다.
본 명세서에서, '세포외 소낭(extracellular vesicle)'은 세포로부터 분비되는 막구조 소낭체를 가리키는 것으로서, 엑소좀(exosome), 엑토좀(ectosome), 마이크로소낭(microvesicle), 마이크로입자(microparticle), 외막소낭(outer membrane vesicle)과 호환 가능하게 사용된다. 세포외 소낭이 유래되는 세포의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 원핵 세포 또는 진핵세포, 예를 들어 세균(예를 들어, 유산균), 효모와 같은 미생물, 식물, 또는 동물 세포(예를 들어, 포유세포)를 포함할 수 있다. 특정 예에서, 세포는 미생물일 수 있다.
상기 표적 단백질은 신호 펩티드가 연결되어 있는 것, 즉 신호 펩티드와 표적 단백질의 융합 단백질의 형태일 수 있다. 상기 재조합 세포는 상기 표적 단백질을 증가된 양으로 상기 세포외 소낭에 탑재하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 재조합 세포는 신호 펩티드가 없는 상기 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 세포에 비하여 증가된 세포외 소낭(extracellular vesicle: EV) 탑재능을 갖는 것일 수 있다. 세포외 소낭 탑재능이란 표적 단백질이 EV 중에 포함되는 정도 또는 표적 단백질이 EV 중에 발현되는 정도를 나타낸다. 세포외 소낭 탑재능은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 양친 세포에 대한 탑재능을 나타내는 것일 수 있다.
상기 유산균은 Lactobacillus, Lactococcus, 및 Bifidobacterium 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 속에 속하는 종인 것일 수 있다. 상기 유산균은 Lactobacillus paracasei, Lactobacillus brevis, 또는 Lactobacillus plantarum일 수 있다.
상기 효모는 Saccharomyces, Pichia, Komagataella 및 Hansenula 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 속에 속하는 종인 것일 수 있다. 상기 효모는 S. cerevisiae, Pichia pastoris, Komagataella phaffii 또는 Hansenula polymorpha일 수 있다.
상기 표적 단백질은 IL-1 저해제이다. 상기 IL-1 저해제는 내재적 생물학적으로 활성인 IL-1의 효과적인 양을 감소시킬 수 있는 것이다. 상기 감소는 활성이 있는 IL-1α, 및/또는 IL-1β의 양을 감소시키는 것 또는 IL-1의 그의 세포 표면 IL-1 수용체에의 결합을 감소시키는 것을 포함한다. 상기 IL-1 저해제는 IL-1의 수용체 결합 펩티드 단편, IL-1α 및/또는 IL-1β 또는 IL-1 수용체에 대한 항체, 또는 IL-1에 대한 수용체의 부분 또는 그 전체 또는 그 변이체일 수 있다. 상기 IL-1에 대한 수용체의 변이체는 유전적으로 변형된 뮤틴(mutein), 또는 멀티머일 수 있다. 상기 IL-1 저해제는 IL-1Ra 폴리펩티드, IL-1β 전환 효소(ICE) 저해제, 길항적 항-IL-1R1 항체, IL-1R1 및 IL-1R2의 가용성 IL-1 결합 형태 또는 단편, IL-1에 대한 항체, 또는 IL-traps일 수 있다. 상기 IL-1β 전환 효소(ICE) 저해제는 펩티드 저해제일 수 있다. 특정 예에서, IL-1 저해제는 아나킨라, 카나키누맙, 릴로나셉트일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 신호 펩티드는 새로 합성된 단백질을 EV로 분비시키는 짧은 펩티드, 예를 들면, 10 내지 40, 15 내지 30, 16 내지 30 아미노산을 갖는 것일 수 있다. 상기 신호 펩티드는 EV로 분비될 단백질의 N-말단에 존재하는 것일 수 있다. 유산균 세포에 대하여 상기 신호 펩티드는 USP45 신호 펩티드, PrtP 신호 펩티드, 또는 서열번호 12의 SP4 신호 펩티드, 또는 그람 양성균의 SPase에 인식되는 절단 서열을 가지고 있으며 10 내지 40개의 아미노산 서열로 이루어지며 단백질을 세포 외로 분출시키는 기능을 가진 신호 펩티드일 수 있다. 효모 세포에 대하여 상기 신호 펩티드는 Saccharomyces cerevisiae의 메이팅 인자 알파(MFα)의 신호 펩티드, Aspergillus의 알파 아밀라제의 신호 펩티드, Saccharomyces cerevisiase의 인버타제 또는 킬러단백질의 신호 펩티드 또는 균류의 SPase에 의해 인식되는 절단서열을 가지고 있는 Pre 신호 펩티드와 골지의 Kex2 엔도펩티다제에 의해 인식되는 절단서열을 가지고 있는 Pro 신호 펩티드로 이루어진 신호 펩티드일 수 있다. 상기 신호 펩티드를 코딩하는 유전자는 신호 펩티드가 상기 표적 단백질의 N 말단에 연결되도록 연결된 것일 수 있다. 상기 신호 펩티드는 상기 단백질에 대하여 자연적인 것 또는 외래적인 것(heterologous)일 수 있다. 상기 표적 단백질은 상기 세포에 대하여 외래 단백질(heterologous protein)일 수 있다. 상기 재조합 세포는 상기 표적 단백질을 발현하는 것일 수 있다. 상기 표적 단백질은 신호 펩티드가 잘려진 상태로 EV에 탑재되는 것일 수 있다. 상기 표적 단백질은 EV의 막 또는 그 내부에 탑재되는 것일 수 있다.
상기 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현 가능한 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 전사 조절 서열과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 전사 조절 서열은 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서, 또는 터미네이터일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 번역 조절 서열과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 번역 조절 서열은 리보좀 결합 자리(ribosome binding site), 또는 리보좀 진입 서열(ribosome entry site sequence)일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 세포의 게놈에 통합되어 있거나 독립적으로 존재하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 벡터에 포함된 것일 수 있다. 상기 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 플라스미드, 또는 바이러스성 벡터일 수 있다.
제2 양상은 상기한 재조합 세포 유래의 세포외 소낭 및 담체를 유효 성분으로 포함하는 IL-1 매개된 질환 또는 증상을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 조성물을 제공한다.
제2 양상에 있어서, 상기 세포외 소낭은 상기 세포의 배양액으로부터 분리된 것일 수 있다. 즉, 상기 세포외 소낭은 세포외로 분비되는 것일 수 있다. 상기 세포외 소낭은 20 내지 500 nm, 예를 들면, 20 내지 200 nm, 100 내지 200 nm의 평균 직경을 갖는 것일 수 있다. 상기 세포외 소낭은 상기한 표적 단백질을 포함하는 것일 수 있다. 상기 표적 단백질은 상기 세포외 소낭의 막 또는 그 내부에 위치하는 것일 수 있다.
상기 세포외 소낭은 배양액으로부터 그를 분리할 수 있는 임의의 방법에 의하여 분리된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 세포외 소낭은 원심분리, 초원심분리, 필터에 의한 여과, 한외여과, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 침전, 및 면역 침강, 프리-플로우 전기영동 모세관 전기영동, 또는 이들의 조합에 의하여 분리될 수 있다. 상기 분리 방법은 불순물의 제거를 위한 세척, 투석, 희석 여과, 버퍼 교환 및 농축 등의 과정을 포함할 수 있다. 상기 세포외 소낭은 하기하는 상기 세포외 소낭을 분리하는 방법에 의하여 생산된 것일 수 있다. 상기 세포외 소낭은 상기 세포 배양액을 컷오프 30 kD 이상, 예를 들면, 50kD 이상, 또는 100kD 이상, 또는 300 kD 이상의 초미세필터를 사용하여 한외 여과하는 방법으로 생산된 것일 수 있다. 상기 세포외 소낭은 상기 세포 배양액을 100,000 xg 이상의 초원심 분리에서 침강하는 것일 수 있다. 상기 분리는 하기하는 제6 양상에 따른 세포외 소낭을 생산하는 방법에 의하여 생산된 것일 수 있다.
상기 담체는 생리적으로 허용가능한 것, 예를 들면, 약제학적으로 또는 화장학적으로 허용가능한 것일 수 있다. 상기 담체는 통상적으로 사용되는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충액, 시클로덱스트린, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 상기 담체는 항산화제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여용 제형을 갖는 것일 수 있다. 상기 비경구 투여 제형은 국소 투여 제형일 수 있다. 국소 투여 제형은 피부 또는 점막 투여 제형일 수 있다. 상기 비경구 투여 제형은 용액, 현탁액, 유탁액, 피부 외용제, 스프레이, 또는 퍼프의 제형을 갖는 것일 수 있다.
상기 조성물은 피부 적용, 점막 적용, 또는 비강 투여 등에 의하여 개체에 투여될 수 있다.
투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여 방법, 배설율 및 질병의 중증도 등에 따라 달라질 수 있다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로써 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 유효 성분의 양을 의미한다. 투여량은 몸무게 70 kg인 성인 개체를 기준으로 할 때, 0.01 내지 1000 mg/일, 0.01 내지 500 mg/일이며, 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여될 수 있다.
상기 조성물은 개체에서 IL-1의 증가된 수준 또는 비정상 발현에 의한 증상 또는 질병을 하기 위한 것일 수 있다. IL-1의 증가된 수준 또는 비정상 발현에 의한 질병은 염증 질병일 수 있다. IL-1의 증가된 수준 또는 비정상 발현에 의한 질병은 류마티스 관절염, 통풍, 다발성 경화증, 화농성 한선염(Hidradenitis suppurativa; Acne inversa), 크리오피린-관련 주기적 증상 발생 증후군(Cryopyrin associated periodic syndrome, CAPS), 가족성 지중해열(Familial Mediterranean fever, FMF), 호중구성 피부증(Neutrophilic dermatoses), 건선, 여드름, 또는 감염성 피부염일 수 있다.
상기 조성물은 상기 개체에 국소적으로 표적 단백질을 전달하기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물은 피부, 경구, 또는 점막을 통하여 전달하기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물은 피부의 표피, 진피 및/또는 피하조직에 표적 단백질을 전달하기 위한 것일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 개, 고양이, 말, 또는 돼지일 수 있다.
제3 양상은 상기 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 IL-1 매개된 질환 또는 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 개, 고양이, 말, 또는 돼지일 수 있다. 상기 IL-1 매개된 질환은 염증성 질환일 수 있다. IL-1 매개된 질환은 류마티스 관절염, 통풍, 다발성 경화증, 화농성 한선염(Hidradenitis suppurativa; Acne inversa), 크리오피린-관련 주기적 증상 발생 증후군(Cryopyrin associated periodic syndrome, CAPS), 가족성 지중해열(Familial Mediterranean fever, FMF), 호중구성 피부증(Neutrophilic dermatoses), 건선, 여드름, 또는 감염성 피부염일 수 있다.
제4 양상은 상기한 재조합 세포를 배양하여 배양물을 얻는 단계; 및 상기 배양물로부터 세포외 소낭을 분리하는 단계를 포함하는, 세포외 소낭을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 배양은 상기 재조합 세포의 성장에 유용한 배지 중에서 인큐베이션하는 것일 수 있다. 상기 배양은 유산균 또는 효모에 적당하다고 알려진 조건, 예를 들면, 온도 및 교반 조건에서 수행될 수 있다.
상기 배양물로부터 세포외 소낭을 분리하는 단계는 배양물로부터 세포외 소낭을 분리하는 것이면 어느 것이나 포함된다.
상기 분리하는 단계는, 상기 배양물을 원심분리하고 상등액을 얻는 단계; 상기 상등액을 여과하는 단계; 및 상기 여과물을 초원심분리하여 침전물을 얻는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 분리 단계에서, 상등액을 얻는 단계에서 원심분리는 1,000 내지 20,000 xg에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 상등액을 여과하는 단계에서, 상기 여과는 초미세필터를 사용한 여과일 수 있다. 상기 여과는 상기 상등액을 컷오프 30 kD 이상, 예를 들면, 50kD 이상, 또는 100 kD 이상, 또는 300 kD 이상 이상의 초미세필터를 사용하여 한외 여과하는 것일 수 있다. 상기 여과물을 초원심분리하여 침전물을 얻는 단계에서, 상기 초원심분리는 100,000 xg 이상, 예를 들면, 100,000 xg 내지 200,000 xg에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 방법은 침전물을 현탁하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 IL-1 저해제가 탑재된 세포외 소낭은 IL-1 저해제를 세포외 소낭에 탑재하여 표적 부위에 적용하였을 때 안정적으로 전달할 수 있다.
다른 양상에 따른 상기한 세포외 소낭을 포함하는 조성물에 의하면, IL-1 매개된 질환 또는 증상을 효율적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
다른 양상에 따른 개체의 질병을 치료하는 방법에 의하면, 개체의 IL-1의 증가된 수준 또는 비정상 발현에 의한 질병을 효율적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
다른 양상에 따른 세포외 소낭을 생산하는 방법에 의하면, 세포외 소낭을 효율적으로 생산할 수 있다.
도 1은 Lactobacillus 속 3개 종에서 분리된 EV 함유 용액에 대하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 나타낸다.
도 2는 효모 배양 브로쓰 또는 효모에서 분리된 EV 함유 용액에 대하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 나타낸다.
도 3은 재조합 효모 Pichia pastoris 유래 IL-1Ra 함유 EV를 세포와 접촉시키고 세포에서 IL-1 길항 활성을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 인공피부에 재조합 효모 또는 유산균 유래 EV를 접촉시키고 그 절편에 대하여 찍은 형관 현미경 사진이다.
도 5는 마우스 등에 LPS로 피부염을 유도시킨 후 재조합 효모 Pichia pastoris 유래 IL-1Ra 함유 EV를 피부에 발라서 피부염이 완화되는 결과를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 유산균(lactic acid bacteria: LAB) 세포 유래의 세포외 소낭
표적 단백질을 발현하는 재조합 유산균을 제작하고, 그 유산균으로부터 세포외 소낭을 생산하였다. 구체적인 과정은 다음과 같다. 유산균 세포는 Lactobacillus paracasei LMT1-21(KCTC13422BP), Lactobacillus brevis LMT1-46(KCTC13423BP) 및 Lactobacillus plantarum LMT1-9 (KCTC13421BP)를 사용하였다. 표적 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 사람 IL-1Ra 폴리펩티드를 사용하였다.
1. 유전자 발현 벡터 및 발현 카세트의 제작
표적 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, Codon optimization tool(http://sq.idtdna.com/CodonOpt)을 사용하여 Lactobacillus paracasei에 최적화된 코돈을 갖는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 도출하고, 이 서열을 합성하였다(마크로젠 사, 한국). 합성된 유전자는 Shuttle-vector pMT54-PR4-SP4(서열번호 3)와 인퓨젼할 수 있도록 서열번호 4 및 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드를 프라이머 세트로 한 PCR을 수행하여 인서트 DNA를 증폭하였다. 여기서, PR4 및 SP4는 각각 프로모터 및 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로서, PR4 프로모터는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 갖고, SP4 신호 펩티드는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 상기 shuttle-vector pMT54-PR4-SP4는 서열번호 6 및 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드를 프라이머 세트로 한 PCR을 수행하여 선형화된 형태의 벡터 DNA를 증폭하고 겔 정제 키트(gel purification kit)를 이용하여 정제하였다. 이렇게 준비한 벡터 DNA 1ul 및 인서트 DNA 3ul를 In-Fusion® HD Cloning Kit을 사용하여 인퓨젼 반응(infusion reaction)을 통해 환형 DNA로 제작한 후, 삼브룩 등의 방법(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn, 1989)으로 대장균 Top10 (Invitrogen 사)에 형질전환시켰다. 각 콜로니에서 얻어진 플라스미드의 서열을 분석하여 확인하였다. 상기 환형 DNA 벡터는 표적단백질을 발현시킬 수 있도록, 프로모터와 신호 펩티드 PR4-SP4에 해당하는 서열을 포함하고 있다.
2. 유산균 형질전환
상기 얻어진 사람 IL-1Ra 유전자 함유 벡터를 3종의 유산균 즉, Lactobacillus paracasei LMT1-21(KCTC13422BP), Lactobacillus brevis LMT1-46(KCTC13423BP) 및 Lactobacillus plantarum LMT1-9 (KCTC13421BP)에 각각 형질전환시켰다. 각 균주를 50 mL의 MRS 액체 배지(Difco, USA)에서 OD600이 0.5가 될 때까지 배양한 후 4 ℃, 7,000 rpm에서 10 분간 원심분리하고, 25 mL ice-cold EPS (1 mM K2HPO4 KH2PO4, pH 7.4, 1mM MgCl2 및 0.5 M sucrose 함유)로 2회 세척하였다. 이 세포를 1 mL ice-cold EPS에 현탁하여 전기천공법(electroporation)에 사용될 컴피턴트 세포를 제조하고, -80 ℃ 냉장고(deep freezer)에 보관하였다. 컴피턴트 세포 40 uL와 벡터 1 ug/uL DNA를 큐벳에 옮기고 5 분간 얼음에 방치하였다. 25 uF, 8 kV/cm, 및 400 ohms 조건에서 펄스를 준 후, 즉시 1 mL MRS 액체 배지를 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 가량 배양하였다. 이 세포를 10 ug/ml 클로람페니콜이 포함된 MRS 배지에서 도말한 후 48 시간 37 ℃에서 배양하여 형질전환된 세포를 얻었다.
3. 세포외 소낭(EV) 분리
얻어진 각 형질전환된 상기 유산균 각 균주를 MRS 액체 배지에서 37 ℃에서 16 시간 동안 정치 배양한 후, 이것을 다시 MRS 액체 배지에 2 % 부피를 접종한 후 16 시간 동안 정치 배양하였다. 얻어진 배양물을 5,000 xg로 15 분 동안 원심분리하여 유산균을 제거한 상등액을 얻어낸 후, 이것을 분자량 컷오프(MWCO) 100 kDa 초미세여과 막을 이용하여 한외여과하여 20 배 농축하였다. 이 농축액을 150,000 xg로 2 시간 동안 초원심분리하여 가라앉은 펠렛을 얻어낸 후, 이 펠렛을 PBS로 재현탁하여 EV 용액을 얻었다. NanoSight NS300 (Malvern)을 이용하여 얻어진 EV의 크기와 개수를 측정하였다. EV의 크기가 평균 150~180 nm에서 관찰되며 80 내지 250 nm에서 90 %의 입자가 분포하였다.
4. EV에 표적 단백질이 존재하는지 확인
3절에서 얻어진 EV 용액에 대하여 웨스턴 블롯을 수행하여, 표적 단백질이 EV에 존재하는지 확인하였다. 상기 EV는 pMT54-PR4-SP4에 사람 IL-1Ra 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝한 벡터로 형질전환된 Lactobacillus paracasei LMT1-21(KCTC13422BP), Lactobacillus brevis LMT1-46(KCTC13423BP) 및 Lactobacillus plantarum LMT1-9 (KCTC13421BP) 균주로부터 분리된 것이다. 이때 상기 유전자는 신호 펩티드 즉, SP4 서열 및 HA-tag이 융합된 서열을 사용하였다.
웨스턴 블롯은 다음과 같이 수행하였다. EV 용액 5 uL에 4 x 로딩 버퍼(thermo), 10x 환원제(reducing agent)(Thermo)를 첨가한 후 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)용 겔에 전기영동하였다. 이 겔의 단백질을 니트로셀룰로스 막에 옮긴 후, 이 막을 차단 용액 1% 탈지유 함유 TBST(Tris-buffered saline with tween 20)에서 2 시간 동안 인큐베이션하여 차단하였다. 이후 TBST를 사용하여 5 분 동안 3번 세척한 후, 차단 용액에 막과
HRP 연결된 1차 항체(AbCam AB1190)를 첨가하여 2 시간 인큐베이션하여 항원-항체 결합을 유도하였다. TBST 세척 후, ECL(enhanced electrochemical) 시스템을 사용하여 표적 단백질의 양 및 위치를 확인하였다.
도 1은 Lactobacillus 속 3개 종에서 분리된 EV 함유 용액에 대하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 나타낸다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 신호 펩티드와 융합된 사람 IL-1Ra 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 pMT54-PR4-SP4 벡터에 클로닝하여 얻어진 벡터로 형질전환된 LMT1-21, LMT1-9 및 LMT1-46으로부터 분리된 EV에는 IL-1Ra가 발현되고 있어서, 이들이 EV에 존재하는 것을 알 수 있다.
실시예 2: 효모 세포 유래의 세포외 소낭
표적 단백질을 발현하는 재조합 효모를 제작하고, 그 효모로부터 세포외 소낭을 생산하였다. 구체적인 과정은 다음과 같다. 효모 세포는 Pichia pastoris를 사용하였다. 표적 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 사람 IL-1Ra 폴리펩티드를 사용하였다.
1. 발현 벡터 및 발현 카세트의 제작
사람 IL-1Ra 폴리펩티드에 해당하는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, Pichia pastoris 코돈에 최적화된 서열을 Codon optimization tool (http://sg.idtdna.com/CodonOpt)을 사용하여 도출하였다. 그 결과, 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 도출하고, 이 서열을 합성하였다(마크로젠 사, 한국). 다음으로, GPD 프로모터(서열번호 14)와 메이팅 인자 알파(mating factor alpha, MFα)의 신호 펩티드(서열번호 15)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 포함된 Vector pDP-001(서열번호 9)를 NotI-HF/XhoI-HF 제한효소 처리하여 선형화된 벡터 단편을 얻었다. 두 DNA 즉, IL-1Ra 유전자와 선형화된 벡터 단편을 In-Fusion® HD Cloning Kit을 사용하여 인퓨젼 반응(infusion reaction)을 통해 환형 벡터 pDP-001-IL-1Ra를 제작하였다. 상기 환형 벡터를 삼브룩 등의 방법(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn, 1989)으로 대장균 Top10 (Invitrogen 사)에 형질전환시켰다. 각 콜로니에서 얻어진 플라스미드의 서열을 분석하여 확인하였다. 발현 카세트는 제작한 플라스미드를 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머 세트를 이용한 PCR을 수행하여 증폭하였다. 상기 환형 벡터는 표적단백질을 발현시킬 수 있도록, GPD 프로모터와 MFα신호 펩티드를 포함하고 있다.
2. 효모 형질전환
pDP-001-IL-1Ra 벡터를 Pichia pastoris PPS-9010균주(Atum)에 형질전환시켰다. 구체적으로, Pichia pastoris 균주를 2 mL YPD (효모추출물 10 g, 펩톤 20g, 포도당 20g/리터) 액체 배지에 접종 후 30℃, 240 rpm 조건에서 24 시간 이상 전배양하였다. 배양된 균주는 50mL YPD 액체 배지에 OD600이 0.05로 접종하여, 30 ℃, 240 rpm 조건에서 OD600이 1.0 내지 1.3까지 배양하였다. 25 mL의 배양액을 50 mL 코니칼 튜브(conical tube)에 담아 4000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 얻었다. 상기 튜브에 25 mL의 1x PBS 용액을 첨가한 후, 1 분 보르텍싱(vortexing)하고 4000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상기 튜브에 1 mL 0.1 M LiCl을 첨가한 후 세포를 현탁하여 컴페턴트 세포를 얻었다.
200 uL 컴페턴트 세포를 마이크로튜브(microtube)에 첨가한 후 12,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 상등액 제거 후, 36uL 1 M LiCl, 240 uL 50% PEG (polyethylene glycol), 10 uL Yeastmaker™ Carrier DNA (Takara)와 65 uL pDP-001-IL-1Ra 벡터를 혼합하여 1분간 보르텍싱한 후 30℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 42 ℃에서 25분간 열 충격(heat-shock) 후 5분간 얼음에 넣었다. 8000rpm에서 10초 원심분리한 후, 100 ul 상등액만 제거하여 세포를 현탁하였다. SC 고체배지 (0.67% Yeast nitrogen base without amino acid, 2g/L Complete supplement mixture drop-out: -ura, 2% glucose, 2% agar)에 도말하여 30℃에서 4 내지 5일 후 형질전환된 콜로니를 얻었다.
3. 세포외 소낭(EV) 분리
얻어진 형질전환 균주를 SC (0.67% Yeast nitrogen base without amino acid, 2g/L Complete supplement mixture drop-out: -ura, 2% glucose )액체 배지에서 30℃, 16시간 동안 배양한 후, 이것을 다시 SC 액체 배지에 2% 부피로 접종한 후 16시간 동안 정치 배양하였다. 5000xg로 15분 동안 원심분리하여 효모를 제거한 상등액을 얻어낸 후, 이것을 분자량 컷오프(MWCO) 100 kDa 초미세여과 막을 이용하여 한외여과하여 20 배 농축하였다. 이 농축액을 150,000 x g로 3 시간 동안 초원심분리하여 가라앉은 펠렛을 얻어낸 후, 이 펠렛을 PBS로 재현탁하여 EV 용액을 얻었다. NanoSight NS300 (Malvern)을 이용하여 얻어진 EV의 크기와 개수를 측정하였다. EV의 크기가 평균 140~170 nm 에서 관찰되며 80 내지 250 nm에서 90 %의 입자가 분포하였다.
4. EV에 표적 단백질이 존재하는지 확인
3절에서 얻어진 EV 용액 5ul 및 세포 수확을 마친 브로쓰 30ul에 대하여 웨스턴 블롯을 수행하여, 표적 단백질이 EV에 존재하는지 확인하였다. 상기 EV는 사람 IL-1Ra 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함한 pDP-001-IL-1Ra 벡터로 형질전환된 Pichia pastoris 균주로부터 분리된 것이다. 이때 상기 유전자는 신호 펩티드 즉, MFα신호 펩티드와 융합된 서열을 사용하였다.
웨스턴 블롯은 다음과 같이 수행하였다. EV 용액 5 uL 및 세포 수확을 마친 브로쓰 30ul에 4 x 로딩 버퍼(Thermo), 10x 환원제(reducing agent)(Thermo)를 첨가한 후 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)용 겔에 전기영동하였다. 이 겔의 단백질을 니트로셀룰로스 막에 옮긴 후, 이 막을 차단 용액 1% 탈지유 함유 TBST(Tris-buffered saline with tween 20)에서 2 시간 동안 인큐베이션하여 차단하였다. 이후 TBST를 사용하여 5 분 동안 3번 세척한 후, 차단 용액에 막과 1차 항체(Anti-IL-1Ra 항체, (AbCam)를 첨가하여 2 시간 인큐베이션하여 항원-항체 결합을 유도하였다. TBST 세척 후, 2차 항체(Anti-Rabbit IgG, AbCam)를 첨가하였다. 1 시간 방치한 후, 1X TBS-T를 사용하여 5분간 3번 세척한 후 ECL(enhanced electrochemical) 시스템을 사용하여 표적 단백질의 양 및 위치를 확인하였다. 웨스턴 블롯에서, 대조군으로서 재조합 IL-1Ra(AbCam, Ab50081)를 사용하였다.
도 2는 효모 배양 브로쓰 또는 효모에서 분리된 EV 함유 용액에 대하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 신호 펩티드와 융합된 사람 IL-1Ra 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함한 pDP-001-IL-1Ra 벡터로 형질전환된 Pichia pastoris 균주는 IL-1Ra를 발현하고, 그로부터 분리된 EV에는 IL-1Ra가 발현되고 있어서, 이들이 EV에 존재하는 것을 알 수 있다. 세균과 달리 IL-1Ra는 글리코실화된(glycosylated) 형태와 비-글리코실화된(non-glycosylated) 형태로 둘 다 발현되며, 양은 대략 1:1임을 확인할 수 있었다.
실시예 3: IL-1Ra 함유 EV에 의한 IL-1β에 대한 길항 활성(antagonistic activity) 평가
HEK-BlueTM IL-1β 세포 (Invivogen #hkb-il1b)를 이용하여 in vitro에서 IL-1 길항 활성을 평가하였다. 상기 세포는 NF-κB 및 AP-1 경로의 활성화를 모니터링함으로써 생활성 IL-1β를 검출하도록 사람 배아 신장 HEK 293 세포주로부터 조작된 것이다. 이 세포는 인플라마좀 활성화 연구에서 IL-1β 분비를 모니터링하는데 유용하다. 또한, 이 세포는 항-IL-1β 항체를 탐색하는데 사용될 수 있다. 상기 세포는 NF-κB 및 AP-1 유도성 분비된 배아 알칼리 포스파타제(secreted embryonic alkaline phosphatase, SEAP) 리포터를 발현한다. IL-1이 상기 세포 표면 상의 수용체 IL-1R1에 결합하면, 신호전달 케스케이드가 유도되어 NF-κB 및 AP-1 활성화를 유도하여, SEAP 생산을 유도한다.
구체적으로, HEK-Blue IL-1β 세포는 제조사 프로토콜에 따라 배양 배지에서 2번 이상 계대 배양하여 안정화시켰다. 이 후 상기 세포를 수거하여 카운팅 후 96-웰 배양 플레이트에 2x104 개/well의 세포들을 씨딩하였다. 24시간 뒤, 사람 IL-1β 2 ng/ml, 표준품으로 재조합 사람 IL-1Ra (Rec IL-1Ra)(AbCam, Ab50081을 8개 농도 (300 ng/ml~0.14 ng/ml), Pichia pastoris 유래 EV_IL-1Ra 8개 농도 (300 ng/ml~0.14 ng/ml, Pichia pastoris에서 동일한 방법으로 준비한 EV (EV_naive)(8개 농도 (EV_IL-1Ra와 동량 입자(particle) 기준) 용액을 준비하였다. 이 때 쓰인 Pichia pastoris 유래 EV_IL-1Ra의 경우 그 농도를 글리코실화된 형태와 비-글리코실화된 형태를 합쳐서 계산하였다.
기존의 배지를 제거한 뒤 사람 IL-1β를 50 μl, 후보물질 (Rec IL-1Ra, EV_IL-1Ra, EV_naive)을 50 μl 넣고 5시간 배양(37℃, 5 % CO2)하였다. 이후 원심분리하여 상층액을 50 μl 따낸 뒤 Phospha-Light™ SEAP Reporter Gene Assay System (Invitrogen #T1015)으로 SEAP 발현양을 측정하였다. 그 결과를 표 1 및 도 3에 나타내었다.
시료 IC50(ng/ml)
Rec IL-1Ra(표준) 5.36
EV-IL-1Ra 2.28
EV-naive N/A
도 3은 재조합 효모 Pichia pastoris 유래 IL-1Ra 함유 EV를 세포와 접촉시키고 세포에서 IL-1 길항 활성을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.표 1 및 도 3에 나타낸 바와 같이, IL-1Ra가 포함된 EV의 경우 사람 IL-1β에 의한 HEK-Blue IL-1β cell에서 SEAP 발현을 저해하는 것으로 나타났으며, 표준품 Rec IL-1Ra와 유사한 수준 이상이었다. 이는 글리코실화된 형태와 비-글리코실화된 형태 모두 표준품 이상의 길항 활성을 가지고 있음을 증명하는데, 둘 중 하나의 형태가 길항 활성이 없으면 IC50 값이 표준품보다 커졌을 것이다. 반면 재조합 단백질이 탑재되지 않은 EV_Naive의 경우에는 길항 활성이 관찰되지 않았다.
실시예 4: IL-1Ra 함유 EV에 의한 피부 투과(Ex-vivo)
본 실시예에서는 3차원 배양된 사람 피부 조직에서 EV 투과성을 확인하였다. 인공적으로 3차원 배양된 피부 조직으로는 NeodermTM-ED (태고사이언스사 제품)를 구매하여 사용하였다.
EV의 피부 투과 능력을 확인하기 위해서 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(Carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE)를 EV에 표지시켰다. EV의 단백질 양을 정량하고, EV와 동일한 양의 대조군 단백질 (AbCam, Ab55483)을 CFSE 용액(Invitrogen, 미국)과 1:200으로 혼합한 후 37 ℃에서 반응시켰다. 이후 대조군 단백질 및 EV 단백질에 표지되지 않은 CFSE는 Desalting 칼럼 (PD-10)을 통해 제거하고, CFSE가 표지된 단백질 또는 EV만 인산완충염수(phosphate buffered saline, PBS)를 사용하여 용출시켰다. CFSE는 단백질에 표지되는 물질로, 대조군 단백질 및 EV에 포함된 단백질을 모두 표지할 수 있다. 3D 인공피부의 각질층 위에 희석된 CFSE 표지 단백질 및 EV가 함유된 PBS를 100 μL 첨가한 후 하루 동안 세포 배양기에서 두었다(37℃, 5% CO2). 이 후 4% 파라포름알데히드 용액에서 고정시킨 후 동결절편제작을 거쳤다. 동결절편은 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)로 핵 염색을 실시하고 커버글라스로 봉입하여 형광현미경에서 관찰을 실시하였다. 동시에 별도로 DAPI 염색 반응을 확인하여 인공피부의 구조를 확인하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4는 인공피부에 IL-1Ra 함유 EV를 접촉시키고 그 절편에 대하여 찍은 형관 현미경 사진이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군 즉, EV에 포함되어 있지 않은 상피세포성장인자 단백질의 경우 대부분 각질을 통과하지 못하지만, LAB 및 효모 유래 EV에 들어있는 단백질이 진피까지 도달하는 것을 확인하였다. 즉, 대조군의 경우, 각질층에서만 파란색 염색이 보였으나, LAB 및 효모 유래 EV의 경우, 진피층에서도 파란색 염색이 보였다. 이는 EV가 피부를 투과하여 EV에 포함된 단백질을 진피까지 전달한다는 것을 나타낸다. 도 4에서, LAB 유래 EV는 실시예1에 따라 재조합 Lactobaillus paracasei로부터 유래된 EV를 나타내고, Yeast 유래 EV는 실시예2에 따라 재조합 Pichia pastoris로부터 유래된 EV를 나타낸다.
실시예 5: IL-1Ra 함유 EV를 피부에 처리하였을 경우 염증 감소 효과
본 실시예에서는 생쥐 등에 피부염을 유도한 후, IL-1Ra가 함유된 EV를 피부에 처리하였을 경우 염증이 경감되는 정도를 관찰하였다.
1. 리포폴리사카리드 (Lipopolysaccharide, LPS) 유도 피부염 모델 실험
C57BL 마우스의 등에 피하주사로 대장균 유래 PBS 중 LPS를 0.1mg 주입하여 염증을 유도하고 Pichia pastoris 유래 IL-1Ra가 포함된 PBS 중의 EV를 IL-1Ra량 기준으로 약 1 μg 피부에 처리하였다. LPS를 주입하지 않은 군 및, LPS를 주입하고 PBS를 바른 군, Pichia pastoris 유래 IL-1Ra가 포함되지 않은 EV를 바른 군을 대조군으로 사용하였다. 48시간 후 마우스를 희생시키고 시료가 도포되었던 피부 조직을 채취하였다.
2. 헤마톡실린 및 에오신 염색
조직화학적 염색을 위해 위에서 채취한 피부를 수득하여 10% 포르말린 고정액으로 고정하고 탈수 과정을 거쳐 파라핀으로 포매하였다. 파라핀 블록을 8 μm 두께로 절편화하여 실란 코팅된 슬라이드 (Silane coated slide, 무토사, 일본)에 접착시켰다. 절편은 탈파라핀 과정 후 함수과정을 거쳐 헤마톡실린 및 에오신(Hematoxyline & Eosin) 염색을 실시하였다.
위 실험 결과를 정량화하기 위해 펭 등(Peng, Ge et al. Inflammation　41 (2017): 154-163.)에 기재된 방법을 이용하여 각 투여그룹의 피부 조직을 정량화 하였다. 구체적으로, 진피 조직 중 호산구(eosinophil)의 수를 확인하였다. 도 5는 Pichia pastoris 유래 IL-1Ra가 포함된 EV를 염증 피부에 도포하고 채취한 피부 중 호산구의 수를 나타낸 도면이다. 도 5에서 나타낸 바와 같이, LPS로 염증을 유도하고 PBS를 바른 대조군, 또는 IL-1Ra가 함유되지 않은 EV를 바른 대조군에서는 염증 반응에 의해서 진피 내에 호산구 세포가 유주된 것을 확인하였으나, IL-1Ra가 포함된 EV를 피부에 처리할 경우, 염증에 의해 진피 내로 유주된 호산구 세포의 수가 감소된 것을 확인하였다. 이는 Pichia pastoris 유래 IL-1Ra가 포함된 EV를 염증 피부에 발랐을 때, 그에 따라 EV에 함유된 IL-1Ra에 의해 피부 염증이 감소되고, 그에 따라 염증 부위로 이동하는 호산구가 줄었다는 것을 나타낸다.
Figure PCTKR2020011137-appb-I000001
Figure PCTKR2020011137-appb-I000002
Figure PCTKR2020011137-appb-I000003

Claims (12)

  1. 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 세포로부터 유래한 세포외 소낭(extracellular vesicle)으로서, 상기 표적 단백질은 IL-1 저해제인 것인 세포외 소낭.
  2. 청구항 1에 있어서, 재조합 세포는 재조합 미생물인 것인 세포외 소낭.
  3. 청구항 2에 있어서, 미생물은 유산균 또는 효모인 것인 세포외 소낭.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 속에 속하는 것인 세포외 소낭.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia), 코마가타엘라(Komagataella) 및 한세눌라(Hansenula) 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 속에 속하는 것인 세포외 소낭.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 IL-1 저해제는 IL-1의 수용체 결합 펩티드 단편, IL-1α 또는 IL-1β 또는 IL-1 수용체에 대한 항체, 또는 IL-1에 대한 수용체의 부분 또는 그 전체 또는 그 변이체인 것인 세포외 소낭.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 IL-1에 대한 수용체의 변이체는 유전적으로 변형된 뮤틴(mutein), 또는 멀티머인 것인 세포외 소낭.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 IL-1 저해제는 IL-1Ra 폴리펩티드, IL-1β 전환 효소(ICE) 저해제, 길항적 항-IL-1R1 항체, IL-1R1 및 IL-1R2의 가용성 IL-1 결합 형태 또는 단편, IL-1에 대한 항체, 또는 IL-traps인 것인 세포외 소낭.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 표적 단백질은 신호 펩티드가 연결되어 있는 것인 세포외 소낭.
  10. 유효 성분으로 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 세포외 소낭, 및 담체를 포함하는 IL-1 매개된 질환을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 피부, 경구, 또는 점막을 통하여 전달하기 위한 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, IL-1 매개된 질환은 류마티스 관절염, 통풍, 다발성 경화증, 화농성 한선염(Hidradenitis suppurativa; Acne inversa), 크리오피린-관련 주기적 증상 발생 증후군(Cryopyrin associated periodic syndrome, CAPS), 가족성 지중해열(Familial Mediterranean fever, FMF), 호중구성 피부증(Neutrophilic dermatoses), 건선, 여드름, 또는 감염성 피부염인 것인 조성물.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014168548A2 (en) * 2013-04-12 2014-10-16 El Andaloussi, Samir Therapeutic delivery vesicles
WO2018153581A1 (en) * 2017-02-22 2018-08-30 Evox Therapeutics Ltd Improved loading of evs with therapeutic proteins

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014168548A2 (en) * 2013-04-12 2014-10-16 El Andaloussi, Samir Therapeutic delivery vesicles
WO2018153581A1 (en) * 2017-02-22 2018-08-30 Evox Therapeutics Ltd Improved loading of evs with therapeutic proteins

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHARLES A. DINARELLO, ANNA SIMON, JOS W. M. VAN DER MEER: "Treating inflammation by blocking interleukin-1 in a broad spectrum of diseases", NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY, NATURE PUB. GROUP, vol. 11, no. 8, 1 August 2012 (2012-08-01), pages 633 - 652, XP055051238, ISSN: 14741776, DOI: 10.1038/nrd3800 *
GALIEVA LUISA R., JAMES VICTORIA, MUKHAMEDSHINA YANA O., RIZVANOV ALBERT A.: "Therapeutic Potential of Extracellular Vesicles for the Treatment of Nerve Disorders", FRONTIERS IN NEUROSCIENCE, vol. 13, XP055783139, DOI: 10.3389/fnins.2019.00163 *
YIM NAMBIN, RYU SEUNG-WOOK, CHOI KYUNGSUN, LEE KWANG RYEOL, LEE SEUNGHEE, CHOI HOJUN, KIM JEONGJIN, SHAKER MOHAMMED R., SUN WOONG,: "Exosome engineering for efficient intracellular delivery of soluble proteins using optically reversible protein–protein interaction module", NATURE COMMUNICATIONS, vol. 7, no. 1, 1 November 2016 (2016-11-01), XP055783136, DOI: 10.1038/ncomms12277 *

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