CN114891122A - 一种原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽及其应用 - Google Patents

一种原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程领域，公开了一种奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽：包括奶牛气管抗菌肽、奶牛β‑乳球蛋白肽和EGFP绿色荧光标签融合蛋白，以原代奶牛乳腺上皮细胞作为生物反应器制备抗菌肽，可以显著提高所制备的抗菌肽活性；所述的奶牛气管抗菌肽可极显著降低金黄色葡萄球菌对细胞的损伤，细胞凋亡率下降81.9％，可有效治疗细菌诱导的小鼠乳腺炎；以所述抗菌多肽主要活性成分的保鲜剂，用于食品的保鲜，可以延长低温食品的保质期一倍以上；所述抗菌多肽含有特定的β‑乳球蛋白肽，其可诱导对乳蛋白的口服免疫耐受，能够减轻尤其是消除牛乳蛋白过敏症的急性症状。

Description

一种原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽 及其应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，更具体地说，本发明涉及一种原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽及其创新应用。
背景技术
奶牛气管抗菌肽(TAP)是牛气管黏膜上皮细胞分泌的具有广谱抗菌活性的多肽。病原微生物和多种促炎因子均能特异性诱导TAP基因在奶牛乳腺组织表达上调，最大上调数十倍，增强了乳腺组织的防御能力。牛气管黏膜抗菌肽是由美国科学家Diamond等从牛气管黏膜上皮细胞中分离得到的一种阳离子型的抗菌活性小肽，体外实验表明TAP具有广谱抗菌活性，对细菌与真菌均具有抑制作用。湿重为1g的牛气管黏膜上皮中可以提取到2μg的牛气管抗菌肽。在抗菌肽家族中，TAP属于β-干扰素家族，是一组具有独特氨基酸序列的抗菌肽，有3个分子内二硫键，其中6个Cys残基在肽链上所处位置与干扰素家族不同，且N端有一个不同于干扰素的5-羟脯氨基。研究表明，牛气管抗菌肽具有抗G+菌和G-菌及真菌的活性，对G+菌的杀伤作用大于对G-菌的杀伤作用，对于哺乳动物没有不良影响。
奶牛乳腺炎是奶牛常见病和多发病，随着奶牛乳腺炎发病率上升，大大降低奶牛产奶量，并严重影响原料奶质量。因此，奶牛乳房炎的治疗越来越受重视。目前主要治疗手段是抗生素、中药制剂的药物治疗，而抗生素的使用，耐药菌株产生及乳中药物残留严重危害到消费者的健康，由于牛气管抗菌肽是生物体内天然的抗菌物质，对动物机体无毒无害，因此有望成为新型抗生素的替代品。
目前气管抗菌肽主要应用在抗菌药物和抗肿瘤药物制备领域，在食品工程及新型药物领域应用尚有待进一步开发。气管抗菌肽是高等动物编码的蛋白，在大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌里面表达有可能会有活性低、无法正确折叠以及形成不溶性包涵体等问题，因此现有抗菌肽的制备多采用真核表达系统——毕赤氏酵母。但是使用毕赤氏酵母制备抗菌肽前需要对目的蛋白进行密码子序列优化，在这个过程中很可能影响原本序列较短的抗菌肽，与此同时抗菌肽在毕赤氏酵母中表达后，最终产物与正常抗菌肽比较，会带上4个多余的氨基酸Glu、Ala、Glu和Ala，并与抗菌肽本身N-端尾巴形成离子键，妨碍其功能的发挥，并且使蛋白容易形成淀粉状沉淀，从而大大降低抗菌肽的活性。除此之外，奶牛乳腺生物反应器也被应用在抗菌肽的制备当中，然而相比于真核表达系统——毕赤氏酵母其制备成本较高。综上所述，进一步开发气管抗菌肽的应用领域，以及构建更高效的抗菌肽制备系统，具有重要的应用价值和广阔的市场前景。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明的另一个目的是提供一种奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽，其可同时满足兽药制备、医药开发、食品保鲜等多个领域的应用需求，所述抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供上述奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽制备方法，在序列为SEQ ID NO:3的奶牛气管抗菌肽基因的5’端插入牛乳蛋白启动子元件，在牛乳蛋白启动子元件3’端插入β-乳球蛋白肽基因，插入β-乳球蛋白肽基因后的牛乳蛋白表达启动子元件序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步的，采用携带增强型绿色荧光蛋白标签的哺乳细胞质粒为载体，将奶牛气管抗菌肽基因转染至原代乳腺上皮细胞中。
进一步的，所述奶牛乳腺上皮细胞生物反应器的制备方法为：采集泌乳奶牛新鲜乳腺组织，冲洗后剥离脂肪组织和结缔组织，分离腺泡组织并传代培养，加入胰酶消化液得到单细胞悬液，分离原代奶牛乳腺上皮细胞，作为原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器。
进一步的，分离腺泡组织将其接种至培养皿中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中20-30分钟左右，使组织块微干涸，然后向培养皿中轻轻加入约1mL培养液，置CO2培养箱中培养1-2小时后再补1mL培养基，在培养箱内静置培养两天，第三天更换培养液，以后每两到三天更换一次培养液。
进一步的，加入胰酶消化液后，至于培养箱内37℃消化3-5分钟，倒置显微镜下观察，待大部分细胞回缩变圆后立即将消化液吸出，继续在培养箱内孵育3-5min，让残留的消化液将细胞消化并脱离瓶底或皿底，立即加2mL含10％FBS的培养液终止消化，用移液器吸取瓶内培养液，反复吹打瓶底细胞，使其成为单细胞悬液。本发明还有一个目的是提供一种原代乳腺上皮细胞作为生物反应器在抗菌肽制备中的应用，具体的方法为：采用携带增强型绿色荧光蛋白标签的哺乳细胞质粒为载体，将抗菌肽基因转染至原代乳腺上皮细胞中，转染前在抗菌肽基因5’端插入牛乳蛋白表达启动元件，插入β-乳球蛋白肽基因后的牛乳蛋白表达启动元件序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还有一个目的是提供一种抗菌多的应用，所述抗菌多肽应用于养殖业，具有多方面优益效果，一方面应用在兽药领域可作为防治奶牛乳腺炎的重要材料，另一方面作为饲料防腐剂在奶牛饲料中添加。用于食品保鲜，不仅具有高效的抑菌性能而且对可诱导人体对乳蛋白的口服免疫耐受，能够减轻尤其是消除牛乳蛋白过敏症的急性症状。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种抗菌多肽，其中，所述抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
一种原代乳腺上皮细胞作为生物反应器在抗菌肽制备中的应用。
优选的是，采用携带增强型绿色荧光蛋白标签的哺乳细胞质粒为载体，将抗菌肽基因转染至原代乳腺上皮细胞中，转染前在抗菌肽基因5’端插入牛乳蛋白表达启动元件，插入β-乳球蛋白肽基因后的牛乳蛋白表达启动元件序列如SEQ ID NO:2所示，所述的抗菌肽基因表达量可上调23202倍，抗菌肽可顺利分泌至原代乳腺上皮细胞外，且所制备的抗菌肽活性相比于传统毕赤氏酵母作为生物反应器可以显著提高。
本发明还提供上述奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽在制备奶牛乳腺炎药物中的应用。本发明还提供一种抗菌多肽在奶牛乳腺炎防控中的应用。
优选的是，给药方式即可通过静脉注射制备抗菌多肽的重组质粒组合物，也可直接乳房基部穿刺注射抗菌多肽。其中，所重组质粒复合物至少包含制备抗菌多肽的重组质粒、F-PEI(1mg/mL)(二者质量比为1:1)，使用1×PBS缓冲液将重组质粒复合物稀释至500μg/mL。
本发明还提供上述抗菌多肽在动物饲料制备中的应用。
优选的是，添加在奶牛饲料当中，使用的质量百分比浓度为1％-3％，可起到防腐的作用。
本发明还提供上述抗菌多肽在食品保鲜中的应用。
优选的是，采用喷雾法或浸渍法用于牛肉制品的保鲜，使用的质量百分比浓度为1％-3％。
优选的是，在巴氏灭菌后向奶制品中添加所述抗菌多肽，添加量为所述奶制品的质量百分含量的1％-3％。
本发明还提供上述奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽在制备减轻牛乳蛋白过敏症药物中的应用。
一种抗菌多肽在制备缓解β-乳球蛋白诱导的过敏反应的生物活性药物中的应用。具有生物活性药物保鲜功能的同时，可诱导人体对乳蛋白的口服免疫耐受，能够减轻尤其是消除牛乳蛋白过敏症的急性症状。
有益效果
本发明以原代奶牛乳腺上皮细胞为新型生物反应器得到一种抗菌多肽，融合有β-乳球蛋白肽、奶牛气管抗菌肽和EGFP绿色荧光标签蛋白，其中β-乳球蛋白肽可促进奶牛抗菌肽分泌到胞外，并提高目的蛋白的表达量，同时可诱导人体对乳蛋白的口服免疫耐受，能够减轻尤其是消除牛乳蛋白过敏症的急性症状，奶牛气管抗菌肽具有广谱的杀菌作用，EGFP绿色荧光标签可解决原代乳腺上皮细胞生物反应器系统中目的蛋白不易检测的问题；本发明所述的原代奶牛乳腺上皮细胞新型生物反应器，相比于真核表达系统——毕赤氏酵母所制备的抗菌肽活性显著提高，为抗菌肽制备提供了新途径、新方法；本发明所述的抗菌多肽同时具有多种功能，可满足兽药制备、医药开发、饲料加工、食品保鲜等多领域的应用要求，将本发明所述的抗菌多肽添加到饲料中，可以有效地抑制饲料中有害菌的繁殖，能防止饲料在运输储存过程中发生变质；所述的抗菌多肽可以有效延长奶制品的保存时间，并且在饮用后可以对人体产生保护作用；应用所述的抗菌多肽制备获得的保鲜剂，用于牛肉制品的保鲜，可以延长低温肉制品的保质期一倍以上；本发明所述的抗菌多肽不仅对致病菌具有较强的杀灭和抑制作用，同时具有广谱抗菌的优点，可极显著降低金黄色葡萄球菌对细胞的损伤，细胞凋亡率下降94.8％，并可有效治疗金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等常见致病菌诱导的小鼠乳腺炎，在兽药制备尤其是针对奶牛乳腺炎治疗药物的制备领域具有非常好的应用前景。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1.实施例2中，原代乳腺上皮细胞中表达、分泌抗菌多肽效果(A：抗菌多肽重组质粒在原代乳腺上皮细胞中分泌表达情况；B：奶牛气管抗菌肽基因在原代乳腺上皮细胞中相对表达量)；
图2.实施例2中，为本发明所述的纯化的抗菌多肽的SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色结果示意图；
图3.实施例3中，本发明所述原代乳腺上皮细胞生物反应器和毕氏酵母所制备抗菌多肽生物活性对比图；
图4.实施例4中，S.aureus攻毒和抗菌多肽处理后各组原代乳腺上皮细胞凋亡情况(A：流式细胞术检测结果图；B.CCK-8实验结果示意图)；
图5.实施例4中，尾静脉注射抗菌多肽重组质粒复合物给药方式小鼠各组织奶牛气管抗菌肽表达情况(A:WB结果示意图；B：荧光定量PCR结果示意图)；
图6.实施例4中，抗菌多肽治疗效果初步验证的小鼠病理切片图(A:小鼠乳腺解剖图；B:小鼠乳腺病理切片图)；
图7.实施例4中，抗菌多肽治疗小鼠乳腺炎肛温变化图(A：松鼠葡萄球菌组；B：芽孢杆菌组；C：大肠杆菌组；D：绿脓杆菌组)；
图8.实施例4中，抗菌多肽治疗小鼠乳腺炎乳腺解剖图(A:松鼠葡萄球菌组乳腺解剖图；B:芽孢杆菌组乳腺解剖图；C:大肠杆菌组乳腺解剖图；D:绿脓杆菌组乳腺解剖图)；
图9.实施例4中，抗菌多肽治疗小鼠乳腺炎病理切片图(A:松鼠葡萄球菌组病理切片图；B:芽孢杆菌组病理切片图；C:大肠杆菌组病理切片图；D:绿脓杆菌组病理切片图)；
图10.实施例4中，抗菌多肽治疗小鼠乳腺炎IL-1β炎性因子荧光定量表达情况(A:松鼠葡萄球菌组结果示意图；B:芽孢杆菌组结果示意图；C:大肠杆菌组结果示意图；D:绿脓杆菌组结果示意图)；
图11.实施例4中，抗菌多肽治疗小鼠乳腺炎IL-6炎性因子荧光定量表达情况(A:松鼠葡萄球菌组结果示意图；B:芽孢杆菌组结果示意图；C:大肠杆菌组结果示意图；D:绿脓杆菌组结果示意图)；
图12.实施例4中，抗菌多肽治疗小鼠乳腺炎TNF-α炎性因子荧光定量表达情况(A:松鼠葡萄球菌组结果示意图；B:芽孢杆菌组结果示意图；C:大肠杆菌组结果示意图；D:绿脓杆菌组结果示意图)；
图13.实施例4中，抗菌多肽治疗小鼠乳腺炎IL-1β炎性因子ELASA表达情况(A:松鼠葡萄球菌组结果示意图；B:芽孢杆菌组结果示意图；C:大肠杆菌组结果示意图；D:绿脓杆菌组结果示意图)；
图14.实施例4中，抗菌多肽治疗小鼠乳腺炎IL-6炎性因子ELASA表达情况(A:松鼠葡萄球菌组结果示意图；B:芽孢杆菌组结果示意图；C:大肠杆菌组结果示意图；D:绿脓杆菌组结果示意图)；
图15.实施例4中，抗菌多肽治疗小鼠乳腺炎TNF-α炎性因子ELASA表达情况(A:松鼠葡萄球菌组结果示意图；B:芽孢杆菌组结果示意图；C:大肠杆菌组结果示意图；D:绿脓杆菌组结果示意图)；
图16.实施例4中，抗菌多肽致敏小鼠耳厚度变化图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明所涉及到的术语除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
如图1-3所示，本发明提供一种抗菌多肽，其中，所述抗菌多肽的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
一种原代乳腺上皮细胞作为生物反应器在抗菌肽制备中的应用，抗菌肽基因5’端插入牛乳蛋白表达启动元件，插入β-乳球蛋白肽基因后的牛乳蛋白表达启动元件序列如SEQ ID NO:2所示。
在上述方案中，所述的抗菌多肽融合有奶牛气管抗菌肽、β-乳球蛋白肽和EGFP绿色荧光标签蛋白，其中奶牛气管抗菌肽具有广谱抗菌作用，β-乳球蛋白肽可促进奶牛抗菌肽分泌到胞外，并提高目的蛋白的表达量，同时可诱导人体对乳蛋白的口服免疫耐受，能够减轻尤其是消除牛乳蛋白过敏症的急性症状，EGFP绿色荧光标签可解决原代乳腺上皮细胞生物反应器系统中目的蛋白不易检测的问题。
下面通过具体实施例对本发明所述的原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的抗菌多肽制备过程进行具体说明。
实施例1
筛选抗菌多肽制备生物反应器，建立原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器模型。
现有抗菌肽的制备多采用真核表达系统——毕赤氏酵母。但是抗菌肽在毕赤氏酵母中表达后，最终产物与正常抗菌肽比较，会带上4个多余的氨基酸Glu、Ala、Glu和Ala，并与抗菌肽本身N-端尾巴形成离子键，妨碍其功能的发挥，并且使蛋白容易形成淀粉状沉淀，从而大大降低抗菌肽的活性。奶牛乳腺上皮细胞能够合成和分泌乳汁，其来源丰富、采集简便，最重要的是容易在体外培养、扩增和导入外源目的基因，因而可作为乳腺生物反应器。然而一直以来体外培养的奶牛乳腺上皮细胞主要被用于研究乳腺生长调控、生物学功能以及泌乳调控机制等科学研究领域，目前被广泛应用的大多是永生性奶牛乳腺上皮细胞系，这些细胞大多能够稳定地进行体外培养并且进行相关的实验操作。但是，建立细胞系过程中会对细胞造成损伤导致丧失表达一些特殊泌乳蛋白的功能。关于原代奶牛乳腺上皮细胞的研究和详细制备方法的介绍相对较少，为了解决这个问题，我们优化了筛选了现有奶牛乳腺上皮细胞的培养方法、奶牛乳腺上皮细胞的纯化方法的最优组合、最优参数，建立原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器模型的制备方法。
无菌采集健康中国荷斯坦泌乳奶牛新鲜乳腺组织，并立即带回实验室，用于分离原代奶牛乳腺上皮细胞。用3倍双抗的D-Hank’s液反复冲洗乳腺组织，直到组织发白、冲洗液清亮为止。在超净台分离修剪，剥离脂肪组织和结缔组织，将呈白色颗粒状的腺泡组织剪成约1mm3大小。然后将其块接种至60mm的培养皿中(接种密度为两个组织块之间间隔0.5cm左右)，室温放置10分钟，轻轻翻转培养瓶使瓶底向上，置37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中20-30分钟左右，使组织块微干涸，然后向培养皿中轻轻加入约1mL培养液，置CO2培养箱中培养1-2小时后再补1mL培养基，在培养箱内静置培养两天，第三天更换培养液，以后每两到三天更换一次培养液。
当细胞生长至90％-95％融合度时，可进行传代培养。将瓶中的培养基吸出，加入2mL D-Hank’s液清洗一遍，然后加入1mL胰酶消化液，至于培养箱内37℃消化3-5分钟，倒置显微镜下观察，待大部分细胞回缩变圆(此时细胞尚未脱壁)后立即将消化液吸出，继续在培养箱内孵育3-5min，让残留的消化液将细胞消化并脱离瓶底或皿底，立即加2mL含10％FBS的培养液终止消化，用移液器吸取瓶内培养液，反复吹打瓶底细胞，使其成为单细胞悬液，然后重新接种至两个培养瓶或皿内，置培养箱内培养。
所述培养基及D-Hank’s液配方：
1、培养基配方：D-MEM/F-12+10％FBS+牛胰岛素(5μg/L)+氢化可的松(5μg/L，无水乙醇溶解)+表皮生长因子(1μg/L)+1％双抗(双抗：1万单位的青霉素、链霉素溶液)
2、D-Hanks液配方：称取KCl 0.4g，KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，Na2HPO4·12H2O 0.132g，D-葡萄糖1.0g，加水至1L。
培养奶牛乳腺上皮细胞过程中，需要去除成纤维细胞的污染。根据二者贴壁速度的不同逐渐将成纤维细胞从乳腺上皮细胞中去除。成纤维细胞贴壁速度快，消化传代后30-40分钟即可贴壁，所以传代培养40分钟后将含细胞的培养液更换一个培养瓶，留在老瓶内的基本都是成纤维细胞，如此经过4代即可得到纯化的原代乳腺上皮细胞。原代乳腺上皮细胞作为抗菌肽制备生物反应器继续传代至第10代内均可使用，这可使其在最大程度上保留乳腺上皮细胞的各项功能。
实施例2
构建抗菌多肽真核表达载体，并转染至上述原代乳腺上皮细胞中后分离纯化所述抗菌多肽。
奶牛气管抗菌肽基因在乳腺上皮细胞中表达量较低，以原代乳腺上皮细胞为生物反应器制备奶牛气管抗菌肽所得到的目的蛋白可能非常少，因此本发明对奶牛气管抗菌肽基因进行优化，在其5’端插入乳腺上皮细胞中表达比较多的牛乳蛋白启动子元件，以提高目的基因的表达。以原代乳腺上皮细胞为生物反应器制备抗菌多肽还需要克服一个难题：传统的真核表达系统——毕赤氏酵母虽然制备的抗菌肽活性较低，但是可以通过在目的蛋白的N-端加上α-factor等信号肽，将蛋白分泌到胞外，而原代乳腺上皮细胞能否将目的蛋白分泌至胞外尚未可知。因此本发明对奶牛抗菌肽基因进行进一步优化，在牛乳蛋白启动子元件3’端插入β-乳球蛋白肽基因序列，优化重组的奶牛气管抗菌肽DNA序列通过全序列基因合成的方式链接在一起。采用携带增强型绿色荧光蛋白标签的哺乳细胞质粒为载体，将优化后的重组奶牛气管抗菌肽基因通过脂质体转染法转染至原代乳腺上皮细胞中，插入β-乳球蛋白肽基因后的牛乳蛋白表达启动元件序列如SEQ ID NO:2所示。转染48h后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况并拍照，并通过荧光定量PCR法检测目的基因的表达量。以未转染的原代乳腺上皮细胞为空白对照。
结果如图1所示，培养48小时后，转染组奶牛气管抗菌肽基因表达量上调了24202.00±3978.73倍，极显著高于未转染的原代乳腺上皮细胞(P<0.01)。在倒置荧光显微镜下观察，未转染组未发现荧光，转染组原代乳腺上皮细胞内部及周围观察到大量明显的绿色荧光，说明原代乳腺上皮细胞表达的目的蛋白是可以分泌到胞外的，所以可以直接离心或过滤去除细胞，取上清，超滤浓缩至1/5体积后，用pH 7.4的PBS磷酸盐缓冲液进行一次超滤溶剂置换和脱盐，后直接上柱纯化。采用离子交换层析介质进行第一步离子交换层析纯化。第二步用弱阳离子交换树脂去除绝大部分的其他杂质，最后得到纯度达到99％以上的多功能奶牛抗菌肽。纯化后的蛋白跑SDS-PAGE胶，用考马斯亮蓝染色的结果如图2所示(泳道1：蛋白质分子量标准；泳道2-5：抗菌多肽)。
实施例3
原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成抗菌多肽的制备效果鉴定。
采用标准方法对上述分离纯化的抗菌多肽进行活性测定，并采用传统真核表达系统——毕赤氏酵母制备的本发明所述抗菌多肽作为实验对照。将800ul的Micrococcus微球菌细胞悬浮液加样到一个比色皿中作为空白，另比色皿一个用于对照，每个样品都如此。将比色杯温度平衡至25℃。使用适当温控的分光光度计监测在波长450nm的光吸收A450直到恒定。将30ul反应缓冲液加入空白试管，30ul抗菌多肽溶液至对照样品池中，加入30ul试样至剩余试管。立即混合，并记录A450光吸收的5分钟的减少量。结果如图3所示，应用本发明所述的原代乳腺上皮细胞作为生物反应器，制备的抗菌多肽活性显著高于实验对照组。
实施例4
抗菌多肽对动物炎症类疾病的治疗效果验证。
1、细胞抗菌实验
将原代培养的奶牛乳腺上皮细胞接种于6孔细胞培养板中，放入CO2恒温培养箱中培养，待细胞生长至80％汇合时，进行实验分组，将细胞分为空白组、感染组和抗菌组。感染组的细胞中接种金黄色葡萄球菌，感染倍数(MOI)为100:1孵育4小时。抗菌组中直接添加分离纯化的抗菌多肽后接种金黄色葡萄球菌。空白组不做任何处理。所有组细胞从6孔板中收集，并在70％乙醇(-20℃)中固定过夜。将细胞离心，PBS洗涤2-3次。加入500μl PI染色液(50μg/ml碘化丙啶，100μg/ml RNase A,0.2％Triton X-100)，4℃孵育30min。最后采用CCK-8法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡。
流式细胞仪分析结果表明(如图4.A所示)，抗菌组细胞存活率达到91.6％，显著高于感染组84.1％，与空白组99.8％相比无显著差异(P>0.05)。抗菌组细胞死亡率分别为0.83％，与感染组死亡率5.52％对比均极显著下降(P<0.01)。CCK-8实验表明过表达奶牛气管抗菌肽显著缓解了金黄色葡萄球菌感染导致的细胞增殖下降(如图4.B所示)。
2、动物治疗实验
(1)小鼠活体各器官表达水平探究及治疗效果初步验证实验
将18只泌乳第7天的ICR小鼠随机分为6组。3只小鼠接种PBS，作为PBS对照组；将空载体pEGFP-N1转染3只小鼠，作为空载体对照组；3只小鼠先用金黄色葡萄球菌攻毒，24h后转染质粒空载体，作为空载体感染组。3只感染金黄色葡萄球菌的小鼠作为感染组。3只小鼠金黄色葡萄球菌攻毒24小时后，乳腺基部穿刺注射分离纯化的抗菌多肽作为蛋白治疗组；3只小鼠先用金黄色葡萄球菌攻毒，24h后转染搭载奶牛气管抗菌肽基因的重组质粒复合物作为质粒治疗组。其中，所述重组质粒复合物至少包含制备抗菌多肽的重组质粒、F-PEI(1mg/mL)(二者质量比为1:1)，使用1×PBS缓冲液将重组质粒复合物稀释至500μg/mL。金黄色葡萄球菌通过乳腺内输注注射50μl细菌悬液(1×106CFU/ml)的方式进行攻毒。所有小鼠治疗后均行颈椎脱位安乐死，无菌取乳腺、心、肝、脾、肺、肾标本进行荧光定量PCR和western blot检测。取乳腺组织标本制作石蜡切片，进行病理检查。
实验结果如图5-6所示，将制备抗菌多肽的重组质粒复合物通过静脉注射的方式注入动物体内，重组质粒可在动物乳腺组织中特异性表达所述抗菌多肽，且注射质粒或直接注射抗菌多肽对小鼠乳腺炎均有一定的治疗效果。
(2)小鼠炎症模型治疗实验
本实验采取四种常见的奶牛乳房炎致病菌(革兰氏阳性、阴性菌各两种)：松鼠葡萄球菌、芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌，将50只泌乳第7天的ICR小鼠随机分为10组，进一步验证奶牛气管抗菌肽在活体动物中的广谱抗菌效果。所有小鼠治疗后测肛温，取血测血常规，再进行脱颈处死取乳腺，部分乳腺组织进行病理组织切片，部分乳腺组织进行IL1β、IL6、TNF-α三种炎性因子的荧光定量PCR检测及ELASA检测。
对照组：5只小鼠接种PBS，作为PBS对照组；5只小鼠转染F-PEI转染试剂，作为转染试剂对照组。
松鼠葡萄球菌组：5只小鼠感染松鼠葡萄球菌，作为松鼠葡萄球菌感染组；5只小鼠感染松鼠葡萄球菌后转染搭载抗菌多肽的重组质粒复合物，作为松鼠葡萄球菌治疗组。实验结果如表1、图7A、图8A、图9A、图10A、图11A、图12A、图13A、图14A、图15A所示，与感染组相比，治疗组肛温呈显著降低趋势，且治疗组淋巴细胞上升、中性粒细胞下降，解剖图及切片所示小鼠炎症情况有所好转，IL1β、IL6、TNF-α炎性因子在蛋白和RNA水平分别都有降低趋势。
芽孢杆菌组：5只小鼠感染芽孢杆菌，作为芽孢杆菌感染组；5只小鼠感染芽孢杆菌后转染搭载抗菌多肽的重组质粒复合物，作为芽孢杆菌治疗组。实验结果如图表1、图7B、图8B、图9B、图10B、图11B、图12B、图13B、图14B、图15B所示，与感染组相比，治疗组肛温呈降低趋势，且治疗组淋巴细胞上升、中性粒细胞下降，解剖图及切片所示小鼠炎症情况有所好转，IL1β、IL6、TNF-α炎性因子在蛋白和RNA水平分别都有降低趋势。
大肠杆菌组：5只小鼠感染大肠杆菌，作为大肠杆菌感染组；5只小鼠感染大肠杆菌后转染搭载抗菌多肽的重组质粒复合物，作为大肠杆菌治疗组。实验结果如表1、图7C、图8C、图9、图10C、图11C、图12C、图13C、图14C、图15C所示，与感染组相比，治疗组肛温呈降低趋势，且治疗组淋巴细胞上升、中性粒细胞下降，解剖图及切片所示小鼠炎症情况有所好转，IL1β、IL6、TNF-α炎性因子在蛋白和RNA水平分别都有降低趋势。
绿脓杆菌组：5只小鼠感染绿脓杆菌，作为绿脓杆菌感染组；5只小鼠感染绿脓杆菌后转染搭载抗菌多肽的重组质粒复合物，作为绿脓杆菌治疗组。实验结果如图表1、图7D、图8D、图9、图10D、图11D、图12D、图13D、图14D、图15D所示，与感染组相比，治疗组淋巴细胞上升、中性粒细胞下降，解剖图及切片所示小鼠炎症情况有所好转，IL1β、IL6、TNF-α炎性因子在蛋白和RNA水平分别都有降低趋势。
综上所述，抗菌多肽的重组质粒复合物具有广谱抗菌效果，在动物活体内有治疗乳房炎的作用。
表1小鼠血常规检测结果
Figure BDA0003683972850000121
同列比较，字母相同各组间差异不显著，大小写字母不同各组间差异显著(P≤0.05)，大写字母不同各组间差异极显著(P≤0.01)。
(3)小鼠牛乳蛋白过敏症治疗实验
实验之前不久将抗菌多肽悬浮于PBS中，悬液终浓度为8mg/ml。本实验使用三周龄无病原体的雌性ICR小鼠。用无牛乳蛋白的标准小鼠饲料喂食小鼠。将其安置于扬州大学的动物房中。
在致敏前的一周内，使用0.5ml抗菌多肽悬液或PBS用钝针对小鼠(每组n＝6)进行口服治疗。在这周内(7天至0天)，小鼠接受标准饮食。于0、7、14、21和28天，用0.5ml的PBS中的20mg抗菌多肽和10μg CT使小鼠口服致敏。非致敏的小鼠用0.5ml的PBS中的10μg CT处理。最后一次致敏之后5天，小鼠在耳廓接受20μl PBS中的10μg乳清蛋白的皮内攻击。攻击前和攻击后1h时，使用电子游标卡尺测量耳厚度。耳厚度的区别(耳肿胀)是急性过敏反应的指征，并被表示为Δμm。结果如图16显示，在这个致敏处理方案中，抗菌多肽的治疗是有效的。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Lys Cys Leu Leu Leu Ala Leu Ala Leu Thr Cys Gly Ala Gln Ala
1 5 10 15
Leu Ile Val Thr Gln Thr Met Lys Gly Leu Asp Ile Gln Lys Val Ala
20 25 30
Gly Met Arg Leu His His Leu Leu Leu Ala Leu Leu Phe Leu Val Leu
35 40 45
Ser Ala Ser Ser Gly Phe Thr Gln Gly Val Gly Asn Pro Val Ser Cys
50 55 60
Val Arg Asn Lys Gly Ile Cys Val Pro Ile Arg Cys Pro Gly Asn Met
65 70 75 80
Lys Gln Ile Gly Thr Cys Val Gly Arg Ala Val Lys Cys Cys Arg Lys
85 90 95
Lys Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile
100 105 110
Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser
115 120 125
Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe
130 135 140
Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr
145 150 155 160
Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met
165 170 175
Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Gln Glu
180 185 190
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
195 200 205
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
210 215 220
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
225 230 235 240
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
245 250 255
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
260 265 270
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
275 280 285
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
290 295 300
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
305 310 315 320
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
325 330 335
<210> 2
<211> 1560
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgcccttca accccatcac agcttgcggt tcatcgcaaa acacggaacc tgggatttat 60
cgtaaaaccc aggttcttcg tgaaacactg agcttcgagg cttgttgcaa gaattaaagg 120
tgctaataca gatcagggca aggaccgaag ctggccaagc ctcctctttc catcacagga 180
aagggaggtc tgggggcggc cgggggtctg ctcccgtggg tgggctcttt ctggtacagt 240
caccaacagt ctctccggga aggaaaccag aggccagaga gcaagccaga gctagtctag 300
gagatccctg agcctccacc caagatgccg accaggccag cgggccccct ggaaagaccc 360
tacagtctag ggggggaaca ggagccgacc cgccaggccc ccgctatcag gagacacccc 420
aaccttgctc ctgttcccct accccagtac gcccacccga cccctgagat gagtggttta 480
cttgcttaga atgtcaattg aaggcttttg tacccccttt gccagtggca cagggcaccc 540
cctgctcggg ccccctccat actcagcgac acacccagca ccagcattcc caccactcct 600
gaggtctgaa ggcagctcgc tgtggtctga gcggtgcgga gggaagtgcc ctgggagatt 660
taaaatgtga gaggtgggag gtgggaggtt gggtcctgta ggccttccca tcccacgtgc 720
ctgcacggag ccctagtgct actcagtcat gcccccgcag caggggtcag gtcactttcc 780
catcctgggg gttattatga ctgttgtcat tgttgttgcc atttttgcta ccctaactgg 840
gcagcgggtg cttgcagagc cctcgatact gaccaggttc ccccctcgga gctcgacctg 900
aaccccatgt caccctcgcc ccagcctgca gagggtgggg tgactgcaga gatcccttta 960
cccaaggcca cagtcacatg gtttggagga gatggtgccc aaggcagaag ccaccctcca 1020
ggacacacct gcccccagtg ctggctctga cctgtccttg tctaagaggc tgaccccaga 1080
agtgttcctg gcgctggcag ccagcctgga cccagagcct ggacaccccc tgcgccccca 1140
cttctggggc gtaccaggaa ccgtccaggc ccagaggggg ccttcctgct tggcctcgaa 1200
tggaagaagg cctcctattg tcctcgtaga ggaagcaacc ccagggccca aggataggcc 1260
aggggggatt cggggaaccg cgtggctggg ggcccggccc gggctggctg gctggccctc 1320
ctcctgtata aggccccgag cccactgtct cagccctcca ctccctgcag agctcagaag 1380
cgtgacccca gctgcagcca tgaagtgcct cctgcttgcc ctggccctca cttgtggcgc 1440
ccaggccctc attgtcaccc agaccatgaa gggcctggat atccagaagg ttcgagggtg 1500
cccgggtggg tggtgagttg cagggcaggc aggggagctg ggcctcagag accaagggag 1560
<210> 3
<211> 192
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaggctcc atcacctgct cctcgcgctc ctcttcctgg tcctgtctgc ttcctcagga 60
tttactcaag gagtaggaaa tcctgtaagc tgtgttagga ataaaggcat ctgtgtgccg 120
atcaggtgtc ctggaaacat gaaacagatt ggcacctgtg tcgggcgggc agtaaaatgc 180
tgtagaaaga ag 192

Claims (10)

1.一种原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽，其特征在于，所述奶牛抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽制备方法，其特征在于，在序列为SEQ ID NO:3的奶牛气管抗菌肽基因的5’端插入牛乳蛋白启动子元件，在牛乳蛋白启动子元件3’端插入β-乳球蛋白肽基因，插入β-乳球蛋白肽基因后的牛乳蛋白表达启动子元件序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求2所述的原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽制备方法，其特征在于，采用携带增强型绿色荧光蛋白标签的哺乳细胞质粒为载体，将奶牛气管抗菌肽基因转染至原代乳腺上皮细胞中。
4.根据权利要求2所述的原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽制备方法，其特征在于，所述奶牛乳腺上皮细胞生物反应器的制备方法为：采集泌乳奶牛新鲜乳腺组织，冲洗后剥离脂肪组织和结缔组织，分离腺泡组织并传代培养，加入胰酶消化液得到单细胞悬液，分离原代奶牛乳腺上皮细胞，作为原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器。
5.根据权利要求2所述的原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽制备方法，其特征在于，分离腺泡组织将其接种至培养皿中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中20-30分钟左右，使组织块微干涸，然后向培养皿中轻轻加入约1mL培养液，置CO2培养箱中培养1-2小时后再补1mL培养基，在培养箱内静置培养两天，第三天更换培养液，以后每两到三天更换一次培养液。
6.根据权利要求2所述的原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽制备方法，其特征在于，加入胰酶消化液后，至于培养箱内37℃消化3-5分钟，倒置显微镜下观察，待大部分细胞回缩变圆后立即将消化液吸出，继续在培养箱内孵育3-5min，让残留的消化液将细胞消化并脱离瓶底或皿底，立即加2mL含10％FBS的培养液终止消化，用移液器吸取瓶内培养液，反复吹打瓶底细胞，使其成为单细胞悬液。
7.根据权利要求1所述的原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽在制备奶牛乳腺炎药物中的应用。
8.根据权利要求1所述的原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽在制备减轻牛乳蛋白过敏症药物中的应用。
9.根据权利要求1所述的原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的奶牛抗菌多肽在食品保鲜中的应用。
10.根据权利9所述的应用，其特征在于，在低温奶制品中添加权利要求1所述的多功能奶牛溶菌酶，所述奶牛抗菌多肽的添加量为低温奶制品的质量百分含量的1％-3％。
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HYTTINEN, J.M: "B.taurus gene for beta-lactoglobulin variant B GenBank: Z48305.1", GENBANK, 15 February 1995 (1995-02-15) *

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