KR20210045409A - 표적 특이적 세포외 소포 - Google Patents

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KR20210045409A
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스테판 보그트
게르하르트 슈타들마이어
플로리안 루에케르
요하네스 그릴라리
마두수단 레디 보빌리
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에버사이트 게엠베하
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Abstract

N-말단 및 C-말단에서 야생형 ED 서열의 영역이 측면에 있는 3-20개의 연속 아미노산 길이를 갖는 ED 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 변형된 영역 내에서 돌연변이유발 방법에 의해 세포외 소포(EV) 표면 단백질의 소포외 도메인(ED)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 변형시켜 표적 결합 부위를 소포외 도메인(ED) 내에 통합시킴으로써 각각 상이한 표적 결합 부위를 포함하는 다양한 표적 특이적 소포외 도메인(TED)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 레퍼토리를 생산하는 단계, 소정의 표적을 특이적으로 인식하는 TED를 선택하는 단계 및 선택된 TED를 포함하는 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 세포외 소포(EV) 표면 단백질의 표적 특이적 소포외 도메인(TED)을 포함하는 단백질을 생산하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

표적 특이적 세포외 소포
본 발명은 표적-특이적 세포외 소포를 조작하는 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 표적-특이적 세포외 소포의 생산 방법에 관한 것이다.
지난 10년 동안, 엑소좀에 대한 연구는 세포 간 통신의 중요한 매개체로 인식됨에 따라 강화되었다[1]. 엑소좀은 원형질막과의 융합시 다소포체에서 방출되며, 방출된 소포는 기능성 RNA, 엑소좀 DNA 및 수용체를 포함하는 막관통 단백질을 주변 환경의 세포로 전달하는 전달 비히클로서 기능한다[2]. 낮은 면역원성 및 낮은 세포 독성과 같은 유리한 특성을 포함한 잠재적 치료 모이어티(therapeutic moiety)로서의 이점과 관련하여, 이들의 적용에 관한 관심은 새로운 캡슐화 방법, 엑소좀 내용물의 세포질 방출 개선, 향상된 세포 흡수 및 보다 특이적인 세포 표적화와 같은 추가 개발을 촉발했다[3].
엑소좀의 소포 흡수는 세포 유형 특이적이며, 막 융합 또는 세포내 이입을 수반할 수 있으며, 심지어 종양원성(oncogenic) 암 수용체의 자극에 의해 유도될 수 있다[4]. 조직 특이적 전달을 달성하기 위해, 인식 단위로서 수용체 특이적 리간드 펩티드를 보유하는 엑소좀 막 단백질, 예를 들어, 테트라스파닌(tetraspanin)을 과발현하도록 공급원 세포(source cell)를 조작하여 엑소좀의 표적화를 최적화할 수 있다[5]. 테트라스파닌은 분자 촉진제로 공지되어 있으며, 테트라스팬 웹(tetraspan web)으로 공지된 큰 세포 신호전달 복합체에 결합되며, 이는 또한 인테그린 및 공수용체 분자와 같은 다른 단백질 계열의 구성원을 포함한다. 더욱이, 이러한 큰 막 단백질 어셈블리는 지질 라프트(lipid raft)와 연관될 수 있다[6-7]. 엑소좀의 세포내 이입에 대한 테트라스파닌 CD9, CD63 및 CD81 리간드의 기능이 보고되었지만[8-10], 흡수 메커니즘은 아직 명확하지 않았다.
거의 편재적인(ubiquitous) 분포에도 불구하고, 테트라스팬 단백질 CD81은 다소포체의 엑소좀 분획이 풍부한 주요 단백질이다[11]. 막관통 도메인 3과 4 사이에 위상 학적으로 위치하는 CD81의 큰 세포외 루프(LEL)는 두 쌍의 시스테인에 의해 안정화된 버섯 모양 구조를 형성하는 5개의 나선형 요소가 특징이다[12-13]. 이 모티프(motif)는 테트라스파닌 계열의 단백질 구성원 사이에서 보존되며[14], 시스테인 결합의 산화는 CD81의 천연 리간드인 C형 간염 바이러스(HCV)의 E2 외피 단백질의 고친화성 결합을 위한 전제 조건이다[15]. 시스테인의 올바른 쌍은 변성되거나 환원된 단백질에 결합하지 않지만 정제된 가용성 hCD81의 천연 형태뿐만 아니라 막 결합된 hCD81과 반응할 수 있는 항체 M38에 의한 인식에 대해 기재된다[16].
1.6Å에서 분해된 hCD81 LEL의 결정 구조는 새로운 유형의 단백질 접힘[12]을 나타내었고, 160개의 테트라스파닌 계열 구성원의 후속 서열 분석은 그들의 접힘 및 주요 구조적 특징이 보존된다는 것을 나타냈다[17]. 시스테인 브릿지와는 별개로, hCD81 LEL은 시스테인 연결을 수용하기 위해 위치한 불변 잔기 Gly157 및 Pro176과 완전히 매립되어 His151 및 Cys190과 함께 수소 결합 네트워크에 기여하는 Tyr127에 의해 안정화된다. 가용성 hCD81 LEL은 2배 축을 중심으로 이량체로 조립되며, 프로모터 사이의 접촉은 각 상호 작용 파트너의 나선 사이와 반대쪽 프로모터의 나선 B와 C-말단 잔기 사이의 저극성 영역이다. 프로모터의 N- 및 C-말단은 세포 표면의 이량체 어셈블리와 유사하게 조립된 이량체의 반대면 중앙 영역에 있으며, 여기서 막관통 세그먼트도 존재한다. 두 번째 저극성 영역은 에너지적으로 불리한 나선 C 및 D의 용매 노출 표면을 포함한다. 용액 연구에 따르면, 나선 D는 상당히 구조화되지 않고, 특정 항원과 결합할 때만 나선 형태를 달성한다[18]. 테트라스파닌 계열 구성원의 서열 정렬은 실제로 삽입 및 결실을 포함하여 이 영역에서 증가된 가변성을 보여준다[19]. 이 표면적은 종- 또는 테트라스파닌-특이적 인식 과정에 관여할 수 있다고 시사되어 왔고[20], 이는 이종이량체 테트라스파닌 종 어셈블리의 가능성을 암시할 수 있다[21]. 특히, CD81의 세그먼트 D는 특정 동종체 클러스터링을 안내할 수 있어야 한다[22].
WO2014/168548은, 예를 들어, 엑소좀 또는 미세소포일 수 있는 치료 전달 소포를 개시하고, 이는 신호 전달 능력이 없는 유인 수용체에 융합된 담체 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 작제물을 막에 부착시켰다.
WO2016/073864는 나노 입자, 지질 기반 담체 분자 또는 세포외 소포에 결합된 CD19 또는 CD21 표적화 항체를 포함하는 B 세포 표적화제를 개시한다.
WO2018/075825는 암 줄기 세포 표적화 펩티드에 융합된 엑소좀 단백질의 세그먼트를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 생체공학 엑소좀을 개시한다.
WO2018/015535A1은 Fc 결합 도메인을 함유하는 단백질로 코팅된 EV를 개시한다. 예시적 EV는 Fc 결합제, 예를 들어, 단백질 A/G, 단백질 A의 Z 도메인 또는 ZZ 도메인에 융합된 엑소좀 단백질을 포함하는 융합 작제물을 운반한다.
US2018/0015182A1은 단백질에 대한 융합체를 포함하는 테트라스파닌을 조작하거나, 단백질을 엑소좀에 부착하기 위한 말단 또는 루프 펩티드 부착 부위를 포함하여 생리활성 화물을 전달하는 엑소좀을 개시한다.
문헌[참조: El Andalouss i et al. (Advanced Drug Delivery Reviews 2013, 65:391-397)]은 표적화된 siRNA 전달을 위한 엑소좀을 기재한다. 예시적인 표적화 엑소좀은 Lamp2b-뇌 특이적 펩티드(RVG, 29-mer 펩티드) 융합 단백질을 포함한다.
문헌[참조: Drummer et al. (Journal of Virology 2002, 76 (21):11143-11147)]은 C형 간염 바이러스 E2 당단백질에 결합하는 CD81의 LEL 상의 결합 부위를 기재한다.
차세대 치료 담체로서의 잠재력을 향상시키기 위해, 특히 세포 흡수의 본질적으로 낮은 효율을 개선하기 위해 엑소좀 매개 전달 시스템을 추가로 개발해야 한다. 안정성이 증가되고 표적 특이성이 개선된 엑소좀 막 단백질을 포함하는 엑소좀 매개 전달 시스템에 대한 특별한 요구가 있다.
본 발명의 목적은 개선된 표적 결합 특성을 갖는 표적-특이적 세포외 소포를 제공하는 것이다. 개선된 표적 결합 특성을 갖는 표적-특이적 EV 표면 단백질 및 이의 결합 도메인을 제공하는 것이 추가 목적이다.
상기 문제는 본 발명에 의해 해결된다.
본 발명에 따르면, N-말단 및 C-말단에서 야생형 소포외 도메인(ED) 서열의 영역이 측면에 있는(flanked) 3-20개의 연속 아미노산 길이를 갖는 ED 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 변형된 영역 내에서 돌연변이유발 방법에 의해 세포외 소포(EV) 표면 단백질의 소포외 도메인(ED)을 인코딩(encoding)하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 변형시켜 표적 결합 부위(target binding site)를 ED 내에 통합시킴으로써 각각 상이한 표적 결합 부위를 포함하는 다양한 표적 특이적 소포외 도메인(target-specific extravesicular domain; TED)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 레퍼토리(repertoire)를 생산하는 단계, 소정의 표적을 특이적으로 인식하는 TED를 선택하는 단계 및 선택된 TED를 포함하는 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 세포외 소포(EV) 표면 단백질의 표적 특이적 소포외 도메인(TED)을 포함하는 단백질을 생산하는 방법이 본원에 제공된다.
단백질의 모든 특징, 특히 본원에 기재된 표적 결합 분자("결합제", "표적-특이적 분자")는 본 발명의 방법을 특성화하는 특징이고, 그 반대의 경우도 마찬가지인 것으로 구체적으로 이해된다.
구체적으로, TED를 포함하는 단백질은 TED, 또는 TED를 포함하는 단백질 임의의 하나 이상의 추가의 영역, 예를 들어, 또 다른 ED 및/또는 막관통 도메인, 또는 특히 이종 서열을 포함하는 재조합 융합 단백질로 구성될 수 있다.
구체적으로, 폴리뉴클레오티드의 레퍼토리는 외부 표면에 다양한 TED를 표시(displaying)하는 유전자 패키지(genetic package)에 포함되며, 바람직하게는 효모, 파지(phage), 박테리아, 리보솜, mRNA 또는 포유류 세포 디스플레이(display)로 이루어진 그룹에서 선택된 디스플레이 시스템을 사용한다.
구체적으로, 변형된 영역은 TED에서 단리될 때 더 낮은 표적 결합 친화성을 갖는다.
구체적으로, 표적 결합 부위는 적어도 2개의 아미노산에서 멀리 떨어진 추가의 변형 영역 내에 또는 야생형 ED 서열 내에 있는 적어도 하나의 추가 결합 영역을 포함한다. 상기 적어도 하나의 추가 결합 영역은 바람직하게는 동일한 ED이고/이거나 본원에 추가로 기재된 특정 거리에서 동일한 TED 내에 위치한다.
구체적으로, TED는 야생형 ED에 대해 적어도 70% 서열 동일성(sequence identity)을 포함한다.
구체적으로, 야생형 ED는 테트라스팬-유사 단백질(tetraspan-like protein), 인테그린 계열의 단백질, 프로테오글리칸, 5-막관통 도메인 단백질(transmembrane domain), 유형 I 막관통 단백질, 노치 계열(Notch family) 단백질, 효소 막 단백질, 면역 조절 표면 단백질, 중간 엽 줄기 세포의 표면 마커, 당단백질 또는 채널링 단백질(channelling protein)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 EV 표면 단백질에서 유래된다 (또는 EV 표면 단백질의 것이다).
구체적으로, 테트라스팬-유사 단백질은 바람직하게는
a) 서열번호 87로 동정된(identified) 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD81;
b) 서열번호 89로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD9;
c) 서열번호 90으로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD53;
d) 서열번호 91로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TSPAN32;
e) 서열번호 92로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD82;
f) 서열번호 93으로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD63;
g) 서열번호 94로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD151; 및
h) 서열번호 95로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD37로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 테트라스파닌이거나;
여기서, 테트라스팬-유사 단백질은 리소좀-연관 막 단백질(lysosome-associated membrane protein), 바람직하게는 서열번호 96으로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 LAMP2이다.
구체적으로, 야생형 ED는 다음 중 어느 하나의 것이다:
a) CD81, 여기서 상기 ED는 서열번호 130 또는 서열번호 131로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
b) CD9, 여기서 상기 ED는 서열번호 132, 서열번호 182 또는 서열번호 133으로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
c) CD53, 여기서 상기 ED는 서열번호 134 또는 서열번호 135로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
d) TSPAN32, 여기서 상기 ED는 서열번호 136 또는 서열번호 137로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
e) CD82, 여기서 상기 ED는 서열번호 138 또는 서열번호 139로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
f) CD63, 여기서 상기 ED는 서열번호 140 또는 서열번호 141로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
g) CD151, 여기서 상기 ED는 서열번호 142 또는 서열번호 143으로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
h) CD37, 여기서 상기 ED는 서열번호 144 또는 서열번호 145로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고; 또는
i) LAMP2, 여기서 상기 ED는 서열번호 146으로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
구체적으로, 단백질은 위치(들)에서 하나 이상의 시스테인(들)에 의해 안정화되어 하나 이상의 이황화 결합(disulfide bond)의 형성을 허용하는 ED 아미노산 서열에 루프 구조(loop structure)를 포함한다.
구체적으로, 변형된 영역은 ED의 루프 영역 내에 위치한다.
구체적으로, ED는
a) CD81의 것이고, 아미노산 서열은 시스테인을 도입하여 야생형 ED 서열에서, 바람직하게는 위치 134와 144 및/또는 130과 146 및/또는 135와 168 사이에서 자연적으로 발생하지 않는 하나 이상의 이황화 결합의 형성을 허용하도록 변형되고, 여기서 번호매김(numbering)은 서열번호 87로 동정된 인간 CD81의 것이고, 또는
b) CD9의 것이고, 아미노산 서열은 시스테인을 도입하여 야생형 ED 서열에서, 바람직하게는 위치 20과 28 사이에서 자연적으로 발생하지 않는 하나 이상의 이황화 결합의 형성을 허용하도록 변형되고, 여기서 위치의 번호매김은 CD9 큰 세포외 루프 (LEL, 서열번호 118)의 것이다.
구체적으로, ED는 CD81의 것이고, 변형된 영역은 위치 160 및 172 내에 위치하며, 여기서 번호매김은 서열번호 87로 동정된 인간 CD81의 것이다.
구체적으로, TED는 위치 132와 141 사이 또는 위치 180과 189 사이에 위치한 적어도 하나의 추가 결합 영역을 포함하며, 여기서 번호매김은 서열번호 87로 동정된 인간 CD81의 것이다.
구체적으로, ED는 CD9의 것이고, 변형된 영역은 위치 155-166, 위치 128-142, 위치 130-140 또는 위치 169-180 중 어느 하나 내에 위치하며, 여기서 번호매김은 서열번호 89로 동정된 인간 CD9의 것이다.
구체적으로, 표적은 세포 표적, 바람직하게는 유사분열 수용체, 사이토카인 수용체, 아시알로당단백질 수용체, 막 수송체, 지단백질, 리포사카라이드(liposaccharide), 당단백질, 프로테오글리칸 또는 무세포 표적, 바람직하게는 사이토카인, 인공 단백질 또는 인공 표면 구조물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
구체적으로, TED를 포함하는 단백질은 상기 TED 및 적어도 하나의 막관통 도메인을 포함하는 표적-특이적 EV 표면 단백질(TSP)이다.
구체적으로, 막관통 도메인은 포유류 EV 표면 단백질로부터 유래하는 막관통 도메인에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 포함한다.
구체적으로, 막관통 도메인은 다음 중 어느 하나의 것이다:
a) CD81, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 147, 서열번호 148, 서열번호 149 또는 서열번호 150으로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
b) CD9, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 151, 서열번호 152, 서열번호 153 또는 서열번호 154로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
c) CD53, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 155, 서열번호 156, 서열번호 157 또는 서열번호 158로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
d) TSPAN32, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 159, 서열번호 160, 서열번호 161 또는 서열번호 162로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
e) CD82, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 163, 서열번호 164, 서열번호 165 또는 서열번호 166으로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
f) CD63, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 167, 서열번호 168, 서열번호 169 또는 서열번호 170으로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
g) CD151, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 171, 서열번호 172, 서열번호 173 또는 서열번호 174로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
h) CD37, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177 또는 서열번호 178로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고; 또는
i) LAMP2, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 179로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
구체적으로, ED 및 막관통 도메인은 둘 모두 동일한 EV 표면 단백질로부터 유래되고 (또는 동일한 EV 표면 단백질의 것이고), 바람직하게는 EV 표면 단백질은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
a) 서열번호 87로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD81;
b) 서열번호 89로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD9;
c) 서열번호 90으로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD53;
d) 서열번호 91로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TSPAN32;
e) 서열번호 92로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD82;
f) 서열번호 93으로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD63;
g) 서열번호 94로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD151;
h) 서열번호 95로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD37; 및
i) 서열번호 96으로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 LAMP2.
본 발명은 다음과 같은 방법으로 표적 특이적 세포외 소포(TEV) 제제를 생산하는 방법을 추가로 제공한다:
a) 본원에 기재된 방법에 의해 수득 가능한 TED를 포함하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
b) 상기 폴리뉴클레오티드를 공급원 세포 또는 공급원 세포 혼합물에 도입하는 단계;
b) 세포외 소포를 생산하는 조건하에서 상기 세포(들)를 배양하는 단계;
c) TED의 표적 결합 부위를 포함하는 TEV를 포함하는 분획을 단리하는 단계; 및
d) 상기 분획에 포함된 TEV의 제제를 생산하는 단계.
구체적으로, TED를 포함하는 단백질은 상기 TED 및 적어도 하나의 막관통 도메인을 포함하는 표적 특이적 EV 표면 단백질(TSP)이고, TEV는 막의 외부 표면에 표적 결합 부위를 나타내고 있다.
구체적으로, 본원에 기재된 방법은 TEV에 소포내 로드(load)를 로딩하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 로드는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 도메인, 단백질, 지질, 유전자, 핵산, 예를 들어, mRNA, miRNA, RNAi 매개 분자, 특히 록킹된(locked) 핵산 또는 포스포로티오에이트, DNA, DNA 단편, 플라스미드, 예를 들어, 미니서클(minicircle) DNA, 약물, 예를 들어, 작은 분자, 특히 화학요법제 또는 세놀리틱스(senolytics) 중 임의의 하나 이상을 포함한다.
구체적으로, 공급원 세포 또는 공급원 세포 혼합물은 진핵 또는 원핵 공급원, 바람직하게는 신체 조직, 체액 또는 세포 배양물로부터 유래된다(또는 이의 것이다).
구체적으로, 공급원 세포 또는 공급원 세포 혼합물은 대상체로부터 수득되고, TEV 제제는 자가 사용용으로 제형화된다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 수득 가능하거나 수득된 TEV 제제를 제공한다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 수득 가능하거나 수득된 자가 TEV 제제를 제공하며, 여기서 공급원 세포 또는 공급원 세포 혼합물은 대상체로부터 수득되고, TEV 제제는 동일한 대상체에게 투여된다.
본 발명은 특히 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 이러한 자가 TEV 제제의 의학적 용도를 제공하며, 여기서 공급원 세포 또는 공급원 세포 혼합물은 상기 대상체로부터 수득된다.
구체적으로, 대상체는 환자, 특히 장애 또는 질환을 앓고 있는 인간 환자이다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 수득 가능하거나 수득된 세포외 소포(EV) 표면 단백질의 표적-특이적 소포외 도메인(TED)을 포함하는 단백질을 제공한다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은 포유류 EV 표면 단백질 서열의 야생형 소포외 도메인(ED)에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 포함하고, N-말단 및 C-말단에서 야생형 ED 서열의 영역이 측면에 있는 3-20개의 연속 아미노산 길이를 갖는 적어도 하나의 변형 영역을 포함하며, 이 변형 영역이 야생형 ED에서 자연적으로 발생하지 않는 표적 결합 부위의 적어도 일부인 세포외 소포(EV) 표면 단백질의 표적-특이적 소포외 도메인(TED)을 제공하고, 여기서 상기 변형 영역은 TED로부터 단리될 때 더 낮은 표적 결합 친화성을 갖고/갖거나, 상기 표적 결합 부위는 적어도 2개의 아미노산에서 멀리 떨어진 추가의 변형된 영역 내에 또는 야생형 ED 서열 내에 적어도 하나의 추가 결합 영역을 포함한다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은 포유류 EV 표면 단백질 서열의 야생형 ED에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 포함하고, N-말단 및 C-말단에서 야생형 ED 서열의 영역이 측면에 있는 3-20개의 연속 아미노산 길이를 갖는 적어도 하나의 변형 영역을 포함하며, 이 변형 영역이 야생형 ED에서 자연적으로 발생하지 않는 표적 결합 부위의 적어도 일부인 소포외 도메인(ED) 및 적어도 하나의 막관통 도메인을 포함하는 표적 특이적 EV 표면 단백질(TSP)을 제공하고, 여기서 상기 변형 영역은 TSP로부터 단리될 때 더 낮은 표적 결합 친화성을 갖고/갖거나, 상기 표적 결합 부위는 적어도 2개의 아미노산에서 멀리 떨어진 추가의 변형 영역 내에 또는 야생형 ED 서열 내에 적어도 하나의 추가 결합 영역을 포함한다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 표적-특이적 분자, 특히 본원에 기재된 TED를 포함하는 단백질, 본원에 기재된 TED, 또는 본원에 기재된 TSP 중 어느 하나를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 구체적으로, 폴리뉴클레오티드는 cDNA분자이다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은 막을 포함하는 표적 특이적 세포외 소포(TEV) 및 막의 외부 표면에 표적-특이적 분자를 표시하는 것을 제공하며, 여기서 표적-특이적 분자는 본원에 기재된 임의의 표적-특이적 분자, 특히 본원에 기재된 TED를 포함하는 단백질, 본원에 기재된 TED 또는 본원에 기재된 TSP 중 어느 하나이다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은 본원에 기재된 표적 특이적 분자 중 어느 하나, 특히 본원에 기재된 TED를 포함하는 단백질, 본원에 기재된 TED 또는 본원에 기재된 TSP 중 어느 하나를 포함하는 약제학적 제제를 제공하거나, 이는 본원에 기재된 TEV 및 약제학적으로 허용되는 담체를 바람직하게는 피내, 피하, 정맥내, 국소 또는 경구 사용하기 위한 제형으로 포함한다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은 본원에 기재된 다양한 적어도 102개의 TEV를 포함하는 표적-특이적 세포외 소포(TEV) 라이브러리(library)를 제공하며, 여기서 다양성은 N-말단 및 C-말단에서 동일한 야생형 소포외 도메인(ED)의 동일한 영역이 측면에 있는 상이한 변형 영역을 갖는 TEV를 포함하거나 이로 구성된다.
구체적으로, TEV 라이브러리는 본원에 기재된 표적 특이적 분자를 포함하는 TEV의 레퍼토리를 포함하며, 여기서 레퍼토리는 적어도 102개의 상이한 변형 영역 또는 표적 결합 부위를 포함한다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은
a) 각각 상이한 표적 결합 부위를 포함하는 다양한 표적-특이적 EV 표면 단백질(TSP)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 레퍼토리를 제공하는 단계;
b) 상기 레퍼토리를 상기 공급원 세포(들)에 도입하는 단계; 및
b) 상이한 표적 결합 특이성을 갖는 표적-특이적 세포외 소포(TEV)의 레퍼토리를 포함하는 분획을 단리하여 TEV의 라이브러리를 생산하는 단계를 포함하는 표적-특이적 세포외 소포(TEV)의 라이브러리를 생산하는 방법을 제공하고,
여기서 폴리뉴클레오티드의 레퍼토리는 ED 내에 표적 결합 부위를 통합하기 위해 N-말단 및 C-말단에서 야생형 ED 서열의 영역이 측면에 있는 3-20개의 연속 아미노산 길이를 갖는 적어도 하나의 변형된 영역 내에서 상기 EV 표면 단백질의 소포외 도메인(ED)의 돌연변이를 수득하기 위해 돌연변이유발 방법에 의해 EV 표면 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 돌연변이 유발함으로써 생산된다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은 바람직하게는 상이한 표적 특이성을 갖는 적어도 102개의 TEV를 포함하는 본원에 기재된 방법에 의해 수득 가능하거나 수득된 TEV 라이브러리를 제공한다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은 포유류 EV 표면 단백질 서열의 야생형 소포외 도메인(ED)에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 포함하고, N-말단 및 C-말단에서 야생형 ED 서열의 영역이 측면에 있는 3-20개의 연속 아미노산 길이를 갖는 적어도 하나의 변형 영역을 포함하는 세포외 소포(EV) 표면 단백질의 표적-특이적 소포외 도메인(TED)을 제공하고, 이 변형 영역은 야생형 ED에서 자연적으로 발생하지 않는 표적 결합 부위의 적어도 일부이고, 여기서 TED는 본원에 추가로 기재된 바와 같이 특성화된다.
구체적으로, 변형된 영역은 TED에서 단리될 때 더 낮은 표적 결합 친화성을 갖는다.
구체적으로, TED는 각각의 야생형 ED 서열에 대해 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성 중 적어도 어느 하나를 포함한다.
구체적으로, 야생형 ED는 본원에 추가로 기재된 바와 같은 EV 표면 단백질에서 유래한다.
특정 EV 표면 단백질은
a) 테트라스팬 유사 단백질,
b) 인테그린 계열의 단백질,
c) 프로테오글리칸,
d) 5-막관통 도메인 단백질,
e) 유형 I 막관통 단백질,
f) 노치 계열 단백질,
g) 막 단백질, 특히 효소 활성을 갖는 것들(효소 TM 단백질),
h) 면역 조절 표면 단백질,
i) 중간 엽 줄기 세포의 표면 마커,
j) 당단백질,
k) 채널링 단백질, 또는
l) 기타 엑소좀 (소포) 표면 단백질 중의 어느 하나 (또는 이들의 조합)이다.
특정 구현예에 따르면, EV 표면 단백질은 테트라스팬 유사 단백질, 특히 테트라스파닌 또는 리소좀 관련 막 단백질이다.
구체적으로, 테트라스팬 유사 단백질은 테트라스팬 접합 복합체 수퍼패밀리, 예를 들어, 부류 I 또는 II의 테트라스파인의 것이고, 바람직하게는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이다:
a) 서열번호 87로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD81;
b) 서열번호 89로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD9;
c) 서열번호 90으로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD53;
d) 서열번호 91로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TSPAN32;
e) 서열번호 92로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD82;
f) 서열번호 93으로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD63;
g) 서열번호 94로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD 151; 및
h) 서열번호 9로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD37.
구체적으로, 리소좀-연관 막 단백질은 서열번호 96으로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 LAMP2이다.
구체적으로, 기원 단백질은 인간 야생형 EV 표면 단백질 또는 이에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 인공 단백질 (또는 비인간 동물의 야생형 단백질)이다.
구체적으로, 기원 ED는 인간 야생형 EV 표면 단백질 또는 이에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 인공 단백질 (또는 비인간 동물의 야생형 단백질)에서 유래하는 야생형 ED이다.
구체적으로, 야생형 ED는 인간 또는 비인간 동물 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 것과 같은 포유류 EV 표면 단백질의 것이다.
구체적으로는, 야생형 ED는 야생형 EC 서열, 특히 다음 중 어느 하나인 인간 EV 표면 단백질에 포함되거나 이로 구성된 ED 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 90, 95, 98, 99%의 서열 동일성 중 적어도 임의의 하나, 또는 100% 서열 동일성을 포함한다:
a) CD81, 여기서 상기 ED는 서열번호 130 또는 서열번호 131로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
b) CD9, 여기서 상기 ED는 서열번호 132, 서열번호 182 또는 서열번호 133으로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
c) CD53, 여기서 상기 ED는 서열번호 134 또는 서열번호 135로 동정되는 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
d) TSPAN32, 여기서 상기 ED는 서열번호 136 또는 서열번호 137로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
e) CD82, 여기서 상기 ED는 서열번호 138 또는 서열번호 139로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
f) CD63, 여기서 상기 ED는 서열번호 140 또는 서열번호 141로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
g) CD 151, 여기서 상기 ED는 서열번호 142 또는 서열번호 143으로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
h) CD37, 여기서 상기 ED는 서열번호 144 또는 서열번호 145로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고; 또는
i) LAMP2, 여기서 상기 ED는 서열번호 146으로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
구체적으로, ED의 서열은 한쪽 또는 양쪽 말단에서 변할 수 있어서, ED는 EV 표면 단백질을 표시하는 EV 또는 ED의 영역을 결정하는 방법에 따라 다수의 아미노산, 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산으로 연장되거나 단축된다.
구체적으로, ED는, 예를 들어, 각각의 EC 또는 각각의 비인간 상동체의 소포외 루프 서열을 포함하거나 이로 구성되는 것과 같은 임의의 비인간 포유류 기원일 수 있다.
구체적으로, 포유류 야생형 테트라스팬 유사 단백질은 포유류 야생형 테트라스팬 유사 단백질에 대해 90, 95, 98 또는 99% 서열 동일성 중 적어도 어느 하나를 포함하거나 100% 서열 동일성을 포함한다.
특정예에 따르면, EV 표면 단백질은 CD81이고, 변형된 영역은 위치 160 및 172 내에 위치하며, 여기서 번호매김은 서열번호 87로 동정된 인간 CD81의 것이다. 바람직하게는, 상기 변형된 영역을 포함하는 이러한 TED는 위치 132와 141 사이, 또는 위치 180과 189 사이에 위치한 적어도 하나의 추가 결합 영역을 포함하고, 여기서 번호매김은 서열번호 87로 동정된 인간 CD81의 것이다.
또 다른 특정예에 따르면, EV 표면 단백질은 CD9이고, 변형된 영역은 위치 155-166, 위치 128-142, 위치 130-140 또는 위치 169-180 중 어느 하나 내에 위치하며, 여기서 번호매김은 서열번호 89로 동정된 인간 CD9의 것이다.
특정 구현예에 따르면, TED 내(특히 표적 결합 부위에 포함된 적어도 2개의 멀리 떨어진 영역 또는 ED 내)의 상기 적어도 하나의 변형된 영역은 용매 노출된 잔기를 포함하고, 바람직하게는 상기 적어도 하나의 변형된 영역은 ED의 루프 및/또는 나선형 영역에 위치한다. 위치의 용매 노출은 전형적으로 표적 결합에 대한 유리한 접근성을 나타낸다. 용매에 대한 노출을 결정하는 테스트 방법은 용매 접근 가능 표면적 및 상대적 접근 가능 표면적이다. 구체적으로, 용매 노출된 잔기는 20% 이상의 상대적 접근 가능 표면적을 갖는 것들이다.
추가의 특정 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 변형된 영역은 용매 노출된 잔기를 포함하는 ED의 알파-나선형 영역에 위치한다. 구체적으로, 알파-나선형 영역은 일련의 코일, 예를 들어, 소수성 및 하전된 아미노산 잔기의 반복 패턴을 포함하여 펩티드 알파-나선을 형성하는 코일 아미노산 서열, 특히 코일 반복 서열을 포함한다. 구체적으로, ED의 나선형 영역은 5 내지 30개, 바람직하게는 7 내지 18개 아미노산 범위의 길이를 갖는다. 구체적으로, 나선형 영역 중 적어도 하나는 표적 결합 부위의 일부이다. 나선형 영역은 전형적으로 이량체화 또는 다량체화하는 경향이 있기 때문에, 상기 표적 결합 부위가 ED 단량체에 포함되는 경우, 상기 표적 결합 부위는 각각 이량체화 및 다량체화를 적절하게 방지한다.
구체적으로, ED는 CD81 또는 CD9와 같은 테트라스파닌의 것이고, 표적 결합 부위는 특히 각각 CD81 및 CD9의 LEL 내에 테트라스파닌의 적어도 하나의 나선형 및/또는 루프 구조를 포함하거나 수반한다. 구체적으로, EV 표면 단백질은 CD81 또는 CD9, 특히 인간 CD81 또는 CD9이다. 구체적으로, 표면 단백질은 단량체 CD81 또는 단량체 CD9이다.
그러나, 일부 경우에, ED 또는 EV 표면 단백질이 이량체 또는 다량체로 존재할 때만 표적 결합 부위를 통합한다. 이러한 경우에, 각각 이량체화 및 다량체화 및 효과적인 표적 결합을 보장하기 위해 비나선형 영역 내에서 표적 결합 부위를 조작하는 것이 바람직한다.
구체적으로, 표적 결합 부위의 위치는 ED 또는 EV 표면 단백질의 상이한 유형에 따라 다르다. 특정 모티프는 보존되는 반면, 다른 모티프는 단백질 계열 내에서 또는 다른 종의 유사한 서열에서 다를 수 있다. 예를 들어, 테트라스파닌 단백질 계열의 나선 D는 상당히 구조화되지 않고, 특정 항원과 결합할 때만 나선 형태를 달성한다. 테트라스파닌 계열 구성원의 서열 정렬은 삽입 및 결실을 포함하여 이 영역에서 증가된 자연적 가변성을 나타낸다. 구체적으로, 이러한 자연적 가변성은 부위 지시된 돌연변이 유발의 우수한 내성을 나타낸다.
구체적으로, 본원에 기재된 TED의 변형된 영역은 야생형 ED 서열의 루프 영역, 특히 큰 세포외 루프 영역 내에 위치한다. EV 표면 단백질은 루프 구조를 포함하는 EV에 부착될 때 3차 구조를 가질 수 있으며, 루프를 주변 소포에 노출시킬 수 있다. 이러한 루프 영역은 ED 내의 표적 결합 부위를 조작하는 데 특히 적합하다.
예를 들어, 테트라스팬 유사 분자는 하나 이상의 작은 소포외 루프 및/또는 하나 이상의 큰 소포외 루프(LEL)를 가질 수 있다. CD81 및 CD9의 예시적인 LEL 서열이 본원에 추가로 개시되어 있다. 인간 CD81의 경우, LEL 서열은 서열번호 7로 확인되고, 인간 CD9의 경우, LEL 서열은 서열번호 118로 동정된다.
구체적으로, 본원에 기재된 바와 같은 TED 또는 EV 표면 단백질은 하나 이상의 이황화 결합의 형성을 허용하는 위치(들)에서 하나 이상의 시스테인(들)에 의해 안정화되는 아미노산 서열에 루프 구조를 포함한다. 구체적으로, 본원에 기재된 바와 같은 상기 TED를 포함하는 TED 또는 EV 표면 단백질은 적어도 2개의 아미노산 측쇄를 연결하는 적어도 하나의 분자내 결합, 예를 들어, 이황화 결합에 의해 안정화되는 적어도 하나의 루프 영역을 포함한다.
ED 또는 EV 표면 단백질의 루프 길이는 다를 수 있다. 구체적으로, ED 또는 EV 표면 단백질은 적어도 하나의 큰 소포외 루프 및 더 작은 크기의 루프를 포함한다. 큰 소포외 루프는 전형적으로 75 내지 140개 아미노산, 바람직하게는 78 내지 132개 아미노산 범위의 길이를 갖는다. 구체적으로, 작은 루프는 25 내지 35개 아미노산, 바람직하게는 26 내지 32개 아미노산 범위의 길이를 갖는다.
구체적으로, ED 또는 EV 표면 단백질은 적어도 하나의 나선형 영역 또는 도메인, 예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 나선형 영역을 포함한다. 구체적으로, 나선형 영역은 루프 영역 내에 있거나 표면 단백질의 말단 영역 내에 있다.
구체적으로, 본원에 기재된 TED를 포함하는 TED 또는 EV 표면 단백질은 단량체로서 EV의 표면에 존재한다. 세포외 또는 소포외 표면 단백질은 생물학적 기능을 위해 이량체화 또는 올리고머화하는 경향이 있지만, 표면 단백질은 단량체로서 표적 결합되도록 조작된다.
구체적으로, 루프 및/또는 나선형 영역 중 적어도 하나는 ED 내에서 변형된 영역을 생산하기 위해 돌연변이 유발되어 표적 결합 부위의 적어도 일부가 된다.
구체적으로, 본원에 기재된 TED는 EV에 고정된 적어도 하나의 루프 및/또는 나선형 구조, 전형적으로 막관통 도메인을 포함하는 표적 특이적 EV(TEV) 표면 단백질에 포함된다.
구체적으로, 본원에 기재된 TED 내의 변형된 영역은 3-20개의 연속 아미노산, 바람직하게는, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개, 최대, 예를 들어, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13 또는 12개의 길이를 갖는다. 변형은 전형적으로 임의의 그러한 변형된 영역 내에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 최대 20개의 점 돌연변이를 초래한다.
구체적으로, 상기 변형은 한 위치에서 하나의 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실, 바람직하게는 아미노산 치환, 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 중 적어도 어느 하나 (또는 그 이하)를 포함하는 다수의 점 돌연변이를 도입한다.
구체적으로 바람직한 것은 제1 변형된 영역 내의 연속적인 위치에서의 다수의 점 돌연변이, 예를 들어, 3 내지 20개, 특히 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 범위의 수; 및 임의로 상기 제1 변형된 영역에서 멀리 떨어진 인접 위치에서 제2 변형된 영역 내의 다수의 점 돌연변이, 예를 들어, 3 내지 20개, 특히 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 범위의 수이고, 여기서 상기 제1 및 제2 변형 영역은 모두 표적 결합 부위에 포함된다. 상기 제1 및 제2 변형 영역 사이의 거리는 전형적으로 야생형 ED에서 유래하는 측면 서열로 구성된다.
구체적으로, 변형된 영역은 N-말단 및 C-말단에서 야생형 ED 서열의 영역이 측면에 위치하여 측면 영역이 변형된 영역의 각각의 말단에 인접하도록 한다. 전형적으로, 측면 영역은 야생형 ED 스패닝(spanning)의 야생형 아미노산 서열을 특징으로 하며, 여기서 야생형 측면 서열은 야생형 ED의 각각의 (변형되지 않은) 서열과 동일한 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 인접 아미노산의 길이를 갖는다.
그러나, 특정 구현예에 따르면, 측면 영역 중 하나 (둘 다는 아님)가 부재할 수 있다. 예를 들어, 변형된 영역은 ED의 C-말단을 포함하는 말단 영역일 수 있다. 이러한 경우, 변형된 영역은 N-말단에서만 야생형 ED 서열의 영역의 측면에 있고, 변형된 영역은 ED의 C-말단 영역이다.
구체적으로, 변형된 영역은 TED 내에 위치할 때 표적에 결합하므로 TED의 주변 2차 또는 3차 구조를 포함하여 표적을 특이적으로 인식한다.
특정 구현예에 따르면, 표적 결합 부위는 TED 내, TSP 내, 또는 TED 및/또는 TSP를 포함하는 EV의 표면에 적어도 상기 변형된 영역 및 TED의 야생형 영역, 및/또는 또 다른 변형 영역을 포함한다.
TED로부터 단리될 때 또는 변형된 영역과 동일한 아미노산 서열로 구성되는 별도의 펩티드로 생산될 때, 전형적으로 이러한 단리된 변형 영역은 더 낮은 표적 결합 친화성을 갖거나 심지어 표적에 결합하기 위한 특이성 또는 선택성이 결여된다. TED 내의 변형된 영역의 표적 결합과 비교하여, 단리된 변형 영역은 구체적으로 동일한 검정 또는 비교 가능한 환경에서 결정된 바와 같이 적어도 10배, 또는 적어도 100배, 적어도 1000배 상이한 결합 상수 또는 결합 동역학으로 미만 친화성 또는 덜 선택적 결합을 갖는다.
본원에 기재된 TED의 표적 결합 특성을 상기 TED로부터 단리된 변형 영역의 표적 결합 특성을 비교하기 위한 적합한 검정은 다음 검정 중 임의의 것을 사용할 수 있다: ELISA, 예를 들어, Biacore를 사용하는 친화성 결정, 생물층 간섭 측정, 동족 항원과 함께 배양된 TED를 표시하는 세포의 형광 측정, 등온 적정 미세 열량 측정법, 형광 상관 분광법.
구체적으로, 표적 결합 부위는 적어도 2개의 영역(여기서, 이들 중 적어도 1개 또는 2개는 본원에 추가로 기재된 바와 같이 변형된 영역임)을 포함하며, 이는EV 표면 단백질의 적어도 하나의 막관통 도메인에 의해 분리된 ED와 같은 동일한 EV 표면 단백질의 적어도 2개의 상이한 ED 내에 있다.
TED 내에 통합되고 동일한 ED 내 또는 적어도 2개의 ED 내에 상기 적어도 하나의 변형된 영역을 포함하거나 그렇지 않으면 수반하는 이러한 표적 결합 부위는 개선된 결합 특성의 특별한 이점을 갖는다. 이러한 개선된 결합 특성은 전형적으로 ED 내의 소정의 영역을 돌연변이 유발하여 ED 내에 매립된 결합 특성을 갖는 변형된 영역이 되고, 표적 결합 특이성 및/또는 친화성에 따라 적합한 결합제를 선택할 때 수득된다.
결합 특성은 구체적으로 ED에 대한 특정 (펩티드) 결합제의 비교 가능한 융합에 비해 개선되어 융합 단백질을 생산한다. 이는 융합시, 결합 특성이 전형적으로 변경되어 비교 가능한 융합 단백질이 단리된 결합제와 비교하여 ED에 결합제의 융합시 낮은 친화성 또는 덜 선택적 결합을 갖기 때문이다.
구체적으로, 변형된 영역은 표적 결합 부위의 적어도 일부이거나 표적 결합 부위로 구성된다. 특정 구현예에 따르면, 변형된 영역은 결합 부위의 모든 접촉 아미노산 잔기를 포함한다.
특정 구현예에 따르면, 표적 결합 부위는 하나 이상의 변형된 결합 영역을 포함하고, 여기서 적어도 제1 변형 영역은 제2 변형 영역으로부터 특정 거리에 위치한다.
구체적으로, 표적 결합 부위는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 인접 아미노산 중 적어도 어느 하나에서 멀리 떨어진 추가의 변형 영역 내에, 또는 야생형 ED 서열 내에 적어도 하나의 추가 결합 영역을 포함한다. 구체적으로, 상기 적어도 2개의 멀리 떨어진 변형 영역 사이의 영역은 야생형 ED 서열의 영역인 N-말단 또는 C-말단에서 본원에 기재된 변형 영역의 측면에 있는 영역 중 하나를 포함한다.
구체적으로, 표적 결합 부위는 상기 TED의 적어도 2개의 먼 영역 내에 결합 잔기를 포함한다. 구체적으로, TED는 상기 표적 결합 부위를 통합하기 위해 상기 적어도 2개의 먼 영역 내에서 변형되거나 돌연변이유발된다.
특정 구현예에 따르면, 표적 결합 부위는 ED 내이지만 변형된 영역 외부에 접촉 아미노산 잔기를 포함한다. 이러한 추가의 접촉 아미노산은 ED의 하나 이상의 추가 영역에 위치할 수 있으며, 이 하나 이상의 추가 영역은, 예를 들어, 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 변형된 (돌연변이된) 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 ED의 야생형 서열을 포함할 수 있다.
특정 구현예에 따르면, ED 또는 표적 결합 부위는 아미노산 서열 내에, 구체적으로, 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산이 멀리 떨어져 있는 특정 거리에 상기 적어도 하나의 변형된 영역, 및 하나 이상의 추가 점 돌연변이, 또는 일련의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 점 돌연변이를 포함한다.
특정 구현예에 따르면, ED 또는 표적 결합 부위는 적어도 2개 또는 3개의 상기 변형된 영역을 포함한다.
구체적으로 바람직한 구현예에서, 표적 결합 부위는 동일한 ED 내의 2개 이상의 비인접 영역 또는 적어도 2개의 상이한 ED를 포함하는, 예를 들어, 각각 특정 거리에, 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개, 전형적으로 최대 100개 또는 80개의 아미노산이 멀리 떨어진 적어도 2개의 영역에 걸쳐 연장되는 결합 표면을 수반하는 입체 형태 결합 부위이다. 구체적으로, 먼 결합 영역은 서로 인접하지 않는다. 구체적으로, 먼 결합 영역은 각각의 EV 표면 단백질의 서열에서 인접하지 않는다.
구체적으로, 결합 부위는 각각의 먼 결합 영역 및 임의로 TED의 하나 이상의 추가 접촉점 또는 영역을 포함한다. 구체적으로, 표적 결합 부위는 적어도 2개의 변형된 (예를 들어, 합성 또는 돌연변이 유발된) 영역 및 임의로 합성되거나 돌연변이유발되지 않지만, ED의 천연 (야생형) 영역인 적어도 하나의 추가 영역 내에 접촉점을 포함한다.
구체적으로, 표적은 EV 표면 단백질의 소포외 부분(특히 본원에 기재된 TED를 포함하는 부분) 내에 통합되는 결합 부위의 입체 형태 파라토프에 의해 결합되며, 이 파라토프는 TED의 먼 영역, 예를 들어, 루프 및/또는 나선형 영역(들)에 접촉 영역을 포함한다. 적합한 TED 및 각각의 EV 표면 단백질은 별개의 영역 내에서 선택된 영역을 돌연변이 유발함으로써 편리하게 생산된다. 예를 들어, 본원에 기재된 TED는 1개, 2개 또는 3개의 먼 영역 내에서 돌연변이 유발된다.
구체적으로, 표적 결합 부위는 야생형 ED 또는 야생형 EV 표면 단백질에서 자연적으로 발생하지 않는 특정의 소정의 표적을 인식하는 신규한 결합 부위이며, 본원에서 "인공" 결합 부위로서 지칭되기도 한다.
특정 구현예에 따르면, 표적 결합 부위는 ED(들)가 표적에 결합하기 위한 신규하거나 추가의 특이성을 갖도록 하는 하나 이상의 ED 내의 신규한 또는 추가의 결합 부위일 수 있다. 이러한 새로운 표적 결합 부위는 ED(들)의 임의의 자연 발생 결합 부위와 동일한 표적에 결합하는 특이성을 가질 수 있거나, 예를 들어, 상이한 표적을 인식하는 상이한 특이성을 가질 수 있다.
다른 특정 구현예에 따르면, 표적 결합 부위는 ED(들)가 (미세한 특이성 또는 친화성은 변할 수 있지만) 자연 발생 결합 부위와 동일한 표적에 결합하는 특이성을 갖도록 하는 ED(들)의 변형된 자연 발생 결합 부위일 수 있다.
특정 측면에 따르면, 별도의 분자로 제공된 TED 또는 이러한 TED를 포함하는 단백질(예: EV 표면 단백질 또는 TSP)은 동일한 표적 또는 상이한 표적을 특이적으로 인식하는 적어도 하나 또는 두 개의 상이한 표적 결합 부위를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 TED는 구체적으로 의료 목적으로, 예를 들어, 특히 EV에 부착된 경우, 본원에 기재된 TED를 포함하는 단백질 또는 이러한 TED를 포함하는 표적 특이적 EV 표면 단백질(TSP)의 치료적 유효량을 전달하여 본원에 추가로 기재된 바와 같은 표적 특이적 세포외 소포(TEV)를 제공하는 데 사용된다.
구체적으로, 표적은 세포 표적, 바람직하게는 유사분열 수용체, 사이토카인 수용체, 아시알로당단백질 수용체, 막 수송체, 지단백질, 리포사카라이드, 당단백질, 프로테오글리칸 또는 무세포 표적, 바람직하게는 사이토카인, 인공 단백질 또는 인공 표면 구조물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 측면에 따르면, 표적은 인간 세포, 예를 들어, 건강하거나 병든 대상체로부터 유래하는 세포, 또는 각각의 세포 용해물이다. 병든 표현형의 인간 세포는 바람직하게는 표적으로서 사용된다.
특정 측면에 따르면, 표적 결합 부위는 신규한 표적, 즉 그렇지 않으면 자연 발생 ED 또는 EV 표면 단백질에 의해 결합되지 않을 표적을 특이적으로 인식한다.
또 다른 측면에 따르면, 표적 결합 부위는 ED 또는 EV 표면 단백질의 천연 리간드이지만, 예를 들어, 개선된 표적 결합에 대해 변형된 결합 특성, 예를 들어, 선택성, 미세한 특이성, 친화성 및/또는 결합성을 갖는 표적을 특이적으로 인식한다. 예를 들어, 테트라스파닌의 천연 리간드는, 예를 들어, 병원체의 항원 또는 세포 병원체 또는 바이러스와 같은 병원체이다. 본원에 기재된 바와 같은 TED, TSP 또는 TEV에 의해 표면 단백질로 제시된 테트라스파닌의 3차 구조를 변형함으로써, 결합 특성은, 예를 들어, 각각의 병원체를 표적으로 하는 결합의 증가된 선택성 및/또는 친화성을 달성하기 위해 개선될 수 있다.
구체적으로, 표적은 항원 또는 항원의 항원성 구조, 특히 표적-특이적 항체에 의해 달리 인식되는 에피토프로 구성된다.
구체적으로, 표적은 세포 수용체이다. 특정예에 따르면, 세포 수용체를 표적으로 하는 본원에 기술된 TED 또는 TSP를 포함하는 EV는 수령자 세포막과 직접 융합할 수 있으며, 따라서 막 단백질을 원형질막에 통합하고 화물을 수령자 세포의 의 세포질로 전달할 수 있다.
구체적으로, 표적은 항원, 예를 들어, 자연 발생 항원 또는 합성 항원이다. 특정 구현예에서, 표적 항원은 병에 걸린 환자의 혈액에 존재하며, 이 항원은 EV의 표면 단백질에 의해 결합되어 환자의 심혈관계 및/또는 림프계로부터 제거된다. 특정예는 병원체, 독소, 병에 걸린 또는 암 세포, 사이토카인 또는 대사 산물과 같은 원치 않는 천연 제제이다. 특정의 추가 구현예에서, 표적 항원은, 예를 들어, 이식편 또는 임플란트와 같은 고체 표면, 또는 본원에 기재된 특정 결합제(예: TED, TSP 또는 TEV)에 의해 효과적인 결합시 제거될 수 있는 화학 물질 또는 합성 화합물과 같은 가용성 화합물의 합성 항원이다.
특이적 표적은 전형적으로 야생형 EV에 의해 인식되는 천연 표적일 수 있다. 그러나, 본원에 기재된 결합제에 포함된 표적 결합 부위는 달리는 야생형 EV에 의해 인식되지 않는 신규한 표적을 특이적으로 인식할 수 있다. 천연 표적 중에는 바이러스 항원과 같은 병원체가 있다. 본원에 기재된 특정 결합제(예: TED, TSP 또는 TEV)는 결합 친화성, 결합성 또는 특이성과 같은 개선된 결합 특성을 가질 수 있는 신규한 결합 부위를 통해 이러한 천연 표적에 결합할 수 있다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은 포유류 EV 표면 단백질 서열의 야생형 ED에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 포함하고, N-말단 및 C-말단에서 야생형 ED 서열의 영역이 측면에 있는 3-20개의 연속 아미노산 길이를 갖는 적어도 하나의 변형된 영역을 포함하며 이 변형된 영역이 야생형 ED에서 자연적으로 발생하지 않는 표적 결합 부위의 적어도 일부인 적어도 하나의 소포외 도메인(ED) 및 적어도 하나의 막관통 도메인을 포함하는 표적-특이적 EV 표면 단백질(TSP)을 제공하며, 여기서 TSP는 본원에 추가로 기재된 바와 같이 특성화된다.
구체적으로, 변형된 영역은 TSP로부터 단리될 때 더 낮은 표적 결합 친화성을 갖는다.
구체적으로, 본원에 기재된 TSP는 하나 이상의 소포외 도메인을 특징으로 하며, 여기서, 그들 중 적어도 하나는 표적 결합("표적-특이적")이다. 구체적으로, 기재된 TSP의 ED는 본원에 기재된 TED이다.
구체적으로, 상기 적어도 하나의 막관통 도메인은 소포 막 단백질, 또는, 예를 들어, 야생형 막관통 도메인의 돌연변이 유발 또는 적합한 아미노산 서열의 새로운 합성에 의해 생산된 인공 막관통 도메인의 것이다.
구체적으로, 막관통 도메인(TM)은 포유류 EV 표면 단백질, 예를 들어, 본원에 추가로 기재된 바와 같은 EV 표면 단백질 중 임의의 것에서 유래하는 각각의 야생형 막관통 도메인 서열에 대해 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 977%, 98%, 99% 서열 동일성 중 적어도 어느 하나 또는 100% 서열 동일성을 포함한다.
구체적으로, 야생형 TM은 인간 또는 비인간 동물 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 것과 같은 포유류 EV 표면 단백질의 것이다.
구체적으로, TM은 엑소좀, 미세소포 또는 세포자멸체 기원의 것인 소포 막 단백질, 특히 야생형 엑소좀, 미세소포, 세포자멸체 단백질, 또는, 예를 들어, 소포외 영역에 변형을 포함하는 이러한 야생형 단백질의 것이다.
구체적으로, 야생형 TM은 EV 표면 단백질을, 특히 인간 EV 표면 단백질의 각각의 세포 또는 소포에 결합할 때 세포 또는 소포 막 내에 통합될 수 있는 EV 표면 단백질의 야생형 서열에 포함되거나 이로 구성되는 TM 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 90, 95, 98, 99% 서열 동일성 중 적어도 어느 하나를 포함하거나 100% 서열 동일성을 포함한다.
구체적으로, 막관통 도메인은 다음 중 어느 하나의 것이다:
a) CD81, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 147, 서열번호 148, 서열번호 149 또는 서열번호 150으로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
b) CD9, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 151, 서열번호 152, 서열번호 153 또는 서열번호 154로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
c) CD53, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 155, 서열번호 156, 서열번호 157 또는 서열번호 158로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
d) TSPAN32, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 159, 서열번호 160, 서열번호 161 또는 서열번호 162로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
e) CD82, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 163, 서열번호 164, 서열번호 165 또는 서열번호 166으로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
f) CD63, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 167, 서열번호 168, 서열번호 169 또는 서열번호 170으로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
g) CD 151, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 171, 서열번호 172, 서열번호 173 또는 서열번호 174로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고;
h) CD37, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177 또는 서열번호 178로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성되고; 또는
i) LAMP2, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 179로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
구체적으로, TM의 서열은 EV 표면 단백질을 표시하는 EV 또는 막관통 도메인의 영역을 결정하는 방법에 따라 TM이 다수의 아미노산, 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산에 의해 연장되거나 단축되도록 한쪽 또는 양쪽 말단에서 다를 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 야생형 ED 및 상기 적어도 하나의 막관통 도메인은 둘 모두 동일한 포유류 EV 표면 단백질로부터 유래하며, 바람직하게는 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다:
a) 서열번호 87로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD81;
b) 서열번호 89로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD9;
c) 서열번호 90으로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD53;
d) 서열번호 91로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TSPAN32;
e) 서열번호 92로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD82;
f) 서열번호 93으로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD63;
g) 서열번호 94로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD151;
h) 서열번호 95로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CD37; 및
i) 서열번호 96으로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 LAMP2.
구체적으로, EV 표면 단백질은 엑소좀, 미세소포 또는 세포자멸체 기원인 소포 막 단백질, 특히 야생형 엑소좀, 미세소포, 세포자멸체 단백질, 또는, 예를 들어, 소포외 영역에 변형을 포함하는 이러한 야생형 단백질이다.
구체적으로, EV 표면 단백질은 세포 엑소좀에서 유래하는 단백질, 즉 엑소좀 단백질이다.
구체적으로, EV 표면 단백질은 세포 미세소포에서 유래하는 단백질, 즉 미세소포 단백질이다.
구체적으로, EV 표면 단백질은 세포자멸체에서 유래하는 단백질, 즉 세포자멸체 단백질이다.
변형 목적으로 본원에 사용되는 엑소좀 단백질, 미세소포 또는 세포자멸체 단백질은 세포 기원, 즉 각각의 세포에 의해 생산될 수 있거나 인공적일 수 있고 새로운 합성에 의해 생산될 수 있다는 것이 충분히 이해되고 있다.
구체적으로, 상기 EV 표면 단백질은 인공 표적 결합 부위를 포함하는 구조를 갖는 폴리펩티드, 단백질 도메인 또는 단백질이다. 이러한 폴리펩티드, 단백질 도메인 또는 단백질은 자연적으로 발생하거나 부분적으로 또는 완전히 합성적일 수 있다.
구체적으로, 하나 또는 두 개의 막관통 도메인은 표면 단백질의 ED에 융합되고, ED를 EV의 막에 부착시킬 수 있다.
특정 측면에 따라, 본 발명은 지질 이중층 막 및 본원에 기재된 TED 또는 본원에 기재된 TSP를 포함하는 표적-특이적 세포외 소포(TEV)를 제공하여 지질 이중층 막의 외부 표면에 표적 결합 부위를 표시한다.
구체적으로, 본원에 기재된 TED는 본원에 기재된 TSP 또는 임의의 다른 적합한 수단을 통해, 예를 들어, 접합, 융합 또는 친화성 결합을 통해 EV에 결합될 수 있다.
구체적으로, 본원에 기재된 TSP는 TSP에 포함된 상기 적어도 하나의 막관통 도메인을 통해 EV에 결합될 수 있고, 특히 여기서 상기 막관통 도메인(들)은 소포 막에 존재하여 TSP가 EV의 외부 표면에 TED 및 임의로 적어도 하나의 추가 ED(이는 표적 결합일 수 있거나 아닐 수 있다)를 제시하도록 한다.
구체적으로, 상기 적어도 하나의 막관통 도메인은 본원에 기재된 TED를 포함하는 임의의 종류의 표적 결합분자, 예를 들어, 본원에 기재된 TSP에 융합될 수 있는 앵커로서 작용한다.
구체적으로, TSP는 적어도 2개, 3개 또는 4개의 막관통 도메인, 바람직하게는 동일한 야생형 EV 표면 단백질의 모든 막관통 막을 포함한다.
구체적으로, 하나 이상(예: 동일한 유형 또는 상이한) 단백질의 일련의 하나 이상의 막관통 도메인 또는 인공 막관통 도메인이 사용될 수 있으며, 이에 의해 소포외 루프 영역, 즉 EV 외부의 루프 구조를 생성할 수 있다. 구체적으로, 적어도 하나의 루프 구조를 고정하는 데 사용되는 막관통 도메인의 수는 2, 3 또는 4이다. 구체적으로, 표면 단백질은 하나 이상의 루프, 예를 들어, 적어도 1, 2, 3 또는 4개의 루프를 포함한다. 그러나, 특정 경우에, 표면 단백질은 루프가 없는 3차 구조를 포함한다.
구체적으로, 2개의 막관통 도메인을 사용하여 본원에 기재된 TSP를 포함하는 EV의 표면에 하나의 소포외 루프 구조를 제시한다. 특정 구현예에 따르면, 3개 또는 4개의 막관통 도메인이 2개의 소포외 루프 구조를 제공하는 데 사용되고, 4개 또는 5개의 막관통 도메인이 3개의 소포외 루프 구조를 제공하는 데 사용된다. 구체적으로, 본원에 기재된 하나의 TSP 내에서, 하나의 막관통 도메인은 루프 구조, 예를 들어, 상기 막관통 도메인을 다른 막관통 도메인에 스패닝하거나 하나 이상의 분자내 결합을 포함하는 루프 구조, 예를 들어, 루프 또는 줄기 구조를 안정화시키는 것들을 소포 표면에 연결하는 아미노산 서열이 뒤따른다. 루프 구조는, 예를 들어, 펩티드 루프 서열의 N-말단 또는 C-말단 융합에 의해 소포 막에 결합되도록 하기 위해 적어도 하나의 막관통 도메인이 측면에 있을 수 있음이 이해 된다. 하나의 막관통 도메인만이 측면에 있는 경우, 반대쪽 말단(막관통 도메인과의 융합에 대향하는 루프 서열의 N- 또는 C-말단)은 전형적으로 막에 고정되지 않는다, 예를 들어, 느슨한 말단이다. 2개의 막관통 도메인, 예를 들어, 막관통 도메인에 대한 펩티드 루프 서열의 N-말단 및 C-말단 융합 둘 다가 측면에 있는 경우, 루프 구조는 양 측면에서 EV 막에 고정된다.
구체적으로, TSP는 하나 이상의 루프 서열을 스패닝하는 다수의 막관통 도메인, 특히 EV 표면에 테트라스파닌 단백질의 야생형 루프 구조, 특히 4개의 막관통 도메인에 의해 고정된 2개의 혈관외 루프를 제시할 수 있는 4개의 막관통 도메인을 포함하는 테트라스팬-유사 단백질이다.
구체적으로, TEV는 신체 조직, 체액 또는 세포 배양물의 진핵 또는 원핵 공급원 세포에서 유래한다.
특정 구현예에 따르면, TEV는 소포내 로드를 운반하고, 예를 들어, 여기서 로드는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 도메인, 단백질, 지질, 유전자, 핵산, 예를 들어, mRNA, miRNA, RNAi 매개 분자, 특히 록킹된 핵산 또는 포스포로티오에이트, DNA, DNA 단편, 플라스미드, 예를 들어, 미니서클 DNA, 약물, 예를 들어, 작은 분자, 특히 화학요법제 또는 세놀리틱스 중 임의의 하나 이상을 포함한다.
EV는 지질 이중층 막, 예를 들어, 엑소좀, 미세소포 또는 세포자멸체의 막을 포함하는 초현미경적 소포인 막 소포일 수 있다. 구체적으로, EV는 세포에 의해 생산되거나 합성적으로 생산된다. 세포에 의해 생산될 때, EV는 생물학적 과정에 의해 세포에 의해 세포외 공간으로 방출될 수 있으며, 표면 단백질은 세포 방출 전 또는 후에 조작된다. EV는, 예를 들어, 탄수화물 구조 및/또는 아미노산 또는 아미노산 서열과의 융합 및/또는 약물, 표지 또는 태그와 같은 화학적 화합물과의 결합에 의해 표면 장식될 수 있다.
구체적으로, 지질 이중층 막은 막 표면 단백질의 상기 적어도 하나의 막관통 도메인, 각각의 코딩 서열의 융합을 통해 또는 대안적으로 화학적 및/또는 친화성 결합에 의해 TED 또는 EV 표면 단백질(TSP)을 고정시킨다. 특정 경우에, 표면 단백질은 막관통 도메인과 같은 다른 수단에 의해 세포외 소포의 지질 이중층 막에 고정된다. 이러한 앵커는, 예를 들어, 스트렙타비딘-비오틴 또는 단백질 A-Fc 상호 작용과 같은 친화성 기반 상호 작용, 또는, 예를 들어, 말레이미드-비함유 시스테인과 같은 공유 기반 상호 작용을 포함할 수 있다. 앵커리지는, 예를 들어, 클릭-화학 결합을 통해 달성될 수 있다.
표면 단백질을 막에 결합하기 위한 예시적인 기술은 S-S 결합(이황화 브릿지), 아미노산 측쇄의 원자의 연결, 예를 들어, 클릭-화학에 의한 생체 접합에 의한 결합 또는 달리 공유 결합을 포함한다. 대안적인 기술은 표면 단백질을 막에 연결하기 위해 비오틴 및 아비딘과 같은 친화성 결합제를 사용한다.
특정 경우에, 하나 이상의 (인공) 표적 결합 부위는 본원에 기재된 TEV의 1개 또는 2개의 표면 단백질(동일한 단백질 또는 상이한)에 포함된다. 구체적으로, 2개의 상이한 표면 단백질은, 예를 들어, 동일한 또는 상이한 항원의 상이한 에피토프를 인식하기 위해 적어도 2개의 상이한 결합 부위를 생산하는 데 사용될 수 있다. 구체적으로, 본원에 기재된 TEV는 단일- 또는 이중특이적이거나 심지어 올리고 특이적일 수 있다.
특정 경우에, 본원에 기재된 TEV의 추가의 표적 결합 부위는 임의의 결합 구조로부터 유래할 수 있고, 예를 들어, 결합 부분을 갖는 항체 및 항체 단편 또는 복합체 분자를 포함하는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드로부터 유래될 수 있다. 구체적으로, 결합 부위는 항체의 항원 결합 부분, 또는 효소, 접착 단백질, 리간드 또는 수용체의 리간드 결합 부분 중 어느 하나의 결합 부위일 수 있고, 이 결합 부위는 결합 파트너의 동족 구조에 결합할 수 있다. EV 표면 단백질은 특히 항체 또는 항체 단편의 단백질 도메인의 하나 이상의 결합 부위, 또는 각각의 항체 도메인 또는 단편, 예를 들어, 하나, 둘 또는 그 이상의 가변 항체 도메인, 예를 들어, Fab, Fv, VH/VL 이량체, scFv, dAb, F(ab)2 또는 기타 생물학적 결합제, 예를 들어, 가용성 T-세포 수용체, 다르핀 등을 포함하는 것들을 포함할 수 있다.
CD81의 경우, 서열번호 7로 동정된 LEL, 또는 CD9의 경우 서열번호 118로 동정된 LEL과 같은 야생형 인간 테트라스파닌 단백질 LEL의 아미노산 서열에 대해 75, 80, 85, 또는 90% 서열 동일성 중 적어도 어느 하나, 바람직하게는 80 내지 90% 범위의 서열 동일성을 특징으로 하는 신규한 표적 결합 부위를 포함하는 변형된 테트라스파닌 단백질이 구체적으로 본원에 기재된다.
신규한 표적 결합 부위를 포함하는 변형된 테트라스파닌 단백질의 특정예는 CD81의 경우, 서열번호 87로 동정된 아미노산 서열, 또는 CD9의 경우 서열번호 89로 동정된 아미노산 서열과 같은 전장 야생형 인간 테트라스파닌 단백질의 아미노산 서열에 대해 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97 또는 98% 서열 동일성 중 적어도 어느 하나, 바람직하게는 90 내지 98% 범위의 서열 동일성을 특징으로 한다.
특정예에 따르면, 신규한 표적 결합 부위는 서열번호 7로 동정된 CD81의 LEL 내, 특히 서열번호 87로 동정된 전장 단백질의 영역 aa113-201 내에 변형된 영역(결합 영역)을 포함한다. 특정 구현예는 aa130-201 내에 신규한 표적 결합 부위를 지칭한다.
특정예는 위치 160-162 및 181-189에서 적어도 하나의 아미노산을 치환하기 위한 CD81의 아미노산 서열(서열번호 87)의 변형을 지칭한다.
추가의 특정 구현예에 따르면, EV 표면 단백질은 CD9이고, 결합 잔기는 다음 영역에서 선택된 적어도 하나 또는 두 개의 상이한 영역 내에 위치한다: 155-166; 128-142; 130-140; 169-180. 구체적으로, CD9는 서열번호 89에 의해 확인된 인간 CD9이다. 이황화 브릿지를 위한 바람직한 Cys 잔기는 132 및 140이고, 여기서 번호매김은 서열번호 89에 따른다.
추가의 특정 구현예에 따르면, EV 표면 단백질은 CD53이고, 결합 잔기는 다음 영역에서 선택된 적어도 2개의 상이한 영역 내에 위치한다: 147-160; 121-134; 123-129; 164-169. 구체적으로, CD53은 서열번호 90에 의해 확인된 인간 CD53이다.
추가의 특정 구현예에 따르면, EV 표면 단백질은 TSPAN32이고, 결합 잔기는 다음 영역에서 선택된 적어도 2개의 상이한 영역 내에 위치한다: 158-171; 130-144; 132-139; 174-183. 구체적으로, TSPAN32는 서열번호 91로 동정된 인간 TSPAN32이다.
추가의 특정 구현예에 따르면, EV 표면 단백질은 CD82이고, 결합 잔기는 다음 영역에서 선택된 적어도 2개의 상이한 영역 내에 위치한다: 153-172; 178-188; 128-137; 194-215. 구체적으로, CD82는 서열번호 92로 동정된 인간 CD82이다.
추가의 특정 구현예에 따르면, EV 표면 단백질은 CD63이고, 결합 잔기는 다음 영역에서 선택된 적어도 2개의 상이한 영역 내에 위치한다: 149-165; 171-176; 127-135; 179-189. 구체적으로, CD63은 서열번호 93에 의해 확인된 인간 CD63이다.
추가의 특정 구현예에 따르면, EV 표면 단백질은 CD151이고, 결합 잔기는 다음 영역에서 선택된 적어도 2개의 다른 영역 내에 위치한다: 159-177; 186-191; 135-145; 194-206. 구체적으로, CD151은 서열번호 94로 동정된 인간 CD151이다.
추가의 특정 구현예에 따르면, EV 표면 단백질은 CD37이고, 결합 잔기는 다음 영역에서 선택된 적어도 2개의 상이한 영역 내에 위치한다: 156-177; 183-206; 131-141; 218-229. 구체적으로, CD37은 서열번호 95로 동정된 인간 CD37이다.
EV 표면 단백질 또는 각각의 ED (또는 EV 표면 단백질에 포함된 막관통 도메인이 아닌 임의의 도메인)은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 신규한 표적 결합 부위를 도입하기 위해 소정의 영역에서 돌연변이 유발을 위해 사용될 수 있다.
신규한 표적 결합 부위를 포함하는 추가의 EV 표면 단백질은 각각의 영역을 돌연변이 유발함으로써 생산될 수 있다. 적합한 영역을 동정하기 위해, 테트라스파닌 부류 I(예: CD9, CD53 및 TSPAN32)의 큰 세포외 루프의 서열은 CD81과 같은 주형을 갖는 스위스모델(Swissmodel) 모델링 서버를 사용하여 분석했다. 테트라스파닌 부류 II를 대표하는 CD82의 큰 세포외 루프의 서열은 단백질 구조 및 기능 예측을 위한 프로그램(i-Tasser 모델링 서버)을 사용하여 모델링되었다. 테트라스파닌 부류 II(CD63, CD 151 및 CD37)의 서열은 CD82 모델 좌표를 사용하여 모델링되었다.
특정 구현예에 따르면, EV 표면 단백질(예: CD81 또는 임의의 다른 테트라스파닌)은 단백질의 소포외 루프 구조를 안정화시키는 하나 이상의 추가의 이황화 결합의 형성을 허용하는 위치(들)에 하나 이상의 시스테인(들)을 도입함으로써 안정화되거나 열 안정화된다. 구체적으로, 적어도 하나의 추가의 시스테인이 표면 단백질의 소포외 도메인의 적어도 하나의 영역에 도입된다. 구체적으로, 시스테인은 표면 단백질의 적어도 2개의 상이한 영역에 도입된다. 신규한 시스테인(들)을 도입하면 일반적으로 시스테인의 설프하이드릴(-SH) 그룹의 산화로부터 형성되는 신규한 (인공) 이황화 결합을 통해 영역의 연결을 가능하게 한다.
특히, 표면 단백질의 3차 구조는 하나 이상의 추가의 분자내 결합으로부터 발생하는 하나 이상의 추가의 작은 루프(들)에 의해 변형될 수 있다. 이러한 추가의 작은 루프(들)는 인공 결합 부위의 추가의 접촉점을 생성하는 데 사용될 수 있다.
하나 이상의 추가의 분자내 이황화 결합(들)은 표준 방법에 의해 단백질의 열 안정성을 결정하는 방법에 의해 측정된 바와 같이 표면 단백질의 안정성을 성공적으로 증가시켰다. 안정화된 EV 표면 단백질은 각각 상이한 표적 결합 또는 상이한 표적 결합 특성을 갖는 EV 표면 단백질 내의 소정의 영역의 돌연변이 유발에 의해 EV 표면 단백질의 레퍼토리를 생산하기 위한 스캐폴드로서 편리하게 사용될 수 있다. 이러한 레퍼토리는 관심있는 표적에 대한 결합제를 선택하기 위한 라이브러리로서 적합하게 사용된다.
구체적으로, 보증된 잔기의 수가 이론적으로 돌연변이되지 않은 단백질에 대한 자유 에너지 변화를 결정짓기 때문에, 시스테인의 쌍으로의 돌연변이 유발 및 시스테인 결합의 후속적 형성을 위한 후보 위치는 결정 구조의 육안 검사로 제 1단계에서 미리 선택될 수 있다. 구체적으로, 적어도 하나의 신규한 시스테인 결합은 미리 선택된 후보에 도입되고, 바람직하게는 신규한 시스테인 결합은 돌연변이 유발을 통해 적어도 하나 또는 한 쌍의 시스테인의 도입으로 생성된다.
구체적으로 바람직한 예는 환원될 때 Cys 잔기를 연결하는 신규한 이황화 결합을 포함하는 변형된 테트라스파닌을 지칭하며, 이 Cys 잔기는, 예를 들어, 루프의 N- 및 C-말단에 있는 2개의 먼 부위에서 테트라스파닌 서열(예: EC 중 하나, 특히 테트라스파닌의 LEL)을 돌연변이시킴으로써 도입되어 루프 구조를 안정화시킨다. 적어도 하나의 이황화 결합에 의해 안정화된 임의의 이러한 루프 구조는 바람직하게는 이러한 루프 구조 내에서 신규한 표적 결합 부위를 조작하기 위한 테트라스파닌을 돌연변이유발하는 데 사용된다.
구체적으로, 적어도 2개의 시스테인은 삽입 또는 치환 중 어느 하나에 의해 도입된다. 특정예에 따르면, LEL의 3차 구조를 안정화시키고/시키거나 변형시키기 위해 추가의 시스테인이 CD81에 도입된다.
특정 구현예에 따르면, EV 표면 단백질은 CD81이고, 아미노산 서열은 시스테인을 도입하도록 변형되어 야생형 ED 서열, 바람직하게는 위치 134와 144 사이 및/또는 위치 130과 146 사이 및/또는 위치 135와 168 사이에서 자연적으로 발생하지 않는 하나 이상의 이황화 결합의 형성을 허용한다.
구체적으로, CD81은 인간 CD81이고, 제1 시스테인은 아미노산 120 및 200 내의 위치에 도입되고, 적어도 제2 시스테인은 아미노산 143 및 201 내의 위치에 도입되며, 여기서 번호매김은 서열번호 87로 동정된 인간 CD81의 것이다.
구체적으로, 제1 시스테인은 아미노산 130 및 140 내의 위치에 도입되고, 제2 시스테인은 아미노산 144 및 170 내의 위치에 도입된다.
구체적으로, 시스테인이 위치 134 및 144에서 인간 CD81 서열(특히, LEL과 같은 CD81의 ED)에 도입되어 각각 A134C 및 L144C를 대체함으로써 추가의 분자내 이황화 결합에 의해 CD81의 LEL의 나선 A와 나선 B를 연결한다. 대안적으로, 추가의 시스테인이 각각 위치 135 및 168에 도입되어 각각 V134C 및 S144C를 대체함으로써 추가의 분자내 이황화 결합에 의해 CD81의 큰 세포외 루프의 나선 A와 나선 C를 연결한다.
특정 구현예에 따르면, Cys 잔기는, 예를 들어, 돌연변이 Ala134Cys 및 Lys144Cys에 의해 서열번호 87로 동정된 CD81 서열(LEL과 같은 CD81의 ED)에 도입되어 위치 134와 144에 시스테인을 스패닝하는 신규한 이황화 결합을 도입한다.
추가의 구현예에 따르면, (추가의 또는 대안적인) Cys 잔기는 돌연변이 Val135Cys 및 Ser168Cys에 의해 서열번호 87로 동정된 CD81 서열에 도입되어 위치 135 및 168에 시스테인을 스패닝하는 신규한 이황화 결합을 도입한다. 추가의 구현예에 따르면, (추가의 또는 대안적인) Cys 잔기는 돌연변이 Ala130Cys 및 Ala146Cys에 의해 서열번호 87로 동정된 CD81 서열에 도입되어 위치 130 및 146에 시스테인을 스패닝하는 신규한 이황화 결합을 도입한다.
추가의 구현예에 따르면, (추가의 또는 대안적인) Cys 잔기는 돌연변이 Val135Cys 및 Ser168Cys에 의해 서열번호 87로 동정된 CD81 서열에 도입되어 위치 135 및 168에 시스테인을 스패닝하는 신규한 이황화 결합을 도입한다.
구체적으로, 인간 CD81의 ED 중 적어도 하나, 특히 LEL은 위치 134 및 144, 및 위치 135 및 168에 추가의 시스테인을 도입하도록 변형되어 나선 B에 나선 A를 연결하고, 나선 C에 나선 A를 연결한다. LEL에서 신규한 이황화 결합 Ala134Cys/Lys144Cys 및 Val135Cys/Ser168Cys를 강력하게 안정화시키는 조합을 갖는 이러한 CD81 돌연변이체는 적어도 20℃의 용융 온도에서 증가된 양(positive)의 이동을 나타낸다.
구체적으로, 인간 CD9의 ED 중 적어도 하나, 특히 LEL은 추가의 시스테인을 도입하도록 변형되어 하나 이상의 신규한 (추가의) 이황화 브릿지를 수득한다. 바람직하게는, 이황화 브릿지는 Lys20Cys 및 Arg28Cys를 돌연변이시킴으로써 수득 가능한 것과 같이 위치 20 및 28을 연결하고, 여기서 위치의 번호매김은 CD9 LEL(서열번호 118)의 것이다. 안정화된 변이체의 생산된 서열은 구체적으로 서열 125를 포함하거나 이로 구성된다.
구체적으로, 돌연변이된 사전 선택된 후보의 열 안정성의 증가는 야생형 단백질과 비교하여 열적 전개가 발생하는 온도의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 55℃ 증가로 나타난다.
구체적으로, 본원에 기재된 TED, TSP 또는 TEV 중 어느 하나는 10-5M 미만, 바람직하게는 10-6M, 10-7M 또는 10-8M 미만, 또는 심지어 10-9M 미만의 KD로 상기 표적에 결합하는 친화성을 갖는다.
일반적으로, 결합제는 KD<10nM인 고친화성 결합제로 간주되고, 일부 경우에, 예를 들어, 치료 목적을 위해, 더 높은 친화성, 예를 들어, KD<1nM, 또는 KD<0.1nM, 또는 KD<0.01nM 또는 KD<pM(피코몰= 10-12M)을 갖는 EV가 제공된다.
선택된 TED, TSP 또는 TEV가 관심 있는 표적에 결합하는 것으로 입증되면, 선택된 결합 ED 또는 EV 표면 단백질은 표준 친화성 성숙 방법, 예를 들어, 친화성 성숙된 항체를 생산하기 위해 전형적으로 사용되는 방법에 의해 친화성 성숙을 거칠 수 있다. 이 목적을 위해, 몇몇 점 돌연변이, 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개, 최대 10개의 점 돌연변이가 분자의 한 영역 내에 또는 전체 분자 내에 도입되어 증가된 결합 친화성을 갖는 결합제를 단리시키기 위해 선택될 수 있는 표적 결합제의 새로운 레퍼토리를 생산할 수 있다. 이러한 친화성 성숙된 결합제는 적어도 1 또는 2log의 KD 차이를 갖는 증가된 결합 친화성을 나타낼 수 있다.
특이적 결합은 통상적인 면역검정과 같은 적합한 결합 검정에서 결정될 수 있다. 면역검정으로 결합을 검출하기 위한 당업계에 공지된 수많은 방법이 있다. 방사성 면역검정, ELISA(효소 결합 면역 흡착 검정), 면역 방사성 검정, 겔 확산 침전 반응, 면역 확산 검정, 웨스턴 블롯, BIAcore 등과 같은 기술을 사용하는 경쟁적 및 비경쟁적 검정 시스템을 포함하여 당업계에 공지된 다양한 면역 검정이 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 본원에 기재된 TEV는 진핵 또는 원핵 공급원 세포로부터 유래한다. 공급원 세포는 본원에서 본원에 기재된 EV를 생산할 수 있는 공여자 세포로 이해된다. 그러나, 공급원 세포는 또한, 예를 들어, 다르게는 공급원 세포에 의해 생산될 하나 이상의 성분(예: 막관통 도메인 및/또는 표면 단백질)을 사용하고 세포 수송 메카니즘에 의존하지 않고 본원에 기재된 특징을 갖는 TEV를 작제하여 시험관내에서 각각의 합성 EV를 생산하기 위한 주형의 역할을 할 수 있다.
예시적인 진핵 생물은 포유류, 식물, 곤충, 진균 또는 효모이다. 특정예는 차이니즈 햄스터 유래 세포, 예를 들어, CHO 세포, 식물, 특히 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 또는 제아 메이스(Zea mays), 또는 진균, 특히 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함하는 인간 또는 비인간 동물 기원, 특히 포유동물의 세포이다.
예시적인 원핵 생물은 박테리아이다. 그람 음성 박테리아의 EV는 외막 소포(OMV)로 공지되어 있다. 구체적인 예는 락토바실러스(Lactobacillus) 또는 미코박테리아(Mycobacteria) 병원체, 또는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis), 모라셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 또는 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)의 EV이다.
구체적으로, 공급원 세포는 신체 조직, 체액 또는 세포 배양물, 바람직하게는 동물 또는 식물 세포; 또는 포유류 체액 또는 조직의 것, 바람직하게는 혈액, 소변, 양수, 복수, 뇌척수액, 타액, 활액 또는 골수의 것이다. 구체적으로, 본원에 기재된 EV는 공급원 세포의 세포 배양물에 의해 생산된다.
구체적으로, 조직은 신장, 뇌와 같은 기관의 것, 또는 태반의 것이다. 구체적으로, 조직은 종양 또는 전이 조직 또는 양성 조직이다.
구체적으로, 공급원 세포는 줄기 세포, 예를 들어, 중간 엽 줄기 세포(MSC), 양수 줄기 세포, 또는 유도된 만성 줄기(iPS) 세포, 수지상 세포, 조혈 세포, 상피 세포, 내피 세포, 신경 세포, 혈액 세포 또는 면역 세포이다. 구체적으로, EV의 공급원 세포는 양막 유래 다능성 전구 세포, 융모막 유래 중간 엽 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포, 각질 세포, 섬유아세포, 배아 줄기 세포, 외배엽 기질 세포, 내배엽 기질 세포, 후각 포위 세포, 치아 펄프 줄기 세포, 또는 불멸화된 중간 엽 줄기 세포일 수 있다.
구체적으로, 공급원 세포는 정상 또는 불멸화된 인간 세포, 예를 들어, 유도된 만능 또는 성체 줄기 세포, 상피 세포 및 암 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
구체적으로, 공급원 세포는 포유류 숙주 세포와 같은 재조합 숙주 세포의 세포주, 예를 들어, 인간 1차 세포와 같은 세포 공장으로 사용되는 세포주, 텔로머라제 불멸화된 세포주, 또는 아데노바이러스 E1A, HPV 유래 E6, EVB 유래 종양 유전자, SV40 또는 전사 인자의 조합을 포함하는 바이러스 종양 유전자에 의해 불멸화된 세포주이다. 구체적으로, 텔로머라제 불멸화된 내피 또는 중간 엽 줄기 세포, HEK293, CHO, Vero, HEK 또는 CAP를 포함하는 세포주.
대규모 EV 생산에 적합하게 사용되는 세포는 중간 엽 줄기 세포, 수지상 세포 및 HEK 세포 또는 293T 세포를 포함한다.
구체적으로, 공급원 세포는 포유류 줄기 세포 또는 수지상 세포, 바람직하게는 인간 기원이다.
특정 구현예에 따르면, EV 표면 단백질은 공급원 세포에 대해 내인성이다. 그러나, 내인성 EV 표면 단백질은 전형적으로 본원에 기재된 TEV에 의해 변형된 표면 단백질로서 제시된다.
추가의 특정 구현예에 따르면, EV 표면 단백질은 공급원 세포에 대해 이종성이다. 이종성 EV 표면 단백질은 다른 유형의 공급원 세포에서 유래하거나 자연적으로 발생하지 않는 합성 표면 단백질일 수 있다. 합성 표면 단백질을 사용할 때, 신규한 표적 결합 부위는 임의의 추가 변형 없이 분자 내에서 합성될 수 있다. 변형된 천연 표면 단백질과 달리, 합성 표면 단백질은 전형적으로 천연 (야생형) 표면 단백질에 대해 서열 동일성(예: 50% 미만의 서열 동일성)을 갖지 않는다.
구체적으로, 본원에 기재된 TEV는 10 내지 1000nm, 바람직하게는 30 내지 150nm 범위의 크기를 갖는다.
구체적으로, 본원에 기재된 TEV는 밀도-구배 초원심분리에 의해 측정되는 것과 같이 1.0 내지 1.4, 바람직하게는 1.1 내지 1.2(g/cm3) 범위의 부력 밀도를 갖는다.
특정 구현예에 따르면, 본원에 기재된 TEV는 소포내 로드를 운반한다. 구체적으로, 로드는 10-14 내지 10-10μl의 용적(1EV당 용적) 내이다. 구체적으로, 로드는 활성 물질 또는 활성 물질의 혼합물을, 예를 들어, 5 내지 90%의 로딩 효율(loading efficiency)로 포함한다.
특정 구현예에 따르면, 본원에 기재된 결합제(특히, 본원에 기재된 TED, TSP 또는 TEV)는 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 있어서 의학적 용도로 제공된다. 의학적 용도는 본원에 기재된 TEV를 투여함으로써 또는, 예를 들어, 체액으로부터 원하지 않는 물질을 퍼징하기 위한 시약 또는 친화성 매트릭스로서 생체외 사용하여 질환 상태의 요법을 위한 치료를 포함한다. 추가의 의학적 용도는 면역 반응을 유발하기 위한 것, 예를 들어, 활성 면역 요법을 위한 대상체의 면역계에 항원을 제시하는 것이다.
EV는 자체적으로 치료제로 사용되거나 특정 로드를 전달하는 전달 시스템으로 사용될 수 있다. 특정예에 따르면, 소포내 로드는 소포 막 내에 캡슐화된 활성 물질 또는 약물이다. 구체적으로, EV에 자연적으로 존재하는 요소와 협력하여 작용하는 활성 물질이 사용된다. 또 다른 특정예에 따르면, EV는 특정 표적에 도달하기 위한 비히클 역할만 하며, 때로는 통상적인 투여 경로로부터 매우 보호된다.
구체적으로, 본원에 기재된 결합제는 화장품, 식품 또는 산업적 목적으로 제공된다. 특정 구현예는 지질 또는 유성 조성물에 제공되거나, 예를 들어, 화장품 또는 식품 목적을 위해 캡슐화된 이러한 TEV를 지칭한다. 산업적 목적은 각각 특정 결합제(산업적 규모)를 분석하거나 제조하는 것과 같은 분석 또는 제조 목적을 포함한다.
구체적으로, TEV는 상기 화합물에 의한 표적화 요법을 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 있어서 표적화 벡터로서의 의학적 용도를 위해 자가 또는 이종성 활성 물질, 특히 이종성 화합물을 포함하는 로드를 운반한다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은, 예를 들어, 특정 상태, 특히 질환 상태를 개선하거나 검출하는 것과 같은 치료 또는 진단 목적으로 본원에 기재된 결합제, 특히 본원에 기재된 TEV 또는 TEV 제제의 유효량을 상기 대상체에게 투여함으로써, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 유효량의 TEV가 사용되며, 여기서 투여량은 투여된 소포내 로드에 따라 측정된다.
구체적으로, 로드는 적어도 하나의 자가 또는 이종성 화합물을 포함한다. 구체적으로, 로드는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 도메인, 단백질, 지질, 유전자, 핵산, 예를 들어, mRNA, miRNA, RNAi 매개 분자, 특히 록킹된 핵산 또는 포스포로티오에이트, DNA, DNA 단편, 플라스미드, 예를 들어, 미니서클 DNA, 약물, 예를 들어, 작은 분자, 특히 화학요법제 또는 세놀리틱스 중 임의의 하나 이상을 포함한다.
작은 분자 약물은 본원에서 생물학적 과정을 조절할 수 있는 저분자량(<900 D) 유기 화합물로서 이해된다. 작은 분자는 다양한 생물학적 기능 또는 적용을 가질 수 있으며, 세포 신호전달 분자, 의학의 약물, 농업용 살충제 및 기타 여러 역할을 한다. 이러한 화합물은 천연(예: 2차 대사 산물) 또는 인공적(예: 항바이러스성 또는 화학요법 약물)일 수 있고; 그들은 질환에 대해 유익한 효과를 가질 수 있거나(예: 약물), 해로울 수 있다(예: 기형 발생 물질 및 발암 물질).
특정 측면에 따르면, TEV는 상기 대상체에 대해 자가인 공급원 세포에서 유래한다. 구체적으로, 자가 기원의 TEV가 사용되며, 이는 대상체의 필요에 따라 생체 내 투여를 위해 시험관내(대상체의 신체 외부)에서 변형되고/되거나 로딩된다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은 단리된 TEV를 포함하는 TEV 제제를 제공한다. TEV 제제는 동일한 표적 특이성을 갖는 적어도 50% EV, 바람직하게는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 적어도 어느 하나로 구성되는 균질한 EV 집단을 특징으로 한다.
특정 측면에 따르면, TEV 제제는 중간 크기가 100 내지 150nm 또는 120 내지 140nm인 균질한 제제이다. 특정 수율은 바람직하게는 공급원 세포당 적어도 1000 EV, 더 바람직하게는 공급원 세포당 적어도 1500 EV, 또는 적어도 1600 EV이다.
구체적으로, TEV 제제는 저장 안정한 수용액 또는 동결 건조된 제제로 제공된다.
본 발명은 또한 바람직하게는 피내, 피하, 정맥내, 국소 또는 경구 사용을 위한 제형으로 본원에 기재된 임의의 TED, 또는 TSP 또는 TEV, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제제를 제공한다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은 N-말단 및 C-말단에서 야생형 ED 서열의 영역이 측면에 있는 3-20개의 연속 아미노산 길이를 갖는 적어도 하나의 변형된 영역 내에서 ED 아미노산 서열의 돌연변이를 수득하기 위한 돌연변이 유발 방법에 의해 세포외 소포(EV) 표면 단백질의 소포외 도메인(ED)을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 변형시켜 ED 내에 표적 결합 부위를 통합하여 각각 상이한 표적 결합 부위를 포함하는 다양한 표적-특이적 소포외 도메인(TED)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 레퍼토리를 생산하는 단계, 소정의 표적을 특이적으로 인식하는 TED를 포함하는 단백질을 선택하는 단계 및 선택된 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 소포외(EV) 표면 단백질의 표적-특이적 소포외 도메인(TED)을 포함하는 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 폴리뉴클레오티드의 레퍼토리는 외부 표면에 다양한 TED를 표시하는 유전자 패키지에 포함되며, 바람직하게는 효모, 파지, 박테리아, 리보솜, mRNA 또는 포유류 세포 디스플레이로 이루어진 그룹으로부터 선택된 디스플레이 시스템을 사용한다.
구체적으로, 선택된 TED를 포함하는 단백질은 본원에 기재된 TSP이다.
구체적으로, 선택된 TED는 본원에서 추가로 기재된 바와 같이 특성화된다.
본 발명은
a) 본원에 기재된 TSP를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 공급원 세포 또는 공급원 세포 혼합물에 도입하는 단계;
b) 세포외 소포를 생산하는 조건하에서 상기 세포(들)를 배양하는 단계;
c) TSP의 표적 결합 부위를 포함하는 TEV를 포함하는 분획을 단리시키는 단계; 및
d) 상기 분획에 포함된 TEV의 제제를 생산하는 단계를 포함하는 본원에 기재된 TEV 제제를 생산하는 방법을 추가로 제공한다.
구체적으로, 공급원 세포 또는 공급원 세포 혼합물은 대상체의 생물학적 샘플에서 수득된다.
구체적으로, 상기 대상체의 생물학적 샘플은 혈액, 소변, 양수, 복수, 뇌척수액, 타액, 활액 또는 골수로 이루어진 그룹에서 선택된다.
구체적으로, 공급원 세포는 세포 배양물에서 배양하기 전에 단리되거나 생물학적 샘플 내에서 배양된다.
구체적으로, 대상체는 인간 또는 비인간 동물을 포함하는 포유동물과 같은 동물이다.
추가의 특정 구현예에 따르면,
a) TEV 표면 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 유전자를 줄기 세포에 도입하는 단계;
b) 상기 줄기 세포를 세포외 소포를 생산하는 조건하에 배양하는 단계;
c) TEV를 포함하는 분획을, 예를 들어, 표적 결합 특이성에 따라 단리시키는 단계; 및
d) TEV 제제를 생산하는 단계를 포함하는, 대상체의 줄기 세포로부터 유래하는 본원에 기재된 TEV의 제제를 생산하는 방법이 제공된다.
구체적으로 줄기 세포는 세포 배양물에서 배양 전에 단리되거나 생물학적 샘플 내에서 배양된다.
특정 구현예에 따르면, EV는 중간 엽 줄기 세포(MSC)로부터 수득된다. MSC는 세포 배양물의 시험관내 증식에 의해, 예를 들어, 배아 줄기 세포 콜로니를 분산시켜 제조할 수 있다. MSC로부터 EV, 특히 엑소좀의 단리는 중간 엽 줄기 세포 조정된 배지에서 수행될 수 있다. 배지는 세포 배양 배지에서 MSC, 이의 후손 또는 이로부터 유래된 세포주를 배양하고 세포 배양 배지를 단리시킴으로써 수득될 수 있다.
구체적으로, 공급원 세포 또는 공급원 세포 혼합물은 대상체로부터 수득되고, TEV 제제는 자가 사용을 위해 제형화된다.
구체적으로 본원에는 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 자가 TEV 제제가 제공되며, 여기서 공급원 세포 또는 공급원 세포 혼합물은 대상체로부터 수득되고, TEV 제제는 동일한 대상체에게 투여된다.
특정 구현예에 따르면, TEV는 종양에 표적화될 수 있고, 로딩된 TEV는 상기 종양에서 직접 수득된 항원으로 로딩시 생산될 수 있다.
구체적으로, 공급원 세포 또는 공급원 세포 혼합물에 도입된 폴리뉴클레오티드 또는 유전자는 TSP를 인코딩하고, TSP의 ED는 TSP의 막관통 도메인 중 적어도 하나를 통해 EV의 표면에 결합된다.
특정 구현예에 따르면, TSP를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 유전자의 공급원 세포로의 도입은 형질 감염을 통해 달성될 수 있다. 구체적으로, 세포(들)는 배양 전에 상기 유전자로 형질 감염된다. 구체적으로, 코딩 유전자는 임의의 통상적으로 사용된 형질 감염 방법, 예를 들어, 전기 천공, 또는 siRNA와 같은 세포자멸사-유도제에 의한 형질 감염, 특히 리포좀 기반 형질 감염으로 세포에 도입된다.
특정 구현예에 따르면, 공급원 세포 또는 공급원 세포 혼합물은 막 소포를 생산 하고 TEV를 방출하는 조건하에 세포 배양물에서 배양되어 배양 상청액에서 TEV를 수득한다.
구체적으로, 세포 배양 조건은 상이한 공급원 세포 또는 공급원 세포를 포함하는 상이한 생물학적 샘플로 조정된다. 특정 측면에 따르면, 생물학적 샘플은 대상체의 생물학적 유체(골수, 말초 혈액 등), 배양 상청액, 세포 용해물, 예비 정제된 용액 또는 막 소포를 포함하는 임의의 다른 조성물로 구성된다. TEV 생산을 위한 특정 세포 배양 방법은 산화 스트레스를 유도하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 산화 스트레스는 외부에서 첨가된 사이토카인 또는 과산화수소와 같은 산화제에 의해 유발될 수 있다.
엑소좀은 또한 인공적으로 합성되거나 제조될 수 있다. 즉, 인간 또는 비인간 세포에서 단리되지 않는다. 단리되는 대신, 엑소좀은 다양한 지질 형성 기술로 합성될 수 있다.
구체적으로, 공급원 세포 또는 공급원 세포 혼합물은 바람직하게는 상기 소포를 소포내 로딩하여 상기 화합물을 운반하는 세포외 소포를 생산하는 조건하에 활성 물질, 예를 들어, 이종성 화합물을 포함하는 세포 배양물에서 배양된다.
구체적으로, 상기 소포내 로딩은 배양에 의해, 임의로 막을 파괴하거나, 로드를 막의 성분에 결합함으로써 이루어진다. 특히, TEV는 시약 기반 방법(인산칼슘, 폴리에틸렌이민, 양이온성 중합체, DEAE-덱스트란, 활성화된 덴드리머, 자기 비드) 또는 기기 기반 방법(전기 천공, 초음파 처리, 볼리스틱 기술, 미세주입, 레이저 감염, 광학주입)을 포함하는 임의의 적합한 형질감염 기술에 의해 로딩된다. 대안적으로, TEV는, 예를 들어, 막 지단백질에 결합하거나 이와 융합시킴으로써 화합물을 막에 결합시키거나 융합시킴으로써 로딩될 수 있다.
TEV의 로딩은 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 수행될 수 있다.
TEV는 세포외 소포를 생산하기 전 또는 후에 로딩될 수 있다.
구체적으로, 공급원 세포는, 예를 들어, 변형을 포함하는 TEV를 생산하기 위해 생물학적, 효소적 및/또는 화학적 반응을 사용하는 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들어, 표면 단백질 글리코실화(예: 시알릴화, 푸코실화 또는 아글리코실화)의 변형, 번역 후 변형 및/또는 화학적 화합물, 약물, 표지, 태그 또는 효소적(예: 효소 기질) 또는 화학적 반응 그룹의 결합에 의해 추가로 표면 장식될 수 있다.
TEV, 특히 미세소포 또는 엑소좀의 단리를 위해, 공급원 세포의 세포 배양 배지를 수집하고, 세포 및 파편을 미리 제거하고, 일련의 (초)원심분리 단계를 거친다. 후속적으로, 생산되는 TEV 펠릿은 일반적으로 수크로스 밀도 구배 원심분리를 거쳐 균질한 EV 집단을 분리한다. 구체적으로, 배양 상청액은 막 소포가 풍부하도록 처리된다. 특히, 막 소포 생산 세포 집단의 배양 상청액 또는 생물학적 샘플로부터 수득된 사전 정제된 용액은 원심분리, 정화, 한외 여과, 나노여과 및/또는 친화성 크로마토그래피와 같은 처리를 거친다.
세포 배양 배지 또는 상청액은, 예를 들어, 특히 접선 힘 여과(tangential force filtration) 또는 한외 여과를 사용하여 특정 다공성 크기 또는 특정 분자량 컷오프를 갖는 막을 통해 여과될 수 있다.
구체적으로, TEV 함유 분획은 단리되고, 임의로 친화성 리간드에 대한 결합, 원심분리, 크로마토그래피, 정화, 한외 여과 또는 나노 여과 중 임의의 하나 이상에 의해 농축된다.
특정 측면에 따르면, TEV를 제조하는 방법, 특히 생물학적 샘플로부터 정제하는 방법은 적어도 하나의 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함한다. 예를 들어, 셀룰로스, 폴리(스티렌-디비닐벤젠), 아가로스, 덱스트란, 아크릴아미드, 실리카, 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 공중합체, 또는 이들의 혼합물, 예를 들어, 아가로스-덱스트란 혼합물을 포함하는 상이한 유형의 음이온 교환 물질이 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 데 사용될 수 있다. 컬럼 상에 보유된 EV는, 특히 증가하는 농도의 식염수 용액 구배의 통로를 사용하여 상이한 방식으로 용출될 수 있다. 전형적으로, 이러한 방식으로 정제된 상이한 분획은 연속 분광광도계 판독을 사용하여 컬럼 출구에서 광학 밀도를 측정하여 검출된다.
대안으로서, 또는 음이온 교환 크로마토그래피 단계 이외에, 겔 투과 크로마토그래피가 사용될 수 있다. 전형적으로, 실리카, 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 공중합체 또는 이들의 혼합물, 예를 들어, 아가로스-덱스트란 혼합물로부터 선택된 물질은 겔 투과 크로마토그래피 단계를 수행하는 데 사용된다.
본 발명은 또한 각각 N-말단 및 C-말단에서 동일한 야생형 소포외 도메인(ED)의 동일한 영역이 측면에 있는 상이한 변형 영역을 갖는 본원에 기재된 102, 103, 104, 105 또는 106개의 TED 중 적어도 어느 하나 이상을 포함하는 TED 라이브러리를 제공한다.
바람직하게는, TED의 라이브러리는 각각 상이한 변형 영역 및/또는 표적 특이성을 갖는 적어도 임의의 102, 103, 104, 105, 또는 106개의 TED를 포함한다. 구체적으로, TED 라이브러리의 레퍼토리는 상이한 표적 특이성을 갖는 적어도 2x106, 107, 2x107, 108 또는 2x108개의 TED를 포함한다.
본 발명은 또한 각각 N-말단 및 C-말단에서 동일한 야생형 소포외 도메인(ED)의 동일한 영역이 측면에 있는 상이한 변형 영역을 갖는 본원에 기재된 102, 103, 104, 105, 또는 106개의 TSD 중 적어도 어느 하나 이상을 포함하는 TSP 라이브러리를 제공한다.
바람직하게는, TSD의 라이브러리는 각각 상이한 변형 영역 및/또는 표적 특이성을 갖는 적어도 임의의 102, 103, 104, 105, 또는 106개의 TSD를 포함한다. 구체적으로, TSD 라이브러리의 레퍼토리는 상이한 표적 특이성을 갖는 적어도 2x106, 107, 2x107, 108 또는 2x108개의 TSD를 포함한다.
본 발명은 또한 각각 N-말단 및 C-말단에서 동일한 야생형 소포외 도메인(ED)의 동일한 영역이 측면에 있는 상이한 변형 영역을 갖는 본원에 기재된 102, 103, 104, 105, 또는 106개의 TEV 중 적어도 어느 하나 이상을 포함하는 TEV 라이브러리를 제공한다.
바람직하게는, TEV의 라이브러리는 각각 상이한 변형 영역 및/또는 표적 특이성을 갖는 적어도 임의의 102, 103, 104, 105, 또는 106개의 TEV를 포함한다. 구체적으로, TEV 라이브러리의 레퍼토리는 상이한 표적 특이성을 갖는 적어도 2x106, 107, 2x107, 108 또는 2x108개의 TEV를 포함한다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은 또한 본원에 추가로 기재된 방법에 의해 생산된, 본원에 기재된 TED, TSP 또는 TEV와 같은 결합제의 라이브러리를 제공한다. 구체적으로, 임의의 이러한 라이브러리를 생산하는 방법은 ED 또는 EV 표면 단백질 내에 신규한 표적 결합 부위를 통합하기 위해 이의 N-말단 및 C-말단에서 야생형 ED 서열의 영역이 측면에 있는 3-20개의 연속 아미노산 길이를 갖는 적어도 하나의 소정의 변형 영역 내에서 상기 ED의 돌연변이를 수득하기 위한 돌연변이 유발 방법에 의해 EV 표면 단백질의 ED를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 돌연변유발시키는 단계를 포함한다.
본 발명은
a) 각각 상이한 표적 결합 부위를 포함하는 다양한 표적 특이적 EV 표면 단백질(TSP)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 레퍼토리를 제공하는 단계;
b) 상기 레퍼토리를 상기 공급원 세포(들)에 도입하는 단계; 및
b) 상이한 표적 결합 특이성을 갖는 표적-특이적 세포외 소포(TEV)의 레퍼토리를 포함하는 분획을 단리시켜 TEV의 라이브러리를 생산하는 단계를 포함하는, 표적-특이적 세포외 소포(TEV)의 라이브러리를 생산하는 방법을 추가로 제공하고,
여기서, 폴리뉴클레오티드의 레퍼토리는 ED 내에 표적 결합 부위를 통합하기 위해 이의 N-말단 및 C-말단에서 야생형 ED 서열의 영역이 측면에 있는 3-20개의 연속 아미노산 길이를 갖는 적어도 하나의 변형 영역 내에서 상기 EV 표면 단백질의 소포외 도메인(ED)의 돌연변이를 수득하기 위한 돌연변이 유발 방법에 의해 EV 표면 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 돌연변이유발하는 단계에 의해 생산된다.
구체적으로, 레퍼토리는 돌연변이 유발 방법에 의해 생산되어 ED의 적어도 소정의 영역 내에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 유전자를 변형하여 본원에 기재된 변형 영역을 생산할 수 있다. 구체적으로, 상기 돌연변이 유발 방법은 변형 영역 내에서 무작위화된 아미노산 서열을 수득하기 위해 적용된다. 구체적으로, 상기 돌연변이 유발 방법은 본원에 기재된 상기 ED 또는 EV 표면 단백질의 적어도 하나 또는 두 개의 멀리 떨어진 영역의 돌연변이 유발을 사용하여 각각 상이한 결합 특이성을 갖는 다양한 ED 또는 EV 표면 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 레퍼토리를 생산하고, 표적을 특이적으로 인식하는 TED 또는 TEV를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 선택한다. 구체적으로, 폴리뉴클레오티드의 레퍼토리는 세포외 소포의 외부 표면에 다양한 표면 단백질을 표시하는 유전적 패키지에 포함된다.
구체적으로, 본원에 추가로 기재된 디스플레이 패키지는, 예를 들어, 본원에 기재된 표면 단백질을 인코딩하는 복제 가능한 유전적 패키지에 사용되며, 여기서 디스플레이 패키지는 바람직하게는 엑소좀, 미세소포, 나노입자 및 리포좀으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 천연 또는 인공 기원의 세포외 소포에 표시된다.
임의로, TED 또는 TSP를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포 배양물에서 각각의 TED 또는 TSP를 생산하기 위해 및/또는 상기 TED 또는 TSP를 포함하는 각각의 TEV를 생산하기 위해 선택된다.
표면 단백질 또는 각각의 코딩 서열의 돌연변이 유발은, 예를 들어, EV 표면 단백질의 소정의 영역 내, 특히 EV 또는 세포의 외부 표면(즉, 표면 단백질의 소포외 또는 세포외 부분)에 제시될 수 있는 영역 내에 하나 이상의 점 돌연변이(들)를 도입하기 위해 EV를 사용하거나 사용하지 않고 수행될 수 있다.
구체적으로, 외부 표면에 다양한 표면 단백질을 표시하는 유전적 패키지에 포함된 폴리뉴클레오티드의 레퍼토리가 생산된다.
구체적으로, 디스플레이 패키지는, 예를 들어, 박테리오파지, 파지미드 및 세포 디스플레이 패키지, 바람직하게는 박테리아, 포유류 또는 곤충 세포 또는 효모로 이루어진 그룹으로부터 선택된 본원에 기재된 표면 단백질을 인코딩하는 복제 가능한 유전적 패키지, 또는 시험관내 디스플레이 시스템, 예를 들어, 리보솜 디스플레이 시스템이다. 이러한 시험관내 디스플레이 시스템은 관련된 결합 특이성 및 친화성을 나타내는 상응하는 단백질 서열로 핵산 정보를 특이적으로 번역한다. 구체적으로 바람직한 방법은 파지, 효모, 박테리아, 리보솜, mRNA 또는 포유류 세포 디스플레이로 이루어진 그룹으로부터 선택된 디스플레이 시스템을 사용한다.
특정예에 따르면, 본원에 기재된 ED 또는 EV 표면 단백질은 유전자 III, 유전자 VI, 유전자 VII, 유전자 VIII 또는 유전자 IX의 단백질 산물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 앵커 단백질을 통해 박테리오파지 또는 파지미드에 의해 표시될 수 있고, 여기서 유전자 III은 파지미드 또는 파지의 N-말단에 위치하기 때문에 종종 선호된다.
또 다른 특정예에 따르면, 본원에 기재된 ED 또는 EV 표면 단백질은, 예를 들어, Aga2 효모 표면 단백질에의 융합에 의해 단백질을 일상적으로 표시하는 효모에 의해 표시될 수 있다. 이것은 효모 디스플레이 라이브러리에 일상적으로 사용된다. 효모 세포에 대한 고정은 또한, 예를 들어, 단백질 A와 같은 고정 단백질의 공동 발현을 통해 달성될 수 있다. 대안적으로, 가용성 표면 단백질은 효모 세포로부터 분비될 수 있고, 단백질 A 또는 목적하는 표적 서열을 특이적으로 인식하는 항체의 외부 첨가에 의해 효모 세포 표면의 유도체화 후에 포획될 수 있다.
예를 들어, 상이한 결합 특성을 갖는 상이한 표면 단백질을 표시하는 일련의 디스플레이 패키지가 제공될 수 있다. 특히, 동일한 표면 단백질의 상이한 변형, 예를 들어, 표면 단백질의 인공 결합 부위 내의 상이한 변형을 표시하는 일련의 디스플레이 패키지가 제공되어 상이한 결합 특성을 갖는 단백질을 표시할 수 있다.
본원에 기재된 방법에서, 디스플레이 라이브러리는 디스플레이 라이브러리의 일련의 구성원이 표적 결합 특성에 따라 선택되도록 표적과 특이적으로 접촉된다. 표적을 인식하는 디스플레이 라이브러리의 구성원들 중, 하나 이상의 라이브러리 구성원은 높은 표적 특이성 및/또는 친화성을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 이러한 동정은 임의의 종류의 결합제를 선택하는 단계, 즉 결합 특이성에 따른 선택으로 구체적으로 이해될 수 있다.
특정 방법은 임의의 다음 방법 및 수단을 사용하여 결합 및 기능성 둘 모두에 따라 동시 선택을 허용한다: 형광 활성화 세포 분류(FACS)는 이러한 연구에 임의의 검출 항체와 결합된 임의의 적합한 표적 세포, 결합제 단백질, 또는 결합 또는 표현형 변화, 예를 들어, 세포자멸사를 등록하는 아넥신(Annexin) V와 같은 염료와 함께 일상적으로 사용된다. 임의의 유사하게 민감한 시스템은 고급 이미징 또는 현미경 감도의 광검출 시스템에 의해 표적 세포에 대한 결합 이벤트를 추적하고 특성화할 수 있다. FACS는 또한 결합제를 분별화하고 세포에서 상응하는 표현형 변화를 특성화하는 주요 기술이다.
추가로, 높은 처리량의 단백질체학 및 세포 생물학에도 사용되는 다양한 기술이 있으며, 이 중 고도로 자동화된 현미경 분석은 본 목적에 가장 유용한 것 중 하나이다. 샘플의 개별 세포를 로봇으로 분석하는 자동화된 높은 정보 함량 디지털 현미경법으로 개선을 달성할 수 있다.
적합한 결합제가 선택되면, 이의 코딩 서열을 사용하여 표면 단백질을 생산하거나 상기 TSP를 포함하는 융합 단백질, 예를 들어, 막관통 도메인과 상기 TED의 융합을 조작하고, 소포 및/또는 세포 막의 표면에서 이러한 단백질을 발현하는 재조합 세포를 생산하거나, 또는 그렇지 않으면, TSP를 포함하고/하거나 그 외부 표면에 TED를 제시하는 본원에 기재된 TEV를 생산할 수 있다.
특이적 표적 결합을 허용하는 조건하에서 레퍼토리를 표적과 접촉시키고, 입증된 표적 결합 특이성을 갖는 후보 결합제를 선택하고 단리함으로써, 본원에 기재된 라이브러리로부터 소정의 표적을 특이적으로 인식하는 후보 결합제를 선택하는 방법이 본원에 추가로 제공된다.
본원에 기재된 방법에서, 라이브러리는 표적이 라이브러리의 구성원에 의해 결합되도록 표적, 예를 들어, 표적 항원 또는 표적 세포와 특이적으로 접촉된다. 표적을 인식하는 라이브러리의 구성원 중에, 하나 이상의 라이브러리 구성원은 높은 표적 특이성 및/또는 친화성을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 이러한 동정은 임의의 종류의 결합제를 선택하는 단계, 즉 결합 특이성에 따르는 선택으로서 구체적으로 이해될 수 있다.
도 1: 본원에 사용된 서열.
서열번호 7, 야생형 인간 CD81 LEL의 아미노산 서열
서열번호 8, 야생형 인간 CD81 LEL의 뉴클레오티드 서열
서열번호 87, 인간 CD81의 아미노산 서열
서열번호 88, 인간 CD81의 뉴클레오티드 서열
서열번호 89, 인간 CD9의 아미노산 서열
서열번호 90, 인간 CD53의 아미노산 서열
서열번호 91, 인간 TSPAN32의 아미노산 서열
서열번호 92, 인간 CD82의 아미노산 서열
서열번호 93, 인간 CD63의 아미노산 서열
서열번호 94, 인간 CD151의 아미노산 서열
서열번호 95, 인간 CD37의 아미노산 서열
서열번호 96, 인간 LAMP2의 아미노산 서열
CD81, CD9, CD53, TSPAN32, CD82, CD63, CD151, CD37, LAMP2의 혈관외 도메인:
서열번호 130, 인간 CD81의 EC1
서열번호 131, 인간 CD81의 EC2
서열번호 132: 인간 CD9의 EC1
서열번호 182: 인간 CD9의 EC1
서열번호 133: 인간 CD9의 EC2
서열번호 134: 인간 CD53의 EC1
서열번호 135: 인간 CD53의 EC2
서열번호 136: 인간 TSPAN32의 EC1
서열번호 137: 인간 TSPAN32의 EC2
서열번호 138: 인간 CD82의 EC1
서열번호 139: 인간 CD82의 EC2
서열번호 140: 인간 CD63의 EC1
서열번호 141: 인간 CD63의 EC2
서열번호 142: 인간 CD151의 EC1
서열번호 143: 인간 CD151의 EC2
서열번호 144: 인간 CD37의 EC1
서열번호 145: 인간 CD37의 EC2
서열번호 146: 인간 LAMP2의 ED (EC)
CD81, CD9, CD53, TSPAN32, CD82, CD63, CD151, CD37의 4개의 막관통 도메인(TM1-4); LAMP2의 하나의 TM:
서열번호 147: 인간 CD81의 TM1
서열번호 148: 인간 CD81의 TM2
서열번호 149: 인간 CD81의 TM3
서열번호 150: 인간 CD81의 TM4
서열번호 151: 인간 CD9의 TM1
서열번호 152: 인간 CD9의 TM2
서열번호 153: 인간 CD9의 TM3
서열번호 154: 인간 CD9의 TM4
서열번호 155: 인간 CD53의 TM1
서열번호 156: 인간 CD53의 TM2
서열번호 157: 인간 CD53의 TM3
서열번호 158: 인간 CD53의 TM4
서열번호 159: 인간 TSPAN32의 TM1
서열번호 160: 인간 TSPAN32의 TM2
서열번호 161: 인간 TSPAN32의 TM3
서열번호 162: 인간 TSPAN32의 TM4
서열번호 163: 인간 CD82의 TM1
서열번호 164: 인간 CD82의 TM2
서열번호 165: 인간 CD82의 TM3
서열번호 166: 인간 CD82의 TM4
서열번호 167: 인간 CD63의 TM1
서열번호 168: 인간 CD63의 TM2
서열번호 169: 인간 CD63의 TM3
서열번호 170: 인간 CD63의 TM4
서열번호 171: 인간 CD151의 TM1
서열번호 172: 인간 CD151의 TM2
서열번호 173: 인간 CD151의 TM3
서열번호 174: 인간 CD151의 TM4
서열번호 175: 인간 CD37의 TM1
서열번호 176: 인간 CD37의 TM2
서열번호 177: 인간 CD37의 TM3
서열번호 178: 인간 CD37의 TM4
서열번호 179: 인간 LAMP2의 TM
추가의 예시적인 테트라스파닌:
TSPAN8, NP_001356689, 서열번호 184
TSPAN14, NP_001121781, 서열번호 185
CD231 (TSPAN7), NP_004606, 서열번호 186
단백질의 인테그린 계열
CD49d, NP_000876, 서열번호 187
ITGB5, NP_001341694.1, 서열번호 188
ITGB6, NP_000879.2, 서열번호 189
ITGB7, NP_000880.1, 서열번호 190
CD71, NP_003225, 서열번호 191
프로테오글리칸
CD138 (신데칸-1), NP_001006947, 서열번호 192
신데칸-2, NP_002989, 서열번호 193
신데칸-3, NP_055469, 서열번호 194
신데칸-4, NP_002990, 서열번호 195
HSPG2, NP_001278789.1, 서열번호 196
5 막관통 도메인 단백질 계열
CD133, XP_011512195, 서열번호 195
유형 I 막관통 단백질
CD50, NP_001307534, 서열번호 196
CD102, NP_001093259, 서열번호 197
노치 패밀리
노치1, NP_060087, 서열번호 198
노치2, NP_001186930, 서열번호 199
노치3, NP_000426, 서열번호 200
노치4, NP_004548, 서열번호 201
DLL 1, NP_005609, 서열번호 202
DLL4, NP_061947.1, 서열번호 203
JAG1, NP_000205.1, 서열번호 204
JAG2, NP_002217.3, 서열번호 205
CD11a, XP_011544151.1, 서열번호 206
CD11b, NP_001139280.1, 서열번호 207
CD11c, NP_001139280.1, 서열번호 208
CD18/ITGB2, NP_001120963.2, 서열번호 209
CD41, NP_000410.2, 서열번호 210
CD51, NP_001138472.1, 서열번호 211
CD61, NP_000203.2, 서열번호 212
CD104, NP_001308052.1, 서열번호 213
효소 활성을 갖는 막 단백질(효소 TM 단백질)
CD13, NP_001141.2, 서열번호 214
Fc 수용체, T-세포 수용체, 보체 수용체, 인터류킨 수용체, 면역글로불린, MHCI 또는 MHC-II 성분을 포함한 면역 조절 표면 단백질
CD2, NP_001758.2, 서열번호 215
CD3 엡실론, NP_000724.1, 서열번호 216
CD3 제타, NP_932170.1, 서열번호 217
CD18, NP_001120963.2, 서열번호 218
CD19, NP_001761.3, 서열번호 219
CD30, NP_001268359.2, 서열번호 220
CD34, NP_001764.1, 서열번호 221
CD36, NP_001120915.1, 서열번호 222
CD40, NP_001289682.1, 서열번호 223
CD40L, NP_000065.1, 서열번호 224
CD44, NP_001001391.1, 서열번호 225
CD45, NP_001254727.1, 서열번호 226
CD47, NP_001768.1, 서열번호 227
CD86, NP_787058, 서열번호 228
CD110, NP_005364.1, 서열번호 229
CD111, NP_976031.1, 서열번호 230
CD115, NP_001336665.1, 서열번호 231
CD117, XP_016863667.1, 서열번호 232
CD125, XP_011531979.1, 서열번호 233
CD135, XP_011533319.1, 서열번호 234
CD184, NP_001334985.1, 서열번호 235
CD200, NP_001352780.1, 서열번호 236
CD279, NP_005009.2, 서열번호 237
CD273, NP_079515.2, 서열번호 238
CD274, NP_054862.1, 서열번호 239
CD362 = 신데칸-2 (서열번호 193 참조)
EGFR, NP_958441.1, 서열번호 240
L1CAM, NP_001137435.1, 서열번호 241
LFA-1, NP_001120963.2, 서열번호 242
LGALS3BP, NP_005558.1, 서열번호 243
MFGE8, NP_001297248.1, 서열번호 244
SLlT2, NP_001276064.1, 서열번호 245
STX3, NP_004168.1, 서열번호 246
중간 엽 줄기 세포의 표면 마커
CD44 (서열번호 225, 상기와 같음)
CD45 (서열번호 226, 상기와 같음)
CD71 (서열번호 191, 상기와 같음)
CD73 (또한 효소 TM 단백질의 그룹에 포함됨), NP_001191742.1, 서열번호 247
CD90, NP_001298091.1, 서열번호 248
CD29 (또한 인테그린 계열의 그룹에 포함됨), NP_596867.1, 서열번호 249
CD105, NP_001265067.1, 서열번호 250
CD106 (또한 시알로당단백질 그룹에 포함됨), NP_001069.1, 서열번호 251
CD146, NP_006491.2, 서열번호 252
CD164, NP_001135874.1, 서열번호 253
CD166, NP_001618.2, 서열번호 254
STRO-1, NP_004958.2, 서열번호 255
당단백질
CD54, NP_000192.2, 서열번호 256
시알로당단백질 CD235a, NP_001295116, 서열번호 257
Ca-채널 단백질을 포함한 채널링 단백질
GLUR2, NP_000817.3, 서열번호 258
GLUR3, NP_000819.3, 서열번호 259
HLA-DM, NP_006111.2, 서열번호 260
기타:
FLOT2, NP_004466, 서열번호 261
EV 표면 단백질 서열은 신호 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 아미노산 서열로 본원에서 제공된다. 본원에서 기재된 바와 같은 TED, TSP 또는 TEV와 같은 결합제를 조작할 목적으로 사용된 EV 단백질 서열이, 있는 경우에, 각각의 서열 정보의 신호 서열을 갖지 않는 것들인 것으로 본원에서 이해된다. 당업자는 본원에서 동정된 서열의 N-말단 부분으로 포함된 신호 서열을 쉽게 동정할 수 있다.
본원에서 언급된 단백질 참조 번호는 각각 NCBI 참조(National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894 USA)이다.
도 2: 인간 CD81 (서열번호 87)의 2차원 모델의 개략도. 세포외 도메인은 2개의 루프, 아미노산 Trp34에서 Tyr63까지의 작은 소포외 루프(SEL)와 Phe113에서 Lys201까지의 큰 소포외 루프(LEL)를 함유한다. 이는 4개의 막관통 도메인(TM), Val12에서 Leu33에 이르는 TM1, Tyr64에서 Gln85에 이르는 TM2, Leu90에서 Gly112에 이르는 TM3 및 Leu202에서 Met228에 이르는 TM4를 포함한다.
도 3: 야생형 테트라스파닌 CD81의 구조에 대한 두 가지 다른 도면. 막관통 영역 TM1-TM4, 작은 소포외 루프(화살표로 표시됨), 큰 소포외 루프의 구조적으로 보존된 도메인(나선 A, B 및 E) 및 이 도메인의 가변 영역(나선 C 및 D)이 표시된다. LEL의 이황화 브릿지(DB)가 표시되고, 팔미테이트 부착 가능한 부위인 소포내 시스테인 잔기는 별표로 표시된다. LEL의 가변 영역은 시스테인 잔기에 의해 분리된 2개(여기에 도시된 야생형 CD81의 경우), 3개 또는 4개의 세그먼트를 함유한다.
도 4: HeLa 세포막에서 재조합 CD81의 국소화.
도 5: 막의 재조합 스노클 태그(Snorkel tag). (A): 스노클 태그된 CD81 (B): 일시적으로 형질 감염된 HeLa 세포에서 항 HA 항체를 사용하여 가시화된 스노클 태그된 CD63. (C) 재조합 EV의 CD81 및 HA 양성(positivity)을 확인하기 위해 전자 현미경법에서 면역금-표지화(Immunogold-labelling).
도 6: PreScission 프로테아제를 사용하여 스노클 태그를 운반하는 재조합 EV의 용출.
도 7: 재조합 CD81-GFP 융합 단백질을 운반하는 EV의 크기, 양 및 비율에 의한 재조합 EV의 특성화.
도 8: CaCo-2의 EV 흡수 (A) 형광 현미경 검사법으로 가시화된 흡수 (B) 유세포 분석에 의한 흡수 양성 세포의 정량화.
도 9: 독성 siRNA를 함유하는 재조합 EV로 Caco-2 세포의 처리.
달리 표시되거나 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 용어는 당업계에서 일반적인 의미를 가지며, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 표준 핸드북, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), Vols. 1 -3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990), and Janeway et al, "Immunobiology" (5th Ed., 또는 보다 최근 판), Garland Science, New York, 2001]을 참조한다.
청구범위의 청구 대상은 구체적으로 천연 (야생형) 생산물의 변이체일 수 있는 인공 생산물 또는 이러한 인공 생산물을 사용하거나 생산하는 방법을 지칭한다. 천연 구조에 대해 어느 정도의 서열 동일성이 있을 수 있지만, 예를 들어, 구체적으로 단리된 핵산 서열, 아미노산 서열, 발현 작제물, 형질 전환된 숙주 세포 및 재조합 단백질을 지칭하는 본 발명의 물질, 방법 및 용도는 "인공적" 또는 합성적이고, 따라서 "자연의 법칙"의 결과로서 간주되지 않음이 충분히 이해된다.
ED 또는 막관통 도메인과 같은 단백질 도메인에 대한 용어 "도메인"은 본원에서 폴리펩티드 또는 단백질의 적어도 특정 부분 (또는 전장)인 연속 아미노산 서열의 폴리펩티드 또는 단백질로서 이해된다. 도메인은 더 큰 단백질에 포함될 수 있다. 그러나, 단백질 도메인은 도메인보다 큰 단백질로부터 단리되는 동안 도메인이라고도 지칭된다.
용어 "발현"은 다음과 같이 이해된다. 예를 들어, 본원에 기재된 항체와 같은 발현 생산물의 목적하는 코딩 서열 및, 예를 들어, 작동 가능한 연결의 프로모터와 같은 제어 서열을 함유하는 핵산 분자가 발현 목적으로 사용될 수 있다. 이러한 서열로 형질 전환되거나 형질감염된 숙주는 인코딩된 단백질을 생산할 수 있다. 형질 전환을 수행하기 위해, 발현 시스템이 벡터에 포함될 수 있지만, 관련된 DNA는 또한 숙주 염색체에 통합될 수 있다. 구체적으로, 상기 용어는, 예를 들어, 벡터에 의해 운반되고 숙주 세포에 도입된 외래 DNA에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 위한 적합한 조건하의 숙주 세포 및 호환 가능한 벡터를 지칭한다.
코딩 DNA는, 예를 들어, 항체와 같은 특정 폴리펩티드 또는 단백질에 대한 특정 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA는 코딩 DNA의 발현을 개시, 조절 또는 다르게는 매개하거나 제어하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA 및 코딩 DNA는 동일한 유전자 또는 상이한 유전자로부터 유래될 수 있으며, 동일하거나 상이한 유기체로부터 유래될 수 있다. 재조합 클로닝 벡터는 종종 클로닝 또는 발현을 위한 하나 이상의 복제 시스템, 숙주에서의 선택을 위한 하나 이상의 마커, 예를 들어, 항생제 내성, 및 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다.
본원에 사용된 "발현 벡터" 또는 "벡터"는 클로닝된 재조합 뉴클레오티드 서열, 즉 재조합 유전자의 전사 및 적합한 숙주 유기체에서 이들의 mRNA의 번역에 필요한 DNA 서열로서 정의된다.
"발현 카세트"는 정의된 제한 부위에서 벡터로 삽입될 수 있는 발현 생산물을 코딩하는 DNA 코딩 서열 또는 DNA 세그먼트를 지칭한다. 카세트 제한 부위는적절한 판독 프레임에서 카세트의 삽입을 보장하도록 설계되었다. 일반적으로, 외래 DNA는 벡터 DNA의 하나 이상의 제한 부위에 삽입된 다음 벡터에 의해 전달 가능한 벡터 DNA와 함께 숙주 세포로 운반된다. 발현 벡터와 같이 DNA가 삽입되거나 추가된 DNA의 세그먼트 또는 서열은 또한 "DNA 작제물"이라고 지칭될 수 있다.
발현 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 추가로 일반적으로 숙주 세포 또는 게놈 통합 부위에서 자율 복제를 위한 기원, 하나 이상의 선택 가능한 마커(예: 아미노산 합성 유전자 또는 제오신, 카나마이신, G418 또는 하이그로마이신과 같은 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자), 다수의 제한 효소 절단 부위, 적합한 프로모터 서열 및 전사 종결자를 포함하고, 이 성분들은 함께 작동 가능하게 연결된다. 본원에 사용된 용어 "벡터"는 뉴클레오티드 서열을 통합하는 게놈뿐만 아니라 자율 복제 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일반적인 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는 일반적으로 추가의 (외래) DNA를 쉽게 수용할 수 있고 적합한 숙주 세포로 쉽게 도입될 수 있는 이중 가닥 DNA의 자체 함유 분자이다. 플라스미드 벡터는 종종 코딩 DNA와 프로모터 DNA를 함유하며 외래 DNA를 삽입하기에 적합한 하나 이상의 제한 부위를 갖는다. 구체적으로, 용어 "벡터" 또는 "플라스미드"는 DNA 또는 RNA 서열(예: 외래 유전자)이 숙주 세포에 도입되어 숙주를 형질 전환하고 도입된 서열의 발현(예: 전사 및 번역)을 촉진할 수 있는 비히클을 지칭한다.
본원에 기재된 TEV와 같은 표적 결합 특이성을 갖는 EV를 포함하는 "EV"로서 약칭된 용어 "세포외 소포"는 본원에서 세포 소포, 또는 세포 외부에서 제공되는 세포로부터 유래하는 소포로서 이해된다. EV는 각각의 공급원 또는 공여자 세포에 의해 생체내 또는 생체외에서 생산될 수 있을 뿐만 아니라 세포를 사용하지 않고, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 EV 특징을 포함하는 합성 EV를 생산하기 위해 리포좀 또는 나노입자를 조작하는 시험관내 방법에 의해 인공적으로 생산될 수 있다.
EV는 전형적으로 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 혈소판, 비만 세포, 상피 세포, 내피 세포, 신경 세포, 암 세포, 희소 돌기 세포, 슈반 세포, 배아 세포 및 MSC를 포함한 다양한 세포 유형에 의해 분비되는 막 포장된 소포이다. EV는 또한 정상적 소변, 혈액, 기관지 세척액, 모유, 타액, 뇌척수액, 양수, 활액 및 악성 복수와 같은 생리적 유체에서 자연적으로 발생한다. EV가 세포간 통신에서 중요한 역할을 수행한다는 것이 입증되었다. 그들은 세포간 통신을 매개하여 기능성 핵산을 기원 세포에서 수령자 세포로 전달할 수 있도록 한다. 그들은 면역 반응, 항상성 유지, 응고, 염증, 암 진행, 혈관 신생 및 항원 제시와 같은 과정에 연루되어 있다. 따라서, EV는 많은 생리학적 및 병리학적 상태에 참여한다.
EV는 본원에서 "로드"라고 지칭되는 생체분자 또는 합성 화물을 함유할 수 있다. 따라서, 그들은 순환 안정성, 생체적합성, 낮은 면역원성 및 독성 프로필로 인해 표적화 치료제 또는 진단제를 위한 매력적인 전달 비히클을 만든다. EV는 구체적으로 뉴런을 포함한 세포간에 화합물을 운반할 수 있다. 유리하게는, 그들은 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있다. 이러한 자연적인 트래피킹 능력은 세포외 소포에 다양한 자가 또는 이종성 화합물의 전달 비히클로 사용될 수 있는 잠재력을 제공한다.
본원에 기재된 예시적인 EV는 엑소좀 또는 미세소포이다.
엑소좀은 세포외 막으로 둘러싸인 소포의 일종이고, 분비된 세포의 분자 성분을 함유한다.
엑소좀은 EV의 주요 하위부류 중 하나를 구성하며, 엔도솜 기원을 갖는다. 엑소좀 EV는 다소포성 엔도솜(MVE)의 제한 막이 안쪽으로 발아됨으로써 형성되는 식작용 기원의 나노미터 크기의 소포이다. 따라서, 그들의 크기는 MVE 내의 관내 소포의 크기와 동등하고, 이는 일반적으로 30㎚ 내지 120㎚, 바람직하게는 50 내지 100㎚의 범위이다.
엑소좀 EV의 생물발생은 세포가 특정 막 영역에서 소량의 세포 내 유체를 흡수하고 초기 엔도솜을 형성할 때 세포내 이입-세포외 유출 경로를 통해 발생한다. 초기 엔도솜은 성숙하기 시작하고 후기 엔도솜으로 확장된 다음, 관내 소포 또는 다소포체(MVB)가 엔도솜 막의 내부 발아에 의해 형성된다. 이어서, MVB는 세포막에 융합되고, 세포외 환경으로 방출된다. 이 시점에서 소포는 엑소좀으로 명명되며, 이는 p53에 의해 조절되고 세포 골격 활성화 경로의 제어하에 있지만 칼슘의 영향을 받지 않는 세포 외 유출을 통해 방출된다. 엑소좀 EV는 수크로스 구배에서 30-100㎚의 직경 및 1.13 내지 1.19g/mL의 밀도를 가질 수 있고; 그들은, 예를 들어, 100,000g에서 원심분리에 의해 수집될 수 있다. 단리 후, 그들은 기능을 유지하면서 6개월 이상 동안 동결 건조물로서, 또는 수용액에서, 예를 들어, 실온 또는 냉장고 온도(2℃-8℃)에서 저장되거나, 임의의 독성 동결방지제 없이 동결될 수 있다(-80℃ 이상에서 -18℃까지).
엑소좀 EV는 다량의 표면 단백질, 예를 들어, 아넥신, 테트라스파인, 예를 들어, CD63, CD81 및 CD9, 및 Hsp60, Hsp70 및 Hsp90을 포함한 열 충격 단백질을 함유할 수 있다. 그들은 또한 Alix, 종양 감수성 유전자 101(Tsg101) 및 클라트린을 발현한다. 엑소좀 EV는 구체적으로 내용물을 보호하고 그들이 조직에서 장거리를 이동할 수 있도록 하는 지질 이중층 막을 포함한다. 막은 전형적으로 소량의 포스파티딜세린 및 다량의 콜레스테롤, 세라마이드 및 스핑고지질을 보유한다.
미세소포는 원형질 막의 단편으로부터 유래된 막으로 둘러싸인 소포의 일종이다. 미세소포 EV는 전형적으로 세포 표면으로부터 발아되고, 그들의 크기는 50㎚ 내지 1000㎚ 사이에서 가변적이다. 인공 미세소포 소포, 예를 들어, 반합성 EV 및 완전 합성 EV는 10 내지 1000㎚, 바람직하게는 10 내지 500㎚, 더욱 더 바람직하게는 10 내지 100㎚ 범위의 크기를 가질 수 있다.
미세소포 EV는 전형적으로 수크로스 구배에서 1.04 내지 1.07g/mL의 밀도로 초원심분리에 의해 단리된다. 미세소포 EV는 전형적으로 지질 라프트와 관련된 다량의 포스파티딜세린 함유 단백질을 함유하며 표면 마커 CD40과 콜레스테롤, 스핑고미엘린 및 세라마이드가 풍부하다. 구체적으로, 그들은 또한 지질 이중층 막에 캡슐화되고, 테트라스파닌과 같은 막관통 단백질을 포함한다.
전형적으로, 세포자멸체 EV는 세포자멸 세포의 세포막의 외부 수포 형성 및 단편화를 통해 방출되며, 직경 50 내지 2,000nm의 광범위한 크기 범위를 갖는다.
EV는 전형적으로 표면 리간드 및 접착 분자, 예를 들어, 표적 세포를 통해 표적과 상호작용한다. 일부 경우에, 그들은 식작용 흡수를 통해 또는 소포의 세포막에의 직접 융합에 의해 세포에 들어갈 수 있다. 그들은 또한 지질-리간드 수용체의 상호 작용에 의해 매개되는 세포 표면에 대한 접착을 통해 내용물을 전달할 수 있다. 이러한 상호 작용은 EV가 상이한 생리학적 및 병리학적 조건에서 세포 간 통신 및 면역 조절에서 중추적인 역할을 할 수 있음을 나타낸다.
나노 크기의 EV는 약물 전달을 위한 탁월한 대안을 나타낸다. EV 막의 조성은 공급원 또는 공여자 세포(예: 줄기 세포)로부터 유래되기 때문에, 이들 입자는 사실상 비면역원성이어서 순환에서 빠른 클리어런스에 저항하여 표적 조직에 대한 약물 전달 효율을 높일 수 있도록 한다. 그들은 표적화 약물 전달의 핵심 요건 중 하나인 세포 유형 특이적 단백질(표면 리간드 및 접착 분자 포함)에 의한 특정 세포 향성(tropism) 또는 회귀성(homing ability)을 자연적으로 보유하는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 자연적 표적은 제한적이며, 친화성 및 특이성 문제가 일반적이다. 본원에 기재된 바와 같은 표면 단백질을 포함하는 EV를 조작함으로써, 큰 특이성 및 친화성을 갖는 임의의 목적하는 표적 또는 세포 유형에 표적화될 수 있는 표적-특이적 EV가 제공된다.
본원에 기재된 EV는 특히 의학적 목적, 예를 들어, 질환 또는 질환 상태, 특히 표적화 요법이 질환 상태를 개선하는 것으로 입증된 질환을 진단 또는 치료하는 데 유용하다.
중간 엽 줄기 세포 유래 EV, 특히 엑소좀 EV는 재생 요법으로서의 용도와 관련하여 특히 유용할 수 있다. 중간 엽 줄기 세포(MSC)로부터 유래하는 EV는 표적 세포로 전달되어 면역계를 조절하는 염증 반응을 억제하는 조직 손상 재생과 같은 치료 효과 및 다수의 다른 유익한 효과를 발휘할 수 있는 생물학적 활성 분자를 운반할 수 있다. 따라서, EV는 무세포 재생 의학에서 효과적인 안전하고 저렴한 치료 접근법일 수 있다.
EV는 특히 생물학적 장벽(예: 혈액 뇌 장벽)을 가로 질러 다르게는 접근할 수 없는 부위에 로드를 전달하는 적합한 약물 전달 시스템일 수 있다.
EV가 생물학적, 화학적 및 물리적 수단을 포함하는 다양한 접근법을 통해 의도된 약물 운반 활성을 나타내도록 제형화될 수 있다. 활성 물질 또는 약물(예: 화학 물질, RNA, DNA, 단백질 또는 지질)의 EV로의 캡슐화는 생체내에서 완전성 및 생물학적 활성을 보존하여 생체 이용율을 크게 증가시킬 수 있다. 공여자 세포의 지질 막은 숙주 순환에서 식균 작용, 분해 및 변형을 회피하도록 적합화된다. 특히, 자가뿐만 아니라 이종성 EV는 전형적으로 망상 내피 시스템(또한 단핵 식세포 시스템으로 공지되기도 함)에서 포획을 피하고, 전부는 아니지만 대부분의 파라미터에서 비면역원성이다.
다양한 접근법이 활성 물질 제제를 EV에 로딩하기 위해 사용될 수 있다. 이에는 (1) 생체외 정제된 EV에의 로딩, 또는 (2) EV 생산 전에 공여자 (공급원) 세포에 사전 로딩한 다음, 각각 단리 및 임의로 정제가 포함된다.
생체외 로딩 전략은 대부분 간단한 배양에서 보다 정교한 화학적 및/또는 물리적 방법에 이르는 치료 분자의 수동적 패키징을 사용한다. 항산화제, 항암 약물, 친유성 염료와 같은 소수성(즉, 친유성) 분자는 주위 조건하에서 자발적으로 EV에 패키징될 수 있다. 실제로, 쿠르쿠민, 독소루비신 및 파클리탁셀을 EV에 성공적으로 로딩하는 것이 입증되었다. 포스파티딜콜린과 콜레스테롤로 구성된 표준 리포좀과 비교하여, EV는 소수성 화학 약물에 대해 더 높은 로딩 효율과 로딩 용량을 나타낸다.
많은 활성 물질이 EV의 막을 자유롭게 침투할 수 없으므로 EV의 로딩은 전형적으로, 예를 들어, 전기 천공, 초음파 처리, 투과, 융합성 리포좀, 중합체성 담체 및/또는 다른 물리적 손상에 의해 수행된다. 초음파 처리 및 압출, 또는 사포닌에 의한 투과는 높은 로딩 효율로 안정한 EV 재형성을 초래하는 것으로 나타났다.
전기 천공은 구체적으로 전기장을 적용하여 EV의 막에 일시적으로 기공을 생성함으로써 활성 물질이 EV의 루멘으로 이동할 수 있도록 한다. 전기 천공은 또한 소포 응집을 유도하여 소포의 완전성에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다. 당업자는 EV 공급원 및 농도, 화물 분자(로드) 및 화물의 최적 로딩에 대한 경시적 인가 전압을 포함한 여러 파라미터를 선택할 수 있다.
EV는 전기 천공시 편리하게 로딩된다. 연구는 EV 비함유 약물 또는 약물 로딩된 리포솜과 비교할 때 전형적으로 화학요법 약물과 관련된 부작용이 감소함에 따라 효율이 향상됨을 입증했다.
EV는 다양한 핵산 분자, 예를 들어, mRNA, miRNA 및 다양한 비코딩 RNA 또는 DNA 분자의 천연 담체이고, 따라서 핵산 전달에 적합한 비히클을 나타낸다. 핵산분자는 관심있는 유전자의 조절에 효과적인 수단이지만, 순환에서 낮은 안정성과 형질 도입성은 이러한 치료 분자를 보호하고 표적 세포와 조직에 전달할 수 있는 비히클의 필요성을 나타낸다. 다시 말하지만, 전기 천공법을 수행하여 물질을 EV에 로딩할 수 있다.
초음파 처리는 응집 및 분해를 최소화하면서 분자의 활성 로딩에 적합한 대안일 수 있다.
EV의 방출 전에 공여자(공급원) 세포에 약물을 사전 로딩하는 상이한 방법이 현장에 존재한다. 예를 들어, 활성 물질은 숙주 세포, 특히 관심 있는 단백질 또는 세포 대사 산물을 과발현하는 재조합 숙주 세포에서 EV로 혼입될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, EV는 표적 결합 부위를 포함하는 표면 단백질을 인코딩하는 유전자 외에 이종 유전자로 형질 감염된 공여자 세포로부터 단리될 수 있다. 로드가 단백질을 포함할 수 있기 때문에, 숙주 세포에 의해 발현된 재조합 단백질의 로딩은 로딩된 EV에 의한 매력적인 단백질 전달 방식일 수 있다. 난백 알부민, 카탈라제, 신경교 세포주 유래 신경 영양 인자(GDNF)를 포함한 다수의 모델 단백질 은 이미 유전자 변형 숙주 세포로부터 EV에 성공적으로 로딩되었다.
본원에 기재된 바와 같은 표적 특이적 EV의 사용은 세포독성, 짧은 생체 분포 및 낮은 표적화 전달 효율과 같은 약물 또는 비히클과 관련된 다수의 안전 문제를 피하거나 극복하면서 혈액 뇌 장벽과 같은 복잡한 생물학적 장벽을 횡단하는 능력을 갖는 차세대 약물 전달 시스템을 나타낸다. 순환 안정성이 낮고/낮거나 표적 세포에 대한 형질도입성이 낮은 화학 약물 및 생물학적 분자는 엔도솜 및 리소좀 분해를 거치지 않고 표적 세포의 세포질로 효율적으로 이동할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, EV는 인공 표적 결합 부위에 의해 특정 조직, 세포, 인공 표면 또는 가용성 화합물을 표적화하기 위해 생산될 수 있다. EV는 결합 부위를 포함하는 적합한 표면 단백질 및 구조를 발현할 목적으로 조작될 수 있다. 예를 들어, 표면 단백질은 공급원 세포에서 과발현되어 공급원 세포에서 적합한 재조합 발현 시스템을 사용하여 EV의 표면에서 발현되도록 할 수 있다.
인공 표적 결합 부위는 소포 형성 전 또는 후에 조작된다. 예를 들어, 결합 부위는, 예를 들어, 루프, 나선형 및/또는 선형 (펩티드) 구조를 포함하도록 소정의 영역에서 본원에 기재된 바와 같은 표면 단백질 내에 혼입될 수 있다. 상기 표면 단백질의 상기 적어도 2개의 먼 영역 내의 특정 표적 접촉 표면 또는 결합 잔기는 동일 반응계에서, 즉, 예를 들어, 각각의 표면 단백질에서 점 돌연변이를 생산하는 공급원 세포를 돌연변이 유발하는 방법을 사용하는 것과 같은 핵산 분자를 재조합하는 방법에 의해 및/또는 생물학적, 효소적 및/또는 화학적 반응을 포함하는 EV의 추가 변형에 의해 EV를 생산할 때 생산될 수 있다.
본원에 기재된 EV는 단리된 EV를 포함하는 EV 제제에 적합하게 제공된다. EV는 크기, 밀도, 로드의 양 및 조성, 표적 결합 친화성 및/또는 선택성, 순도 등을 결정하는 것과 같은 적합한 품질 제어 측정에 의해 결정될 수 있는 특정 특성을 특징으로 할 수 있다.
예시적인 품질 제어 방법은 실시예 섹션에 추가로 기재되어 있다.
본원에서 사용된, ED로 약칭된 용어 "소포외 도메인"은 EV에 부착되거나 결합될 때 EV의 외부 표면(소포외 표면)에 위치하는 단백질 도메인을 포함하는 것으로 이해된다. 그러나, 단백질 도메인은 EV에서 단리되거나 EV 표면 단백질에서 단리되는 동안 ED라고 칭명되기도 한다.
아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 요소와 관련하여 본원에 사용된 용어 "측면" 또는 "측면에 있는"은 본원에서 다음과 같이 이해된다: 제1 서열 요소는 제1 서열 요소가 제2 서열 요소에 바로 인접하여 위치하여 상기 제1 및 제2 서열의 인접 서열을 제공할 때 제2 서열 요소가 측면에 있는 것으로 간주된다. 선형 제1 서열 요소는 이의 말단 중 하나에서만 또는 두 말단에서, 즉 한 측면 또는 양 측면에서 또 다른 요소가 측면에 있을 수 있다.
본원에 기재된 TED에서, 변형된 영역은 구체적으로 N-말단에 하나, C-말단에 하나로 2개의 측면 서열이 측면에 위치한다. 따라서, 이러한 변형된 영역은 "매립된"이라고 칭명되기도 하는 측면 서열 사이에 위치한다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 특정 재조합 단백질, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 표면 단백질을 생산하거나, 본원에 기재된 EV 및 이의 임의의 자손을 생산하기 위해 형질 전환된 1차 대상체 세포를 지칭한다. 모든 자손이 부모 세포와 정확히 동일하지는 않지만 (고의적이거나 우발적인 돌연변이 또는 환경의 차이로 인해), 그러한 변경된 자손은 자손이 원래 형질 전환된 세포와 동일한 기능성을 유지하는 한 이러한 용어에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "숙주 세포주"는 재조합 유전자를 발현하여 재조합 폴리펩티드 또는 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포의 세포주를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "세포주"는 장기간에 걸쳐 증식하는 능력을 획득한 특정 세포 유형의 확립된 클론을 지칭한다. 이러한 숙주 세포 또는 숙주 세포주는 세포 배양물에서 유지될 수 있고/있거나 배양되어 재조합 폴리펩티드를 생산할 수 있다.
ED의 변형된 영역과 관련하여 본원에 사용된 용어 "단리된" 또는 "단리"는 "실질적으로 순수한" 형태로 존재하기 위해 ED의 측면 서열로부터 충분히 분리된 변형된 영역의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 지칭할 것이다. "단리된"은 반드시 인공 또는 합성 펩티드, 또는 이러한 펩티드와 다른 화합물 또는 물질의 혼합물의 배제, 또는 기본적인 결합 활성을 방해하지 않고, 예를 들어, 불완전한 정제로 인해 존재할 수 있는 불순물의 존재를 의미하지는 않는다. 용어 "단리된"은 또한 화학적으로 합성된 것들을 포함하는 것을 의미한다.
특히, 변형된 영역은 본원에 기재된 바와 같이 TED로부터 단리되거나, 본원에 기재된 TSP로부터 단리될 수 있거나, 각각 TED와 TSP(로부터 단리되지 않은)에 포함된 동일한 변형 영역과 비교하여 표적 결합 친화성 및/또는 특이성과 같은 이의 결합 특성을 비교할 목적으로 각각의 단리된 펩티드로서 제공될 수 있다.
본원에 기재된 EV와 관련하여 본원에 사용된 용어 "단리된" 또는 "단리"는 "실질적으로 순수한" 형태로 존재하기 위해 자연적으로 관련되는 환경으로부터 충분히 분리된 이러한 소포를 지칭할 것이다. "단리된"은 반드시 다른 화합물 또는 물질과 인공 또는 합성 혼합물의 배제, 또는 기본적인 활성을 방해하지 않고, 예를 들어, 불완전한 정제로 인해 존재할 수 있는 불순물의 존재를 의미하지는 않는다. 특히, 본원에 기재된 바와 같은 단리된 EV는 또한 화학적으로 합성된 것들을 포함하는 것을 의미한다.
본원에 기재된 EV 표면 단백질과 같은 폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여, 용어 "단리된"은 구체적으로 그들이 자연적으로 관련되는 물질이 없거나 실질적으로 없는 화합물, 예를 들어, 그들이 자연 환경, 또는 이러한 제조가 시험관내 또는 생체내에서 실행되는 재조합 DNA 기술에 의한 경우 그들이 제조되는 환경(예: 세포 배양물)에서 발견되는 다른 화합물을 지칭할 것이다.
본원에 기재된 결합제, 특히 본원에 기재된 TED, TSP 또는 TEV와 관련하여 본원에 기재된 "라이브러리"는 특정의 다양한 결합제를 포함하는 다수의 상이한 표적 결합 종(라이브러리 구성원)을 포함하는 결합제의 레퍼토리를 포함하는 것으로 이해된다. 라이브러리는 전형적으로 기능적 결합에 의해 구별될 수 있고 따라서 목적하는 결합 특성에 따라서 선택될 수 있는 라이브러리 구성원을 포함한다.
본원에 기재된 TED 라이브러리는 구체적으로 각각 동일한 야생형 ED의 동일한 야생형 서열에 매립된 상이한 변형 영역을 갖는 TED, 특히 본원에 기재된 TEV의 세트 또는 컬렉션을 포함한다.
본원에 기재된 TSP 라이브러리는 구체적으로 각각 동일한 야생형 EV 표면 단백질의 동일한 야생형 서열에 매립된 상이한 TED를 갖는 TSP, 특히 본원에 기재된 TSP의 세트 또는 컬렉션을 포함한다. TSP 라이브러리는 TED 라이브러리와 같은 ED 라이브러리를 포함할 수 있다. TED 라이브러리는 ED 또는 EV 표면 단백질을 돌연변이 유발함으로써 적합하게 생산되어 가용성 단백질로서 또는 EV 표면에 각각 ED 및 EV 표면 단백질 돌연변이체의 레퍼토리를 생산한다.
본원에 기재된 TEV 라이브러리는 구체적으로 각각 소포의 막에 결합된 동일한 야생형 EV 표면 단백질의 동일한 야생형 서열에 매립된 상이한 TED를 갖는 TEV, 특히 본원에 기재된 TEV의 세트 또는 컬렉션을 포함한다. TEV 라이브러리는 TSP 라이브러리와 같은 표면 단백질의 라이브러리를 포함할 수 있다.
라이브러리는 적합한 돌연변이 유발 방법, 예를 들어, 표면 단백질의 소포외 도메인의 부위 지시된 돌연변이 유발을 포함하는 익히 공지된 기술에 의해 작제될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 라이브러리는 바람직하게는 적어도 102개의 라이브러리 구성원, 더 바람직하게는 적어도 103개, 더 바람직하게는 적어도 104개, 더 바람직하게는 적어도 105개, 더 바람직하게는 적어도 106개의 라이브러리 구성원, 더 바람직하게는 적어도 107개, 보다 바람직하게는 적어도 108개, 더욱 바람직하게는 적어도 109개, 더 바람직하게는 적어도 1010개, 더 바람직하게는 적어도 1011개, 최대 1012개의 라이브러리 구성원을 포함한다.
구체적으로, 라이브러리는 적어도 102, 103, 104, 105 또는 106개의 라이브러리 구성원을 포함하며, 여기서 각 라이브러리 구성원은 변형된 표면 단백질의 서열에서 적어도 하나의 뉴클레오티드가 다르다. 구체적으로, 라이브러리는 적어도 106개의 라이브러리 구성원을 포함하며, 여기서 각 라이브러리 구성원은 상이한 표적 결합 부위 또는 특이성을 갖는다.
임의의 단백질 또는 유전자 다양성 라이브러리는, 예를 들어, 다수의 개별 라이브러리 구성원을 포함하여 서열의 다양성을 생성하거나, 예를 들어, 안정화된 또는 기능적 활성 라이브러리 구성원이 풍부한 미리 선택된 라이브러리를 사용하는 본원에 기재된 목적을 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, 디스플레이 시스템은 소정의 단백질, 본원에서 본원에 기재된 표면 단백질을 이의 인코딩 핵산, 예를 들어, 이의 인코딩 mRNA, cDNA 또는 유전자와 결합할 수 있다. 따라서, 라이브러리의 각 구성원은 그 위에 표시되는 변형된 표면 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 디스플레이 시스템은 세포, 바이러스, 예를 들어, 파지, 리보솜, 진핵 세포, 예를 들어, 효모, 플라스미드를 포함한 DNA, 및 mRNA 디스플레이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
당업계에 익히 공지된 바와 같이, 예를 들어, 세포 및 비세포 방법, 특히 동원된 디스플레이 시스템과 같은 디스플레이 기술을 포함하여 특정 결합 특성 및 친화성을 갖는 단백질의 동정 및 단리에 사용될 수 있는 다양한 디스플레이 및 선택 기술이 있다. 세포 시스템 중에서, 파지 디스플레이, 바이러스 디스플레이, 효모 또는 다른 진핵 세포 디스플레이, 예를 들어, 포유류 또는 곤충 세포 디스플레이가 사용될 수 있다. 동원된 시스템은 가용성 형태의 디스플레이 시스템, 예를 들어, 시험관내 디스플레이 시스템, 그들 중 리보솜 디스플레이, mRNA 디스플레이 또는 핵산 디스플레이에 관련된다.
표면 단백질의 다양성 및/또는 EV 또는 세포에 고정된 표면 단백질의 다양성을 표시하기 위한 특정 라이브러리가 본원에 제공된다. 바람직하게는, 라이브러리는 파지 디스플레이 또는 효모 라이브러리이다. 구체적으로, 효모 숙주 세포는 효모 세포의 표면에서 본원에 기재된 표면 단백질을 나타낸다. 파지 및 파지미드 디스플레이 시스템은 선택 과정을 간소화하는 다재 및 잠재적인 능력으로 익히 공지되어 있다. 효모 디스플레이는 여러 가지 매력적인 특징을 제공한다: 진핵 전사 및 번역 기계는 단백질 발현에 매우 잘 적합하며 유세포 분석을 사용하면 스캐폴드 리간드를 사용하여 실시간으로 개별 클론의 높은 처리량 정량 분석을 가능하게 한다.
효모 숙주 세포는 바람직하게는 속 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia), 한세눌라(Hansenula), 쉬지사카로마이세스(Schizisaccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 야로위아(Yarrowia) 및 칸디다(Candida)로부터 선택된다. 가장 바람직한 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)이다.
특정 경우에, 본원에 기재된 표면 단백질의 레퍼토리가 표시되어 본원에 기재된 표면 단백질을 인코딩하는 DNA, RNA 또는 cDNA를 포함하는 실체가, RNA 또는 DNA 디스플레이 라이브러리에서와 같이, 그것이 인코딩하는 표면 단백질에 직접 연결될 수 있도록 한다. 이러한 경우에, 표면 단백질 변이체는 무세포 단백질 합성 방법의 변형에 의해 생성된다.
라이브러리에서 결합 활성 (또는 임의의 다른 목적하는 활성)의 스크리닝은 당업계에 익히 공지된 방법에 따라, 예를 들어, 파지 디스플레이 기술로부터 수행된다. 예를 들어, 고체상에 고정된 표적은 레퍼토리의 결합 구성원을 동정하고 단리시키는 데 사용될 수 있다. 스크리닝은 목적하는 특성에 따라 레퍼토리의 구성원을 선택하도록 한다.
표적의 적합한 결합제를 선택하는 방법에서, 하나 이상의 후보 결합 서열을 선택하는 기회를 증가시키기 위해 라이브러리 구성원의 레퍼토리에서 각 결합제의 큰 다양성, 예를 들어, 적어도 10개의 카피를 제공하는 것이 유리하고, 이는 표적 특이적 세포외 소포 작제물을 조작하기 위한 적합성에 대해 추가로 특성화될 수 있다.
표적 결합 구조를 포함하는 라이브러리 구성원에 대한 라이브러리 스크리닝은 임의의 적합한 선택 방법에 의해 수행될 수 있다. 스크리닝 단계는 하나 또는 여러 라운드의 선택(패닝(panning)으로 지칭되기도 함)을 포함할 수 있다.
하나 또는 여러 라운드의 선택은, 예를 들어, 1, 2, 또는 바람직하게는 3라운드를 포함하고, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10라운드의 선택을 포함할 수 있다. 특히, 선택 라운드는 상기 표적 또는 이의 에피토프에 결합하는 단백질을 선택하기 위해 상기 표적의 존재하에 라이브러리를 배양함을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "돌연변이 유발"은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 변경하기 위한 임의의 당업계 인식 기술을 지칭한다. 바람직한 유형의 돌연변이 유발에는 오류가 발생하기 쉬운 PCR 돌연변이 유발, 포화 돌연변이 유발 또는 기타 부위 지시된 돌연변이 유발이 포함된다. 예를 들어, 무작위화 기술에 의해 목적하는 위치에 점 돌연변이를 도입하기 위해 임의의 공지된 돌연변이 유발 방법이 사용될 수 있다. 일부 경우에는, 위치는, 예를 들어, 항체 서열을 무작위화하기 위해 임의의 가능한 아미노산 또는 바람직한 아미노산의 선택으로 무작위로 선택된다.
본원에 사용된 용어 "재조합"은 "유전 공학에 의해 제조되거나 그 결과"를 의미한다. 대안적으로, 용어 "조작된"이 사용된다. 예를 들어, 표면 단백질은 부모 서열의 변이체를 생산하기 위해 각각의 부모 서열을 조작함으로써 변이체를 생산하도록 돌연변이될 수 있다. 재조합 숙주는 구체적으로 재조합 발현 벡터 또는 클로닝 벡터를 포함하거나, 특히 숙주에 이질적인 뉴클레오티드 서열을 사용하여 재조합 핵산 서열을 함유하도록 유전적으로 조작되었다. 재조합 단백질은 숙주에서 각각의 재조합 핵산을 발현시킴으로써 생산된다.
"점 돌연변이"는 본원에서 특히 아미노산 서열의 특정 위치(한 위치)에서 상이한 아미노산을 위한 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 교환, 결실 또는 삽입에서 조작되지 않은 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열의 발현을 초래하는 폴리뉴클레오티드의 조작으로 이해된다. 구체적으로, 아미노산 잔기의 하나 이상의 단일(비연속적) 또는 이중선은 점 돌연변이의 대상체일 수 있다. 구체적으로, 바람직한 돌연변이 유발 방법은 선택된 위치에서 점 돌연변이, 바람직하게는 하나의 (소정의) 아미노산 위치에서 하나의 아미노산의 다른 하나의 아미노산으로의 치환 또는 단지 하나의 소정의 아미노산 위치에서만 더 많은 아미노산을 제공한다. 하나 이상의 점 돌연변이는 변형된 영역 내에 있을 수 있고, 특히 영역 내의 비연속적 또는 연속적 위치에서의 점 돌연변이일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "레퍼토리"는 고친화성으로 표적에 결합하기 위한 다양한 특이성을 갖는 변형된 표면 단백질의 변이체와 같은 변이체의 컬렉션을 지칭할 것이다. 전형적으로, 나선 및 루프 영역이 있는 세포외 도메인을 포함하는 표면 단백질의 구조는 이러한 레퍼토리에서 동일한다. 다양성은 구체적으로 변형되는 하나 이상의 소정의 위치 또는 영역, 예를 들어, 표적을 특이적으로 인식하고 결합하는 동일한 표적 결합 부위의 일부인 적어도 2개의 먼 영역 내에 결합 잔기를 포함하는 결합 부위의 다양성을 반영한다.
본원에 기재된 레퍼토리는 구체적으로 이종성 표면 단백질, 표적 특이적 세포외 소포 작제물 또는 표적의 혼합물인 라이브러리 내에 제공된다. 라이브러리는 단백질 또는 EV의 단순한 혼합물의 형태를 취할 수 있거나, 단리된 폴리펩티드 또는 단백질로서, 또는 이러한 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 핵산으로, 또는 심지어 상기 레퍼토리의 다양한 표적-특이적 결합제를 반영하여 핵산의 라이브러리로 형질 전환된 핵산을 발현하는 유기체 또는 세포, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 동물 또는 식물 세포 등으로서 이러한 변형된 표면 단백질의 각각의 결합 영역의 형태일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 온혈 포유류, 특히 인간 또는 비인간 동물을 지칭할 것이다. 따라서, 용어 "대상체"는 또한 특히 개, 고양이, 토끼, 말, 소, 돼지 및 가금류를 포함하는 동물을 지칭할 수 있다. 특히, 본원에 기재된 항체는 질환 상태의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체 또는 환자를 치료하는 의학적 용도로 제공된다. 용어 "환자"는 예방적 또는 치료적 치료를 받는 인간 및 기타 포유류 대상체를 포함한다. 따라서, 용어 "치료"는 예방적 및 치료적 치료를 모두 포함하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "EV 표면 단백질"을 포함한 용어 "표면 단백질"은 EV의 지질 이중층 막 내에 고정되는 EV의 표면 위 또는 표면에 위치된 단백질을 지칭한다. 이를 위해, "고정"은 본원에서 막 내에 위치하는 단백질 도메인으로의 융합에 의해 세포 표면에 결합하는 것으로 이해된다. 표면 단백질은 본원에서 적어도 하나의 ED 및 적어도 하나의 막관통 도메인을 포함하는 것으로 이해된다. 이러한 표면 단백질은 EV의 막에 대한 상기 적어도 하나의 막관통 단백질 도메인의 통합을 통해 EV에 결합될 수 있다. 막관통 도메인(들)은 표면 단백질의 일부이거나, 예를 들어, 표면 단백질을 EV에 고정시키기 위해 표면 단백질에 융합될 수 있다.
용어 "EV 표면 단백질"은 구체적으로 "엑소좀 단백질" 및 폴리펩티드 또는 단백질 작제물을 적합한 소포 구조 또는 EV로 수송하는 데 사용될 수 있는 EV의 단백질을 포함한다. 구체적으로, 이 용어는 EV와 같은 소포 구조로 폴리펩티드 또는 단백질 작제물의 수송, 트래픽킹 또는 셔틀링을 가능하게 하는 임의의 프로체인을 포함한다. 이러한 EV 표면 단백질의 예는, 예를 들어, 본원(특히 도 1)(만약 있는 경우, 신호 서열 제외)에 제공된 서열에 의해 동정된 바와 같은 본원에 기재된 하나 이상의 유형의 EV 표면 단백질을 전체 또는 일부(단편으로서) 포함하는 단리된, 합성 및/또는 재조합 아미노산 서열, 또는 클로닝된 동형을 포함한 이의 동형이다.
예시적인 EV 표면 단백질은
a)i) 테트라스파닌, 예를 들어, CD81(예: 인간 CD81, 서열번호 87), CD9(예: 인간 CD9, 서열번호 89), CD53(예: 인간 CD53, 서열번호 90), TSPAN32(예: 인간 TSPAN32, 서열번호 91), CD82(예: 인간 CD82, 서열번호 92), CD63(예: 인간 CD63, 서열번호 93), CD151(예: 인간 CD151, 서열번호 94), CD37(예: 인간 CD37, 서열번호 95), TSPAN8(예: 인간 TSPAN8, 서열번호 184), TSPAN14(예: 인간 TSPAN14, 서열번호 185), 또는 CD231 (TSPAN7)(예: 인간 CD231 (TSPAN7), 서열번호 186; 또는
ii) 리소좀-연관 막 단백질, 예를 들어, LAMP2(예: 인간 LAMP2, 서열번호 96)을 포함하는 테트라스팬 유사 단백질;
b) 인테그린 계열의 단백질, 예를 들어, CD49d(예: 인간 CD49d, 서열번호 187), ITGB5(예: 인간 ITGB5, 서열번호 188), ITGB6(예: 인간 ITGB6, 서열번호 189), ITGB7(예: 인간 ITGB7, 서열번호 190), CD71(예: 인간 CD71, 서열번호 191), CD29(예: 인간 CD29, 서열번호 249);
c) 프로테오글리칸, 예를 들어, CD138 (신데칸-1)(예: 인간 CD138 (신데칸-1), 서열번호 192), 신데칸-2 (예: 인간 신데칸-2, 서열번호 193), 신데칸-3 (예: 인간 신데칸-3, 서열번호 194), 신데칸-4 (예: 인간 신데칸-4, 서열번호 195), HSPG2 (예: 인간 HSPG2, 서열번호 196);
d) 5-막관통 도메인 단백질 계열, 예를 들어, CD133(예: 인간 CD133, 서열번호 195);
e) 타입 I 막관통 단백질, 예를 들어, (예; 인간 CD50, 서열번호 196), CD102 (예: 인간 CD102, 서열번호 197);
f) 노치 계열, 예를 들어, 노치1(예: 인간 노치1, 서열번호 198), 노치2(예: 인간 노치2, 서열번호 199), 노치3(예: 인간 노치3, 서열번호 200), 노치4(예: 인간 노치4, 서열번호 201), DLL1(예: 인간 DLL1, 서열번호 202), DLL4(예: 인간 DLL4, 서열번호 203), JAG1(예: 인간 JAG1, 서열번호 204), JAG2(예: 인간 JAG2, 서열번호 205), CD11a(예: 인간 CD11a, 서열번호 206), CD11b(예: 인간 CD11b, 서열번호 207), CD11c(예: 인간 CD11c, 서열번호 208), CD18/ITGB2 (예: 인간 CD18/ITGB2, 서열번호 209), CD41 (예: 인간 CD41, 서열번호 210), CD51 (예: 인간 CD51, 서열번호 211), CD61(예: 인간 CD61, 서열번호 212), CD104(예: 인간 CD104, 서열번호 213);
g) 효소 활성을 갖는 막 단백질(효소 TM 단백질), 예를 들어, CD13(예: 인간 CD13, 서열번호 214), CD73(예: 인간 CD73, 서열번호 247);
h) 예를 들어, Fc 수용체, T-세포 수용체, 보체 수용체, 인터류킨 수용체, 면역글로불린, MHCI 또는 MHC-II 성분을 포함하는 면역 조절 표면 단백질; 예시적인 단백질은 CD2(예: 인간 CD2, 서열번호 215), CD3 엡실론(예: 인간 CD3 엡실론, 서열번호 216), CD3 제타(예: 인간 CD3 제타, 서열번호 217), CD18(예: 인간 CD18, 서열번호 218), CD19(예: 인간 CD19, 서열번호 219), CD30(예: 인간 CD30, 서열번호 220), CD34(예: 인간 CD34, 서열번호 221), CD36(예: 인간 CD36, 서열번호 222), CD40(예: 인간 CD40, 서열번호 223), CD40L(예: 인간 CD40L, 서열번호 224), CD44(예: 인간 CD44, 서열번호 225), CD45(예: 인간 CD45, 서열번호 226), CD47 (예: 인간 CD47, 서열번호 227), CD86 (예: 인간 CD86, 서열번호 228), CD110(예: 인간 CD110, 서열번호 229), CD111(예: 인간 CD111, 서열번호 230), CD115(예: 인간 CD115, 서열번호 231), CD117(예: 인간 CD117, 서열번호 232), CD125(예: 인간 CD125, 서열번호 233), CD135(예: 인간 CD135, 서열번호 234), CD184(예: 인간 CD184, 서열번호 235), CD200(예: 인간 CD200, 서열번호 236), CD279(예: 인간 C D279, 서열번호 237), CD273(예: 인간 CD273, 서열번호 238), CD274(예: 인간 CD274, 서열번호 239), CD362 = 신데칸-2(예: 인간, 서열번호 193), EGFR(예: 인간 EGFR, 서열번호 240), L1CAM(예: 인간 L1CAM, 서열번호 241), LFA-1(예: 인간 LFA- 1, 서열번호 242), LGALS3BP(예: 인간 LGALS3BP, 서열번호 243), MFGE8(예: 인간 MFGE8, 서열번호 244), SL1T2(예: 인간 SL1T2, 서열번호 245), STX3(예: 인간 STX3, 서열번호 246);
i) 중간 엽 줄기 세포의 표면 마커, 예를 들어, CD44(예: 인간 CD44, 서열번호 225), CD45(예: 인간 CD45, 서열번호 226), CD71(예: 인간 CD71, 서열번호 191), CD73(예: 인간 CD73, 서열번호 247), CD90(예: 인간 CD90, 서열번호 248), CD29(예: 인간 CD29, 서열번호 249), CD105(예: 인간 CD105, 서열번호 250), CD106(예: 인간 CD106, 서열번호 251), CD146(예: 인간 CD146, 서열번호 252), CD164(예: 인간 CD164, 서열번호 253), CD166(예: 인간 CD166, 서열번호 254), STRO-1(예: 인간 STRO-1, 서열번호 255);
j) 당단백질, 예를 들어, CD54(예: 인간 CD54, 서열번호 256), CD235a(예: 인간 CD235a, 서열번호 257), CD106(예: 인간 CD106, 서열번호 251);
k) Ca-채널 단백질을 포함한 채널링 단백질, 예를 들어, GLUR2(예: 인간 GLUR2, 서열번호 258), GLUR3 (예: 인간 GLUR3, 서열번호 259), HLA-DM(예: 인간 HLA-DM, 서열번호 260); 또는
l) 기타 엑소좀 (소포성) 표면 단백질, 예를 들어, FLOT2(예: 인간 FLOT2, 서열번호 261)이다.
추가의 기타 EV 표면 단백질은 TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, 및 T-세포 수용체(T 세포 수용체 유전자좌)로부터 선택되고, 이는 가변 아미노산 서열을 갖는다. 당업자는 본원에 제공된 정보에 기초하여, 또는 각각의 데이터베이스, 예를 들어, 인간 EV 표면 단백질(적어도 하나의 ED 또는 TM을 포함하는 단편, 또는 이러한 EV 표면 단백질의 동형을 포함함), 또는 비인간 동물의 상동체 또는 유사체의 게놈 유전자좌 및 아미노산 서열을 제공하는 데이터베이스로부터 적합한 EV 표면 단백질을 용이하게 동정할 수 있다.
구체적으로, EV 표면 단백질은 루프, 나선형 및/또는 선형 (펩티드) 구조를 갖는 영역을 포함하는 3차 구조, 특히 적어도 하나의 큰 루프와 하나 이상의 나선형 영역을 포함하는 CD81에 대해 기재된 것과 같은 테트라스팬-유사 3차 구조를 포함한다. 이러한 3차 구조는 3차 구조의 먼 영역에 접촉점을 포함하는 인공 결합 부위를 포함하도록 적절하게 조작될 수 있다.
특정 경우에, 표면 단백질은 링커를 통해 세포외 소포의 지질 이중층 막에 고정된다. 이러한 링커는, 예를 들어, 아미노산 링커, 친수성 및 비하전된 중합체를 기반으로 하는 링커, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 다당류일 수 있거나, 양이온성 및 음이온성 그룹을 모두 함유하는 쯔비터이온성 중합체로 구성될 수 있다.
특정 표면 단백질은 포유류 기원의 것, 특히 인간 또는 비인간 포유류 동물, 예를 들어, 온혈 동물, 특히 개, 고양이, 토끼, 말, 소, 돼지 및 가금류를 포함한 종에서 자연적으로 발생하는 것이다.
본원에 사용된 용어 "막관통 도메인"은 전형적으로 소수성인 지질 막-스패닝 단백질 도메인을 지칭한다. 구체적으로, 표면 단백질은 EV에 소포외 루프를 고정하는 적어도 2개의 막관통 도메인을 포함한다. 테트라스파닌 단백질은 전형적으로 4개의 막-스패닝 도메인을 포함한다. 막관통 도메인은 전형적으로 EV에 부착되거나 결합될 때 EV의 막 내에 위치한다. 그러나, 단백질 도메인은 EV로부터 단리되거나 EV 표면 단백질로부터 단리되는 동안 막관통 도메인이라 칭명되기도 한다.
"테트라스팬" 또는 "테트라스팬 단백질"로서 지칭되기도 하는 "테트라스파닌"은 본원에서 클러스터를 형성하고 다양한 막관통 및 세포질 신호 전달 단백질("테트라스파닌 수퍼패밀리"로서 지칭되기도 함)과 상호 작용함으로써 테트라스파닌 풍부 마이크로도메인으로 지칭되는 막 마이크로도메인을 구성하는 단백질 수퍼패밀리인 막관통 4 수퍼패밀리의 단백질로 이해된다. 테트라스파닌은 전형적으로 4개의 소수성 막관통 도메인의 존재를 특징으로 하는 세포-표면 단백질이다. 자연적으로 발생하는 테트라스파닌 단백질은 세포 발달, 활성화, 성장 및 운동성을 조절하는 역할을 하는 신호 전달 이벤트를 매개한다.
본원에서 이해되는 바와 같은 테트라스파닌은 전형적으로 혈관외 도메인(소포외 도메인, ED로 지칭되기도 함), 막관통 도메인 및 혈관내 도메인으로 구성된다. 예를 들어, 테트라스파닌의 N- 및 C-말단은 전형적으로 EV 내에 위치하는 반면, 막관통 도메인은 지질 이중층 막 내에 위치하며, 혈관외 도메인은 EV의 외부 표면에 위치한다. 테트라스파닌의 특정예는 글리코실화된다.
소포외 도메인, ED라고 지칭되기도 하는 세포외 (혈관외) 도메인은 테트라스파닌에서 가장 가변적인 영역이고, 이는 표적의 결합에 관여할 수 있다. EC1(제1 세포외 루프)은 작은 세포외 루프(SEL)라고도 지칭된다. 테트라스파닌의 EC2("큰 세포외 루프", LEL)는 모든 테트라스파닌에 대한 모델 단백질로서 CD81LEL을 사용하여 연구되었다. LEL의 도메인은 소수성 표면을 통해 동종이량체화를 매개하는 것으로 제안된 보존된 A, B 및 E 나선을 갖는 불변 영역, 및 단백질-단백질 상호작용을 담당하는 서열이 측면에 있는 나선 C 및 D가 있는 가변 영역으로 나뉜다. 구체적으로, EC2는 EC2 접힘(CCG 모티프)의 경우, 이황화 결합을 형성하는 적어도 2개의 보존된 시스테인 잔기, 모든 테트라스파닌에 존재하는 4개의 막관통에 근접한 1개의 시스테인 잔기 및 대부분의 테트라스파닌에서 Pro-Xaa-Xaa-Cys(PXXC, 서열번호 183, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있다) 모티프를 포함한다.
테트라스파닌 중, CD9, CD63, CD81, CD82 및 CD151은 광범위한 조직 분포를 갖는 반면, 나머지는 특별한 조직, 예를 들어, 조혈 세포에서 Tssc6, CD37 및 CD53에 제한된다. 면역 전자 현미경법 연구는 테트라스파닌이 다양한 유형의 식작용 막에 풍부하고, 엑소좀 마커로서 널리 사용되어 왔음을 나타냈다.
테트라스팬 단백질 CD81은 다소포체의 엑소좀 분획이 풍부한 주요 단백질이다. 인간 CD81은 서열번호 87로 동정된 아미노산 서열 (서열번호 88로 동정된 코딩 서열)을 포함하거나 이로 구성된다.
막관통 도메인 3과 4 사이에 위상학적으로 위치한 CD81의 큰 세포외 루프는 두 쌍의 시스테인에 의해 안정화된 버섯 모양 구조를 형성하는 5개의 나선형 요소를 특징으로 한다. 이 모티프는 테트라스파닌 계열의 단백질 구성원 사이에서 보존되고, 시스테인 결합의 산화는, 예를 들어, CD81의 천연 리간드인 C형 간염 바이러스(HCV)의 E2 외피 단백질의 고친화성 결합에 관여한다.
테트라스팬 단백질은 가용성 단백질로서 발현될 수 있거나, 테트라스파닌 발현 세포 또는 각각의 EV의 표면에서 표시될 수 있다.
1.6Å에서 분해된 hCD81 LEL의 결정 구조는 새로운 유형의 단백질 접힘을 나타내었고, 160개의 테트라스파닌 계열 구성원의 후속적 서열 분석은 접힘 및 주요 구조적 특징이 보존되었음을 나타냈다. 시스테인 브릿지와 별도로, hCD81 LEL은 시스테인 연결을 수용하도록 위치하는 불변 잔기 Gly157 및 Pro176뿐만 아니라 완전히 매립되어 His151 및 Cys190과 함께 수소 결합 네트워크에 기여하는 Tyr127에 의해 안정화될 수 있다. 가용성 hCD81 LEL은 2배 축을 중심으로 이량체로 조립될 수 있으며, 프로토머 사이의 접촉은 각 상호 작용 파트너의 나선 사이와 대향하는 프로토머의 나선 B와 C-말단 잔기 사이의 저극성 영역이다. 프로토머의 N- 및 C-말단은 막관통 세그먼트도 존재하는 세포 표면의 이량체 어셈블리와 유사하게 조립된 이량체의 대향면의 중심 영역에 있다. 제2의 저극성 영역은 나선 C 및 D의 용매 노출된 표면을 포함한다. 용액 연구에 따르면, 나선 D는 상당히 구조화되지 않았으며, 특정 항원과 결합할 때만 나선 형태를 달성한다. 테트라스파닌 계열 구성원의 서열 정렬은 실제로 삽입 및 결실을 포함하여 이 영역에서 증가된 가변성을 보여준다. 이 표면적은 이종이량체 테트라스파닌 종 어셈블리의 가능성을 암시할 수 있는 종- 또는 테트라스파닌-특이적 인식 과정에 관여할 수 있다고 시사되었다. 특히, CD81의 세그먼트 D는 특정 동종체 클러스터링을 안내할 수 있다.
특정 구현예에 따르면, CD81과 같은 테트라스파닌의 생물물리학적 특성은 단백질을 안정화시키는 신규한 이황화 브릿지를 형성하기 위해 새로운 시스테인 잔기의 쌍을 도입함으로써 개선된다. 구체적으로, 신규한 이황화 브릿지의 형성은 CD81과 같은 테트라스파닌의 안정성을 증가시키고, 이는 더 높은 안정성을 갖는 돌연변이체, 예를 들어, 상기 하나 이상의 변형된 영역 내에 하나 이상의 변형된 영역 또는 결합 잔기를 포함하는 신규한 표적 특이적 결합 부위를 포함하는 돌연변이체의 생산을 허용한다. 구체적으로, 아미노산 서열은 표적화 또는 무작위 돌연변이 유발에 의해 변형되어 결합 부위를 구성하는 소정의 위치 또는 영역(들)에서 결합 잔기를 포함하거나(특히 치환에 의해), 결합 잔기를 포함하는 다양한 결합 부위를 포함하는 라이브러리를 생성할 수 있다.
CD81과 마찬가지로, 테트라스파닌 CD9는 4개의 소수성 막관통 도메인과 2개의 세포외 도메인, ED(예: EC1 및 EC2를 포함하거나 이로 구성됨)를 함유하는 세포-표면 단백질이다.
자연적으로 발생하는 CD9는 228개의 아미노산으로 구성되며, 무게는 24-27kDa이다. 4개의 작고 매우 보존된 소수성 막관통 도메인은 각각 24 내지 27개 아미노산을 포함한다. 그것은 작은 N-말단(11개 아미노산) 및 C-말단 세포질(7개의 아미노산) 꼬리 뿐만 아니라 매우 작은 세포내 도메인(4개의 아미노산)을 갖는다. 단백질의 나머지 부분은 2개의 세포외 도메인(20개의 아미노산의 작은 하나의 EC1 및 83개의 아미노산의 큰 하나의 EC2)으로 구성된다. 4개의 잘 보존된 시스테인 잔기(C)에 의해 생성된 2개의 이황화 결합은 큰 세포외 도메인(EC2)을 안정화한다. CD9는 또한 테트라스파닌 시그니처(아미노산 65-89) 및 CCG 모티프(아미노산 152-154)를 함유한다. CD9는 엑소좀 표면에서 가장 편재적으로 발현되는 단백질 중 하나이고, 따라서 엑소좀 마커로 간주된다. 세포외 루프의 아미노산 서열에는 변동이 있지만, CD9 단백질 서열은 종 사이에서 매우 잘 보존되어 있다(인간, 마우스 및 래트 사이에 90%). CD9는 또한 특히 막관통 도메인에서 다른 테트라스파닌과 일부 상동성을 공유한다.
야생형 CD9는 다른 테트라스파닌, 인테그린, EWI 분자, TGF-a, 디프테리아 독소 수용체 또는 티로신 키나제, 임신 특정 당단백질 및 MHC 부류 II 분자와 같은 면역계의 단백질 및 Ig 수퍼패밀리의 구성원을 포함한 다른 많은 단백질과 상호 작용하거나 복합체를 형성할 수 있다. 더욱이, CD9는 혈소판 활성화 및 응집뿐만 아니라 세포 부착, 확산, 세포 운동성 및 종양 전이에 관여한다. CD9는 또한 마디결 접합 형성을 조절하며 생식세포 융합에 필요하다. 또한, CD9는 근육 세포 융합을 촉진하고 근관 유지를 지원한다.
본원에 기재된 바와 같이, 테트라스파닌 CD63은 4개의 막관통 도메인 및 3개의 추정 N-글리코실화 부위를 함유하는 고도로 글리코실화된 단백질 세포-표면 단백질이다.
야생형 CD63은 전형적으로 후기 엔도솜, 리소좀, 분비 소포 및 원형질막에 존재하며, 이러한 구획 사이를 이동한다. CD63은 광범위하고 가변적으로 글리코실화되고, 이의 EC2 영역은 3개의 잠재적인 N-연결된 글리코실화 부위(N130, N150 및 N172)를 함유한다. 그것은 종종 CD63이 풍부한 다소포체의 마커로서 사용된다. 그것은 CD82와 같은 다른 테트라스파닌; MHC 부류 II 분자 HLA-DR, HLA-DM 및 HLA-DO; 여러 인테그린; 및 포스파티딜이노시톨 4-키나제를 포함한 다수의 천연 상호 작용 파트너를 갖는다. CD63은 또한 극단적 C 말단에 티로신 기반 모티프를 함유한다. 막 단백질의 세포질 도메인 중 티로신 기반 모티프는 클라트린 어댑터 복합체에 의해 인식되고, 세포내 이입, 리소좀 표적화 및 기저 측 표적화에 중요한 역할을 한다. CD63의 티로신 기반 모티프는 어댑터 단백질 복합체 2 및 3(AP-2 및 AP-3)의 μ-서브유닛과의 상호 작용을 매개한다.
본원에 기재된 바와 같이, 테트라스파닌 CD151은 테트라스파닌의 특징적인 구조를 갖는다. 그것은 LEL에 단일 N-글리코실화 부위를 갖는 253-아미노산 단백질이며, 여러 시스테인 잔기에서 팔미토일화된다. 면역블롯팅은 CD151의 비글리코실화 및 글리코실화 형태를 나타내는 겉보기 kDa 28 및 32의 밴드의 이중선을 나타낸다. 인간 CD151은 서열번호 94로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
야생형 CD151은 상피, 내피, 근육, 신장 사구체 및 근위 및 원위 세뇨관, 슈반 세포 및 수지상 세포를 포함하는 광범위한 세포 및 조직 분포를 가지며, 대부분의 인간 성인 조직에서 단일 RNA 종이 관찰된다. CD151은 혈소판과 거핵 세포에서 높은 수준으로 발현된다. 다른 테트라스파닌과 마찬가지로, CD151은 여러 인테그린과 함께 세포막에서 연관된다.
모든 면역 세포는 테트라스파닌을 발현하지만, 이들 중 대부분은 다양한 다른 세포 유형에 존재한다. 조혈 계통에서 발견되는 CD37, CD53, TSPAN32(Tssc6) 및 TSPAN33과 같은 몇 가지가 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 테트라스파닌 CD37은 인테그린 및 다른 막관통 4 수퍼패밀리 단백질과 복합체를 형성하는 것으로 공지된 테트라스파닌의 전형적인 구조를 갖는 세포 표면 당단백질이다. 대체 스플라이싱은 상이한 동형을 인코딩하는 다수의 전사체 변이체를 초래한다. 인간 CD37은 서열번호 95로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
CD37은 면역계의 세포에 의해 발현되는 것으로 공지되어 있으며, 성숙한 B 세포에서 가장 풍부하고, T 세포와 골수 세포에서 더 낮은 발현이 발견된다. 야생형 CD37은 체액성 및 세포성 면역 반응을 모두 제어한다. 마우스의 CD37 결핍은 B 세포 림프종에서 자발적인 발달로 이어지며, CD37 음성 림프종 환자는 임상 결과가 더 나빠진다.
본원에 기재된 바와 같이, 테트라스파닌 CD53은 원형질막에 4번 스패닝하는 pan-백혈구 표면 당단백질이며 막관통 4 수퍼패밀리의 구성원이다. 마우스 CD53(Cd53)의 단백질 서열 및 유전자 구조는 게놈 및 cDNA 클론 둘 다의 단리에 의해 결정되었다. CD53은 마우스 Cd53이 랫트 CD53과 91% 동일하고 인간 CD53과 82% 동일하기 때문에 진화에서 매우 보존된다. 테트라스파닌 CD53은 4개의 막관통 도메인을 갖고, 그것은 제2 세포외 루프에서 2회 글리코실화된다. 그것은 219개 아미노산의 길이를 가지며, 세포막, 엔도솜 및 엑소좀의 지질 이중층 막에 위치한다. 인간 CD53은 서열번호 90으로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
야생형 CD53은 사실상 조혈 줄기 세포의 하위 집합인 모든 면역 세포에 의해, 다양한 혈액학적 악성 종양에서 발현된다.
CD9, CD151, Tssc6 및 CD63을 포함하여 혈소판에 존재하는 여러 테트라스파닌이 있다. 녹아웃 마우스 모델에서의 최근 연구는 CD151 및 Tssc6이 주요 혈소판 인테그린, 인테그린 알파(IIb)베타(3) 및 생체내 혈전 안전성의 '아웃사이드-인(outside-in)' 신호전달 특성의 조절에 물리적이고 기능적으로 관련됨을 나타냈다.
본원에 사용된 바와 같이, TSPAN32로서 칭명되기도 하는 테트라스파닌 Tssc6은 테트라스파닌 수퍼패밀리의 구성원이다. 단백질은 320개의 아미노산 크기를 가지며, 낮은 수준에서 편재적으로 발현된다. 높은 수준의 TSPAN32 발현은 전형적으로 말초 혈액 백혈구, 흉선 및 비장을 포함한 조혈 조직에 국한된다.
인간 TSPAN32는 서열번호 91로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
본원에 사용된 바와 같이, 리소좀 관련 막 단백질 2(LAMP2)는 리소좀 관련 막 당단백질이다. LAMP2는 2개의 보존된 내강 도메인(전체 단백질의 90% 구성), 단일 막관통(TM) 도메인(약 20개 아미노산) 및 짧은(10-12개 아미노산) C-말단 세포질 꼬리를 갖는 통합 막 단백질이다. 글리코실화는 내강 도메인에서 발견된다. 인간 LAMP2는 서열번호 96으로 동정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 본원에 사용된 바와 같이 LAMP2는 바람직하게는 인공 결합 부위를 포함하도록 소포외 루프 영역에서 변형을 포함한다.
야생형 LAMP2는 다양한 스트레스에 반응하여 단백질의 리소좀 분해를 매개하고 생물학적 반감기가 긴 단백질의 정상적인 전환의 일부로서의 과정인 샤페론-매개된 자식 작용에서 중요한 역할을 한다.
본원에 사용된 용어 "테트라스팬 유사 단백질"(때로는 테트라스파닌 유사라 칭명됨)은 적어도 2개의 막관통 도메인 및 상기 적어도 2개의 막관통 도메인 사이에 배치된 적어도 하나의 ED를 포함하는 EV 표면 단백질을 지칭할 것이며, 바람직하게는 여기서 상기 적어도 2개의 막관통 도메인 사이의 영역은 하나의 ED를 포함하거나 이로 구성된다.
테트라스팬 유사 단백질의 구체적인 예는 자연 발생 또는 변형된 테트라스파닌 단백질 및 기타, 예를 들어, 리소좀 관련 막 당단백질(LAMP), 또는 재조합 또는 합성 단백질, 예를 들어, 하나의 단백질의 하나 이상의 막관통 도메인 및 다른 단백질의 하나 이상의 ED를 포함하는 키메라 단백질이고, 이로 인해 재조합 테트라스팬 유사 단백질을 수득한다.
단백질 서열 및 이의 돌연변이체에 대하여 "서열 동일성" 또는 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는 서열을 정렬하고, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 필요하다면 갭을 도입한 후, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고 비교되는 특정 폴리펩티드 서열("부모 서열")의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "특이성", "표적-특이적" 또는 "특이적 결합"은 이종 분자 집단에서 관심있는 동족 리간드를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 조건(예: 면역검정 조건)하에서, 변형된 표면 단백질은 특정 표적에 결합하고샘플에 존재하는 다른 분자에 상당한 양으로 결합하지 않는다. 특이적 결합은 결합이 선택된 바와 같이 표적 동일성, 높은, 중간 또는 낮은 결합 친화성 또는 결합성 측면에서 선택적임을 의미한다. 선택적 결합은 일반적으로 결합 상수 또는 결합 동역학이 적어도 10배 상이하고, 바람직하게 차이가 적어도 100배, 보다 바람직하게는 적어도 1000배인 경우 달성된다.
특이적 결합은 유사한 항원 또는 상이한 종(유사체)의 동일한 항원과의 특정 교차 반응을 배제하지 않는다. 예를 들어, 결합 실체는 또한 바람직하게는 전임상 동물 연구를 촉진하기 위해 인간 표적과 유사한 설치류 표적과 교차 반응할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "표적"은 특히 항체의 결합 부위에 의해 인식될 수 있는 모든 항원 및 표적 분자를 포함할 것이다. 본원에 기재된 표면 단백질은 항체와 유사한 항원 구조 또는 에피토프를 특이적으로 인식하는 인공 표적 결합 부위를 포함하도록 조작된다.
특이적 표적은 세포 표적 또는 가용성 표적이다. 많은 경우에, 표적은 종양 세포의 표면에 위치한 수용체 또는 사이토카인 또는 대상체 또는 환자의 순환에 존재할 수 있는 성장 인자와 같은 자가-항원이다. 추가의 표적은 병원체 기원, 예를 들어, 미생물 또는 바이러스 병원체일 수 있다.
표적 항원은 전체 표적 분자로서 또는 이러한 분자의 단편, 특히 하위 구조, 예를 들어, 일반적으로 "에피토프"로 지칭되는 표적의 폴리펩티드 또는 탄수화물 구조, 예를 들어, B-세포 에피토프, T-세포 에피토프로서 인식되며, 이는 면역학적으로 관련되며, 즉 천연 또는 모노클로날 항체에 의해 인식 가능할 수도 있다.
구체적으로, 표적 항원은 수용체를 포함하는 세포 표면 항원, 특히 erbB 수용체 티로신 키나제(예: EGFR, Her2neu를 포함하는 HER2, HER3 및 HER4, 특히 이러한 수용체의 세포외 도메인의 에피토프, 예를 들어, 4D5 에피토프)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또한, 추가의 항원, 예를 들어, TNF-수용체 수퍼패밀리의 분자, 예를 들어, Apo-1 수용체, TNFR1, TNFR2, 신경 성장 인자 수용체 NGFR, CD40, CD40-리간드, OX40, TACI, BCMA, BAFF-수용체, T-세포 표면 분자, T-세포 수용체, T-세포 항원, Apo-3, DR4, DR5, DR6, 유인 수용체, 예를 들어, DcR1, DcR2, CAR1, HVEM, GITR, ZTNFR-5, NTR-1, TNFL1, IGFR-1, c-Met, 이들 분자에 제한되지 않지만, B 세포 표면 항원, 예를 들어, CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, DC-SIGN, 고형 종양 또는 혈액 암 세포의 항원 또는 마커, 림프종 또는 백혈병 세포, 이들 분자에 제한되지 않지만, 혈소판을 포함한 기타 혈액 세포가 표적화될 수 있다.
화합물, 특히 본원에 기재된 바와 같은 결합제, 특히 본원에 기재된 바와 같은 TEV의 임의의 용어 "유효량" 또는 "충분량"과 상호교환적으로 본원에 사용된 용어 "치료적 유효량"은 대상체에게 투여될 때 임상적 결과를 포함하여 유리하거나 목적하는 결과를 초래하기에 충분한 양 또는 활성이고, 따라서, 유효량 또는 이의 동의어는 적용되는 맥락에 따라 달라진다.
유효량은 질환 또는 장애를 치료, 예방 또는 억제하기에 충분한 화합물의 양을 의미하는 것으로 의도된다. 질환의 맥락에서, 본원에 기재된 바와 같은 결합제 또는 TEV의 치료적 유효량은 결합제 또는 TEV와 이의 표적 항원, 예를 들어, 종양 세포의 상호 작용으로부터 이익을 얻는 질환 또는 상태를 치료, 조절, 약화, 역전 시키거나 영향을 미치는 데 구체적으로 사용된다.
이러한 유효량에 상응하는 화합물의 양은 소정의 약물 또는 화합물, 약제학적 제형, 투여 경로, 질환 또는 장애의 유형, 치료될 대상체 또는 숙주의 동일성 등과 같은 다양한 인자에 따라 다르지만, 그럼에도 불구하고 당업자에 의해 일상적으로 결정될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 결합제는 약제학적 조성물에 구체적으로 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 결합제 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 이러한 약제학적 조성물은적절하게 볼루스 주사 또는 주입 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 비경구 투여 외에, 국소 투여 또는 경구 투여가 바람직할 수 있다. 이러한 투여 수단을 촉진시키는 데 적합한 약제학적 담체는 당업계에 익히 공지되어 있다.
약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 본원에 제공된 결합제와 생리학적으로 적합한 임의의 및 모든 적합한 용매, 보조제, 분산 매질, 코팅제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 추가의 예는 멸균수, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
적합한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 구체적으로 하나 이상의 임의의 및 모든 통상적인 용매, 분산 매질, 충전제, 고체 담체, 수용액, 코팅제, 국소 투여에 적합한 비히클, 기타 항균제, 등장성 및 흡수 증진제 또는 지연제, 또는 약제학적 활성 물질의 활성 향상제 또는 지연제를 포함한다. 통상의 약제학적으로 허용되는 첨가제는, 예로서, 문헌[참조: Remington: the Science & Practice of Pharmacy by Alfonso Gennaro, 20th ed., Lippencott Williams & Wilkins, (2000)]에 개시되어 있다.
하나의 구현예에서, 적합한 약제학적으로 허용되는 담체는 불활성 고체 충전제 또는 희석제 및 멸균 수성 또는 유기 용액(예: 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 에탄올, 벤질 알코올 등)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 특정 구현예에서, 적합한 약제학적으로 허용되는 부형제는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀라제, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 규산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 충전제, 예를 들어, 당(예: 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨) 및 셀룰로스 제제(예: 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈, PVP)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 이러한 측면에서, 결합제는 목적하는 투여 경로에 적합한 하나 이상의 담체와 결합될 수 있다, 예를 들어, 임의의 락토스, 수크로스, 전분, 알칸산의 셀룰로스 에스테르, 스테아르산, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 산화마그네슘, 인산 및 황산의 나트륨 및 칼슘 염, 아카시아, 젤라틴, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리딘, 폴리비닐 알코올과 혼합될 수 있고, 임의로 통상적인 투여를 위해 추가로 정제화되거나 캡슐화된다. 다른 담체, 보조제 및 투여 방식은 제약 분야에 익히 공지되어 있다. 담체는 제어 방출 물질 또는 시간 지연 물질, 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로 또는 왁스, 또는 당업계에 익히 공지된 다른 물질과 함께 포함할 수 있다.
추가의 약제학적으로 허용되는 담체는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌(참조: REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES)에 기재되어 있다. 액체 제형은 용액, 에멀젼 또는 현탁액일 수 있으며, 현탁제, 가용화제, 계면활성제, 방부제 및 킬레이트제와 같은 부형제를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 결합제 및 하나 이상의 치료적 활성제가 제형화되는 약제학적 조성물이 고려된다. 본원에 기재된 결합제의 안정한 제형은 목적하는 순도를 갖는 상기 작제물을 동결 건조된 제형 또는 수용액의 형태로 임의의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 저장용으로 제조된다. 생체내 투여용 제형은 바람직하게는 멸균성, 예를 들어, 멸균 수용액의 형태이다. 이것은 멸균 여과막 또는 기타 적합한 멸균 방법을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
본원에 기재된 결합제를 포함하는 약제학적 조성물의 투여는 경구, 피하, 정맥내, 비강내, 이내, 경피, 점막, 국소, 예를 들어, 정제, 겔, 연고, 고약, 좌약, 패치, 로션, 크림 등, 복강내, 근육내, 폐내, 질내, 비경구, 직장 또는 안구내를 포함하는 다양한 방식으로 수행될 수 있다.
하나의 구현예에서, 약제학적 조성물은 경구, 정맥내 또는 흡입 투여된다. 특정의 구현예에서, 결합제는 고체 투여 형태, 크림, 수성 혼합물, 동결 건조된 수성 혼합물 및 에어로졸로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 투여 형태로 투여된다.
비경구 투여용으로 사용된 예시적인 제형은 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 적합한 것들, 예를 들어, 멸균 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다.
본원에 기재된 결합제는 구체적으로 진단용 조성물로, 예를 들어, 시험관내 또는 생체내 용도로 사용될 수 있다. 따라서, 조성물에 또는 일부의 키트에 본원에 기재된 바와 같은 결합제, 및 임의로 진단용 시약을 포함하는 진단용 조성물이 제공된다.
진단 키트는 바람직하게는 임의로 통상적 또는 비특이적 물질 또는 성분, 예를 들어, 불, 완충제 또는 부형제 없이 생물학적 샘플에서 표적을 정성적 또는 정량적으로 결정하기 위해 모든 필수 성분을 포함한다. 저장 안정성 키트는 바람직하게는 적어도 6개월, 더 바람직하게는 적어도 1년 또는 2년의 저장 수명으로 제공할 수 있다. 이는 건조(예: 동결 건조) 성분으로 구성될 수 있고/있거나 방부제를 포함할 수 있다.
바람직한 진단 키트는, 예를 들어, 패키징된 또는 사전패키징된 유닛으로서 제공되며, 여기서 성분은 하나의 패키지에만 함유되고, 이는 일상적인 실험을 촉진시킨다. 이러한 패키지는 하나 이상의 테스트에 필요한, 예를 들어, 일련의 생물학적 샘플의 테스트를 수행하기에 적합한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 추가로적합하게 표준 또는 참조 대조군을 함유할 수 있다.
진단용 조성물은 생리학적 샘플과의 반응 혼합물로 바로 사용할 시약, 또는 이러한 시약의 보존된 형태, 예를 들어, 동결 건조된 것과 같은 저장 안정성 형태; 급속 동결된(예: 액체 질소에서) 초저온 저장(-70℃ 내지 -80℃), 냉동 저장(-20℃ 내지 5℃) 및 제어된 실온(15℃ 내지 27℃); 예를 들어, 글리세롤-스톡, 조직 파라핀-블록, (협측) 면봉 및 다른 표준 생물학적 샘플 저장 방법일 수 있고, 이러한 시약의 보존된 형태는 즉시 사용 가능한 시약을 수득하기 위해 재구성되거나 제조될 수 있다. 이러한 즉시 사용 가능한 시약은 전형적으로 수용액의 형태, 구체적으로 (생리학적) 완충제 상태(예" EDTA 완충됨, 인산염 완충제, HBSS, 시트레이트 완충제 등)이다 .
구체적으로, 추가의 진단 시약은 구체적으로 결합제와 반응하는 시약 및/또는 이의 표적에 결합하는 결합제의 반응 생산물이다. 적합한 진단 시약은 용매, 완충제, 염료, 항응고제, 본원에 기재된 결합제 및/또는 결합제-표적 복합체에 특이적으로 결합하는 리간드일 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 임의로 표지를 갖는 결합제 및/또는 표지를 갖는 추가의 진단 시약, 예를 들어, 결합제 또는 결합제와 각각의 표적의 복합체를 특이적으로 인식하는 시약, 및/또는 적어도 하나의 결합제 및 진단 시약을 고정하기 위한 고체 상을 함유하는 본원에 기재된 결합제의 진단용 제제를 제공한다.
구체적으로, 추가의 진단 시약은 진단 표지 또는 결합제 및/또는 표적에 결합하는 결합제의 반응 생산물과 특이적으로 반응하는 시약이다.
EV 또는 진단 시약은 직접 표지되거나 간접적으로 표지될 수 있다. 간접적 표지는 결합제 또는 표적에 대한 진단 시약과 복합체를 형성하는 표지된 결합제를 포함할 수 있다.
표지는 전형적으로 검정에서 검출될 수 있는 분자 또는 분자의 일부이다. 예시적인 표지는 발색단, 형광 색소 또는 방사성 분자이다. 일부 구현예에서, EV 또는 진단 시약은 자체로 검출 가능한 분자(예: 형광 잔기, 전기화학적 표지, 금속 킬레이트 등)뿐만 아니라 검출 가능한 반응 생산물(예: 효소, 예를 들어, 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타데 등)의 생산에 의해 또는 자체로 검출 가능할 수 있는 특정 결합 분자(예: 비오틴, 디곡시게닌, 말토스, 올리고히스티딘, 2,4-디니트로벤젠, 페닐아르제네이트, ssDNA, dsDNA 등)에 의해 간접적으로 검출될 수 있는 분자를 포함하는 검출 가능한 표지에 접합된다.
바람직한 진단 제제 또는 검정은 고체 상, 예를 들어, 라텍스 비드, 금 입자 등에 고정된 본원에 기재된 EV를 포함한다.
다음 항목은 본 발명의 특정 구현예로 간주된다:
1. 표적을 특이적으로 인식하는 인공 결합 부위를 포함하는 표면 단백질을 고정시키는 지질 이중층 막을 포함하는 표적-특이적 세포외 소포(EV)로서, 상기 결합 부위가 상기 표면 단백질의 적어도 2개의 먼 영역 내에 결합 잔기를 포함하는, 표적-특이적 세포외 소포(EV).
2. 항목 1에 있어서, 상기 표면 단백질이 소포 막 단백질의 막관통 도메인을 포함하고, 이 막관통 도메인이 표면 단백질을 EV에 고정시키는, EV.
3. 항목 2에 있어서, 상기 막 단백질이 바람직하게는 CD81, CD9, CD37, CD53, CD63 및 CD82, 또는 LAMP2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 테트라스팬 단백질인, EV.
4. 항목 1 내지 항목 3 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 표면 단백질이 CD81이고, 상기 결합 잔기가 위치 160과 172 사이의 제1 영역 내에, 그리고 위치 132와 139 사이 또는 위치 180과 189 사이에 위치한 적어도 하나의 추가 영역 내에 위치하고, 여기서 번호매김은 서열번호 87로 동정된 CD81의 것인, EV.
5. 항목 4에 있어서, 상기 표면 단백질이 단백질의 소포외 루프 구조를 안정화시키는 하나 이상의 추가 이황화 결합의 형성을 허용하는 위치(들)에 하나 이상의 시스테인(들)을 도입함으로써 안정화된 CD81인, EV.
6. 항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, 신체 조직, 체액 또는 세포 배양물의 진핵 또는 원핵 공급원 세포에서 유래하는, EV.
7. 항목 1 내지 6 중 어느 한 항목에 있어서, 소포내 로드를 운반하고, 상기 로드가 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 도메인, 단백질, 지질, 유전자, 핵산, 예를 들어, mRNA, miRNA, RNAi 매개 분자, 특히 록킹된 핵산 또는 포스포로티오에이트, DNA, DNA 단편, 플라스미드, 예를 들어, 미니서클 DNA, 약물, 예를 들어, 작은 분자, 특히 화학요법제 또는 세놀리틱스 중 임의의 하나 이상을 포함하는, EV.
8. 항목 1 내지 7 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 표적이 세포 표적, 예를 들어, 유사 분열 수용체, 사이토카인 수용체, 아시알로당단백질 수용체, 막 수송체, 지단백질, 리포사카라이드, 당단백질, 프로테오글리칸 또는 무세포 표적, 예를 들어, 사이토카인, 인공 단백질 또는 인공 표면 구조로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, EV.
9. 항목 1 내지 8 중 어느 한 항목의 EV, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 바람직하게는 피내, 피하, 정맥 내, 국소 또는 경구 사용을 위한 제형으로 포함하는 약제학적 제제.
10. 항목 1 내지 8 중 어느 한 항목의 EV 제제를 생산하는 방법으로서,
a) 표면 단백질을 인코딩하는 유전자를 공급원 세포 또는 공급원 세포 혼합물에 도입하는 단계;
b) 세포외 소포를 생산하는 조건하에서 상기 세포(들)를 배양하는 단계;
c) 표적 결합 특이성을 갖는 EV를 포함하는 분획을 단리하는 단계; 및
d) EV 제제를 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
11. 항목 10에 있어서, 상기 유전자가 표적을 특이적으로 인식하는 인공 결합 부위를 포함하도록 돌연변이 유발 방법에 의해 변형되고, 여기서 상기 돌연변이 유발 방법이 상기 표면 단백질의 적어도 2개의 먼 영역의 돌연변이 유발을 사용하여 각각 상이한 결합 특이성을 갖는 다양한 표면 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 레퍼토리를 생산하고, 표적을 특이적으로 인식하는 표면 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 선택하는, 방법.
12. 항목 11에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 레퍼토리가 바람직하게는 파지, 효모, 박테리아, 리보솜, mRNA 또는 포유류 세포 디스플레이로 이루어진 그룹에서 선택된 디스플레이 시스템을 사용하여 외부 표면에 다양한 표면 단백질을 표시하는 유전적 패키지에 포함되는, 방법.
13. 자가 사용하기 위한, 항목 10 내지 12 중 어느 한 항목에 따라 제조된 EV 제제로서, 상기 공급원 세포 또는 공급원 세포 혼합물이 대상체로부터 수득되고, 상기 EV 제제가 동일한 대상체에게 투여되는, EV 제제.
14. 항목 10 내지 12 중 어느 한 항목에 있어서, EV 라이브러리를 생산하기 위한 것이고,
a) 다양한 표면 단백질을 인코딩하는 유전자의 레퍼토리가 상기 공급원 세포(들)에 도입되고;
b) 다양한 표적 결합 특이성을 갖는 표적 결합 EV의 레퍼토리를 포함하는 EV 라이브러리를 생산하기 위해 각각 상이한 표적 결합 특이성을 갖는 EV의 레퍼토리가 단리되고,
여기서 상기 레퍼토리는 상기 유전자의 적어도 2개의 소정의 먼 영역 내에서 상기 유전자를 돌연변이 유발함으로써 생산되는, 방법.
15. 항목 14의 방법에 의해 생산된 EV의 라이브러리로서, 바람직하게는 상기 레퍼토리가 상이한 표적 특이성을 갖는 적어도 102개의 EV를 포함하는, EV의 라이브러리.
본원에 기재된 실시예는 본 발명을 예시하는 것이며 이에 대한 제한을 의도하지 않는다. 본 발명의 상이한 구현예가 본 발명에 따라 기재되었다. 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본원에 기재되고 예시된 기술에 대해 많은 변형 및 변경이 이루어질 수 있다. 따라서, 실시예는 단지 예시일 뿐이며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다.
실시예
실시예 1: CD81 LEL의 효모 디스플레이
야생형 인간 CD81 LEL 서열은 Aga2와 함께 C-말단 융합 단백질로 클로닝되고, Xpress-태그가 선행되고 C-말단 첨부된 his-태그 및 V5-태그를 가졌다.
CD81 LEL의 아미노산 서열은 다음과 같았다:
(서열번호 7):
FVNKDQIAKDVKQFYDQALQQAVVDDDANNAKAVVKTFHETLDCCGSSTLTALTTSVLKNNLCPSGSNIISNLFKEDCHQKIDDLFSGK.
코딩 뉴클레오티드 서열은 다음과 같았다:
(서열번호 8):
TTTGTCAACAAGGACCAGATCGCCAAGGATGTGAAGCAGTTCTATGACCAGGCCCTACAGCAGGCCGTGGTGGATGATGACGCCAACAACGCCAAGGCTGTGGTGAAGACCTTCCACGAGACGCTTGACTGCTGTGGCTCCAGCACACTGACTGCTTTGACCACCTCAGTGCTCAAGAACAATTTGTGTCCCTCGGGCAGCAACATCATCAGCAACCTCTTCAAGGAGGACTGCCACCAGAAGATCGATGACCTCTTCTCCGGGAAG.
인간 CD81 LEL의 증폭을 위한 프라이머는 다음과 같았다:
(서열번호 9): ACGTGGATCCTTTGTCAACAAGGACCAGATC
(서열번호 10): ACGTGCGGCCGCGCCTTCCCGGAGAAGAGGTC.
PCR 산물을 BamHI 및 NotI로 절단하고 상응하게 절단된 벡터 pYD1(Thermo Fisher Scientific)로 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 전기적합 이. 콜리(E. coli) TOP10으로 형질 전환시키고 형질 전환체를 암피실린 플레이트에서 선택하였다. 플라스미드는 미니프렙으로 단리시키고, 화학적 형질 전환을 사용하여 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) EBY100으로 형질 전환시켰다. 20ml의 YPD 배지(2% 펩톤, 1% 효모 추출물, 2% 글루코스)(Merck) 중의 EBY100(Thermo Fisher Scientific)의 종균 배양물을 30℃ 및 180rpm에서 밤새 배양했다. 이어서, 배양물을 0.4의 OD600으로 희석하고, 30℃ 및 180rpm에서 약 5시간 동안 배양하였다. 이어서, 50ml의 세포 배양물 분취액을 실온에서 5분 동안 1000g에서 펠릿화한 다음, 25ml의 AD로 세척하고 다시 펠릿화했다. 세포를 3ml의 100mM Li-아세테이트에 재현탁시키고, 진탕 배양기에서 30℃에서 15분 동안 배양하였다. 이어서, 0.3ml의 세포 현탁액을 펠릿화하고 상청액을 제거했다. 형질 전환 혼합물의 성분은 다음과 같이 첨가되었다: 240μl 50% PEG 3350, 36μl 1.0M Li-아세테이트, 50μl 2mg/ml ssDNA(연어 정자 담체 DNA, 사전에 5분 동안 95℃까지 가온한 다음, 얼음 위에 놓는다)(Sigma Aldrich) 및 1㎍의 pYD1-CD81 LEL 플라스미드. 세포 펠릿을 형질 전환 혼합물에 재현탁시키고, 30℃에서 30분 동안 진탕 배양기에서 배양한 다음 42℃에서 45분 동안 열 충격을 가했다. 효모 세포를 RT에서 5분, 1000g에서 펠릿화하고, AD에 재현탁시키고, 형질 전환체를 30℃에서 3일 동안 MDL 배지에서 선택했다.
형질 전환체를 SD-CAA(1% 카사미노산(Becton Dickinson), 100mM K-인산염 완충제, pH 6.0(Merck), 1xYNB(Becton Dickinson), 2% 글루코스(Merck))에 접종하고, 30℃에서 밤새 배양했다. 유도는 37℃에서 밤새 또는 20℃에서 2일 동안 SG/R-CAA 배지(1% 카사미노산(Becton Dickinson), 100mM K-인산염 완충제, pH 6.0(Merck), 1xYNB(Becton Dickinson), 2% 갈락토스(Merck), 1% 라피노스(Merck))로 이루어졌다. 이어서, 효모 배양물은 재조합 단백질의 발현에 대해 조사했다. FACS 분석은 리포터 태그만을 인코딩하는 변형되지 않은 발현 벡터로 형질 전환된 효모와 유사한 디스플레이 수준을 나타냈다. 또한, 효모 배양물은 표시하는 야생형 CD81 LEL은 구조 보고 항체 M38 및 1.3.3.22(Thermo Fisher Scientific)로 염색하였으며, 결과는 조사된 태그와 동일한 발현 수준을 나타냈다. FACS 분석은 20℃ 또는 37℃의 스트레스 조건에서 유도된 배양물에 대해 유사한 디스플레이 수준을 나타냈다. 태그의 발현은 태그만을 인코딩하는 벡터로 형질 전환된 효모에 대해 발견된 것과 유사한 수준이었다. 또한, 야생형 CD81을 발현하는 효모 세포는 20℃에서 유도된 세포와 유사하게 항-CD81 항체로 염색시켰다.
실시예 2: CD81 LEL의 파지 디스플레이
야생형 CD81 LEL을 코딩하는 서열은 c-myc 태그 및 g3p 단백질로부터 N-말단 위치하는 재조합 단백질로의 파지 입자의 발현을 허용하는 발현 벡터 fdmyc의 다중 클로닝 부위로 클로닝하였다. 증폭을 위한 프라이머는 다음과 같다:
(서열번호 11): ACGAGTGCACAGTTTGTCAACAAGGACCAGATC
(서열번호 12): ACGTGCGGCCGCCTTCCCGGAGAAGAGGTC.
PCR 산물을 제한 효소 ApaL1 및 NotI로 절단하고, 상응하게 절단된 벡터 fdmyc에 결찰시켰다. 결찰 혼합물은 이. 콜리 TG1 세포(Thermo Fisher Scientific)로 형질 전환시키고, 테트라사이클린-함유 TYE-플레이트(1.5% 한천, 1.6% 펩톤, 1% 효모 추출물(Merck))에서 선택했다. 테트라사이클린-함유 배지에서 30℃에서 밤새 배양 후, 높은 역가의 1011-1012 파지 입자/L 배양물을 수득하여 발현된 단백질이 파지 증식에 유해하지 않음을 나타낼 수 있다. 융합 단백질의 발현 수준은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅으로 파지 입자의 분석을 사용하여 테스트되었다. 표시된 단백질의 검출은 항-g3p 항체(New England Biolabs)로 수행되었으며, 야생형 CD81 LEL과 50% 융합되는 것으로 밝혀졌다. 파지 유래된 CD81 LEL은 CD81 특이적 항체, M38 및 1.3.3.22 모두로 검출될 수 있으며, 이는 파지 표시된 분자의 올바른 접힘을 나타낸다.
실시예 3: 가용성 CD81 LEL의 발현
CD81 LEL 서열은 다음 프라이머로 증폭되었다:
(서열번호 13): ACGTGCTAGCTTTGTCAACAAGGACCAGATC
(서열번호 14): ACGTGGATCCTCATCACTTCCCGGAGAAGAGGTC.
PCR 단편은 제한 효소 NheI 및 BamHI로 절단하고, 동일한 효소로 절단된 벡터 pTT22SSP4(CNRC)에 결찰시켰다. 결찰 혼합물은 전기적합 이. 콜리 TOP10(Thermo Fisher Scientific)로 형질 전환시키고, 형질 전환체는 암피실린 플레이트 상에서 선택했다. 플라스미드는 미니프렙으로 단리시키고, 정확히 제조업체의 지침에 따라 HEK-293-6E 세포(CNRC)로 형질 감염시켰다. 단백질 발현은 TN-20을 첨가하여 0.5%의 최종 농도로 5일 동안 진행시켰다. 이어서, hCD81 LEL을 표준 프로토콜을 사용하여 Ni-NTA 크로마토그래피를 통해 정제했다. 상청액을 PBS 및 20mM 이미다졸로 완충하고, pH를 7.5로 조정하였다. Excel Ni-NTA 컬럼(GE Healthcare)을 PBS 및 20mM 이미다졸, pH 7.5로 평형화하고, 완충된 상청액을 로딩했다. 용출은 PBS, pH 7.5 중 20 내지 500mM 이미다졸의 선형 구배로 5 컬럼 용적으로 이루어졌다. 단백질 함유 분획을 풀링하고, 밤새 4℃에서 100배 용적의 PBS에 대해 투석하였다.
네이티브 조건에서의 SEC 분석은 가용성 야생형 CD81 LEL과 유사하게 단백질의 이량체 형태에 상응하는 단분산 용출 프로파일을 나타냈다.
대안적으로, 단백질은 정확히 제조업체의 지침에 따라 MaxTiter 프로토콜에 따라 ExpiCHO 발현 시스템(Thermo Fisher Scientific)에서 발현되었다. 이어서, hCD81 LEL을 표준 프로토콜을 사용하여 Ni-NTA 크로마토그래피를 통해 정제했다. 상청액을 동일한 용적의 AD로 희석하고, PBS 및 20mM 이미다졸로 완충하고 pH를 7.5로 조정했다. Excel Ni-NTA 컬럼(GE Healthcare)을 PBS 및 20mM 이미다졸, pH 7.5로 평형화하고, 완충된 상청액을 로딩했다. 용출은 PBS, pH 7.5 중 20 내지 500mM 이미다졸의 선형 구배로 5 컬럼 용적으로 이루어졌다. 단백질 함유 분획을 풀링하고, 4℃에서 밤새 100배 용적의 PBS에 대해 투석하였다.
실시예 4: CD81 라이브러리 1의 작제
CD81 LEL의 C- 및 D-세그먼트의 총 12개 아미노산 잔기에서 무작위화된 CD81 LEL 돌연변이체의 효모 디스플레이 라이브러리가 작제되었다. 아미노산 잔기: 160-162 및 181-189(1G8Q에서와 같이 번호매김)가 무작위화되었다. 효모 디스플레이 라이브러리는 7x107 독립 구성원 크기로 제조되었다. 재조합을 위한 PCR 단편은 다음 올리고뉴클레오티드를 사용하고 Q5 HiFi 폴리머라제(New England Biolans)를 사용하고 제조하고, 겔 전기영동 후 정제했다:
(서열번호 15):
CTTCCACGAGACGCTTGACTGCTGTGGATCCNNKNNKNNKACTGCTTTGACCACCTC,
여기서, N은 A, C, G 또는 T 중 어느 하나이다.
(서열번호 16):
CCGCGCCTTCCCGGAGAAGAGGTCATCGATCTTCTGGTGGCAAKMMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNGTTGCTGCCCGAGGGAC,
여기서, N은 A, C, G 또는 T 중 어느 하나이고; M은 A 또는 C 중 어느 하나이다.
PCR 단편의 재조합을 용이하게 하기 위해 수령자 벡터를 변형시켰다. 모든 돌연변이 유발 단계는 정확히 제조업체의 지침에 따라 QuikChange Lightning 돌연변이 유발 키트(Agilent)를 사용하여 수행되었다.
BamHI 부위는 다음 올리고뉴클레오티드를 사용하여 pYD1_CD81 LEL에 도입하고:
(서열번호 17): GCTTGACTGCTGTGGATCCAGCACACTGACTG
(서열번호 18): CAGTCAGTGTGCTGGATCCACAGCAGTCAAGC,
이어서, 자연 발생하는 BamHI 부위는 다음 올리고뉴클레오티드를 사용하여 제거했다:
(서열번호 19): CGATAAGGTACCAGGTTCCTTTGTCAACAAG
(서열번호 20): CTTGTTGACAAAGGAACCTGGTACCTTATCG.
벡터는 BamHI 및 ClaI로 선형화되었고, 벡터 백본은 아가로스 겔로부터 정제되었다. 화학적 형질 전환을 사용하여 PCR 단편 및 벡터 백본을 에스. 세레비지애 EBY100에 도입하였다. 20ml의 YPD 배지 중 EBY100의 종균 배양물을 30℃ 및 180rpm에서 밤새 배양했다. 이어서, 배양물을 OD600 = 0.4로 희석하고, 30℃ 및 180rpm에서 약 5시간 동안 배양했다. 이어서, 50ml의 세포 배양물의 분취액을 실온에서 5분 동안 1000g에서 펠릿화한 다음, 25ml의 AD로 세척하고, 다시 펠릿화했다. 세포를 3ml의 100mM Li-아세테이트에 재현탁시키고, 진탕 배양기에서 30℃에서 15분 동안 배양하였다. 세포를 펠릿화하고, 상청액을 제거했다. 형질 전환 혼합물의 성분은 다음과 같이 첨가했다: 2400μl 50% PEG 3350, 360μl 1.0M Li-아세테이트, 500μl 2mg/ml ssDNA(연어 정자 담체 DNA, 사전에 5분 동안 95℃까지 가온한 다음, 얼음 위에 놓음), 10μg 선형화된 수령자 벡터 및 7μg DNA 단편. 세포 펠릿을 형질 전환 혼합물에 재현탁시키고, 30℃에서 30분 동안 진탕 배양기에서 배양하고 42℃에서 45분 동안 열 충격을 가했다.
실온에서 5분 동안 1000g에서 원심분리로 세포를 수집하고 상청액을 제거한 후, 펠릿을 10ml SD-CAA 배지(1% 카사미노산(Becton Dickinson), 100mM의 K-인산염 완충제, pH 6.0(Merck), 1xYNB(Becton Dickinson), 2% 글루코스(Merck)에 재현탁시켰다. 분취액을 라이브러리 크기를 결정하기 위한 희석 플레이팅을 위해 제거했다: 10μl의 세포 현탁액을 990μl SD-CAA 배지에서 희석시키고, 이중 100μl를 MDL 플레이트(1.5% 한천(Merck), 1xYNB(Becton Dickinson), 2% 글루코스(Merck) 및 0.01% 류신(Sigma-Aldrich))에 놓고 30℃에서 3일 동안 배양했다. 효모 세포를 50ml SD-CAA 배지에서 희석시키고, 30℃ 및 180rpm에서 24시간 동안 배양하고, 1:20 희석으로 신선한 SD-CAA 배지로 계대하고 동일한 조건하에서 추가의 24시간 동안 배양했다. 세포는 4℃에서 5분, 1000g에서 수거하고, 펠릿은 -80℃에서 동결시키기 전에 동일한 용적의 30% 글리세롤에 재현탁시켰다.
실시예 5: 마우스 EGFR-Fc를 사용한 CD81 LEL 라이브러리 1의 선택
마우스 EGFR-Fc는 Sino Biological에서 구입했다. 비오티닐화를 위해, EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-LC-비오틴 시약을 3:1 몰 비로 사용했다. 항원은 정확히 제조업체의 지침에 따라 0.25μg/μl의 농도로 재구성되었다. 비오티닐화 시약과의 배양은 실온에서 1시간 동안 진탕시키면서 진행되었다. 결합되지 않은 비오틴은 100x 용적의 PBS에 대한 투석으로 10.000 Da MWCO를 갖는 Snakeskin 투석 튜브(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 4℃에서 밤새 교반하면서 제거했다.
선택을 위해, 라이브러리를 SD-CAA에 접종하고 30℃에서 밤새 배양했다. 유도는 37℃에서 밤새 SG/R-CAA 배지로 이루어졌다. 유도된 세포 현탁액을 10% BSA-PBS 1ml당 108개 세포로 희석시키고, 20℃에서 5분 동안 1000g에서 원심분리시켰다. 세포를 차단하기 위해, 펠릿을 10% BSA-PBS 1ml에 재현탁시키고, 회전 플랫폼에서 20℃에서 30분 동안 배양했다. 세포를 3000rpm에서 5분 동안 20℃에서 원심분리하고, 1μM 비오티닐화된 EGFR-Fc를 함유하는 250μl 10% BSA-PBS에 재현탁시켰다. 회전 플랫폼에서 실온에서 30분 동안 배양한 후, 세포를 4℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리했다. 세포를 세척하기 위해, 펠릿을 1ml 빙냉 PBS에 재현탁시키고, 4℃에서 5분 동안 1000g에서 원심분리했다. 이어서, 세포를 스트렙타비딘-Alexafluor 647(1:800) 및 항-V5-FITC 항체(1:100)(Thermo Fisher Scientific)와 함께 250㎕의 10% BSA-PBS에 재현탁시키고, 얼음 위에서 30분 동안 배양했다. 세포를 3000rpm에서 5분 동안 4℃에서 원심분리하고, 그들을 빙냉 PBS 1ml에 재현탁시킨 다음 다시 원심분리시켰다. 마지막으로, 세포는 250μl 빙냉 PBS에 재현탁시키고, FACS AriaTM으로 분류할 때까지 얼음에 정치시켰다. 1차 분류는 2.5x 라이브러리 크기를 커버하고, 1% 위양성 효모 세포를 수집하고, 2차 분류에서 1차 분류의 20x 출력을 처리하고, 0.1% 위양성 효모 세포를 증식시켰다. 다음 두 번의 분류 라운드에서, 이전 분류의 적어도 100x 출력을 처리하고, 다시 0.1%의 효모 세포를 수집하고, 4차 분류 후에 단일 효모 디스플레이 클론을 특성화하기 위해 플레이트 아웃했다. 23개의 선택된 클론을 마우스 EGFR-Fc로 염색하여 스크리닝하고, 클론 9, 10 및 23을 제외한 모든 클론은 항원으로 유의하게 염색되었지만 2차 시약 스트렙타비딘-Alexafluor 647로는 염색되지 않았다.
항원 마우스 EGFR-Fc 및 2차 시약 스트렙타비딘-Alexafluor 647을 사용하거나 2차 시약 스트렙타비딘-Alexafluor 647만을 사용하여 선택된 CD81 LEL 변이체를 표시하는 효모 클론의 형광 중앙치.
효모 단독 2차 단독 항원 + 2차
1 15.69 33.12
2 12.81 22.36
3 12.49 23.39
4 12.42 16.48
5 16.96 34.12
6 11.39 24.6
7 8.84 18.65
8 16.14 51.32
9 14.59 11.76
10 13.96 16.18
11 19.67 36.52
12 25.87 56.93
13 21.36 47.54
14 19.85 26.23
15 16.93 43.68
16 14.61 26.19
17 18.56 21.22
18 16.67 57.94
19 16.72 20.57
20 15.67 13.24
21 10.08 33.69
22 14.03 18.58
23 20.27 15.97
야생형 CD81 LEL 28.27 9.1
서열분석시, 6개의 상이한 서열이 동정되었다(표 2).
동정된 서열
클론 나선 C
(AA 160-162) 		세그먼트 D
(AA 181-189)
1 VRR RRPRKRTRS (서열번호1)
2 ERL RRSRRRVHD (서열번호2)
3 RAN IWRARRRRS (서열번호3)
4 ERL RRSRRRVHD (서열번호2)
5 SFS RRFRKRPGD (서열번호4)
6 SSS SRRWRHRIA (서열번호5)
7 ERL RRSRRRVHD (서열번호2)
8 VRR RRPRKRTRS (서열번호1)
9 MGN WWGRRFRVS (서열번호6)
10 ERL RRSRRRVHD (서열번호2)
11 ERL RRSRRRVHD (서열번호2)
12 ERL RRSRRRVHD (서열번호2)
13 RAN IWRARRRRS (서열번호3)
14 ERL RRSRRRVHD (서열번호2)
15 VRR RRPRKRTRS (서열번호1)
16 ERL RRSRRRVHD (서열번호2)
17 ERL RRSRRRVHD (서열번호2)
18 SSS SRRWRHRIA (서열번호5)
19 SFS RRFRKRPGD (서열번호4)
20 ERL RRSRRRVHD (서열번호2)
21 RAN IWRARRRRS (서열번호3)
22 ERL RRSRRRVHD (서열번호2)
23 ERL RRSRRRVHD (서열번호2)
실시예 6: 인간 EGFR-Fc를 사용한 CD81 라이브러리 1의 선택
인간 EGFR-Fc는 Sino Biological에서 구입했다. 비오티닐화를 위해, EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-LC-비오틴 시약을 3:1 몰 비로 사용했다. 항원은 정확히 제조업자의 지침에 따라 0.25μg/μl의 농도로 정확하게 재구성되었다. 비오티닐화 시약과의 배양은 실온에서 1시간 동안 진탕시키면서 진행되었다. 결합되지 않은 비오틴은 100x 용적의 PBS에 대한 투석으로 10.000 Da MWCO와 함께 Snakeskin 투석 튜브(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 4℃에서 밤새 교반하면서 제거했다.
분류를 위해, 라이브러리는 밤새 진탕시키면서 30℃에서 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 SD-CAA에서 먼저 배양한 다음, 재조합 단백질의 발현은 페니실린-스트렙토마이신을 갖는 SG/R-CAA 배지에 효모 세포를 재현탁시키고, 그들을 37℃에서 밤새 진탕시키면서 배양하여 유도했다.
MACS의 경우, 109개의 유도된 효모 세포를 2500g에서 5분 동안 펠릿화하고, 펠릿을 50ml 세척 완충제(PBS, pH 7.2, 0.25% BSA, 2mM EDTA)에 재현탁시켜 세척하고, 2500g에서 5분 동안 다시 펠릿화했다. 세척된 세포를 0.25μM 비오티닐화된 항원을 함유하는 25ml 세척 완충제에 재현탁시키고, 부드럽게 진탕시키면서 실온에서 30분 동안, 빙욕에서 10분 동안 배양했다. 이어서, 세포 및 항원 용액을 2500g 및 4℃에서 5분 동안 펠릿화하고, 50ml 세척 완충제로 2회 세척하고 각 세척 단계 후에 펠릿화하였다. 세포를 5ml 세척 완충제 + 25μl 스트렙타비딘 마이크로비드(μMACS 스트렙타비딘 키트, MACS Miltenyi)에 재현탁시키고, 얼음에서 10분 동안 배양했다. 마지막으로, 15ml 세척 완충제를 첨가하였다.
LS 컬럼을 분리기에 넣고 3ml의 세척 완충제를 적용하여 컬럼을 사전 조정했다. 이어서, 세포 용액을 7ml 배치에 로딩했다. 컬럼의 낙하가 중지되면, 그것을 자석에서 간단히 제거하고, 자석에 다시 배치하여 컬럼에서 비드의 방향을 변경하여 포획된 세포가 유동하도록 했다. 다음 7ml 세포 현탁액을 로딩하기 전에 1ml의 세척 완충제를 컬럼에 적용했다. 이러한 단계는 모든 세포가 로딩될 때까지 반복되었다. 이어서, 컬럼을 3ml 세척 완충제로 세척하고, 자석에서 간단히 제거하고 3ml 세척 완충제로 다시 세척하였다. 결합 세포를 용출시키기 위해, 컬럼을 자석에서 제거하고, 5ml 세척 완충제를 첨가했다. 제공된 플런저를 사용하여 세포를 컬럼을 통해 새로운 튜브로 밀어 넣었다. 결합 세포 분획을 2,500g에서 5분 동안 펠릿화하였다. 펠릿을 10ml SD-CAA 배지에 재현탁시키고, 30℃ 및 180rpm에서 밤새 배양했다. 10μl의 용출된 세포를 990μl SD-CAA에서 희석시키고, 100μl를 MDL 플레이트에 플레이팅하고 3일 동안 30℃에서 배양하여 MACS 절차의 출력을 추정했다.
이후의 FACS 선택 라운드에서, 유도된 세포 현탁액을 10% BSA-PBS 1ml 당 108개의 세포로 희석하고 3000rpm에서 5분 동안 20℃에서 원심분리했다. 세포를 차단하기 위해, 펠릿을 10% BSA-PBS 1ml에 재현탁시키고 회전 플랫폼에서 20℃에서 30분 동안 배양했다. 세포를 3000rpm에서 5분 동안 20℃에서 원심분리하고, 1μM 비오티닐화된 EGFR-Fc를 함유하는 250μl의 10% BSA-PBS에 재현탁시켰다. 회전 플랫폼에서 20℃에서 30분 동안 배양한 후 세포를 4℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리했다. 세포를 세척하기 위해, 펠릿을 1ml 빙냉 PBS에 재현탁시키고, 4℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리했다. 이어서, 세포를 스트렙타비딘-Alexafluor 647(1:800) 및 항-V5-FITC 항체(1:100)(Thermo Fisher Scientific)와 함께 250㎕의 10% BSA-PBS에 재현탁시키고, 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 3000rpm에서 5분 동안 4℃에서 원심분리한 후 그들을 빙냉 PBS 1ml에 재현탁시키고 다시 원심분리했다. 마지막으로, 세포를 250μl의 빙냉 PBS에 재현탁시키고 FACS AriaTM으로 분류할 때까지 얼음에 정치시켰다. 이전 분류 라운드의 적어도 20x 출력을 처리하고, 0.1% 상위 항-V5-항체 양성 효모 세포를 수집했다. 5차 분류를 플레이트 아웃하여 단일 효모 디스플레이 클론을 특성화했다.
다음 결합제의 서열이 동정되었다(표 3):
동정된 결합제의 서열
클론 나선 C
(AA 160-162) 		세그먼트 D
(AA 181-189)
1 ILG PHHWRFPKA (서열번호 181)
실시예 7: CD81 LEL 라이브러리 2의 작제
항원 특이적 CD81 LEL 결합제의 가능한 레퍼토리를 확장하기 위해, CD81 LEL 라이브러리 1에서 무작위화된 것들과 상이한 아미노산 잔기가 잠재적인 항원 인식 부위를 형성할 수 있는 라이브러리를 설계하는 것이 목표였다. 이 설계는 11개 아미노산 잔기의 무작위화를 포함한다: 나선 A의 아미노산 잔기 132-133, AB 루프의 136-139 및 나선 C의 162-165, 167 및 171-172. 여기서 스캐폴드는 2개의 새로운 이황화 결합을 포함하는 CD81 LEL 돌연변이체이다: 하나는 나선 A와 B(C4)를 연결하고, 하나는 나선 A와 C(C9)를 연결한다. 이어서, 새로운 이황화 결합 Ala134Cys/Lys144Cys 및 Val135Cys/Ser168Cys의 조합을 갖는 이 CD81LEL 돌연변이체는 HEK293-6E 세포(CNRC)에서 생산되고 열 안정성에 대해 테스트되었다. 열 전개는 최대 130℃까지 기록되었으며, 야생형 hCD81LEL보다 43℃ 높은 Tm 109.40±0.25℃에서 단일 이벤트로 진행되었다. C4C9라고 지칭되는 이 단백질은 야생형 단백질의 특징적인 시간에 단일의 날카로운 피크로서 네이티브 조건에서 SEC로 이동했다. 중요하게는, 안정화된 돌연변이는 야생형 hCD81 LEL과 동일한 정도로 구조-리포터 항체 M38(Thermo Fisher Scientific)에 결합할 수 있었다. 이 돌연변이체에 대한 Far-UV CD 스펙트럼을 조사했고, 야생형 hCD81 LEL에 대해 수득된 것과 동일한 것으로 밝혀졌고, 이는 이전 공개된 결과와 유사하에 208 및 222nm에서 두 가지 특징적인 최소값을 갖는 높은 α- 나선 함량을 갖는 단백질의 전형이었다.
첫째, 일련의 돌연변이 유발 단계로, 효모 디스플레이 pyd1_CD81LEL에 대한 수령자 벡터를 고유한 BamHI 및 HindIII 제한 부위의 결실로 변형시켰다. 모든 돌연변이 유발 단계는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 Quickchange Lightning 돌연변이 유발 키트(Agilent)를 사용하여 수행되었다: BamHI 부위를 다음 올리고뉴클레오티드를 사용하여 결실되었고:
(서열번호 21): CGATAAGGTACCAGGTTCCTTTGTCAACAAG
(서열번호 22): CTTGTTGACAAAGGAACCTGGTACCTTATCG
HinDIII 부위는 다음 올리고뉴클레오티드를 사용하여 결실되었다:
(서열번호 23): GTATGTTTTTAAGCTCCTGCAGGCTAGTGGTG
(서열번호 24): CACCACTAGCCTGCAGGAGCTTAAAAACATAC.
선형화 후 라이브러리 단편의 재조합을 용이하게 하기 위해, 새로운 BamHI 제한 부위를 다음 올리고뉴클레오티드를 사용하여 도입했고;
(서열번호 25): TTTGTGTCCCTCGGGATCCAACATCATCAGCAA
(서열번호 26): TTGCTGATGATGTTGGATCCCGAGGGACACAAA,
새로운 HindIII 제한 부위를 다음 올리고뉴클레오티드를 사용하여 도입했다:
(서열번호 27): GCAGTTCTATGACCAAGCTTTACAGCAGGCCGTGG
(서열번호 28): CCACGGCCTGCTGTAAAGCTTGGTCATAGAACTGC.
수령자 벡터 DNA를 Nucleobond(Macherey-Nagel)를 사용하는 중간 제조로 단리시키고, BamHI 및 HindIII의 제한을 사용하여 벡터를 선형화했다. 벡터 백본은 예비 겔 전기 영동 후 정제를 사용하여 단리시켰다.
또한, 신규한 이황화 결합을 형성하는 돌연변이 Ala134Cys 및 Lys144Cys 및 또 다른 신규한 이황화 결합을 형성하는 Val135Cys 및 Ser168Cys를 갖는 CD81의 주형 삽입물을 변형하여 라이브러리 인코딩 단편의 정확한 재조합을 촉진하기 위해 제한 부위를 갖는 서열을 도입하였다. 변형을 위한 주형은 pTT22SSP4_CD81 LEL C4C9 돌연변이체였다. HindIII 부위는 다음 올리고뉴클레오티드를 사용하여 도입되었고:
(서열번호 29): GCAGTTCTATGACCAAGCTTTACAGCAGTGCTGTG
(서열번호 30): CACAGCACTGCTGTAAAGCTTGGTCATAGAACTGC
BamHI 부위는 다음 올리고뉴클레오티드를 이용하여 도입되었다:
(서열번호 31): TTTGTGTCCCTCGGGATCCAACATCATCAGCAA
(서열번호 32): TTGCTGATGATGTTGGATCCCGAGGGACACAAA.
무작위화된 뉴클레오티드 서열을 갖는 PCR 단편은 다음 올리고뉴클레오티드로 생산되었다:
(서열번호 33):
AAGGATGTGAAGCAGTTCTATGACCAAGCTTTANNKNNKTGCTGTNNKNNKNNKNNKGCCAACAACGCCTGTGCTGTG,
여기서, N은 A, C, G 또는 T 중 임의의 하나이고,
(서열번호 34):
CTTGAAGAGGTTGCTGATGATGTTGGATCCCGAGGGACACAAATTMNNMNNGAGCACACAMNNGGTMNNMNNMNNMNNTGTGCTGGAGCCACAGCA,
여기서, N은 A, C, G 또는 T 중 임의의 하나이고; M은 A 또는 C 중 임의의 하나이다.
(IUPAC 뉴클레오티드 코드에 따름).
Q5 HiFi 폴리머라제(New England Biolabs)를 사용한 PCR 반응에서 라이브러리 단편을 겔 전기 영동 후 정제했다.
형질 전환을 위해, 20ml YPD 배지(2% 펩톤, 1% 효모 추출물, 2% 글루코스)(Merck) 중 EBY100(Thermo Fisher Scientific)의 종균 배양물을 30℃ 및 180rpm에서 밤새 배양했다. 이어서, 배양물을 0.4의 OD600으로 희석하고, 30℃ 및 180rpm에서 약 5시간 동안 배양하였다. 이어서, 50ml의 세포 배양물의 분취액을 실온에서 5분 동안 1000g에서 펠릿화한 다음, 25ml의 AD로 세척하고, 다시 펠릿화했다. 세포를 3ml의 100mM Li-아세테이트에 재현탁시키고, 진탕 배양기에서 30℃에서 15분 동안 배양하였다. 세포를 펠릿화하고 상청액을 제거했다. 형질 전환 혼합물의 성분은 다음과 같이 첨가되었다: 2400μl 50% PEG 3350, 360μl 1.0M Li-아세테이트, 500μl 2mg/ml ssDNA(연어 정자 담체 DNA, 사전에 5분 동안 95℃까지 가온시킨 다음, 얼음 위에 놓음)(Sigma-Aldrich), 10μg의 선형화된 수령자 벡터 및 7μg의 DNA 단편. 세포 펠릿을 형질 전환 혼합물에 재현탁시키고, 30℃에서 30분 동안 진탕 배양기에서 배양하고 42℃에서 45분 동안 열 충격을 가했다.
실온에서 5분 동안 1000g에서 원심분리로 세포를 수집하고 상청액을 제거한 후, 펠릿을 10ml의 SD-CAA 배지에 재현탁시켰다. 라이브러리 크기를 결정하기 위해 희석 플레이팅을 위해 분취액을 제거했다: 10μl의 세포 현탁액을 990μl SD-CAA 배지에서 희석하고, 이중 100μl를 MDL 플레이트에 플레이팅하고 30℃에서 3일 동안 배양했다. 효모 세포를 50ml SD-CAA 배지에서 희석하고, 30℃ 및 180rpm에서 24시간 동안 배양하고, 1:20 희석으로 신선한 SD-CAA 배지로 계대하고 동일한 조건하에서 추가 24시간 동안 배양했다. 세포를 4℃에서 5분, 1000g에서 수거하고, 펠릿을 동일한 용적의 30% 글리세롤에 재현탁시킨 후 -80℃에서 동결시켰다.
CD81_LEL 라이브러리 2의 효모 디스플레이 형질 전환은 다음을 초래했다:
라이브러리 2_4: 9.5x106개의 독립 구성원,
라이브러리 2_5: 2.1x107개의 독립 구성원 및
라이브러리 2_6: 1.7x107개의 독립 구성원.
실시예 7: 인간 EGFR-Fc를 사용한 CD81 LEL 라이브러리 2의 선택
분류를 위해, 라이브러리를 먼저 밤새 진탕시키면서 30℃에서 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 SD-CAA 배지에서 배양한 다음, 재조합 단백질의 발현은 페니실린-스트렙토마이신과 함께 SG/R-CAA 배지에 효모 세포를 재현탁시키고 그들을 37℃에서 밤새 진탕시키면서 배양함으로써 유도했다.
다음으로, 109개의 세포를 2500g에서 5분 동안 펠릿화한 다음, 50ml 세척 완충제(1x D-PBS(Thermo Fisher Scientific), 0.25% BSA(Sigma Aldrich), 2mM EDTA(Sigma Aldrich))에 펠릿을 재현탁하여 그들을 세척하고, 2500g에서 5분 동안 다시 펠릿화했다. 세척된 세포를 0.25μM 비오티닐화된 항원을 함유하는 25ml 세척 완충제에 재현탁시키고, 부드럽게 진탕시키면서 실온에서 30분 동안, 빙욕에서 10분 동안 배양했다. 이어서, 세포 및 항원 용액을 2,500g 및 4℃에서 5분 동안 펠릿화하고, 50ml 세척 완충제로 2회 세척하고 각 세척 단계 후에 펠릿화했다. 세포를 5ml 세척 완충제 + 25μl 스트렙타비딘 마이크로비드에 재현탁시키고, 얼음에서 10분간 배양했다. 마지막으로, 15ml 세척 완충제를 첨가했다.
LS 컬럼(Milteny Biotec)을 분리기에 넣고, 3ml의 세척 완충제를 적용하여 컬럼을 사전 조정했다. 이어서, 세포 용액을 7ml 배치에 로딩했다. 컬럼의 낙하가 중지되면, 자석에서 간단히 제거하고 자석에 다시 배치하여 컬럼에서 비드의 방향을 변경하여 포획된 세포가 유동하도록 했다. 다음 7ml 세포 현탁액을 로딩하기 전에, 1ml의 세척 완충제를 컬럼에 적용하였다. 이러한 단계는 모든 세포가 로딩될 때까지 반복되었다. 이어서, 컬럼을 3ml 세척 완충제로 세척하고 자석에서 간단히 제거하고 3ml 세척 완충제로 다시 세척했다. 결합 세포를 용출시키기 위해, 컬럼을 자석에서 제거하고, 5ml 세척 완충제를 첨가했다. 제공된 플런저를 사용하여, 세포를 컬럼을 통해 새로운 튜브로 밀어 넣었다. 결합 세포 분획을 2500g에서 5분 동안 펠릿화했다. 펠릿을 10ml SD-CAA 배지에 재현탁시키고 30℃ 및 180rpm에서 밤새 배양했다. 추가로, 10-2 희석액 100μl를 MDL 플레이트에 플레이팅하고 30℃에서 배양했다.
유도된 세포 현탁액을 10% BSA-PBS 1ml 당 108개의 세포로 희석하고, 20℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리했다. 세포를 차단하기 위해, 펠릿을 10% BSA-PBS 1ml에 재현탁시키고, 회전 플랫폼에서 20℃에서 30분 동안 배양했다. 세포를 20℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리하고, 1μM 비오티닐화된 EGFR-Fc(Sino Biological)를 함유하는 250μl의 10% BSA-PBS에 재현탁시켰다. 회전 플랫폼에서 20℃에서 30분 동안 배양한 후 세포를 4℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리했다. 세포를 세척하기 위해, 펠릿을 1ml 빙냉 PBS에 재현탁시키고 4℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리했다. 이어서, 세포는 스트렙타비딘-Alexafluor 647 (1:800) 및 항-V5-FITC 항체(1:100)(Thermo Fisher Scientific)와 함께 250㎕의 10% BSA-PBS에 재현탁시키고, 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 4℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리한 후, 그들을 빙냉 PBS 1ml에 재현탁시키고 다시 원심분리했다. 마지막으로, 세포는 250μl의 빙냉 PBS에 재현탁시키고, FACS AriaTM로 분류할 때까지 얼음 위에 정치시켰다.
분류 후, 세포를 적절한 양의 SD-CAA에 재현탁시키고 상기 기재된 바와 같이 유도하기 전에 30℃ 및 180rpm에서 배양하였다.
라이브러리 AB1
(AA 132-133) 		AB2
(AA 136-139) 		CD1
(AA 162-165) 		CD2
(AA167) 		CD3
(AA171-172)
81_2_4 VI GASA
(서열번호 35)		 DAGP
(서열번호 36)		 H VE
81_2_4 KW SFLV
(서열번호 37)		 PLTM
(서열번호 38)		 T LK
81_2_6 WR AKMY
(서열번호 39)		 SARF
(서열번호 40)		 E TW
실시예 8: 가용성 형태로 변형된 CD81 LEL의 발현
CD81을 인코딩하는 서열은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 효모 디스플레이 클론으로부터 증폭되었다.
(서열번호 41):
ACGTGCTAGCTTTGTCAACAAGGACCAGATC
(서열번호 42):
ACGTGGTGACCGGTGCTGGAACCCTTCCCGGAGAAGAGGTC.
PCR 단편을 제한 효소 NheI 및 BstEII로 절단하고, 동일 효소로 절단된 벡터 pTT28(CNRC)에 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 전기적합 이. 콜리 TOP10(Thermo Fisher Scientific)으로 형질 전환시키고, 형질 전환체를 암피실린 플레이트에서 선택했다. 플라스미드는 미니프렙으로 단리시키고, ExpiCHO 세포(Thermo Fisher Scientific)로 형질 감염시켰다. ExpiCHO 발현 시스템(Thermo Fisher Scientific)에서의 발현은 정확히 제조업체의 지침을 따르는 MaxTiter 프로토콜에 따랐다. 이어서, hCD81 LEL 변이체는 표준 프로토콜을 사용하여 Ni-NTA 크로마토그래피를 통해 정제되었다. 상청액을 동일한 용적의 AD로 희석하고, PBS 및 20mM 이미다졸로 완충시키고, pH를 7.5로 조정했다. Excel Ni-NTA 컬럼(GE Healthcare)을 PBS 및 20mM 이미다졸, pH 7.5로 평형화하고, 완충된 상청액을 로딩했다. 용출은 PBS, pH 7.5 중 20 내지 500mM 이미다졸의 선형 구배로 5 컬럼 용적에서 이루어졌다. 단백질 함유 분획을 풀링하고, 밤새 4℃에서 100배 용적의 PBS에 대해 투석하였다.
네이티브 조건에서의 SEC 분석은 가용성 야생형 CD81 LEL과 유사하게 단백질의 이량체 형태에 상응하는 단분산 용출 프로파일을 나타냈다.
대안적으로, 단백질은 정확히 제조업체의 지침에 따라 MaxTiter 프로토콜에 따라 ExpiCHO 발현 시스템(Thermo Fisher Scientific)에서 발현되었다. 이어서, hCD81 LEL을 표준 프로토콜을 사용하여 Ni-NTA 크로마토그래피를 통해 정제했다. 상청액을 동일한 용적의 AD로 희석하고, PBS 및 20mM 이미다졸로 완충하고 pH를 7.5로 조정했다. Excel Ni-NTA 컬럼(GE Healthcare)을 PBS 및 20mM 이미다졸, pH 7.5로 평형화하고, 완충된 상청액으로 로딩했다. 용출은 PBS, pH 7.5 중 20 내지 500mM 이미다졸의 선형 구배로 5 컬럼 용적에서 이루어졌다. 단백질 함유 분획을 풀링하고, 밤새 4℃에서 100배 용적의 PBS에 대해 투석하였다.
실시예 9: CD81 LEL의 열 안정화
hCD81 LEL (단편 Phe113-Lys201)(서열번호 87에 따르는 번호매김)을 인코딩하는 단편은 전장 CD81 서열(Geneart)을 갖는 합성 작제물로부터 증폭되었다. DSDBASE(Vinayagam et al. 2004, Nucleic Acids Research, Volume 32, Issue suppl_1, Pages D200-D202, https://doi.org/10.1093/nar/gkh026)가 도메인내 이황화 결합의 생성에 적합한 시스테인 잔기를 보유할 가능성이 있는 위치의 동정을 위한 예측 도구로서 사용되었다. 이 알고리즘은 인접 아미노산 잔기의 Cα 및 Cβ 원자 사이의 거리와 비틀림 각도 및 생산되는 S-S 결합 길이에 대해 hCD81 LEL 결정 구조 1G8Q를 분석하는 데 사용되었다. 36개의 예측된 가능한 이황화 결합 중에서 결정 구조의 육안 검사로 판단되는 성공 가능성이 가장 높은 11개가 선택되었다. 이들 중 5개는 hCD81 LEL의 프로토머 A와 프로토머 B 모두에서 DSDBASE 프로그램에 의해 예측되었다.
선택된 단일 아미노산 잔기의 시스테인으로의 돌연변이 유발은 표 5에 나열된 올리고뉴클레오티드와 함께 정확히 제조업체의 지침에 따라 QuikChange Lightning 돌연변이 유발 키트(Agilent)를 사용하여 수행되었다.
돌연변이 유발에 사용된 올리고뉴클레오티드
hCD81 LEL 변이체 치환 올리고뉴클레오티드 서열 서열번호
C1 A134C CAGGCCCTACAGCAGTGCGTGGTGGATGATGAC 43
　 GTCATCATCCACCACGCACTGCTGTAGGGCCTG 44
A143C GATGATGCCAACAACTGCAAGGCTGTGGTGAAG 45
　 　 CTTCACCACAGCCTTGCAGTTGTTGGCATCATC 46
C2 A130C CAGTTCTATGACCAGTGTCTACAGCAGGCCGTG 47
　 CACGGCCTGCTGTAGACACTGGTCATAGAACTG 48
V146C AACAACGCCAAGGCTTGTGTGAAGACCTTCCAC 49
　 　 GTGGAAGGTCTTCACACAAGCCTTGGCGTTGTT 50
C3 Q133C GACCAGGCCCTACAGTGCGCCGTGGTGGATGATG 51
　 CATCATCCACCACGGCGCACTGTAGGGCCTGGTC 52
A143C GATGATGCCAACAACTGCAAGGCTGTGGTGAAG 53
　 　 CTTCACCACAGCCTTGCAGTTGTTGGCATCATC 54
C4 A134C CAGGCCCTACAGCAGTGCGTGGTGGATGATGAC 55
　 GTCATCATCCACCACGCACTGCTGTAGGGCCTG 56
K144C GACGCCAACAACGCCTGTGCTGTGGTGAAGACC 57
　 　 GGTCTTCACCACAGCACAGGCGTTGTTGGCGTC 58
C5 L154C GACCTTCCACGAGACGTGTGACTGCTGTGGCTC 59
　 GAGCCACAGCAGTCACACGTCTCGTGGAAGGTC 60
K193C GAGGACTGCCACCAGTGTATCGATGACCTCTTC 61
　 　 GAAGAGGTCATCGATACACTGGTGGCAGTCCTC 62
C6 A120C CAACAAGGACCAGATCTGTAAGGATGTGAAGCAG 63
　 CTGCTTCACATCCTTACAGATCTGGTCCTTGTTG 64
F198C AAGATCGATGACCTCTGTTCCGGGAAGTGATGAG 65
　 　 CTCATCACTTCCCGGAACAGAGGTCATCGATCTT 66
C7 A130C CAGTTCTATGACCAGTGTCTACAGCAGGCCGTG 67
　 CACGGCCTGCTGTAGACACTGGTCATAGAACTG 68
A143C GATGATGCCAACAACTGCAAGGCTGTGGTGAAG 69
　 　 CTTCACCACAGCCTTGCAGTTGTTGGCATCATC 70
C8 L131C TTCTATGACCAGGCCTGCCAGCAGGCCGTGGTG 71
　 CACCACGGCCTGCTGGCAGGCCTGGTCATAGAA 72
L165C AGCACACTGACTGCTTGTACCACCTCAGTGCTC 73
　 　 GAGCACTGAGGTGGTACAAGCAGTCAGTGTGCT 74
C9 V135C GCCCTACAGCAGGCCTGTGTGGATGATGACGCC 75
　 GGCGTCATCATCCACACAGGCCTGCTGTAGGGC 76
S168C GCTTTGACCACCTGTGTGCTCAAGAACAAT 77
　 　 ATTGTTCTTGAGCACACAGGTGGTCAAAGC 78
C10 V169C TTGACCACCTCAGTGTGCAAGAACAATTTGTGTC 79
　 GACACAAATTGTTCTTGCACACTGAGGTGGTCAA 80
L174C GTGCTCAAGAACAATTGTTGTCCCTCGGGCAGC 81
　 　 GCTGCCCGAGGGACAACAATTGTTCTTGAGCAC 82
C11 S160C GACTGCTGTGGCTCCTGTACACTGACTGCTTTG 83
　 CAAAGCAGTCAGTGTACAGGAGCCACAGCAGTC 84
D189C AACCTCTTCAAGGAGTGTTGCCACCAGAAGATC 85
　 　 GATCTTCTGGTGGCAACACTCCTTGAAGAGGTT 86
hCD81 LEL 변이체를 pTT22SSP4 포유류 발현 벡터(CNRC)로 클로닝하고, 2개의 상이한 발현 시스템에서 발현시켰다. 사전 스크리닝을 위해, 작제물은 형질감염 후 2일째에 0.8%의 최종 농도로 TN-20을 공급하면서 5% CO2하에 4일 동안 180rpm 및 37℃에서 궤도 진탕기에서 4mM 글루타민 및 50μg/mL G-418(Thermo Fisher Scientific)이 보충된 F17 배지에서 2mL 규모로 HEK293-6E 세포(CNRC)에서 발현되었다. 돌연변이체 C5는 발현되지 않았고, C6은 불량하게 발현되었고, C10은 눈에 띄는 이량체를 형성했고, 따라서 그들은 추가의 분석에서 생략되었다. 추가 특성화용으로 선택된 돌연변이체(C1, C2, C3, C4, C7, C8, C9 및 C11)를 정확히 제조업체의 지침에 따라 ExpiCHO 세포(Thermo Fisher Scientific)로 형질감염시켰다. 세포의 배양은 MaxTiter 프로토콜(Thermo Fisher Scientific)에 따라 진행했다. 14일 후에 상청액을 수거하고, Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 정화 후, 샘플을 20mM 이미다졸, pH 7.5을 갖는 인산염 완충된 식염수(PBS)로 완충하고, 동일한 완충제로 평형화된 Excel Ni-NTA 컬럼(GE Healthcare)을 통과시켰다. His-태그된 hCD81 LEL을 5 컬럼 용적에서 20 내지 500mM 이미다졸의 구배로 용출시켰다. 표적 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고 4℃에서 밤새 100배 용적의 PBS에 대해 2회 투석하였다. 단백질은 사용할 때까지 -80℃에서 저장했다.
다이오드 어레이 검출기와 굴절률 검출기가 장착된 Shimadzu LC-20A Prominence 시스템을 사용하여 Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼(GE Healthcare)으로 SEC-HPLC를 수행했다. 사용된 이동상 완충제는 200mM NaCl을 갖는 PBS였다. 0.75mL/분의 일정한 유속으로 크로마토그래피를 수행했다. 약 2mg/mL로 총 200μg 단백질을 분석용 컬럼에 로딩했다. 10 내지 500kDa(Bio-Rad) 범위의 분자량 표준 세트를 사용하여 컬럼 보정을 수행했다. 돌연변이체 C1 및 C8은 충분히 분해된 피크를 나타내지 않았으며, 다른 모든 돌연변이체는 야생형 단백질과 유사했다.
DSC 실험은 pH 7.4에서 PBS로 희석된 80μM 단백질 용액을 사용하는 자동화된 MicroCal PEAQ-DSC 자동화 시스템(Malvern)을 사용하여 수행되었다. 가열은 20℃에서 110℃까지 1℃/분의 속도로 수행되었다. 이어서, 단백질 용액을 동일 반응계에서 냉각시키고, 동일한 열 스캔을 실행하여 제1 스캔에서 빼기 위한 기준선을 수득했다. 모든 측정은 중복으로 수행되었다. 피팅은 비-2-상태 전이 메커니즘을 사용하여 MicroCal PEAQ-DSC 소프트웨어로 수행했다.
야생형 CD81 LEL의 열 안정성 측정은 66.15℃에서 단일 융점을 나타냈지만 2.4 x104 kcal/mol의 낮은 엔탈피를 나타냈다.
hCD81 LEL 변이체의 Tm
hCD81 LEL 돌연변이된 위치 1 돌연변이된 위치 2 Tm (℃)
변이체 세그먼트 상에 위치됨 아미노산 세그먼트 상에 위치됨 아미노산 　
야생형 66.15±0.25
C1 나선 A Ala134 나선 B Ala143 n.d.1
C2 나선 A Ala130 나선 B Val146 67.35±0.05
C3 나선 A Gln133 나선 B Ala143 82.15±0.05
C4 나선 A Ala134 나선 B Lys144 88.95±0.05
C5 나선 B Leu154 나선 E Lys193 n.d.
C6 나선 A Ala120 나선 E Phe198 n.d.
C7 나선 A Ala130 나선 B Ala143 76.90±0.00
C8 나선 A Leu131 나선 C Leu165 n.d.
C9 나선 A Val135 나선 C Ser168 90.45±0.15
C10 나선 C Val169 세그먼트 C의 비구조화 부분 Leu174 n.d.
C11 나선 C 선행 루프 Ser160 나선 D의 개시 Asp189 70.25±0.15
시차 열 열량 측정 스캔은 배경으로서 감수되는 변성된 단백질 용액의 재스캔으로 실행했다. 여기서, 야생형 CD81 LEL 및 기타 안정화된 변이체와 대조적으로 돌연변이체 C2는 놀랍게도 110℃까지 가역적 전개를 나타냄이 발견되었다.
이어서, 강력하게 안정화하는 신규한 이황화 결합 Ala134Cys/Lys144Cys 및 Val135Cys/Ser168Cys의 조합을 갖는 hCD81LEL 돌연변이체를 생산하고 이의 열 안정성을 테스트했다. 열 전개는 130℃까지 기록되었고, 야생형 CD81LEL보다 43℃ 높은 109.40±0.25℃의 Tm에서 단일 이벤트로 진행되었다. C4C9라고 칭명되는 이 단백질은 야생형 단백질의 특징적인 시간에 단일의 날카로운 피크로서 네이티브 조건에서 SEC로 이동했다.
중요하게는, 안정화된 돌연변이체는 야생형 CD81 LEL과 동일한 정도로 구조-리포터 항체 M38에 결합할 수 있었다. ELISA 플레이트(Maxisorp, NUNC)는 실온에서 1시간 동안 PBS에서 5㎍/mL의 항-hCD81 M38 항체(Thermo Fisher Scientific)로 코팅했다. RT에서 1시간 동안 5% 소 혈청 알부민(BSA)-PBS로 차단한 후, hCD81 LEL 변이체로 형질감염된 HEK293-6E 세포의 상청액 또는 2.5% BSA-PBS에서 희석된 hCD81 LEL의 정제된 변이체를 RT에서 1시간 동안 결합하도록 했다. 광범위한 세척 후, 돌연변이체 단백질의 결합은 2.5% BSA-PBS에서 1:2000으로 희석된 항-his-서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 접합 항체(QIAgen)로 검출되었다. 항체 결합은 3,3',5,5'-테트라 메틸벤지딘(TMB)(Sigma Aldrich)으로 나타났고, 반응은 동일 용적의 30% H2SO4를 첨가하여 정지시켰고, 흡광도는 450/620nm에서 판독했다.
Figure pct00001
돌연변이체 C4C9 및 야생형 CD81에 대한 Far-UV CD 스펙트럼을 조사했다. CD 스펙트럼은 Chirascan 분광 편광계(Applied Photophysics)에서 측정되었다. 1mm 석영 큐벳을 사용했다. 단백질 제제를 PBS에서 1mg/mL로 희석했다. 스펙트럼은 야생형 hCD81 LEL 및 C4C9에 대해 동일한 것으로 밝혀졌다. 관찰된 스펙트럼은 이전에 공개된 결과와 유사하게 208 및 222nm에서 두 가지 특징적인 최소값을 갖는 높은 α-나선 함량을 갖는 단백질의 전형이었다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
실시예 10: 세포 배양에서 표적 특이적 EV의 생산.
10.1 HeLa 세포를 사용하는 표적 특이적 EV 공여자 세포주의 일시적 형질감염
표적 특이적 CD81-GFP-함유 엑소좀(CD81-GFP-엑소좀)을 분비하기 위해 C-말단 GFP-융합 재조합 CD81을 발현하는 HeLa 세포를 전기 천공법을 사용하여 일시적으로 형질감염시켰다. HeLa 세포(5x 106 세포)를 형질감염 2-3일 전에 T175 세포 배양 플라스크(Sigma, Kremsmunster, Germany)에 플레이팅했다. 10% FCS, 4mM L-글루타민을 함유하는 완전 RPMI-1640 배지(Merck, Darmstadt, Germany)를 공여자 HeLa 세포의 규칙적인 배양에 사용했다. 형질감염 당일(0일)에, HeLa 세포(70-85%의 컨플루언시에서 최적으로)는 0.1% 트립신 용액(5분 처리, 완전 RPMI-1640으로 중화)을 사용하여 수거했다. RPMI-1640에서 분리된 HeLa 세포는 ViCell 세포 계수기를 사용하여 정량화되었다. 3x 106 세포를 CD81-GFP 플라스미드(pTT5, NRC 캐나다, 캐나다 오타와, 4㎍)로 형질감염시켜 하나의 T175 플라스크를 충전시켰다. 전기 천공은 인-하우스 제조된 전기 천공 완충제(5mM KCl, 15mM MgCl2, 120mM Na2HP04/NaH2P04 pH7.2, 50mM 만니톨, 0.005% Pluronic F-68)를 사용하여 제조업체 브로셔(HeLa 세포에 대한 프로그램 I-013)에 따라서 Amaxa Nucleofector I 장치(Lonza, Basel, Switzerland)를 사용하여 수행했다. 전기 천공된 세포는 완전 RPMI-1640에서 회수하고, 세포가 배양 플라스크 표면에 부착할 수 있도록 24시간 동안 배양했다. 실제로, 원형질막에 국소화된 재조합 CD81을 표적화하는 다양한 형태의 인간 트랜스페린 수용체가 재조합 테트라스파닌의 기능적 통합을 시사하고 있다(도 4).
10.2 표적 특이적 EV의 단리 및 정제
1일째(형질감염 24시간 후)에 배양 배지를 제거하고, 각 용적(1x T175의 경우 45mL)의 EV-고갈 분비 배지(RPMI-1640)로 교체했다. EV-고갈 RPMI-1640은 초원심분리된(14-18h, 4℃, 100,000g) 완전 RPMI-1640(20% FCS 함유)로부터 상청액 분획을 수집하고 배지를 RPMI-1640을 사용하여 10% FCS로 희석하고 L-글루타민을 4mM의 최종 농도로 첨가함으로써 제조했다. HeLa 세포를 72시간 동안(37℃, 5% CO2 대기) EV-고갈 배지와 함께 배양하여 표적 특이적 EV를 분비했다.
EV의 단리는 초원심분리를 사용하여 수집 시간 72시간 후에 수행되었다. 조정된 세포 배양 배지를 수집하고, 4℃에서 30분 동안 원심분리하여(3,100 x g) 세포 및 세포 파편을 제거했다. 상청액을 450nm 주사기 필터 장치(Merck, Darmstadt, Germany)를 통해 통과시키고, 100ml 밀봉 가능한 초원심분리 튜브로 옮겼다. 이어서, 상청액을 초원심분리기(Optima L-60, Beckman Coulter, Brea, USA)를 사용하여 4℃에서 90분 동안 원심분리했다(100,000 x g). 상청액을 제거하고, 펠릿을 잔류하는 배지 1ml에서 수집하였다. 초원심분리의 제2 단계를 수행하여(100,000 × g, 90분, 4℃) EV를 더 작은 용적으로 수집했다. 상청액을 다시 제거하고, 잔류하는 EV 펠릿을 200 내지 400μl의 HEPES 기반 1x 생세포 이미징 용액(ThermoFisher Scientific, Waltham, USA)에 재현탁시켰다. 이 방법을 사용하여 약 1011 EVs/ml를 HeLa 상청액으로부터 정제했다.
실시예 11: 추적 가능하고 정제 가능한 태그를 운반하는 EV의 생산
11.1 레트로 바이러스 시스템에서 CD81-스노클 태그의 서열 및 클로닝
야생형 인간 CD81 서열 아미노산 서열 서열번호 87; 핵산 서열 서열번호 88)을 C-말단 융합된 스노클 태그(참조: Brown et al. 2013, PLoS ONE 8(9): e73255. doi:10.1371/journal.pone.0073255)를 사용하여 pBMN 벡터로 클로닝하였다. 스노클 태그는 소포 막 표면에 태그가 표시되도록 할 수 있다. CD81의 PCR 산물은 NcoI와 AgeI로 절단되고, 스노클 태그의 PCR 산물은 AgeI와 NotI로 절단되었다. pBMN 플라스미드는 NcoI 및 NotI로 절단되었다. NcoI 및 NotI로 결찰된 분해된 PCR 산물은 pBMN 플라스미드를 분해했다. 결찰 혼합물은 적격 이. 콜리 세포로 형질 전환되었고, 형질 전환체는 암피실린 플레이트 상에서 선택되었다. 플라스미드는 내독소가 없는 플라스미드 제제(Qiagen Maxiprep)에 의해 단리되었다.
11.2 레트로 바이러스 형질 감염을 사용한 EV 공여자 세포에서 CD81-스노클 태그의 안정한 발현
Phoenix 세포(5x 106 세포)를 형질 감염 1일 전(0일)에 T75 플레이트(Sigma, Kremsmunster, Germany)에 플레이팅했다. 세포는 10% FCS 및 4mM L-글루타민과 함께 DMEM 4.5g 글루코스를 갖는 완전 성장 배지에서 배양했다. 일단 세포가 60-70% 융합되면, 배양 배지를 제거하고, FCS가 없는 4mM L-글루타민을 갖는 DMEM 4.5g 글루코스로 대체했다. 세포는 jetPRIME 형질 감염 시약(Polyplus, France)을 사용하여 10μg의 pBMN-CD81-스노클 태그(CD81 C-말단에 융합된 스노클 태그) 플라스미드로 형질 감염된다. 형질 감염 24시간 후(1일), 배지를 7ml의 완전 성장 배지로 변경하였다. 표적 세포(HeLa)는 10% FCS 및 4mM의 L-글루타민을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 1x 105 세포/웰로 6 웰 플레이트에 플레이팅하였다(Sigma, Kremsmunster, Germany). 시딩 24시간 후(2일)에, HeLa 세포(50-80% 컨플루언시)가 감염될 수 있다. Phoenix 세포(바이러스 입자 함유)로부터 7mL 상청액을 0.45μm 필터(Merck, Darmstadt, Germany) 및 폴리브렌(최종 농도 8μg/mL)을 사용하여 이 여액에 여과하고, 혼합했다. 신선한 성장 배지를 Phoenix 세포에 첨가했다. 표적 세포로부터의 상청액을 제거하고, 최대 2mL의 바이러스 함유 상청액을 첨가했다. 전체 플레이트를 파라필름으로 포장하고, 실온에서 60분 동안 800 x g에서 원심분리하였다. 이어서, 바이러스 상청액을 버리고, 신선한 성장 배지를 Hela 세포에 첨가했다. 바이러스 감염은 세포가 CD81-스노클 태그를 발현하는 95-100%에 도달할 때까지 다음 3일 동안 수행되었다. 태그된 CD81은 세포에 국한되어 올바른 접힘 및 국소화를 나타낸다(도 5a). CD81의 C-말단에 융합된 스노클 태그와 함께, 상기 방법은 또한 Hela 세포에서 CD63 융합 단백질로 성공적으로 수행되었다(도 5b). 인간 중간 엽 줄기 세포(ASC)에서 유사한 결과가 관찰되었다. EV는 10nm 금 입자에 결합된 항 HA 항체 및 18nm 금 입자에 결합된 항-CD81 항체에 의해 면역금 표지화 후 전자 현미경 검사를 받을 때 CD81뿐만 아니라 HA 태그에 대해 동시에 양성이다(도 5c).
11.3 CD81-스노클 태그의 크기, 수 및 통합을 위한 EV의 특성화
CD81-스노클 태그를 안정하게 발현하는 HeLa 세포를 배양 배지에서 3개의 T75 플레이트(5x 106 세포/플라스크)에 플레이팅했다. 시딩 24시간 후(1일) 배양 배지를 제거하고, 각각의 용적(1 x T75에 대해 12ml)의 EV-고갈 분비 배지(RPMI-1640)로 교체했다. EV-고갈 RPMI-1640은 초원심분리된(14-18h, 4℃, 100,000g) 완전 RPMI-1640(20% FCS 함유)으로부터 상청액 분획을 수집하고 RPMI-1640을 사용하여 배지를 10% FCS로 희석하고, L-글루타민을 4mM의 최종 농도로 첨가하여 제조했다. HeLa 세포를 EV 고갈 배지와 함께 48시간 동안(37℃, 5% CO2 대기) 배양하여 스노클 태그를 운반하는 EV를 분비했다.
EV 고갈 배지에서 48시간 동안 세포를 배양한 후 스노클 태그를 운반하는 EV의 단리를 수행했다. 조정된 배지를 수집하고 4℃에서 5분 동안 700g에서 원심분리하여 세포 파편을 제거했다. 상청액을 4℃에서 10분 동안 2000g에서 2nd 라운드의 원심분리를 위해 통과시켜 세포자멸체와 더 큰 입자를 제거했다. 이어서, 상청액은 0.22μM 필터(Merck, Darmstadt, Germany)를 통해 통과시켜 미세소포와 같은 더 큰 입자를 제거한다. 처리된 상청액을 300kDa의 기공 크기 중공 섬유(SpectrumLabs, Netherlands)와 함께 접선 유동 여과 컬럼을 사용하여 초기 용적의 1/20th배로 농축시켰다. 농축된 조정 배지는 EV를 추가로 특성화하는 데 사용된다. 10μl의 농축된 조정 배지는 여과된 DPBS(Merck, Darmstadt, Germany)에서 1000배로 희석시키고, nanosight NS500을 사용하여 산란 모드에서 나노입자 추적 분석(NTA)에 사용했다. 모든 획득 파라미터는 크기 및 농도 측정의 파라미터와 동일했다. 모든 실험은 실험을 3회 수행하여 측정되었다. 상이한 단리로부터 EV의 크기는 약 110-140nm이다.
CD81-스노클 태그의 EV로의 통합은 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었다. nanosight로 정량화된 1E10 EV를 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 단백질 겔에서 BCA 키트(Thermo fisher science)로 정량화된 50㎍의 세포 용해물과 함께 웰당 로딩하고, SDS-PAGE를 수행했다. 겔상 단백질은 Trans-Blot 터보 전달 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 PVDF 막으로 전달되었다. 정량화를 위한 스노클 태그와 함께 EV 특이적 마커에 대한 특이적 항체. 실제로, EV는 CD63, CD81 및 TSG101을 포함한 웨스턴 블롯에서 전형적인 EV 단백질의 마커와 세포내 단백질 칼넥신의 부재를 보여주었다.
11.4 항-HA 매트릭스 및 PreScission 프로테아제를 이용한 스노클 태그를 배타적으로 운반하는 EV의 단리
CD81-스노클 태그를 발현하는 HeLa 세포의 조정 배지를 차등 원심분리(700g 및 2000g)로 처리하고 0.22μm 필터(Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하여 여과하고, 300kDa 기공 크기 중공 섬유(SpectrumLabs, Netherlands)와 함께 접선 유동 여과 컬럼을 사용하여 1ml로 농축시켰다. 350μl의 농축된 조정 배지를 아가로스 비드(Sigma)에 접합된 항-HA 항체 200μl와 혼합하고, 시험관 회전자에서 4℃에서 밤새 배양했다. 16-18시간 배양 후, 아가로스 비드를 4℃에서 5분 동안 500g에서 스핀 다운하고, 통과액(결합되지 않은 EV)을 수집하고, 비드를 4℃에서 5분 동안 500g에서 아가로스 비드를 스핀 다운하여 여과된 DPBS 1ml로 세척했다. 이어서, EV 상의 스노클 태그에 결합된 항-HA 항체 접합된 아가로스 비드는 시험관 회전자에서 4℃에서 16 내지 18시간 동안 50mM Tris (Sigma), 150mM Nacl (Sigma), pH 7-7.4에서 8개 단위로 PreScission 프로테아제 처리(sigma) 4μl에 적용했다. 16 내지 18시간 동안 PreScission 프로테아제 처리 후, 아가로스 비드를 500g에서 스핀 다운시키고, 상청액을 수집했다. 모든 샘플(유입, 통과액, 세척 및 용출)을 1 내지 1000배 희석으로 NTA 분석에 사용하여 정제된 스노클 태그를 운반하는 EV의 수를 정량화했다. PreScission 프로테아제를 사용하는 정제는 절단된 HA 태그를 사용하여 PreScission 분해 후 용출 분획에서 밴드가 검출되지 않고 나머지 CLIP 태그가 용출 분획에서 잘 보이기 때문에 친화성 매트릭스에서 약하게 용출된 소포의 약 80-90%를 산출했다. 용출 분획을 용출되지 않고 비드에 남아 있는 분획과 비교하면 약 80-90%의 수율이 관찰된다(도 6).
스노클 태그의 PreScission 프로테아제 부위 앞에 AXL 특이적 표적화를 위한 Gas6과 같은 항원 특이적 리간드를 삽입하면 스노클 태그를 운반하는 특정 EV의 정제를 가능하게 하고, 정제 후 EV의 표적화가 수행된다.
실시예 12: 표적 특이적 세포외 EV의 특성화
12.1 EV 크기 및 재조합 단백질 통합 비율의 특성화
10μl의 EV 단리물을 6mL의 여과된 DPBS(Merck, Darmstadt, Germany)로 희석시키고, ZetaView(Particle Metrix, Inning, Germany)로 산란 및 형광 모드로 나노 입자 추적 분석(NTA)에 이어, NTA 소프트웨어(Particle Metrix, Inning, Germany)를 사용하는 평가에 사용했다. 모든 획득 파라미터는 크기 및 농도 측정의 파라미터와 동일했다. 모든 실험은 실험을 3회 수행하여 측정되었다.
산란 및 형광 모드로 측정된 입자 수의 비율은 표적 특이적 CD81-LEL 부분과 형광 GFP를 보유하는 재조합 EV와 비-재조합 및 비-형광 네이티브 EV 사이의 비율과 동일하다. 재조합 EV 생산의 상이한 배치를 통해 NTA 측정으로부터 수득된 비율은 모든 단리된 EV의 약 30-50%가 재조합이라는 것을 보여주었다. 상기 언급된 단리 방법으로 단리된 EV의 일반적인 중간 크기는 약 120 내지 140nm이며, 표적 특이적 형광성 EV의 전형적인 수율은 60-400nm의 범위의 HeLa 세포 당 1600 내지 5000 재조합 EV에 달하여 입자 크기의 직경 130nm에서 피크에 도달했다(도 7).
12.2 시험관내 특정 EV 흡수의 정성화 및 정량화
(a) 형광 현미경 검사를 통한 표적 항원 양성 세포에서 EV 흡수의 정성화
수령자 세포(예: Caco-2 세포)를 8 웰 ibidi 유리 바닥 플레이트(웰당 2.5 x 104 세포)에 시딩하고, 완전 배양 배지(37℃, 5% CO2 대기)에서 24시간 동안 부착되도록 했다. 배양 시간 후, 109개의 재조합 EV를 각 웰에 첨가했다. 세포를 추가로 24시간 동안 배양하여 재조합 입자가 수령자 세포에 의해 흡수되도록 했다. 세포를 최종적으로 PBS로 세척하고, 얼음 위에서 산성 글리신 완충제(100mM NaCl, 100mM 글리신, pH 3.5)로 처리하여 표면 결합된 EV를 제거했다. 이어서, 형광 현미경 검사(DMI3000B; Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)를 사용하여 세포를 40배 배율로 이미지화하였다. 현미경 이미징 파라미터(노출 시간, 콘트라스트 및 이득)는 모든 실험에서 동일했다. 실제로, 재조합 EV는 수령자 세포에 의해 쉽게 흡수되었다(도 8a).
(b) 유세포 분석을 통한 표적 항원 양성 세포에서 EV 흡수의 정량화
수령자 세포(예: Caco-2 세포)를 24 웰 플라스틱 바닥 플레이트(웰당 0.25 x 106 세포)에 시딩하고, 완전 배양 배지(37℃, 5% CO2 대기)에서 24시간 동안 부착되도록 했다. 배양 시간 후, 고정된 수의 5x 109 재조합 EV를 각 웰에 첨가했다. 세포를 추가로 24시간 동안 배양하여 재조합 입자가 수령자 세포에 의해 흡수되도록 했다. 세포를 최종적으로 DPBS로 세척하고, 0.1% 트립신(5분, 37℃)으로 처리하고 10% FBS를 함유하는 완전 배지로 중화시켰다. 이어서, 세포를 300g에서 원심분리하고, 펠릿을 빙냉 DPBS에 재현탁시켰다.
샘플을 얼음 위에 보관하고 Cytoflex S 유세포 분석기(Beckman Coulter, Brea, USA)로 측정했다. 데이터는 Cytoflex 소프트웨어로 분석되었다. 평균 형광 강도는 대조군/미처리 세포 샘플(△MFI)에 대해 표준화되었다. 여기서, 30 내지 60%로 트랜스페린 수용체를 표적화하는 재조합 EV의 증가된 흡수는 비-Tfr1 표적화 CD81을 과발현하는 세포의 EV(CP4EV) 또는 야생형 EV(wtEV)와 비교하여 재조합 CD81 작제물(Tfr1EVsP1, Tfr2EVs P1, Tfr2CP4EVs P1)에 따라서 관찰되었다(도 8b).
실시예 13: 세포자멸사-유도 siRNA를 사용한 치료 로딩된 표적 특이적 EV의 생산
13.1 siRNA를 이용한 재조합 EV의 형질 감염
인간 트랜스페린 수용체를 표적화하는 비-재조합 또는 재조합 CD81을 운반하는 정제된 EV는 리포좀 기반 형질감염 시약 다르마펙트(Dharmacon, Lafyette, USA)를 사용하여 세포자멸사 유도 siRNA(TOX 형질 감염 대조군, Dharmacon) 또는 비표적화 대조군 siRNA(ON-TARGETplus 비-표적화 siRNA, Dharmacon)로 형질 감염시켰다. EV는 제조업체 브로셔에 따라 각각의 표적화 또는 비표적화 siRNA(25nM siRNA의 최종 농도)로 형질 감염시켰다. siRNAdml 로딩을 qPCR을 사용하여 제어했다.
13.2 표적 특이적 세포 독성을 결정하기 위한 세포 기반 검정
표적 항원 발현 세포는 완전한 배지 중 96-웰 플레이트에 7.5x103개 세포/웰의 밀도로 시딩한 다음, 웰당 5x108 재조합/siRNA-형질감염된 EV로 72시간 동안 배양하였다. 실험은 EV 용량 또는 EV 대조군당 6회 반복으로 수행되었다. 배지 제거 및 PBS 세척 후, 세포를 1x WST-1(Sigma, St. Louis, USA)과 함께 1시간, 2시간 및 4시간 동안 또는 1x AlamarBlue(ThermoFisher Scientific, Waltham, USA)와 함께 밤새 완전 배지에서 배양했다. 검정 판독은 각 제조업체의 브로셔에 따라 마이크로 플레이트 리더 무한 200 Pro(Tecan, Mannedorf, Switzerland)에서 수행했다. 실제로, 대조군과 비교하여 트렌스페린 수용체를 표적화하는 EV의 약 30% 더 높은 세포독성이 특히 Tfr1CP4 재조합 CD81 작제물을 사용하여 관찰되었다(도 10).
실시예 14: 라이브러리 CD81 LEL_L3의 설계
CD81 LEL_L3 라이브러리 설계는 가역적으로 재접히는 CD81 LEL 안정화 돌연변이체(서열번호 180)를 기반으로 했다.
서열번호 180:
FVNKDQIAKDVKQFYDQCLQQACVDDDANNAKACVKTFHETLDCCGSSTLTALTTCVLKNNLCPSGSNIISNLFKEDCHQKIDDLFSGK
이 라이브러리에서 안정화 돌연변이 Ala130Cys/Ala146Cys 및 Val135Cys/Ser168Cys는 추가적으로 작동하여 CD81 LEL의 열 전이의 중점을 93.4℃로 증가시키고, 이 조합된 돌연변이체는 110℃까지 가열될 때 가역적으로 다시 접힐 수 있다. 라이브러리에서, 위치 132-133, 136-141, 162-165, 167 및 171-172의 아미노산 잔기를 무작위화하여 항원 결합에 사용할 수 있는 복합체 표면을 형성했다(서열번호 1에서 X)(서열번호 97).
서열번호 97:
FVNKDQIAKDVKQFYDQCLXXACXXXXXXNAKACVKTFHETLDCCGSSTXXXXTXCVLXXNLCPSGSNIISNLFKEDCHQKIDDLFSGK
여기서, X는 임의의 아미노산이다.
실시예 15: 효모 디스플레이 라이브러리 CD81 LEL_L2 및 L3의 작제
효모 디스플레이 라이브러리 CD81 LEL_L2의 경우, 무작위화 삽입물을 인코딩하는 PCR 재조합 산물은 Q5 HiFi 폴리머라제 MasterMix(New England Biolabs), 10ng/μl 주형(pTT22SSP4_C4C9) 및 50pmol의 올리고뉴클레오티드 LIB2FWD(서열번호 98) 및 EFrev(서열번호 99)를 사용하여 100μl 분취량으로 생산했다. 98℃에서 30초 동안 초기 변성 후, 각각 98℃에서 20초 변성, 55℃에서 20초 어닐링 및 72℃에서 20초 연장의 35 사이클이 이어지고, 72℃에서 5분 동안 배양 단계로 완료했다. PCR 산물은 Illustra GFX 정제 키트로 정제하고, AD에서 용출시켰다.
서열번호 98:
AAGGATGTGAAGCAGTTCTATGACCAAGCTTTANNKNNKTGCTGTNNKNNKNNKNNKGCCAACAACGCCTGTGCTGTG
여기서, N은 A, C, G 또는 T 중 어느 하나이다.
서열번호 99:
CTTGAAGAGGTTGCTGATGATGTTGGATCCCGAGGGACACAAATTMNNMNNGAGCACACAMNNGGTMNNMNNMNNMNNTGTGCTGGAGCCACAGCA
여기서, N은 A, C, G 또는 T 중 어느 하나이고; M은 A 또는 C 중 어느 하나이다.
효모 디스플레이 라이브러리 CD81 LEL_L3의 경우, 무작위화 삽입물을 인코딩하는 PCR 재조합 산물은 Q5 HiFi 폴리머라제 MasterMix(New England Biolabs), 10ng/μl 주형(pTT22SSP4_C2C9) 및 50pmol의 올리고뉴클레오티드 LIB3FWD(서열번호 100) 및 LIB2REV2(서열번호 99)를 사용하여 100μl 분취량으로 생산했다. 98℃에서 30초 동안 초기 변성 후, 각각 98℃에서 20초 변성, 55℃에서 20초 어닐링 및 72℃에서 20초 연장의 35 사이클이 이어지고, 72℃에서 5분 동안 배양 단계로 완료했다. PCR 산물은 Illustra GFX 정제 키트(GE Healthcare)로 정제하고, AD에서 용출시켰다.
서열번호 100:
AAGGATGTGAAGCAGTTCTATGACCAGTGTCTANNKNNKGCCTGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKAACGCCAAGGCTTGTGTG
여기서, N은 A, C, G 또는 T 중 어느 하나이다.
수령자 벡터 pYD1 delbamdelhind_bamhind는 BamHI 및 HindIII를 사용하여 선형화하고, 분취용 아가로스 겔 전기 영동 및 Illustra GFX 정제 키트(GE Healthcare)를 사용하여 정제하고, AD에서 용출시켰다.
효모 사카로마이세스 세레비지애 EBY100은 화학적 PEG3350/Li-아세테이트/ssDNA 형질 전환 방법을 사용하여 선형화된 수령자 벡터 및 PCR 재조합 산물로 형질 전환시켰다. 2개의 라이브러리, L2A와 L2B, 및 L3A와 L3B는 각각의 재조합 단편으로 생산되었다. 각 라이브러리에 대해, 250ml YPD 배지를 0.4의 OD600까지 밤새 배양물로 접종하였다. 30℃에서 진탕 배양기에서 5시간 배양 후, 효모 세포를 50ml 분취량으로 수거했다. 상청액을 제거하고, 효모 세포를 분취량당 25ml AD로 실온에서 5분, 3000rpm에서 세척하였다. 세포 펠릿을 100mM Li-아세테이트의 분취량당 3ml에 재현탁시키고, 30℃에서 15분, 200rpm에서 진탕시켰다. 세포를 실온에서 5분, 3000rpm에서 수집하였다. 각 효모 세포 분취량에, 2750μl의 50% PEG3350 용액, 360μl의 1M Li-아세테이트, 500μl의 열 충격 ssDNA 및 10μg의 선형화된 수령자 벡터 및 10μg의 재조합 PCR 단편의 혼합물을 첨가했다. 배양은 30℃에서 30분, 200rpm에서 수행한 후 42℃에서 45분 동안 열 충격을 가했다. 효모 세포를 실온에서 5분, 3000rpm에서 수집하고, 페니실린 및 스트렙토마이신을 갖는 250ml SD-CAA 배지로 희석했다. 배양은 30℃에서 24시간 동안 200rpm으로 진행되었으며, 배양물 12.5ml를 30℃에서 24시간 동안 페니실린과 스트렙토마이신을 갖는 250ml의 신선한 SD-CAA 배지로 옮기고, 4℃에서 10분, 3000rpm에서 펠릿화하고, 동일 용적의 30% 글리세롤과 혼합한 후 동결시켰다. 라이브러리 크기는 희석 플레이팅을 사용하여 결정하였고, L2의 경우, 1.1 ×108 독립적 구성원이고, L3의 경우 1.2 × 108 독립적 구성원인 것으로 결정되었다.
라이브러리의 정확성 수준을 결정하기 위해, 플라스미드 DNA를 10μl의 펠릿화 효모 세포로부터 단리시키고, 전기 천공법을 사용하여 이. 콜리 TOP10으로 형질 전환했다. CD81 LEL 돌연변이체의 발현 카세트는 프라이머 pydfwd(서열번호 101) 및 pydrev(서열번호 102)를 사용하여 증폭시키고. 이들 프라이머 중 하나를 사용하여 서열분석했다. 라이브러리 L2A의 정확성은 62.5%, L2B는 87.5%, L3A는 62.5%, L3B는 100%인 것으로 밝혀졌다.
서열번호 101: AGTAACGTTTGTCAGTAATTGC
서열번호 102: GTCGATTTTGTTACATCTACAC
품질 관리를 위해, 효모 세포를 페니실린 및 스트렙토마이신을 갖는 SG/RCAA 배지에서 20℃에서 48시간 동안 또는 37℃에서 24시간 동안 유도했다. 염색을 위해, 효모 세포를 2% BSA-PBS 용액에서 실온에서 30분 동안 OD600 1에서 차단했다. 이어서, 그들을 100μl-분취량에 재현탁시키고, N-말단에 위치한 Xpress 태그와 반응성인 항-Xpress 항체(Thermo Sientific)(1:1000), 및 적절하게 접힌 CD81 LEL을 검출하는 M38 항체(Thermo Scientific)(1μg/ml)로 실온에서 1시간 동안 2% BSA-PBS에서 염색했다. 세포를 4℃에서 5분 동안, 3000rpm에서 펠릿화하고, 염소 항-마우스(Fab')2-FITC 접합체(Sigma Aldrich)를 사용하여 2% BSA-PBS에 재현탁시키고, 2% BSA-PBS에서 1:200으로 희석했다. 다른 염색은 다음과 같다: 2% BSA-PBS에서 1:200 희석된 항-his-태그-Alexa Fluor 488(QIAgen) 및 2% BSA-PBS에서 1:100 희석된 항-V5-태그-FITC(Thermo Scientific)를 C-말단 his 태그 및 C-말단 V-태그를 검출하여 클론의 정확한 판독을 결정하는 데 사용된다. 형광 항체와의 배양은 얼음 위에서 30분 동안 이루어졌다. 마지막으로, 세포를 4℃에서 5분, 3000rpm에서 수집하고, 200μl의 빙냉 PBS에 재현탁시켰다. 염색된 샘플 및 염색되지 않은 대조군의 형광은 Guava EasyCyte 유세포 분석기를 사용하여 결정되었다. 양성 세포의 백분율이 결정되었으며, 표 9에 제시된다.
Figure pct00005
실시예 16: CD81 LEL-기반 EGFR-특이적 결합제
16.1 인간 EGFR-Fc를 사용하는 CD81 LEL 라이브러리 L2 및 L3의 선택
인간 EGFR-Fc는 Sino Biological에서 구입했다. 비오티닐화를 위해, EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-LC-비오틴 시약(Thermo Scientific)을 3:1 비오틴 대 단백질 몰 비로 사용했다. 항원은 정확히 제조업자의 지침에 따라 0.25μg/μl의 농도로재구성되었다. 비오티닐화 시약과의 배양은 실온에서 1시간 동안 진탕시키면서 진행되었다. 결합되지 않은 비오틴은 100x 용적의 PBS에 대한 투석으로 10.000 Da MWCO를 갖는 Snakeskin 투석 튜브(Thermo Scientific)를 사용하여 4℃에서 밤새 교반하면서 제거했다.
분류를 위해, 라이브러리 2A, 2B, 3A 및 3B를 최초로 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 SD-CAA 배지에서 30℃에서 밤새 진탕시키면서 배양한 다음, 재조합 단백질의 발현은 효모 세포를 페니실린-스트렙토마이신을 갖는 SG/R-CAA 배지에 재현탁시키고 그들을 37℃에서 밤새 진탕시키면서 배양하여 유도했다.
MACS의 경우, 109개의 유도된 효모 세포를 1000g에서 5분 동안 펠릿화하고, 펠릿을 50ml의 세척 완충제(PBS, pH 7.2, 0.25% BSA, 2mM의 EDTA)에 재현탁시켜 세척하고, 2500g에서 5분 동안 다시 펠릿화했다. 세척된 세포를 0.5μM 비오티닐화된 항원을 함유하는 5ml 세척 완충제에 재현탁시키고 부드럽게 진탕시키면서 실온에서 30분 동안 배양하였다. 항원 결합은 10ml 빙냉 세척 완충제를 첨가하여 급냉시키고, 세포 및 항원 용액을 1000g 및 4℃에서 5분 동안 펠릿화하였다. 세포를 5ml 세척 완충제 + 25μl 스트렙타비딘 마이크로비드(μMACS 스트렙타비딘 키트, MACS Miltenyi)에 재현탁시키고, 얼음에서 10분 동안 배양했다. 마지막으로, 15ml 세척 완충제를 첨가하고, 세포를 40μl-세포 스트레이너(strainer)를 통해 통과시켰다.
LS 컬럼(MACS Miltenyi)을 분리기에 넣고, 3ml의 세척 완충제를 적용하여 컬럼을 사전 조정했다. 이어서, 세포 용액을 7ml 배치에 로딩했다. 컬럼의 낙하가 중지되면, 그것을 자석으로부터 간단히 제거하고, 자석으로 다시 넣어 컬럼 내 비드의 방향을 변경하여 포획된 세포가 유동하도록 했다. 다음 7ml의 세포 현탁액을 로딩하기 전에, 세척 완충제 1ml를 컬럼에 적용하였다. 이러한 단계는 모든 세포가 로딩될 때까지 반복되었다. 이어서, 컬럼을 3ml 세척 완충제로 세척하고, 자석에서 간단히 제거하고 3ml 세척 완충제로 다시 세척하였다. 결합 세포를 용출시키기 위해, 컬럼을 자석에서 제거하고 5ml 세척 완충제를 첨가했다. 제공된 플런저를 사용하여 세포를 컬럼을 통해 새로운 튜브로 밀어 넣었다. 결합 세포 분획을 2500g에서 10분 동안 펠릿화했다. 펠릿을 10ml SD-CAA 배지에 재현탁시키고, 10μl의 용출된 세포를 990μl SD-CAA에서 희석시키고, 100μl를 MDL 플레이트 상에 플레이팅하고, 30℃에서 3일 동안 배양하여 MACS 절차의 출력을 추정하고, 나머지 세포는 30℃ 및 180rpm에서 밤새 배양시켰다.
이어지는 FACS 선택 라운드에서, 유도된 세포 현탁액을 10% BSA-PBS 1ml 당 108개 세포로 희석하고 20℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리했다. 세포를 차단하기 위해, 펠릿을 10% BSA-PBS 1ml에 재현탁시키고, 회전 플랫폼에서 20℃에서 30분 동안 배양했다. 세포는 20℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리하고 0.5μM 비오티닐화 EGFR-FC를 함유하는 250㎕의 10% BSA-PBS에 재현탁시켰다. 회전 플랫폼에서 20℃에서 1시간 동안 배양 후, 세포를 4℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리했다. 세포를 세척하기 위해, 펠릿을 1ml 빙냉 PBS에 재현탁시키고, 4℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리했다. 이어서, 세포를 스트렙타비딘-Alexa Fluor 647(1:800) 및 항-V5-FITC 항체(1:100)를 갖는 250㎕의 10% BSA-PBS에 재현탁시키고, 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 4℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리하고, 250μl의 빙냉 PBS에 재현탁시키고 Sony 세포 분류기 SH8000으로 분류할 때까지 얼음에 보관했다. 이전 분류 라운드의 적어도 20x 출력을 처리하고, 0.1% 상부 항-V5-항체-양성 효모 세포를 수집하였다. 가시적 농축 후, 종류를 플레이트 아웃하여 단일 효모 디스플레이 클론을 특성화하였다. 일부 농축된 종류의 경우, 100nM 항원 농도를 사용하여 추가의 선택 라운드가 수행되었다.
스크리닝을 위해, 유도된 효모 세포를 실온에서 30분 동안 OD600 1에서 2% BSA-PBS로 차단했다. 이어서, 그들은 실온에서 30분 동안 2% BSA-PBS에서 100nM에서 시작하여 비오티닐화된 인간 EGFR-Fc의 2배 연속 희석액과 함께 배양했다. 결합은 얼음 위에서 30분 동안 2% BSA-PBS에서 1:1000 희석으로 스트렙타비딘-Alexa Fluor 647로 검출시켰다. 마지막으로, 세포를 200μl 빙냉 PBS에 재현탁시키고, 샘플의 형광을 Guava EasyCyte 유세포 분석기에서 기록했다. 항원-결합 세포의 비율을 평가하고(표 10), EGFR 특이적 결합제 L2B_EU1_1은 서열번호 103을 갖는 아미노산 서열로 동정되었다. 부모 클론과 상이한 잔기는 굵은 글씨로 표시된다.
Figure pct00006
서열번호 103:
FVNKDQIAKDVKQFYDQALWWCCVLYKANNACAVVKTFHETLDCCGSSTGRSHTACVLKGNLCPSGSNIISNLFKEDCHQKIDDLFSGK
16.2 EGFR-특이적 클론에 대한 항원 결합 확인을 위한 포유류 디스플레이 시스템
야생형 CD81 LEL 및 EGFR 특이적 클론 L2BEU1_1의 서열은 pDisplay 벡터(Thermo Scientific)의 SfiI 및 SalI 제한 부위 사이에 클로닝되었다. 이 디스플레이 시스템은 N-말단 HA-태그와 C-말단 c-myc-태그 사이에서 관심 있는 C-말단 고정 단백질의 발현을 허용한다. 작제물은 HEK293-6E 세포(CNRC)로 형질 감염시켰다. 세포를 48시간 또는 72시간 후에 수거하고, 얼음 위의 4% BSA-PBS에서 30분 동안 차단하고, 얼음 위에서 30분 동안 4% BSA-PBS에서 10μg/ml의 CD81에 대한 항체(M38, Thermo Scientific) 및 4% BSA-PBS에서 10μg/ml의 항-c-myc(A-14, sc789, Santa Cruz)로 염색했다. 이들의 결합은 얼음 위에서 30분 동안 4% BSA-PBS에서 1:1000 희석된 2차 시약 항-마우스 F(ab)2-Alexa Fluor 555(Thermo Scientific), 및 4% BSA-PBS에서 1:100으로 희석된 Alexa Fluor 488(Thermo Scientific)과 접합된 항-토끼 (H + L) 항체와 배양 후 검출시켰다. 이어서, 세포를 PBS에 재현탁시키고, Guava EasyCyte 유세포 분석기(Merck Millipore)로 분석할 때까지 얼음 위에 보관했다. 항원 반응성은 300nM에서 비오티닐화된 인간 EGFR-Fc와 함께 배양하고 4% BSA-PBS에서 1:1000에서 스트렙타비딘-Alexa Fluor 647로 검출한 후 결정되었다. 야생형 CD81 LEL 및 EGFR-결합 돌연변이체는 모두 항-c-myc 항체와의 반응성으로 판단할 때 포유류 세포 표면에서 우수한 수준의 디스플레이를 나타냈다(표 11). 야생형 CD81 LEL은 항-CD81 항체와 잘 반응하는 반면, 돌연변이체는 아마도 라이브러리 돌연변이 유발로 인한 관련 에피토프의 변형으로 인해 어떠한 반응성도 나타내지 않았다(표 11). 포유류 세포 디스플레이 형식의 항원 결합은 항원 결합 CD81 LEL 돌연변이체에 대해 확인할 수 있었다(표 11).
Figure pct00007
16.3 EGFR 결합제의 특이성, 종 교차 반응성 및 에피토프 매핑의 특성화
HEK293-6E 세포는 야생형 CD81 LEL 및 항-EGFR 돌연변이체 CD81 LEL L2B_EU1_1을 인코딩하는 pDisplay 작제물로 형질 감염시켰다. 1x105개 세포를 얼음 위에서 30분 동안 2% BSA-PBS에서 차단한 다음, 2% BSA-PBS에서 얼음 위에서 30분 동안 각각 500nM의 비오티닐화된 인간 EGFR-Fc, 비오티닐화된 인간 Her2/neu-Fc 및 비오티닐화된 마우스 EGFR-Fc로 염색했다. 4℃에서 5분, 300g에서 원심분리한 후, 항원의 결합은 얼음에서 30분 동안 1:1000으로 희석된 스트렙타비딘-Alexa Fluor 647(Thermo Scientific)로 검출시켰다. 이어서, 세포를 4℃에서 5분, 300g에서 원심분리하고, 200μl의 빙냉 PBS에 재현탁시켰다. 디스플레이는 얼음 위에서 30분 동안 2% BSA-PBS에서 10μg/ml로 항-c-myc 항체(A-14, sc789, Santa Cruz) 및 2% BSA-PBS에서 1:1000 희석된 Alexa Fluor 488(Thermo Scientific)과 접합된 항-토끼 (H + L) 항체로 유도된 배양물을 염색하여 측정했다. 형광은 Guava EasyCyte 유세포 분석기로 결정되었다. 항-EGFR 클론은 인간 Fc 및 Her2/neu Fc 단백질이 아닌 동족 항원에만 결합하는 것으로 나타났다(표 12). EGFR-반응성 클론은 마우스 EGFR과 교차 반응성인 것으로 나타났다(표 12).
Figure pct00008
Figure pct00009
에피토프 매핑 실험에서, 300nM 항원 용액을 3배 몰 과량의 검증된 항-EGFR 항체 세툭시맙(Li et al., Cancer Cell 7 (4), 301-311 (2005). DOI: 10.1016/j.ccr.2005.03.003) 및 마투주맙(Schmiedel et al., Cancer Cell 13 (4), 365-373 (2008). doi: 10.1016/j.ccr.2008.02.019.2005) 또는 시판되는 인간 IgG- 카파 동형 항체(Sigma-Aldrich)와 함께 배양한 다음, 돌연변이체 CD81 LEL- 디스플레이 세포의 염색에 사용했다. 항원에 대한 검증된 항체의 결합은 실온에서 2% BSA-PBS에서 30분 동안 진행된 다음, 용액을 사용하여 CD81 LEL 돌연변이체 디스플레이 세포를 염색했다. 검출은 얼음 위에서 30분 동안 2% BSA-PBS에서 1:1000으로 희석된 스트렙타비딘-Alexa Fluor 647로 진행되었다. 디스플레이 세포의 MFI 값이 기록되었다. 데이터는 L2B_EU1_1 클론의 결합 부위가 세툭시맙 항체의 결합 부위와 중첩됨을 나타낸다(표 13). L2B_EU1_1은 여전히 과량의 마투주맙 항체의 존재하에 항원에 결합할 수 있다.
Figure pct00010
16.4 CD81 LEL 기반 EGFR-결합제의 변형된 루프의 재무작위화
이 실험의 목적은 EGFR-결합 돌연변이체에서 돌연변이된 잔기의 스트레치를 재무작위화하고, 클론의 결합이 항원 결합 부위를 도입하기 위해 부모 클론에서 무작위화된 폴리펩티드 쇄의 양쪽 스트레치에 있는 아미노산 잔기에 의존한다는 것을 보여주는 것이었다.
재조합을 위한 PCR 단편은 라이브러리 L2BE1_A의 나선 A 및 AB-루프에서 돌연변이된 잔기를 무작위화하는 돌연변이 유발 프라이머 LIB2FWD(서열번호 98)를 1번 및 라이브러리 L2BE1_B의 나선 C에서 돌연변이된 잔기를 무작위화하는 돌연변이 유발 프라이머 LIB2REV2(서열번호 99)를 1번 사용하여 생산되었다. PCR 단편은 Q5 고충실도 폴리머라제(New England Biolabs)를 사용하여 생산되었다. 라이브러리 L2BE1_A의 재조합 단편의 경우, 프라이머 LIB2FWD는 프라이머 AP2(서열번호 104)와 함께 사용되었고, 라이브러리 L2BE1_B의 경우, 프라이머 LIB2REV2(서열번호 99)는 프라이머 AP1(서열번호 105)과 함께 사용되었다.
서열번호 104: CTTGAAGAGGTTGCTGAT
서열번호 105: AAGGATGTGAAGCAGTTC
각각의 재조합 단편은 에스. 세레비지애 EBY100으로의 화학적 형질 전환을 사용하여 클로닝된 CD81 LEL_dellbamdelhind_bamhind 서열을 갖는 BamHI/HindIII 선형화된 수령자 벡터 pYD1과 함께 형질 전환되었다. 35μg의 선형화된 벡터와 25 μg의 PCR 단편이 라이브러리 작제용으로 사용되었다. 라이브러리의 크기는 라이브러리 L2BE1_A의 경우 8.4x106개의 독립적 구성원이고, 라이브러리 L2BE1_B의 경우 1.18x107개의 독립적 구성원이었다. 라이브러리의 품질 관리에는 스트레스 온도로서 라이브러리 구성원의 유도 및 항-Xpress 태그 항체로 검출된 N-말단 태그를 통한 효모-표면 표시 단백질의 후속 측정에 이어, 염소 항-마우스 (Fab')2-FITC(Sigma Aldrich)와의 배양 및 항-V5-FITC 항체(Thermo Scientific)를 사용한 C-말단 V5 태그의 검출을 통해 표시된 단백질의 올바른 판독 프레임의 결정이 포함된다. 각 라이브러리에 대한 항원-결합 세포의 백분율은 500nM에서 인간 EGFR-Fc로 염색하고 염소 항-인간 감마 쇄-PE 접합체(Sigma Aldrich)로 검출한 후 결정되었다. 라이브러리에 대한 양성 세포의 백분율은 표 14에 부모 클론에 대한 특성 값과 함께 제시된다. 두 표적화 영역에서 돌연변이된 잔기의 재무작위화는 항원-양성 클론의 수를 감소시켰으며, 이는 두 무작위화된 스트레치의 아미노산 잔기가 항원 결합에 기여한다는 것을 의미한다.
Figure pct00011
실시예 17: 인간 태반 라미닌에 대한 CD81 LEL 기반 결합제
17.1 인간 라미닌을 사용하는 CD81 LEL 라이브러리 L2 및 L3의 선택
인간 라미닌은 Sigma-Aldrich에서 구입했다. 비오티닐화를 위해, EZ-LinkTM-설포-NHS-LC-LC-비오틴 시약(Thermo Scientific)은 4℃에서 밤새 PBS의 100배 용적에 대한 항원의 투석 후 3:1 몰 비로 사용되었다. 비오티닐화 시약과의 배양은 실온에서 1시간 동안 진탕시키면서 진행되었다. 결합되지 않은 비오틴은 100배 용적의 PBS에 대한 투석으로 10.000 Da MWCO를 갖는 Snakeskin 투석 튜브(Thermo Scientific)를 사용하여 4℃에서 밤새 교반하면서 제거했다.
분류를 위해, 라이브러리 2A, 2B, 3A 및 3B는 밤새 진탕시키면서 30℃에서 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 SD-CAA 배지에서 먼저 배양한 다음, 재조합 단백질의 발현은 효모 세포를 페니실린-스트렙토마이신을 갖는 SG/R-CAA 배지에 재현탁시키고, 그들을 37℃에서 밤새 진탕시키면서 배양함으로써 유도되었다.
MACS의 경우, 109개의 유도된 효모 세포를 1000g에서 5분 동안 펠릿화하고, 펠릿을 50ml의 세척 완충제(PBS, pH 7.2, 0.25% BSA, 2mM의 EDTA)에 재현탁시켜 세척하고, 1000g에서 5분 동안 다시 펠릿화했다. 세척된 세포를 1μM 비오티닐화된 항원을 함유하는 5ml 세척 완충제에 재현탁시키고 부드럽게 진탕시키면서 실온에서 30분 동안 배양하였다. 항원 결합은 10ml 빙냉 세척 완충제를 첨가하여 급냉시키고, 세포 및 항원 용액을 1000g 및 4℃에서 5분 동안 펠릿화하였다. 세포를 5ml 세척 완충제 + 25μl 스트렙타비딘 마이크로비드(μMACS 스트렙타비딘 키트, MACS Miltenyi)에 재현탁시키고, 얼음에서 10분 동안 배양했다. 마지막으로, 15ml 세척 완충제를 첨가하고, 세포 현탁액을 40-㎛ 스트레이너를 통해 여과시켰다.
LS 컬럼(MACS Miltenyi)을 분리기에 넣고, 3ml의 세척 완충제를 적용하여 컬럼을 사전 조정했다. 이어서, 세포 용액을 7ml 배치에 로딩했다. 컬럼의 낙하가 중지되면, 그것을 자석으로부터 간단히 제거하고, 자석으로 다시 넣어 컬럼 내 비드의 방향을 변경하여 포획된 세포가 유동하도록 했다. 다음 7ml의 세포 현탁액을 로딩하기 전에, 세척 완충제 1ml를 컬럼에 적용하였다. 이러한 단계는 모든 세포가 로딩될 때까지 반복되었다. 이어서, 컬럼을 3ml 세척 완충제로 세척하고, 자석에서 간단히 제거하고 3ml 세척 완충제로 다시 세척하였다. 결합 세포를 용출시키기 위해, 컬럼을 자석에서 제거하고 5ml 세척 완충제를 첨가했다. 제공된 플런저를 사용하여 세포를 컬럼을 통해 새로운 튜브로 밀어 넣었다. 결합 세포 분획을 2500g에서 10분 동안 펠릿화했다. 펠릿을 10ml SD-CAA 배지에 재현탁시키고, 10μl의 용출된 세포를 990μl SD-CAA에서 희석시키고, 100μl를 MDL 플레이트 상에 플레이팅하고, 30℃에서 3일 동안 배양하여 MACS 절차의 출력을 추정하고, 나머지 세포는 30℃ 및 180rpm에서 밤새 배양시켰다.
이어지는 FACS 선택 라운드에서, 유도된 세포 현탁액을 10% BSA-PBS 1ml 당 108개 세포로 희석하고 20℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리했다. 세포를 차단하기 위해, 펠릿을 10% BSA-PBS 1ml에 재현탁시키고, 회전 플랫폼에서 20℃에서 30분 동안 배양했다. 세포는 20℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리하고, 1μM 비오티닐화 라미닌을 함유하는 250㎕의 10% BSA-PBS에 재현탁시켰다. 회전 플랫폼에서 20℃에서 1시간 동안 배양 후, 세포를 4℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리했다. 세포를 세척하기 위해, 펠릿을 1ml 빙냉 PBS에 재현탁시키고, 4℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리했다. 이어서, 세포를 스트렙타비딘-Alexa Fluor 647(1:800) 및 항-V5-FITC 항체(1:100)를 갖는 250㎕의 10% BSA-PBS에 재현탁시키고, 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 4℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리하고, 250μl의 빙냉 PBS에 재현탁시키고 Sony 세포 분류기로 분류할 때까지 얼음에 보관했다. 이전 분류 라운드의 적어도 20x 출력을 처리하고, 0.1% 상부 항-V5-항체-양성 효모 세포를 수집하였다. 가시적 농축 후, 종류를 플레이트 아웃하여 단일 효모 디스플레이 클론을 특성화하였다. 일부 농축된 종류의 경우, 100nM 항원을 사용하여 추가의 선택 라운드가 수행되었다.
17.2 포유류 세포에서의 발현
올리고뉴클레오티드 서열 CD81hnhe1(서열번호 106) 및 LELp28_bste2(서열번호 107)를 사용하여 증폭되고 포유류 발현 벡터 pTT28의 NheI 및 BstEII 부위 사이에서 클로닝된 고유한 결합제 서열 및 작제물의 서열은 생어 서열분석(Sanger sequencing)을 사용하여 확인되었다.
서열번호 106: ACGTGCTAGCTTTGTCAACAAGGACCAGATC
서열번호 107: ACGTGGTGACCGGTGCTGGAACCCTTCCCGGAGAAGAGGTC
재조합 단백질은 정확히 제조업체 지침에 따라 HEK293-6E에서 발현되었다. 25ml 배양물의 상청액을 4℃에서 15분, 3500rpm에서 원심분리하여 수거하고, PBS 및 20mM 이미다졸로 완충하고, 0.45μm 필터를 통해 여과한 후 1-ml-His Excel 컬럼(GE Healthcare)에 로딩하고, PBS/20mM 이미다졸, pH 7.5로 평형화했다. 이어서, 컬럼을 동일한 완충제로 세척하고, his-태그된 단백질을 5 컬럼 용적으로 PBS, pH 7.5 중 20-500mM 이미다졸의 구배로 용출시켰다. 분획 4-6은 SDS-PAGE에 이어 쿠마시 염색(Coomassie staining)으로 용출된 단백질의 존재에 대해 분석되었다. 다음 돌연변이체에 대해 발현을 확인할 수 있었다: L2A_LU1(서열번호 108), L2A_LU1_1(서열번호 109), L2B_LU1(서열번호 110), L3B_LU1_2(서열번호 111). 부모 클론과 다른 잔기는 굵은 글씨로 나타낸다.
서열번호 108: L2A_LU1:
FVNKDQIAKDVKQFYDQALRECCNTFDANNACAVVKTFHETLDCCGSSTTHSSTGCVLFFNLCPSGSNIISNLFKEDCHQKIDDLFSGK
서열번호 109: L2A_LU1_1:
FVNKDQIAKDVKQFYDQALMICCHRHYANNACAVVKTFHETLDCCGSSTPSSTTPCVLQNNLCPSGSNIISNLFKEDCHQKIDDLFSGK
서열번호 110: L2B_LU1:
FVNKDQIAKDVKQFYDQALVFCCFGGHANNACAVVKTFHETLDCCGSSTHPYKTKCVLQRNLCPSGSNIISNLFKEDCHQKIDDLFSGK
서열번호 111: L3B_LU1_2:
FVNKDQIAKDVKQFYDQCLKYACKQGDWENAKACVKTFHETLDCCGSSTVANMTRCVLPANLCPSGSNIISNLFKEDCHQKIDDLFSGK
17.3 가용성 형식의 항원 결합
정돈된 용출된 단백질은 그들의 동족 항원과 대조군 항원으로서 BSA에 대한 결합에 대해 테스트되었다. 스트렙타비딘-활성화 플레이트(고정제, NUNC)를 실온에서 30분 동안 PBS에서 5μg/ml의 비오티닐화된 라미닌으로 코팅하고, 실온에서 1시간 동안 4% BSA-PBS로 차단했다. 용출된 단백질을 2% BSA-PBS에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 결합하도록 했다. PBS로 3회 세척 단계 후, 결합은 2% BSA-PBS에서 30분 동안 항-pentaHis 항체-HRP 접합체(QIAgen)의 1:3000 희석으로 검출하고, TMB(Sigma-Aldrich)의 첨가시 나타났다. 반응은 H2SO4를 첨가하여 중지시키고, 흡광도는 450/620nm에서 판독했다(표 15). 표적 단백질과의 특이적 반응성은 3개의 라미닌 특이적 클론인 L2A_LU1, L2B_LU1 및 L3B_LU1_2에 대해 확인할 수 있었다.
Figure pct00012
17.4 포유류 세포 디스플레이 시스템에서 라미닌 결합제의 발현
라미닌 결합 클론의 서열은 pDisplay 벡터(Thermo Scientific)의 SfiI 및 SalI 제한 부위 사이에 클로닝되었다. 이 디스플레이 시스템은 N-말단 HA-태그와 C-말단 c-myc-태그 사이에 관심있는 C-말단 고정 단백질의 발현을 허용한다. 작제물은 HEK293-6E 세포(CNRC)로 형질 감염시켰다. 세포를 48시간 또는 72시간 후에 수거하고, 얼음 위의 4% BSA-PBS에서 30분 동안 차단하고, 얼음 위에서 30분 동안 4% BSA-PBS에서 10㎍/ml의 항-c-myc 항체(A-14, sc789, Santa Cruz)로 염색했다. 이들의 결합은 얼음 위에서 30분 동안 4% BSA-PBS에서 1:1000으로 희석된 Alexa Fluor 488(Thermo Scientific A11034)과 접합된 2차 항-토끼 (H + L) 항체와배양한 후 검출되었다. 항원 반응성은 500nM에서 비오티닐화된 인간 라미닌과 함께 배양하고 4% BSA-PBS에서 1:1000에서 스트렙타비딘-Alexa Fluor 647로 검출한 후에 결정되었다. 이어서, 세포를 PBS에 재현탁시키고 Guava EasyCyte 유세포 분석기(Merck Millipore)로 분석할 때까지 얼음 위에 보관했다. 테스트된 모든 클론에 대해, 포유류 세포 표면 위의 표시가 검출될 수 있다(표 16). 9개의 클론에 대해, 재조합 항원과의 반응성이 확립될 수 있다(표 16).
Figure pct00013
발견된 클론의 서열은 다음에 대해 결정되었다: L3A_LU1(서열번호 112), L2B_LU1_1(서열번호 113), 81 L1(서열번호 110, L2B_LU1과 동일), 81L_13(서열번호 114), 81L_17(서열번호 115), 81L_21(서열번호 116). 부모 클론과 상이한 잔기는 굵은 글씨로 나타낸다.
서열번호 112:
FVNKDQIAKDVKQFYDQCLLWACSKRYKYNAKACVKTFHETLDCCGSSTMGNLTECVLIENLCPSGSNIISNLFKEDCHQKIDDLFSGK
서열번호 113:
FVNKDQIAKDVKQFYDQALWKCCNLSQANNACAVVKTFHETLDCCGSSTYLCATYCVLWPNLCPSGSNIISNLFKEDCHQKIDDLFSGK
81L_1 (서열번호 110):
FVNKDQIAKDVKQFYDQALVFCCFGGHANNACAVVKTFHETLDCCGSSTHPYKTKCVLQRNLCPSGSNIISNLFKEDCHQKIDDLFSGK
서열번호 114:
FVNKDQIAKDVKQFYDQCLSWACNRKYEPNAKACVKTFHETLDCCGSSTKANYTHCVLEMNLCPSGSNIISNLFKEDCHQKIDDLFSGK
서열번호 115:
FVNKDQIAKDVKQFYDQCLRHACSGLSGRNAKACVKTFHETLDCCGSSTIKHKTLCVLIKNLCPSGSNIISNLFKEDCHQKIDDLFSGK
서열번호 116:
FVNKDQIAKDVKQFYDQALFICCFRRYANNACAVVKTFHETLDCCGSSTRNNETACVLAKNLCPSGSNIISNLFKEDCHQKIDDLFSGK
실시예 18: EV 표면에서 발현된 항-라미닌 CD81 돌연변이체
18.1 EV 제조
HeLa 세포에 야생형 CD81 또는 L2A_LU1(서열번호 12) 또는 L3B_LU1_2(서열번호 15)의 서열에 상응하는 변형된 LEL을 갖는 CD81을 형질도입하고, eGFP와 인 프레임으로 pBMN 발현 벡터에 클로닝시켰다. 세포외 소포(EV)는 RPMI(10% FCS, 4mM L-글루타민)에서 80%의 컨플루언스로 배양된 형질 도입된 HeLa 세포로부터 제조했다. 이 후, 배지를 교환하고, OptiPRO SFM에서 72 내지 96시간 동안 EV 수집을 수행했다. 세포 및 세포 파편을 제거하기 위해 세포 배양 상청액을 3,000g에서 30분 동안 원심분리하였다. 더 큰 입자는 상청액을 0.45㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 여과하여 배제시켰다. 최종적으로, EV는 120000g에서 90분 동안 초원심분리에 의해 펠릿화하고, 생세포 이미징 용액(Thermo Scientific)에 재현탁시켰다. CD81-eGFP 융합을 보유하는 재조합 EV는 유세포 분석법 기반 검출(ImmunoStep)을 위한 인간 CD9 포획 비드를 사용하여 확인되었다.
18.2 EV 표면에서 발현된 항-라미닌 CD81 돌연변이체의 특이적 항원 결합을 보여주는 경쟁 검정
야생형 CD81-eGFP 및 각각의 라미닌 표적화 변이체 L2A_LU1 및 L3B_LU1_2를 보유하는 5x 109개의 재조합 EV를 밤새 6x 103 CD9 + 포획 비드와 함께 배양하였다. 비오티닐화된 인간 태반 라미닌 5㎍/mL를 비드에 첨가하고, 일부 병렬 샘플에서는 경쟁을 위해 표지되지 않은 라미닌 15㎍/mL를 첨가했다. 뉴트라비딘-PE(1:800)를 사용하여 EV-결합 라미닌을 검출했다. 배경(BG) 형광은 뉴트라비딘-PE로만 염색하여 결정했다. eGFP의 형광은 488nm에서 측정되었고 PE-형광은 561nm에서 측정되었다. 라미닌 결합 CD81 돌연변이체 모두에 대해, 표적 항원에 대한 특이적 결합이 나타났지만, 이는 야생형 CD81에서는 관찰되지 않았다. 또한, 표지되지 않은 라미닌에 의한 표지된 것보다 우월한 결과는 특이적 결합을 나타내는 신호를 감소시켰다(표 17).
Figure pct00014
18.3 라미닌 표적화 EV의 모델 간암종 세포주 Huh7로의 흡수
CD81-eGFP 및 이의 표적화 변이체를 보유하는 2.4x, 1.6x 및 0.8x 1010개의 재조합 EV를 3시간 동안 0.4x 106개의 Huh7 세포와 함께 배양했다. 세포를 트립신화하고, 중화시키고, 100㎕의 PBS에 재현탁시켰다. 유세포 분석법을 사용하여 통합된 eGFP 양성 EV를 갖는 세포의 흡수 수준을 측정하고, 주요 집단(FSC/SSC를 통해 게이팅됨)의 MFI 값을 결정했다. 표 18에서, CD81 야생형-eGFP의 MFI최대로 정규화된 EV의 단일 배치의 수득된 결과의 생물학적 3배가 제시되어 라미닌 표적화 EV의 2 내지 3배 증가된 흡수를 나타낸다.
Figure pct00015
다른 실험에서, 라미닌-표적화 EV의 상이한 배치의 간암종 세포주 Huh7로의 흡수 복제를 수행하였다. 3개의 독립적인 EV 배치를 중복 테스트하고, MFI최대로 정규화했다. CD81-eGFP 또는 각각의 표적화 변이체를 포함하는 2.4x1010개의 재조합 EV를 0.4x 106개의 Huh7 세포와 함께 3시간 동안 배양하였다. 세포를 트립신화하고, 중화시키고, 120㎕의 PBS에 재현탁시켰다. 유세포 분석법을 사용하여 eGFP 양성 EV가 통합된 세포의 흡수 수준을 측정하고, 주요 집단(FSC/SSC를 통해 게이팅됨)의 MFI 값을 결정했다. 값은 MFI최대로 정규화되었다. 중복의 평균 및 표준 편차는 표 19에 제시되어 있다. 과발현된 라미닌 결합 CD81을 갖는 EV는 Huh7 세포로의 더 높은 흡수를 보여주었다.
Figure pct00016
실시예 19: 인간 Her2/neu에 대한 CD81 LEL 기반 결합제
19.1 인간 Her2/neu를 사용하는 CD81 LEL 라이브러리 L2A 및 L2B의 선택
인간 Her2/neu-Fc는 SinoBiological에서 구입했다. 비오티닐화를 위해, EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-LC-비오틴 시약(Thermo Scientific)을 비오틴 대 단백질의 3:1 몰 비로 사용했다. 비오티닐화 시약과의 배양은 실온에서 1시간 동안 진탕시키면서 진행되었다. 결합되지 않은 비오틴은 100x 용적의 PBS에 대한 투석으로 10.000 Da MWCO를 갖는 Snakeskin 투석 튜브(Thermo Scientific)를 사용하여 4℃에서 밤새 교반하면서 제거하고, 표지된 항원의 분취량은 추가로 사용할 때까지 -80℃에서 저장했다.
분류를 위해, 라이브러리 2A 및 2B를 최초로 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 SD-CAA 배지에서 30℃에서 밤새 진탕시키면서 배양한 다음, 재조합 단백질의 발현은 효모 세포를 페니실린-스트렙토마이신을 갖는 SG/R-CAA 배지에 재현탁시키고 그들을 37℃에서 밤새 진탕시키면서 배양하여 유도했다.
MACS의 경우, 4x109개의 유도된 효모 세포를 1000g에서 5분 동안 펠릿화하고, 실온에서 30분 동안 회전 휠에서 10% BSA-PBS에서 차단했다. 세포를 펠릿화하고, 0.5μM 비오티닐화된 항원을 함유하는 10% BSA-PBS에 재현탁시키고 회전 휠에서 실온에서 30분 동안 배양하였다. 항원 결합은 10배 용적의 빙냉 PBS를 첨가하여 급냉시키고, 세포를 1000g 및 4℃에서 5분 동안 펠릿화하였다. 세포를 5ml 세척 완충제 + 200μl 스트렙타비딘 마이크로비드(MACS Miltenyi)에 재현탁시키고, 얼음에서 15분 동안 배양했다. 마지막으로, 15ml MACS 세척 완충제(0.5% BSA, PBS 중 2mM EDTA; pH 7.4)를 첨가했다. 세포 현탁액을 40-㎛ 세포 스트레이너를 통해 통과시켰다.
LS 컬럼(MACS Miltenyi)을 분리기에 넣고, 3ml의 세척 완충제를 적용하여 컬럼을 사전 조정했다. 이어서, 세포 용액을 7ml 배치에 로딩했다. 컬럼의 낙하가 중지되면, 그것을 자석으로부터 간단히 제거하고, 자석으로 다시 넣어 컬럼 내 비드의 방향을 변경하여 포획된 세포가 유동하도록 했다. 다음 7ml의 세포 현탁액을 로딩하기 전에, 세척 완충제 1ml를 컬럼에 적용하였다. 이러한 단계는 모든 세포가 로딩될 때까지 반복되었다. 이어서, 컬럼을 5ml 세척 완충제로 3회 세척했다. 결합 세포를 용출시키기 위해, 컬럼을 자석에서 제거하고 5ml 세척 완충제를 첨가했다. 제공된 플런저를 사용하여 세포를 컬럼을 통해 새로운 튜브로 밀어 넣었다. 결합 세포 분획을 2500g에서 10분 동안 펠릿화했다. 펠릿을 10ml SD-CAA 배지에 재현탁시키고, 10μl의 용출된 세포를 990μl SD-CAA에서 희석시키고, 100μl를 MDL 플레이트 상에 플레이팅하고, 30℃에서 3일 동안 배양하여 MACS 절차의 출력을 추정하고, 나머지 세포는 30℃ 및 180rpm에서 밤새 배양시켰다.
이어지는 FACS 선택 라운드에서, 유도된 세포 현탁액을 10% BSA-PBS 1ml 당 108개 세포로 희석하고 20℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리했다. 세포를 차단하기 위해, 펠릿을 10% BSA-PBS 1ml에 재현탁시키고, 회전 플랫폼에서 20℃에서 30분 동안 배양했다. 세포는 20℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리하고 0.5μM 비오티닐화 Her2/neu-Fc를 함유하는 150㎕의 10% BSA-PBS에 재현탁시켰다. 회전 플랫폼에서 실온에서 1시간 동안 배양 후, 항원 결합은 1ml의 빙냉 PBS를 첨가하여 급냉시켰다. 세포를 4℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리하고, 스트렙타비딘-Alexa Fluor 647(Thermo Fisher Scientific)(1:800) 및 항-V5-FITC 항체(Thermo Scientific)(1:100)를 갖는 800㎕의 10% BSA-PBS에 재현탁시키고, 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 4℃에서 5분 동안 3000rpm에서 원심분리하고, 250μl의 빙냉 PBS에 재현탁시키고 Sony SH8000 분류 장치로 분류할 때까지 얼음에 보관했다. 이전 분류 라운드의 적어도 20x 출력을 처리하고, 0.1% 상부 항-V5-항체 양성 효모 세포를 수집하였다. 농축된 풀을 5회 분류 라운드에 적용하고, 단일 효모 클론은 스크리닝을 위해 플레이트 아웃했다. 5개의 동정된 서열을 pDisplay 발현 벡터로 클로닝하고, HEK293-6E 세포에서 발현하고, 인간 Her2/neu에 대한 결합에 대해 테스트했다. 세포를 48시간 또는 72시간 후에 수거하고, 얼음 위의 4% BSA-PBS에서 30분 동안 차단하고, 얼음 위에서 30분 동안 4% BSA-PBS에서 10㎍/ml의 항-c-myc 항체(A-14, sc789, Santa Cruz)로 염색했다. 이들의 결합은 얼음 위에서 30분 동안 4% BSA-PBS에서 1:1000으로 희석된 Alexa Fluor 488(Thermo Scientific A11034)과 접합된 2차 항-토끼 (H + L) 항체와 함께 배양한 후 검출되었다. 항원 반응성은 300nM에서 시작하는 2배 희석 시리즈에서 비오티닐화된 인간 Her2/neu/Fc와 배양하고 4% BSA-PBS에서 1:1000에서 스트렙타비딘-Alexa Fluor 647로 검출한 후 결정되었다. 이어서, 세포를 PBS에 재현탁시키고 Guava EasyCyte 유세포 분석기(Merck Millipore)로 분석할 때까지 얼음 위에 보관했다.
클론 81_H2_11(서열번호 117)은 인간 HER2/neu의 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다(표 20). 부모 클론과 다른 잔기는 굵은 글씨로 나타낸다.
서열번호 117:
FVNKDQIAKDVKQFYDQALVNCCYTRAANNACAVVKTFHETLDCCGSSTHYVDTHCVLNRNLCPSGSNIISNLFKEDCHQKIDDLFSGK
Figure pct00017
19.2 CD81 LEL 기반 Her2/neu 결합제 특이성의 특성화
HEK293-6E 세포는 야생형 CD81 LEL 및 항-Her2/neu 지시된 CD81 LEL 81H2-11을 인코딩하는 pDisplay 작제물로 형질 감염시켰다. 1x105 세포를 얼음 위에서 30분 동안 2% BSA-PBS에서 차단한 다음, 2% BSA-PBS에서 얼음에서 30분 동안 각각 500nM 비오티닐화된 인간 EGFR-Fc, 비오티닐화된 인간 Her2/neu-Fc 및 비오티닐화된 마우스 EGFR-Fc로 염색했다. 4℃에서 5분, 300g에서 원심분리한 후, 항원의 결합은 얼음에서 30분 동안 1:1000으로 희석된 스트렙타비딘-Alexa Fluor 647로 검출되었다. 이어서, 세포를 4℃에서 5분, 300g에서 원심분리하고, 200μl의 빙냉 PBS에 재현탁시켰다. 디스플레이는 얼음 위에서 30분 동안 2% BSA-PBS에서 10μg/ml의 항-c-myc 항체(A-14, sc789, Santa Cruz) 및 2% BSA-PBS에서 1:1000 희석된 Alexa Fluor 488(Thermo Scientific A11034)과 접합된 항-토끼 (H + L) 항체로 유도된 배양물을 염색하여 측정했다. 형광은 Guava EasyCyte 유세포 분석기로 결정되었다. 항-Her2/neu 클론은 동족 항원에만 결합하는 것으로 나타났다(표 21).
Figure pct00018
실시예 20: 인간 CD9 LEL의 안정화
20.1 안정화된 CD9 LEL 돌연변이체의 설계 및 작제
전장 인간 CD9 서열을 갖는 Genbank 항목을 동정하고, BLAST 비교를 수행하여 LEL 영역의 경계를 묘사했다. 문헌(참조: Seigneuret, 2006)에 정의된 CD9 LEL 영역의 상동성 모델링은 제안된 가장 가까운 모델로 CD81 LEL PDB:1iv5와 함께 Swissmodel(Waterhouse et al ., 2018)을 사용하여 수행되었다. 생산되는 구조는 0.413Å의 RMSD로 CD81 LEL 결정 구조 1g8q와 정렬될 수 있다. CD9 LEL의 서열(서열번호 118)은 pTT28 벡터(CNRC)의 NheI 및 BstEII 클로닝 부위 사이의 올리고뉴클레오티드 CD9hnhe1(서열번호 119) 및 CD9p28_bste2(서열번호 120)를 사용하여 클로닝되었다.
서열번호 118:
HKDEVIKEVQEFYKDTYNKLKTKDEPQRETLKAIHYALNCCGLAGGVEQFISDICPKKDVLETFTVKSCPDAIKEVFDNK
서열번호 119: ACGTGCTAGCCACAAGGATGAGGTGATTAAG
서열번호 120: ACGTGGTGACCGGTGCTGGAACCTTTATTGTCGAAGACCTC
돌연변이 유발 반응을 수행하여 올리고뉴클레오티드 CD9_L20C(서열번호 121) 및 CD9_20Ca(서열번호 122), 및 CD9_28C(서열번호 123) 및 CD9_28Ca(서열번호 124를 사용하여 제조업체 지침에 따라 QuickChange Lightning 돌연변이 유발 키트(Agilent)로 위치 20 및 28에서 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 교체하여 (서열번호 125)에서의 아미노산 서열을 같은 안정화된 변이체 CD9 LEL_20_28을 생산했다.
서열번호 121: GACACCTACAACAAGTGCAAAACCAAGGATGAG
서열번호 122: CTCATCCTTGGTTTTGCACTTGTTGTAGGTGTC
서열번호 123: AAGGATGAGCCCCAGTGTGAAACGCTGAAAGCC
서열번호 124: GGCTTTCAGCGTTTCACACTGGGGCTCATCCTT
서열번호 125:
HKDEVIKEVQEFYKDTYNKCKTKDEPQCETLKAIHYALNCCGLAGGVEQFISDICPKKDVLETFTVKSCPDAIKEVFDNK
CD9 LEL 및 CD9 LEL_20_28은 정확히 제조업체의 지침에 따라 MaxTiter 프로토콜에 따라 ExpiCHO 시스템에서 발현되었고, 각각 35 및 70mg/L 상청액에서 1단계 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피로 정제되었다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE로 분석되었으며, 둘 다 단량체였다. 열 안정성은 시차 주사 열량계(DSC)를 사용하여 결정되었다. 야생형 단백질의 융점은 52.7℃인 것으로 결정되었고 안정화된 변이체 20-28의 융점은 81.9℃인 것으로 결정되어 성공적인 안정화를 나타낸다.
20.2 결합제 선택을 위한 CD9 LEL 기반 효모 디스플레이 라이브러리 작제
20.2.1 야생형 CD9 LEL의 효모 디스플레이
CD9 LEL의 서열은 pYD1 벡터의 BamHI 및 NotI 클로닝 부위 사이의 올리고뉴클레오티드 CD9YDbam1(서열번호 126) 및 CD9YDnot2(서열번호 127)를 사용하여 클로닝하고, 작제물은 화학적 형질 전환을 사용하여 에스. 세레비지애로 형질 전환되었다.
서열번호 126: ACGTGGATCCCACAAGGATGAGGTGATTAAG
서열번호 127: ACGTGCGGCCGCGCTTTATTGTCGAAGACCTC
형질 전환체를 MDL-플레이트에서 선택하고, SD-CAA에서 30℃에서 배양하고 20℃에서 48시간 동안, 37℃에서 24시간 동안 유도했다. N-말단 태그를 통해 효모 표면 표시된 단백질의 후속적 측정은 항-Xpress 태그 항체(Thermo Scientific)의 1:2000 희석으로의 검출에 이어, 염소 항-마우스 (Fab')2-Alexa Fluor 555(Thermo Scientific)(1:1000)와의 배양을 통해 수행되었고, 표시된 단백질의 올바른 판독 프레임의 결정은 1:200에서 항-his-Alexa Fluor 488 항체(QIAgen)로 C-말단 his-태그의 검출 및 1:100에서 항-V5-FITC 항체(Thermo Scientific)에 의한 C-말단 V5-태그의 검출을 통해 이루어졌고, 모두 2% BSA-PBS에 중에서 였다. 또한, 항-CD9 특이적 항체 MEM-61(Thermo Scientific)과의 반응성은 효모 세포를 2% BSA-PBS에서 10μg/ml 항체로 먼저 배양하고 염소 항-마우스 (Fab')2-Alexa Fluor 555(Thermo Scientific)와의 결합을 2% BSA-PBS에서 1:1000 희석에서 검출함으로써 결정되었다. 200㎕ 빙냉 PBS에 재현탁시킨 후, 양성 효모 세포의 백분율을 Guava EasyFlow Cytometer로 결정했다(표 22).
Figure pct00019
20.2.2 결합 클론의 설계를 위한 CD9 LEL의 돌연변이 유발
CD9 LEL_20_28 서열의 잔기 18-19, 21-25 및 27은 올리고뉴클레오티드 CD9NOTREC2(서열번호 129)와 결합된 올리고뉴클레오티드 CD9PFOREC1(서열번호 128)을 사용하여 돌연변이 유발되어 PCR 재조합 단편을 생산했다.
서열번호 128:
CACAAGGATGAGGTGATTAAGGAAGTCCAGGAGTTTTACAAGGACACCTACNNKNNKTGCNNKNNKNNKNNKNNKCCCNNKTGTGAAACGCTGAAAGCC
여기서, N은 A, C, G 또는 T 중 어느 하나이다.
서열번호 129:
CTTCGAAGGGCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCGCTTTATTGTCGAAGACCTC
이 단편은 효소 PfoI 및 NotI로 선형화된 벡터 pYD1CD9와 함께 사용되어 에스. 세레비지애 EBY100을 형질 전환시킨다. 크기 1x108개의 독립적 구성원의 생산되는 라이브러리는 결합 클론의 농축이 달성될 때까지 하나의 MACS 기반 선택 및 여러 FACS 기반 선택 라운드를 사용하여 인간 EGFR-Fc를 갖는 결합제에 대해 선택된다. 결합제의 서열은 포유류 pDisplay 벡터로 재클로닝되고, 생산되는 플라스미드는 HEK293-6E 세포를 형질 감염시키는 데 사용된다. 48 내지 72시간 후, 세포를 수거하고, 항원과 2차 시약으로 염색하여 특이적으로 결합하는 클론을 검출한다.
참고문헌
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Claims (35)

  1. N-말단 및 C-말단에서 야생형 소포외 도메인(ED) 서열의 영역이 측면에 있는(flanked) 3-20개의 연속 아미노산 길이를 갖는 ED 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 변형된 영역 내에서 돌연변이유발 방법에 의해 세포외 소포(EV) 표면 단백질의 소포외 도메인(ED)을 인코딩(encoding)하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 변형시켜 표적 결합 부위(target binding site)를 ED 내에 통합시킴으로써 각각 상이한 표적 결합 부위를 포함하는 다양한 표적 특이적 소포외 도메인(TED)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 레퍼토리(repertoire)를 생산하는 단계, 소정의 표적을 특이적으로 인식하는 TED를 선택하는 단계 및 선택된 TED를 포함하는 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 세포외 소포(EV) 표면 단백질의 표적 특이적 소포외 도메인(TED)을 포함하는 단백질을 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 레퍼토리가 바람직하게는 효모, 파지(phage), 박테리아, 리보솜, mRNA 또는 포유류 세포 디스플레이(display)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 디스플레이 시스템을 사용하여, 외부 표면에 다양한 TED를 표시(displaying)하는 유전적 패키지(genetic package)에 포함되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 변형된 영역이 TED로부터 단리될 때 더 낮은 표적 결합 친화성을 갖는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 결합 부위가 적어도 2개의 아미노산에서 멀리 떨어진 추가의 변형된 영역 내에 또는 야생형 ED 서열 내에 있는 적어도 하나의 추가 결합 영역을 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, TED가 야생형 ED에 대해 적어도 70% 서열 동일성(sequence identity)을 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 ED가 테트라스팬-유사 단백질(tetraspan-like protein), 인테그린 계열 단백질, 프로테오글리칸, 5-막관통 도메인(transmembrane domain) 단백질, I형 막관통 단백질, 노치 계열(Notch family) 단백질, 효소 막 단백질, 면역 조절 표면 단백질, 중간 엽 줄기 세포의 표면 마커, 당단백질 또는 채널링 단백질(channelling protein)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 EV 표면 단백질로부터 유래하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 테트라스팬 유사 단백질이 바람직하게는
    a) 서열번호 87로 동정된(identified) 아미노산 서열을 포함하는 CD81;
    b) 서열번호 89로 동정된 아미노산 서열을 포함하는 CD9;
    c) 서열번호 90으로 동정된 아미노산 서열을 포함하는 CD53;
    d) 서열번호 91로 동정된 아미노산 서열을 포함하는 TSPAN32;
    e) 서열번호 92로 동정된 아미노산 서열을 포함하는 CD82;
    f) 서열번호 93으로 동정된 아미노산 서열을 포함하는 CD63;
    g) 서열번호 94로 동정된 아미노산 서열을 포함하는 CD151; 및
    h) 서열번호 95로 동정된 아미노산 서열을 포함하는 CD37로 이루어진 그룹으로부터 선택된 테트라스파닌(tetraspanin)이고, 또는
    테트라스팬 유사 단백질이 리소좀-연관 막 단백질(lysosome-associated membrane protein), 바람직하게는 서열번호 96으로 동정된 아미노산 서열을 포함하는 LAMP2인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 ED가 다음 중 어느 하나의 것인, 방법:
    a) CD81, 여기서 ED는 서열번호 130 또는 서열번호 131로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고;
    b) CD9, 여기서 ED는 서열번호 132, 서열번호 182 또는 서열번호 133으로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고;
    c) CD53, 여기서 ED는 서열번호 134 또는 서열번호 135로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고;
    d) TSPAN32, 여기서 ED는 서열번호 136 또는 서열번호 137로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고;
    e) CD82, 여기서 ED는 서열번호 138 또는 서열번호 139로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고;
    f) CD63, 여기서 ED는 서열번호 140 또는 서열번호 141로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고;
    g) CD151, 여기서 ED는 서열번호 142 또는 서열번호 143으로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고;
    h) CD37, 여기서 ED는 서열번호 144 또는 서열번호 145로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고; 또는
    i) LAMP2, 여기서 ED는 서열번호 146으로 동정된 아미노산 서열을 포함한다.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 위치(들)에서 하나 이상의 시스테인(들)에 의해 안정화되어 하나 이상의 이황화 결합(disulfide bond)의 형성을 허용하는 ED 아미노산 서열에 루프 구조(loop structure)를 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 영역이 ED의 루프 영역 내에 위치하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, ED가
    a) CD81의 것이고, 아미노산 서열은 시스테인을 도입하도록 변형되어 바람직하게는 위치 134와 144 사이 및/또는 130과 146 사이 및/또는 135와 168 사이에, 야생형 ED 서열에서 자연적으로 발생하지 않는 하나 이상의 이황화 결합의 형성을 허용하고, 여기서 번호매김(numbering)은 서열번호 87로 동정된 인간 CD81의 것이고, 또는
    b) CD9의 것이고, 아미노산 서열은 시스테인을 도입하도록 변형되어 바람직하게는 위치 20과 28 사이에, 야생형 ED 서열에서 자연적으로 발생하지 않는 하나 이상의 이황화 결합의 형성을 허용하고, 여기서 위치의 번호매김은 CD9 큰 세포외 루프(LEL, 서열번호 118)의 것인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, ED가 CD81의 것이고, 변형된 영역이 위치 160 및 172 내에 위치하며, 여기서 번호매김은 서열번호 87로 동정된 인간 CD81의 것인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, TED가 위치 132와 141 사이 또는 위치 180과 189 사이에 위치하는 적어도 하나의 추가 결합 영역을 포함하고, 여기서 번호매김은 서열번호 87로 동정된 인간 CD81의 것인, 방법.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, ED가 CD9의 것이고, 변형된 영역이 위치 155-166, 위치 128-142, 위치 130-140, 또는 위치 169-180 중 어느 하나 내에 위치하고, 여기서 번호매김은 서열번호 89로 동정된 인간 CD9의 것인, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 표적이 세포 표적, 바람직하게는 유사분열 수용체, 사이토카인 수용체, 아시알로당단백질 수용체, 막 수송체, 지단백질, 리포사카라이드(liposaccharide), 당단백질, 프로테오글리칸 또는 무세포 표적, 바람직하게는 사이토카인, 인공 단백질 또는 인공 표면 구조물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, TED를 포함하는 단백질이 상기 TED 및 적어도 하나의 막관통 도메인을 포함하는 표적-특이적 EV 표면 단백질(TSP)인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 막관통 도메인이 포유류 EV 표면 단백질로부터 유래하는 막관통 도메인에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 포함하는, 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 막관통 도메인이 다음 중 어느 하나의 것인, 방법:
    a) CD81, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 147, 서열번호 148, 서열번호 149 또는 서열번호 150으로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고;
    b) CD9, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 151, 서열번호 152, 서열번호 153 또는 서열번호 154로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고;
    c) CD53, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 155, 서열번호 156, 서열번호 157 또는 서열번호 158로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고;
    d) TSPAN32, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 159, 서열번호 160, 서열번호 161 또는 서열번호 162로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고;
    e) CD82, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 163, 서열번호 164, 서열번호 165 또는 서열번호 166으로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고;
    f) CD63, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 167, 서열번호 168, 서열번호 169 또는 서열번호 170으로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고;
    g) CD151, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 171, 서열번호 172, 서열번호 173 또는 서열번호 174로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고;
    h) CD37, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177 또는 서열번호 178로 동정된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고; 또는
    i) LAMP2, 여기서 막관통 도메인은 서열번호 179로 동정된 아미노산 서열을 포함한다.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, ED 및 막관통 도메인이 둘 모두 동일한 EV 표면 단백질에서 유래하고, 바람직하게는 EV 표면 단백질이 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법:
    a) 서열번호 87로 동정된 아미노산 서열을 포함하는 CD81;
    b) 서열번호 89로 동정된 아미노산 서열을 포함하는 CD9;
    c) 서열번호 90으로 동정된 아미노산 서열을 포함하는 CD53;
    d) 서열번호 91로 동정된 아미노산 서열을 포함하는 TSPAN32;
    e) 서열번호 92로 동정된 아미노산 서열을 포함하는 CD82;
    f) 서열번호 93으로 동정된 아미노산 서열을 포함하는 CD63;
    g) 서열번호 94로 동정된 아미노산 서열을 포함하는 CD151;
    h) 서열번호 95로 동정된 아미노산 서열을 포함하는 CD37; 및
    i) 서열번호 96으로 동정된 아미노산 서열을 포함하는 LAMP2.
  20. a) 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득 가능한 TED를 포함하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
    b) 상기 폴리뉴클레오티드를 공급원 세포(source cell) 또는 공급원 세포 혼합물에 도입하는 단계;
    b) 상기 세포(들)를 세포외 소포를 생산하는 조건하에서 배양하는 단계;
    c) TED의 표적 결합 부위를 포함하는 TEV를 포함하는 분획을 단리하는 단계; 및
    d) 상기 분획에 포함된 TEV의 제제를 생산하는 단계에 의해 표적 특이적 세포외 소포(TEV)를 생산하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, TED를 포함하는 단백질이 상기 TED 및 적어도 하나의 막관통 도메인을 포함하는 표적-특이적 EV 표면 단백질(TSP)이고, TEV가 이의 막의 외부 표면에 표적 결합 부위를 표시하는, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, TEV에 소포내 로드(load)를 로딩하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 로드가 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 도메인, 단백질, 지질, 유전자, 핵산, 예를 들어, mRNA, miRNA, RNAi 매개 분자, 특히 록킹된(locked) 핵산 또는 포스포로티오에이트, DNA, DNA 단편, 플라스미드, 예를 들어, 미니서클(minicircle) DNA, 약물, 예를 들어, 작은 분자, 특히 화학요법제 또는 세놀리틱스(senolytics) 중 임의의 하나 이상을 포함하는, 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 공급원 세포 또는 공급원 세포 혼합물이 진핵 또는 원핵 공급원, 바람직하게는 신체 조직, 체액 또는 세포 배양물로부터 유래하는, 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 공급원 세포 또는 공급원 세포 혼합물이 대상체로부터 수득되고, TEV 제제가 자가 사용용으로 제형화되는, 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득 가능한 TEV 제제.
  26. 제23항의 방법에 의해 생산된 자가 TEV 제제로서, 공급원 세포 또는 공급원 세포 혼합물이 대상체로부터 수득되고, TEV 제제가 동일한 대상체에게 자가 사용하기 위해 제형화되는, 자가 TEV 제제.
  27. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득 가능한 세포외 소포(EV) 표면 단백질의 표적 특이적 소포외 도메인(TED)을 포함하는 단백질.
  28. 포유류 EV 표면 단백질 서열의 야생형 소포외 도메인(ED)에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 포함하고, N-말단 및 C-말단에서 야생형 ED 서열의 영역이 측면에 있는 3-20개의 연속 아미노산 길이를 갖는 적어도 하나의 변형된 영역을 포함하며, 이 변형 영역이 야생형 ED에서 자연적으로 발생하지 않는 표적 결합 부위의 적어도 일부인 세포외 소포(EV) 표면 단백질의 표적-특이적 소포외 도메인(TED)으로서, 변형된 영역이 TED로부터 단리될 때 더 낮은 표적 결합 친화성을 갖고/갖거나 표적 결합 부위가 적어도 2개의 아미노산에서 멀리 떨어진 추가의 변형 영역 내에, 또는 야생형 ED 서열 내에 적어도 하나의 추가 결합 영역을 포함하는, 표적 특이적 소포외 도메인(TED).
  29. 포유류 EV 표면 단백질 서열의 야생형 ED에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 포함하고, N-말단 및 C-말단에서 야생형 ED 서열의 영역이 측면에 있는 3-20개의 연속 아미노산 길이를 갖는 적어도 하나의 변형된 영역을 포함하며, 이 변형 영역이 야생형 ED에서 자연적으로 발생하지 않는 표적 결합 부위의 적어도 일부인 소포외 도메인(ED) 및 적어도 하나의 막관통 도메인을 포함하는 표적-특이적 EV 표면 단백질(TSP)로서, 변형 영역이 TSP로부터 단리될 때 더 낮은 표적 결합 친화성을 갖고/갖거나 표적 결합 부위가 적어도 2개의 아미노산에서 멀리 떨어진 추가의 변형 영역 내에, 또는 야생형 ED 서열 내에 적어도 하나의 추가 결합 영역을 포함하는, 표적 특이적 EV 표면 단백질(TSP).
  30. 제27항의 단백질, 제28항의 TED 또는 제29항의 TSP 중 어느 하나를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  31. 막 및 막의 외부 표면에 표적 특이적 분자의 디스플레이를 포함하는 표적 특이적 세포외 소포(TEV)로서, 표적 특이적 분자가 제27항의 단백질, 제28항의 TED 또는 제29항의 TSP 중 어느 하나인, 표적 특이적 세포외 소포(TEV).
  32. 제27항의 단백질, 제28항의 TED, 제29항의 TSP 또는 제25항, 제26항 또는 제31항 중 어느 한 항의 TEV 중 어느 하나, 및 약제학적으로 허용되는 담체를, 바람직하게는 피내, 피하, 정맥내, 국소 또는 경구 사용하기 위한 제형으로 포함하는 약제학적 제제.
  33. 각각 N-말단 및 C-말단에 동일한 야생형 소포외 도메인(ED)의 동일한 영역이 측면에 있는 상이한 변형 영역을 갖는, 제31항의 다양한 적어도 102개의 TEV를 포함하는 표적 특이적 세포외 소포(TEV) 라이브러리(library).
  34. 표적 특이적 세포외 소포(TEV)의 라이브러리를 생산하는 방법으로서,
    a) 각각 상이한 표적 결합 부위를 포함하는 다양한 표적 특이적 EV 표면 단백질(TSP)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 레퍼토리를 제공하는 단계;
    b) 상기 레퍼토리를 상기 공급원 세포(들)에 도입하는 단계; 및
    b) 상이한 표적 결합 특이성을 갖는 표적-특이적 세포외 소포(TEV)의 레퍼토리를 포함하는 분획을 단리하여 TEV의 라이브러리를 생산하는 단계를 포함하고,
    여기서, 폴리뉴클레오티드의 레퍼토리가 N-말단 및 C-말단에 야생형 ED 서열의 영역이 측면에 있는 3-20개의 연속 아미노산 길이를 갖는 적어도 하나의 변형된 영역 내에서 상기 EV 표면 단백질의 소포외 도메인(ED)의 돌연변이를 수득하기 위해 돌연변이 유발 방법에 의해 EV 표면 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 돌연변이 유발하여 표적 결합 부위를 ED 내에 통합시킴으로써 생산되는, 방법.
  35. 바람직하게는 상이한 표적 특이성을 갖는 적어도 102개의 TEV를 포함하는, 제34항의 방법으로 수득 가능한 TEV 라이브러리.
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