CN111647045B

CN111647045B - 一种cd133拮抗多肽及其衍生物与应用

Info

Publication number: CN111647045B
Application number: CN202010553817.7A
Authority: CN
Inventors: 黄来强; 代小勇; 木兰; 邓婷; 董璐; 王丽君
Original assignee: Shenzhen International Graduate School of Tsinghua University
Current assignee: Shenzhen International Graduate School of Tsinghua University
Priority date: 2020-06-17
Filing date: 2020-06-17
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2040-06-17
Also published as: CN111647045A

Abstract

本发明涉及一种CD133拮抗多肽及其衍生物与应用，具体公开了一种CD133拮抗多肽：所述CD133拮抗多肽HL12‑CP4的氨基酸残基序列如SEQ ID No:1所示，该结合肽及其衍生物在体外能结合CD133，通过与CD133的结合阻断其下游信号通路从而抑制结直肠癌细胞增殖，促进结直肠癌细胞发生凋亡，为结直肠癌等提供有效的治疗小分子药物，能够在医学与生物学领域得到广泛的应用。

Description

一种CD133拮抗多肽及其衍生物与应用

技术领域

本发明涉及生物技术和生物医药领域，具体而言，本发明是结直肠癌靶点CD133受体拮抗多肽HL12-CP4及其衍生物与应用。

背景技术

1.1.结直肠癌

结直肠癌(CRC)是世界上常见的恶性肿瘤之一。世界卫生组织国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer，IARC)报告指出，结直肠癌发病率位于肺癌、乳腺癌之后居恶性肿瘤第3位，死亡率位于肺癌、肝癌和胃癌之后，居恶性肿瘤第4位。结直肠癌发病地域分布在世界范围内有显著差异性，欧美区域发病率较亚洲地区更高。中国的CRC发生率为29人/10万人，死亡率为14人/10万人。但随着物质生活水平的不断提高，生活方式的改变，特别是饮食习惯的改变，我国结直肠癌的发病率呈现逐渐上升的趋势。相比之下，欧美国家因较早的开展结直肠癌筛查，近20年来结直肠癌的发病率和病死率却明显下降。与欧美国家人相比较，中国人结直肠癌呈现“三高一低”的特点：1、结肠癌的发病率稍低于直肠癌，但近几年结肠癌发病率呈上升趋势；2、低位直肠癌所占比例较高；3、青年人比例很高约占10％-15％；4、早期筛查就诊率低。

目前结直肠癌的病因尚未完全明确，但是伴随着医学及分子生物学的不断发展及研究的日益深入，逐渐的认识到结直肠癌的发生、发展是多基因共同作用、多个信号通路参与而引起的“炎症-增生-癌变”的演变过程。国内外研究发现，K-ras的基因突变、DNA分子的甲基化及胰岛素样生长因子是促进CRC发生发展的重要原因。随着对CRC病因的不断研究，与其发病的相关高危因素逐渐被认识，如长期高脂摄入、亚硝酸盐化合物食物摄入、维生素缺乏、长期酗酒等饮食因素；溃疡性结肠炎、结肠腺瘤、家族性腺瘤性息肉病(FAP)等被认为是癌前性病变的疾病；年龄增大(＞60岁)及家族遗传等因素都是CRC的高危因素。

目前结直肠癌患者的治疗手段主要是外科手术治疗，化学药物治疗，放射线放射治疗。其中外科手术目前是结直肠癌治疗最重要、最有效的手段，放疗与化疗已成为结直肠癌辅助治疗的重要组成部分。与此同时，靶向治疗、基因治疗、新辅助化疗、免疫治疗等治疗手段也越来越多的被应用。分子靶向药物治疗在特定患者中疗效显著，患者生存获益。但靶向药物的应用存在局限性，主要因为目前靶向药物的有效的靶点还较少，同时在选择适宜的靶向治疗药物前，需要对患者进行相应的分子靶点检测。目前针对CRC患者，主要的两种靶向药物是以血管内皮生长因子(VEGF)为靶点的贝伐珠单抗和以表皮生长因子受体(EGFR)为靶点的西妥昔单抗。国内学者研究提示，进展期及晚期结直肠癌患者使用西妥昔单抗和贝伐珠单抗生存获益。

1.2.CD133与结直肠癌干细胞

肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)是在肿瘤组织中存在一群具有自我更新且无限增殖，能够促进维持肿瘤生长的具有与正常组织干细胞相似功能的细胞，而且肿瘤干细胞具有多分化潜能，可以分化产生不同的组织细胞。其来源目前尚无定论，目前主要有两种观点；一种观点认为肿瘤干细胞来源于机体内原有的正常干细胞突变产生；另一种观点认为肿瘤干细胞是祖细胞基因突变突变而形成肿瘤干细胞。此外有部分学者提出肿瘤干细胞可能是骨髓来源的干细胞突变产生。目前研究已从结在卵巢癌、胰腺癌、脑肿瘤和直肠癌等肿瘤组织中分离出肿瘤干细胞。CD133又称Prominin-1，含5个跨膜区和2个胞外区的糖蛋白，是Prominin家族中的一员，最初作为造血干/祖细胞的标志物。2006年O，Brien等人首次从结直肠癌标本中分离出CD133+肿瘤细胞，并发现CD133+具有成瘤能力，而提出CD133可能为结直肠癌肿瘤干细胞。随后Cherciu等人研究提示CD44、CD133、0et4、ALDHl、CDl66、CD24等可能是结直肠癌肿瘤标干细胞标记物。伴随着对结直肠癌肿瘤干细胞标记物的研究报道增多，目前CD44/CD133是常用的结直肠癌肿瘤干细胞的标志物，并且CD44/CD133的高表达是影响患者预后的危险因素。

1.3.噬菌体展示技术

噬菌体展示技术(phage display techniques,PDT)是1985年由Smith等人提出的；1988年，噬菌体展示肽库首次构建成功；从1990年至今，噬菌体展示肽库得到快速发展和应用。噬菌体展示技术的原理是将外DNA通过基因工程技术克隆到适当的噬菌体载体上,使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性。然后利用靶分子，采用适当的淘洗方法洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为噬菌体基因组中的一部分可通过噬菌体DNA序列测序出来。该技术的显著特点是建立了基因型和表现型之间的对应关系。噬菌体展示技术适合用于全人源抗体药物的制备。治疗类风湿关节炎的抗肿瘤坏死因子α的Humira是第一个应用噬菌体抗体库技术生产的并被美国食品药品管理局批准的全人源抗体药物。到2014为止，被美国食品药品管理局批准的应用噬菌体抗体库技术生产的抗体有6个，且同时有30种以上的相关药物处于临床试验阶段。除筛选制备型抗体外，噬菌体抗体库技术也能被用于筛选相应抗原。因此，噬菌体展示技术抗体库因其具有的高库容、高效方便以及灵活筛选等优势，在生命科学的许多领域得到广泛应用，尤其在肿瘤诊断和肿瘤抗体药物制备等领域正越来越受到的重视，可以作为筛选非小细胞肺癌表面抗原靶向抗体的有利工具。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种CD133拮抗多肽，该拮抗多肽与受体CD133具有特异性高亲和力，能够通过与CD133的结合来阻断CD133的信号通路，证明该多肽在靶向抑制结直肠癌细胞增殖、促进结直肠癌细胞凋亡等方面起着重要的作用，其在结直肠癌靶向治疗方面具有巨大的应用价值。

本发明的另一目的在于提供上述CD133受体拮抗多肽的衍生物，该衍生物也能够与CD133受体具有特异性高亲和力，且特异性与CD133结合。

本发明的再一目的在于提供上述CD133拮抗多肽及其衍生物的应用。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

本发明一个方面提供了一种CD133拮抗多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，

Thr-Gln-Gln-Asp-Asp-Arg-Glu-Pro-Val-Asn-Phe-Arg(简写为：TQQDDREPVNFR)SEQ ID No：1。

上述CD133拮抗多肽的筛选方法，该方法利用噬菌体随机肽库，首先采用CD133质粒转染293T细胞，获得永久高表达CD133的稳定细胞系，以野生型293T细胞为对照吸附细胞，进行5轮全细胞消减筛选，随机挑取50个阳性噬菌体扩增，提取克隆单链DNA测序。分析多肽的氨基酸序列的基本特征，多肽同源性比较，检索出现频率高的多肽基序。

本发明另一个方面提供了一种CD133拮抗多肽的衍生物，所述的CD133拮抗多肽的衍生物为CD133拮抗多肽氨基酸侧链基团上、CD133拮抗多肽片段的氨基端或羧基端进行常规修饰得到的产物，或者为CD133拮抗多肽上连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物；所述的常规修饰优选为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰或固定化修饰等；所述的标签优选为His₆、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc或ProfinityeXact等；

所述的CD133拮抗多肽的衍生物优选为：上述CD133拮抗多肽末端进行酰胺化修饰。

所述的CD133拮抗多肽及其衍生物可以来源于哺乳类动物或者鸟类，例如灵长类动物(人类)；啮齿类动物，包括小鼠，大鼠，仓鼠，兔，马，牛，犬类，猫等。

亲水性分析表明，本发明的CD133拮抗多肽HL12-CP4为亲水性多肽。

所述的CD133拮抗多肽及其衍生物的获得，采用现有技术中的公知方法进行，既可以用多肽自动合成仪进行化学合成；通过将短肽序列推导出核苷酸序列，然后克隆到载体中进行生物合成；也可以从现有存在的生物体内进行大量提取和纯化。

本发明再一个方面提供了一种多聚核苷酸，其编码SEQ ID No.1所述多肽。

本发明再一个方面提供了一种载体，其包含了本发明所述的核苷酸，可以通过基因技术手段与启动子序列链接。

本发明再一个方面提供了一种宿主细胞，其转染了本发明所述的载体。

本发明再一个方面提供了一种药物，所述药物包含CD133拮抗多肽或其衍生物。

所述的药物可以含有一种或者是多种药学上可以接受的载体。

在本发明的技术方案中，所述药学上可以接受的载体优选为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂等；

在本发明的技术方案中，所述的药物可以进一步制成片剂、粒剂、胶囊、口服液或注射剂等多种形式，各种剂型的药物可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明再一个方面提供了一种检测试剂，所述检测试剂包含CD133拮抗多肽或其衍生物。

本发明再一个方面提供了前述CD133拮抗多肽或CD133拮抗多肽的衍生物的抗体。

本发明再一个方面提供了本发明所述的CD133拮抗多肽、CD133拮抗多肽的衍生物在制备抑制高表达CD133的肿瘤细胞增殖的药物中的用途。

本发明再一个方面提供了本发明所述的CD133拮抗多肽、CD133拮抗多肽的衍生物在制备促进高表达CD133的肿瘤细胞凋亡药物中的用途。

在本发明的技术方案中，高表达CD133的肿瘤细胞选自直肠癌细胞、结肠癌细胞、胆管癌细胞、胶质瘤细胞、子宫内膜癌细胞、肺癌细胞、胃腺癌细胞。

本发明再一个方面提供了本发明所述的CD133拮抗多肽、CD133拮抗多肽的衍生物在制备治疗高表达CD133的肿瘤疾病的药物中的用途。

在本发明的技术方案中，高表达CD133的肿瘤疾病选自直肠癌、结肠癌、胆管癌、胶质瘤、子宫内膜癌、肺癌、胃腺癌。

在本发明的具体实验中，利用CD133拮抗多肽HL12-CP4可以特异性的与高表达CD133的细胞293T CD133^+/+结合。

在进一步试验中，发明人利用高表达CD133的结直肠癌细胞HCT-116作为细胞模型验证了CD133拮抗多肽HL12-CP4的功能，与对照组相比，发现HL12-CP4可以显著抑制结直肠癌细胞HCT-116的增殖。

在本发明的另一具体实验中，发明人采用流式细胞技术检测发现CD133拮抗多肽HL12-CP4促进HCT-116发生凋亡。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:

(1)本发明提供了一种CD133拮抗多肽HL12-CP4及其衍生物，所述的拮抗多肽及其衍生物能够专一性与CD133结合，并特异性与CD133结合抑制CD133信号通路。

(2)本发明筛选得到的CD133拮抗多肽及其衍生物可以通过阻断CD133的信号通路抑制结直肠癌细胞增殖，促进结直肠癌细胞发生凋亡，可以作为CD133结合位点的生物类多肽药物，可用于制备预防和/或治疗结直肠癌药物。能够在医学与生物学领域得到广泛的应用，并产生巨大的社会与经济效益。

附图说明

图1：CD133以及HL12-CP4多肽疏水轮廓比较分析。其中：A：CD133疏水轮廓图；B：HL12-CP4多肽疏水轮廓图；C：CD133以及HL12-CP4多肽疏水轮廓比较图。CD133轮廓为红色，HL12-CP4轮廓为蓝色(已用箭头标出)；

图2：HL12-CP4噬菌体与CD133结合能力；

图3：HL12-CP4抑制结直肠癌细胞HCT-116的增殖作用；

图4：HL12-CP4促进HCT-116发生凋亡。A：流式细胞仪检测对照组细胞凋亡；B：流式细胞仪检测HL12-CP4给药组细胞凋亡；C：细胞凋亡数据统计。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

实施例1：进行CD133拮抗多肽HL12-CP4的淘选、扩增、纯化、测序及合成。

本实施例主要是为了筛选获得与CD133特异性结合的阳性噬菌体，再通过将阳性噬菌体扩增、纯化，提取噬菌体单链DNA(ssDNA)进行测序，将所获得的序列分析对比，最后合成高纯度的拮抗多肽HL12-CP4。

具体如下：

1.建立永久高表达CD133的293T细胞系：293T-CD133^+/+

①选取生长旺盛的可发光的人293T细胞，在转染前一天以5×10⁵个/孔，接种于6孔板中，培养至第二日后，细胞融合度为60％；

②第二日进行转染，以6孔板的一个培养孔为单位，用200μL的opti-MEM培养基稀释3μg质粒，另以200μL的opti-MEM培养基稀释6μL脂质体Lipofectamine2000，分别轻轻混匀后，室温放置5分钟；

③将两管稀释液轻轻混合，室温静置20分钟后，向混合后的稀释液中轻轻加入600μL的opti-MEM培养基；

④将待转染的细胞用PBS轻轻漂洗一次，然后将混合好的稀释液轻轻加入培养孔中，置于二氧化碳培养箱中培养；

⑤培养4～6小时后弃尽转染所用培养基，向孔中加入3mL完全培养基；

⑥48小时后选用含有1μg/mL嘌呤霉素(puromycin)的培养基进行筛选；待细胞不再出现死亡后即得到稳定表达CD133的293T细胞系。

⑦用TRIzol提取总RNA，定量2μg RNA进行逆转录(逆转录试剂盒，购于Promega公司)，并用特异引物序列进行qPCR。

所用特异引物序列为Hu-CD133引物序列：

Fw 5’-GAGCTAAGGGAAGGGCGG-3’SEQ ID No:2

Rv 5’-ATAAACAGCAGCCCCAGGAC-3’SEQ ID No:3

⑧与转染了pSM2c-Hu-scramble RNA的做比较，检测CD133的高表达水平，并命名为：293T-CD133^+/+，即可以用于阳性噬菌体筛选。

2.进行CD133拮抗多肽的淘选、扩增、纯化、测序及合成

①ER2738宿主菌液的制备：无菌技术操作，先取200μL LB-Tet液体培养基于1.5mL灭菌离心管中，再从E.coli ER2738的甘油冻存物中取0.2μL菌液与之充分混匀，全部吸取涂布于LB-Tet平板上，标记平板，室温放置3min，然后置于37℃恒温培养箱倒置过夜培养。次日观察，长出克隆后用封口膜封口，4℃避光保存备用。用灭菌枪头以无菌技术挑取单菌落，放入已预先加有3mL LB-Tet液体培养基的10mL灭菌离心管中，标记后于恒温摇床37℃，300rpm/min振荡培养过夜。次日，细菌扩增液于4℃储存备用。取10mL灭菌离心管，无菌操作加入3mL LB-Tet液体培养基，取30μL过夜培养的细菌接种其中，恒温摇床37℃，300rpm/min振荡培养2～3h，细菌处于指数生长期，肉眼观察呈雾状(OD₆₀₀～0.5)。

②CD133拮抗肽的淘选：将高表达CD133细胞按10⁵个/培养皿接种于预先包被多聚赖氨酸的60×15mm²培养皿中，常规培养至细胞密度80％～90％时，用于淘洗(同时用不表达CD133的细胞系作为空白对照)每轮洗脱液先取1μL测滴度，剩下的将其加入到20mL LB培养液中扩增，再纯化、最后再测扩增后的滴度，扩增物于4℃短期保存，并取相等数量级用于下一轮淘选，剩下的扩增物用50％的甘油于-20℃保存。

③测定噬菌体的滴度:取4支灭菌的10mL离心管，每个噬菌体稀释度准备1个灭菌离心管，微波炉熔化顶层琼脂(Agarose Top)，每管加入3mL顶层琼脂，45℃水浴备用。每个噬菌体稀释度准备1块LB/IPTG/Xgal平板，37℃恒温培养箱预热备用。将OD₆₀₀～0.5的E.coli ER2738大肠杆菌按照噬菌体稀释度200μL/管分装，4℃保存备用。取4支灭菌的1.5mL离心管，分别盛有100μL、90μL、90μL、90μL LB-Tet培养基，将待测噬菌体吸取1μL入100μL LB-Tet培养基中，按10倍梯度稀释，分别标记为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4，每个稀释度轻轻振荡混匀，瞬间离心。取10μL待滴定的各稀释度的噬菌体与200μL E.coli ER2738混合，轻轻振荡混匀，瞬间离心，室温孵育5min。将混合菌液迅速加入顶层琼脂中，快速振荡混匀，立即倒入预热的LB/IPTG/Xgal平板，将其均匀展平，室温冷却5min，37℃恒温培养箱中，倒置平板培养过夜。

④洗脱噬菌体的扩增及纯化：取250mL的锥形瓶，按1:100比例，将过夜培养的ER2738宿主菌液加入至20mL LB液体培养基中，37℃，250rpm剧烈振荡培养2h；然后将待扩增的噬菌体液加入到锥形瓶中，37℃，250rpm剧烈振荡培养4.5h；将培养物转入50mL离心管中，4℃10000rpm离心10min。上清液转入另一干净离心管中，4℃10000rpm再次离心10min；取上清的80％转入另一干净离心管中，加入1/4体积的PEG/NaCl，颠倒混匀后于4℃沉淀过夜；第二天，将沉淀于4℃,12000rpm离心20min。用干净枪头小心吸取上清液，再4℃12000rpm离心1min，去掉残留上清液；然后用1mL TBS重悬沉淀物，轻轻吹打100次。然后将悬液转入2mL离心管中，4℃10000rpm离心5min除去残余细胞；将上清加入1/4体积的PEG/NaCl后，于冰上孵育60min再次沉淀；取出离心管，4℃12000rpm离心20min，去掉上清；用200μL TBS重悬沉淀，4℃10000rpm离心1min。上清转入另一离心管中。4℃短期保存，也可以用50％的甘油于-20℃长期保存。单克隆噬菌体的扩增，包括⑴按1:100比例，将过夜培养的ER2738宿主菌液加入至2mL LB液体培养基中，37℃，250rpm剧烈振荡培养2h；用灭菌牙签，从第四轮滴度平板中选取少于100个噬菌斑的平板，挑取分隔良好的蓝色噬菌斑，加入到培养管中，37℃250r/min剧烈震荡培养4.5h；然后将培养物转入到新鲜离心管中，4℃10000rpm离心30sec。上清转入以新鲜管中，再同样离心一次；将上清的80％转入新鲜离心管中，4℃贮存，也可以用50％的甘油于-20℃长期保存。

⑤琼脂糖凝胶电泳鉴定M13噬菌体ssDNA：将凝胶成形模具水平放置，将选好的梳子放好，梳子底部与模具之间留1mm空间；称取DNA电泳用琼脂糖1g放入250mL的三角烧瓶中，加入100mL 1×TAE缓冲液，混匀后，将烧瓶置于微波炉中，加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解；关闭电磁炉，取出三角烧瓶，将其置室温下冷却至室温(手握烧瓶可以耐受)，再加入溴化乙锭5μL，混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。本实验所用制胶板约需胶液100mL；室温下待凝胶完全凝固，需时约30分钟，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中；在电泳槽加入1×TAE缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜；将样品用Loading buffer稀释以后加入胶板中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外；接通电源，调节电压至50伏，电泳90min后，将凝胶板取出，在紫外灯下观察结果。

⑥ssDNA测序及序列分析：将提取的M13噬菌体ssDNA送到上海英潍捷基生物技术有限公司进行DNA测序。测序以后用Bioedit软件进行序列分析。通过分析结果可知，样品序列为Thr-Gln-Gln-Asp-Asp-Arg-Glu-Pro-Val-Asn-Phe-Arg，以HL12-CP4表示，最后短肽由合肥国肽生物科技有限公司。

图1的疏水性轮廓分析，证明HL12-CP4多肽与CD133存在有效结合的可能。

实施例2 酶联免疫吸附法检测噬菌体单克隆与CD133的结合

首先挑取HL12-CP4噬菌体单克隆，接种于含有ER2738的LB培养基中，37℃，230rpm震荡培养7个小时。5000rpm,常温离心15min，搜集上清4℃保存。293T野生型细胞、293TCD133^+/+细胞、HCT-116细胞以及HT-29细胞按每孔5×10³个接种于96孔板中培养24小时。次日，弃掉细胞培养基，每孔加入封闭液(DMEM+5％BSA)封闭2小时。弃掉封闭液后，每孔加入100μL噬菌体稀释液(1:100)作用2小时。然后用PBST(PBS+0.1％Tween-20)洗3次，每次5min以去掉未结合的噬菌体。每孔加入100μL稀释(1:5000)后的过氧物酶链接的抗M13噬菌体抗体(购买于GE公司)，室温作用1小时。PBST(PBS+0.1％Tween-20)洗3次，每次5min以去掉未结合的抗体。每孔加入50μL TMB底物(Sigma)，室温避光作用30分钟，每孔加入50μL浓H₂SO₄终止反应，并使用酶标仪在450nm处读数。结果发现，与不表达CD133的293T野生型细胞相比，HL12-CP4噬菌体于高表达CD133的293T CD133^+/+细胞、HCT-116细胞以及HT-29细胞具有较高的结合能力，差异具有显著性(^***P＜0.001)，结果见图2。

实施例3 HL12-CP4可以显著抑制结直肠癌细胞HCT-116的增殖

①将结直肠癌细胞HCT-116以5ⅹ10³个/孔接种于96孔细胞培养板中，每孔培养基体积为200μL，培养24h，然后饥饿过夜；

②加入不同浓度梯度(100μM，10μM，1μM，0.1μM，0.01μM，0.001μM)的HL12-CP4多肽分别培养24小时、48小时、72小时；

③每孔加入20μL的MTT工作溶液，继续放入二氧化碳培养箱中培养4小时；

④弃培养板中的上清，加入150μL DMSO(二甲基亚砜)，震荡10分钟，在酶标仪上选择490nm波长进行检测，绘制细胞的生长曲线。

发明人实验室在前期工作中，通过q-PCR试验检测发现结直肠癌细胞HCT-116高表达CD133。图3显示，不同浓度的HL12-CP4短肽可以显著抑制结直肠癌细胞HCT-116细胞增殖，并且随着作用时间的增加，短肽抑制结直肠癌细胞HCT-116细胞增殖的作用也更为显著。

实施例4 HL12-CP4可以促进结直肠癌细胞HCT-116的凋亡

①将结直肠癌细胞HCT-116以5×10⁵个/孔接种于6孔细胞培养板中，每孔培养基体积为1mL，培养24h，然后饥饿过夜；

②加入不同浓度梯度(1μM，0.1μM，0.01μM)的HL12-CP4多肽分别培养24小时、48小时、72小时；

③先将上清收集到离心管中，再用不含EDTA的胰酶小心消化收集细胞培养液到离心管。500g左右离心5分钟，沉淀细胞；

④用预冷的PBS洗涤细胞两次，500g左右离心5分钟收集细胞；

⑤加入100μL预冷的1×AnnexinV Binding Buffer，重悬细胞；

⑥加入5μL AnnexinV-FITC和5μL PI，轻轻混匀，室温避光反应15分钟；

⑦加入400μL预冷的1×AnnexinV Binding Buffer，轻轻混匀，将样品至于冰上避光放置，1h内用流式细胞仪检测。分析检测结果。

图4显示，通过流式细胞仪分析发现，随着作用浓度的升高，HL12-CP4短肽可以明显促进结直肠癌细胞HCT-116发生凋亡。与对照组相比较有显著性差异，^**P<0.01。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学深圳国际研究生院

<120> 一种CD133拮抗多肽及其衍生物与应用

<130> CP120010402C

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> HL12-CP4

<400> 1

Thr Gln Gln Asp Asp Arg Glu Pro Val Asn Phe Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Hu-CD133引物序列

<400> 2

gagctaaggg aagggcgg 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Hu-CD133引物序列

<400> 3

ataaacagca gccccaggac 20

Claims

1.一种CD133拮抗多肽，其特征在于：所述CD133拮抗多肽的氨基酸残基序列如SEQ IDNo:1所示。

2.一种权利要求1所述的CD133拮抗多肽的衍生物，其特征在于：

所述的CD133拮抗多肽的衍生物为权利要求1所述的CD133拮抗多肽氨基酸侧链基团上或权利要求1所述的CD133拮抗多肽片段的氨基端或羧基端进行常规修饰得到的产物，或者为权利要求1所述的CD133拮抗多肽上连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物；

所述的常规修饰为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰或固定化修饰；

所述的标签为His₆、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc或ProfinityeXact。

3.一种多聚核苷酸，其编码权利要求1所述的CD133拮抗多肽或权利要求2所述的衍生物。

4.一种载体，其包含了权利要求3所述的多聚核苷酸。

5.一种宿主细胞，其转染了权利要求4所述的载体。

6.一种药物，所述药物包含权利要求1所述的CD133拮抗多肽或权利要求2所述的衍生物。

7.根据权利要求6所述的药物，所述药物含有一种或者是多种药学上可以接受的载体。

8.根据权利要求7所述的药物，所述药学上可以接受的载体为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。

9.一种检测试剂，所述检测试剂中包含权利要求1所述的CD133拮抗多肽或权利要求2所述的衍生物。

10.权利要求1所述的CD133拮抗多肽、权利要求2所述的CD133拮抗多肽的衍生物在制备抑制高表达CD133的肿瘤细胞增殖或促进高表达CD133的肿瘤细胞凋亡的药物中的用途；

高表达CD133的肿瘤细胞选自直肠癌细胞。

11.权利要求1所述的CD133拮抗多肽、权利要求2所述的CD133拮抗多肽的衍生物在制备治疗高表达CD133的肿瘤疾病的药物中的用途；

高表达CD133的肿瘤疾病选自直肠癌。