CN101391115B - 一种生物活性蛋白或多肽涂层生物支架的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物活性蛋白或多肽涂层生物支架的制备方法，其采用阳极极化的方法，以支架本体为阳极，将其与阴极一起插入生物活性蛋白或多肽溶液中，在电源电场力的作用下，生物活性蛋白或多肽电离而带负电，向支架阳极移动，均匀地涂覆在支架的表面。本发明所提供的制备方法，无需额外制备载药涂层，无明显界面，能够在支架本体全部或者部分表面通过阳极极化作用均匀包被一层生物活性蛋白或多肽，生物活性蛋白或多肽包被量稳定性好，不易洗脱，并且使用安全，适于工业上大规模的生产，操作简单，成本低。

Description

一种生物活性蛋白或多肽涂层生物支架的制备方法

技术领域

本发明属于生物支架制备领域，具体地说，涉及一种生物活性蛋白或多肽涂层生物支架的制备方法。

背景技术

由于动脉粥样硬化引起血管管腔狭窄，从而造成肌肉供血供氧障碍而引起相应部位的肌肉缺血坏死。半个世纪以来，冠心病等动脉血管疾病已成为严重威胁人类健康的疾病之一。

1976年德国学者安德里亚·格隆茨戈首次提出了动脉血管内安装支架的设想，到90年代冠状动脉支架已广泛地应用于临床治疗。血管支架是为防止心血管及外周血管阻塞病变进行介入治疗的主要手段，其特点是能通过细小管道进入预定的部位，释放后能膨胀至设定的直径大小，对管腔起到支撑作用，使管腔保持通畅。血管支架按照表面状态可分为裸支架、药物洗脱支架、聚合物包被支架、金属涂层支架、放射性支架和人造血管覆盖支架，最先使用的支架基本为裸支架。由于支架相对血管或其它肌体管道来说是一种异源性物质，安放后刺激血管内膜引起反应性增生，使血管发生再狭窄。再狭窄的发生率高达30％-35％，尤其是病变较长的血管和直径较小的血管。为解决再狭窄的问题，人们随后开发出放射性支架和药物洗脱支架，其中药物洗脱支架已被公认为在冠心病的介入治疗中，是能够解决冠脉血管内再狭窄问题的最有效的方法。

现有的药物洗脱支架多采用聚合物作为载体来携带药物并控制其释放，典型的作法是：将活性药物和聚合物混合涂覆在裸支架部分或全部表面上，聚合物一般最少要占涂层质量的70％以上才能起到载体的作用，支架本体上涂覆一层包含活性药物的聚合物涂层，聚合物涂层上又涂覆一层多聚物涂层。这种含有聚合物涂层的药物支架在临床应用中可以将再狭窄发生率降低到10％以下，但是，这种支架在植入人体后，由于药物的不断减少而聚合物浓度相应的不断增高，可能导致血栓的形成。

理想的可植入的支架不但应具有良好的生物相容性，而且能促进受伤组织愈合，防止细胞过度增生，加速管腔组织内皮化，防止血栓形成和再狭窄。因此能够促进内皮修复和抑制内膜增殖的不同阶段信号因子成为目前研究的热点之一，包括血管内皮细胞生长因子(VEGF)、一氧化氮合酶(iNOS，eNOS)、雌激素、17β雌二醇等。这些支架在动物实验阶段大部分都表现了较好的抑制再狭窄和促进内皮修复的结果。其中较为理想的设计理念为内皮祖细胞捕获支架，这种支架通过动员外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)到血管局部加速支架表面内皮的快速修复，抵抗再狭窄发生的同时降低支架血栓的发生。根据这一理念，奥勃斯医学技术股份有限公司(Orbusneich)设计的Genous支架将内皮祖细胞特异性CD34抗体共价固定在R支架的表面，通过抗原抗体特异结合的理论捕获血液循环中的内皮祖细胞以加速内皮愈合以及控制中膜和外膜的增殖。阿昔单抗具有抗血小板活性、抑制中心粒细胞和单核细胞引起的炎症，并具有αvβ3抗体活性，能够特异捕获内皮祖细胞(EPC)等特性，Humed公司利用阿昔单抗这些生物特性，将其涂覆在支架表面加速支架表面内皮化的同时具有抗炎和抗血栓活性。还有RGD环肽支架，通过设计出对αvβ3整合素受体更高亲和力的RGD环肽，特异捕获内皮祖细胞加速支架表面内皮修复。但是这些支架在临床实验阶段并没有如动物实验显示的良好结果，可能是因为他们为了固定或者涂覆这些生物抗体均在支架本体设置了一层基质层，而这一层基质诱发的炎症和过敏反应很可能是导致临床实验结果失败的原因。

Orbusneich公司申请的中国专利01806680.1提供了一种包涂了基质和与内皮细胞抗原反应的抗体的医疗器械组合物和其制造方法。该专利首先在医疗器械表面涂覆一层由合成材料如聚尿烷、聚L-乳酸等，或天然材料如胶原蛋白、血纤蛋白等，或长约C60-C100的呋仑碳组成的基质，然后通过基质连接物分子将治疗有效量的与内皮细胞抗原反应的抗体共价固定在医疗器械表面，从而促使内皮细胞在所述医疗器械上分化和增殖，所述抗体限定为单克隆抗体。

中国专利申请03803370.4提供了一种医疗装置的各种组成部分和其制作方法。此类医疗装置都用含有抗体、具有刺激内皮生成作用的化合物和小分子物质的生物相容的基质进行包衣。特征在于至少包括一层包衣层，至少一种具有治疗有效量的抗体、抗体片段或其组合，以及至少一种化合物，能够促进在该装置表面的始祖代内皮细胞加速黏附、生长和分化过程，而成为成熟的和功能性内皮细胞，以防止内膜增殖。

中国专利申请200580004068.6阐述一种用于植入到体内血管和管腔结构中的医疗装置，其包括与血液接触的表面和用于将一种或多种药物有控制地释放到毗邻组织中的涂层，所述涂层包含生物可吸收性或不可吸收性的生物相容性基质、一种或多种药物、一种或多种配体，所述配体结合于该医学装置与血液接触表面上的内皮祖细胞膜上的特异性分子。

以上器械或装置的特点是均在装置本体表面涂布了一层基质，利用基质的连接作用把生物抗体或药物涂覆和/或固定在本体上。但本申请发明经研究发现，如果能够直接在装置本体上涂覆和/或固定生物活性成分，避免在本体和生物抗体之间设置一层基质，不仅能够充分利用生物活性成分在生理环境下发挥促进内皮修复和抑制平滑肌增殖的优势，同时也能避免基质带来的炎症及副作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物活性蛋白或多肽涂层生物支架的制备方法，该方法无需涂覆基质，就能充分发挥所涂覆生物活性物质的促进内皮修复和抑制平滑肌增殖的作用。

本发明所提供的生物活性蛋白或多肽涂层生物支架的制备方法，其采用阳极极化的方法，以支架本体为阳极，将其与阴极一起插入生物活性蛋白或多肽溶液中，在电源电场力的作用下，生物活性蛋白或多肽电离而带负电，向支架阳极移动，均匀地涂覆在支架的表面。

上述采用阳极极化的方法涂覆生物支架，包括如下步骤：

1、支架本体的预处理：用四氢呋喃、丙酮、乙醇或甲醇超声清洗，然后再用去离子水进行清洗；

2、生物活性蛋白或多肽涂覆液的配制：以蒸馏水、生理盐水、硼酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液、浓度为1％-20％的乙醇溶液或磷酸盐缓冲溶液为溶剂，加入浓度为0.001mg/ml-1mg/ml的生物活性蛋白或多肽溶液；

3、涂覆液的涂覆：采用阳极极化包被的方式涂覆生物支架，以支架本体为阳极，在直流电源下，控制电压在0.1V以上，生物活性蛋白或多肽电离带负电，向阳极移动，均匀牢固地涂覆在支架本体表面，涂覆时间为1-100min，涂覆量为支架重量的1/10²-1/10⁶。

阳极极化的原理：电化学中的极化现象是指极化作用一经开始，在阳极，电子流走了，溶液中的阴离子向阳极移动；在阴极，电子流入快，溶液中的阳离子向阴极移动。当把支架作为阳极，溶液中采用蛋白或多肽溶液时，该蛋白或多肽电离变为阴离子，通电后蛋白或多肽向阳极支架处移动，在阴阳相吸作用下，克服支架表面的液面张力，使蛋白或多肽与支架表面牢固均匀的结合，与电镀的原理基本相同。

所述支架本体可先经过表面清洗和防腐处理后，进行阳极极化的涂覆处理；所述涂覆后的生物支架自然晾干，经预冷冻后，放入真空冷冻干燥机干燥。

其中，支架本体的表面清洗过程为：

1、用砂带打磨支架本体表面，用于去除表面的氧化物，调整表面粗糙度；

2、利用超声波，依次用75％的医用乙醇溶液、99.5％的丙酮溶液、去离子水清洗，超声波频率为28-100KHz，清洗时间为5-15min；

3、将支架本体放入15-60g/L、70-100℃的氢氧化钠溶液中浸泡5-10min，用于去除油脂和氧化皮；

4、将清洗后的支架本体放置在真空干燥机中，温度设定在30-40℃，干燥30-60min后取出。

支架本体的防腐处理采用化学氧化处理或阳极氧化处理的方法进行。

化学氧化处理的过程为：将支架本体浸入含重铬酸钾15-20g/L、硝酸15-25g/L、氯化钠0.75-1.25g/L的混合溶液中，在70-80℃下，氧化0.5-2.0min，在支架本体表面生成氧化膜。

阳极氧化处理的过程为：采用交流电氧化，在两电极上分别安装完全相同的支架本体，阳极氧化处理用槽液为高锰酸钾15-20g/L、磷酸三钠15-55g/L、氟化钾25-55g/L、氢氧化钾65-165g/L、氢氧化铝15-65g/L的混合液，在20-60℃下，电流密度为0.1-10A/dm2，交流电压为50-90V下，氧化10-50min，支架本体表面生成氧化膜。

除上方法外，还可采用离子注入、激光表面处理、热扩散、金属镀层、气相沉积、有机涂层等方式中的一种或多种对支架本体表面进行防腐处理。

本发明的生物活性蛋白或多肽涂层生物支架的制备方法中，所述的支架本体的材质为不锈钢、钴铬合金、镁合金、Ni-Ti合金或其它医用金属材料。

所述的支架本体为冠脉血管支架、颈动脉血管支架、外周血管支架、肾动脉血管支架、颅内动脉血管支架、移植片固定膜、移植片固定膜移植物、合成的人造血管、心脏瓣膜、血管修补筛、起搏器、起搏器导子、除纤颤器、PFO隔膜封闭装置、血管夹、动脉血管瘤闭锁器、血液透析移植物、血液透析导管、房室吻合分流、大动脉血管瘤移植物装置、静脉瓣、血管接合夹、留置式动脉导管或血管护鞘或药物输送口等。

所述生物活性成分为阿昔单抗(抗血小板凝聚单克隆抗体)、一氧化氮合酶(NOS)、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)多肽、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子3(FGF-3)、成纤维细胞生长因子4(FGF-4)、成纤维细胞生长因子5(FGF-5)、成纤维细胞生长因子6(FGF-6)、成纤维细胞生长因子7(FGF-7)、成纤维细胞生长因子8(FGF-8)、成纤维细胞生长因子9(FGF-9)、碱性成纤维细胞生长因子、血小板诱导性因子、转化生长因子β1、酸性成纤维细胞生长因子、骨粘连蛋白、促血管生成素1、促血管生成素2、胰岛素样生长因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、血小板衍生生长因子AA、血小板衍生生长因子BB、血小板衍生生长因子AB、内皮细胞PAS蛋白1、血小板反应蛋白、增殖蛋白、肝配蛋白-Al、E-选择蛋白、肥胖蛋白、白介素8、甲状腺素以及神经鞘氨醇1-磷酸酯、角蛋白8(Keratin8)、尿激酶前体(Pro-UK)、反义寡核核苷酸、抗CD2白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD3白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD4白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD8白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD3R白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD1a白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD1b白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD5白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD6白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD7白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD9白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD10白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD11a白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD18白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD19白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD20白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD21白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD22白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD23白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD24白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD37白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD33白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD34白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD35白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD64白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD65白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CDw65白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD66b白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD66e白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD31白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD133白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD89白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CDw90白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD56白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD57白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD94白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD40白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD72白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD77白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD16白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD32白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD63白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD36白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD41白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD42a白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD42b白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD11b白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD11c白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD29白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD44白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD48白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD49a白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD49b白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD49c白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD49e白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD49f白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD50白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD51白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD54白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD58白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD61白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD62E白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD62L白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD62p白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD103白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD105白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD26白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD71白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD95白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD122白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CDw124白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD126白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD127白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD117白细胞分化抗原抗体及其片段、抗血管内皮生长因子1(VEGF-1)抗体及其片段、抗血管内皮生长因子2(VEGF-2)抗体及其片段、抗CD146(Muc-18)抗体及其片段、抗干细胞抗原(Sca-1)抗体及其片段、抗干细胞因子1(SCF/c-Kti配体)抗体及其片段、抗酪氨酸激酶Tie-2抗体及其片段和抗HAD-DR细胞表面抗原抗体及其抗体片段中的一种或多种。

此外，在支架本体表面涂覆抗体前，可先涂覆治疗性药物，涂覆的治疗性药物与抗体的比例为10:1-100:1。其中，所述治疗性药物为肝素、阿司匹林、水蛭素、秋水仙碱、抗血小板GPIIb/IIIa受体拮抗剂、白甲氨蝶呤、嘌呤类、嘧啶类、植物碱类和埃坡破霉素(Epothilone)类、雷公藤系列化合物、抗生素、激素、抗体治癌药物、环孢霉素、他克莫司及同系物(FK506)、脱精胍菌素(15-deoxyspergualin)、霉酚酸脂(MMF)、雷帕霉素(Rapamycin)及其衍生物、FR 900520、FR 900523、NK 86-1086、戊酰胺(depsidomycin)、康乐霉素C(kanglemycin C)、斯博格埃林(spergualin)、灵菌红素25c(prodigiosin25-c)、曲尼斯特(tranilast)、多球壳菌素(myriocin)、FR 651814、SDZ214-104、环孢霉素C、布雷青霉素(bredinin)、麦考酚酸、布雷菲得菌素A、WS9482、糖皮质类固醇、替罗非班(tirofiban)、埃替非巴肽(eptifibatide)、紫杉醇、放线菌素-D等中的一种或多种。

上述治疗性药物溶液的涂覆处理，其过程为：以甲醇作溶剂，加入浓度为1-15μg/ml的上述治疗性药物的溶液对支架本体表面进行定向超声喷涂，匀速旋转支架本体，根据支架本体表面药物含量要求喷涂1-15次；

上述治疗性药物的涂覆处理，其过程也可为：以四氢呋喃作有机溶剂，加入浓度为1-15μg/ml的药物，将支架本体浸泡在上述溶液中5-10分钟，重复浸涂4次。

上述支架本体的表面还可制成有直径100-800nm的孔洞。

本发明所提的生物活性涂层支架的制备方法，其具有如下有益效果：

1.在支架本体原材料的表面，即直接与人体病变组织接触的表面上制备有孔洞或者没有孔洞分布。无需额外制备载药涂层，无明显界面，能够在支架本体全部或者部分表面通过静电作用均匀包被一层抗体；

2.支架本体全部或者部分表面包被抗体后，支架本体上抗体包被量稳定性较好，经过直接或者超声清洗生物支架，生物支架上抗体量均没有损失，这预示着该抗体支架能够耐受更长时间的血液冲刷，抗体主要是通过阳极吸附作用或者特殊的孔洞结构结合到支架本体表面；

3.使用安全，满足临床需要。抗体包被所使用的药品器材都是比较安全的医用级药品和器材，本身产品就比较安全，所使用的抗体为治疗性抗体，能够直接作用于人体；

4.工业实用性强。该种抗体包被方式能够进行大规模的工业化生产，且操作简单，成本较低。

附图说明

图1为本发明支架本体的扫描电镜图。

图2为本发明表面带有纳米孔的支架本体表面的扫描电镜图。

图3为本发明表面带有纳米孔的支架本体上的抗体分布扫描电镜图。

图4为阳极极化涂覆过程示意图；

图中：1、操控电脑2、阳极极化仪3、储液容器4、电极。

图5为实施例1的单克隆抗体CD34涂层生物支架吸附抗原细胞KG-1a后在荧光显微镜下的图片。

图6为直接采用碳酸钠缓冲液涂覆的单克隆抗体CD34涂层生物支架吸附抗原细胞KG-1a后在荧光显微镜下的图片。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

图1所示的支架本体是医用316L不锈钢，也可以为钴络合金、镁合金、Ni-Ti合金或其它医用金属材料。通过激光雕刻或机械加工而成的，除可制成血管支架外，还可制成骨缝合线、骨钉、骨连接件，脊椎骨盘、缝合用锚、止血钳、止血螺丝、止血板、止血夹，以及组织粘合剂、密封剂、人造骨等医疗设备。

图2所示的表面带有纳米孔的支架本体是医用316L不锈钢合金，也可以为钴络合金、镁合金、Ni-Ti合金或其它医用金属材料。经抛光后，用激光雕刻成血管支架；支架表面通过化学或物理方法，如腐蚀、阳极氧化、微弧氧化、微弧氮化等方法或这些方法的结合，在器械本体原材料的局部表面直接制备形成孔洞，孔洞可以是载药槽或孔结构，孔洞的直径为100-800nm。

实施例1  单克隆抗体CD34涂层生物支架的制备

选用316L不锈钢合金或者钴络合金材质经抛光后，用激光雕刻成血管支架，按照如下步骤制得单克隆抗体CD34涂层生物支架：

1、支架本体表面的清洗：

(1)砂带打磨支架本体表面，机械去除表面的氧化物，调整表面粗糙度；

(2)利用超声波，依次用75％的医用乙醇溶液、99.5％的丙酮溶液、去离子水清洗，超声波频率为100KHz，清洗时间为10min；

(3)将支架本体放入30g/L、80℃的氢氧化钠溶液中浸泡10min，去除油脂和氧化皮；

(4)将清洗后的支架本体放置在真空干燥机中，温度设定在40℃，干燥45min后取出。

2、支架本体表面的防腐处理：采用交流电氧化，在两电极上安装完全相同的图1所示的支架或者图2所示的支架，阳极氧化处理用槽液成份为：高锰酸钾18g/L、磷酸三钠55g/L、氟化钾40g/L、氢氧化钾165g/L、氢氧化铝65g/L；在60℃，氧化50min，电流密度为10A/dm²，交流电压为90V，支架本体表面即可生成氧化膜。

3、支架本体表面单克隆抗体CD34溶液的涂覆处理：

(1)支架本体的预处理：用四氢呋喃超声清洗，超声波频率为100KHz，清洗时间为10min；使用去离子水清洗三次；

(2)抗体涂覆液的配制：以浓度为0.05mol/l、pH值为9.6的碳酸盐缓冲溶液为溶剂，加入浓度为0.1mg/ml单克隆抗体(CD34)溶液；

(3)阳极极化涂覆：如图4所示，将支架本体串联到阳极极化仪的阳极[4]上，将配制好的抗体溶液注入阳极极化的抗体储存容器[3]中，调节阳极电压为2.5v，进行极化，极化时间为30min，通电后抗体离子向阳极支架处移动，在阴阳相吸作用下，克服支架表面的液面张力，使单克隆抗体与支架表面牢固均匀的结合。并在支架表面形成一层均匀的抗体涂层，抗体的量为支架重量的1/10³；

(4)、生物支架干燥：将支架自然稍晾干后，冰箱中预冷冻后放入真空冷冻干燥机中干燥4h。

实施例2  具有纳米孔的单克隆抗体CD34涂层生物支架的制备

选用316L不锈钢合金或者钴络合金材质经抛光后，用激光雕刻成血管支架；支架表面通过化学或物理方法，如腐蚀、阳极氧化、微弧氧化、微弧氮化等方法或这些方法的结合在器械本体原材料的局部表面直接制备形成孔洞，孔洞可以是载药槽或孔结构，孔洞的直径为200-300nm。按照如下步骤制得单克隆抗体CD34涂层生物支架：

1、支架本体表面的清洗：

(1)砂带打磨支架本体表面，机械去除表面的氧化物，调整表面粗糙度；

(2)利用超声波，依次用75％的医用乙醇溶液、99.5％的丙酮溶液、去离子水清洗，超声波频率为100KHz，清洗时间为10min；

(3)将支架本体放入30g/L、80℃氢氧化钠溶液中浸泡10min，去除油脂和氧化皮；

(4)将清洗后的支架本体放置在真空干燥机中，温度设定在40℃，干燥45min后取出。

2、支架本体表面的防腐处理：采用交流电氧化，在两电极上安装完全相同的图1所示的支架或者图2所示的支架，阳极氧化处理用槽液成份为：高锰酸钾15g/L、磷酸三钠15g/L、氟化钾25g/L、氢氧化钾65g/L、氢氧化铝15g/L；在25℃，氧化10min，电流密度为0.1A/dm2，交流电压为50V，支架本体表面即可生成氧化膜。

3、支架本体表面单克隆抗体CD34溶液的涂覆处理：

(1)支架本体的预处理：用四氢呋喃超声清洗，超声波频率为100KHz，清洗时间为10min；使用去离子水清洗三次；

(2)抗体涂覆液的配制：以浓度为0.05mol/l、pH值为9.6的碳酸盐缓冲溶液为溶剂，加入浓度为0.1mg/ml单克隆抗体CD34溶液；

(3)阳极极化涂覆：如图4所示，将支架本体串联到阳极极化仪的阳极[4]上，将配制好的抗体溶液注入阳极极化的抗体储存容器[3]中，调节阳极电压为2.5v，进行极化，极化时间为30min，通电后抗体离子向阳极支架处移动，在阴阳相吸作用下，克服支架表面的液面张力，使单克隆抗体(CD34)与支架表面牢固均匀的结合。并在支架表面形成一层均匀的抗体涂层，抗体的量为支架重量的1/10³；

(4)、生物支架干燥：将支架自然稍晾干后，冰箱中预冷冻后放入真空冷冻干燥机中干燥4h。

实施例3  具有纳米孔的抗体药物联合涂层生物支架的制备

选用316L不锈钢合金或者钴络合金材质经抛光后，用激光雕刻成血管支架；支架表面通过化学或物理方法，如腐蚀、阳极氧化、微弧氧化、微弧氮化等方法或这些方法的结合在器械本体原材料的局部表面直接制备形成孔洞，孔洞可以是载药槽或孔结构，孔洞的直径为200-300nm。按照如下步骤制得单克隆抗体CD34涂层生物支架：

1、支架本体表面的清洗：

(1)砂带打磨支架本体表面，机械去除表面的氧化物，调整表面粗糙度；

(2)利用超声波，依次用75％的医用乙醇溶液、99.5％的丙酮溶液、去离子水清洗，超声波频率为100KHz，清洗时间为10min；

(3)将支架本体放入30g/L、80℃氢氧化钠溶液中浸泡10min，去除油脂和氧化皮；

(4)将清洗后的支架本体放置在真空干燥机中，温度设定在40℃，干燥45min后取出。

2、支架本体表面的防腐处理：采用交流电氧化，在两电极上安装完全相同的图1所示的支架或者图2所示的支架，阳极氧化处理用槽液成份为：高锰酸钾15g/L、磷酸三钠15g/L、氟化钾25g/L、氢氧化钾65g/L、氢氧化铝15g/L；在25℃，氧化10min，电流密度为0.1A/dm2，交流电压为50V，支架本体表面即可生成氧化膜。

3、治疗性药物溶液的涂覆处理：以四氢呋喃作溶剂，加入浓度为15μg/ml的雷帕霉素对支架表面进行定向超声喷涂，匀速旋转支，喷涂4次，使支架表面药物含量达到支架重量的1/10²。

4、支架本体表面单克隆抗体CD34溶液的涂覆处理：

(1)、支架本体的预处理：用四氢呋喃超声清洗，超声波频率为100KHz，清洗时间为10min；使用去离子水清洗三次；

(2)、抗体涂覆液的配制：以浓度为0.05mol/l、pH值为9.6的碳酸盐缓冲溶液为溶剂，加入浓度为0.1mg/ml单克隆抗体CD34溶液；

(3)阳极极化涂覆：如图4所示，将支架本体串联到阳极极化仪的阳极[4]上，将配制好的抗体溶液注入阳极极化的抗体储存容器[3]中，调节阳极电压为2.5v，极化时间为30min，通电后抗体离子向阳极支架处移动，在阴阳相吸作用下，克服支架表面的液面张力，使单克隆抗体与支架表面牢固均匀的结合。并在支架表面形成一层均匀的抗体涂层，抗体的量为支架重量的1/10³；

(4)、生物支架干燥：将支架自然稍晾干后，冰箱中预冷冻后放入真空冷冻干燥机中干燥4h。

实验例1静电包被效果前后抗体支架捕获细胞效果对比

1、试验材料

KG-1a细胞，DAPI活细胞核染色剂，316L不锈钢支架。

直接采用浓度为0.05mol/l、pH值为9.6的碳酸盐缓冲溶液为溶剂，加入浓度为0.1mg/ml单克隆抗体(CD34)溶液，浸涂316L不锈钢支架制得抗体涂层生物支架1

以浓度为0.05mol/l、pH值为9.6的碳酸盐缓冲溶液为溶剂，加入浓度为0.1mg/ml单克隆抗体(CD34)溶液，按照实施例1的方法制得抗体涂层生物支架2。

2、试验目的

比较静电包被效果前后抗体支架的捕获细胞效果

3、试验方法

将一定量的DAPI活细胞核染色剂加入到KG-1a细胞培养液中，培养一个小时后离心除去培养液中的未结合的染色剂后，稀释细胞浓度为10⁶个/ml，分别向上述生物支架1和生物支架2中加入1ml的细胞液。培养1小时后在荧光显微镜下观察支架上吸附的细胞情况。结果如图7图8所示。

4、试验结果

由图5(静电包被的抗体生物支架)和图6(直接采用碳酸钠缓冲液包被的抗体生物支架)可见，经过静电包被后的抗体支架吸附大量的该抗体的抗原细胞，而未经过静电包被的抗体支架只吸附少量的抗原细胞KG-1a。

5、试验结论

通过静电包被的支架能够包被上大量的具有生物活性功能的抗体，而且分布均匀。

Claims (5)

1.一种生物活性蛋白或多肽涂层生物支架的制备方法，其特征在于，采用阳极极化的方法，以支架本体为阳极，将其与阴极一起插入生物活性蛋白或多肽溶液中，在电源电场力的作用下，生物活性蛋白或多肽电离而带负电，向支架阳极移动，均匀地涂覆在支架的表面；

用阳极化方法涂覆生物支架，包括如下步骤：

（1）支架本体的预处理：用四氢呋喃、丙酮、乙醇或甲醇超声清洗，然后再用去离子水进行清洗；

（2）生物活性蛋白或多肽涂覆液的配制：以蒸馏水、生理盐水、硼酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液为溶剂，加入浓度为0.001mg/ml-1mg/ml的生物活性蛋白或多肽溶液；

（3）涂覆液的涂覆：采用阳极极化包被的方式涂覆生物支架，以支架本体为阳极，在直流电源下，控制电压在0.1V以上，生物活性蛋白或多肽电离带负电，向阳极移动，涂覆时间为1-100min，涂覆量为支架重量的1/10²-1/10⁶；

在阳极极化的涂覆处理前，先对支架本体进行表面清洗和防腐处理；阳极极化涂覆处理后的生物支架自然晾干，经预冷冻后，放入真空冷冻干燥机干燥；

在阳极极化的涂覆处理前，所述支架本体的表面清洗过程为：

（1）用砂带打磨支架本体表面，用于去除表面的氧化物，调整表面粗糙度；

（2）利用超声波，依次用75%的医用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶液、去离子水清洗，超声波频率为28-100KHz，清洗时间为5-15min；

（3）将支架本体放入15-60g/L、70-100℃的氢氧化钠溶液中浸泡5-10min，用于去除油脂和氧化皮；

（4）将清洗后的支架本体放置在真空干燥机中，温度设定在30-40℃，干燥30-60min后取出；

在阳极极化的涂覆处理前，所述支架本体的防腐处理采用化学氧化处理或阳极氧化处理的方法进行，所述化学氧化处理的过程为：将支架本体浸入含重铬酸钾15-20g/L、硝酸15-25g/L、氯化钠0.75-1.25g/L的混合溶液中，在70-80℃下，氧化0.5-2.0min；所述阳极氧化处理的过程为：采用交流电氧化，在两电极上分别安装完全相同的支架本体，阳极氧化处理用槽液为高锰酸钾15-20g/L、磷酸三钠15-55g/L、氟化钾25-55g/L、氢氧化钾65-165g/L、氢氧化铝15-65g/L的混合液，在20-60℃下，电流密度为0.1-10A/dm²，交流电压为50-90V下，氧化10-50min；

所述的支架本体的材质为不锈钢、钴铬合金、镁合金或Ni-Ti合金；

所述生物活性蛋白或多肽为阿昔单抗、一氧化氮合酶、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子3、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子9、碱性成纤维细胞生长因子、血小板诱导性因子、转化生长因子β1、酸性成纤维细胞生长因子、骨粘连蛋白、促血管生成素1、促血管生成素2、胰岛素样生长因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、血小板衍生生长因子AA、血小板衍生生长因子BB、血小板衍生生长因子AB、内皮细胞PAS蛋白1、血小板反应蛋白、增殖蛋白、肝配蛋白-A1、E-选择蛋白、肥胖蛋白、白介素8、甲状腺素、神经鞘氨醇1-磷酸酯、角蛋白8、尿激酶前体、反义寡核核苷酸、抗CD2白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD3白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD4白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD8白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD3R白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD1a白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD1b白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD5白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD6白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD7白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD9白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD10白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD11a白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD18白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD19白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD20白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD21白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD22白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD23白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD24白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD37白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD33白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD34白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD35白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD64白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD65白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CDw65白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD66b白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD66e白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD31白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD133白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD89白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CDw90白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD56白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD57白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD94白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD40白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD72白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD77白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD16白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD32白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD63白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD36白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD41白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD42a白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD42b白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD11b白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD11c白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD29白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD44白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD48白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD49a白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD49b白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD49c白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD49e白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD49f白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD50白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD51白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD54白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD58白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD61白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD62E白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD62L白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD62p白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD103白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD105白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD26白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD71白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD95白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD122白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CDw124白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD126白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD127白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD117白细胞分化抗原抗体及其片段、抗血管内皮生长因子1抗体及其片段、抗血管内皮生长因子2抗体及其片段、抗CD146抗体及其片段、抗干细胞抗原抗体及其片段、抗干细胞因子1抗体及其片段、抗酪氨酸激酶Tie-2抗体及其片段和抗HAD-DR细胞表面抗原抗体及其抗体片段中的一种或多种。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述支架本体表面制成有直径100-800nm的孔洞。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述的支架本体为冠脉血管支架、颈动脉血管支架、外周血管支架、肾动脉血管支架、颅内动脉血管支架、移植片固定膜、移植片固定膜移植物、合成的人造血管、心脏瓣膜、血管修补筛、起搏器、起搏器导子、除纤颤器、PFO隔膜封闭装置、血管夹、动脉血管瘤闭锁器、血液透析移植物、血液透析导管、房室吻合分流、大动脉血管瘤移植物装置、静脉瓣、血管接合夹、留置式动脉导管或血管护鞘或药物输送口。

4.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在支架本体表面涂覆抗体前，先涂覆治疗性药物，并且所涂覆的治疗性药物与抗体的比例为10:1-100:1。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述治疗性药物为肝素、阿司匹林、水蛭素、秋水仙碱、抗血小板GPIIb/IIIa受体拮抗剂、白甲氨蝶呤、嘌呤类、嘧啶类、植物碱类、埃坡破霉素类、雷公藤系列化合物、抗生素、激素、抗体治癌药物、环孢霉素、他克莫司及同系物、脱精胍菌素、霉酚酸脂、雷帕霉素及其衍生物、FR900520、FR 900523、NK 86-1086、戊酰胺、康乐霉素C、斯博格埃林、灵菌红素25c、曲尼斯特、多球壳菌素、FR 651814、SDZ214-104、环孢霉素C、布雷青霉素、麦考酚酸、布雷菲得菌素A、WS9482、糖皮质类固醇、替罗非班、埃替非巴肽、紫杉醇、放线菌素-D中的一种或多种。

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