CN108926747A - 一种抗黏附多肽的应用、一种植入医疗器械及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医疗器械技术领域，具体涉及一种可对器械植入部位进行损伤内皮修复的技术领域。本发明提供了抗黏附多肽在制备植入医疗器械中的应用。一种植入医疗器械负载有细胞捕获物质及抗黏附多肽。所述植入医疗器械的制备方法，包括将所述细胞捕获物质负载在所述植入医疗器械计划负载细胞捕获物质的表面和将所述抗黏附多肽负载在所述植入医疗器械的孔内或槽内。本发明提供的技术方案从抗细胞黏附的角度入手，运用抗黏附多肽与细胞膜上的黏附分子结合的机理，阻断了除捕获的特种细胞以外的其他种类的细胞与植入医疗器械表面的黏附，可以大大提高捕获细胞的纯度，提高内皮修复的效率，从而达到促进内皮新生、抑制内膜增生、抑制炎症反应的目的。

Description

一种抗黏附多肽的应用、一种植入医疗器械及其制备方法
技术领域
本发明属于医疗器械技术领域，具体涉及一种可对器械植入部位进行损伤内皮修复的技术领域。
背景技术
在支架、封堵器等医疗器械植入人体的过程中，由于轴向剪切力、摩擦力等作用会对植入组织周围的内皮组织造成一定的损伤。这种内皮组织的损伤会导致周围组织遭受炎症反应、内膜增生等危害，长期的内皮损伤会造成血管再狭窄、血栓等严重后遗症。因而，对损伤的内皮组织进行修复十分必要。
近年来，人们尝试了多种手段进行内皮修复，主要的技术点是通过在植入器械表面捕获内皮细胞、内皮祖细胞、内皮前体细胞等可以增殖或分化为新生内皮的细胞来实现。可以分为四大类。
(1)磁力捕获内皮细胞进行内皮修复
1999年Consigny等人将聚苯乙烯磁性微球用白蛋白包裹后通过胞吞作用送达到内皮细胞内部，赋予内皮细胞以磁性。接着用两个球囊隔离出一段血管，将内皮细胞通过导管输送到隔离出的血管位置，并在体外用磁铁将磁性内皮细胞固定在目标血管位置。为避免重力的干扰，在内皮细胞黏附期间，实验动物处于旋转的状态。待细胞黏附后将球囊和导管撤出，观察内皮细胞黏附状况。与未吞噬磁性微球的内皮细胞相比，吞噬了磁性微球的内皮细胞在血管内的黏附率更高。2006年Pislaru等人首先运用相似的方法赋予内皮细胞磁性，其后在不锈钢支架表面涂覆具有磁性的金属镍涂层，用强磁场对金属镍涂层进行磁化。经过磁化后被输送到猪体内，接着再将吞噬磁性微球的内皮细胞经导管缓慢输送到支架部位的血管内。与未吞噬磁性微球的内皮细胞相比，磁化后的内皮细胞可以在支架表面聚集。2009年Kyrtatos等人运用CD133磁珠从人血液中提取内皮祖细胞，并使用经FDA批准的超顺磁氧化铁纳米粒子赋予内皮祖细胞磁性，进行荧光标记后通过输送器输送到血管内，通过体外磁体的磁力吸引作用将具备磁性的内皮祖细胞富集在目标部位。2016中国哈尔滨医科大学的Zhang等人将磁性微粒与DNA质粒结合，在待修复部位引入促血管内皮生长因子基因，促进促血管内皮生长因子的表达，以达到促内皮修复的目的。
(2)多肽接枝捕获细胞
细胞与细胞外基质的黏附，一般是由细胞膜上的黏附蛋白与细胞外基质中的蛋白质上的某种特异性黏附的结合介导发生的。其中一种在生物医用材料领域应用的较为广泛的多肽结构为RGD(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸)，它可以和细胞膜上的整合素蛋白发生特异性结合从而使细胞与细胞外基质发生黏附。 2006年Blindt等人将环状RGD多肽负载到支架表面的高分子涂层内，与未负载 RGD的支架和裸支架相比，12周后负载了RGD的支架相比于其它两种支架具有更好的促进内皮修复、抑制内膜增生和抑制再狭窄的功能。YIGSR多肽(酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸)可以促进内皮细胞的黏附，2008年Taite 等人将YIGSR多肽负载到聚氨酯-聚乙二醇共聚物中，有效的促进了内皮细胞的黏附抑制血小板黏附。不过，RGD、YIGSR等与细胞的黏附具有普适性，并非针对内皮祖细胞的特异性黏附多肽，因而存在促进其他种类细胞增生的风险。针对内皮祖细胞的特异性黏附多肽还没有找到，2008年Veleva等人筛选出同样具备内皮修复潜能的人血内皮前体细胞的特异性黏附多肽TPSLEQRTVYAK，体外实验表明TPSLEQRTVYAK可以选择性地黏附人血内皮前体细胞，人内皮前体细胞被称为后内皮祖细胞，相比于内皮祖细胞而言具有更强的表型维持能力。 2016年中国西南交大的黄楠课题组将生物素修饰后的TPSLEQRTVYAK与白蛋白共同接枝到表面有聚多巴胺涂层的金属钛表面，进行内皮祖细胞的捕获，结果表明这种改性后的钛金属表面可以促进内皮新生，抑制内膜增生和平滑肌细胞增殖。
(3)寡核苷酸适配子
寡核苷酸适配子(aptamer)是人工合成的单链寡核苷酸(单链DNA或 RNA)，具有折叠的三维空间结构，能够与蛋白质、多肽、酶、抗体、细胞受体等目标物质进行高亲和力、高特异性的结合，它可以一种称为指数式富集配体系统进化技术(SELEX)的体内提取技术来获得，其功能类似抗体,但比抗体具有更多的优势。2008年Hoffmann等人将DNA寡核苷酸适配子运用到内皮祖细胞的捕获研究中，他们首先通过SELEX技术获得内皮祖细胞的DNA寡聚核苷酸适配子，在体外从血液中成功的捕获到了内皮祖细胞，并验证了其向内皮细胞分化的能力，证明该技术具促内心修复治疗的潜能。
(4)细胞膜表面特异性蛋白抗体
运用内皮细胞或内皮祖细胞表面表达的特异性蛋白的抗体进行内皮祖细胞捕获，是目前促内皮修复研究中运用的最广泛的手段。目前使用较广泛的蛋白抗体：VEGFR-2(KDR)、CD34、CD133的抗体。2008年Markway等人将在玻片表面修饰G蛋白后接着用白蛋白钝化背景，最后涂覆上VEGFR-2(KDR)的抗体涂层。在处理后的玻片表面进行细胞黏附实验和动态细胞捕获实验，结果表明相比于没有VEGFR-2抗体的涂层有VEGFR-2的涂层可以有效的捕获到内皮细胞。2003年Kutryk等人将CD34视为内皮祖细胞的特异性表达蛋白，将CD34 抗体通过肽键固定在聚四氟乙烯涂层上，考察了CD34抗体支架体外捕获内皮祖细胞的能力。该技术己经归属OrbusNeich公司所有，商品名为Genous R Stent。在Gennous之后OrbusNeich公司又研究出了CD34抗体和雷帕霉素双药涂层，产品名为Combo。抗体的修饰方法除了化学接枝外还有静电吸附作用。由于 CD34抗体蛋白在溶液中带正电，2010年浙江大学的计剑研究组运用静电自组装的方法，成功将CD34抗体静电吸附到肝素/胶原的静电自组装涂层表面。相比于CD34抗体而言，CD133抗体被认为具有更强的捕获内皮祖细胞的特异性。2007年大连理工大学的张世轩等人发表的专利中首次提到了将CD133抗体运用到内皮祖细胞捕获当中。他们选用具有良好生物相容性的聚阳离子壳聚糖和具有良好抗凝作用的聚阴离子透明质酸作为静电自组装的基础涂层，再将CD133 抗体通过静电自组装的方法组装到壳聚糖(正电)和透明质酸(负电)的层层自组装涂层表面，最终实现了体内和体外的内皮祖细胞捕获。
然而，以上四大类方法虽然实现了内皮细胞、内皮祖细胞、内皮前体细胞的捕获，但从目前的研究结果来看，通过捕获内皮细胞、内皮祖细胞、内皮前体细胞的黏附来促进内皮新生的效果仍有待改进。
2013年Sedaghat等人采用化学接枝的方法在支架表面修饰了CD133抗体。他们首先在支架表面涂覆上一层生物大分子，接着对生物大分子进行硅烷化处理，然后通过EDC交联剂将CD133抗体化学交联到涂层表面。短时间的体外捕获实验证明具有CD133抗体涂层的支架表面可以成功捕获到内皮祖细胞，但是体内实验内皮修复的效果却不理想。可能的原因是体内CD133+的细胞数量极少，而随着时间的推移，支架表面其它种类细胞的非特异性黏附增加，更加抑制了CD133+细胞的黏附。
2014青岛大学的Yi AN等人通过化学交联法将CD133抗体负载到支架表面，他们首先合成富含羧基的LLA(左旋丙交酯)和MBC (5-methyl-5-benzyloxycarbonate-1,3-dioxan-2-one)的共聚物(PLM)，接着将共聚物喷涂到支架表面，然后通过EDC将CD133抗体化学交联到PLM涂层上，最后得到负载CD133抗体的支架。虽然体外实验证明CD133抗体负载支架可以很好得捕获内皮祖细胞，但是与裸支架相比4周后内皮细胞覆盖支架的程度基本相似。由此可见，迅速捕获内皮细胞并不意味着可以迅速实现内皮修复，想要通过CD133抗体负载支架获得更优异的内皮修复效果，还需要更加深入的研究。近年来，人们尝试了对这种能够捕获内皮细胞的支架进行改进，期望能在抑制其他细胞增生的同时，达到促进内皮修复的效果。其中，一个极具代表性的例子是OrbusNeich公司的Genous R Stent向ComboStent的改进。Genous R Stent在捕获内皮细胞的同时还会捕获到其他种类的细胞，因而在后续的Combo Stent中引入了雷帕霉素来抑制平滑肌细胞的增生。但是，雷帕霉素作为抗癌药物，对正常人体会造成一定的伤害。
发明内容
本发明提供一种抗黏附多肽的应用、一种植入医疗器械及其制备方法，用以解决目前通过捕获细胞技术来促进内皮新生时存在的细胞捕获的选择性、特异性差而造成的其他细胞增生的问题，从而达到促进内皮修复的效果。
为了解决上述技术问题，本发明的一个技术方案是：一种抗黏附多肽在制备植入医疗器械中的应用，所述植入医疗器械在特异性地捕获细胞的同时释放所述抗黏附多肽。此处，所谓特异性地捕获细胞是指，针对性地捕获促进内皮细胞生长的细胞，此处指选自内皮细胞、内皮前体细胞或内皮祖细胞中的至少一种。在医疗器械植入体内后，通过细胞捕获技术捕获促进内皮细胞生长的细胞，同时通过抗黏附多肽可有效抑制非内皮细胞在器械表面的黏附，促进内皮组织迅速修复，进而达到抑制内膜增生、降低炎症反应的效果。
所述抗黏附多肽是指可以和细胞膜表面介导细胞黏附的蛋白(整合素分子、)结合，从而抑制细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的黏附行为的多肽物质。
优选地，所述抗黏附多肽选自RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽)、RGD 多肽衍生肽、YIGSR(酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸多肽)、RGD聚多肽和YIGSR聚多肽中的一种或两种以上。
RGD多肽衍生肽是指，如c-(RGD)-fK(环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸多肽)。
RGD是细胞膜上介导细胞与细胞基质的黏附蛋白整合素分子的特异性识别多肽，可以与整合素分子发生特异性结合从而介导细胞与细胞基质的黏附作用。
优选地，所述植入医疗器械通过磁力或特异性识别分子捕获细胞。
磁力的捕获原理在于磁化特种细胞，从而通过磁力作用引导特种细胞在目标位置聚集，使用实例可见背景技术。本发明中的特种细胞是指内皮细胞、内皮前体细胞或内皮祖细胞。
特异性识别分子的捕获原理在于通过特异性识别分子与特种细胞特异性结合，使特种细胞在目标位置聚集，使用实例可见背景技术。
本发明还提供了一种植入医疗器械，所述植入医疗器械负载有特异性细胞捕获物质及抗黏附多肽。
优选地，所述植入医疗器械为带孔支架或挖槽支架。
所述带孔支架是指支架杆上有贯穿支架杆管腔内壁和外壁的孔洞的支架，外壁面向血管壁的一侧，内壁面向血液的一侧。支架可以是网状支架、管状支架、缠绕型支架、环状支架中的任意一种。孔的位置不限定。孔的立体几何形状不限。孔的尺寸和个数以不影响支架的支撑性能为限。
所述挖槽支架是指支架杆上有沟槽的支架，沟槽可容纳药物涂层。支架可以是网状支架、管状支架、缠绕型支架、环状支架中的任意一种。槽位于支架杆管腔内壁(面向血流的一侧)。槽在支架杆上的位置不限定。槽的立体几何形状不限。槽的尺寸和个数以不影响支架的支撑性能为限。
优选地，当植入医疗器械为带孔支架时，所述抗黏附多肽仅填充在支架的孔内，当植入医疗器械为挖槽支架时，所述抗黏附多肽仅填充在支架的槽内。孔或槽可位于支架杆上的任何位置。支架植入体内抗黏附多肽在体液中溶解，从支架孔中或槽内释放。
优选地，所述支架孔或槽内负载的抗黏附多肽的浓度为：10μg/mm2～1000 μg/mm2，更优选10μg/mm2～100μg/mm2。浓度过低导致短期内多肽完全释放，达不到抗黏效果；浓度过高，释放的多肽在孔或槽表面累积，反而促进细胞黏附到支架表面。
优选地，所述抗黏附多肽选自RGD、RGD多肽衍生肽、YIGSR、RGD聚多肽和YIGSR聚多肽中的一种或两种以上。
优选地，所述特异性的细胞捕获物质为磁性金属涂层或特种细胞的特异性识别分子。
优选地，所述磁性金属涂层为磁性金属镍涂层。
提取体内内皮细胞或内皮祖细胞，用超顺磁氧化铁纳米粒子赋予细胞磁性，在不锈钢支架表面涂覆具有磁性的金属镍涂层，对金属镍涂层进行磁化。支架植入后将吞噬磁性粒子的细胞经导管缓慢输送到支架部位的血管内，实现引导特种细胞在目标位置聚集。
优选地，所述特种细胞为内皮细胞、内皮前体细胞和内皮祖细胞，所述特异性识别分子为针对特种细胞相应标志物的抗体、多肽或寡聚核苷酸适配子。
所述标志物是指，特种细胞上的特定抗原，比如CD133、AC133、CD34、 VEGFR-2，多肽对应的标志物，比如TPSLEQRTVYAK多肽，寡聚核苷酸适配子的标志物，比如内皮祖细胞的DNA寡聚核苷酸适配子。
优选地，所述针对特种细胞相应标志物的抗体选自抗CD133、抗AC133、抗CD34和抗VEGFR-2中的一种或两种以上。
优选地，负载所述抗体的浓度为：10μg/mm2～1000μg/mm2，更优选为：10 μg/mm2～100μg/mm2。浓度过低，捕获细胞数量过少，浓度达到一定程度抗体结合位点饱和，效果不再增加。
优选地，所述针对特种细胞相应标志物的多肽为TPSLEQRTVYAK(苏氨酸 -脯氨酸-丝氨酸-亮氨酸-谷氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-苏氨酸-缬氨酸-酪氨酸-丙氨酸 -赖氨酸多肽)。所述TPSLEQRTVYAK为内皮前体细胞特异性识别多肽。
优选地，负载所述TPSLEQRTVYAK多肽的浓度为：1μg/mm2～100μg/mm2，更优选为：1μg/mm2～10μg/mm2。
优选地，所述针对特种细胞相应标志物的寡聚核苷酸适配子选自能够识别内皮细胞、内皮前体细胞、内皮祖细胞的所有寡聚核苷酸适配子。
优选地，负载所述寡聚核苷酸适配子的浓度为：10ng/mm2～10μg/mm2，优选100ng/mm2～1μg/mm2。寡聚核苷酸分解快速，浓度过低，无法被捕获到，浓度达到一定程度效果不再增加。
本发明还提供了上述植入医疗器械的制备方法：包括将所述特异性细胞捕获物质负载在所述植入医疗器械的至少一部分表面的工序和将所述抗黏附多肽负载在所述植入医疗器械的孔内或槽内的工序。
优选地，所述抗黏附多肽负载在所述植入医疗器械表面的方法为：将所述抗黏附多肽用溶液溶解，将溶液注入所述植入医疗器械的孔内或槽内，待溶剂挥发后，所述抗黏附多肽附着在孔壁或槽壁上。
优选地，所述抗黏附多肽负载在所述植入医疗器械表面的方法为：将所述抗黏附多肽包裹在嵌段聚合物胶束内，配制成溶胶注入所述植入医疗器械的孔或槽内，待溶剂挥发后再继续注入，直至孔或槽被填满。该法可使得多肽在孔或槽内实现缓慢释放。
优选地，所述嵌段聚合物为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物。
本发明提供的技术方案从抗细胞黏附的角度入手，运用抗黏附多肽与细胞膜上的黏附分子结合的机理，阻断了除期望捕获的特种细胞以外的其他种类的细胞与植入医疗器械表面的黏附，可以大大提高捕获细胞的纯度，提高内皮修复的效率，从而达到促进内皮新生、抑制内膜增生、抑制炎症反应的目的。
附图说明
图1a是实施例1中未经RGD处理的悬浮细胞在培养板表面的黏附情况；
图1b是实施例1中经RGD处理的悬浮细胞在培养板表面的黏附情况；
图1c是实施例1中经YIGSR处理的悬浮细胞在培养板表面的黏附情况。
图2a是实施例2中释放抗黏附多肽c-(RGD-fk)的实验组支架植入动物体内 14天后血管内壁电镜图；
图2b是实施例2中释放抗黏附多肽YIGSR的实验组支架植入动物体内14 天后血管内壁电镜图；
图2c是实施例2中对照组支架植入动物体内14天后血管内壁电镜图；
图3是本发明促内皮修复效果的机理示意图；
图4实施例3-8所述带孔支架的支架杆切面图，支架杆管腔内壁和外壁设有有细胞捕获涂层，孔中负载抗黏附多肽；
图5实施例9所述带孔支架的支架杆切面图，管腔内壁设有细胞捕获层，管腔外壁设有药物涂层，孔内负载抗细胞黏附多肽；
图6实施例10所述带孔支架的支架杆切面图，管腔内壁设有细胞捕获涂层，管腔外壁无涂层，孔内负载抗黏附多肽；
图7实施例11-12所述带槽支架的支架杆切面图，管腔内壁和外壁设有细胞捕获涂层，槽内负载抗黏附多肽；
图8实施例13所述带槽支架的支架杆切面图，管腔内壁设有细胞捕获层，管腔外壁设有药物涂层，槽内负载抗黏附多肽；
图9实施例14所述带槽支架的支架杆切面图，槽内负载抗黏附多肽填充，支架杆管腔内壁设有细胞捕获涂层，管腔外壁无涂层。
图中所示：
1-支架杆、2-管腔内壁、3-管腔外壁、4-细胞捕获涂层、5-孔、6-抗黏附多肽、 7-药物涂层、8-槽。
具体实施方式
为了便于理解，下面结合实施例阐述所述抗黏附多肽的应用、所述植入医疗器械及其制备方法，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明中所用的原材料及器械，如无特别指出，均为可市购商品。
本发明中所涉及的“医疗器械”可以是植入体内的器械。该器械可以短期暂时使用，或者长期永久性植入。在某些实施方式中，合适的器械是那些通常用于为心律失调、心力衰竭、瓣膜性疾病、血管病、糖尿病、神经疾病和失调症、整型外科、神经外科、肿瘤学、眼科学和ENT手术提供医疗和/或诊断的器械。本发明所涉及的医疗器械包括但不限于以下设备：支架、支架移植物、吻合连接器、合成贴片、引线、电极、针、导线、导管、传感器、手术仪器、血管成形球、创口引流管、分流管(shunt)、管子、输液套简(infusion sleeve)、尿道插管、小球、植入物、血液充氧发生器、泵、脉管移植物、埋入式介入药盒(vascular accessport)、心瓣膜、瓣环成形术环、缝合线、手术夹、手术钉、起博器、可植入去纤颤器、神经刺激器、整型外科器械、脑脊髓液分流管、可植入药泵、椎笼、人造椎间盘、髓核的替代器械、耳管、眼内晶状体和在介入手术中使用的任何管。优选地，本发明所涉及的医疗器械尤其是：支架、球囊、封堵器、瓣膜或人工血管。
本发明所涉及的抗细胞黏附多肽可以通过多种工艺与医疗器械的表面相结合或负载，如浸涂、喷涂、洗涤、气相沉淀、刷涂、辊涂和其它本领域已知的方法。
实施例1细胞实验
验证抗细胞黏附多肽处理后的细胞在培养板表面的黏附性能。
(一)细胞培养
人动脉血管平滑肌细胞培养在含10％FBS(Gibico品牌)的DMEM(Gibico 品牌)高糖培养基中。人脐静脉血管内皮细胞培养在EGMTM-2BulletKitTM (Lonza，CC-3162)培养基中，培养基中含有10％FBS和多种生长因子。
(二)细胞接种
当细胞数量达到80％培养瓶底面积时，吸去培养基，加入胰酶，待细胞从培养瓶底收缩但未完全脱离时，吸掉胰酶，轻拍瓶底至细胞完全脱离瓶底。加入10mL含1％FBS的PBS溶液终止消化，并吹打细胞形成细胞悬浮液。将10mL 细胞悬浮液等量分装到两只5mL的离心管中，1000r/min离心10分钟。弃去上层溶液，获得底层细胞。
对离心后获得的3管细胞，1管用含10％FBS的DMEM高糖培养基，稀释细胞至密度为30000/mL；1管用含有100M RGD三肽和10％FBS的DMEM高糖培养基稀释细胞至密度为30000/mL；1管用含有100M YIGSR多肽和10％FBS 的DMEM高糖培养基稀释细胞至密度为30000/mL。将细胞悬浮液置于37℃的摇床上，摇晃30min，使细胞与抗黏附多肽充分结合。最后，将稀释后的细胞接种到12孔板内，黏附24小时后进行细胞核染色，对细胞黏附密度进行观察。
(三)细胞染色
细胞经4％多聚甲醛固定10分钟，加入考马斯蓝染夜染色45秒(Boster)，吸掉染夜后用PBS和纯化水各漂洗3次，每次5分钟。荧光显微镜下拍照观察。
(四)实验结果
在细胞悬浮状态下，对细胞进行抗黏附多肽处理，处理前后的细胞分别接种到培养板内。培养24小时后，对细胞进行考马斯蓝染色。染色结果用光学显微镜观察。图1a显示的是未经抗黏附多肽处理的细胞黏附的状况。图1b为经过RGD处理后的悬浮细胞的黏附情况。图1c为经过YIGSR处理后的悬浮细胞的黏附情况。对比未经抗黏附多肽处理的细胞黏附状态可以得知，经过抗黏附多肽处理后的悬浮细胞，在培养板上呈现收缩状态，细胞黏附密度低，黏附力弱。该实验表明，经过抗黏附多肽的处理，可抑制细胞的黏附性能。
实施例2动物实验
验证抗黏附多肽对细胞捕获支架促内皮修复效果的影响。
(一)样品制备
(1)抗体负载
配制PEI溶液(5mg/mL,0.15M NaCl)，壳聚糖溶液(CS，1mg/mL，0.15M NaCl，pH＝4.0)，透明质酸钠溶液(HA,1mg/mL,0.15M NaCl,pH＝6.0)，NaCl溶液(0.15M)，AC133(CD133-1)抗体溶液1g/mL。
将L605裸金属支架切割成支架杆带孔的结构。用H2SO4：H2O2(30％)＝3：1 溶液清洗30分钟，接着用去离子超声清洗3次，每次10分钟。氮气吹干后首先浸于聚乙烯亚胺(PEI)溶液中，静置30分钟后取出，清洗、吹干。将PEI 处理过的支架浸于透明质酸钠溶液中，静置20分钟后清洗、吹干，得到HA外层；接着将支架浸于壳聚糖溶液中，静置20分钟后清洗、吹干，得到CS外层；重复上述过程7次即得到透明质酸钠/壳聚糖自组装7双层膜。将支架浸于细胞捕获物质AC133(CD133-1)抗体溶液中，在37℃条件下静置20分钟。最后将支架浸入HA进行一次组装，获得可以捕获内皮祖细胞的支架。所述支架表面 CD133-1(AC133)抗体的单位面积分布量为10μg/mm2。最终获得的支架分为三组。其中一组不做后续处理，另外两组分别注入抗黏附多肽c-(RGD-fk)和 YIGSR。
(2)抗黏附多肽c-(RGD-fk)注入
将c-(RGD-fk)多肽溶解在纯化水中，配制成浓度为5mg/mL的溶液。取100 mL溶液，向其中加入10g聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物F-127 (Sigma-aldrich,P2443)，搅拌溶解配置成溶胶。将溶胶滴加到一组支架样品的支架孔内，待水分挥发后，重复滴加直至孔被填满。将干燥后的支架放入纯化水中清洗10分钟，去除表面游离多肽。氮气吹干支架，在4℃条件下保存。所述抗黏附多肽c-(RGD-fk)在孔内的负载浓度为100μg/mm2。
(3)抗黏附多肽YIGSR注入
将YIGSR多肽溶解在纯化水中，配制成浓度为5mg/mL的溶液。取100mL 溶液，向其中加入10g聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物F-127 (Sigma-aldrich,P2443)，搅拌溶解配置成溶胶。将溶胶滴加到另一组架样品的支架孔内，待水分挥发后，重复滴加直至孔被填满。将干燥后的支架放入纯化水中清洗10分钟，去除表面游离多肽。氮气吹干支架，在4℃条件下保存。所述抗黏附多肽YIGSR在孔内的负载浓度为100μg/mm2。
(二)支架植入
准备体重为2.2-2.6kg的新西兰大白兔9只，动物体重与年龄相匹配。9只动物分为3组，包括两个实验组和一个对照组，每组3只动物。实验组植入同时负载捕获细胞抗体和抗黏附多肽的支架，其中1组含有抗黏附多肽
c-(RGD-fk)，另外一组含有抗黏附多肽YIGSR，对照组植入仅负载捕获细胞抗体的支架。器械按照目标支架:动脉尺寸＝1.10:1.0-1.20:1.0的比例进行植入。支架植入前将通过血管造影术对目标血管进行评价。支架植入后所有目标血管也将再次进行血管造影术评价。
(三)实验结果
植入14天后，取出植入支架段，沿血管轴向剖开，用含肝素的生理盐冲洗 1分钟，然后将血管转移到2.5％戊二醛中固定，24小时后取出脱水、干燥进行扫描电镜观察内皮覆盖情况。观察结果如图2a、b、c所示。图2a为释放抗黏附多肽c-(RGD-fk)的实验组支架14天的动物血管内壁图，图2b为释放抗黏附多肽YIGSR的实验组支架14天的动物血管内壁图，图2a和图2b中血管内皮有完整的内皮覆盖，内皮细胞形态良好。图2c为对照组支架血管内壁图，从图中可以看出，血管内壁有大量的纤维蛋白和淋巴细胞覆盖，内皮不良。结果表明，同时负载捕获细胞抗体和抗黏附多肽的使用可以达到更好的促内皮修复效果。
同时负载捕获细胞抗体和抗黏附多肽从而达到促内皮修复效果的机理如图 3所示，从支架缓慢释放到血液中的RGD等抗黏附多肽可以与细胞膜上的整合素蛋白结合介导细胞黏附，即，抗黏附多肽先占据了所有游离细胞表面的黏附位点，因此细胞只能通过内皮细胞、内皮祖细胞、内皮前体细胞的特异性识别物质结合到支架表面，而其他种类的细胞因为无法被内皮细胞、内皮祖细胞、内皮前体细胞的特异性识别物质识别所以不会被捕获，从而可以抑制其在支架上的黏附，大大降低其他种类细胞的干扰。
为使RGD等多肽达到与细胞膜上的整合素蛋白结合介导细胞黏附的效果，只要使RGD等多肽游离于血液中即可，可以从支架缓慢释放到血液中，也可以采取其他方式。例如，通过在血管内注射游离的RGD，事先将血管内单核细胞膜上整合素占位，就可以抑制其在支架上的黏附，再通过支架上的特异性抗体或其他特异性黏附物质捕获目标细胞，即可大大降低其它杂细胞的干扰。
实施例3
配制PEI溶液(5mg/mL,0.15M NaCl)，壳聚糖溶液(CS，1mg/mL，0.15M NaCl，pH＝4.0)，透明质酸钠溶液(HA,1mg/mL,0.15M NaCl,pH＝6.0)，NaCl 溶液(0.15M)，细胞捕获物质AC133(CD133-1)抗体溶液10mg/mL。
将L605裸金属支架切割成支架杆带孔的结构。用体积比H2SO4：H2O2(30％) ＝3：1溶液清洗30分钟，纯水清洗、氮气吹干。接着浸于PEI溶液中，30分钟后取出，清洗、吹干。将PEI处理过的支架浸于透明质酸钠溶液中，静置20分钟后清洗、吹干，得到HA外层；接着将支架浸于壳聚糖溶液中，静置20分钟后清洗、干，得到CS外层；重复上述过程7次即得到透明质酸钠/壳聚糖自组装7双层膜。将支架浸于CD133-1(AC133)抗体溶液中，在37℃条件下静置20分钟。最后将支架浸入HA进行一次组装，如图3所示，在支架杆1表面(包括管腔内壁2和管腔外壁3)形成细胞捕获涂层4，获得可以捕获内皮祖细胞的支架。
将抗黏附多肽c-(RGD-fk)多肽溶解在纯化水中，配制成浓度为0.5mg/mL 的溶液。取100mL溶液，向其中加入10g F127，搅拌溶解配置成溶胶。将溶胶滴加到支架孔内，待水分挥发后，重复滴加，如图3所示，直至孔5 被抗黏附多肽6填满。将干燥后的支架放入纯化水中清洗，去除表面游离多肽。氮气吹干支架，在4℃条件下保存。所述支架表面CD133-1(AC133)抗体的单位面积分布量为1000μg/mm2，所述抗黏附多肽c-(RGD-fk)在孔内的负载浓度为 10μg/mm2。
实施例4
将L605裸金属支架切割成支架杆带孔的结构。按实施例1中方法制备AC133 抗体负载支架。将c-(RGD-fk)多肽溶解在氯仿中，配制成浓度为10mg/mL的溶液。将最终溶液滴加到支架孔内，待溶剂挥发后，重复滴加，如图3所示，直至孔5被抗黏附多肽6填满。将干燥后的支架放入纯化水中清洗，去除表面游离多肽。氮气吹干支架，在4℃条件下保存。所述支架表面CD133-1(AC133) 抗体的负载浓度为10μg/mm2，所述抗黏附多肽c-(RGD-fk)在孔内的负载浓度为100μg/mm2。
实施例5
配制PEI溶液(5mg/mL,0.15M NaCl)，壳聚糖溶液(CS，1mg/mL，0.15M NaCl，pH＝4.0)，透明质酸钠溶液(HA,1mg/mL,0.15M NaCl,pH＝6.0)，NaCl 溶液(0.15M)，细胞捕获物质VEGFR-2抗体溶液100μg/mL。
将L605裸金属支架切割成支架杆带孔的结构。用H2SO4：H2O2＝3：1溶液清洗30分钟，纯水清洗、氮气吹干。然后浸于PEI溶液中，静置30分钟后取出清洗、吹干。将PEI处理过的支架浸于透明质酸钠溶液中，静置20分钟后清洗、吹干，得到HA外层；接着将支架浸于壳聚糖溶液中，静置20分钟后清洗、吹干，得到CS外层；重复上述过程7次即得到透明质酸钠/壳聚糖自组装7双层膜。将支架浸于VEGFR-2抗体溶液中，在37℃条件下静置20分钟。最后将支架浸入HA进行一次组装，如图3所示，在支架杆1表面(包括管腔内壁2和管腔外壁3)形成细胞捕获涂层4，获得可以捕获内皮细胞的支架。
将抗黏附多肽YIGSR多肽溶解在纯化水中，配制成浓度为50mg/mL的溶液。取100mL溶液，向其中加入10g聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物 F108(Sigma-aldrich,542342)，搅拌溶解。将最终溶液滴加到支架孔内，待水分挥发后，重复滴加，如图3所示，直至孔5被抗黏附多肽6填满。将干燥后的支架放入纯化水中清洗，去除表面游离多肽。氮气吹干支架，在4℃条件下保存。所述支架表面VEGFR-2抗体的负载浓度为10μg/mm2，所述抗黏附多肽YIGSR 多肽在孔内的负载浓度为1000μg/mm2。
实施例6
将L605裸金属支架切割成支架杆带孔的结构。100μg细胞捕获物质内皮祖细胞DNA寡聚核苷酸适配子溶解于10mL乙醇中，配制成浓度为10μg/mL的溶液。200mg聚乳酸，搅拌溶解于10mL乙酸正丙酯中，配制成2％的聚乳酸溶液。取100μL内皮祖细胞DNA寡聚核苷酸适配子溶液加入聚乳酸溶液中搅拌溶解，配制成内皮祖细胞DNA寡聚核苷酸适配子浓度为1μg/mL的2％聚乳酸溶液。将溶液喷涂在支架表面。如图3所示，在支架杆1表面(包括管腔内壁2和管腔外壁3)形成细胞捕获涂层4。
将抗黏附多肽RGD溶解在纯化水中，配制成浓度为5mg/mL的溶液。取100mL 溶液，向其中加入10gF127，搅拌溶解配置为溶胶。将溶胶滴加到支架孔内，待水分挥发后，重复滴加，如图3所示，直至孔5被抗黏附多肽6 填满。将干燥后的支架放入纯化水中清洗，去除表面游离多肽。氮气吹干支架，在4℃条件下保存。所述支架表面内皮祖细胞DNA寡聚核苷酸适配子的负载浓度为10ng/mm2，所述抗黏附多肽RGD在孔内的负载浓度为100μg/mm2。
实施例7
将L605裸金属支架切割成支架杆带孔的结构。10mg细胞捕获物质内皮祖细胞DNA寡聚核苷酸适配子溶解于10mL乙醇中，配制成浓度为1mg/mL的溶液。200mg聚乳酸，搅拌溶解于10mL乙酸正丙酯中，配制成2％的聚乳酸溶液。取100μL内皮祖细胞DNA寡聚核苷酸适配子溶液加入聚乳酸溶液中搅拌溶解，配制成内皮祖细胞DNA寡聚核苷酸适配子浓度为1μg/mL的2％聚乳酸溶液。将溶液喷涂在支架表面。如图3所示，在支架杆1表面(包括管腔内壁2和管腔外壁3)形成细胞捕获涂层4。
将抗黏附多肽RGD肽八聚体溶解在纯化水中，配制成浓度为5mg/mL的溶液。取100mL溶液，向其中加入10g F127，搅拌溶解配置为溶胶。将最终溶胶滴加到支架孔内，待水分挥发后，重复滴加，如图3所示，直至孔5被抗黏附多肽6填满。将干燥后的支架放入纯化水中清洗10分钟，去除表面游离肽。氮气吹干支架，在4℃条件下保存。所述支架表面内皮祖细胞DNA寡聚核苷酸适配子的负载浓度为10μg/mm2，所述抗黏附多肽RGD肽八聚体在孔内的负载浓度为100μg/mm2。
实施例8
将L605裸金属支架切割成支架杆带孔的结构。100mg细胞捕获物质 TPSLEQRTVYAK多肽溶解于10mL氯仿中，配制成浓度为10mg/mL的溶液。200mg 聚乳酸，搅拌溶解于10mL乙酸正丙酯中，配制成2％的聚乳酸溶液。取100μL TPSLEQRTVYAK多肽溶液加入聚乳酸溶液中搅拌溶解，配制成TPSLEQRTVYAK多肽浓度为1μg/mL的2％聚乳酸溶液。将溶液喷涂在支架表面。如图3所示，在支架杆1表面(包括管腔内壁2和管腔外壁3)形成细胞捕获涂层4。
将抗黏附多肽RGD肽四聚体溶解在纯化水中，配制成浓度为5mg/mL的溶液。取100mL溶液，向其中加入10gF127，搅拌溶解配置为溶胶。将最终溶胶滴加到支架孔内，待水分挥发后，重复滴加，如图3所示，直至孔5 被抗黏附多肽6填满。将干燥后的支架放入纯化水中清洗10分钟，去除表面游离肽。氮气吹干支架，在4℃条件下保存。所述支架表面TPSLEQRTVYAK多肽的负载浓度为100μg/mm2，所述抗黏附多肽RGD肽四聚体在孔内的负载浓度为 100μg/mm2。
实施例9
将支架切割成支架杆带孔的结构。按实施例1中方法在支架杆管腔内壁2 负载AC133抗体。接着在支架外表面(支架杆外壁)喷涂雷帕霉素药物。如图 6所示，获得管腔内壁2具有捕获内皮祖细胞功能的细胞捕获层4，管腔外壁3 具有抑制再狭窄功能药物涂层7的支架。
将抗黏附多肽c-(RGDfK)溶解在纯化水中，配制成浓度为5mg/mL的溶液。取100mL溶液，向其中加入10gF127，搅拌溶解配置获得溶胶。将最终溶胶滴加到支架孔内，待水分挥发后，重复滴加，如图6所示，直至孔5 被抗黏附多肽6填满。将干燥后的支架放入纯化水中清洗，去除表面游离肽。氮气吹干支架，在4℃条件下保存。所述支架表面AC133抗体的负载浓度为10 μg/mm2，所述支架雷帕霉素药物负载浓度为5μg/mm2，所述抗黏附多肽c-(RGDfK)在孔内的负载浓度为100μg/mm2。
实施例10
将L605裸金属支架切割成支架杆带孔的结构。20μg细胞捕获物质 TPSLEQRTVYAK多肽溶解于10mL氯仿中，配制成浓度为2μg/mL的溶液。200mg 聚乳酸，搅拌溶解于10mL乙酸正丙酯中，配制成2％的聚乳酸溶液。取100μL TPSLEQRTVYAK多肽溶液加入聚乳酸溶液中搅拌溶解，配制成TPSLEQRTVYAK多肽浓度为1μg/mL的2％聚乳酸溶液。将溶液喷涂在支架内表面，如图6所示，管腔内壁2负载了细胞捕获涂层4，管腔外壁3无涂层。
将抗黏附多肽RGD肽四聚体溶解在纯化水中，配制成浓度为5mg/mL的溶液。取100mL溶液，向其中加入10gF127，搅拌溶解配置为溶胶。将最终溶胶滴加到支架孔内，待水分挥发后，重复滴加，如图6所示，直至孔被抗黏附多肽6填满。将干燥后的支架放入纯化水中清洗10分钟，去除表面游离肽。氮气吹干支架，在4℃条件下保存。所述支架表面TPSLEQRTVYAK多肽的负载浓度为1μg/mm2，所述抗黏附多肽RGD肽四聚体在孔内的负载浓度为100 μg/mm2。
实施例11
将支架切割成管腔内壁挖槽的结构。如图7所示，按实施例1中方法在支架杆1表面(管腔内壁2和外壁3)负载AC133抗体，获得细胞捕获涂层4。
抗黏附多肽YIGSR多聚体n(n＝2-10)溶解在纯化水中，配制成浓度为5mg/mL 的溶液。取100mL溶液，向其中加入10gF127，搅拌溶解配置成溶胶。将最终溶胶滴加到支架槽内，待水分挥发后，重复滴加，如图7所示，直至槽8被抗黏附多肽6填满。将干燥后的支架放入纯化水中清洗10分钟，去除表面游离肽。氮气吹干支架，在4℃条件下保存。所述支架表面AC133抗体的负载浓度为10μg/mm2，所述抗黏附多肽YIGSR多聚体在槽内的负载浓度为 100μg/mm2。
实施例12
将支架切割成管腔内壁挖槽的结构。如图7所示，按实施例1中方法在支架杆1表面(管腔内壁2和外壁3)负载CD133-1(AC133)抗体，获得细胞捕获涂层4。
将抗黏附多肽RGD、YIGSR杂化多聚体(RGD)m-(YIGSR)n(m＝2-10,n＝2-10)溶解在纯化水中，配制成浓度为5mg/mL的溶液。取100mL溶液，向其中加入10 gF127，搅拌溶解配置成溶胶。将最终溶液滴加到支架槽内，待水分挥发后，重复滴加，如图7所示，直至槽8被抗黏附多肽6填满。将干燥后的支架放入纯化水中清洗10分钟，去除表面游离肽。氮气吹干支架，在4℃条件下保存。所述支架表面AC133抗体的负载浓度为10μg/mm2，所述抗黏附多肽在槽内的负载浓度为100μg/mm2。
实施例13
将支架切割成管腔内壁挖槽的结构。按实施例1中方法制备AC133抗体负载支架。接着在支架管腔外表面喷涂雷帕霉素药物涂层。如图8所示，获得管腔内壁2具有捕获内皮祖细胞功能的细胞捕获涂层4，管腔外壁3具有抑制再狭窄功能的药物涂层5。
将抗黏附多肽RGD、YIGSR杂化多聚体(RGD)m-(YIGSR)n(m＝2-10,n＝2-10) 溶解在纯化水中，配制成浓度为5mg/mL的溶液。取100mL溶液，向其中加入 10gF127，搅拌配置为溶胶。将最终溶胶滴加到支架槽内，待水分挥发后，重复滴加，如图8所示，直至槽8被抗黏附多肽6填满。将干燥后的支架放入纯化水中清洗，去除表面游离肽。氮气吹干支架，在4℃条件下保存。所述支架表面AC133抗体的负载浓度为10μg/mm2，所述支架表面雷帕霉素药物负载浓度为5μg/mm2，所述抗黏附多肽在槽内的负载浓度为100μg/mm2。
实施例14
将支架切割成管腔内壁挖槽的结构。1mg细胞捕获物质TPSLEQRTVYAK多肽溶解于10mL氯仿中，配制成浓度为100μg/mL的溶液。200mg聚乳酸，搅拌溶解于10mL乙酸正丙酯中，配制成2％的聚乳酸溶液。取100μL TPSLEQRTVYAK 多肽溶液加入聚乳酸溶液中搅拌溶解，配制成TPSLEQRTVYAK多肽浓度为1μg/mL 的2％聚乳酸溶液。将溶液喷涂在支架内表面，如图9所示，获得支架杆1管腔内壁2负载细胞捕获涂层4，管腔外壁3无涂层的支架。
将抗黏附多肽RGD肽四聚体溶解在纯化水中，配制成浓度为5mg/mL的溶液。取100mL溶液，向其中加入10gF127，搅拌溶解配置为溶胶。将最终溶胶滴加到支架槽内，待水分挥发后，重复滴加，如图9所示，直至槽8 被抗黏附多肽6填满。将干燥后的支架放入纯化水中清洗10分钟，去除表面游离肽。氮气吹干支架，在4℃条件下保存。所述支架表面TPSLEQRTVYAK多肽的负载浓度为50μg/mm2，所述抗黏附多肽RGD肽四聚体在槽内的负载浓度为 100μg/mm2。
实施例15
将支架切割成管腔内壁挖槽的结构。支架涂覆具有磁性的金属镍涂层，利用强磁场磁化镍涂层；将支架放置于AC133抗体磁珠溶液中，使得AC133抗体磁珠被镍涂层磁力吸附到支架表面，获得负载AC133抗体的支架。
将抗黏附多肽YIGSR多肽溶解在纯化水中，配制成浓度为5mg/mL的溶液。取100mL溶液，向其中加入10gF108，搅拌配置获得溶胶。将最终溶胶滴加到支架槽内，待水分挥发后，重复滴加直至槽被填满。将干燥后的支架放入纯化水中清洗，去除表面游离多肽。氮气吹干支架，在4℃条件下保存。所述支架表面AC133抗体的负载浓度为10μg/mm2，所述抗黏附多肽在槽内的负载浓度为100μg/mm2。
实施例16
将支架切割成管腔内壁挖槽的结构。支架涂覆具有磁性的金属镍涂层，利用强磁场磁化镍涂层。将抗黏附多肽YIGSR多肽溶解在纯化水中，配制成浓度为5mg/mL的溶液。取100mL溶液，向其中加入10gF108，搅拌配置获得溶胶。将最终溶胶滴加到支架槽内，待水分挥发后，重复滴加直至槽被填满。将干燥后的支架放入纯化水中清洗，去除表面游离多肽。氮气吹干支架，在4℃条件下保存。所述抗黏附多肽在槽内的负载浓度为100μg/mm2。
用CD133磁珠从兔血液中提取内皮祖细胞，并将细胞置于超顺磁氧化铁纳米粒子溶液中，使其吞噬磁性粒子后具有磁性。支架植入兔髂动脉血管后，将吞噬了超顺磁氧化铁纳米粒子的内皮细胞通过输送器输送到支架段血管内，通过支架的磁性作用将具备磁性的内皮祖细胞富集在支架表面。最后，再将导管撤出。随着支架内负载的抗黏附多肽YIGSR多肽向血液中的释放，可排除其他种类的细胞向支架表面的黏附，促进支架的快速内皮化。
实施例17
用静电层层自组装法制备AC133抗体负载支架。进行支架植入手术时，首先经导管在植入位置输送浓度为5mg/mL的YIGSR聚多肽溶液100mL，接着植入抗体负载支架。术后7-14天内，每天静脉注射YIGSR聚多肽溶液，剂量为50 mg-5g。
实施例18
用静电层层自组装法制备AC133抗体负载封堵器。进行植入手术时，首先经导管在植入位置输送浓度为5mg/mL的抗黏附多肽RGD溶液100mL，接着植入抗体负载封堵器。术后7-14天内，每天静脉注射RGD溶液，剂量为50mg-5g。
实施例19
用静电层层自组装法制备AC133抗体负载人工瓣膜。进行植入手术时，首先经导管在植入位置输送浓度为5mg/mL的抗黏附多肽RGD溶液100mL，接着植入抗体负载人工瓣膜。术后7-14天内，每天静脉注射RGD溶液，剂量为50mg-5 g。
实施例20
用静电层层自组装法制备AC133抗体负载人工血管。进行植入手术时，首先经导管在植入位置输送浓度为5mg/mL的RGD溶液100mL，接着植入抗体负载人造血管。术后7-14天内，每天静脉注射RGD溶液，剂量为50mg-5g。

Claims (18)

1.一种抗黏附多肽在制备植入医疗器械中的应用，其特征在于，所述植入医疗器械在特异性地捕获细胞时释放所述抗黏附多肽。
2.根据权利要求1所述的抗黏附多肽在制备植入医疗器械中的应用，其中，所述抗黏附多肽是选自RGD、RGD多肽衍生肽、YIGSR、RGD聚多肽和YIGSR聚多肽中的一种或两种以上。
3.根据权利要求1所述的抗黏附多肽在制备植入医疗器械中的应用，其中，所述植入医疗器械通过磁力或特异性识别分子捕获细胞。
4.一种植入医疗器械，其特征在于，所述植入医疗器械负载有特异性细胞捕获物质及抗黏附多肽。
5.根据权利要求4所述的植入医疗器械，其中，所述植入医疗器械为带孔支架或挖槽支架，当所述植入医疗器械为带孔支架时，所述抗黏附多肽负载在孔内，当所述植入医疗器械为挖槽支架时，所述抗黏附多肽负载在槽内。
6.根据权利要求5所述的植入医疗器械，其中，所述支架孔或槽内负载的抗黏附多肽的浓度为：10μg/mm2～1000μg/mm2。
7.根据权利要求4～6任一所述的植入医疗器械，其中，所述抗黏附多肽是选自RGD、RGD多肽衍生肽、YIGSR、RGD聚多肽和YIGSR聚多肽中的一种或两种以上。
8.根据权利要求4～6任一所述的植入医疗器械，其中，所述特异性细胞捕获物质为磁性金属涂层或特异性识别分子，所述特异性识别分子特异性识别内皮细胞、内皮前体细胞或内皮祖细胞。
9.根据权利要求8所述的植入医疗器械，其中，所述磁性金属涂层为磁性金属镍涂层。
10.根据权利要求8所述的植入医疗器械，其中，所述特异性识别分子为针对内皮细胞、内皮前体细胞或内皮祖细胞相应标志物的抗体、多肽或寡聚核苷酸适配子。
11.根据权利要求10所述的植入医疗器械，其中，所述针对内皮细胞、内皮前体细胞或内皮祖细胞相应标志物的抗体为选自抗CD133、抗AC133、抗CD34和抗VEGFR-2中的一种或两种以上。
12.根据权利要求11所述的植入医疗器械，其中，负载所述抗体的浓度为：10μg/mm2～1000μg/mm2。
13.根据权利要求10所述的植入医疗器械，其中，所述针对内皮细胞、内皮前体细胞或内皮祖细胞相应标志物的多肽为TPSLEQRTVYAK。
14.根据权利要求13所述的植入医疗器械，其中，负载所述
TPSLEQRTVYAK多肽的浓度为：1μg/mm2～100μg/mm2。
15.根据权利要求10所述的植入医疗器械，其中，负载所述寡聚核苷酸适配子的浓度为：10ng/mm2～10μg/mm2。
16.权利要求5-15的任一项所述的植入医疗器械的制备方法，其特征在于，包括将所述特异性细胞捕获物质负载在所述植入医疗器械的至少一部分表面的工序和将所述抗黏附多肽负载在所述植入医疗器械的孔内或槽内的工序。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其中，将所述抗黏附多肽负载在所述植入医疗器械的至少一部分表面的工序为：将所述抗黏附多肽用溶液溶解，将所述溶液注入所述植入医疗器械的孔内或槽内，待溶剂挥发后，所述抗黏附多肽附着在孔壁或槽壁上。
18.权利要求16所述的制备方法，其中，将所述抗黏附多肽负载在所述植入医疗器械的至少一部分表面的方法为：将所述抗黏附多肽包裹在嵌段聚合物胶束内，配制成溶胶注入所述植入医疗器械的孔或槽内，待溶剂挥发后再继续注入，直至孔或槽被填满。
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