CN112105648A - 细胞介导的外泌体递送 - Google Patents

Abstract

本发明涉及经工程化的细胞，所述经工程化的细胞能够实现外泌体介导的治疗货物递送，特别是蛋白治疗物和RNA治疗物。本发明还涉及具有创造性的多核苷酸、多肽和药物组合物。

Description

细胞介导的外泌体递送

技术领域

本发明涉及经工程化的细胞，所述经工程化的细胞能够实现内源性外泌体介导的治疗货物递送，特别是蛋白治疗物和RNA治疗物的递送。

背景技术

即便不是全部，但大多数细胞会释放EV，EV影响着邻近细胞或远距离细胞。EV的三种主要类型是外泌体、微囊泡(MV)和凋亡小体，其共同特征是它们是被脂质双分子层包裹的细胞来源的囊泡，根据来源不同，直径范围为30-2000nm。与直接从质膜出芽的MV(直径约为200-1000nm)不同，外泌体(直径为50-200nm)源自内溶酶体途径。已从大多数体液中分离出EV，并且越来越明显的是，它们不仅在调节正常生理过程(诸如干细胞维持、组织修复和免疫监视)中发挥关键作用，而且还在一系列疾病潜在的病理学中发挥关键作用。EV以多效性方式发挥其生物效应；经由蛋白和生物活性脂质配体直接激活受体细胞上的细胞表面受体，或递送效应子，包括蛋白和RNA(例如，微小RNA(miRNA)和mRNA)。此类广泛的生物学功能表明，EV可能具有先天治疗潜力，例如，在再生医学和恶性疾病领域。除了EV的先天治疗能力外，人们越来越关注其将RNA和蛋白自然输送至细胞中的能力，这可能使它们成为理想的非病毒药物递送媒介物。确实，现今已有许多研究均涉及到EV在递送miRNA和其他外源大分子药物方面的潜力。例如，外泌体的RNA转运能力，并利用其递送治疗性siRNA(例如，WO2010/119256)。Heusermann等人，JCB，2016强调了EV通过快速动力学并且作为单个囊泡而非聚集体，以类似于病毒的方式被受体细胞摄入。因此，EV摄取是快速过程，它赋予了EV在体外和体内将大分子货物递送至受体细胞的独特特性。

CAR T细胞是具有嵌合抗原受体的T细胞，同时识别与B细胞受体相似的抗原，但T细胞会作出应答。使用靶向CD19的CAR T细胞已经显示出CAR T细胞治疗的潜力，所述细胞可根除大肿瘤，甚至据报道，其还适于治疗脑转移瘤。然而，对于实体瘤，这些治疗尚未获得成功。两个主要障碍阻止了CAR T治疗对实体瘤的有效性。第一主要障碍是尽管进行了大量的投资和严格的研究，但很难识别出仅在肿瘤细胞上表达的抗原。由于CAR T治疗通常非常有效，因此如果抗原出现在非肿瘤细胞上，副作用通常会危及生命。CD19存在于所有B细胞上，但是由于有免疫球蛋白替代治疗可用，患者在治疗后无需B细胞也可存活，但是当将CART设计为靶向实体肿瘤时，这种不良事件缓解策略并不适用。第二主要障碍是实体肿瘤的微环境中存在的免疫调节机制，这会阻止CAR T细胞完全激活。为了克服CAR T细胞在遇到抗原后仅产生T细胞应答的缺点，已经开发出SynNotch受体，所述SynNotch受体摄取经工程化的细胞并且这些经工程化的细胞的应答超过现有CAR T细胞(例如，如专利申请WO2017193059和US20170233474中所述)。Notch受体是进化的旧受体，所述受体在与相邻细胞上的其配体结合时将控制转录。仅当配体存在于另一个细胞上时，受体才被激活。如果配体出现在同一细胞上，则所述受体被抑制并且也不被可溶性配体激活。当Notch受体与配体结合时，受体的表征发生变化，并且这使若干切割蛋白骨架的蛋白酶切割位点暴露。这随后在细胞质侧释放转录因子(TF)，作为对受体配体相互作用的应答，所述转录因子越过细胞核并开始转录靶基因。对于SynNotch系统，细胞外识别结构域已被交换为例如scFv、纳米抗体或肽，因此理论上所述受体可以识别任何细胞表面靶。此外，将受体的TF部分工程化为包括人工来源的TF，而不是正常结构域。细胞进一步带有对抗原识别后释放的人工TF作出应答的感应元件。迄今为止，SynNotch系统已用于在细胞外环境中激活后递送治疗剂，诸如细胞因子和抗体。然而，尚未解决的一个问题是如何使细胞分泌可渗透邻近细胞并影响受体细胞的细胞质或细胞核中的蛋白和/或RNA的治疗活性分子，并由此极大地增加SynNotch技术和相似平台的可成药靶标。

发明内容

因此，本发明的目的是通过产生治疗性EV(优选为外泌体)而产生对其环境作出应答的细胞。此外，本发明旨在满足本领域中的现有需求，例如，确保对细胞外环境内的组分作出应答的模块化检测系统，诱导载有治疗剂的EV的表达，提供仅在刺激剂存在下作出应答的细胞开/关治疗系统，递送生物制剂(诸如RNA和蛋白)的手段，将复合的、细胞产生的生物分子递送入靶细胞的方法，以及，最后，使用组织特异性内源性细胞递送治疗剂的手段。

本发明通过对细胞进行基因工程化以表达嵌合多肽受体来实现这些目的和其他目的，所述嵌合多肽受体与其靶标结合后诱导基因产物表达以被载入EV中。因此，我们将工程化的EV与嵌合抗原受体技术进行了创新结合，以构建在受到既定抗原刺激后分泌计划EV的细胞。这扩展了CAR-T(和其他基于CAR的方法)及嵌合抗原受体(例如，SynNotch)技术的范围，从而能够将大分子药物直接递送至特定微环境中的受体细胞的细胞质中和/或递送至靶器官、器官系统或组织中的特定环境中。因此，与现有细胞治疗相比，这带来几项优势：(1)治疗将具有高度特异性，因为治疗性EV(通常为外泌体)的激活和随后的分泌仅在确定抗原(defined antigen)存在的情况下发生。另外，将从载入EV的治疗货物(诸如miRNA)进一步实现特异性，所述治疗货物可以被设计成对仅存在于患病细胞中的靶标具有高度特异性。(2)所述特异性将消除采用先前基于细胞的治疗(诸如常规CAR T细胞治疗)时所见的非特异性副作用。(3)由于第1点和第2点，现在可以利用因重度副作用而无法用于CAR T细胞治疗的抗原。(4)所述系统将使不可成药的靶标成药。理论上，使用嵌合抗原受体技术和工程化的外泌体的创造性组合可以靶向任何基因和/或非编码RNA。(5)可以操纵不同的细胞类型，例如，T细胞、巨噬细胞、NK细胞、DC细胞、间充质基质细胞、羊膜来源的细胞、HEK细胞等，并将其用作活性治疗细胞。(6)所述系统将非常适用，因为受体所识别的治疗性货物分子和/或抗原易于交换。因此，所述系统可以简单地进行调控以用于治疗癌症和非恶性疾病两者。

在第一方面中，本发明涉及一种经基因修饰以产生嵌合多肽受体的细胞，所述嵌合多肽受体包含(i)细胞外识别结构域、(ii)至少一个蛋白酶切割位点和(iii)细胞内转录因子。细胞外识别结构域与其靶标的结合诱导至少一个蛋白酶切割位点发生蛋白水解切割，随后所述细胞内转录因子诱导编码基因产物的至少一种多核苷酸的诱导内源性转录，所述基因产物包含至少一种外泌体多肽。在优选的实施例中，所述基因产物还包含目的蛋白(POI)。由于存在可以与POI共价连接(例如，作为融合蛋白)或非共价连接的外泌体多肽，POI将被转运入EV(例诸如外泌体)中，并被递送至靶细胞。

在另一方面中，本发明涉及一种由经基因修饰的细胞产生的细胞外囊泡(EV)。这些EV(即EV群体)包含基因产物，如上所述，所述基因产物通常包含与POI融合和/或以其他方式与POI连接的至少一种外泌体多肽。在优选的实施例中，所述EV是外泌体。

在又一方面中，本发明涉及一种重组表达载体，所述重组表达载体包含编码基因产物的多核苷酸。此外，本发明涉及一种由多核苷酸编码的基因产物。

在再一方面中，本发明涉及一种编码嵌合多肽受体的重组表达载体，即，至少部分地在细胞表面展示并且至少包含以下结构域的多肽：(i)细胞外识别结构域、(ii)至少一个蛋白酶切割位点和(iii)细胞内转录因子，以驱动产生基因产物。

在还一方面中，本发明涉及一种产生治疗效果的方法，视体内、离体和/或体外而定，所述方法包括：

(i)离体或在体外将包含编码基因产物的多核苷酸的重组表达载体和编码嵌合多肽受体的重组表达载体引入细胞；

(ii)将经基因修饰的细胞施用于个体。

在又一方面中，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的经基因修饰的细胞，并且，此外，本发明还涉及此类经基因修饰的细胞和/或包含此类细胞的药物组合物在医药中的用途，例如，在预防和/或治疗癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、遗传性疾病、感染性疾病、代谢性疾病、CNS疾病、溶酶体贮积病和神经退行性疾病中的用途。

附图说明

图1：基于从激活的K652细胞产生的EV的荧光素酶测定，所述激活的K652细胞包含靶向CD19的嵌合多肽受体，并且还包含编码外泌体蛋白CD63和报告POI NanoLuc的多核苷酸。在由CD19激活后，K562细胞产生CD63-NanoLuc，CD63-NanoLuc随后被载入由所述细胞产生的EV中。

图2：使用基于外泌体蛋白CD63经由可自切割的内含肽与Cre蛋白融合的Cre-EV负载策略，在摄取载有Cre重组酶的EV后，报告细胞发生红色至绿色的荧光转换。如实例1所用，在由CD19抗原激活后，K562细胞产生载有Cre重组酶的EV。报告CD19+ve MDA-MD-231细胞系随后的摄取表明从绿色荧光转换为红色荧光。

图3：摄取p53 mRNA后，p53感应肿瘤细胞发生细胞死亡。在实例1中由CD19抗原激活后，K562细胞产生p53 mRNA，以及从多核苷酸表达基因产物，所述基因产物包含RNA结合蛋白PUF的RNA结合结构域，以EV负载包含PUF蛋白结合位点的p53 mRNA。由于外泌体递送的p53 mRNA翻译，随后p53感应肿瘤细胞系的摄取导致细胞死亡。

图4：卵巢癌细胞在暴露于由supT1细胞产生的负载粒酶B的外泌体后发生细胞死亡。由supT1细胞表达的嵌合多肽受体的scFv与卵巢癌细胞表达的CA-125肿瘤抗原之间的相互作用。细胞死亡以剂量依赖性方式发生。作为目的蛋白的粒酶B由编码POI和外泌体蛋白Lamp2B的多核苷酸编码，这使得能够将粒酶B转运入supT1细胞产生的EV中。图4的黑色柱表示工程化为靶向CA125的supT1细胞，并且在其与靶标接合后产生包含与CA-125阳性细胞混合的粒酶B的EV；白色柱示出与CA-125阴性细胞混合的supT1抗CA-125粒酶B EV产生的细胞，且灰色柱示出与CA-125阳性细胞混合的不含编码基因产物的多核苷酸的supT1抗CA-125细胞。Y轴示出卵巢癌细胞的细胞死亡百分比。

图5：使用SynNotch嵌合多肽受体将永生化CEM(急性淋巴母细胞性淋巴瘤)细胞进行基因工程化以靶向乳腺癌细胞系T47D的MUC1，所述SynNotch嵌合多肽受体包含(i)抗MUC1的scFv、(ii)SynNotch受体核心蛋白和(iii)经由蛋白酶切割位点(S1)与SynNotch核心蛋白连接的人工转录因子Gal4VP64。当scFv与MUC1在靶T47D细胞上相互作用时，Gal4VP64被释放并激活EV蛋白CD63的表达，所述EV蛋白CD63与自切割内含肽融合，所述自切割内含肽转而又与FCU1融合，从而将FCU1引导进入EV，在EV中内含肽被切割并释放出游离的FCU1。随后，载有FCU1的EV被T47D细胞摄入，并在施用5-氟尿嘧啶后细胞发生凋亡。图5中的黑色柱表示与完整scFv-SynNotch-Gal4VP64混合的MUC1阳性T47D细胞，其展示包含CD63-内含肽-FCU1多核苷酸构建体的CEM细胞；白色柱表示与完整SynNotch CEM细胞混合的MUC1阴性T47D细胞；灰色柱示出与CEM细胞混合的MUC1阳性T47D细胞，其仅包含嵌合多肽受体的SynNotch-Gal4VP64部分，但具有编码功能性CD63-内含肽-FCU1的多核苷酸(以质粒DNA的形式)。从图中可以看出，在与包含编码外泌体蛋白(CD63)和POI(FCU1)的多核苷酸的完全功能性SynNotch CEM细胞混合的情况下，在MUC1阳性组中T47D细胞仅在施用5-氟尿嘧啶后进入凋亡状态。Y轴示出T47D细胞的细胞死亡百分比。

图6：使用包含以下组分的嵌合多肽受体转导原代人T细胞：(i)抗PSMA的骆驼科纳米抗体、(ii)TNFR的跨膜结构域，其使得能够在抗PSMA的骆驼科纳米抗体的细胞表面上展示、(iii)Notch细胞内结构域(NID)的转录因子(所述NID包含S2金属蛋白酶切割位点)，所述转录因子通过S2位点的切割而被释放。T细胞也经工程化以包含编码基因产物CD81-PUF(其中PUF是mRNA结合蛋白)的NID应答多核苷酸，以及在3'UTR中具有PUF结合位点的PTENmRNA。当在嵌合多肽受体激活之后进行表达时，PTEN mRNA中PUF与PUF结合位点之间的相互作用会主动将mRNA载入EV中。图6示出与PC3 PSMA阳性细胞混合的抗PSMA+、CD63-PUF+和PTEN mRNA+ T细胞；白色柱表示与PC3 PSMA阴性细胞混合的抗PSMA+、CD63-PUF+和PTENmRNA+ T细胞，灰色柱示出与PC3 PSMA阳性细胞混合的抗PSMA+、CD63-PUF+，无PTEN mRNA T细胞与之混合；而且，点状柱示出与PC3 PSMA阳性细胞混合的仅CD63-PUF+和PTEN mRNA+细胞，无抗PSMA嵌合受体T细胞与之混合。从图中可以看出，通过流式细胞仪分析，仅抗PSMA+、CD63-PUF+和PTENmRNA+ T细胞诱导细胞凋亡增加。

图7：使用与SynNotch受体融合的抗CD19单链抗体以及编码与EV蛋白CD81连接的CFTR蛋白的多核苷酸，转导原代自然杀伤(NK)细胞。将NK细胞与HEK 293T细胞混合，且共培养3天后，除去NK细胞并测量I¹²⁵的流量。图7中带有三角形的黑线示出与抗CDI 9-SynNotch-CFTR细胞混合的对CD19呈阳性的HEK细胞；带黑框的灰线示出与抗CD19-SynNotch-CFTR细胞混合的对CD19呈阴性的HEK细胞；而且，带空框的黑线示出与不含CFTR编码多核苷酸的抗CD19-SynNotch细胞混合的对CD19呈阳性的HEK细胞。Y轴是碘化物¹²⁵的流出速率(k/min)，而x轴表示时间(以分钟计)。

具体实施方式

本发明涉及一种经工程化的细胞，通常是细胞系或原代细胞，其通过嵌合多肽受体对特定细胞外刺激作出应答，所述嵌合多肽受体包含细胞外识别结构域、蛋白酶切割位点和转录因子，所述转录因子的激活导致产生载有例如目的蛋白的EV，任选地，与另一货物分子(例如，治疗性RNA货物)组合。因此，本发明提供了用于非常复杂的生物系统的高度可修饰的、可靶向的和模块化的递送媒介物，所述生物系统无法通过其他方式进行递送。

为了方便和清楚起见，以下收集并描述了本文采用的某些术语。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。

术语“细胞外囊泡”或“EV”或“外泌体”应被理解为涉及例如可从细胞获得的任何类型的囊泡，例如，微囊泡(例如，从细胞质膜脱落的任何囊泡)、外泌体(例如，内溶酶体途径来源的任何囊泡)、凋亡小体(例如，可从凋亡细胞获得)、微粒(可以源自例如血小板)、核外粒体(例如，可源自血清中的中性粒细胞和单核细胞)、前列腺小体(例如，可从前列腺癌细胞获得)或心脏小体(例如，可源自心脏细胞)等。此外，在一些实施例中，所述术语应被理解为还涉及细胞外囊泡模拟物，通过膜挤出或其他技术等获得的细胞膜囊。本质上，本发明可以涉及任何类型的基于脂质的结构(具有囊泡形态或具有任何其他类型的合适形态)，其可以用作泛素连接酶递送或转运媒介物并任选地用作抗体。对于本领域技术人员将显而易见的是，当描述EV的医学和科学用途和应用时，本发明通常涉及多个EV，即EV群体，其可以包含数千、数百万、数十亿或甚至数万亿或甚至更多个EV。同样，术语“群体”应被理解为涵盖在一起构成此类群的多个实体。换句话说，当单个EV以多个存在时构成EV群体。因此，自然地，本领域技术人员将清楚的是，本发明既涉及单个EV又涉及EV群体。类似推理自然适用于本发明的经基因修饰的细胞，即，本发明既涉及单个细胞又涉及此类细胞的群体。

术语“EV蛋白”与“EV多肽”以及“外泌体多肽”与“外泌体蛋白”等在本文可互换使用，并且应被理解为涉及可用以将多肽构建体的任何多肽(通常包括，除了外泌体蛋白以外的至少一种目的蛋白和/或至少任何其他类型的目的生物分子，通常用于治疗应用)转运至合适的囊泡结构，即至合适的EV，通常是外泌体。更具体地，这些术语应被理解为包含能够将融合蛋白构建体转运、运输或穿梭至囊泡结构(诸如EV)的任何多肽。此类外泌体多肽的实例是例如CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71(也称为转铁蛋白受体)及其外泌体分选结构域(即转铁蛋白受体外泌体分选结构域)、CD133、CD138(多配体蛋白聚糖-1)、CD235a、ALIX、多配体蛋白聚糖结合蛋白-1(Syntenin-1)、多配体蛋白聚糖结合蛋白-2(Syntenin-2)、Lamp2、Lamp2b、多配体蛋白聚糖-2、多配体蛋白聚糖-3、多配体蛋白聚糖-4、TSPAN8、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受体、白介素受体、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II组分、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、TSG101、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、PTGFRN、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B、其他外泌体多肽及其任何组合，但是，能够将多肽构建体转运至EV的许多其他多肽也包括在本发明的范围内。通常，在本发明的许多实施例中，将至少一种外泌体多肽与至少一种POI融合以形成融合蛋白，所述融合蛋白被转运至EV，然后EV由经基因修饰的细胞分泌。此类POI可具有固有治疗效果(诸如在为抗体、双特异性或多特异性抗体衍生物、双特异性T细胞衔接子(BiTE)、细胞因子、酶等的情况下)，但它们还可充当其他治疗剂的载体蛋白，所述其他治疗剂为例如RNA分子，诸如shRNA或mRNA。此类融合蛋白还可包含各种其他组分以优化其功能，包括接头、跨膜结构域、胞质结构域、多聚化结构域等。本文提及的蛋白和多肽优选是人源的，但也可从其他哺乳动物或非哺乳动物获得。

在第一方面中，本发明涉及一种经基因工程化的细胞，其包含嵌合多肽，所述嵌合多肽包含细胞外识别结构域、至少一个蛋白酶切割位点和细胞内转录因子(TF)。通过细胞外识别结构域与其靶标(其通常存在于靶细胞或者靶器官或组织上)的相互作用，蛋白酶切割结构域进行切割以释放细胞内TF。一经释放，TF则激活多核苷酸转录，所述多核苷酸存在于细胞中且其编码基因产物，所述基因产物包含至少一种通常与POI融合的外泌体多肽，POI随后被转运至EV中。TF通常与多核苷酸的特定多核苷酸调节元件结合，从而诱导基因产物转录。在有益的实施例中，POI是治疗性目的蛋白或是能够将由经工程化的细胞产生的另一种生物分子转运至由所述细胞产生的EV(优选为外泌体)中的蛋白。

在实施例中，由TF通过内源性转录产生的基因产物是与通常具有治疗活性的目的蛋白(POI)融合的外泌体多肽。目的蛋白实质上可以是任何蛋白，例如：抗体、单链抗体或任何其他抗体衍生物(诸如双特异性或多特异性抗体或者抗体衍生物)、双特异性T细胞衔接子(BiTE)、受体、细胞因子(诸如白介素)、酶(诸如胱天蛋白酶)、粒酶、Cas、Cas9、检查点抑制剂、共刺激抑制剂、膜转运蛋白(诸如NPC-1或胱氨酸转运蛋白(cystinosine))、剪接因子、胞内抗体、单链可变片段(scFv)、亲和体、双特异性和多特异性抗体或结合子、受体、配体、用于例如酶替代治疗或基因编辑的酶、肿瘤抑制子、病毒或细菌抑制因子、细胞组分蛋白、DNA和/或RNA结合蛋白、DNA修复抑制因子、核酸酶、蛋白酶、整合酶、转录因子、生长因子、凋亡抑制因子和诱导因子、毒素(例如，假单胞菌外毒素)、结构蛋白、神经营养因子(诸如NT3/4)、脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)及其各自的亚基(诸如2.5Sβ亚基)、离子通道、膜转运体、蛋白稳定因子、细胞信号传导相关蛋白、翻译和转录相关蛋白、核苷酸结合蛋白、蛋白结合蛋白、脂质结合蛋白、糖胺聚糖(GAG)和GAG结合蛋白、代谢蛋白、细胞应激调节蛋白、炎症和免疫系统调节蛋白、线粒体蛋白和热休克蛋白等。在一个优选的实施例中，POI是CRISPR相关(Cas)多肽，以便能够在靶细胞中进行基因编辑。替代地，在另一优选实施例中，Cas多肽可以是催化失活的，以能够进行靶向基因工程化。又一替代方案可以是任何其他类型的CRISPR效应子，诸如单RNA指导的核酸内切酶Cpf1。其他优选的实施例包括选自包含以下各项的组的POI：用于溶酶体贮积病的酶，例如葡萄糖脑苷脂酶(诸如伊米苷酶)、α半乳糖苷酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶和艾杜硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶、加硫酶、酸性α葡萄糖苷酶、鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、半乳糖基神经酰胺酶、神经酰胺酶，α-N-乙酰半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、溶酶体酸性脂肪酶、酸性鞘磷脂酶、NPC1、NPC2、乙酰肝素磺酰胺酶、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、乙酰肝素-α-氨基葡萄糖苷-N-乙酰基转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸盐硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸盐硫酸酯酶、透明质酸酶、α-N-乙酰神经氨酸酶、GlcNAc磷酸转移酶、粘脂蛋白1、棕榈酰蛋白硫酯酶、三肽基肽酶I、棕榈酰蛋白硫酯酶1、三肽基肽酶1、battenin、linclin、α-D-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、天冬氨酰胺酶、α-L-岩藻糖苷酶、胱氨酸转运蛋白、组织蛋白酶K、硝酸盐转运蛋白、LAMP2和氨基己糖苷酶。在其他优选实施例中，POI可以是例如改变炎症应答的细胞内蛋白，例如，表观遗传蛋白(诸如甲基化酶和溴结构域)，或改变肌肉功能的细胞内蛋白，例如，转录因子(诸如MyoD或Myf5)，调节肌肉收缩力的蛋白，例如，肌球蛋白、肌动蛋白、钙/结合蛋白(诸如肌钙蛋白)，或结构蛋白(诸如肌营养不良蛋白、小型肌营养不良蛋白、微肌营养不良蛋白、肌养相关蛋白(utrophin)、肌联蛋白、伴肌动蛋白)，肌营养不良蛋白相关蛋白(诸如小肌营养蛋白、互生蛋白、中间丝蛋白(syncoilin)、结蛋白、肌聚糖蛋白、肌萎缩蛋白、肌长蛋白、聚集蛋白和/或福山蛋白(fukutin)。POI的其他实例包括趋化因子、趋化因子受体、嵌合抗原受体、细胞因子、细胞因子受体、分化因子、生长因子、生长因子受体、激素、代谢酶、病原体来源的蛋白、增殖诱导因子、受体、RNA指导的核酸酶、位点特异性核酸酶、小分子第二信使合成酶、T细胞受体、毒素来源的蛋白、转录激活子(transcriptionactivator)、转录阻遏因子(transcription repressor)、转录激活因子(transcriptionalactivator)、转录阻遏因子(transcriptional repressor)、翻译调节因子、翻译激活因子、翻译阻遏因子、激活免疫受体、抗体、凋亡抑制因子、凋亡诱导因子、工程化的T细胞受体、免疫激活因子、免疫抑制因子、抑制性免疫受体、RNA指导的DNA结合蛋白和二次结合触发的转录开关。除非通过其名称、任何其他命名法或本领域技术人员已知的方式另外指明，否则POI通常是人源蛋白或肽，并且可以在各种公开数据库(诸如Uniprot、RCSB等)中查找。

在本发明的一个实施例中，内源性转录后的基因产物是RNA结合蛋白(RBP)。RNA结合蛋白的非限制性实例包括hnRNPAl、hnRNPA2B1、DDX4、ADAD1、DAZL、ELAVL4、IGF2BP3、SAMD4A、TDP43、FUS、FMR1、FXR1、FXR2、EIF4A1-3、MS2外壳蛋白、Cas6、Cas9、PUF、PUF531、PUFx2、PUFeng和其他PUF结构域，以及其任何结构域、部分或衍生物。更广泛地，RNA结合蛋白和结构域的特定亚类，例如，mRNA结合蛋白(mRBP)、前rRNA结合蛋白、tRNA结合蛋白、小核或核仁RNA结合蛋白、非编码RNA结合蛋白和转录因子(TF)，也可以包括在基因产物中，并用以将RNA货物转运至EV(诸如外泌体)中。RNA结合POI的其他非限制性实例包括小RNA结合结构域(RBD)(其可以是单链和双链RBD(ssRBD和dsRBD)两者)，诸如DEAD、KH、GTP_EFTU、dsrm、G-patch、IBN_N、SAP、TUDOR、RnaseA、MMR-HSR1、KOW、RnaseT、MIF4G、zf-RanBP、NTF2、PAZ、RBM1CTR、PAM2、Xpo1、Piwi、CSD和Ribosomal_L7Ae。此类RNA结合结构域可以以多个(诸如在PUFx2的情况下)、单独或与他者组合存在，并且还可形成较大RNA结合蛋白构建体的一部分，只要保持它们的关键功能(即转运目的RNA货物(例如，mRNA或短RNA)的能力)即可。可通过RNA结合蛋白的方式将天然存在的RNA货物载入此类EV和外泌体。任选地，所述细胞可进一步经基因修饰以包含编码并产生或过表达RNA货物的核酸构建体。

待通过RBP转运的RNA治疗性货物可以选自例如以下非限制性RNA分类：mRNA、miRNA、shRNA、siRNA、IncRNA、ncRNA、piRNA、piwiRNA、circRNA、tRNA、rRNA、crRNA、TLR激活寡核苷酸以及其他任何目的RNA分子。在还一实施例中，可使用DNA货物代替RNA，以将目的DNA分子转运至EV中。在还一实施例中，具有优势的是目的RNA货物包含允许与RNA结合POI相互作用的结构域或基序。所述结构域和基序可位于通常在非翻译区(UTR)内的核苷酸的5'或3'末端附近，替代地，结构域和基序进一步远离可能在编码区内的多核苷酸末端。作为一个非限制性实例，其转录由嵌合多肽的TF激活的合适基因产物可以是CD63、CD81、Lamp2、多配体蛋白聚糖、Alix(即合适的外泌体蛋白/多肽)与PUF(RNA结合蛋白/多肽)之间的融合蛋白，所述融合蛋白将与适当的细胞内RNA基序结合，并使得RNA分子载入由细胞产生的EV中。这种细胞工程化策略是原位递送例如编码RNA分子(诸如编码治疗性合适蛋白的mRNA)或非编码RNA分子(例如，沉默RNA分子(诸如miRNA或shRNA))的高效方式，并且这种类型的细胞介导的原位EV递送是治疗恶性疾病(例如，实体或血液癌症)及潜在非恶性疾病的潜在转化方法。

在还一实施例中，细胞外识别结构域是抗体、抗体衍生物、单链片段、单链抗体、纳米抗体、单结构域抗体、骆驼科抗体(诸如美洲驼抗体)、非抗体识别支架、肽、受体的配体、粘附分子、受体、T细胞受体、细胞因子受体、白介素受体、细胞外基质组分或其任何组合。ScFv和其他类型的基于单链的识别蛋白(任选地源自抗体和抗体样蛋白)代表高度合适的细胞外识别结构域。细胞外识别结构域可与之结合的靶抗原的非限制性实例包括疾病相关抗原，例如，癌症相关抗原、自身免疫性疾病相关抗原、病原体相关抗原、炎症相关抗原等。例如，细胞外识别结构域可对癌症相关抗原具有特异性，例如，CD19、CD20、CD38、CD30、Her2/neu、ERBB2、CA125、MUC-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD44表面粘附分子、间皮蛋白、癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)、MAGE、MAGE-A1、IL-13R-a2、GD2等。癌症相关抗原还包括例如4-1BB、5T4、腺癌抗原、甲胎蛋白、BAFF、B淋巴瘤细胞、C242抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、C-MET、CCR4、CD152、CD19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD4、CD40、CD44v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CEA、CNT0888、CTLA-4、DRS、EGFR、EpCAM、CD3、FAR、纤连蛋白外结构域B、叶酸受体1、GD2、GD3神经节苷脂、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、人分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-1、IgG1、L1-CAM、IL-13、IL-6、胰岛素样生长因子I受体、整合蛋白α5β1、整合蛋白αvβ3、MORAb-009、MS4A1、MUC1、粘蛋白CanAg、N-羟乙酰神经氨酸、NPC-1C、PDGF-Rα、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、TAG-72、腱生蛋白C、TGFβ2、TGF-β、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2和波形蛋白。在替代实施例中，抗原可与炎症或自身免疫性疾病相关，诸如1型糖尿病、多发性硬化、视神经脊髓炎、类风湿关节炎。炎症疾病相关抗原的非限制性实例包括例如AOC3(VAP-1)、CAM-3001、CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1)、CD125、CD147(基础免疫球蛋白)、CD154(CD40L)、CD2、CD20、CD23(IgE受体)、CD25(IL-2受体的α链)、CD3、CD4、CD5、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE Fc区、IL-1、IL-12、IL-23、IL-13、IL-17、IL-17A、IL-22、IL-4、IL-5、IL-5、IL-6、IL-6受体、整合蛋白a4、整合蛋白α4β7、LFA-1(CD11a)、肌生长抑制蛋白、OX-40、硬化蛋白、SOST、TGFβ1、TNF-α和VEGF-A。

在还一实施例中，细胞的基因工程化在体外或离体进行。细胞经基因工程化以表达嵌合多肽，所述嵌合多肽包含细胞外识别结构域、至少一个蛋白酶切割位点和细胞内转录因子，并且此外，经工程化以包含编码所述基因产物的多核苷酸。细胞可源自待治疗的个体，但是也可以利用可获自相关的、不相关的、匹配的或不匹配的供体的同种异体细胞。基因工程化过程可以使用常规的细胞工程化方法进行，包括病毒转导(使用，例如，慢病毒、腺病毒或AAV等)、非病毒转染方法、电穿孔等。优选地，构建、分离、繁殖和筛选单克隆培养物的遗传和表达特征。在许多情况下，永生化细胞系是用于进一步进行细胞基因工程化的合适起始材料。细胞系的优势在于允许所述工程化的治疗性细胞的扩大生产，而从原代细胞和组织起始可提供其他优势，诸如保持天然基因型、表型和其他特性以及细胞功能。

在还一实施例中，选择进行基因修饰的细胞是效应免疫细胞，例如，T细胞、细胞毒性CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、巨噬细胞、单核细胞或自然杀伤(NK)细胞。通常，所述细胞可以选自以下合适细胞类型的非限制性实例中的任何一个：T细胞、细胞毒性CD8+ T细胞、CD4+T细胞、调节性T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、B细胞、浆细胞、树突细胞(DC)、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、上皮细胞、内皮细胞、干细胞、MSG、胎盘来源的细胞、羊膜来源的细胞、脐带细胞、脐血细胞、HEK细胞、神经元细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞等。从特定组织工程化的细胞对于治疗那些器官的疾病可具有优势，例如，小胶质细胞用于治疗亨廷顿病、帕金森病或阿尔茨海默病，或者肝细胞用于治疗C型Niemann-Pick病、HBV或HCV等。

在附加有利实施例中，本发明的特别合适的细胞包括具有用于治疗癌症和/或自身免疫性和/或免疫学疾病的细胞。此类特别有利的细胞包括巨噬细胞、单核细胞、B细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞和其他免疫系统细胞。例如，工程化的巨噬细胞或单核细胞、经工程化的NK或NKT细胞和/或经工程化的T细胞在各种癌症环境中可高度具有优势，其中，此类产生EV的细胞源可以用作高效嵌合抗原受体细胞，从而能够原位递送治疗性EV(诸如外泌体)，其中此类外泌体可包含至少一种目的生物分子。如上所述，通过原位产生的EV递送的合适的目的生物分子包括目的蛋白，诸如抗体、单链抗体或任何其他抗体衍生物(例如，纳米抗体、scFv、单结构域抗体、双特异性抗体、三特异性抗体等)、双特异性T细胞衔接子(BiTE)、多特异性T细胞衔接子、受体、细胞因子、酶、检查点抑制剂、共刺激抑制剂、RNA结合蛋白、转运体、剪接因子、转录因子、肿瘤抑制子等，以及各种其他类型的生物分子货物分子。作为非限制性实例，此类细胞还可以经工程化以包含选自包括以下各项的非限制性实例的至少一种RNA货物分子：mRNA、sgRNA、shRNA、miRNA、shRNA、siRNA、IncRNA、ncRNA、piRNA、piwiRNA、circRNA、tRNA、rRNA、crRNA及其任何组合。

在还一实施例中，蛋白酶切割结构域包含至少一个蛋白酶切割位点。所述位点可包含S1、S2和/或S3切割位点，即一个、两个或三个或者可能甚至更多的切割位点。在一个实施例中，蛋白酶切割位点包含异二聚结构域，所述异二聚结构域包含S2蛋白水解切割位点。在又一实施例中，S1蛋白水解切割位点是弗林样蛋白酶切割位点，所述弗林样蛋白酶切割位点包含氨基酸序列Arg-X-(Arg/Lys)-Arg，其中，X是任何氨基酸(SEQ ID NO:1和2)。S3切割位点经γ-分泌酶复合物处理，从膜锚释放细胞内转录因子。S2切割位点还可另外经修饰以被替代蛋白酶(诸如uPA、纤溶酶、PSA、MMP金属蛋白酶、组织蛋白酶B和凝血酶)切割。这可通过在S2切割位点诱变受体以使氨基酸序列突变从而改变蛋白酶特异性来实现。S2位点还可另外经突变以被器官特异性或细胞特异性蛋白酶切割，以进一步增加受体激活的特异性。S3切割位点也可经突变以被除了天然γ分泌酶之外的不同蛋白酶切割。S3位点可经突变以被任何膜内蛋白酶或所选细胞表达的任何细胞内蛋白酶切割。

在另一实施例中，用嵌合多肽受体和编码含POI的基因产物的多核苷酸进行基因工程化的本文细胞还可还包含生长诱导受体。此类生长诱导受体可由细胞组成性表达，或者可经工程化为在嵌合多肽受体的TF的控制下，从而通过抗原识别触发。举例来说，此类受体可包含结合某细胞因子的单链抗体或结合后激活细胞内生长应答的任何其他可溶性分子。作为非限制性实例，与EpoRD2结构域融合的单链抗体进一步与GP130的细胞内结构域融合，在被所述抗原激活后使得细胞生长。生长诱导受体可例如由与癌症相关蛋白(诸如在肿瘤细胞上表达的PD-L1、IL10、TGF-β或VEGF)诱导。这将使得本文的经工程化的细胞(例如，T细胞)生长，并同时下调肿瘤相关蛋白，从而进一步提高治疗效果。在又一非限制性实例中，生长诱导受体可由常规的嵌合抗原受体(CAR)组成，所述常规的嵌合抗原受体在抗原衔接后诱导T细胞应答，所述T细胞应答还涉及细胞分裂和生长。

在又一实施例中，融合多肽是嵌合Notch多肽，所述嵌合Notch多肽从N末端至C末端包含以下且以共价连接。在本文，Notch的细胞外识别结构域已被Notch受体上非天然存在的识别结构域取代。此外，嵌合Notch包含Lin-12 Notch重复区、S2蛋白水解切割位点和跨膜结构域，所述跨膜结构域包含S3蛋白水解切割位点。最后，嵌合Notch包含与Notch调节区异源的细胞内转录因子，其中，所述细胞外识别结构域与其靶标的结合诱导S2和S3蛋白酶切割位点发生切割，从而释放细胞内转录因子，所述细胞内转录因子激活多核苷酸转录以产生基因产物。基因产物在产生后与EV相关，由细胞分泌。

在又一实施例中，编码所述基因产物的多核苷酸可还包含转录控制元件，所述转录控制元件对转录因子作出应答，所述转录控制元件与编码序列可操作地连接。本发明的关键是嵌合多肽受体之间的相互作用与至少一种基因产物的EV介导的递送活性之间的功能联系，所述至少一种基因产物由在转录因子控制下的至少一种多核苷酸编码。CAR细胞与用于近癌细胞的原位递送的工程化的EV技术的独特结合可改变实体瘤治疗，所述实体瘤迄今为止已被证明对于例如CAR T和CAR NK细胞治疗而言难治愈。

在还一实施例中，所述细胞可经基因修饰以产生至少两种类型的融合多肽，其中，(i)细胞外识别结构域、(ii)蛋白酶切割位点和(iii)细胞内转录因子中的至少一种在融合多肽之间不同。一个替代方案是利用两个(或更多个，例如，三个或四个)融合多肽，其中，所述融合多肽的细胞外识别结构域彼此不同。这样，可以更大程度地控制基于EV活性的特异性触发，并且可将多种抗原用作靶细胞的靶标。例如，作为非限制性实例，在靶向各种形式的血液和实体瘤的情况下，存在于相同的经工程化的细胞上的两种嵌合抗原受体可用以靶向(i)HER2和IL13Ralpha2(同时)、(ii)CD19和CD3、(iii)CTLA4和PDL1以及(iv)LAG3和PDL1。

在还一实施例中，基因产物(蛋白及任选的RNA和/或其他目的生物分子)以及任何其他所需蛋白/RNA的内源性产生可通过多种不同嵌合多肽受体的作用，释放不同的细胞内转录因子，以及与可控制编码相同或不同基因产物之多核苷酸的各种特异性转录控制位点的结合而发生。作为非限制性实例，在多个嵌合(例如基于Notch的多肽)激活后，细胞产生参与产生外泌体的组分，所述外泌体包含CD63-PUF(与RNA结合蛋白融合的外泌体蛋白)和具有一个或多个PUF结合序列的mRNA，以及潜在地表达外泌体多肽以产生免疫逃逸和组织趋性。此外，清楚的是，所述细胞可表达单一嵌合notch受体的单个拷贝、多于一个嵌合受体的多个拷贝、多个不同合成Notch受体的多个拷贝或其任何组合。

在还一方面中，本发明涉及一种由经工程化的细胞产生的细胞外囊泡(EV)。产生的EV载有由嵌合多肽受体的细胞内转录因子表达的基因产物。此外，优选的是细胞产生数千个EV，甚至更优选的是细胞产生数万个EV，或甚至数百万个EV。在另一优选的实施例中，由所述细胞产生的EV是外泌体。如上所述，对于本发明重要的是通过EV-POI基因产物的转录(即从编码至少一个外泌体蛋白的多核苷酸的表达)，将EV-POI融合蛋白和任选的RNA药物货物载入EV中。优选地，所述EV包含基因产物的多个拷贝，例如，每个EV约10个、约100个、或甚至约1000个或甚至多达10000个或更多个拷贝。

在还一方面中，本发明涉及一种重组表达载体，所述重组表达载体包含编码基因产物的多核苷酸。所述重组表达载体可还包含转录控制元件，所述转录控制元件对与编码序列可操作地连接的转录因子作出应答，所述转录控制元件与编码序列可操作地连接。进一步地，转录控制元件与细胞可以是内源性的或异源性的，并且多核苷酸的编码序列与细胞也可以是内源性的或异源性的。另外，本发明涉及由上述多核苷酸编码的基因产物。典型地，基因产物包含外泌体多肽和POI，其中POI本身具有治疗或靶向活性，或者具有例如能够与其他目的生物分子(诸如RNA或DNA或者蛋白或肽)相互作用的转运特性，以将此类生物分子转运至细胞所产生的EV中。

在还一方面中，本发明涉及编码本发明的嵌合多肽受体的重组表达载体，以及嵌合多肽受体本身。

通常，多核苷酸构建体可存在于各种类型的载体和表达构建体中，例如，质粒、微环、病毒(整合或非整合)、线性或环状核酸(诸如线性DNA)或者单链或双链DNA延伸、mRNA、经修饰的mRNA等。这些载体和/或表达构建体可以是可诱导的，并由外部因素(诸如四环素或强力霉素)或任何其他类型的诱导因子控制。此外，如上所述，包含本发明多肽的多核苷酸构建体可如上所述实质上存在于任何类型的EV源细胞中。如上所述，可使用多种常规技术(诸如转染、病毒介导的转化、电穿孔等)来引入细胞(通常细胞培养物包含合适的产生EV的细胞类型)中。可使用常规转染试剂(诸如脂质体、CPP、阳离子脂质或阳离子聚合物、磷酸钙、树状聚合物等)进行转染。病毒介导的转染也是非常合适的方法，并且可以使用常规病毒载体(诸如腺病毒、AAV或慢病毒载体)进行。当构建用于细胞库的稳定细胞系，即构建产生EV的细胞源的主细胞库(MCB)和工作细胞库(WCB)时，病毒介导的转化特别重要。使用电穿孔、基于脂质的转染、基于聚乙烯亚胺(PEI)的转染或用于产生稳定经工程化的细胞和/或细胞系的任何其他合适的方法，还可有利地实现稳定细胞和细胞系的产生。

在还一实施例中，本发明的细胞可以是例如原代细胞或细胞系。可使用例如hTert、SV40 T抗原、C-MYC、v-myc、E6/E7或永生化策略的任何其他非限制性实例来使细胞永生化。

在还一方面中，本发明涉及一种在体内、离体和/或在体外产生治疗效果的方法，所述方法包括：

(i)离体或在体外将(a)包含编码基因产物的多核苷酸的重组表达载体和(b)编码嵌合多肽受体的重组表达载体引入细胞；

(ii)将经基因修饰的细胞施用于个体。

据推测，治疗效果是由经基因工程化(修饰)的细胞所产生并释放的EV(通常是外泌体)产生的。如上所述，从经工程化的细胞释放的EV可包括各种类型的药物货物(诸如蛋白或RNA货物)，所述药物货物可对例如靶细胞的内部和/或靶细胞的外部和/或在体内任何其他合适的位置(例如，在肿瘤或转移部位或实质上在任何器官或组织中)产生治疗效果。

在又一方面中，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的经基因修饰的细胞，而且此外，本发明还涉及此类经基因修饰的细胞和/或药物组合物在医药中的用途，例如，在预防和/或治疗癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、遗传性疾病、感染性疾病、代谢性疾病、CNS疾病、溶酶体贮积病和神经退行性疾病中的用途。

可以将经工程化的细胞(通常是其群体)系统性、局部、区域性地或直接在所需部位施用于个体。根据本发明的细胞可经由各种不同的施用途径施用于人或动物受试者，例如，耳廓(耳部)、口颊、结膜、皮肤、牙齿、电渗、子宫颈内、鼻窦、气管内、肠内、硬膜上、羊膜外、体外循环、血液透析、浸润、间质、腹腔内、羊膜内、动脉内、关节内、胆道内、支气管内、囊内、心脏内、软骨内、尾内、海绵体、腔内、脑内、脑池内、角膜内、冠内(牙齿)、冠状动脉内、海绵体内、皮内、椎间盘内、管内、十二指肠内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、牙龈内、回肠内、病灶内、腔内、淋巴内、髓内、脑膜内、肌内、眼内、卵巢内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、窦内、脊柱内、滑膜内、腱内、睾丸内、鞘内、胸腔内、肾小管内、肿瘤内、鼓膜内、子宫内、血管内、静脉内、静脉推注、静脉滴注、脑室内、膀胱内、玻璃体内、离子电渗、冲洗、喉、鼻、鼻胃、闭塞包扎技术、经眼、经口、口咽、其他、肠胃外、经皮、关节周围、硬膜外、神经外、牙周、直肠、呼吸(吸入)、眼球后、软组织、蛛网膜下腔、结膜下、皮下、舌下、粘膜下、局部、透皮、透粘膜、经胎盘、经气管、经鼓室、输尿管、尿道和/或阴道施用，及/或以上施用途径的任何组合，这通常取决于待治疗的疾病和/或细胞和EV群体本身的特征。

在又一方面中，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明的经基因工程化的细胞。通常，根据本发明的药物组合物包含一种类型的与至少一种药学上可接受的辅料一起配制的治疗性基因工程化的细胞(例如，稳定细胞群体，其包含某种类型的嵌合多肽受体和编码治疗性基因产物的多核苷酸，所述治疗性基因产物对嵌合多肽受体的转录因子作出应答)，但是例如，在需要组合治疗的情况下，药物组合物中自然可包含多于一种基因工程化的细胞群体。然而，自然地，如上所述，单个细胞或单个细胞群体可包含多于一种嵌合多肽受体和转录控制元件，所述多于一种嵌合多肽受体和转录控制元件对转录因子作出应答，所述转录控制元件与编码序列可操作地连接。所述至少一种药学上可接受的辅料可选自包含任何药学上可接受的材料、组合物或媒介物的组，例如，固体或液体填充剂、稀释剂、辅料、载体、防冻剂、抗聚集物质、血小板溶解产物、血清白蛋白和尤其是重组产生的人血清白蛋白、溶剂或包封材料，其可涉及例如将细胞群体悬浮、维持其活性或将其从一个器官或身体的一部分运载或转运至另一器官或身体的一部分(例如，从血液至任何目的组织和/或器官和/或身体部分)。施用于患者的细胞剂量将依赖于，例如，待治疗或缓解的疾病或症状数、施用途径、基因产物的药理作用、EV的固有特性、任何靶向实体的存在以及技术人员已知的各种其他相关参数。

因此，根据本发明的细胞和EV可用于预防和/或治疗目的，例如，用于预防和/或治疗和/或缓解各种疾病和病症。可应用本发明的疾病的非限制性样品包括克罗恩病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、类风湿关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、结节病、特发性肺纤维化、银屑病、肿瘤坏死因子(TNF)受体相关周期性综合征(TRAPS)、白介素-1受体拮抗剂(DIRA)缺乏症、子宫内膜异位症、自身免疫性肝炎、硬皮病、肌炎、中风、急性脊髓损伤、血管炎、格林巴利综合征、急性心肌梗死、ARDS、败血症、脑膜炎、脑炎、肝功能衰竭、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肾功能衰竭、心力衰竭或任何急性或慢性器官衰竭以及相关潜在病因、移植物抗宿主病、杜氏肌营养不良症和其他肌营养不良症、溶酶体贮积症(诸如高雪氏病、法布里氏病，MPS I、II(亨特综合征)和III、尼曼-皮克病、庞贝氏症等)、神经退行性疾病(包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和其他三核苷酸重复相关疾病)、痴呆、ALS、癌症诱发的恶病质、厌食症、2型糖尿病和各种癌症。实际上，所有类型的癌症均是本发明的相关疾病靶标，例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、小脑或脑、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、脑干神经胶质瘤、脑癌、脑肿瘤(小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤(儿童期，胃肠道)、原发性未知癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、增生性小圆形细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌(眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤)、胆囊癌、胃癌(Gastric/Stomach)cancer)、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞瘤(颅外、性腺外或卵巢)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤(脑干神经胶质瘤、脑星形细胞瘤、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤)、胃类癌、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽喉癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、Kaposi肉瘤、肾脏癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病((急性成淋巴细胞白血病(也称为急性淋巴细胞白血病)、急性粒细胞白血病(也称为急性骨细胞白血病)、慢性淋巴细胞白血病(也称为慢性成淋巴细胞白血病)、慢性粒细胞白血病(也称为慢性骨细胞白血病)、毛细胞白血病))、嘴唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发性)、肺癌(非小细胞、小细胞)、淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、髓母细胞瘤、Merkel细胞癌、间皮瘤、具有隐发原发性的转移性鳞状上皮癌、口癌、多发性内分泌肿瘤、多发性骨髓瘤/血浆细胞瘤、真菌病、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、骨细胞白血病、慢性粒细胞白血病(急性、慢性)、骨髓瘤、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮间质瘤)、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低度恶性潜能肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖瘤、松果细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(尤文家族肉瘤、卡波济肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤)、Sézary综合征、皮肤癌(非黑色素瘤、黑色素瘤)、小肠癌、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤(Thymoma)和胸腺癌(Thymic carcinoma)、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、

巨球蛋白血症和/或Wilm肿瘤。

通常可以指出，包含如本文所述的经基因修饰的细胞(例如，T细胞、巨噬细胞、单核细胞、NK细胞或NKT细胞或者根据本发明的任何其他经基因工程化的细胞)的药物组合物可以以10²至10¹²个细胞/kg体重、优选地10⁵至10⁸个细胞/kg体重(包括这些范围内的所有整数值)的剂量施用。细胞数将依赖于组合物所预期的最终用途以及其中所含细胞的类型。对于本文提供的用途，细胞通常为一升或更少的体积，其可以是500ml或以下、甚至250ml或100ml或以下。因此，期望细胞的密度通常大于10⁶个细胞/ml，并且通常大于10⁷个细胞/ml，通常为10⁸个细胞/ml或更高。临床相关免疫细胞数可以分配为多次输注，所述多次输注累积等于或超过10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³或10¹⁴个细胞。在本发明的一些方面中，特别是由于实质上所有施用的细胞均将被重新定向至特定的靶抗原，因此可以施用在10⁶/千克体重范围内的较低细胞数。可以以各种剂量水平多次施用经工程化的细胞组合物。所述细胞对于接受治疗的患者可以是同种异体的、同基因的、异种的或自体的。如有需要，治疗还可包括施用有丝分裂原(例如，PHA)或淋巴因子、细胞因子和/或趋化因子(例如，IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-α、IL-18和TNF-β、GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、MIPIα等)。

实验和实例

构建体设计和克隆：ORF通常通过合成产生并克隆至哺乳动物表达载体中，例如，pSF-CAG-Amp。简单地说，按照生产商说明书用Notl和Sall酶消化合成的DNA和载体质粒。按照生产商说明书，使用T4连接酶将限制性、纯化的DNA片段连接在一起。通过补加氨苄青霉素的平板上的细菌转化选择成功的连接事件。按照生产商说明书，通过“maxi-prep”产生用于转染的质粒。

细胞培养和转染：视实验设计和测定而定，对本文的经基因工程化的细胞进行非病毒或病毒转染。转染和转导在各种细胞培养系统中进行，包括但不限于2D细胞培养、振荡培养箱、各种形式的生物反应器、中空纤维生物反应器、波浪袋等。使用例如电穿孔、阳离子脂质转染、脂质体转染、PEI转染等方法对细胞进行稳定或瞬时修饰。为了简洁起见，本文仅提及用于细胞工程化的合适细胞的几个实例：HEK293T细胞、supT1细胞、K652细胞、常规T细胞(例如，CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、调节性T细胞等)、常规NK细胞、常规NKT细胞、成纤维细胞、间充质基质细胞(可从例如骨髓、脂肪组织、脐带胶质(Wharton's jelly)、围产期组织、胎盘、羊膜等获得)、B细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞(DC)、嗜酸性粒细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞等。按照供应商(例如，ATCC)或生产商的建议接种细胞。

测定和分析：Western印迹法是一种非常方便的分析方法，其用于评估EV(例如，外泌体)中POI的富集。简单地说，根据生产商的说明书(Novex PAGE 4-12％凝胶)进行SDS-PAGE，由此每孔上样1×10¹⁰个EV和20μg细胞裂解物。根据生产商的说明书(Immobilon(RTM)，Invitrogen)，将SDS-PAGE凝胶中的蛋白转移到PVDF膜上。通常按照供应商的说明书(一抗——Abeam，二抗——Licor)在Odyssey封闭缓冲液(Licor)中封闭膜，并用抗POI和/或外泌体蛋白的抗体进行探测。分子探针在680和800nm波长下显现。为了探测载入EV中的各种RNA种类(例如，shRNA或mRNA)，通常根据生产商的说明书使用qPCR。

实例1.通过CD19依赖性嵌合Notch多肽激活，在K562细胞中表达CD63-NanoLuc。

K562细胞经工程化以表达CD19感应嵌合Notch多肽，所述多肽通过激活释放诱导CD63-NanoLuc表达的细胞内转录因子。此外，产生了两种HEK293T细胞系，一种具有稳定的CD19表达，一种则没有。将每种HEK293T细胞与报告基因嵌合Notch多肽K562细胞一起接种在24孔板中。四十八小时后，从条件培养基中收获EV并测量NanoLuc活性。在没有CD19的样品中测得的NanoLuc活性可忽略不计，而在存在CD19的情况下，报告基因K562细胞在EV中表达CD63-Nanoluc。此数据表明，只有通过CD19的存在及其与K562细胞上的嵌合Notch多肽的相互作用，CD63-Nanoluc才能表达并载入EV中。进行类似实验，但是这次将目的NanoLuc报告基因蛋白与跨膜外泌体蛋白CD81和CD9融合，所述跨膜外泌体蛋白属于四跨膜蛋白家族。这些原理性实验证明，NanoLuc可被治疗性蛋白或目的RNA取代，从而在靶细胞、组织、器官或部位产生治疗效果(图1)。Y轴＝发光(RLU)

实例2.从稳定的K562嵌合Notch多肽细胞摄取CD63-内含肽-Cre后，Cre重组酶应答性MDA细胞中的GFP表达。

K562细胞经工程化以表达CD19感应嵌合Notch多肽，所述多肽通过其激活诱导CD63-内含肽-Cre或可溶性Cre重组酶的表达。CD63-内含肽-Cre是一种先前描述的体系，其可使Cre重组酶载入EV中，最终从任何外泌体蛋白中释放。此外，对MDA-MB-231 Cre应答性细胞系进行工程化以稳定表达CD19。通过Cre重组酶的活性，报告基因细胞的GFP表达被永久激活。将MDA-Lox+ve或-Lox-ve的组合与K562-CD63-内含肽-Cre或-Cre一起接种在24孔板中。四十八小时后，针对剩余MDA群体对GFP+ve细胞进行计数(MDA细胞组成性表达红色荧光蛋白，所述红色荧光蛋白通过Cre活性变为绿色)。在CD19存在和随后释放EV CD63-内含肽-Cre的情况下，观察到红色荧光向绿色荧光的明显转变。然而，在不存在CD19或载有EV的Cre的情况下，荧光的变化可以忽略不计(图2)。在类似的实验中，可溶性外泌体蛋白Alix和多配体蛋白聚糖结合蛋白经由内含肽与Cre重组酶融合，在靶MDA-MD-231细胞中产生相似水平的重组。Y轴＝GFP阳性细胞百分比。

实例3.在p53感应细胞中，通过EV递送的p53 mRNA通过p53表达诱导细胞死亡。

K562细胞经工程化以表达CD19感应SynNotch多肽，所述多肽通过激活可诱导EV-负载-RNA-结合(CD63-PUF)多肽和带有PUF蛋白结合基序的p53 mRNA的表达。另外，产生了另一种K562细胞系，其中表达了带有结合基序的p53 mRNA，然而，这些细胞缺乏EV负载机制(即PUF和CD63之间的融合蛋白)。将肿瘤细胞系进行稳定地工程化以表达CD19。如前所述，在48小时后，仅SynNotch激活(CD19+ve)与EV负载策略(CD-63PUF)的组合才使得将p53mRNA递送至p53感应肿瘤细胞系，从而引起约50％的肿瘤细胞系死亡。同样，缺乏CD19或CD63PUF的组合未引起明显的细胞死亡(图3)。Y轴＝根据膜联蛋白染色和FAGS分析的凋亡细胞百分比。

实例4.在p53感应细胞中，通过EV递送的p53 mRNA通过p53表达诱导细胞死亡。

K562细胞经工程化以表达间皮蛋白感应嵌合多肽受体，所述受体通过激活诱导外泌体蛋白-RNA结合(CD63-PUF)多肽和带有结合基序的p53 mRNA的表达。另外，产生了另一种K562细胞系，其中表达了带有结合基序的p53 mRNA，但缺乏EV负载机制。将间皮瘤细胞系进行稳定地工程化以表达间皮蛋白。如前所述，在48小时后，只有嵌合多肽受体激活(间皮蛋白+ve)与外泌体多肽(CD-63PUF)的组合才使得p53 mRNA递送至p53感应肿瘤细胞系，从而引起约50％的肿瘤细胞系死亡。同样，缺乏间皮蛋白或CD63PUF的组合未引起明显的细胞死亡(数据未示出)。

实例5.嵌合多肽受体与TNF受体的结合诱导抗STAT3单链Ab的外泌体介导的细胞内递送。

K562细胞经工程化以表达嵌合多肽受体，所述嵌合多肽受体包含靶向TNF受体的抗体作为其细胞外识别结构域。通过在体外将TNFR与靶免疫细胞结合，嵌合多肽受体的TF触发转录激活和与针对细胞内靶STAT3的单链抗体片段融合的外泌体多肽(多配体蛋白聚糖结合蛋白)的表达。使用基于荧光素酶的STAT3敏感细胞系测定，验证了含多配体蛋白聚糖结合蛋白-抗STAT3-单链Ab的外泌体的产生和细胞内递送(数据未示出)。

实例6.在实例6中，测试卵巢癌细胞(Skov3)暴露于由supT1细胞产生的负载粒酶B的外泌体后的细胞死亡。由supT1细胞表达的嵌合多肽受体的scFv与卵巢癌细胞上表达的CA-125肿瘤抗原之间的相互作用触发负载有粒酶B的外泌体的产生，伴有暴露于浓度增加的经工程化的supT1细胞后以剂量依赖性方式发生的Skov3细胞死亡。作为目的蛋白的粒酶B由编码POI(即粒酶B)和外泌体蛋白Lamp2B的多核苷酸编码，这使得能够将粒酶B转运入supT1细胞产生的EV中。图4的黑色柱表示工程化为靶向CA125的supT1细胞，并且在其与靶标接合后产生包含与CA-125阳性细胞混合的粒酶B的EV；白色柱示出与CA-125阴性细胞混合的supT1抗CA-125粒酶B EV产生的细胞，灰色柱示出没有编码与CA-125阳性细胞混合的基因产物的多核苷酸的supT1抗CA-125细胞。Y轴示出Skov3细胞的细胞死亡百分比。

实例7.使用SynNotch嵌合多肽受体将永生化CEM(急性淋巴母细胞性淋巴瘤)细胞进行基因工程化以靶向乳腺癌细胞系T47D的MUC1，所述SynNotch嵌合多肽受体包含(i)抗MUC1的scFv、(ii)SynNotch受体核心蛋白和(iii)经由蛋白酶切割位点(S1)与SynNotch核心蛋白连接的人工转录因子Gal4VP64。当scFv与MUC1在靶T47D细胞上相互作用时，Gal4VP64被释放并激活EV蛋白CD63的表达，所述EV蛋白CD63与自切割内含肽融合，所述自切割内含肽转而又与FCU1融合，从而将FCU1引导进入EV，在EV中内含肽被切割并释放出游离的FCU1。随后，载有FCU1的EV被T47D细胞摄入，并在施用5-氟尿嘧啶后细胞发生凋亡。图5中的黑色柱表示与完整scFv-SynNotch-Gal4VP64混合的MUC1阳性T47D细胞，其展示包含CD63-内含肽-FCU1多核苷酸构建体的CEM细胞；白色柱表示与完整SynNotch CEM细胞混合的MUC1阴性T47D细胞；灰色柱示出与CEM细胞混合的MUC1阳性T47D细胞，其仅包含嵌合多肽受体的SynNotch-Gal4VP64部分，但具有编码功能性CD63-内含肽-FCU1的多核苷酸(以质粒DNA的形式)。从图中可以看出，当与包含编码外泌体蛋白(CD63)和POI(FCU1)的多核苷酸的完全功能性SynNotch CEM细胞混合使用时，MUC1阳性组中T47D细胞仅在5-氟尿嘧啶后进入凋亡状态。Y轴示出T47D细胞的细胞死亡百分比。

实例8.使用包含以下组分的嵌合多肽受体转导原代人T细胞：(i)抗PSMA的骆驼科纳米抗体、(ii)TNFR的跨膜结构域，其使得能够在抗PSMA的骆驼科纳米抗体的细胞表面上展示、(iii)Notch细胞内结构域(NID)的转录因子(所述NID包含S2金属蛋白酶切割位点)，所述转录因子通过S2位点的切割而被释放。T细胞也经工程化以包含编码基因产物CD81-PUF(其中PUF是mRNA结合蛋白)的NID应答多核苷酸，以及在3'UTR中具有PUF结合位点的PTEN mRNA。当在嵌合多肽受体激活之后进行表达时，PTEN mRNA中PUF与PUF结合位点之间的相互作用会主动将mRNA载入EV中。图6示出与PC3 PSMA阳性细胞混合的抗PSMA+、CD63-PUF+和PTEN mRNA+ T细胞；白色柱表示与PC3 PSMA阴性细胞混合的抗PSMA+、CD63-PUF+和PTEN mRNA+ T细胞，灰色柱示出与PC3 PSMA阳性细胞混合的抗PSMA+、CD63-PUF+，无PTENmRNA T细胞与之混合；而且，点状柱示出与PC3 PSMA阳性细胞混合的仅CD63-PUF+和PTENmRNA+细胞，无抗PSMA嵌合受体T细胞与之混合。从图中可以看出，通过流式细胞仪分析，仅抗PSMA+、CD63-PUF+和PTENmRNA+ T细胞诱导细胞凋亡增加。

实例9.使用与SynNotch受体融合的抗CD19单链抗体以及编码与EV蛋白CD81连接的CFTR蛋白的多核苷酸，转导原代自然杀伤(NK)细胞。将NK细胞与HEK 293T细胞混合，且共培养3天后，除去NK细胞并测量I¹²⁵的流量。图7中带有三角形的黑线示出与抗CD19-SynNotch-CFTR细胞混合的对CD19呈阳性的HEK细胞；带黑框的灰线示出与抗CD19-SynNotch-CFTR细胞混合的对CD19呈阴性的HEK细胞；而且，带空框的黑线示出与不含CFTR编码多核苷酸的抗CD19-SynNotch细胞混合的对CD19呈阳性的HEK细胞。Y轴是碘化物¹²⁵的流出速率(k/min)，而x轴表示时间(以分钟计)。

Claims (30)

1.一种经基因修饰以产生嵌合多肽受体的细胞，所述嵌合多肽受体包含(i)细胞外识别结构域、(ii)至少一个蛋白酶切割位点和(iii)细胞内转录因子，其特征在于，所述细胞外识别结构域与其靶标的结合诱导所述至少一个蛋白酶切割位点发生蛋白水解切割并通过所述细胞内转录因子诱导编码基因产物的至少一种多核苷酸的内源性转录，所述基因产物包含至少一种外泌体多肽。

2.根据权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述基因产物还包含目的蛋白。

3.根据权利要求2所述的细胞，其特征在于，所述目的蛋白是抗体、单链抗体或任何其他抗体衍生物、双特异性T细胞衔接子(BiTE)、受体、细胞因子如白介素、酶如胱天蛋白酶、粒酶、Cas、Cas9、检查点抑制剂、共刺激抑制剂、RNA结合蛋白、膜转运体如NPC-1、剪接因子、细胞器相关蛋白、溶酶体酶、转录因子、线粒体蛋白、细胞内蛋白、抗病毒蛋白、抗菌蛋白。

4.根据权利要求2-3中任一项所述的细胞，其特征在于，当所述目的蛋白是RNA结合蛋白时，所述细胞进一步经基因修饰以包含RNA货物分子，所述RNA货物分子选自由以下各项组成的组：mRNA、sgRNA、shRNA、miRNA、shRNA、siRNA、IncRNA、ncRNA、piRNA、piwiRNA、circRNA、tRNA、rRNA、crRNA及其任何组合。

5.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，所述基因修饰是体外或离体基因修饰。

6.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞是效应免疫细胞。

7.根据权利要求5和/或6所述的细胞，其特征在于，所述细胞是T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、CD4+T细胞、调节性T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、浆细胞、树突细胞(DC)、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、上皮细胞、内皮细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、干细胞、骨髓源性间充质基质细胞、脐带胶质源性MSC或任何其他细胞类型。

8.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，所述嵌合多肽受体的细胞外识别结构域是抗体、抗体衍生物、单链片段、单链抗体、纳米抗体、肽、受体的配体、粘附分子、受体、白介素受体、细胞外基质组分或其任何组合。

9.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，所述至少一个蛋白酶切割位点是S1、S2和/或S3切割位点中的至少一种。

10.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，融合多肽是嵌合Notch多肽，所述嵌合Notch多肽从N末端至C末端包含以下且以共价连接：

(i)细胞外识别结构域，所述细胞外识别结构域不在Notch受体多肽中天然存在；

(ii)Notch调节区，所述Notch调节区包含Lin 12-Notch重复区、S2蛋白水解切割位点和跨膜结构域，所述跨膜结构域包含S3蛋白水解切割位点；

(iii)细胞内转录因子，所述细胞内转录因子与所述Notch调节区是异源性的，

其中所述细胞外识别结构域与其靶标的结合诱导所述S2蛋白酶切割位点和所述S3蛋白酶切割位点处发生切割，从而释放所述细胞内转录因子，所述细胞内转录因子激活所述多核苷酸的转录。

11.根据权利要求10所述的细胞，其特征在于，所述Notch调节区还包含异二聚结构域，所述异二聚结构域包含所述S2蛋白水解切割位点。

12.根据权利要求9-11中任一项所述的细胞，其特征在于，所述S1蛋白水解切割位点是弗林样蛋白酶切割位点，所述弗林样蛋白酶切割位点包含氨基酸序列Arg-X-(Arg/Lys)-Arg，其中X是任何氨基酸。

13.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，所述融合多肽包含至少一个接头。

14.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，所述多核苷酸还包含转录控制元件，所述转录控制元件对所述转录因子作出应答，所述转录控制元件与编码序列可操作地连接。

15.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞经基因修饰以产生至少两种类型的融合多肽，其中所述(i)细胞外识别结构域、所述(ii)蛋白酶切割位点和所述(iii)细胞内转录因子中的至少一种在所述融合多肽之间不同。

16.根据权利要求15所述的细胞，其特征在于，所述融合多肽的细胞外识别结构域彼此不同。

17.一种由根据权利要求1-16中任一项所述的细胞产生的细胞外囊泡(EV)。

18.根据权利要求16所述的EV，其特征在于，所述EV是外泌体。

19.根据权利要求17-18中任一项所述的EV，其特征在于，所述EV包含所述基因产物。

20.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含所述多核苷酸，所述多核苷酸编码前述权利要求中任一项所述的基因产物。

21.根据权利要求20所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体还包含转录控制元件，所述转录控制元件对所述转录因子作出应答，所述转录控制元件与编码序列可操作地连接。

22.根据权利要求20-21中任一项所述的重组表达载体，其特征在于，所述转录控制元件与权利要求1-16中任一项所述的细胞是内源性的或异源性的。

23.根据权利要求20-22中任一项所述的重组表达载体，其特征在于，所述多核苷酸的编码序列与权利要求1-16中任一项所述的细胞是内源性的或异源性的。

24.一种由权利要求20-23中任一项所述的多核苷酸编码的基因产物。

25.一种重组表达载体，所述重组表达载体编码前述权利要求中任一项所述的嵌合多肽受体。

26.一种由权利要求24所述的重组表达载体编码的融合多肽。

27.一种产生治疗效果的方法，所述方法包括：

(i)离体或在体外将根据权利要求20-23中任一项所述的重组表达载体和根据权利要求25所述的重组表达载体引入细胞；

(ii)将所述经基因修饰的细胞施用于个体。

28.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-16中任一项所述的细胞。

29.根据权利要求1-16中任一项所述的细胞或根据权利要求28所述的药物组合物在医药中的用途。

30.根据权利要求1-16中任一项所述的细胞或根据权利要求28所述的药物组合物在治疗以下各项中的用途：癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、遗传性疾病、感染性疾病、代谢性疾病、CNS疾病、溶酶体贮积病和神经退行性疾病。

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