KR20230117174A - 핵산을 세포에 전달하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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KR20230117174A
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일라이어스 퀴자노
피터 글레이저
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스티븐 스퀸토
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제나오 바이오, 인크.
예일 유니버시티
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Abstract

핵산 화물을 세포 내로 전달하기 위한 조성물 및 이의 사용 방법이 제공된다. 조성물은 통상적으로 (a) 3E10 단클론 항체 또는 이의 항원 결합, 세포 침투 단편; 1가, 2가, 또는 다가 단쇄 가변 단편(scFv); 또는 디아바디; 또는 이의 인간화 형태 또는 변이체, 및 (b) 예를 들어, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 기능적 핵산, 기능적 핵산을 암호화하는 핵산, 또는 이들의 조합을 포함하는 핵산 화물을 포함한다. 요소 (a) 및 (b)는 통상적으로 비공유 결합되어 복합체를 형성한다.

Description

핵산을 세포에 전달하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 12월 4일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/121,782호, 및 2021년 3월 3일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/156,070호에 대한 우선권을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 통합된다.
연방 후원 연구에 관한 진술
본 발명은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)이 수여한 CA197574에 따라 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 일정한 권리를 갖는다.
서열 목록에 대한 참조
2021년 12월 5일에 생성되고 154,915바이트의 크기를 갖는 "127689-5004-WO03_ST.25"라는 명칭의 텍스트 파일로서 제출된 서열 목록은 37 C.F.R. § 1.52(e)(5)에 따라 참조로서 본원에 통합된다.
유전자 요법은 암과 같은 유전적 또는 후천성 질환에 대한 유전자 대체 및 녹다운으로부터 백신접종에 이르는 다양한 응용을 포함한다. 바이러스 벡터 및 합성 리포좀은 오늘날 많은 응용을 위한 선택 비히클로서 출현하였지만, 생산의 복잡성, 제한된 포장 용량, 및 유전자 요법 응용을 제한하고 예방적 유전자 요법의 가능성을 억제하는 바람직하지 않은 면역학적 특징을 포함하는 제한 및 위험을 갖는다(Seow 및 Wood의 문헌[Mol Ther. 17(5): 767-777 (2009)]).
세포 및 조직에서 폴리뉴클레오티드의 생체 내 흡수 및 분포가 관찰되었다(Huang 등의　FEBS Lett.,　558(1-3):69-73 (2004)). 또한, 비록, 예를 들어, Nyce 등은 흡입 시 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)가 내인성 계면활성제(폐 세포에 의해 생성된 지질)에 결합하고, 추가적인 담체 지질 없이 폐 세포에 의해 섭취되고(Nyce 등의 문헌[Nature, 385:721-725 (1997)]), 작은 핵산을 T24 방광 암종 조직 배양 세포 내로 섭취하지만(Ma 등의 문헌[Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 8:415-426 (1998)]), 특히　생체 내　응용을 위한 개선된 핵산 형질감염 기술에 대한 필요성이 존재한다. AAV9는 여전히 사람들에게 일반적으로 사용되는 바이러스 벡터로서 2003년에 발견되었다(Robbins, "Gene therapy pioneer says the field is behind - and that delivery technology is embarrassing," Stat, November, 2019).
따라서, 본 발명의 목적은 핵산의 세포 내로의 전달을 개선하기 위한 조성물 및 이의 사용 방법을 제공하는 것이다.
핵산 화물을 세포 내로 전달하기 위한 조성물 및 이의 사용 방법이 제공된다. 조성물은 통상적으로 (a) 3E10 단클론 항체 또는 이의 세포 침투성 단편; 1가, 2가, 또는 다가 단쇄 가변 단편(scFv); 또는 디아바디; 또는 이의 인간화 형태 또는 변이체; 및 (b) 예를 들어, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 기능적 핵산, 기능적 핵산을 암호화하는 핵산, 또는 이들의 조합을 포함하는 핵산 화물을 포함한다. 요소 (a) 및 (b)는 통상적으로 비공유 결합되어 복합체를 형성한다. 다양한 구현예에서의 핵산은 DNA(단일 가닥 또는 이중 가닥), RNA, 올리고뉴클레오타이드, PNA, 및 기타 핵산을 포함한다.
예시적인 3E10 항체 및 이의 단편 및 융합 단백질은 (i) 서열번호 7-11, 14, 또는 53-58 중 어느 하나의 CDR과 조합된 서열번호 1-6, 12, 13, 46-48 또는 50-52 중 어느 하나의 CDR; (ii) 서열번호 24-30, 44, 및 45로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 경쇄 사슬 CDR과 조합된, 서열번호 15-23, 42, 및 43으로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 중쇄 CDR; (iii) (i) 또는 (ii)의 인간화 형태; (iv) 서열번호 7 또는 8과 적어도 85% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된, 서열번호 1 또는 2 중 어느 하나와 적어도 85% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; (v) (iv)의 인간화 형태; 또는 (vi) 서열번호 9-11 또는 53-58과 적어도 85% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된, 서열번호 3-6, 46-48, 또는 50-52 중 어느 하나와 적어도 85% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 갖는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 및 이의 단편 및 융합 단백질은 3E10 중쇄 아미노산 서열 또는 이의 CDR의 D31 또는 N31에 상응하는 아미노산 잔기가 아르기닌(R) 또는 리신(L)으로 치환된 CDR1 중쇄 변이체이다.
일부 구현예에서, 항체 및 이의 단편 및 융합 단백질은 서열번호 92 또는 93의 핵산 결합 포켓, 또는 DNA, RNA와 같은 핵산 또는 이들의 조합에 결합하는 동일하거나 개선된 능력을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
또한, 3E10 중쇄 아미노산 서열 또는 이의 CDR1의 D31 또는 N31에 상응하는 아미노산 잔기가 아르기닌(R) 또는 리신(L)으로 치환된 CDR1 중쇄 변이체를 포함하는　3E10 결합 단백질 자체, 및 서열번호 92 또는 93의 핵산 결합 포켓, 또는 핵산, 예컨대, DNA, RNA 또는 이들의 조합에 결합하는 동일하거나 개선된 능력을 갖는 이의 변이체를 갖는 결합 단백질 자체가 제공된다.
일부 구현예에서, 항체 또는 단편 또는 융합 단백질은 이중특이적일 수 있고, 예를 들어, 관심 세포 유형, 조직 또는 기관을 표적으로 하는 결합 서열을 포함할 수 있다.
핵산 화물은, DNA, RNA, 변형된 핵산(PNA를 포함하지만 이에 한정되지는 않음), 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 핵산 화물은 통상적으로 기능적 화물, 예컨대 기능적 핵산(예를 들어, 억제성 RNA, 예컨대 siRNA), mRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, miRNA, 또는 벡터, 예를 들어 발현 벡터이다. 벡터를 포함하는, 핵산 화물은 발현 조절 서열, 예컨대 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는, 예를 들어 플라스미드일 수 있다. 통상적으로, 화물은, 예를 들어, 무작위로 전단된 또는 단편화된 게놈 DNA가 아니다.
일부 구현예에서, 화물은 Cas 엔도뉴클레아제, gRNA, 또는 이들의 조합을 암호화하는 핵산을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 화물은 키메라 항원 수용체 폴리펩티드 또는 T 세포 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 화물은 기능적 핵산, 예컨대, 안티센스 분자, siRNA, 마이크로RNA(miRNA), 앱타머, 리보자임, RNAi, 또는 외부 가이드 서열, 또는 이를 암호화하는 핵산 작제물이다.
화물은 복수의 단일 핵산 분자, 또는 복수의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 상이한 핵산 분자를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 화물의 핵산 분자는 약 1 내지 약 25,000개의 핵염기 길이를 갖는 핵산 분자를 포함하거나 이로 이루어진다. 화물은 단일 가닥 핵산, 이중 가닥 핵산, 또는 이들의 조합일 수 있다.
복합체 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 복합체는 중합체 나노입자에 캡슐화된다. 표적화 모이어티, 세포 침투성 펩티드, 또는 이들의 조합은 나노입자와 연결되거나, 결합되거나, 접합되거나, 그렇지 않으면 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 복합체는 지질 나노입자에 캡슐화되지 않고, 캡슐화 기술을 불필요하게 만든다.
단독으로 또는 나노입자에 캡슐화된 유효량의 복합체와 세포를 접촉시킴으로써 핵산 화물을 세포 내로 전달하는 방법이 또한 제공된다. 접촉은 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내에서 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 생체 외 처리된 세포의 유효량은 이를 필요로 하는 대상체에게, 예를 들어, 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하기 위한 유효량으로 투여된다.
일부 구현예에서, 이러한 접촉은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여한 후 생체 내에서 발생한다. 대상체는 유전자 장애 또는 암과 같은 질환 또는 장애를 가질 수 있다. 조성물은, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의해, 대상체에서 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 감소시키기 위한 유효량으로 대상체에게 투여될 수 있다.
조성물 및 방법의 응용이 또한 제공되며, 유전자 요법 및 T 세포 또는 CAR T 세포 제조/형성/요법을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
도 1a-1c는 대조군(1a) 및 단독(1b)일 때 및 1시간 동안 3E10과 혼합된 경우(1c) PNA의 흡수를 보여주는 산포도이다. 도 1d는 도 1a-1c의 데이터를 정량화한 막대 그래프이다.
도 2a-2c는 대조군(2a) 및 단독(2b)일 때 및 24시간 동안 3E10과 혼합된 경우(2c) PNA의 흡수를 보여주는 산포도이다. 도 2d는 도 2a-2c의 데이터를 정량화한 막대 그래프이다.
도 3a-3c는 대조군(3a) 및 단독(3b)일 때 및 24시간 동안 3E10과 혼합된 경우(3c) siRNA의 흡수를 보여주는 산포도이다. 도 3d는 도 3a-3c의 데이터를 정량화한 막대 그래프이다.
도 4a-4h는 대조군(4a) 및 단독(4b)일 때 및 24시간 동안 3E10과 다양한 농도로 혼합된 경우(4c-4h) mRNA의 흡수를 보여주는 산포도이다. 도 4i는 도 4a-4h의 데이터를 정량화한 막대 그래프이다.
도 5a-5h는 대조군(5a) 및 단독(5b)일 때 및 1시간 동안 3E10과 다양한 농도로 혼합된 경우(5c-5h) mRNA의 흡수를 보여주는 산포도이다. 도 5i는 도 5a-5h의 데이터를 정량화한 막대 그래프이다.
도 6은 3E10과 72 시간 혼합 후 24시간 동안 세포와 인큐베이션한 후 GFP 리포터 플라스미드 DNA의 세포 발현을 보여주는 일련의 이미지이다.
도 7a는 마우스에게 전신 주사하기 전에 실온에서 15분 동안 증가하는 용량의 3E10(0.25, 0.5, 및 1 mg)과 혼합된 형광 표지된 siRNA의 종양에서의 축적을 보여주는 막대 그래프이다. 도 7b는 마우스에 전신 주사하기 전에 실온에서 15분 동안 1 mg 3E10 또는 0.1 mg D31N 변이체 3E10과 혼합된 형광 표지된 siRNA의 종양에서의 축적을 보여주는 막대 그래프이다. 모든 종양을 주사 후 24시간 시점에 분석하였다.
도 8은 시간(IM 주사 후 일수)에 따라 마우스 근육(IM)으로의 3E10 매개 mRNA(생물발광(광자/초))의 전달을 보여주는 선 그래프이다.
도 9a 및 9b는 주사 후 24시간 시점에 IVIS(Perkin Elmer)에 의해 이미지화된 대조군(도 9a) 및 IV 주사된 3E10-D31N의 근육으로의 분포(도 9b)를 보여주는 이미지이다. 도 9c는 IVIS 이미지에서 형광을 정량화한 막대 그래프이다.
도 10은 마우스에 VivoTag680(Perkin Elmer)으로 표지된 3E10-D31N을 100 μg 또는 200 μg 정맥 내 주사한 후 24시간 후에 조직에 대한 3E10-D31N의 용량 의존적 생체분포의 IVIS 이미지에서의 형광을 정량화한 막대 그래프이다.
도 11a 및 11b는 주사 후 24시간 시점에 IVIS (Perkin Elmer)에 의해 이미지화된 대조군(도 11a) 및 동계 결장 종양(CT26)에 대한 IV 주사된 3E10-D31N의 분포(도 11b)를 보여주는 이미지이다. 도 11c는 IVIS 이미지에서 형광을 정량화한 막대 그래프이다.
도 12a, 12b 및 도 12c는 주사 24시간 후에 IVIS (Perkin Elmer)에 의해 이미지화된 대조군(도 12a) 및 IV 주사된 내이키드 단일 가닥 DNA(ssDNA)(도 12b) 및 3E10-D31N + ssDNA(도 12c)의 동계 결장 종양 분포(CT26)를 보여주는 이미지이다. 도 12d는 IVIS 이미지에서 형광을 정량화한 막대 그래프이다.
도 13은 RIG-I의 3E10 매개 전달 및 자극을 보여주는 막대 그래프이다.
도 14a는 3E10의 분자 모델링, 이의 추정 핵산 결합 포켓(NAB1), 및 그 안의 아미노산 돌연변이에 의해 유도된 예측된 구조적 변화의 예시이다. 도 14b는 점으로 강조된 NAB1 아미노산 잔기를 갖는 3E10-scFv(Pymol)의 분자 모델링의 예시이다. 도 14c는 3E10의 추정 핵산 결합 포켓에 대한 아미노산 서열 맵핑을 도시한다.
도 15a 및 15b는 ELISA에 의해 측정했을 때, 단일(15a) 및 이중 가닥 DNA(15b)에 대한 3E10 결합을 보여주는 막대 그래프이다.
도 16은 단일 뉴클레오티드 반복을 함유하는 DNA 서열에 대한 3E10-D31N 결합을 보여주는 막대 그래프이다.
도 17a-17d는 단일 뉴클레오티드 반복(아데닌 (17a), 티민 (17b), 구아닌 (17c), 또는 시토신 (17d))을 함유하는 DNA 서열에 대한 3E10 변이체 결합을 보여주는 막대 그래프이다.
도 18a 및 18b는 RNA(폴리 아데닌, 시토신, 우라실, 구아닌, 또는 이노신 뉴클레오티드)에 대한 3E10-WT(18a) 및 3E10-D31N(18b) 결합을 보여주는 막대 그래프이다.
도 19a, 19b 및 19c는 실시예 9에 기술된 바와 같이, 3E10과 720 뉴클레오티드 mRNA 분자 사이에 형성된 복합체로 수행된 mRNA 보호 검정의 겔 전기영동을 보여준다.
도 20a 및 20b는 흑색종 세포 생존력에서 야생형(20a) 또는 D31N 3E10(20b) + 폴리(I:C)의 영향을 보여주는 막대 그래프이다.
도 21은 실시예 20에 기술된 바와 같이, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1 및 100:1 (3E10:mRNA) 몰 비로 제조된 3E10과 14 kb mRNA 분자 사이에 형성된 복합체로 수행된 mRNA 보호 검정의 겔 전기영동 분석을 보여준다.
정의.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단쇄 Fv" 또는 "scFv"는 scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 링커에 의해 결합된 단일 폴리펩티드 사슬 내 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 단쇄 가변 단편을 의미한다(즉, 단일 폴리펩티드 사슬의 VH 및 VL가 서로 결합하여 Fv를 형성함).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가변 영역"은 면역글로불린의 이러한 도메인을 항체에 의해 광범위하게 공유되는 도메인(예를 들어, 항체 Fc 도메인)으로부터 구별하기 위해 의도된다. 가변 영역은 잔기가 항원 결합을 담당하는 "초가변 영역"을 포함한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(즉, 일반적으로 경쇄 가변 도메인에서 대략적으로 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및 중쇄 가변 도메인에서 대략적으로 잔기 27-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); Kabat 등(Ed)의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 이러한 잔기(즉, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3) 및 중쇄 가변 도메인에서 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3); Chothia 및 Lesk의 문헌[1987, J. Mol. Biol. 196:901-917])를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "골격 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 표적 항원에 결합하는 천연 또는 합성 항체를 지칭한다. 이러한 용어는 다클론 항체 및 단클론 항체를 포함한다. 온전한 면역글로불린 분자 이외에, 용어 "항체"에는 이들 면역글로불린 분자의 결합 단백질, 단편 및 중합체, 및 표적 항원에 결합하는 면역글로불린 분자의 인간 또는 인간화된 버전도 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 침투성 항체"는 살아있는 포유류 세포의 세포질 및/또는 핵 내로 수송되는 면역글로불린 단백질, 이의 단편, 변이체, 또는 이에 기반한 융합 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 항체는 담체 또는 접합체의 도움 없이 세포의 세포질 내로 수송된다. 일부 구현예에서, 세포 침투성 항체는 담체 또는 접합체 유무에 관계없이 핵 내로 수송된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체"는 기준 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 상이하지만 필수적 특성을 보유하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 폴리펩티드의 통상적인 변이체는 다른 기준 폴리펩티드와 아미노산 서열이 상이하다. 일반적으로, 기준 폴리펩티드 및 변이체의 서열이 전체적으로 매우 유사하고, 많은 영역에서 동일하도록 차이가 제한된다. 변이체 및 기준 폴리펩티드는 하나 이상의 변형(예를 들어, 치환, 첨가 및/또는 결실)에 의해 아미노산 서열이 상이할 수있다. 치환되거나 삽입된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 암호화되거나 암호화되지 않은 것일 수 있다. 폴리펩티드의 변이체는 대립 유전자 변이체와 같이 자연적으로 발생할 수 있거나, 자연적으로 발생하는 것으로 알려지지 않은 변이체일 수 있다.
아미노산 변화를 만들 때, 아미노산의 친수성 지수를 고려할 수 있다. 폴리펩티드에 대한 상호 작용적 생물학적 기능을 부여하는 데 있어서의 친수성 아미노산 지수의 중요성은 당업계에서 일반적으로 이해된다. 각각의 아미노산에는 소수성 및 전하 특성에 기초하여 친수성 지수가 할당되었다. 이러한 지수는 다음과 같다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루탐산(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르탐산(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
아미노산의 상대적 친수성 특성은 생성된 폴리펩티드의 이차 구조를 결정하며, 이는 결국 다른 분자와의 폴리펩티드의 상호작용을 정의하는 것으로 여겨진다. 이러한 변화에서, 친수성 지수가 ± 2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ± 1 이내가 특히 바람직하며, ± 0.5 이내가 더욱 바람직하다.
유사한 아미노산의 치환은 또한 친수성에 기초하여 이루어질 수 있는데, 특히, 이와 같이 생성된 생물학적으로 기능적으로 동등한 폴리펩티드 또는 펩티드는 면역학적 구현예에 사용하기 위한 것이다. 다음의 친수성 값이 아미노산 잔기에 할당되었다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파르탐산(+3.0 ± 1); 글루타민산(+3.0 ± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 프롤린(-0.5 ± 1); 트레오닌(-0.4); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 이러한 변화에서, 친수성 값이 ± 2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ± 1 이내인 아미노산이 특히 바람직하며, ± 0.5 이내인 아미노산의 치환이 훨씬 더 바람직하다.
전술한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적인 유사성, 예를 들어, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초한다. 전술한 다양한 특징을 고려하는 예시적인 치환은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 다음을 포함한다(원래 잔기: 예시적인 치환): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gln, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gln: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gln), (Ile: Leu, Val), (Leu: Ile, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Tip: Tyr), (Tyr: Trp, Phe), 및 (Val: Ile, Leu). 따라서, 본 개시의 구현예는 전술한 바와 같은 폴리펩티드의 기능적 또는 생물학적 등가물을 고려한다. 특히, 폴리펩티드의 구현예는 관심 폴리펩티드에 대해 약 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "서열 동일성의 백분율(%)"은 최대 서열 동일성 백분율을 달성하기 위해 서열을 정렬하고, 필요한 경우 갭을 도입한 후, 기준 핵산 서열에서의 뉴클레오티드 또는 아미노산과 동일한 후보 서열에서의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 백분율로서 정의된다. 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 목적의 정렬은 해당 분야 내의 다양한 기술, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터는 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합하는"은 다른 항원에 유의하게 결합하지 않으면서 항체의 동족 항원(예를 들어, DNA 또는 RNA)에 대한 항체의 결합을 지칭한다. 이러한 조건 하에서 표적에 대한 항체의 특이적 결합은 항체가 표적에 대한 특이성에 대해 선택되는 것을 필요로 한다. 다양한 면역분석 포맷이 특정 항원과 특이적으로 면역 반응성인 항체를 선택하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역분석법은 항원과 특이적으로 면역 반응성인 단클론 항체를 선택하는 데 일상적으로 사용된다. 특이적 면역 반응성을 결정하는 데 사용될 수 있는 면역검정 포맷 및 조건에 대한 설명은, 예를 들어, Harlow 및 Lane의 문헌[(1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publishations, New York]을 참조한다. 바람직하게는, 항체는 제2 분자와 약 105 mol-1 (e.g., 106 mol-1, 107 mol-1, 108 mol-1, 109 mol-1, 1010 mol-1, 1011 mol-1, 및 1012 mol-1　이상) 초과의 친화도 상수(Ka)로 항원에 "특이적으로 결합한다".
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단클론 항체" 또는 "MAb"는 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 집단 내의 개별 항체는 항체 분자의 작은 하위 집합에 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 투여의 표적인 임의의 개체를 의미한다. 대상체는 척추동물, 예를 들어 포유동물일 수 있다. 따라서, 대상체는 인간일 수 있다. 본 용어는 특정 연령 또는 성별을 나타내지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은 사용된 조성물의 양이 질환 또는 장애의 하나 이상의 원인 또는 증상을 개선시키기에 충분한 양임을 의미한다. 이러한 개선은 감소 또는 변경만을 필요로 하며, 반드시 제거되는 것은 아니다. 정확한 투여량은 대상체-의존적 변수(예를 들어, 연령, 면역계 건강 등), 치료 중인 질환 또는 장애, 뿐만 아니라 투여 경로 및 투여 중인 제제의 약동학과 같은 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 생물학적으로가 아닌 또는 달리 바람직하지 않은 물질을 지칭하며, 즉, 이 물질은 유의한 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않거나 이를 함유하는 약학적 조성물의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않고 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "담체" 또는 "부형제"는 하나 이상의 활성 성분이 조합된, 제형 내의 유기 또는 무기 성분, 천연 또는 합성 비활성 성분을 지칭한다. 담체 또는 부형제는 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 활성 성분의 임의의 분해를 최소화하고 대상체에서 임의의 부작용을 최소화하도록 자연적으로 선택될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료"는 질환, 병리학적 상태 또는 장애를 치유, 개선, 안정화 또는 예방하기 위한 의도로 환자의 의학적 관리를 지칭한다. 이 용어는 활성 치료, 즉 질환, 병리학적 상태 또는 장애의 개선을 구체적으로 지향하는 치료를 포함하며, 또한 인과적 치료, 즉 관련 질환, 병리학적 상태 또는 장애의 원인을 제거하는 것을 지향하는 치료를 포함한다. 또한, 이 용어는 완화 치료, 즉, 질환, 병리학적 상태, 또는 장애의 치유보다는 증상의 완화를 위해 설계된 치료; 예방 치료, 즉, 관련 질환, 병리학적 상태, 또는 장애의 발생을 최소화하거나 부분적으로 또는 완전히 억제하도록 의도된 치료; 및 지지 치료, 즉, 연관된 질환, 병리학적 상태, 또는 장애의 개선을 지향하는 또 다른 구체적인 요법을 보충하기 위해 사용된 치료를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "표적화 모이어티"는 입자, 분자 또는 복합체를 선택된 세포 또는 조직 유형 상의 수용체 부위로 유도할 수 있는 물질이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "유도하다"는 분자 또는 복합체가 선택된 세포 또는 조직 유형에 우선적으로 부착되도록 하는 것을 지칭한다. 이는 이하에서 논의되는 바와 같이 복합체를 유도하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "억제" 또는 "감소"는 활성, 반응, 병태, 질환, 또는 다른 생물학적 파라미터를 감소시키는 것을 의미한다. 이는 활성, 반응, 병태 또는 질환의 완전한 제거를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 이는 또한, 예를 들어, 자연 수준 또는 대조군 수준 대비 활성, 반응, 병태 또는 질환의 통계적으로 유의한 감소를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "융합 단백질"은 하나의 폴리펩티드의 아미노 말단과 또 다른 폴리펩티드의 카르복실 말단 사이에 형성된 펩티드 결합을 통해 2개 이상의 폴리펩티드의 결합에 의해 형성된 폴리펩티드를 지칭한다. 융합 단백질은 구성 폴리펩티드의 화학적 결합에 의해 형성될 수 있거나, 단일 연속 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열로부터 단일 폴리펩티드로서 발현될 수 있다. 단쇄 융합 단백질은 단일 연속 폴리펩티드 골격을 갖는 융합 단백질이다. 융합 단백질은 분자 생물학의 종래의 기술을 사용하여 2개의 유전자를 프레임에서 단일 핵산 서열로 연결한 다음, 융합 단백질이 생산되는 조건 하에 적절한 숙주 세포 내에서 핵산을 발현시킴으로써 제조될 수 있다.
본원에서 값의 범위의 인용은, 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 단지 범위 내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 지칭하는 짧은 방법으로서의 역할을 하도록 의도되며, 각각의 별도의 값은 마치 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다.
용어 "약"의 사용은 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 대략 +/- 10%의 범위에서 언급된 값의 위 또는 아래에 있는 값을 설명하도록 의도된다.
본원에 기술된 모든 방법은 달리 표시되지 않거나 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된 임의의 그리고 모든 실시예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 구현예를 더 잘 밝히기 위한 의도이고, 달리 청구되지 않는 한 구현예의 범위에 대한 제한을 제기하지 않는다. 본 명세서 내의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 것으로서 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
조성물
3E10 항체가 핵산을 형질막을 가로질러 세포 세포질 및 핵 내로 전달하는 것을 돕는 것이 발견되었다. 따라서, 핵산 작제물의 전달을 향상시키기 위해 3E10을 사용하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 통상적으로, 유효량의 3E10 항체가 세포 내로의 전달이 바람직한 핵산과 접촉된다. 통상적으로, 접촉은 3E10 및 핵산 화물이 복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 일어난다. 복합체는 핵산 화물이 세포 내로 전달되기에 충분한 시간 동안 세포와 접촉된다. 세포가 항체의 부재 하에 핵산 화물과 접촉된 경우보다 더 많은 양, 더 좋은 품질(예를 들어, 더 온전한, 기능적인 등), 또는 더 빠른 속도, 또는 이들의 조합으로 화물이 축적될 수 있다. 항체가 전달 수단의 역할을 하기 때문에, 전달 시스템은 통상적으로 비-바이러스이다.
A. 3E10 항체
일반적으로 본원에서 "3E10" 또는 "3E10 항체"로 지칭되지만, 이러한 구절에 항원 결합 단편, 변이체, 및 scFv, 디-scFv, 트리-scFv, 및 다른 단쇄 가변 단편을 포함하는 단편 및 결합 단백질, 및 본원에 개시된 다른 세포 침투성 핵산 수송 분자가 포함되며 본원에 개시된 조성물 및 방법에서 사용하기 위해 명시적으로 제공된다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 항체 및 다른 결합 단백질은 본원에서 세포 침투성으로도 지칭된다.
바람직한 구현예에서, 3E10 항체는 담체 또는 접합체의 도움 없이 세포의 세포질 및/또는 핵 내로 운반된다. 예를 들어, 세포독성 효과 없이 포유류 세포의 핵으로 생체 내에서 수송되는 단클론 항체 3E10 및 이의 활성 단편은 Richard Weisbart의 미국 특허 제4,812,397호 및 제7,189,396호에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 항체는 Rad51에 결합하고/하거나 Rad51을 억제할 수 있다. 예를 들어, Turchick 등의 문헌[Nucleic Acids Res., 45(20): 11782-11799 (2017)], WO 2020/047344, 및 WO 2020/047353]에 기술된 항체를 참조한다(이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 구체적으로 통합됨).
조성물 및 방법에 사용될 수 있는 항체는 임의의 부류의 전체 면역글로불린(즉, 온전한 항체), 이의 단편, 및 항체의 적어도 항원 결합 가변 도메인을 함유하는 합성 단백질을 포함한다. 항원 결합 활성은 통상적으로 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역이라고 불리는 3개의 분절에 농축된다. 가변 도메인의 더욱 높게 보존된 부분을 골격(FR)이라고 한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR 영역을 포함하며, 주로 베타-시트 형태를 채택하고, 3개의 CDR에 의해 연결되며, 이는 베타-시트 구조와 연결되고, 일부 경우에, 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 사슬에서의 CDR은 FR 영역에 매우 근접하여 함께 유지되고, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 따라서, 통상적으로 항체는 적어도 핵산 결합을 유지하는 데 필요한 CDR을 함유한다.
3E10 항체는 통상적으로 3E10과 동일하거나 상이한 에피토프(들)에 결합하는 단클론 3E10, 또는 이의 변이체, 유도체, 단편, 융합, 또는 인간화 형태이다.
2000년 9월 6일, 단클론 항체 3E10을 생산하는 하이브리도마 세포주의 부다페스트 조약의 조건에 따른 수탁물을 수령하여, American Type Culture Collection(ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA)에 수여되고, 특허 기탁 번호 PTA-2439가 주어졌다.
따라서, 항체는 ATCC No. PTA 2439 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체 3E10과 동일하거나 상이한 에피토프 특이성을 가질 수 있다. 항체는 단클론 항체 3E10의 파라토프를 가질 수 있다. 항체는 3E10의 단쇄 가변 단편, 또는 변이체, 예를 들어, 이의 보존적 변이체일 수 있다. 예를 들어, 항체는 3E10(3E10 Fv)의 단쇄 가변 단편, 또는 이의 변이체일 수 있다.
1. 3E10 서열
단클론 항체 3E10의 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 3E10 중쇄 및 경쇄의 서열이 아래에 제공되며, 여기서 단일 밑줄은 Kabat 시스템에 따라 식별된 CDR 영역을 나타내고, 서열번호 12-14 내 이탤릭체는 가변 영역을 나타내고, 이중 밑줄은 신호 펩티드를 나타낸다. IMGT 시스템에 따른 CDR도 제공된다.
a. 3E10 중쇄
일부 구현예에서, 3E10의 중쇄 가변 영역은 다음과 같다: EVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFS D YGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSS(서열번호 1; Zack 등의 문헌[Immunology and Cell Biology, 72:513-520 (1994); GenBank: L16981.1 - 마우스 Ig 재배열 L-사슬 유전자, 부분적 cds; 및 GenBank: AAA65679.1 - 면역글로불린 중쇄, 부분적[Mus musculus]).
일부 구현예에서, 3E10 중쇄는 MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFS D YGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (3E10 WT 중쇄; 서열번호 12)로서 표현된다.
예를 들어, Zack 등의 문헌[J. Immunol., 157(5):2082-8 (1996)]에 개시된 바와 같이, 야생형 서열에 돌연변이를 포함하는 3E10 항체의 변이체도 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 3E10의 중쇄 가변 영역의 아미노산 위치 31은 항체 및 이의 단편의 핵에 침투하고 DNA에 결합하는 능력에 영향을 미치는 것으로 결정되었다(서열번호 1, 2 및 13에서 굵게 표시됨). CDR1에서 D31N 돌연변이(서열번호 2 및 13에서 굵게 표시됨)는 핵에 침투하고, 원래 항체보다 훨씬 더 큰 효율로 DNA에 결합한다(Zack 등의 문헌[Immunology and Cell Biology, 72:513-520 (1994)], Weisbart 등의 문헌[J. Autoimmun., 11, 539-546 (1998)]; Weisbart 등의 문헌[Int. J. Oncol., 25, 1867-1873 (2004)]). 일부 구현예에서, 항체는 D31N 치환을 갖는다.
일부 구현예에서, 3E10의 중쇄 가변 영역의 바람직한 변이체에 대한 아미노산 서열은 다음과 같다: EVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFS N YGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSS (서열번호 2).
일부 구현예에서, 3E10 중쇄는 MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFS N YGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (3E10 D31N 변이체중쇄; 서열번호 13).
일부 구현예에서, 서열번호 1 또는 2의 C-말단 세린은 3E10 중쇄 가변 영역에서 없거나, 예를 들어, 알라닌으로 치환된다.
Kabat에 의해 식별된 상보성 결정 영역(CDR)은 위에 밑줄로 표시되어 있고 CDR H1.1(원래 서열): DYGMH (서열번호 15); CDR H1.2 (D31N 돌연변이 가짐): NYGMH (서열번호 16); CDR H2.1: YISSGSSTIYYADTVKG (서열번호 17); CDR H3.1: RGLLDY (서열번호 18)를 포함한다.
Kabat CDR H2.1의 변이체는 YISSGSSTIYYADSVKG(서열번호 19) 및 YISSSSSTIYYADSVKG(서열번호 42)를 포함한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)은 IMGT 시스템에 따라 정의될 수 있다. IMGT 시스템에 의해 식별된 상보성 결정 영역(CDR)은 CDR H1.3(원래 서열): GFTFSDYG(서열번호 20); CDR H1.4(D31N 돌연변이 가짐): GFTFSNYG(서열번호 21); CDR H2.2: ISSGSSTI(서열번호 22) 및 변이체 ISSSSSTI(서열번호 43); CDR H3.2: ARRGLLLDY(서열번호 23)를 포함한다.
b. 3E10 경쇄
일부 구현예에서, 3E10의 경쇄 가변 영역은 다음과 같다: DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIK (서열번호 7).
3E10의 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 또한 다음과 같을 수 있다: DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFHLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLELK (서열번호 8).
일부 구현예에서, 3E10 경쇄는 MGWSCIILFLVATATGVHSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (3E10 WT 경쇄; 서열번호 14)로 표현된다.
다른 3E10 경쇄 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Zack 등의 문헌[J. Immunol., 15;154(4):1987-94 (1995)]; GenBank: L16981.1 - 마우스 Ig 재배열된 L-사슬 유전자, 부분 cds; GenBank: AAA65681.1 - 면역글로불린 경쇄, 부분[Mus muscucleus])을 참조한다.
Kabat에 의해 식별된 상보성 결정 영역(CDR)은 밑줄로 표시되어 있고 CDR L1.1: RASKSVSTSYSYMH(서열번호 24); CDR L2.1: YASYLES(서열번호 25); CDR L3.1: QHSREFPWT(서열번호 26)를 포함한다.
Kabat CDR L1.1의 변이체는 RASKSVSTSSYSYLA(서열번호 27) 및 RASKTVSTSSYSYMH(서열번호 44)를 포함한다.
Kabat CDR L2.1의 변이체는 YASYLQS(서열번호 28)이다.
추가적으로 또는 대안적으로, 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)은 IMGT 시스템에 따라 정의될 수 있다. IMGT 시스템에 의해 식별된 상보성 결정 영역(CDR)은 CDR L1.2 KSVSTSSYSY(서열번호 29) 및 변이체 KTVSTSSYSY(서열번호 45); CDR L2.2: YAS(서열번호 30); CDR L3.2: QHSREFPWT(서열번호 26)를 포함한다.
일부 구현예에서, 서열번호 7 또는 8의 서열의 C-말단 단부는 3E10 경쇄 가변 영역에 아르기닌을 추가로 포함한다.
2. 인간화 3E10
일부 구현예에서, 항체는 인간화 항체이다. 비인간 항체를 인간화하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간인 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "수입" 잔기로 지칭되며, 이는 통상적으로 "수입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 항체 인간화 기술은 일반적으로 항체 분자의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 암호화하는 DNA 서열을 조작하기 위한 재조합 DNA 기술의 사용을 포함한다.
예시적인 3E10 인간화 서열은 WO 2015/106290, WO 2016/033324, WO 2019/018426, 및 WO/2019/018428에서 논의되고, 아래에 제공된다.
a. 인간화 3E10 중쇄 가변 영역
일부 구현예에서, 인간화 3E10 중쇄 가변 도메인은 EVQLVQSGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (hVH1, 서열번호3), 또는 EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMTSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSS (hVH2, 서열번호4), 또는 EVQLQESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWIRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRSEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTLVTVSS (hVH3, 서열번호5), 또는 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEYVSYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVKRGLLLDYWGQGTLVTVSS (hVH4, 서열번호6), 또는 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 2, 6 및 10, 서열번호 46), 또는 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 3, 7 및 11, 서열번호 47), 또는 EVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 4, 8 및 12, 서열번호 48), 또는 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 13, 16 및 19, 서열번호 50), 또는 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 14 및 17, 서열번호 51), 또는 EVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 15 및 18, 서열번호 52)를 포함한다.
b. 인간화 3E10 경쇄 가변 영역
일부 구현예에서, 인간화 3E10 경쇄 가변 도메인은 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYLAWYQQKPEKAPKLLIKYASYLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGAGTKLELK (hVL1, 서열번호 9), 또는 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPEKAPKLLIKYASYLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHSREFPWTFGAGTKLELK (hVL2, 서열번호 10), 또는 DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIK (hVL3, 서열번호 11) DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIK (변이체 2, 3 및 4, 서열번호 53), 또는 DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIK (변이체 6, 7 및 8, 서열번호 54), 또는 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIK (변이체 10, 11 및 12, 서열번호 55), 또는 DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIK (변이체 13, 14 및 15, 서열번호 56), 또는 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIK (변이체 16, 17 및 18, 서열번호 57), 또는 DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIK (변이체 19, 서열번호 58)를 포함한다.
c. 세포 침투 및 핵 국소화
개시된 조성물 및 방법은 통상적으로 세포, 및 선택적으로 핵으로 침투하는 능력을 유지하는 항체를 이용한다.
자가항체에 의한 세포 내재화 기전은 다양하다. 일부는 정전기적 상호작용 또는 FcR-매개 세포내이입을 통해 세포 내로 유입되는 반면, 다른 일부는 세포 표면 미오신 또는 칼레티쿨린과의 결합에 기초한 기전을 사용한 후, 세포내이입이 이어진다(Ying-Chyi 등의 문헌[Eur J Immunol 38, 3178-3190 (2008)], Yanase 등의 문헌[J Clin Invest 100, 25-31 (1997)]). 3E10은 (Fc가 없는 3E10 단편의 세포 침투 능력에 의해 입증된 바와 같이) Fc-독립 기전으로 세포에 침투하지만, 뉴클레오시드 수송체 ENT2의 존재와 관련된다(Weisbart 등의 문헌[Sci Rep 5:12022. doi: 10.1038/srep12022. (2015)], Zack 등의 문헌[J Immunol 157, 2082-2088 (1996)], Hansen 등의 문헌[J Biol Chem 282, 20790-20793 (2007)]). 따라서, 일부 구현예에서, 개시된 조성물 및 방법에 사용된 항체는 Fc-독립 기전으로 세포에 침투하지만 뉴클레오시드 수송체 ENT2의 존재와 연관된 항체이다.
핵산에 결합하는 능력을 방해하는 3E10에서의 돌연변이는 항체가 핵 침투를 할 수 없게 할 수 있다. 따라서, 통상적으로 개시된 변이체 및 항체의 인간화 형태는 핵산에 결합하는 능력을 유지한다. 또한, 3E10 scFv는 ENT2-의존적 방식으로 살아있는 세포 및 핵 내로 침투할 수 있고 흡수 효율은 ENT2 결핍 세포에서 손상되는 것으로 이전에 밝혀졌다(Hansen 등의 문헌[J. Biol. Chem. 282, 20790-20793 (2007)]). 따라서, 일부 구현예에서, 개시된 항체의 변이체 및 인간화 형태는 ENT-의존적, 바람직하게는 ENT2-의존적 방식으로 세포 핵 내로 침투하는 능력을 유지한다.
WO 2019/152806 및 WO 2019/152808에서 논의된 바와 같이, 일부 인간화 3E10 변이체는 원래의 쥣과 동물 3E10(D31N) 디-scFv보다 더 효율적으로 세포 핵으로 침투하는 것으로 밝혀졌지만, 다른 것들은 핵으로 침투하는 능력을 상실한 것으로 밝혀졌다. 특히, 변이체 10 및 13은 쥣과 항체와 비교해 핵에 매우 잘 침투하였다.
인간화 3E10 VL에서의 잠재적 이분 핵 국소화 신호(NLS)가 식별되었으며, 다음 서열의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다: RASK S VSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKY (서열번호 88); RASK T VSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKY (서열번호 89); 또는 RVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKL (서열번호 90).
예시적인 컨센서스 NLS는 다음과 같거나 다음을 포함할 수 있다, (X)RASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLL(X)KY (여기서 (X)는 임의의 잔기이지만, 바람직하게는 염기성 잔기(R 또는 K)(서열번호 91) 또는 서열번호 53과 적어도 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체이다.
따라서, 일부 구현예에서, 특히 핵 수입이 중요한 경우, 개시된 항체는 서열번호 88-91 중 어느 하나의 서열, 또는 세포의 핵 내로 이동할 수 있는 이의 단편 및 변이체(예를 들어, 서열번호 88-91 중 어느 하나와 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 가짐)를 포함할 수 있다.
NLS의 존재는 3E10이 핵 수입 경로를 통해 핵 외피를 통과할 수 있음을 나타낸다. 일부 구현예에서, NLS는 수입 경로의 하나 이상의 구성원과 상호 작용함으로써 수입을 개선한다. 따라서, 일부 구현예에서, NLS는 임포틴-β, 임포틴-β/임포틴-α 이종이량체, 또는 이들의 조합에 결합할 수 있다.
3. 핵산 결합
개시된 조성물 및 방법은 통상적으로 DNA, RNA, 또는 이들의 조합과 같은 핵산에 결합하는 능력을 유지하는 항체를 이용한다.
아래의 실시예는 3E10 및 추가 3E10 변이체의 분자 모델링을 도시한다. 3E10(Pymol)의 분자 모델링은 추정 핵산 결합 포켓(NAB1)을 밝혀냈고(예를 들어, 도 14a 및 14b 참조), 아래 서열에 밑줄을 그어 도시하였다.
WT 중쇄 scFv 서열
E VQLVESGGGL VKPGGSRKLSCAASGFTFSD YGMHWVRQAP EKGLEWVAYISSGSSTIYYA DTVKGRFTIS RDNAKNTLFL QMTSLRSEDT AMYYCARRGL LLDYWGQGTT LTVS (서열번호 92)
경쇄 scFv 서열
DIVLTQSPASL AVSLGQRATI SCRASKSVST SSYSYMHWYQ QKPGQPPKLL IKYASYLESG VPARFSGSGS GTDFTLNIHP VEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIK RADAAPGGGG SGGGGSGGGGS (서열번호 93)
일부 구현예에서, 개시된 항체는 밑줄 친 NAB1 서열의 일부 또는 전부를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 핵산에 결합하는 능력이 변경된 변이체 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, NAB1에서의 돌연변이(예를 들어, 치환, 삽입 및/또는 결실)는 DNA, RNA, 또는 이들의 조합과 같은 핵산에 대한 항체의 결합을 개선한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 보존적 치환이다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 NAB1 포켓의 양이온 전하를 증가시킨다.
본원에서 논의되고 예시된 바와 같이, CDR1의 잔기 31에서 아스파르트산의 아스파라긴으로의 돌연변이는 이러한 잔기의 양이온 전하를 증가시키고 생체 내에서 핵산 결합 및 전달을 향상시켰다(3E10-D31N).
추가적인 예시적인 변이체는 CDR1의 잔기 31에서 아스파르트산의 아르기닌(3E10-D31R)(모델링은 양이온 전하를 확장시키는 것을 나타냄) 또는 리신(3E10-D31K)(모델링은 전하 배향의 변화를 나타냄)으로의 돌연변이를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 3E10 결합 단백질은 D31R 또는 D31K 치환을 포함한다.
추가의 예시적인 변이체는 단독으로 또는 D31N, D31R, 또는 D31K와의 조합하는 아르기닌(R) 96에서 아스파라긴(N)으로의 돌연변이, 및/또는 세린(S) 30에서 아스파르트산(D)으로의 돌연변이를 포함한다.
3E10 D31 또는 N31에 상응하는 잔기를 갖는 본원에 개시된 모든 서열은 D31R 또는 D31K 또는 N31R 또는 N31K 치환으로 명시적으로 개시된다.
3E10(Pymol)의 분자 모델링은 추정 핵산 결합 포켓(NAB1)을 보여주었다(도 14a-14b). CDR1의 잔기 31에서 아스파르트산의 아스파라긴으로의 돌연변이는 이러한 잔기의 양이온 전하를 증가시키고 생체 내에서 핵산 결합 및 전달을 향상시켰다(3E10-D31N).
CDR1의 잔기 31에서 아스파르트산의 아르기닌(3E10-D31R)으로의 돌연변이는 양이온 전하를 추가로 증가시킨 반면, 리신(3E10-D31K)으로의 돌연변이는 전하 배향을 변화켰다(도 14a).
분자 모델링으로부터 예측된 NAB1 아미노산은 위의 중쇄 및 경쇄 서열에 밑줄이 그어져 있다. 도 14b는 점으로 도시된 NAB1 아미노산 잔기를 갖는 3E10-scFv(Pymol)의 분자 모델링을 보여주는 도면이다.
R96에 상응하는 잔기를 갖는 본원에 개시된 모든 서열은 R96N 치환으로 명시적으로 개시된다.
S30에 상응하는 잔기를 갖는 본원에 개시된 모든 서열은 S30D로 명시적으로 개시된다.
임의의 치환은 임의의 조합에 포함될 수 있다. 따라서, 잔기 31, 30 및 96의 임의의 조합에서 2개 또는 3개의 치환을 갖는 서열이 명시적으로 제공된다.
특정 구현예에서, 서열은 R96N 치환 없이, 단독으로 또는 30D와 조합하여 31N, 31K, 또는 31R을 갖는다. 따라서, 일부 구현예에서, 96에 상응하는 잔기는 N이 아니고, 보다 구체적인 구현예에서는 R이 유지된다.
4. 단편, 변이체 및 융합 단백질
항-핵산 항체는 3E10 또는 이의 인간화 형태의 가변 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 1-11 또는 46-58 중 어느 하나, 또는 서열번호 12-14 중 어느 하나의 중쇄 및/또는 경쇄)과 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 가변 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는 항체 단편 또는 융합 단백질로 이루어질 수 있다.
항-핵산 항체는 3E10 또는 이의 변이체 또는 인간화 형태의 CDR(들)의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 1-11 또는 46-58, 또는 서열번호 12-14 또는 서열번호 15-30 또는 42-45 중 어느 하나의 CDR(들)과 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 하나 이상의 CDR(들)을 포함하는 항체 단편 또는 융합 단백질로 이루어질 수 있다. 2개의 아미노산 서열의 동일성 백분율의 결정은 BLAST 단백질 비교에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 전술한 바람직한 가변 도메인의 CDR 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개 모두를 포함한다.
바람직하게는, 항체는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 중 각각 하나와 조합하여 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 중 각각 하나를 포함한다.
3E10에 대한 경쇄 가변 서열의 예측된 상보성 결정 영역(CDR)이 위에 제공된다. 또한 GenBank: AAA65681.1 - 면역글로불린 경쇄, 부분[Mus musculus] 및 GenBank: L34051.1 - 마우스 Ig 재배열된 카파-사슬 mRNA V 영역을 참고한다. 3E10에 대한 중쇄 가변 서열의 예측된 상보성 결정 영역(CDR)이 위에 제공된다. 또한, 예를 들어, Zack 등의 문헌[Immunology and Cell Biology, 72:513-520 (1994)], GenBank 등록 번호 AAA65679.1. Zach 등의 문헌[J. Immunol. 154 (4), 1987-1994 (1995)] 및 GenBank: L16982.1 - 마우스 Ig 재배열된 L-사슬 유전자, 부분 cds를 참고한다.
따라서, 일부 구현예에서, 세포 침투성 항체는 서열번호 1 또는 2의 CDR 또는 전체 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 또는 서열번호 12 또는 13의 중쇄 영역; 또는 서열번호 7 또는 8, 또는 서열번호 14의 경쇄 영역과 조합된 이의 인간화 형태; 또는 이의 인간화 형태를 함유한다. 일부 구현예에서, 세포 침투성 항체는 CDR, 서열번호 9, 10 또는 11과 조합하여 서열번호 3, 4, 5 또는 6의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 전체를 함유한다. 일부 구현예에서, 세포 침투성 항체는 서열번호 53-58 중 어느 하나와 조합하여 서열번호 46-48 또는 50-52 중 어느 하나의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 전체 또는 CDR를 함유한다.
3E10 D31 또는 N31에 상응하는 잔기를 갖는 본원에 개시된 모든 서열은 D31R 또는 D31K 또는 N31R 또는 N31K 치환으로 그 안에 명시적으로 개시된다. 따라서, 일부 구현예에서, 3E10 결합 단백질은 전술한 서열 또는 다음의 서열 중 어느 하나의 변이체이고, 여기서 3E10 중쇄의 잔기 31에 상응하는 아미노산 잔기는 아르기닌(R) 또는 리신(K)으로 치환된다.
또한, 핵산 전달 활성을 갖는 항체 단편이 포함된다. 단편의 활성이 변형되지 않은 항체 또는 항체 단편에 비해 유의하게 변형되거나 손상되지 않는 경우, 단편은, 다른 서열에 부착 여부에 관계없이, 특정 영역 또는 특정 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 치환, 또는 다른 선택된 변형을 포함한다.
기술은 또한 본 개시의 항체에 대해 특이적인 단쇄 항체의 생산에 적합할 수 있다. 단쇄 항체의 생산 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 단쇄 항체는 짧은 펩티드 링커를 사용하여 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 함께 융합함으로써 생성될 수 있고, 이에 의해 단일 분자 상의 항원 결합 부위를 재구성할 수 있다. 하나의 가변 도메인의 C-말단이 15 내지 25개의 아미노산 펩티드 또는 링커를 통해 다른 가변 도메인의 N-말단에 테더링되는 단쇄 항체 가변 단편(scFv)은 항원 결합 또는 결합의 특이성을 유의하게 파괴하지 않고 개발되었다. 링커는 중쇄 및 경쇄가 적절한 입체 배향으로 함께 결합할 수 있도록 선택된다.
항-핵산 항체는 이들의 핵산 전달 능력을 개선하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포 침투성 항-핵산 항체는 표적 세포의 세포질 및/또는 핵에서 치료 표적에 특이적인 또 다른 항체에 접합된다. 예를 들어, 세포 침투성 항-핵산 항체는 3E10 Fv 및 치료 표적에 특이적으로 결합하는 단클론 항체의 단쇄 가변 단편을 함유하는 융합 단백질일 수 있다. 다른 구현예에서, 세포 침투성 항-핵산 항체는 3E10으로부터 유래한 제1 중쇄 및 제1 경쇄, 및 치료 표적에 특이적으로 결합하는 단클론 항체로부터 유래한 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 갖는 이중특이적 항체이다.
3E10으로부터 유래한 제1 중쇄 및 제1 경쇄 및 표적에 특이적으로 결합하는 단클론 항체로부터 유래한 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 갖는 이중특이적 항체 및 다른 결합 단백질은 Weisbart 등의 문헌[Mol. Cancer Ther., 11(10):2169-73 (2012)], 및 Weisbart 등의 문헌[Int. J. Oncology, 25:1113-8 (2004)], 및 미국 특허 출원 제2013/0266570호에 논의되어 있고, 이들 문헌은 그 전체가 참조로서 구체적으로 통합된다. 일부 구현예에서, 표적은 표적 세포 유형, 조직, 기관 등에 특이적이다. 따라서, 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 표적 세포 유형, 조직, 기관에 복합체를 표적화하는 표적화 모이어티로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 중쇄 및 제2 경쇄는, 예를 들어, 바람직한 세포 유형에서 발현된 수용체 또는 리간드를 표적화함으로써 조혈 줄기 세포, CD34+ 세포, T 세포 또는 임의의 다른 바람직한 세포 유형을 표적으로 한다. 일부 구현예에서, 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 흉선, 비장 또는 암세포를 표적으로 한다.
일부 구현예에서, 특히 생체 내 T 세포를 표적화, 예를 들어, 항원 특이적 T 세포, CAR T 세포, 면역 세포 또는 CD3, CD7, 또는 CD8과 같은 T 세포 마커의 생체 내 생산이 표적화될 수 있다. 예를 들어, 항-CD8 항체 및 항-CD3 Fab 단편 둘 다 생체 내에서 T 세포를 표적화하는 데 사용되어 왔다(Pfeiffer 등의 문헌[EMBO MolMed., 10(11) (2018). pii: e9158. doi: 10.15252/emmm.201809158., Smith 등의 문헌[Nat Nanotechnol., 12(8):813-820 (2017). doi: 10.1038/nnano.2017.57]). 따라서, 일부 구현예에서, 3E10 항체 또는 항원 결합 단편 또는 융합 단백질은 이중특이적 항체 부분이며, 이중특이적 항체 부분은 CD3, CD7, CD8, 또는 다른 면역 세포(예를 들어, T 세포) 마커, 또는 흉선, 비장 또는 간과 같은 특정 조직에 대한 마커에 특이적으로 결합할 수 있다.
2가 단쇄 가변 단편(di-scFv)은 2개의 scFv를 연결함으로써 조작될 수 있다. 이는 2개의 VH 및 2개의 VL 영역을 갖는 단일 펩티드 사슬을 생산하여 탠덤 scFv를 생성함으로써 수행될 수 있다. ScFv는 2개의 가변 영역이 함께 접히기에는 너무 짧은 링커 펩티드(약 5개의 아미노산)로도 설계되어, scFv가 이량체화되도록 강제할 수 있다. 이러한 유형은 디아바디로 알려져 있다. 디아바디는 상응하는 scFv보다 최대 40배 낮은 해리 상수를 갖는 것으로 나타났으며, 이는 이들이 그들의 표적에 대해 훨씬 더 높은 친화도를 갖는다는 것을 의미한다. 여전히 더 짧은 링커(하나 또는 2개의 아미노산)는 삼량체(트리아바디 또는 트리바디)의 형성을 유도한다. 테트라바디도 생산되었다. 이들은 디아바디보다 표적에 대해 훨씬 더 높은 친화도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 항-핵산 항체는 3E10의 2개 이상의 결합된 단쇄 가변 단편(예를 들어, 3E10 디-scFv, 3E10 트리-scFv) 또는 이의 보존적 변이체를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 항-핵산 항체는 디아바디 또는 트리아바디(예를 들어, 3E10 디아바디, 3E10 트리아바디)이다. 3E10의 단일 및 2개 이상 결합된 단쇄 가변 단편에 대한 서열은 WO 2017/218825 및 WO 2016/033321에 제공된다.
항체의 기능은 항체 또는 이의 단편을 치료제와 결합시킴으로써 향상될 수 있다. 항체 또는 단편과 치료제의 이러한 결합은, 항체 또는 항체 단편 및 치료제를 포함하는, 면역접합체를 제조하거나 융합 단백질을 제조하거나, DNA 또는 RNA(예를 들어, siRNA)와 같은 핵산에 항체 또는 단편을 연결함으로써 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 침투성 항체는 그의 반감기를 변경하도록 변형된다. 일부 구현예에서, 항체의 반감기가 순환 또는 치료 부위에 더 긴 시간 동안 존재하도록 항체의 반감기를 증가시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 장기간 동안 순환 또는 치료될 위치에서 항체의 역가를 유지하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 구현예에서, 항-핵산 항체의 반감기는 잠재적 부작용을 감소시키기 위해 감소된다. 3E10Fv와 같은 항체 단편은 전체 크기 항체보다 짧은 반감기를 가질 수 있다. 반감기를 변경하는 다른 방법이 공지되어 있으며, 기술된 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는, 예를 들어, Xtend?? 항체 반감기 연장 기술(Xencor, Monrovia, CA)을 사용하여 반감기를 연장시키는 Fc 변이체로 조작될 수 있다.
a. 링커
본원에서 사용되는 용어 "링커"는, 제한 없이, 펩티드 링커를 포함한다. 펩티드 링커는 가변 영역에 의한 에피토프의 결합을 방해하지 않는 한 임의의 크기일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 하나 이상의 글리신 및/또는 세린 아미노산 잔기를 포함한다. 하나의 가변 도메인의 C-말단이 통상적으로 15 내지 25개의 아미노산 펩티드 또는 링커를 통해 다른 가변 도메인의 N-말단에 테더링되는 1가 단쇄 항체 가변 단편(scFv). 링커는 중쇄 및 경쇄가 적절한 입체 배향으로 함께 결합할 수 있도록 선택된다. 디아바디, 트리아바디 등에서의 링커는 통상적으로 위에서 논의한 바와 같은 1가 scFv의 링커보다 짧은 링커를 포함한다. 2가, 3가 및 기타 다가 scFv는 통상적으로 3개 이상의 링커를 포함한다. 링커는 길이 및/또는 아미노산 조성물이 동일하거나 상이할 수 있다. 따라서, 당업계에 공지된 바와 같이, scFv의 원하는 원자가에 기초하여 링커의 수, 링커(들)의 조성, 및 링커(들)의 길이를 결정할 수 있다. 링커(들)는 2가, 3가 및 기타 다가 scFv의 형성을 허용하거나 유도할 수 있다.
예를 들어, 링커는 4-8개 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 GQSSRSS(서열번호 31)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 링커는 15-20개 아미노산, 예를 들어, 18개 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 GQSSRSSSGGGSSGGGGS(서열번호 32)를 포함한다. 다른 가요성 링커는, 이에 한정되지는 않으나, 아미노산 서열 Gly-Ser, Gly-Ser-Gly-Ser(서열번호 33), Ala-Ser, Gly-Gly-Gly-Ser(서열번호 34), (Gly4-Ser)2(서열번호 35) 및 (Gly4-Ser)4 (서열번호 36), 및 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(서열번호 37)을 포함한다.
다른 예시적인 링커는, 예를 들어, RADAAPGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 59) 및 ASTKGPSVFPLAPLESSGS (서열번호 60)을 포함한다.
b. 예시적인 항-핵산 scFv 서열
모노-, 디- 및 트리-scFv를 포함하는 예시적인 쥣과 3E10 scFv 서열은 WO 2016/033321, WO 2017/218825, WO 2019/018426, 및 WO/2019/018428에 개시되어 있으며, 아래에 제공되어 있다. 개시된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 세포 침투성 항체는 예시적인 scFv, 및 이의 단편 및 변이체를 포함한다.
scFv 3E10(D31N)에 대한 아미노산 서열은 다음과 같다: AGIHDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSSLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH(서열번호 38).
서열번호 38을 참조하는 scFv 단백질 도메인의 주석
· AGIH 서열은 용해도를 증가시킨다(서열번호 38의 아미노산 1-4)
· Vk 가변 영역(서열번호 38의 아미노산 5-115)
· 경쇄 CH1(서열번호 38의 아미노산 116-121)의 초기(6 aa)
· (GGGGS)3(서열번호 37) 링커 (서열번호 38의 아미노산 122-136)
· VH 가변 영역(서열번호 38의 아미노산 137-252)
· Myc 태그(아미노산 253-268 서열번호 38)
· His 6 태그(서열번호 38의 아미노산 269-274)
3E10 디-scFv의 아미노산 서열 (D31N)
디-scFv 3E10(D31N)은 3E10의 2X 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 2가 단쇄 가변 단편이며, 여기서 중쇄의 위치 31에서의 아스파르트산은 아스파라긴으로 돌연변이된다. 디-scFv 3E10(D31N)에 대한 아미노산 서열은 다음과 같다: AGIHDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSSLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH(서열번호 39).
서열번호 39를 참조하는 scFv 단백질 도메인의 주석
· AGIH 서열은 용해도를 증가시킨다(서열번호 39의 아미노산 1-4)
· Vk 가변 영역(서열번호 39의 아미노산 5-115)
· 경쇄 CH1(서열번호 39의 아미노산 116-121)의 초기(6 aa)
· (GGGGS)3(서열번호 37) 링커(서열번호 39의 아미노산 122-136)
· VH 가변 영역(서열번호 39의 아미노산 137-252)
· 인간 IgG CH1 초기 13개 아미노산(서열번호 39의 아미노산 253-265)으로 이루어진 Fv 단편 사이의 링커
· 회전 서열(서열번호 39의 아미노산 266-271)
· Vk 가변 영역(서열번호 39의 아미노산 272-382)
· 경쇄 CH1의 초기(6 aa)(서열번호 39의 아미노산 383-388)
· (GGGGS)3 (서열번호 37) 링커(서열번호 39의 아미노산 389-403)
· VH 가변 영역(서열번호 39의 아미노산 404-519)
· Myc 태그(서열번호 39의 아미노산 520-535)
· His 6 태그(서열번호 39의 아미노산 536-541)
트리-scFv에 대한 아미노산 서열
트리-scFv 3E10(D31N)은 310E의 3X 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 삼중 단쇄 가변 단편이며, 중쇄의 위치 31에서의 아스파르트산은 아스파라긴으로 돌연변이된다. 트리-scFv 3E10(D31N)에 대한 아미노산 서열은 다음과 같다: AGIHDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRGLLLDYWGQGTTLTVSSLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH(서열번호 40).
서열번호 40을 참조하는 트리-scFv 단백질 도메인의 주석
· AGIH 서열은 용해도를 증가시킨다(서열번호 40의 아미노산 1-4)
· Vk 가변 영역(서열번호 40의 아미노산 5-115)
· 경쇄 CH1의 초기 (6 aa)(서열번호 40의 아미노산 116-121)
· (GGGGS)3(서열번호 37) 링커(서열번호 40의 아미노산 122-136)
· VH 가변 영역(서열번호 40의 아미노산 137-252)
· 인간 IgG CH1 초기 13개 아미노산(서열번호 40의 아미노산 253-265)으로 이루어진 Fv 단편 사이의 링커
· 회전 서열(서열번호 40의 아미노산 266-271)
· Vk 가변 영역(서열번호 40의 아미노산 272-382)
· 경쇄 CH1의 초기 (6 aa)(서열번호 40의 아미노산 383-388)
· (GGGGS)3(서열번호 37) 링커(서열번호 40의 아미노산 389-403)
· VH 가변 영역(서열번호 40의 아미노산 404-519)
· 인간 IgG CH1 초기 13개 아미노산(서열번호 40의 아미노산 520-532)으로 이루어진 Fv 단편 사이의 링커
· 회전 서열(서열번호 40의 아미노산 533-538)
· Vk 가변 영역(서열번호 40의 아미노산 539-649)
· 경쇄 CH1의 초기(6 aa)(서열번호 40의 아미노산 650-655)
· (GGGGS)3(서열번호 37) 링커(서열번호 40의 아미노산 656-670)
· VH 가변 영역(서열번호 40의 아미노산 671-786)
· Myc 태그(서열번호 40의 아미노산 787-802)
· His 6 태그(서열번호 40의 아미노산 803-808)
WO 2016/033321 및 Noble 등의 문헌[Cancer Research, 75(11):2285-2291 (2015)]은 디-scFv 및 트리-scFv가 1가 대응체와 비교하여 일부 개선되고 추가적인 활성을 갖는다는 것을 보여준다. 예시적인 융합 단백질 각각의 상이한 도메인에 대응하는 하위 서열도 또한 위에 제공된다. 당업자는 예시적인 융합 단백질 또는 이의 도메인이 위에서 보다 상세히 논의된 융합 단백질을 작제하는데 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 디-scFv는 VH 가변 도메인(예를 들어, 서열번호 39의 아미노산 404-519, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편)에 연결된 Vk 가변 영역(예를 들어, 서열번호 39의 아미노산 272-382, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편)을 포함하는 제2 scFv에 연결된 VH 가변 도메인(예를 들어, 서열번호 39의 아미노산 137-252, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편)에 연결된 Vk 가변 영역(예를 들어, 서열번호 39의 아미노산 5-115, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편)을 포함하는 제1 scFV를 포함한다. 일부 구현예에서, 트리-scFv는 VH 가변 도메인(예를 들어, 서열번호 40의 아미노산 671-786, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편)에 연결된 Vk 가변 영역(예를 들어, 서열번호 40의 아미노산 539-649, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편)을 포함하는 제3 scFv 도메인에 연결된 디-scFv를 포함한다.
Vk 가변 영역은, 예를 들어, 단독 또는 경쇄 CH1의 (6 aa)(서열번호 39의 아미노산 116-121)와 조합하여 링커(예를 들어, (GGGGS)3(서열번호 37)에 의해 VH 가변 도메인에 연결될 수 있다. 다른 적절한 링커는 위에서 논의되고 당업계에 공지되어 있다. scFv는 단독으로 또는 회전 서열(예를 들어, 서열번호 39의 아미노산266-271과 조합하여 링커(예를 들어, 서열번호 39의 인간 IgG CH1 초기 13개 아미노산(253-265))에 의해 연결될 수 있다. 다른 적절한 링커는 위에서 논의되고 당업계에 공지되어 있다.
따라서, 디-scFv는 서열번호 39의 아미노산 5-519를 포함할 수 있다. 트리-scFv는 서열번호 40의 아미노산 5-786를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 추가 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 융합 단백질은 용해도를 향상시키는 서열(예를 들어, 서열번호 39의 아미노산 1-4)을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 디-scFv는 서열번호 39의 아미노산 1-519를 포함할 수 있다. 트리-scFv는 서열번호 40의 아미노산 1-786를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 융합 단백질의 정제, 단리, 포획, 식별, 분리 등을 향상시키는 하나 이상의 도메인을 포함한다. 예시적인 도메인은, 예를 들어, Myc 태그(예를 들어, 서열번호 39의 아미노산 520-535) 및/또는 His 태그(예를 들어, 서열번호 39의 아미노산 536-541)를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 디-scFv는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 트리-scFv는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 대체 가능한 도메인 및 추가 도메인은 위에서 더 상세히 논의된다.
예시적인 3E10 인간화 Fv 서열은 WO 2016/033324: DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEYVSYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVKRGLLLDYWGQGTLVTVSS (서열번호 41).
예시적인 3E10 인간화 디-scFv 서열은 WO 2019/018426 및 WO/2019/018428에서 논의되며, 다음을 포함한다: DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 2, 서열번호 61), DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 3, 서열번호 62), DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 4, 서열번호 63), DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 6, 서열번호 64), DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 7, 서열번호 65), DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 8, 서열번호 66), DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 10, 서열번호 67), DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 11, 서열번호 68), DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 12, 서열번호 69), DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 13, 서열번호 70), DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 14, 서열번호 71), DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 15, 서열번호 72), DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 16, 서열번호 73), DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 17, 서열번호 74), DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGKAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGDVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPEKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 18, 서열번호 75), 및 DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLESSGSDIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQAPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSREFPWTFGQGTKVEIKRADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSS (변이체 19, 서열번호 76).
c. 추가 서열
항-핵산 항원 결합 단백질, 항체, 단편 및 융합 단백질의 구성에 사용될 수 있는 추가 서열은 다음을 포함하지만, 이들에 제한되지는 않는다, EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (IgG1 L2345A/L235A 중쇄 전장 서열, 서열번호 77), ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (IgG1 불변 중쇄 영역 1, 서열번호 78),
EPKSCDKTHTCP (IgG1 힌지 영역, 서열번호 79), PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK (IgG1 L2345A/L235A 불변 중쇄 영역 2, 서열번호 80), GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (IgG1 불변 중쇄 영역 3, 서열번호 81), EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (IgG1 N297D 중쇄 전장 서열, 서열번호 82), PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK (IgG1 N297D 불변 중쇄 2, 서열번호 83), EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGLLLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (IgG1 L2345A/L235A/N297D 중쇄 전장 서열, 서열번호 84), PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK (IgG1 L2345A/L235A/N297D 불변 중쇄 영역 2, 서열번호 85), PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK (서열번호 86, 미변형 불변 중쇄 영역 2), 및 DIQMTQSPSSLSASLGDRATITCRASKTVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (경쇄 전장 서열, 서열번호 87).
B. 화물
본원에 제공된 방법 및 조성물에 사용되는 바와 같이, 3E10은 통상적으로 핵산 화물과 복합체를 이루어서 세포와 접촉된다. 항체 또는 결합 단백질과 핵산 화물 간의 상호작용은 비공유적이다.
핵산 화물은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 화물은 DNA, RNA, 핵산 유사체, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함할 수 있다. 아래에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 핵산 유사체는 염기 모이어티, 당 모이어티, 또는 인산염 골격이 변형될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 핵산의 안정성, 혼성화, 또는 용해도를 개선할 수 있다.
핵산 화물은, 일단 세포 내로 전달되면 생물학적으로 활성인 제제이거나 이를 암호화한다는 의미에서 통상적으로 기능적이다. 예시적인 화물은 아래에서 보다 상세히 논의되지만, 예를 들어, 발현 작제물 및 벡터를 포함하는 관심 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA 또는 DNA, siRNA와 같은 억제 핵산, 또는 예를 들어, 발현 작제물 및 벡터를 포함하는 억제 핵산을 암호화하는 핵산을 예를 들어 포함한다.
개시된 조성물은 복수의 단일 핵산 화물 분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 복수의 상이한 핵산 분자의 다중성(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10 또는 그 이상)을 포함한다.
일부 구현예에서, 화물 분자는 약 0.001, 약 0.01, 약 1, 10, 100, 1,000, 10,000, 및/또는 100,000의 킬로베이스의 길이이다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 화물은 0.001 kb 및 100 kb 사이, 또는 0.001 kb 및 50 kb 사이, 또는 0.001 kb 및 25 kb 사이, 또는 0.001 kb 및 12.5 kb 사이, 또는 0.001 kb 및 10 kb 사이, 또는 0.001 kb 및 8 kb 사이, 또는 0.001 kb 및 5 kb, 또는 0.001 kb 및 2.5 kb 사이, 또는 0.001 kb 및 1 kb 사이, 또는 0.01 kb 및 100 kb 사이, 또는 0.01 kb 및 50 kb 사이, 또는 0.01 kb 및 25 kb 사이, 또는 0.01 kb 및 12.5 kb 사이, 또는 0.01 kb 및 10 kb 사이, 또는 0.01 kb 및 8 kb 사이, 또는 0.01 kb 및 5 kb, 또는 0.01 kb 및 2.5 kb 사이, 또는 0.01 kb 및 1 kb 사이, 또는 0.1 kb 및 100 kb 사이, 또는 0.1 kb 및 50 kb 사이, 또는 0.1 kb 및 25 kb 사이, 또는 0.1 kb 및 12.5 kb 사이, 또는 0.1 kb 및 10 kb 사이, 또는 0.1 kb 및 8 kb 사이, 또는 0.1 kb 및 5 kb, 또는 0.1 kb 및 2.5 kb 사이, 또는 0.1 kb 및 1 kb 사이, 또는 1 kb 및 100 kb 사이, 또는 1 kb 및 50 kb 사이, 또는 1 kb 및 25 kb 사이, 또는 1 kb 및 12.5 kb 사이, 또는 1 kb 및 10 kb 사이, 또는 1 kb 및 8 kb 사이, 또는 1 kb 및 5 kb, 또는 1 kb 및 2.5 kb 사이(각각 포괄적)이다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 화물은 약 0.001 kb 및 약 100 kb 사이, 또는 약 0.001 kb 및 약 50 kb 사이, 또는 약 0.001 kb 및 약 25 kb 사이, 또는 약 0.001 kb 및 약 12.5 kb 사이, 또는 약 0.001 kb 및 약 10 kb 사이, 또는 약 0.001 kb 및 약 8 kb 사이, 또는 약 0.001 kb 및 약 5 kb, 또는 약 0.001 kb 및 약 2.5 kb 사이, 또는 약 0.001 kb 및 약 1 kb 사이, 또는 약 0.01 kb 및 약 100 kb 사이, 또는 약 0.01 kb 및 약 50 kb 사이, 또는 약 0.01 kb 및 약 25 kb 사이, 또는 약 0.01 kb 및 약 12.5 kb 사이, 또는 약 0.01 kb 및 약 10 kb 사이, 또는 약 0.01 kb 및 약 8 kb 사이, 또는 약 0.01 kb 및 약 5 kb, 또는 약 0.01 kb 및 약 2.5 kb 사이, 또는 약 0.01 kb 및 약 1 kb 사이, 또는 약 0.1 kb 및 약 100 kb 사이, 또는 약 0.1 kb 및 약 50 kb 사이, 또는 약 0.1 kb 및 약 25 kb 사이, 또는 약 0.1 kb 및 약 12.5 kb 사이, 또는 약 0.1 kb 및 약 10 kb 사이, 또는 약 0.1 kb 및 약 8 kb 사이, 또는 약 0.1 kb 및 약 5 kb, 또는 약 0.1 kb 및 약 2.5 kb 사이, 또는 약 0.1 kb 및 약 1 kb 사이, 또는 약 1 kb 및 약 100 kb 사이, 또는 약 1 kb 및 약 50 kb 사이, 또는 약 1 kb 및 약 25 kb 사이, 또는 약 1 kb 및 약 12.5 kb 사이, 또는 약 1 kb 및 약 10 kb 사이, 또는 약 1 kb 및 약 8 kb 사이, 또는 약 1 kb 및 약 5 kb, 또는 약 1 kb 및 약 2.5 kb 사이(각각 포괄적)이다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 화물은 0.2 kb 및 10 kb 사이, 또는 0.2 kb 및 5 kb 사이, 또는 0.2 kb 및 2.5 kb 사이, 또는 0.2 kb 및 1 kb 사이, 또는 0.2 kb 및 0.5 kb 사이, 또는 0.2 kb 및 0.25 kb 사이, 또는 0.5 kb 및 10 kb 사이, 또는 0.5 kb 및 5 kb 사이, 또는 1 kb 및 5 kb 사이, 또는 1 kb 및 3 kb 사이, 또는 2 kb 및 10 kb 사이, 또는 3 kb 및 5 kb 사이이다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 화물은 약 0.2 kb 및 약 10 kb 사이, 또는 약 0.2 kb 및 약 5 kb 사이, 또는 약 0.2 kb 및 약 2.5 kb 사이, 또는 약 0.2 kb 및 약 1 kb 사이, 또는 약 0.2 kb 및 약 0.5 kb 사이, 또는 약 0.2 kb 및 약 0.25 kb 사이, 또는 약 0.5 kb 및 약 10 kb 사이, 또는 약 0.5 kb 및 약 5 kb 사이, 또는 약 1 kb 및 약 5 kb 사이, 또는 약 1 kb 및 약 3 kb 사이, 또는 약 2 kb 및 약 10 kb 사이, 또는 약 3 kb 및 약 5 kb 사이이다.
특정 응용예에 있어서, 핵산 화물은, 예를 들어, 각각에 대한 구체적인 값이 명백하게 개시된, 전술한 범위(포함형) 중 하나에 속하는 하나 이상의 별개의 길이일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 크기는 단일 뉴클레오티드 또는 핵염기만큼 작을 수 있다. 예시적인 응용예에서, 화물은 STING 작용제인 cGAMP와 유사한 환형 디뉴클레오티드이다. 다른 구현예에서, 화물은 짧은 올리고머이다. 예를 들어, 8량체만큼 짧은 올리고머가 안티-센스 또는 스플라이스 스위칭에 사용될 수 있다. 약간 더 긴 것(예를 들어, 18 내지 20량체)이 유전자 편집을 위해 사용될 수 있다.
1. 화물의 형태
핵산 화물은 핵산이며 단리된 핵산 조성물일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "단리된 핵산"은 포유류 게놈에서 핵산의 한쪽 또는 양쪽 측면 옆에 일반적으로 위치하는 핵산을 포함하여, 포유류 게놈에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리되는 핵산을 지칭한다. 핵산과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "단리된"은 또한 임의의 비-자연 발생 핵산 서열과의 조합을 포함하는데, 이는 이러한 비-자연 발생 서열이 자연에서 발견되지 않고 자연 발생 게놈에서 바로 연속하는 서열을 갖지 않기 때문이다.
단리된 핵산은, 예를 들어, 자연 발생 게놈에서 DNA 분자 바로 옆에서 일반적으로 발견되는 핵산 서열 중 하나가 제거되거나 존재하지 않는 DNA 분자일 수 있다. 따라서, 단리된 핵산은, 제한 없이, 다른 서열(예를 들어, 화학적으로 합성된 핵산, 또는 PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생산된 cDNA 또는 게놈 DNA 단편)과 독립적인 별개의 분자로서 존재하는 DNA 분자뿐 아니라, 벡터, 자치적으로 복제하는 플라스미드, 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스), 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA에 혼입된 재조합 DNA를 포함한다. 또한, 단리된 핵산은 하이브리드 또는 융합 핵산의 일부인 재조합 DNA 분자와 같은 조작된 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산은 예를 들어, cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리 내 수백 내지 수백만 개의 다른 핵산 중에 존재하는 핵산이 아니며, 또는 게놈 DNA 제한 분해물이 아니다.
폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 게놈 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산은 mRNA 또는 cDNA 서열이며, 여기서 하나 이상의 (또는 모든) 엑손이 결실되었다. 다양한 구현예에서, 핵산은 폴리펩티드를 암호화한다. 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 원하는 발현 숙주 또는 세포에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 코돈은 핵산 서열이 유래된 유기체 또는 세포와 발현 숙주 또는 세포 간의 코돈 사용 차이를 처리하기 위해 동일한 아미노산을 암호화하는 대안적인 코돈으로 치환될 수 있다. 이러한 방식으로, 핵산은 발현 숙주-선호 코돈을 사용하여 합성될 수 있다.
핵산은 센스 또는 안티센스 배향일 수 있거나, 예를 들어, 폴리펩티드를 암호화하는 기준 서열에 상보적일 수 있다.
a. 벡터
화물은 핵산 벡터, 예를 들어 폴리펩티드(들) 및/또는 기능적 핵산(들)을 암호화하는 벡터일 수 있다. 전술한 것들과 같은 핵산은 세포에서의 발현을 위해 벡터 내에 삽입될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "벡터"는 그 안에 포함된 핵산의 복제 또는 발현을 지시할 수 있는 핵산으로, 예컨대 또 다른 DNA 분절이 삽입되어 삽입된 분절의 복제를 일으킬 수 있는 플라스미드, 코스미드 또는 유사한 핵산 벡터이다. 벡터는 발현 벡터일 수 있다. "발현 벡터"는 하나 이상의 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터)을 포함하는 벡터이고, "발현 조절 서열"은 또 다른 DNA 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하고 제어하는 DNA 서열이다.
벡터 내의 핵산은 하나 이상의 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 조절 서열은 발현 조절 서열이 관심 코딩 서열의 발현을 효과적으로 조절하도록 유전자 작제물에 통합될 수 있다. 발현 조절 서열의 예는 프로모터, 인핸서, 및 전사 종결 영역을 포함한다. 프로모터는, 통상적으로 전사가 시작되는 지점의 상류 100개의 뉴클레오티드 이내(일반적으로 RNA 중합효소 II의 개시 부위 근처)의 DNA 분자의 영역으로 구성된 발현 조절 서열이다. 코딩 서열을 프로모터의 조절 하에 가져오기 위해서는, 폴리펩티드의 번역 판독 프레임의 번역 개시 부위를 프로모터의 하류에 있는 1개 내지 약 50개의 뉴클레오티드 사이에 위치시킬 필요가 있다. 인핸서는 시간, 위치 및 수준의 측면에서 발현 특이성을 제공한다. 프로모터와 달리, 인핸서는 전사 부위로부터 다양한 거리에 위치할 때 기능을 할 수 있다. 인핸서는 전사 개시 부위의 하류에 위치할 수도 있다. RNA 중합효소가 코딩 서열을 mRNA로 전사할 수 있고, 그런 다음 코딩 서열에 의해 암호화된 단백질로 번역될 수 있을 때, 코딩 서열은 세포에서 "작동 가능하게 연결"되고 발현 조절 서열의 "조절 하에" 있다.
일부 구현예에서, 화물은 세포 내로 전달되고 염색체 외에 남아있다. 일부 구현예에서, 화물은 숙주 세포 내로 도입되고 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다. 이하에서 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 조성물은 유전자 요법의 방법에 사용될 수 있다. 유전자 요법의 방법은 세포의 유전자형을 변경하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 도입은 유전자 재조합을 통해 내인성 유전자를 교정, 대체 또는 달리 변경할 수 있다. 방법은 결함이 있는 유전자, 이종 유전자, 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 작은 핵산 분자의 전체 대체 카피의 도입을 포함할 수 있다. 예를 들어, 교정 유전자는 숙주의 게놈 내의 비특이적 위치에 도입될 수 있다.
일부 실시예에서, 화물은 핵산 벡터이다. 유전자 서열 및 적절한 전사 및 번역 조절 요소를 함유하는 발현 벡터를 작제하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 이들 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체 내 유전자 재조합을 포함한다. 발현 벡터는 일반적으로 조절 서열 및, 예를 들어 관심 폴리뉴클레오티드일 수 있는, 삽입된 코딩 서열의 번역 및/또는 전사에 필요한 요소를 함유한다. 코딩 서열은 프로모터 및/또는 인핸서에 작동 가능하게 연결되어 원하는 유전자 산물의 발현을 조절하는 것을 도울 수 있다. 생명공학에 사용되는 프로모터는 의도된 유전자 발현의 조절 유형에 따라 상이한 유형이다. 이들은 일반적으로 구성적 프로모터, 조직 특이적 또는 발달 단계 특이적 프로모터, 유도성 프로모터, 및 합성 프로모터로 나누어질 수 있다.
포유류 세포에 사용하기 위한 발현 벡터는 복제 기점(필요하거나 원하는 경우), 임의의 필요한 리보솜 결합 부위와 함께, 발현될 유전자의 앞에 위치한 프로모터, RNA 스플라이스 부위(필요하거나 원하는 경우), 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 복제 기점은, 예컨대 SV40 또는 다른 바이러스(예를 들어, 폴리오마, 아데노, VSV, BPV) 공급원으로부터 유래될 수 있는 외인성 기원을 포함하도록 벡터를 작제함으로써 제공될 수 있거나, 숙주 세포 염색체 복제 기전에 의해 제공될 수 있다. 벡터가 숙주 세포 염색체에 통합되는 경우, 보통 후자가 충분하다.
프로모터는 포유류 세포의 게놈(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 우두 바이러스 7.5K 프로모터)로부터 유래될 수 있다. 또한, 이러한 조절 서열이 숙주 세포 시스템과 맞는 경우, 원하는 유전자 서열과 정상적으로 연관된 프로모터 또는 조절 서열을 사용하는 것이 또한 가능하고, 바람직할 수 있다.
다수의 바이러스 기반 발현 시스템이 사용될 수 있는데, 예를 들어, 흔히 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 거대세포바이러스 및 시미안 바이러스 40(SV40)으로부터 유래된다. SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는, 둘 다 SV40 바이러스 복제 원점도 또한 함유하는 단편으로서 바이러스로부터 쉽게 수득되기 때문에 유용하다. 바이러스 복제 원점에 위치한 BglI 부위를 향해 HindIII 부위로부터 연장되는 대략 250 bp 서열이 포함되는 경우, 더 작거나 더 큰 SV40 단편도 사용될 수도 있다.
개시된 조성물의 효율적인 번역을 위해 특정 개시 신호가 또한 요구될 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 번역 조절 신호가 추가로 제공될 필요가 있을 수 있다. 당업자는 이러한 필요성을 결정하고 필요한 신호를 제공할 수 있을 것이다. 개시 코돈은 전체 삽입체의 번역을 보장하기 위해 원하는 코딩 서열의 해독틀 프레임 내(또는 상 내)여야 한다는 것이 잘 알려져 있다. 이러한 외인성 번역 조절 신호 및 개시 코돈은 다양한 기원, 천연 및 합성 둘 다일 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소 또는 전사 종결자의 포함에 의해 향상될 수 있다.
진핵 발현에서, 원래 클로닝된 분절 내에 함유되지 않은 경우, 적절한 폴리아데닐화 부위를 전사 단위에 통합하고자 하는 것도 통상적으로 바람직할 것이다. 통상적으로, 폴리 A 첨가 부위는 전사 종결 전의 위치에서 단백질의 종결 부위의 약 30 내지 2000개의 뉴클레오티드 "하류"에 위치한다.
b. mRNA
화물은 mRNA일 수 있다.
안정성 및/또는 번역 효율을 촉진할 수 있는 화학 구조도 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, RNA는 5' 및/또는 3' UTR을 가질 수 있다. 3' UTR의 길이는, 예를 들어, 100개의 뉴클레오티드를 초과할 수 있다. 일부 구현예에서, 3' UTR 서열은 약 100 내지 약 5000 뉴클레오티드, 예컨대 약 100 내지 약 500 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 길이가 0 내지 약 3000 뉴클레오티드, 예컨대 약 10 내지 약 100 뉴클레오티드이다.
5' 및 3' UTR은 관심 유전자에서 자연적으로 발생하는 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열은 UTR 서열을 정방향 및 역방향 프라이머에 통합하거나 임의의 다른 주형의 변형에 의해 첨가될 수 있다. 관심 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 변형시키는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 서열의 AU-풍부 요소는 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 3' UTR은 당업계에 잘 알려진 UTR의 특성에 기초하여 전사된 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택되거나 설계될 수 있다.
일부 구현예에서, 5' UTR은 코작 서열을 함유하며, 이는 내인성 유전자의 코작 서열이다. 코작 서열은 일부 RNA 전사체의 번역 효율을 증가시킬 수 있지만, 모든 RNA의 효율적인 번역을 가능하게 하기 위해 요구되는 것으로 보이지는 않는다. 다른 구현예에서, 5' UTR은 RNA 게놈이 세포에서 안정한 RNA 바이러스로부터 유래될 수 있다. 다른 구현예에서, 다양한 뉴클레오티드 유사체가 3' 또는 5' UTR에서 사용되어 mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 방해할 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA는 세포에서 리보솜 결합, 번역 개시 및 mRNA 안정성을 결정하는 5' 말단 캡, 3' 폴리(A) 꼬리, 또는 이들의 조합을 갖는다.
5' 캡은 RNA 분자에 안정성을 제공한다. 5' 캡은, 예를 들어, 모두 상업적으로 이용 가능한 m7G(5')ppp(5')G, m7G(5')ppp(5')A, G(5')pp(5')G 또는 G(5')ppp(5')A 캡 유사체일 수 있다. 5' 캡은 또한 항-역-캡-아날로그(ARCA)(Steinfki 등의 문헌[RNA, 7:1468-95 (2001)]) 또는 임의의 다른 적절한 유사체일 수 있다. 5' 캡은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 혼입될 수 있다(Cougt 등의 문헌[Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)]; Stepinski 등의 문헌[RNA, 7:1468-95 (2001)]; Elango 등의 문헌[Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)]).
RNA는 또한 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 함유할 수 있다. IRES 서열은 mRNA에 대한 캡 독립적 리보솜 결합을 개시하고 번역 개시를 용이하게 하는 임의의 바이러스, 염색체 또는 인공적으로 설계된 서열일 수 있다.
일반적으로, 폴리(A) 꼬리의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 양의 상관관계가 있다. 일 구현예에서, 폴리(A) 꼬리는 100 내지 5000개 아데노신(예를 들어, 50 내지 300개 아데노신)이다.
또한, 3' 말단에 상이한 화학적 기를 부착하면 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 이러한 부착은 변형된/인공 뉴클레오티드, 앱타머 및 다른 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, ATP 유사체는 폴리(A) 중합효소를 사용하여 폴리(A) 꼬리에 혼입될 수 있다. ATP 유사체는 RNA의 안정성을 추가로 증가시킬 수 있다. 적절한 ATP 유사체는, 이에 한정되지는 않으나, 코디오시핀 및 8-아자아데노신을 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA는 미국 특허 제8,691,966호에 기술된 변형된, 염기와 같은 하나 이상의 변형된 염기를 포함하며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 일부 구현예에서, mRNA는 변형된 우리딘 및/또는 변형된 시토신을 포함한다. 예를 들어, 적어도 약 50%의 우리딘 또는 모든 우리딘은 변형된 우리딘, 예컨대 슈도우리딘 또는 N1-메틸-슈도우리딘, 및/또는 5-메톡시-우리딘일 수 있다. 일부 구현예에서, 실질적으로 모든 우리딘은 슈도우리딘 또는 N1-메틸-슈도우리딘으로 대체된다. mRNA와 함께 사용하기 위한 다른 변형된 염기는 5-메틸 시티딘 및 N6-메틸 아데노신을 포함한다.
2. 화물의 서열
a. 관심 폴리펩티드
화물은 하나 이상의 단백질을 암호화할 수 있다. 화물은 단일시스트론 또는 다중시스트론일 수 있는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 다유전자이다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, mRNA 또는 벡터와 같은 발현 작제물일 수 있다.
화물은 하나 이상의 관심 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 폴리펩티드는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드는 유기체에 치료적 또는 예방적 효과를 제공하거나 유기체에서 질환 또는 장애를 진단하는 데 사용될 수 있는 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 암, 자가면역 질환, 기생충, 바이러스, 박테리아, 진균 또는 다른 감염의 치료를 위해, 발현될 폴리뉴클레오티드(들)는 면역계의 세포에 대한 리간드 또는 수용체로서 기능하는 폴리펩티드를 암호화할 수 있거나, 유기체의 면역계를 자극하거나 억제하는 기능을 할 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 유기체에서 결함이 있는 폴리뉴클레오티드를 보충하거나 대체한다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 디스트로핀, 유트로핀, 또는 이들의 조합을 암호화한다. 이러한 조성물은 이영양증, 특히 근이영양증, 예를 들어 뒤시엔느 근이영양증으로부터 대상체를 치료하기 위한 유효량으로 투여될 수 있다.
또 다른 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 항원, 예를 들어, 백신 제형 및 관련 방법에 사용될 수 있는 항원을 암호화한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 바이러스 항원(들), 예를 들어, SARS-CoV-2 항원(들)을 암호화한다. 따라서, SARS-CoV-2 바이러스 및 바이러스 감염증 및 COVID19를 포함하는 이와 연관된 질환으로부터의 보호 및 치료를 위한 조성물 및 이의 사용 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 핵산은 인플루엔자 항원을 암호화한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 선별 마커, 예를 들어 약물 내성 선별 마커와 같은 진핵 세포에서 효과적인 선별 마커를 포함한다. 이러한 선별 마커 유전자는 선택적 배양 배지에서 성장시킨 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 인자를 암호화할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 카나마이신, 겐타마이신, 제오신, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하고, 영양요구성 결핍을 보완하거나, 배지로부터 보류된 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 암호화한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 리포터 유전자를 포함한다. 리포터 유전자는 통상적으로 숙주 세포에 존재하지 않거나 발현되지 않는 유전자이다. 리포터 유전자는 통상적으로 일부 표현형 변화 또는 효소 특성을 제공하는 단백질을 암호화한다. 이러한 유전자의 예는 Weising 등의 문헌 [Ann. Rev. Genetics, 22, 421 (1988)]에 제공된다. 바람직한 리포터 유전자는 글루쿠로니다아제(GUS) 유전자 및 GFP 유전자를 포함한다.
b. 기능적 핵산
화물은 기능적 핵산이거나 이를 암호화할 수 있다. 기능적 핵산은 표적 분자에 결합하거나 특정 반응을 촉매하는 것과 같은 특정 기능을 갖는 핵산 분자이다. 이하에서 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 기능적 핵산 분자는 다음의 비제한적인 카테고리로 나누어질 수 있다: 안티센스 분자, siRNA, miRNA, 앱타머, 리보자임, RNAi, 및 외부 가이드 서열, 및 환형 디뉴클레오티드. 기능적 핵산 분자는 표적 분자에 의해 보유된 특정 활성의 효과기, 억제제, 조절제, 및 자극제로서 작용할 수 있거나, 기능적 핵산 분자는 임의의 다른 분자와는 독립적인 새로운 활성을 가질 수 있다.
기능적 핵산 분자는 DNA, RNA, 폴리펩티드, 또는 탄수화물 사슬과 같은 임의의 거대분자와 상호작용할 수 있다. 종종, 기능적 핵산은 표적 분자와 기능적 핵산 분자 사이의 서열 상동성에 기초하여 다른 핵산과 상호작용하도록 설계된다. 다른 상황에서, 기능적 핵산 분자와 표적 분자 사이의 특이적 인식은 기능적 핵산 분자와 표적 분자 사이의 서열 상동성에 기초하지 않고, 오히려 특이적 인식이 일어날 수 있게 하는 삼차 구조의 형성에 기초한다.
따라서, 조성물은 유전자 또는 이의 유전자 산물의 발현 또는 풍부도를 감소시키도록 설계된 하나 이상의 기능적 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기능적 핵산 또는 폴리펩티드는 mRNA의 발현 또는 번역을 표적화하고 감소시키거나 억제하도록; 또는 단백질의 발현을 감소시키거나 억제하거나, 활성을 감소시키거나, 단백질의 분해를 증가시키도록 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 기능적 핵산의 생체 내 발현에 적합한 벡터를 포함한다.
i. 안티센스
기능적 핵산은 안티센스 분자이거나 이를 암호화할 수 있다. 안티센스 분자는 정규 또는 비 정규 염기 페어링을 통해 표적 핵산 분자와 상호작용하도록 설계된다. 안티센스 분자와 표적 분자의 상호작용은, 일부 구현예에서, 예를 들어, RNAse H 매개 RNA-DNA 하이브리드 분해를 통해 표적 분자의 파괴를 촉진하도록 설계된다. 대안적으로, 안티센스 분자는 전사, 스플라이싱, 번역 또는 복제와 같은, 표적 분자 상에서 정상적으로 일어날 수 있는 가공 기능을 중단시키도록 설계된다. 안티센스 분자는 표적 분자의 서열에 기초하여 설계될 수 있다. 표적 분자의 가장 접근 가능한 영역을 찾음으로써 안티센스 효율을 최적화하기 위한 수많은 방법이 있다. 안티센스 분자는 10-6, 10-8, 10-10, 또는 10-12 이하의 해리 상수(Kd)로 표적 분자에 결합하는 것이 바람직하다.
ii. RNA 간섭
일부 구현예에서, 기능적 핵산은 RNA 간섭을 통해 유전자 침묵을 유도한다. 유전자 발현은 RNA 간섭(RNAi)을 통해 매우 특이적인 방식으로 효과적으로 침묵화될 수도 있다. 이러한 침묵은 원래 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 첨가로 관찰되었다(Fire 등의 문헌[(1998) Nature, 391:806-11]; Napoli 등의 문헌[(1990) Plant Cell 2:279-89]; Hannon의 문헌[(2002) Nature, 418:244-51]). 일단 dsRNA가 세포 내로 들어가면, RNase III 유사 효소인 다이서에 의해 3' 말단부 상에 2개의 뉴클레오티드 돌출을 함유하는, 21-23개 뉴클레오티드의 길이인 이중 가닥의 작은 간섭 RNA(siRNA)로 절단된다(Elbashir 등의 문헌[(2001) Genes Dev., 15:188-200]; Bernstein 등의 문헌[(2001) Nature, 409:363-6]; Hammond 등의 문헌[(2000) Nature, 404:293-6]). ATP 의존적 단계에서, siRNA는 흔히 RNAi 유도 침묵 복합체(RISC)로 알려진 다중-서브유닛 단백질 복합체에 통합되고, 이는 siRNA를 표적 RNA 서열로 안내한다(Nykanen 등의 문헌[(2001) Cell, 107:309-21]). 일부 시점에서, siRNA 이중가닥은 풀리고, 안티센스 가닥은 RISC에 결합된 채로 남아 엔도 및 엑소뉴클레아제의 조합에 의해 상보적 mRNA 서열의 분해를 유도하는 것으로 보인다(Martinez 등의 문헌[(2002) Cell, 110:563-74]). 그러나, iRNA 또는 siRNA의 효과 또는 이들의 사용은 임의의 유형의 기전에 제한되지 않는다.
짧은 간섭 RNA(siRNA)는 서열-특이적 전사후 유전자 침묵을 유도할 수 있는 이중-가닥 RNA을 포함하며, 이에 의해 유전자 발현을 감소시키거나 심지어 억제한다. 일 예에서, siRNA는 mRNA와 같은, 상동성 RNA 분자의 특이적 분해를 유발한다. 예를 들어, WO 02/44321은 3' 돌출 말단과 염기쌍을 이룰 때 표적 mRNA의 서열 특이적 분해를 할 수 있는 siRNA를 개시하며, 이는 참조로서 본원에 통합된다.
서열 특이적 유전자 침묵화는 효소 다이서에 의해 생산된 siRNA를 모방하는 합성의 짧은 이중 가닥 RNA를 사용하여 포유류 세포에서 달성될 수 있다(Elbashir 등의 문헌[(2001) Nature, 411:494 498]) (Ui-Tei 등의 문헌[(2000) FEBS Lett 479:79-82]). siRNA는 화학적으로 또는 시험관 내에서 합성될 수 있거나, 세포 내부에서 siRNA로 가공되는 짧은 이중-가닥 헤어핀-유사 RNA(shRNA)의 결과물일 수 있다. 합성 siRNA는 일반적으로 알고리즘 및 종래의 DNA/RNA 합성기를 사용하여 설계된다. 공급업체로는 Ambion(Austin, Texas), ChemGenes(Ashland, Massachusetts), Dharmacon(Lafayette, Colorado), Glen Research(Sterling, Virginia), MWB Biotech(Esbersberg, Germany), Proligo(Boulder, Colorado), 및 Qiagen(Vento, The Netherlands)을 포함한다. siRNA는 Ambion의 SILENCER® siRNA 작제 키트와 같은 키트를 사용해 시험관 내에서 합성될 수도 있다.
벡터로부터 siRNA의 생산은 짧은 헤어핀 RNAse(shRNA)의 전사를 통해 더 흔히 이루어진다. 예를 들어, Imgenex의 GENESUPPRESSOR™ 구성 키트 및 Invitrogen의 BLOCK-IT™ 유도성 RNAi 플라스미드 및 렌티바이러스 벡터와 같은, shRNA를 갖는 벡터의 생산을 위한 키트가 이용 가능하다.
일부 구현예에서, 기능적 핵산은 siRNA, shRNA, miRNA이다. 일부 구현예에서, 조성물은 기능적 핵산을 발현하는 벡터를 포함한다.
iii. 앱타머
기능적 핵산은 앱타머이거나 이를 암호화할 수 있다. 앱타머는 바람직하게는 특정 방식으로 표적 분자와 상호작용하는 분자이다. 통상적으로, 앱타머는 스템-루프 또는 G-사중체와 같은 정의된 2차 및 3차 구조로 접히는 15-50개 염기 길이의 작은 핵산이다. 앱타머는 ATP 및 테오필린과 같은 작은 분자뿐만 아니라 역전사효소 및 트롬빈과 같은 큰 분자에 결합할 수 있다. 앱타머는 표적 분자에 10-12 M 미만의 Kd로 매우 단단히 결합할 수 있다. 앱타머는 10-6, 10-8, 10-10, 또는 10-12 미만의 Kd로 표적 분자에 결합하는 것이 바람직하다.
앱타머는 매우 높은 특이성으로 표적 분자에 결합할 수 있다. 예를 들어, 분자 상의 단일 위치에서만 표적 분자와 상이한 다른 분자 사이의 결합 친화도에 있어서 10,000배를 초과하는 차이를 갖는 앱타머를 단리하였다. 앱타머가 배경 결합 분자와의 Kd보다 적어도 10, 100, 1000, 10,000, 또는 100,000배 더 낮은 표적 분자와의 Kd를 갖는 것이 바람직하다. 폴리펩티드와 같은 분자에 대한 비교를 수행할 때, 배경 분자는 상이한 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
iv. 리보자임
기능적 핵산은 리보자임이거나 이를 암호화할 수 있다. 리보자임은 분자내 또는 분자간 화학 반응을 촉매할 수 있는 핵산 분자이다. 리보자임은 분자간 반응을 촉매하는 것이 바람직하다. 해머헤드 리보자임과 같은 천연 시스템에서 발견되는 리보자임에 기초한 뉴클레아제 또는 핵산 중합효소 유형 반응을 촉매하는 다수의 상이한 유형의 리보자임이 있다. 또한, 천연 시스템에서 발견되지 않지만, 신생 특정 반응을 촉매하도록 조작된 다수의 리보자임이 있다. 바람직한 리보자임은 RNA 또는 DNA 기질을 절단하고, 보다 바람직하게는 RNA 기질을 절단한다. 리보자임은, 통상적으로, 절단이 후속되는, 표적 기질의 인식 및 결합을 통해 핵산 기질을 절단한다. 종종 이러한 인식은 주로 정규 또는 비 정규 염기쌍 상호작용에 기초한다. 표적 기질의 인식이 표적 기질 서열에 기초하기 때문에, 이러한 특성은 리보자임이 핵산의 표적 특이적 절단에 대한 특히 좋은 후보가 되도록 한다.
v. 외부 가이드 서열
기능적 핵산은 외부 가이드 서열이거나 이를 암호화할 수 있다. 외부 가이드 서열(EGS)은 복합체를 형성하는 표적 핵산 분자에 결합하는 분자이며, 이는 RNase P에 의해 인식되고, 이어서 표적 분자를 절단한다. EGS는 선택된 RNA 분자를 특이적으로 표적화하도록 설계될 수 있다. RNAse P는 세포 내에서 전사 RNA(tRNA)를 가공하는 것을 돕는다. 박테리아 RNAse P는 천연 tRNA 기질을 모방하기 위해 표적 RNA:EGS 복합체를 유발하는 EGS를 사용함으로써 거의 모든 RNA 서열을 절단하도록 모집될 수 있다. 유사하게, 진핵 세포 내 원하는 표적을 절단하기 위해 RNA의 진핵 EGS/RNAse P-유도 절단을 이용할 수 있다. 다양한 상이한 표적 분자의 절단을 용이하게 하기 위해 EGS 분자를 제조하고 사용하는 방법의 대표적인 예는 당업계에 공지되어 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA, EGS, 리보자임 및 앱타머와 같은 기능적 핵산의 생체 내 발현을 위한 벡터를 제조하고 사용하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
vi. 환형 디뉴클레오티드
기능적 핵산은 환형 디뉴클레오티드이거나 이를 암호화할 수 있다. 환형 디뉴클레오티드는 STING 어댑터 단백질에 직접 결합하여 IFN-b를 생산한다(Zhang 등의 문헌[Mol Cell., 51(2):226-35 (2013). doi: 10.1016/j.molcel.2013.05.022.]). 몇몇 정규 및 비정규 디뉴클레오티드가 당업계에 공지되어 있고, 이에 한정되지는 않으나, 2'3'-cGAMP, 2'3'-cGAMP, 3'3'-cGAMP, c-디-AMP, c-디-GMP, cAIMP(CL592), cAIMP 디플루오르(CL614), cAIM(PS)2 디플루오르(Rp/Sp) (CL656), 2'2'-cGAMP, 2'3'-cGAM(PS)2(Rp/Sp), 3'3'-cGAMP 플루오르화됨, c-디-AMP 플루오르화됨, 2'3'-c-디-AMP, 2'3'-c-디-AM(PS)2(Rp,Rp), 2'3'-c-디-AM(PS)2(Rp,Rp), c-디-GMP 플루오르화됨, 2'3'-c-디-GMP, c-디-IMP, DMXAA를 포함한다.
vii. 면역자극 올리고뉴클레오티드
일부 구현예에서, 기능적 핵산은 올리고뉴클레오티드 리간드이거나 이를 암호화할 수 있다. 예는, 이에 한정되지는 않으나, 패턴 인식 수용체(PRR) 리간드를 포함한다.
PRR의 예는 선천 면역 반응의 개시에 역할을 하고 또한 이후 더욱 항원 특이적 적응 면역 반응에 영향을 미치는 톨-유사 신호전달 분자 계열을 포함한다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 톨 유사 수용체 9(TLR9)와 같은 톨 유사 계열 신호전달 분자에 대한 리간드로서 작용할 수 있다.
예를 들어, 비메틸화 CpG 부위는 인간에서 형질세포양 수지상 세포 및 B 세포 상에서 TLR9에 의해 검출될 수 있다(Zaida 등의 문헌[Infection and Immunity, 76(5):2123-2129, (2008)]). 따라서, 올리고뉴클레오티드의 서열은 하나 이상의 비메틸화 시토신-구아닌(CG 또는 CpG, 상호 교환적으로 사용됨) 디뉴클레오티드 모티프를 포함할 수 있다. 'p'는 DNA의 인산디에스테르 골격을 지칭하지만, 일부 구현예에서, CG를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 변형된 골격, 예를 들어 포스포로티오에이트(PS) 골격을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 하나를 초과하는 CG 디뉴클레오티드를 함유할 수 있고, 이는 인접하여 배열되거나 개입 뉴클레오티드(들)에 의해 분리될 수 있다. CpG 모티프(들)는 올리고뉴클레오티드 서열의 내부에 있을 수 있다. 다수의 뉴클레오티드 서열은 CG 디뉴클레오티드(들)의 수 및 위치뿐만 아니라 CG 이량체의 측면에 위치하는 정확한 염기 서열에 변이를 가지고 TLR9를 자극한다.
통상적으로, CG ODN은 서열, 이차 구조, 및 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 대한 효과에 기초하여 분류된다. 5개의 부류는 클래스 A(유형 D), 클래스 B(유형 K), 클래스 C, 클래스 P 및 클래스 S(Vollmer, J & Krieg, AM의 문헌[Advanced drug deliveryment reviews 61(3): 195-204 (2009)], 참조로서 본원에 통합됨)이다. CG ODN은 I형 인터페론(예를 들어, IFNα)의 생산을 자극하고 수지상 세포(DC)의 성숙을 유도할 수 있다. 일부 부류의 ODN은 또한 간접적인 사이토카인 신호전달을 통한 자연 살해(NK) 세포의 강력한 활성화제이다. 일부 부류는 인간 B 세포 및 단핵구 성숙의 강한 자극제이다(Weiner, GL의 문헌[PNAS USA 94(20): 10833-7 (1997)]; Dalpke, AH의 문헌[Immunology 106(1): 102-12 (2002)]; Hartmann, G,의 문헌[J of Immun. 164(3):1617-2 (2000)]이며, 이들 각각은 참조로서 본원에 통합됨).
다른 PRR 톨-유사 수용체는, 이중-가닥 RNA, 단일-가닥 및 짧은 이중-가닥 RNA를 각각 인식할 수 있는 TLR3, 및 TLR7, 및 레티노산-유도성 유전자 I(RIG-I)-유사 수용체, 즉, RIG-I 및 흑색종 분화-관련 유전자 5(MDA5)를 포함하며, 이들은 세포질에서 RNA-감지 수용체로서 가장 잘 알려져 있다.
RIG-I(Ddx58로도 알려진 레티노산-유도성 단백질 1) 및 MDA-5(Ifih1 또는 Helicard로도 알려진 흑색종-분화-관련 유전자 5)는 RIG-I-유사 수용체(RLR) 계열에 속하고 숙주 항바이러스 반응에 중요한 세포질 RNA 헬리카제이다.
RIG-I 및 MDA-5는 RNA 바이러스의 복제 중간체인 이중-가닥 RNA(dsRNA)를 감지하고, 미토콘드리아 항바이러스 신호 전달 단백질 MAVS(IPS-1, VISA 또는 Cardif로도 알려짐)를 통해 신호를 전달하여, I형 인터페론(IFN-α 및 IFN-β)의 생산을 유도한다.
RIG-I는 캡핑되지 않은 5'-이/삼인산 말단 및 짧은 평활 말단 이중 가닥 포션을 나타내는 바이러스 RNA를 검출하며, 이는 자가-RNA로부터의 구별을 용이하게 하는 두 가지 필수 특징부이다. MDA-5 생리학적 리간드의 특징은 아직 완전히 특성화되지 않았다. 그러나, RIG-I 및 MDA-5는 dsRNA의 길이에 따라 상이한 의존성을 나타내는 것으로 인정된다: RIG-I는 짧은 dsRNA에 선택적으로 결합하는 반면, MDA-5는 긴 dsRNA에 선택적으로 결합한다. 이와 일치하게, RIG-I 및 MDA-5는 상이한 길이의 선호도를 갖는 합성 dsRNA 유사체인 폴리(I:C)에 결합한다.
일부 상황에서, RIG-I는 간접적으로 dsDNA를 감지할 수도 있다. 바이러스 dsDNA는 RNA 중합효소 III에 의해 5'-삼인산 모이어티를 갖는 dsRNA로 전사될 수 있다. 따라서, B-형 DNA의 합성 유사체인 폴리(dA:dT)는 또 다른 RIG-I 리간드를 구성한다.
예시적인 RIG-I 리간드는, 이에 한정되지는 않으나, RIG-I의 특이적 작용제인 5'ppp-dsRNA; RIG-I의 특이적 작용제인 3p-hpRNA; 폴리(I:C)의 크기에 따라 RIG-I 및/또는 MDA-5에 의해 인식되는 폴리(I:C)/LyoVec 복합체; RIG-I에 의해 간접적으로 인식되는 폴리(dA:T)/LyoVec 복합체를 포함한다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, 또는 RIG-I-유사 수용체, 또는 이들의 조합에 대한 기능적 리간드를 함유한다.
면역자극 올리고뉴클레오티드의 예, 및 이를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 상업적으로 이용 가능한데. 예를 들어, 본원에 참조로서 통합된 Bodera, P.의 문헌[Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov. 5(1):87-93 (2011)]을 참조한다.
아래의 예는3E10-D31N + 폴리 (I:C)가 흑색종 세포 사멸을 향상시킴을 보여준다. 따라서, 일부 구현예에서, 폴리(I:C)와 같은 면역자극 올리고뉴클레오티드가 흑색종과 같은 암을 치료하기 위해 사용된다.
3. 화물의 조성
개시된 핵산 화물은 통상적으로 헤테로환 염기(핵산 염기), 헤테로환 염기에 부착된 당 모이어티, 및 당 모이어티의 하이드록실 기능을 에스테르화하는 인산염 모이어티를 포함하는 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드이거나 이를 포함할 수 있다. 주요 자연 발생 뉴클레오티드는 헤테로환 염기로서 우라실, 티민, 시토신, 아데닌 및 구아닌, 및 인산디에스테르 결합에 의해 연결된 리보오스 또는 데옥시리보오스 당을 포함한다.
일부 구현예에서, 화물은 DNA 또는 RNA 대응체에 비해, 안정성, 반감기, 또는 표적 수용체에 대한 특이도 또는 친화도를 개선하기 위해 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 유사체를 포함하거나 이로 구성된다. 화학적 변형은 핵염기, 당 모이어티, 뉴클레오티드 결합, 또는 이들의 조합의 화학적 변형을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "변형된 뉴클레오티드" 또는 "화학적으로 변형된 뉴클레오티드"는 하나 이상의 헤테로환 염기, 당 모이어티 또는 인산염 모이어티 성분의 화학적 변형을 갖는 뉴클레오티드를 정의한다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드의 전하는 동일한 핵염기 서열의 DNA 또는 RNA와 비교하여 감소된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 낮은 음전하, 무전하, 또는 양전하를 가질 수 있다.
통상적으로, 뉴클레오시드 유사체는 표준 폴리뉴클레오티드 염기에 대한 왓슨-크릭 염기 짝짓기에 의해 수소 결합을 할 수 있는 염기를 지지하며, 여기서 유사체 골격은 올리고뉴클레오티드 유사체 분자와 표준 폴리뉴클레오티드 내 염기(예를 들어, 단일-가닥 RNA 또는 단일-가닥 DNA) 사이에서 서열-특이적 방식으로 이러한 수소 결합을 허용하는 방식으로 염기를 제시한다. 일부 구현예에서, 유사체는 실질적으로 하전되지 않은 인 함유 골격을 갖는다.
a. 헤테로환 염기
주요 자연 발생 뉴클레오티드는 헤테로환 염기로서 우라실, 티민, 시토신, 아데닌 및 구아닌을 포함한다. 화물은 그들의 핵염기 성분에 대한 화학적 변형을 포함할 수 있다. 헤테로환 염기 또는 헤테로환 염기 유사체의 화학적 변형은 표적 서열에 결합하는 데 결합 친화도 또는 안정성을 증가시키는 데 효과적일 수 있다. 화학적으로 변형된 헤테로환 염기는, 이에 한정되지는 않으나, 이노신, 5-(1-프로피닐) 우라실(pU), 5-(1-프로피닐) 시토신(pC), 5-메틸시토신, 8-옥소-아데닌, 슈도시토신, 슈도이소시토신, 5 및 2-아미노-5-(2'-데옥시-.베타.-D-리보푸라노실)피리딘 (2-아미노피리딘) 및 다양한 피롤로 및 피라졸로피리미딘 유도체를 포함한다.
b. 당 변형
화물은 또한 변형된 당 모이어티 또는 당 모이어티 유사체를 갖는 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 당 모이어티 변형은, 이에 한정되지는 않으나, 2'-O-아미노에톡시, 2'-O-아모니오에틸(2'-OAE), 2'-O-메톡시, 2'-O-메틸, 2-구아니도에틸(2'-OGE), 2'-O,4'-C-메틸렌(LNA), 2'-O-(메톡시에틸)(2'-OME) 및 2'-O-(N-(메틸)아세트아미도)(2'-OMA)를 포함한다. 2'-O-아미노에틸 당 모이어티 치환은 중성 pH에서 양성자화되고 따라서 TFO와 표적 이중체 사이의 전하 반발을 억제하기 때문에 특히 바람직하다. 이러한 변형은 리보스 또는 덱시리보스의 C3'-엔도 형태를 안정화시키고, 또한 이중체의 퓨린 가닥에서 i-1 인산염과의 브릿지를 형성한다.
일부 구현예에서, 핵산은 모폴리노 올리고뉴클레오티드이다. 모폴리노 올리고뉴클레오티드는 통상적으로 염기-특이적 수소 결합에 의해, 폴리뉴클레오티드 내의 염기에 결합하는 데 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기-쌍 모이어티를 함유하는 2개 많은 모폴리노 단량체로 구성되며, 이들은 1개 내지 3개의 원자 길이의 인-함유 결합에 의해 함께 연결되어, 하나의 단량체의 모폴리노 질소를 인접한 단량체의 5' 엑소사이클릭 탄소에 결합시킨다. 퓨린 또는 피리미딘 염기쌍 모이어티는 통상적으로 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실 또는 티민이다. 모폴리노 올리고머의 합성, 구조 및 결합 특성은 미국 특허 제5,698,685호, 제5,217,866, 제5,142,047호, 제5,034,506호, 제5,166,315호, 제5,521,063호, 및 제5,506,337호에 상세히 기술되어 있다.
모폴리노-기반 서브유닛의 중요한 특성은 통상적으로 다음을 포함한다: 안정하고, 하전되지 않은 골격 연결에 의해 올리고머 형태로 결합되는 능력; 형성된 중합체가 심지어 10-14 염기만큼 짧은 올리고머로, 표적 RNA를 포함하는 상보성 염기 표적 핵산과 높은 Tm으로 혼성화될 수 있도록 뉴클레오티드 염기(예: 아데닌, 시토신, 구아닌, 티미딘, 우라실 또는 이노신)를 지지하는 능력; 올리고머가 포유류 세포 내로 능동적으로 수송되는 능력; 올리고머:RNA 이종이중체의 RNAse 분해에 저항하는 능력.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 전술한 바와 같이, 하전되지 않은 결합에 의해 결합된 염기쌍 모이어티를 갖는 모폴리노 기반 서브유닛을 사용한다.
c. 뉴클레오티드간 결합
올리고뉴클레오티드는 2개의 뉴클레오시드 모이어티 사이의 화학적 결합을 지칭하는 뉴클레오티드간 결합에 의해 연결된다. DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드의 인산염 골격에 대한 변형은 결합 친화도 또는 안정성 올리고뉴클레오티드를 증가시키거나, 올리고뉴클레오티드 뉴클레아제 소화의 감수성을 감소시킬 수 있다. 디에틸-에틸렌디아미드(DEED) 또는 디메틸-아미노프로필아민(DMAP)을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 양이온 변형은 올리고뉴클레오티드와 표적 사이의 정전기 반발 감소로 인해 특히 유용할 수 있다. 인산염 골격의 변형은 또한 인산디에스테르 결합에서 비-가교 산소 중 하나를 황 원자로 치환하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 치환은 포스포디에스테르 결합 대신에 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 생성한다. 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 함유하는 올리고뉴클레오티드는 생체 내에서 더 안정한 것으로 나타났다.
위에서 논의된 바와 같이, 감소된 전하를 갖는 변형된 뉴클레오티드의 예는 변형된 뉴클레오티드간 결합, 예컨대, 비카이랄 및 하전되지 않은 서브유닛 간 결합을 갖는 인산염 유사체(예를 들어, Sterchak, E. P. 등의 문헌[Organic. Chem., 52:4202, (1987)]), 및 비카이랄 서브유닛 간 결합을 갖는 하전되지 않은 모폴리노-계 중합체(예를 들어, 미국 특허 제5,034,506호 참조)를 포함한다. 일부 뉴클레오티드간 결합 유사체는 모폴리데이트, 아세탈 및 폴리아미드-결합 헤테로환을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 화물은 잠금 핵산으로 구성된다. 잠금 핵산(LNA)은 변형된 RNA 뉴클레오티드이다(예를 들어, Brasch 등의 문헌[Chem. Biol., 8(1):1-7 (2001)] 참조). LNA는 펩티드 핵산(PNA)/DNA 하이브리드의 특성과 유사한 특성인, DNA/DNA 하이브리드보다 더 안정적인 DNA와 혼성체를 형성한다. 따라서, LNA는 PNA 분자처럼 사용될 수 있다. LNA 결합 효율은 일부 구현예에서 양전하를 첨가함으로써 증가될 수 있다. 상업적 핵산 합성기 및 표준 포스포라미디트 화학을 사용하여 LNA를 제조한다.
또 다른 구현예에서, 화물은 펩티드 핵산으로 구성된다. 펩티드 핵산(PNA)은 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위를 반복함으로써 올리고뉴클레오티드의 인산염 골격이 전체적으로 대체되는 합성 DNA 모사체이며, 인산디에스테르 결합은 통상적으로 펩티드 결합에 의해 대체된다. 다양한 헤테로환 염기는 메틸렌 카르보닐 결합에 의해 골격에 연결된다. PNA는 종래의 DNA 올리고뉴클레오티드와 유사한 헤테로환 염기의 간격을 유지하지만, 비카이랄이고 중성으로 하전된 분자이다. 펩티드 핵산은 펩티드 핵산 단량체로 구성된다.
다른 골격 변형은 펩티드 및 아미노산 변이 및 변형을 포함한다. 따라서, PNA와 같은 올리고뉴클레오티드의 골격 성분은 펩티드 결합일 수 있거나, 대안적으로 이들은 비-펩티드 펩티드 결합일 수 있다. 예시는 아세틸 캡, 8-아미노-3,6-디옥사옥타논산(본원에서 O-링커로 지칭됨)과 같은 아미노 스페이서, 리신과 같은 아미노산을 포함하며, PNA에서 양전하가 요구되는 경우 등에 특히 유용하다. PNA의 화학적 조립 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,539,082호, 제5,527,675호, 제5,623,049, 제5,714,331호, 제5,736,336호, 제5,773,571호 및 제5,786,571호를 참조한다.
화물은 그의 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 안정성 및/또는 친화도를 증가시키기 위해 하나 또는 두 개의 말단에서 하나 이상의 말단 잔기 또는 변형을 선택적으로 포함한다. 일반적으로 사용되는 양으로 하전된 모이어티는 아미노산 리신 및 아르기닌을 포함하지만, 다른 양으로 하전된 모이어티도 또한 유용할 수 있다. 화물은, 프로필아민기를 사용하여 분해를 방지하기 위해 말단 캡핑되도록 추가로 변형될 수 있다. 3' 또는 5' 캡핑 올리고뉴클레오티드에 대한 절차는 당업계에 잘 알려져 있다.
일부 구현예에서, 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
d. 미세 조정(Fine Tuning) 결합
아래의 예는 다양한 3E10 결합 단백질이 다른 것들에 비해 일부 뉴클레오티드에 대한 강화된 결합을 보여줄 수 있고, 가장 특이하게는 티민 또는 구아닌으로 이루어진 서열에 대한 결합에서 주목할 만한 증가가 있었으며, 결합은 일반적으로 아데노신에 비해 더 낮았음을 보여준다. 예를 들어, 도 17a-17d 및 18a-18b를 참조한다.
따라서, 화물의 서열은 이들 특성을 고려하여 화물과 3E10 결합 단백질 사이의 결합 강도를 미세 조정하도록 변형될 수 있다.
예를 들어, 개시된 화물 중 임의의 것은 폴리A, 폴리T, 폴리G, 폴리T, 폴리U, 또는 아데닌(A), 티민(T), 시토신(C), 우라실(U), 구아닌(G), 또는 이노신(I) 중 2, 3, 4개 이상의 조합을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 이러한 서열은, 예를 들어, 3E10 결합 단백질에 대한 결합을 증가시키거나 감소시키도록, 화물에 첨가된 합성 논-코딩 서열일 수 있다. 이러한 서열은 핵산 화물의 5' 또는 3' 말단에 있을 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다. 화물은 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA일 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열이 3E10 결합 단백질의 결합을 증가시키기 위해 첨가된다. 일부 실시예에서, 추가된 서열은 폴리G, 폴리T, 폴리U, 또는 폴리I 또는 티민, 구아닌, 우라실 및/또는 이노신 중 둘 이상의 조합으로 구성된다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열이 결합을 감소시키기 위해 첨가된다. 일부 구현예에서, 추가된 서열은 폴리A 또는 아데닌 또 다른 뉴클레오티드, 예를 들어, 시토신의 조합으로 구성된다.
추가적으로 또는 대안적으로, 이들 결합 특성은 우선적으로 결합을 증가시키거나(예를 들어, 티민, 구아닌, 우라실 및/또는 이노신에 대한 선호) 결합을 감소시키는(예를 들어, 아데닌 및/또는 시토신에 대한 선호) 코돈 최적화를 사용하여 화물의 핵산 서열의 합리적인 설계에 대해 고려될 수 있다.
C. 약학적 조성물
조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 치료적으로 사용될 수 있다.
3E10 항체와 복합체를 이룬 핵산 화물을 포함하는 조성물은 바람직하게는 적절한 약학적 담체와 조합하여 치료적 용도로 사용된다. 이러한 조성물은 유효량의 조성물, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다.
조성물은 적절한 약학적 담체 내 국소 투여, 국부 투여 또는 전신 투여용 제형일 수 있다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition by E. W. Martin (Mark Publishing Company, 1975])은 통상적인 담체 및 제조 방법을 개시하고 있다. 복합체는 세포로 표적화하기 위한 생분해성 또는 비-생분해성 중합체 또는 단백질 또는 리포좀으로 형성된 적절한 생체적합성 입자에 캡슐화될 수도 있다. 이러한 시스템은 당업자에게 잘 알려져 있다. 일부 구현예에서, 복합체는 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 전달을 위해 본원에 개시된 복합체는, 리포좀 또는 다른 중합체 또는 지질 입자에 캡슐화되지 않는다.
주사용 제형은 단위 투여 형태로, 예를 들어, 앰플로 또는 다중 투여 용기로, 선택적으로 보존제를 첨가한 상태로 제공될 수 있다. 조성물은 멸균 수용액 또는 비수성 용액, 현탁액 및 유화액과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이는 특정 구현예에서 대상체의 혈액과 등장성일 수 있다. 비수성 용매의 예는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대, 올리브 오일, 참기름, 코코넛 오일, 아라키스 오일, 땅콩 오일, 광유, 에틸 올레에이트와 같은 주사용 유기 에스테르, 또는 합성 모노 또는 디-글리세리드를 포함하는 고정유이다. 수성 담체는 식염수 및 완충 배지를 포함하는 물, 알코올/수성 용액, 유화액 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 1,3-부탄디올, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락트화 링거 또는 고정유를 포함한다. 정맥 내 비히클은 유체 및 영양 보충제, 및 전해질 보충제(예컨대, 링거 덱스트로스에 기초한 것들)를 포함한다. 물질은 용액, 유화액, 또는 현탁액(예를 들어, 입자, 리포좀, 또는 세포 내에 혼입됨)일 수 있다. 통상적으로, 적절한 양의 약학적으로 허용 가능한 염이 제형에 사용되어 제형을 등장성으로 만든다. 트레할로스는, 통상적으로 1-5%의 양으로, 약학적 조성물에 첨가될 수 있다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 보다 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다.
약학적 조성물은 담체, 증점제, 희석제, 완충제, 보존제, 및 표면 활성제를 포함할 수 있다. 담체 제형은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa]에서 찾을 수 있다. 당업자는 과도한 실험에 의존하지 않고 조성물을 제조하고 제형화하기 위한 다양한 파라미터를 쉽게 결정할 수 있다.
또한, 조성물은 단독으로 또는 다른 적절한 성분과 조합하여 흡입을 통해 투여될 에어로졸 제형으로 만들어질 수 있다(즉, 이들은 "호흡"될 수 있다). 에어로졸 제형은 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소, 및 공기와 같은 가압된 허용 가능한 분사제 내에 배치될 수 있다. 흡입에 의한 투여의 경우, 화합물은 적절한 추진제를 사용하여 가압 팩 또는 네뷸라이저로부터 에어로졸 분무제의 형태로 전달된다.
일부 구현예에서, 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 염, 담체, 완충제, 유화제, 희석제, 부형제, 킬레이트제, 보존제, 가용화제, 또는 안정화제와 같은 제형 성분을 포함한다.
조성물은, 혈관 또는 요 카테터와 같은 침습적 장치를 사용하여, 그리고 약물 전달 능력을 가지며 확장 장치 또는 스텐트 이식편으로서 구성된 스텐트와 같은 중재 장치를 사용하여, 제제 및/또는 뉴클레오티드 전달 시스템의 조직 특이적 흡수를 가능하게 하는 방식으로 전달될 수 있다.
제형은 생분해성 임플란트를 사용하여 확산에 의해 또는 중합체 매트릭스의 분해에 의해 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 제형의 투여는 일정 기간, 예를 들어, 수 시간, 수 일, 수 주, 수 개월 또는 수 년에 걸쳐 조성물에 대한 순차적 노출을 초래하도록 설계될 수 있다. 이는, 예를 들어, 제형의 반복 투여에 의해 또는 조성물이 반복 투여 없이 장기간에 걸쳐 전달되는 지속적이거나 조절된 방출 전달 시스템에 의해 달성될 수 있다.
복합체는 핵산 화물 및 항체를 포함하며, 이의 조성물은 폐 또는 점막 투여를 위해 제형화될 수 있다. 투여는 폐, 비강, 경구(설하, 구강), 질 또는 직장 점막으로의 조성물의 전달을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 에어로졸은 분사제를 사용하여 생성되는지 여부와 상관없이, 용액 또는 현탁액 내에 있을 수 있는 입자의 미세한 미스트의 임의의 제형을 지칭한다. 에어로졸은 초음파 처리 또는 고압 처리와 같은 표준 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
상기도를 통한 투여의 경우, 제형은 점적 또는 분무로 비강에 투여하기 위한 용액, 예를 들어, 완충되거나 완충되지 않은 물 또는 등장성 식염수, 또는 현탁액으로 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 용액 또는 현탁액은 비강 분비물에 대해 등장성이고, 예를 들어, 약 pH 4.0 내지 약 pH 7.4 또는, pH 6.0 내지 pH 7.0 범위의 대략 동일한 pH이다. 완충액은 생리학적으로 양립될 수 있으며, 단순히 예로서 인산염 완충액을 포함한다.
일부 구현예에서, 특히 생체 내에서 T 세포를 표적화하기 위한 것, 예를 들어, CAR T 세포 또는 항원-특이적 T 세포, 면역 세포 또는 CD3, CD7, 또는 CD8과 같은 T 세포 마커, 또는 간과 같은 표적 조직의 마커의 생체 내 생산을 위한 것이 표적화될 수 있다. 예를 들어, 항-CD8 항체 및 항-CD3 Fab 단편 둘 다 생체 내에서 T 세포를 표적화하는 데 사용되어 왔다(Pfeiffer 등의 문헌[EMBO MolMed., 10(11) (2018). pii: e9158. doi: 10.15252/emmm.201809158., Smith 등의 문헌[Nat Nanotechnol., 12(8):813-820 (2017). doi: 10.1038/nnano.2017.57]). 따라서, 일부 구현예에서, 입자 또는 다른 전달 비히클은 CD3, CD7, CD8, 또는 또 다른 면역 세포(예를 들어, T 세포) 마커, 또는 흉선, 비장 또는 간과 같은 특정 조직에 특이적인 마커에 특이적인 표적화 모이어티를 포함한다. 결합 모이어티는, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
표적화 모이어티는 복합체 또는 이의 다른 전달 비히클과 연결되거나, 결합되거나, 접합되거나, 달리 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 표적화 분자는 표적화된 세포의 표면 상의 수용체 또는 다른 분자에 결합하는 단백질, 펩티드, 핵산 분자, 당류 또는 다당류일 수 있다. 이식편에 대한 결합의 결합력 및 특이성의 정도는 표적화 분자의 선택을 통해 조절될 수 있다.
모이어티의 예는, 예를 들어, 특정 세포로의 분자의 전달을 제공하는 표적화 모이어티, 예를 들어, 조혈 줄기 세포, CD34+ 세포, T 세포 또는 임의의 다른 바람직한 세포 유형뿐만 아니라, 바람직한 세포 유형에서 발현된 수용체 및 리간드에 대한 항체를 포함한다. 바람직하게, 모이어티는 조혈 줄기 세포를 표적화한다. 세포외 기질("ECM")을 표적으로 하는 분자의 예는 글리코사미노글리칸("GAG") 및 콜라겐을 포함한다.
복합체에 직접 또는 간접적으로 부착된 다른 유용한 리간드는 병원균-관련 분자 패턴(PAMP)을 포함한다. PAMP는 세포 또는 조직의 표면 상의 톨-유사 수용체(TLR)를 표적화하거나, 세포 또는 조직에 내부적으로 신호를 보내, 잠재적으로 흡수를 증가시킨다. 입자 표면에 접합되거나 공동-캡슐화된 PAMP는 다음을 포함할 수 있다: 비메틸화된 CpG DNA(박테리아), 이중-가닥 RNA(바이러스), 지질다당류(박테리아), 펩티도글리칸(박테리아), 리포아라비노만닌(박테리아), 자이모산(이스트), 미코플라스마 지단백질, 예컨대 MALP-2(박테리아), 플라젤린(박테리아) 폴리(이노신-시티딜산)(박테리아) 리포테이코산(박테리아) 또는 이미다조퀴놀린(합성).
복합체에 직접 또는 간접적으로 공유 부착될 수 있는 렉틴은 뮤신 및 점막 세포 층에 대해 표적 특이적이 되도록 한다.
표적화 모이어티의 선택은 나노입자 조성물의 투여 방법 및 표적화될 세포 또는 조직에 따라 달라질 것이다. 표적화 분자는 일반적으로 세포 또는 조직에 대한 입자의 결합 친화도를 증가시킬 수 있거나, 또는 나노입자를 기관 내 특정 조직 또는 조직 내 특정 세포 유형에 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 흉선, 비장 또는 암세포를 표적화한다.
III. 사용 방법
핵산의 전달을 향상시키기 위해 3E10을 사용하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 통상적으로, 유효량의 3E10 항체는 먼저 세포 내로의 전달을 원하는 핵산 화물과 접촉된다. 예를 들어, 핵산 화물 및 항체는 핵산 화물과 항체가 복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 용액에 혼합될 수 있다. 다음으로, 혼합물을 세포와 접촉시킨다. 다른 구현예에서, 화물 및 항체는 세포를 함유하거나 그렇지 않으면 입욕된 용액에 첨가되고, 복합체는 세포의 존재 하에 형성된다. 복합체는 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내(예를 들어, 유기체에 복합체를 전달함으로써) 세포와 접촉될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 복합체의 용액은 배양 시 세포에 첨가되거나 치료 대상 동물에 주사된다.
항체는 핵산을 세포 내로, 일부 구현예에서는 세포 핵 내로 전달하는 것을 돕는 것으로 여겨진다. 치료는, 예를 들어, 간단한 비경구 투여에 의해, 예컨대 IV 또는 피하 또는 근육내 투여에 의해 이를 필요로 하는 대상체에게 항체 및 핵산 화물의 혼합물을 투여하는 것일 수 있다.
조성물 및 방법은 RNA, DNA, PNA 또는 다른 변형된 핵산, 또는 이들의 조합으로 형성된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 핵산 작제물을 포함할 수 있다.
조성물의 유효량 또는 치료적 유효량은 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료, 억제 또는 완화하거나, 달리 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과, 예를 들어 질환 또는 장애의 기저 병태생리학적 기전 중 하나 이상을 감소, 억제 또는 역전시키기에 충분한 투여량일 수 있다.
유효량은 또한, 항체가 없는 상태에서의 화물의 투여에 비해 핵산 화물의 전달 속도, 양 및/또는 전달의 질을 증가시키는 데 효과적인 양일 수 있다. 조성물의 제형은 투여 방식에 맞게 만들어진다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 투여되는 특정 조성물 뿐만 아니라, 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 복합체를 함유하는 약학적 조성물의 다양한 적절한 제형이 존재한다. 정확한 투여량은 대상체-의존성 변수(예를 들어, 연령, 면역계 건강, 임상 증상 등)와 같은 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.
일부 구현예에서, 투여 전에, 특히 생체 내 투여를 위해, 항체 및 핵산은 실온에서 일정 기간 동안 혼합된다. 일부 구현예에서, 복합체화 시간은, 예를 들어, 1분 내지 30분, 또는 10분 내지 20분(각각, 포괄형)이며, 바람직한 복합체화 시간은 약 15분이다. 항체 용량은 0.0001 mg 내지 1 mg의 범위(각각, 포괄형)일 수 있으며 바람직한 용량은 약 0.1 mg이다. 핵산 용량은 0.001 μg 내지 100 μg의 범위(포괄형)일 수 있고, 바람직한 용량은 10 μg이다. 아래의 생체 내 데이터(예를 들어, 도 6b)는 0.1 mg 3E10, 10 μg의 mRNA를 사용하여 생산되었고, 15분 동안 복합체화되었다. 또 다른 구현예에서, 항체/핵산 화물은 투여 전에 재구성을 위해 건조되거나 동결 건조된 형태로 제공된다.
아래의 실시예는, DNA 화물이 종양에 제한되지 않고 다수의 조직에 더 일반적으로 전달될 수 있는 반면, RNA 전달은 종양 조직에 대해 더욱 선택적일 수 있음을 나타낼 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, RNA 화물은 (예를 들어, 단독으로) 암세포 또는 다른 종양 조직에 선택적으로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 화물의 보다 넓은 분포가 요구되는 경우, RNA는 DNA(예를 들어, 담체 DNA)와 혼합되어 비암/종양 조직으로의 전달을 용이하게 할 수 있다. 담체 DNA는, 예를 들어, 플라스미드 DNA 또는 예를 들어, 살몬 정자로부터 유래된 저 분자량일 수 있다. 일부 구현예에서, 담체 DNA는 비암호화 DNA이다. 담체 DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 담체 DNA는 길이가 1-10개, 1-100개, 1-1,000개, 또는 1-10,000개 뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 하위범위 또는 이의 정수, 또는 이들의 조합을 갖는 핵산으로 구성된다. 통상적으로, 담체 DNA는 항체에 접합되지 않거나 그렇지 않으면 공유 부착되지 않는다. 통상적으로, 담체 DNA는 화물 핵산(예를 들어, RNA) 및 항체와 공동-인큐베이션되고, 그와 함께 복합체로서 공동-전달된다. 일부 구현예에서, 담체 DNA는 비암호화 DNA이다.
A. 시험관 내 및 생체 외 방법
시험관 내 및 생체 외 방법의 경우, 세포는 통상적으로 배양 중에 조성물과 접촉된다. 생체 외 방법의 경우, 세포를 대상체로부터 단리하고 생체 외에서 조성물과 접촉시켜 화물 핵산(들)을 함유하는 세포를 생산할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 세포는 치료될 대상체로부터 또는 동계 숙주로부터 단리된다. 표적 세포는 조성물과 접촉하기 전에 대상체로부터 제거될 수 있다.
B. 생체 내 방법
일부 구현예에서, 핵산 화물의 세포로의 생체 내 전달은 대상체에서 유전자 편집 및/또는 질환 또는 장애의 치료에 사용된다. 통상적으로 항체-핵산 화물을 포함하는 조성물은 생체 내 요법을 위해 대상체에게 직접 투여될 수 있다.
조성물은 정맥 내, 복강 내, 양막 내, 근육 내, 피하, 또는 국소(설하, 직장 내, 비강 내, 폐, 직장 점막, 및 질) 및 경구(설하, 협측 또는 장관)를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 비경구 경로를 포함하여, 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 비강 투여 또는 경구 흡입과 같이, 폐 전달용으로 제형화된다. 제형의 투여는 복합체가 그들의 표적에 도달할 수 있게 하는 임의의 허용 가능한 방법에 의해 달성될 수 있다. 투여는 치료되는 병태에 따라 국소화되거나(즉, 특정 영역, 생리학적 시스템, 조직, 기관, 또는 세포 유형에 대해) 전신 투여될 수 있다. 생체 내 전달을 위한 조성물 및 방법은 WO 2017/143042에서도 논의된다.
방법은 또한 유효량의 항체-핵산 복합체 조성물을 배아 또는 태아, 또는 이를 임신한 모체에게 생체 내 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 방법에서, 조성물은 정맥 또는 동맥, 예컨대, 융모 정맥 또는 배꼽 정맥 내로, 또는 배아 또는 태아의 양막 내로 조성물을 주사 및/또는 주입함으로써 자궁 내 전달된다. 예를 들어, Ricciardi 등의 문헌[Nat Commun. 2018 Jun 26;9(1):2481. doi: 10.1038/s41467-018-04894-2], 및 WO 2018/187493을 참조한다.
C. 응용
관심 폴리펩티드 또는 기능적 핵산을 암호화하는 핵산 화합물, 예를 들어, mRNA, 기능적 핵산, DNA 발현 작제물, 벡터 등은 세포에서 폴리펩티드의 발현 또는 억제를 위해, 3E10 항체를 사용하여 세포 내로 전달될 수 있다. 조성물 및 방법은 다양한 상이한 응용 분야에 걸쳐 사용될 수 있다. 비제한적인 예는 CRISPR 및 gRNA 발현 벡터 +/- 편집 DNA, 큰 DNA(플라스미드 및 발현 벡터)의 전달, 유전자 대체 및 유전자 요법, 예를 들어, 생체 내 또는 생체 외에서 CAR-T 세포 또는 T 세포 수용체를 생성하고 생체 내 또는 생체 외에서 CAR-T 세포 생산을 단순화하기 위한 DNA 및/또는 RNA의 전달, siRNA의 전달, mRNA의 전달 등을 포함한다. 유전자 요법/유전자 편집 및 면역조절, 특히 키메라 항원 수용체 T 세포 생산과 관련된 예시적인 응용이 아래에서 논의된다.
1. 유전자 요법 및 편집
일부 구현예에서, 조성물은 유전자 편집을 위해 사용된다. 예를 들어, 방법은 단일 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기된 유전적 결함, 장애 및 질환을 치료, 예를 들어, 점 돌연변이에 의해 야기된 유전적 결함, 장애 및 질환을 교정하는 데에 특히 유용할 수 있다. 표적 유전자가 유전적 장애의 원인인 돌연변이를 함유하는 경우, 본 방법은 표적 유전자의 DNA 서열을 정상으로 복원할 수 있는 돌연변이유발 복구에 사용될 수 있다. 표적 서열은 유전자의 코딩 DNA 서열 내에 있거나 인트론 내에 있을 수 있다. 표적 서열은 또한 프로모터 또는 인핸서 서열을 포함하여, 표적 유전자의 발현을 조절하는 DNA 서열 내에 있을 수 있다.
본원의 방법에서, 복합체와 접촉된 세포가 대상체에게 투여될 수 있다. 대상체는 혈우병, 근 이영양증, 글로빈병증, 낭성 섬유증, 색소성 건피증, 또는 리소좀 축적 질환과 같은 질환 또는 장애를 가질 수 있다. 이러한 구현예에서, 유전자 변형, 유전자 대체, 유전자 첨가, 또는 이들의 조합은 대상체에서 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 감소시키기 위한 유효량으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, DNA 화물은 뉴클레아제를 암호화하는 핵산, 공여자 올리고뉴클레오티드 또는 공여자 올리고뉴클레오티드를 암호화하는 핵산, 또는 이들의 조합을 포함한다.
a. 유전자 편집 뉴클레아제
핵산 화물은 표적 세포의 게놈에서 단일 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 요소 또는 요소들을 암호화하는 것들을 포함하고, 선택적으로, 그러나, 바람직하게는 공여자 올리고뉴클레오티드와 같은 다른 요소 및/또는 특히 CRISPR/Cas의 경우, gRNA와 같은 시스템의 다른 요소와 조합된다. 조성물은, 예를 들어, 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 달리 변형시키기 위해 사용될 수 있다.
i. 가닥 절단 유도 요소 CRISPR/Cas
일부 구현예에서, 핵산 화물은 CRISPR/Cas-매개 게놈 편집 조성물의 하나 이상의 요소, CRISPR/Cas-매개 게놈 편집 조성물의 하나 이상의 요소를 암호화하는 핵산, 또는 이들의 조합을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, CRISPR/Cas-매개 게놈 편집 조성물은 포유류 대상체에서 CRISPR/Cas-매개 게놈 편집을 수행하는 데 필요한 CRISPR 시스템의 요소를 지칭한다. 아래에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, CRISPR/Cas-매개 게놈 편집 조성물은 통상적으로 crRNA, tracrRNA(또는 가이드 RNA 또는 단일 가이드 RNA로도 지칭되는 이의 키메라) 및 Cas9와 같은 Cas 효소를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. CRISPR/Cas-매개 게놈 편집 조성물은 선택적으로 표적 부위(예를 들어, Cas9에 의해 유도된 단일 또는 이중 스탠드 절단 부위)에서 또는 이에 인접하여 표적 세포의 게놈 내로 재조합될 수 있는 공여자 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템은 진핵생물에 사용하기 위한 유전자 편집(특정 유전자를 침묵화, 강화 또는 변경)으로 사용하기 위해 조정되었다(예를 들어, Cong의 문헌[Science, 15:339(6121):819-823 (2013)] 및 Jinek 등의 문헌[Science, 337(6096):816-21 (2012)] 참조). cas 유전자 및 특이적으로 설계된 CRISPR을 포함하는 필수 요소로 세포를 형질감염시킴으로써, 유기체의 게놈은 임의의 원하는 위치에서 절단되고 변형될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 게놈 편집에 사용하기 위한 조성물을 제조하는 방법은 WO 2013/176772 및 WO 2014/018423에 상세히 기술되어 있으며, 이들은 그 전체가 참조로서 본원에 구체적으로 통합된다.
본원에 개시된 전달 방법은 CRISPR/Cas 시스템에 대한 수많은 변형과 함께 사용하기에 적합하다.
일반적으로, "CRISPR 시스템"은 CRISPR-연관 ("Cas") 유전자의 발현 또는 활성을 유도하는데 관여하는 전사체 및 기타 요소를 집합적으로 지칭하며, Cas 유전자를 암호화하는 서열, tracr(트랜스-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열("직접 반복" 및 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 tracrRNA-가공된 부분 직접 반복을 포함함), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로도 지칭됨), 또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사물을 포함한다. 가이드 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 tracr 메이트 서열(예를 들어, 직접 반복-스페이서-직접 반복)은 뉴클레아제에 의한 가공 전에는 pre-crRNA(pre-CRISPR RNA) 또는 가공 후에는 crRNA로 지칭될 수도 있다.
이하에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 일부 구현예에서, tracrRNA 및 crRNA는 연결되고 키메라 crRNA-tracrRNA 하이브리드를 형성하며, 여기서, 성숙한 crRNA는 Cong의 문헌[Science, 15:339(6121):819-823 (2013)] 및 Jinek 등의 문헌[Science, 337(6096):816-21 (2012)]에 기술된 바와 같은 천연 crRNA:tracrRNA 이중체를 모방하기 위해 합성 스템 루프를 통해 부분적 tracrRNA에 융합된다. 단일 융합된 crRNA-tracrRNA 작제물은 본원에서 가이드 RNA 또는 gRNA(또는 단일 가이드 RNA(sgRNA))로도 지칭된다. sgRNA 내에서, crRNA 부분은 '표적 서열'로서 식별될 수 있고, tracrRNA는 종종 '스캐폴드'로서 지칭된다.
일부 구현예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 I형, II형, 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)와 같은 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체로부터 유래된다.
일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 프로토스페이서로도 지칭됨)를 특징으로 한다. CRISPR 복합체의 형성 맥락에서, "표적 서열"은 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계되어 표적 서열과 가이드 서열 간의 혼성화가 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드와 같은 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치한다.
표적 핵산에서, 각각의 프로토스페이서는 개별 CRISPR 시스템에 특이적인 인식을 갖는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)와 연결된다. 스트렙토코쿠스 피오게네스 CRISPR/Cas 시스템에서, PAM은 뉴클레오티드 서열 NGG이다. 스트렙토코쿠스 피오게네스 CRISPR/Cas 시스템에서, PAM은 뉴클레오티드 서열 NNAGAAW이다. tracrRNA 이중체는 Cas를 crRNA의 스페이서 영역과 프로토스페이서 DNA 사이의 이종이중체 형성을 통해 프로토스페이서 및 필수 PAM으로 이루어진 DNA 표적에 유도한다.
통상적으로, 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서, CRISPR 복합체(표적 서열에 혼성화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체화된 가이드 서열을 포함함)의 형성은 표적 서열 내 또는 그 부근(예를 들어, 표적 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 또는 그 이상의 염기 쌍 이내)에서 한쪽 또는 양쪽 가닥의 절단을 초래한다. 또한, tracr 서열의 전부 또는 일부는, 예컨대 가이드 서열에 작동가능하게 연결된 tracr 메이트 서열의 전부 또는 일부에 대한 혼성화에 의해 CRISPR 복합체의 일부를 형성할 수 있다.
일단 원하는 DNA 표적 서열이 식별되면, 실무자가 적절한 표적 부위를 결정하는 것을 돕는 데 이용할 수 있는 많은 자원이 있다. 예를 들어, 40%를 초과하는 인간 엑손을 표적으로 하는, 약 190,000개의 잠재적 sgRNA의 생물정보학적으로 생성된 목록을 포함하는 수많은 공공 자원은, 실무자가 표적 부위를 선택하고, 그 부위에서 닉 또는 이중 가닥 절단에 영향을 미치도록 연관 sgRNA를 설계하는 것을 돕기 위해 이용 가능하다. 또한, 과학자들이 광범위한 종에서 CRISPR 표적화 부위를 찾고 적절한 crRNA 서열을 생성하는 데 도움이 되도록 설계된 도구인 crispr.u-psud.fr/도 참조한다.
일부 구현예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 유도하는 하나 이상의 벡터는, CRISPR 시스템의 요소의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 직접적인 형성을 유도하도록 표적 세포 내에 도입된다. 예를 들어, Cas 효소, tracr-메이트 서열에 결합된 가이드 서열, 및 tracr 서열은 각각 별도의 벡터 상의 별도의 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 동일하거나 상이한 조절 요소로부터 발현된 둘 이상의 요소가 단일 벡터에 조합될 수 있고, 하나 이상의 추가 벡터가 제1 벡터에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 성분을 제공한다. 단일 벡터로 조합되는 CRISPR 시스템 요소는 임의의 적절한 배향으로 배열될 수 있는데, 예를 들어, 하나의 요소는 제2 요소에 대해 5'(이의 "상류") 또는 3'(이의 "하류")에 위치한다. 하나의 요소의 코딩 서열은 제2 요소의 코딩 서열과 동일하거나 반대인 가닥 상에 위치할 수 있고, 동일하거나 반대의 방향으로 배향될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 프로모터는 CRISPR 효소 및 가이드 서열, (선택적으로 가이드 서열에 작동 가능하게 연결된) tracr 메이트 서열, 및 하나 이상의 인트론 서열 내에 내장된 tracr 서열(예를 들어, 각각 상이한 인트론 내, 적어도 하나의 인트론 내 2개 이상, 또는 모두 단일 인트론 내) 중 하나 이상을 암호화하는 전사체의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소, 가이드 서열, tracr 메이트 서열, 및 tracr 서열은 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 이로부터 발현된다.
일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 삽입 부위, 예컨대 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열("복제 부위"로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 삽입 부위(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 삽입 부위)는 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소의 상류 및/또는 하류에 위치한다. 일부 구현예에서, 벡터는, 가이드 서열이 삽입 부위 내로 삽입된 후 발현 시 가이드 서열이 진핵 세포에서 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 유도하도록, tracr 메이트 서열의 상류, 및 선택적으로, Tracr 메이트 서열에 작동가능하게 연결된 조절 요소의 하류에 삽입 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 2개 이상의 삽입 부위를 포함하며, 각각의 삽입 부위는 각 부위에서 가이드 서열의 삽입을 허용하기 위해 2개의 tracr 메이트 서열 사이에 위치한다. 이러한 배열에서, 2개 이상의 가이드 서열은 단일 가이드 서열의 2개 이상의 카피, 2개 이상의 상이한 가이드 서열, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다수의 상이한 가이드 서열이 사용되는 경우, 단일 발현 작제물을 사용하여 세포 내에서 CRISPR 활성을 다수의 상이한 상응하는 표적 서열에 표적화할 수 있다. 예를 들어, 단일 벡터는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20개의 가이드 서열 또는 이를 초과하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 초과의 이러한 가이드-서열 함유 벡터가 제공될 수 있고, 선택적으로 세포에 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 CRISPR 효소, 예컨대 Cas 단백질을 암호화하는 효소 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 요소를 포함한다. Cas 단백질의 비제한적인 예시는 Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (also known as Csnl and Csxl2), CaslO, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, CsxlO, Csxl6, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4, 이의 상동체 또는 이의 변형된 형태를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형되지 않은 CRISPR 효소는 Cas9와 같은 DNA 절단 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 표적 서열의 위치에서, 예컨대 표적 서열 내에서 및/또는 표적 서열의 상보체 내에서 한쪽 또는 양쪽 가닥의 절단을 유도한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 표적 서열의 첫 번째 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 또는 그 이상의 염기쌍 내에서 한쪽 또는 양쪽 가닥의 절단을 유도한다.
일부 구현예에서, 벡터는, 돌연변이된 CRISPR 효소가 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 한쪽 또는 양쪽 가닥을 절단하는 능력이 결여되도록, 상응하는 야생형 효소에 대해 돌연변이된 CRISPR 효소를 암호화한다. 예를 들어, S. 피오게네스 유래의 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인 내 아스파르트산-대-알라닌 치환(D10A)은 Cas9를 두 가닥을 절단하는 뉴클레아제에서 니카아제(단일 가닥을 절단함)로 변환시킨다. Cas9를 니카아제로 만드는 돌연변이의 다른 예는, 제한 없이, H840A, N854A, 및 N863A를 포함한다. 또 다른 예로서, Cas9(RuvC I, RuvC II, 및 RuvC III)의 둘 이상의 촉매 도메인을 돌연변이시켜 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 돌연변이된 Cas9를 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, D10A 돌연변이는 H840A, N854A, 또는 N863A 돌연변이 중 하나 이상과 조합되어 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 Cas9 효소를 생산한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는, 돌연변이된 효소의 DNA 절단 활성이 돌연변이되지 않은 형태에 대해 약 25%, 10%, 5%>, 1%>, 0.1%>, 0.01% 이하일 때, 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 것으로 간주된다.
일부 구현예에서, CRISPR 효소를 암호화하는 효소 코딩 서열은 진핵 세포와 같은 특정 세포에서의 발현에 최적화된 코돈이다. 진핵 세포는 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 또는 비인간 영장류를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 포유류와 같은 특정 유기체의 것들이거나 이로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는, 천연 아미노산 서열을 유지하면서 그 숙주 세포의 유전자에 더 자주 또는 가장 자주 사용되는 코돈으로 천연 서열의 적어도 하나의 코돈(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 또는 그 이상의 코돈)을 대체함으로써, 관심 있는 숙주 세포에서의 발현 강화를 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 코돈 편향(유기체 간의 코돈 사용에서의 차이)은 종종 메신저 RNA(mRNA)의 번역 효율과 상관되며, 이는 무엇보다도 번역되는 코돈의 특성 및 특정 전달 RNA(tRNA) 분자의 가용성에 의존하는 것으로 여겨진다.
세포에서 선택된 tRNA의 우세성은 일반적으로 펩티드 합성에 가장 빈번하게 사용되는 코돈의 반영이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기초하여 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현에 맞게 조정될 수 있다. 코돈 사용 표는, 예를 들어, "코돈 사용 데이터베이스"에서 쉽게 이용할 수 있고, 이들 표는 다수의 방식으로 조정될 수 있다. Nakamura, Y. 등의 문헌[Nucl. Acids Res., 28:292 (2000)]을 참조한다. 특정 숙주 세포에서의 발현을 위해 특정 서열을 코돈 최적화하기 위한 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 Gene Forge(Aptagen; Jacobus, PA)가 또한 이용 가능하다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소를 암호화하는 서열의 하나 이상의 코돈(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 이상, 또는 모든 코돈)은 특정 아미노산에 대해 가장 빈번하게 사용되는 코돈에 상응한다.
일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 포함하는 CRISPR 효소를 암호화한다. 하나를 초과하는 NLS가 존재하는 경우, 각각의 NLS는 다른 것들과 독립적으로 선택될 수 있어서, 단일 NLS는 하나 초과의 카피로 존재할 수 있고/있거나 하나 이상의 카피로 존재하는 하나 이상의 다른 NLS와 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, NLS의 가장 가까운 아미노산이 N-또는 C-말단으로부터 폴리펩티드 사슬을 따라 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상의 아미노산 내에 있는 경우, NLS는 N- 또는 C-말단 근처에 있는 것으로 간주된다.
일반적으로, 하나 이상의 NLS는 진핵 세포의 핵에서 검출 가능한 양으로 CRISPR 효소의 축적을 유도하기에 충분한 강도를 갖는다. 일반적으로, 핵 국소화 활성의 강도는 CRISPR 효소 내 NLS의 수, 사용된 특정 NLS(들), 또는 이들 인자의 조합으로부터 유래될 수 있다.
핵 내 축적의 검출은 임의의 적절한 기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 마커는 CRISPR 효소에 융합될 수 있어서, 세포 내의 위치가, 예컨대 핵의 위치를 검출하기 위한 수단(예를 들어, DAPI와 같은 핵에 특이적인 염색)과 조합하여 시각화될 수 있다. 세포 핵은 또한 세포로부터 단리될 수 있으며, 그 다음 그 내용물은 면역조직화학, 웨스턴 블롯, 또는 효소 활성 검정과 같은 단백질을 검출하기 위한 임의의 적절한 공정에 의해 분석될 수 있다. 핵에서의 축적은 CRISPR 효소 또는 복합체에 노출되지 않았거나 하나 이상의 NLS가 결여된 CRISPR 효소에 노출된 대조군과 비교하여, 예컨대, CRISPR 복합체 형성의 효과에 대한 검정(예를 들어, 표적 서열에서의 DNA 절단 또는 돌연변이에 대한 검정, 또는 CRISPR 복합체 형성 및/또는 CRISPR 효소 활성에 의해 영향을 받는 변경된 유전자 발현 활성에 대한 검정)에 의해 간접적으로 결정될 수도 있다.
일부 구현예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 유도성 프로모터의 조절 하에 있으며, 이는 Cas9와 같은 유도성 Cas를 포함할 수 있다.
Cong의 문헌[Science, 15:339(6121):819-823 (2013)]은 Cas9, tracrRNA, pre-crRNA(또는 Cas9 및 sgRNA)의 이종 발현이 포유류 염색체의 표적화된 절단을 달성할 수 있다는 것을 보고하였다. 따라서, 본원에 개시된 방법에 사용된 CRISPR 시스템, 및 따라서, 화물 핵산은 CRISPR/Cas 시스템 키메라 RNA(chiRNA) 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 제1 조절 요소 및 선택적으로 적어도 하나 이상의 핵 국소화 서열을 포함할 수 있는 CRISPR 효소를 암호화하는 효소 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제2 조절 요소를 포함하는 CRISPR 시스템의 요소를 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있는 벡터 시스템이되, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열은 (a) 진핵 세포에서 표적 서열에 혼성화될 수 있는 가이드 서열, (b) tracr 메이트 서열, 및 (c) tracr 서열을 포함한다. 요소 (a), (b) 및 (c)는 5'에서 3 방향으로 배열될 수 있되, 여기서 성분 I 및 II는 시스템의 동일하거나 상이한 벡터 상에 위치하고, 전사될 때, tracr 메이트 서열은 tracr 서열에 혼성화되고, 가이드 서열은 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 유도하되, 여기서, CRISPR 복합체는 (1) 표적 서열에 혼성화되는 가이드 서열, 및 (2) tracr 서열에 혼성화되는 tracr 메이트 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함할 수 있고, CRISPR 효소를 암호화하는 효소 코딩 서열은 이종 기능성 도메인을 추가로 암호화한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 벡터가 또한 적절한 Cas 효소, 예를 들어, Cas9를 암호화한다. 상이한 유전자 요소는 동일하거나 상이한 프로모터의 조절 하에 있을 수 있다.
구체적인 사항은 상이한 조작된 CRISPR 시스템에서 다양할 수 있지만, 전체 방법론은 유사하다. CRISPR 기술을 사용하여 DNA 서열(많은 이용 가능한 온라인 도구 중 하나를 사용하여 식별됨)을 표적화하는 것에 관심이 있는 실무자는 표적 서열을 함유하는 짧은 DNA 단편을 가이드 RNA 발현 플라스미드에 삽입할 수 있다. sgRNA 발현 플라스미드는 표적 서열(약 20개의 뉴클레오티드), tracrRNA 서열의 형태(스캐폴드)뿐만 아니라 적절한 프로모터 및 진핵 세포에서의 적절한 가공에 필요한 요소를 함유한다. 이러한 벡터는 상업적으로 이용 가능하다(예를 들어, Addgene을 참조한다). 시스템의 대부분은 이중 가닥 DNA를 형성하기 위해 어닐링된 다음 sgRNA 발현 플라스미드에 클로닝되는 맞춤형 상보적 올리고에 의존한다. 형질감염된 세포에서 동일하거나 분리된 플라스미드로부터의 sgRNA 및 적절한 Cas 효소의 공동 발현은 원하는 표적 부위에서 (Cas 효소의 활성에 따라) 단일 또는 이중 가닥 절단을 초래한다.
ii. 징크 핑거 뉴클레아제
일부 구현예에서, 표적 세포의 게놈에서 단일 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 요소는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 암호화하는 핵산 작제물 또는 작제물들이다. 따라서, 핵산 화물은 ZFN을 암호화할 수 있다.
ZFN은 통상적으로 절단 도메인에 연결된 징크-핑거 단백질로부터 유래된 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 가장 흔한 절단 도메인은 IIS형 효소 Fokl이다. Fok1은 하나의 가닥 상의 인식 부위로부터의 9개의 뉴클레오티드 및 다른 하나의 인식 부위로부터의 13개의 뉴클레오티드에서 DNA의 이중-가닥 절단을 촉매한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,356,802호; 제5,436, 150호 및 제5,487,994호; 및 Li 등의 문헌 [Proc., Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992):4275-4279]; Li 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2764-2768 (1993)]; Kim 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:883-887 (1994a)]; Kim 등의 문헌 [J. Biol. Chem. 269:31 ,978-31,982 (1994b)]을 참조한다. 이들 효소 중 하나 이상(또는 이의 효소적 기능적 단편)은 절단 도메인의 공급원으로서 사용될 수 있다.
원칙적으로, 임의의 관심 게놈 위치를 표적화하도록 설계될 수 있는 DNA 결합 도메인은 Cys2His2 징크 핑거의 탠덤 어레이일 수 있으며, 이들 각각은 일반적으로 표적 DNA 서열에서 3 내지 4개의 뉴클레오티드를 인식한다. Cys2His2 도메인은 다음의 일반 구조를 갖는다: Phe(때로는 Tyr)-Cys-(2 내지 4개의 아미노산)-Cys-(3개의 아미노산)-Phe(때로는 Tyr)-(5개의 아미노산)-Leu-(2개의 아미노산)-His-(3개의 아미노산)-His. 다수의 핑거를 함께 연결함으로써(숫자는 다양함: 공개된 연구에서 단량체 당 3 내지 6개의 핑거가 사용되었음), ZFN 쌍은 18 내지 36 뉴클레오티드 길이 게놈 서열에 결합하도록 설계될 수 있다.
조작 방법은, 이에 한정되지는 않으나, 합리적인 설계 및 다양한 유형의 경험적 선택 방법을 포함한다. 합리적 설계는, 예를 들어, 삼중(또는 사중) 뉴클레오티드 서열 및 개별 징크 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 각각의 삼중 또는 사중 뉴클레오티드 서열은 특정 삼중 또는 사중 서열에 결합하는 징크 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열에 결합한다. 예를 들어, 미국 특허 제6, 140,081호; 제6,453,242호; 제6,534,261호; 제6,610,512호; 제6,746,838호; 제6,866,997호; 제7,067,617호; 미국 특허 출원 공개 제2002/0165356호; 제2004/0197892호; 제2007/0154989호; 제2007/0213269호; 및 국제 특허출원 공개 번호 WO 98/53059 및 WO 2003/016496을 참조한다.
iii. 전사 활성화제 유사 효과기 뉴클레아제
일부 구현예에서, 표적 세포의 게놈에서 단일 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 요소는 전사 활성화제 유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)를 암호화하는 핵산 작제물 또는 작제물들이다. 따라서, 핵산 화물은 TALEN을 암호화할 수 있다.
TALEN은 ZFN과 유사한 전체 구조를 가지며, DNA 결합 도메인이 식물 병원성 박테리아의 전사 인자인 TAL 효과기 단백질로부터 유래한다는 주요 차이점을 갖는다. TALEN의 DNA-결합 도메인은 아미노산 반복체의 탠덤 어레이이며, 각각은 약 34개 잔기 길이이다. 반복은 서로 매우 유사하며; 통상적으로 이들은 2개의 위치(아미노산 12 및 13, 반복 가변 이잔기 또는 RVD로 불림)에서 주로 상이하다. 각각의 RVD는 4개의 가능한 뉴클레오티드 중 하나에 대해 우선적으로 결합하는 것을 나타내며, 이는 구아닌에 추가하여 아데닌에 결합하는 것으로 알려진 NN RVD을 통해 각각의 TALEN 반복체가 단일 염기쌍에 결합하는 것을 의미한다. TAL 효과기 DNA 결합은 징크-핑거 단백질의 결합보다 기전적으로 덜 이해되어 있지만, 이들의 보다 단순한 코드는 조작된 뉴클레아제 설계에 매우 유익할 수 있다. TALEN은 또한 이량체로서 절단하고, 비교적 긴 표적 서열을 가지며(지금까지 보고된 가장 짧은 것은 단량체당 13개의 뉴클레오티드에 결합함), 결합 부위 사이의 스페이서의 길이에 대해 ZFN보다 덜 엄격한 요건을 갖는 것으로 보인다. 단량체 및 이량체 TALEN은 10회 초과, 14회 초과, 20회 초과, 또는 24회 초과의 반복을 포함할 수 있다.
특이적 핵산에 결합하도록 TAL을 조작하는 방법은 Cermak 등의 문헌[Nucl. Acids Res. 1-11 (2011)]에 기술되어 있다. TAL 효과기 및 이를 사용하여 DNA를 변형시키는 방법을 개시하는 미국 특허 공개 제2011/0145940호. Miller 등의 문헌 [Nature Biotechnol 29: 143 (2011)]은 TAL 절단 변이체를 Fokl 뉴클레아제의 촉매 도메인에 결합함으로써 부위 특이적 뉴클레아제 구조에 대한 TALEN을 만드는 것으로 보고하였다. 생성된 TALEN은 불멸화 인간 세포에서 유전자 변형을 유도하는 것으로 나타났다. TALE 결합 도메인에 대한 일반적인 설계 원리는, 예를 들어, WO 2011/072246에서 찾을 수 있다.
b. 공여자 폴리뉴클레오티드
본원에 기술된 게놈 편집 시스템의 뉴클레아제 활성은 표적 DNA를 절단하여 표적 DNA에서 단일 또는 이중 가닥 절단체를 생성한다. 이중 가닥 절단은 비-상동성 말단 결합, 및 상동성-유도 복구의 두 가지 방법 중 하나로 세포에 의해 복구될 수 있다. 비-상동성 말단 결합(NHEJ)에서, 이중 가닥 절단은 절단 말단을 서로 직접 연결함으로써 복구된다. 이와 같이, 일부 핵산 물질이 손실되어 결실을 초래할 수 있음에도, 새로운 핵산 물질이 부위 내로 삽입되지 않는다. 상동성-유도 복구(HDR)에서, 절단된 표적 DNA 서열에 상동성을 갖는 공여자 폴리뉴클레오티드가 절단된 표적 DNA 서열을 복구하기 위한 주형으로 사용되어, 공여자 폴리뉴클레오티드로부터 표적 DNA로 유전 정보를 전달한다. 이와 같이, 새로운 핵산 물질이 부위 내로 삽입/카피될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 핵산 화물은 공여자 폴리뉴클레오티드이거나 이를 포함한다. NHEJ 및/또는 상동성-유도 복구로 인한 표적 DNA의 변형은 유전자 교정, 유전자 대체, 유전자 태그 부착, 이식 유전자 삽입, 뉴클레오티드 결실, 유전자 파괴, 유전자 돌연변이 등을 유도하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 게놈 편집 조성물에 의한 DNA의 절단은 표적 DNA 서열을 절단하고, 외래적으로 제공된 공여자 폴리뉴클레오티드의 부재 하에 세포가 서열을 복구하게 함으로써 표적 DNA 서열로부터 핵산 물질을 결실시키는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 게놈 편집 조성물이 표적 DNA 서열과 상동성을 갖는 적어도 하나의 분절을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, 방법은, 핵산 물질을 표적 DNA 서열에 첨가, 즉, 삽입 또는 교체(예를 들어, 단백질, siRNA, miRNA 등을 암호화하는 핵산을 "녹인"), 태그(예를 들어, 6xHis, 형광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질; 황색 형광 단백질 등), 헤마글루티닌(HA), 플래그, 등)을 첨가, 유전자에 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 내부 리보솜 진입 서열(IRES), 2A 펩티드, 시작 코돈, 정지 코돈, 스플라이싱 신호, 국소화 신호, 등)을 첨가, 핵산 서열을 변형(예를 들어, 돌연변이 도입) 등을 하기 위해 사용될 수 있다. 이와 같이, 조성물은, 예를 들어 유전자 요법에 사용된 바와 같이 부위 특이적, 즉 "표적화", 방법, 예를 들어 유전자 녹아웃, 유전자 녹인, 유전자 편집, 유전자 태그 부착 등으로 DNA를 변형시키는 데 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 서열을 표적 DNA 서열에 삽입하는 것이 바람직한 응용예에서, 삽입될 공여자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 또한 세포에 제공된다. "공여자 서열" 또는 "공여자 폴리뉴클레오티드" 또는 "공여자 올리고뉴클레오티드"는 절단 부위에 삽입될 핵산 서열을 의미한다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 통상적으로, 상동성을 갖는 게놈 서열과 공여자 폴리뉴클레오티드 사이의 상동성-유도 복구를 지원하기 위해 절단 부위의 측면, 예를 들어, 절단 부위의 약 50개 염기 이하 이내, 예를 들어, 약 30개 염기 이내, 약 15개 염기 이내, 약 10개 염기 이내, 약 5개 염기 이내, 또는 절단 부위의 바로 측면에 위치하는 핵산 서열과 절단 부위에서 게놈 서열에 대해 충분한 상동성, 예를 들어, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 상동성을 함유한다. 공여자 서열은 통상적으로 공여자가 대체하는 게놈 서열과 동일하지 않다. 오히려, 공여자 서열은 상동성-유도 복구를 지원하기에 충분한 상동성이 존재하는 한, 게놈 서열에 대해 적어도 하나 이상의 단일 염기 변화, 삽입, 결실, 반전 또는 재배열을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 공여자 서열은 2개의 상동성 영역이 측면에 위치한 비-상동성 서열을 포함하여, 표적 DNA 영역과 2개의 측면 서열 사이의 상동성-유도 복구는 표적 영역에서 비-상동성 서열의 삽입을 초래한다.
2. 면역조절
a. CAR T 세포
개시된 조성물 및 방법은 면역 수용체, 특히 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 키메라 면역 수용체(CIR)를 발현하는 림프구의 제조라는 맥락에서 특히 유용하다. 인공 면역 수용체(또한 본원에서 키메라 T 세포 수용체, 키메라 면역 수용체, 키메라 항원 수용체(CAR), 및 키메라 면역 수용체(CIR)로도 알려지고 지칭됨)는 조작된 수용체이며, 이는 선택된 특이성을 세포 상에 접목시킨다. 논의된 방법에 따라 변형된 세포는, 이하에서 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 암, 감염, 염증 및 자가면역 질환의 치료를 위한 다양한 면역 요법에 사용될 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 키메라 항원 수용체 화물을 암호화하는 mRNA 또는 DNA는 면역 세포, 예컨대 림프구에 전달된다.
화물은 생체 내, 생체 외, 또는 시험관 내에서 면역 세포에 전달될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 화물은 mRNA이며, 이는 비용 감소, 제조 용이성, 부작용(예를 들어, 사이토카인 폭풍, 신경독성, 이식편 대 숙주 질환 등) 감소 중 하나 이상을 허용할 수 있다. 특정 구현예에서, 면역 세포(예를 들어, T 세포)는 CAR T 세포 요법을 필요로 하는 대상체로부터 수확되고, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 하나 이상의 CAR T 세포 작제물을 암호화하는 mRNA를 수확된 세포 내로 전달하는 데 사용되고, 세포는 대상체에게 복귀된다. 일부 구현예에서, 세포를 초기에 수확하여 대상체에게 복귀시키는 공정은 1주 이하, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일이 소요된다. 특정 구현예에서, 세포를 초기에 수확하여 대상체에게 복귀시키는 공정은 1 또는 2일, 또는 1일 미만, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간 이내에 수행된다.
키메라 항원 수용체의 설계 및 개발에 대한 전략은 그 전체가 참조로서 본원에 구체적으로 통합된 Dotti 등의 문헌[Immunol Rev. 2014 January; 257(1): . doi:10.1111/imr.12131 (35 pages)]뿐 아니라, Dotti의 문헌[Molecular Therapy, 22(5):899-890(2014)], Karlsson 등의 문헌[Cancer Gene Therapy, 20:386-93 (2013)], Charo, 등의 문헌[Cancer Res., 65(5):2001-8 (2005)], Jensen, 등의 문헌[Immunol Rev., 257(1): 127-144 (2014)], Eaton 등의 문헌[Gene Therapy, 9:527-35 (2002)], Barrett 등의 문헌[Annu Rev Med., 65: 333-347 (2014)], Cartellieri등의 문헌[Journal of Biomedicine and Biotechnology, Volume 2010, Article ID 956304, 13 pages doi:10.1155/2010/956304]; 및 미국 특허 공개 번호 제2015/0017120호, 제2015/0283178호, 제2015/0290244호, 제2014/0050709호, 및 제2013/0071414호에 검토되어 있다.
CAR은 단클론 항체의 항원 결합 특성을 T 세포의 용해능 및 자가 재생과 결합시키고, 종래의 T 세포와 비교해 여러 이점을 갖는다(Ramos 및 Dotti의 문헌[Expert Opin Biol Ther., 11:855-873 (2011)], Curan 등의 문헌[J GeneMed., 14:405-415 (2012)], Maher의 문헌[ISRN Oncol. 2012:278093 (2012)]). CAR-T 세포는 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC)와는 독립적으로 암세포를 인식하고 사멸시킨다. 따라서, 표적 세포 인식은 종양이 MHC-제한된 T 세포 인식을 회피하는 일부 기전, 예를 들어 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 분자의 하향 조절 및 결함 항원 처리에 의해 영향을 받지 않는다.
키메라 면역 수용체는 초기에 1980년대에 개발되었고, 원래는 단클론 항체의 가변(항원 결합) 영역 및 T 세포 수용체(TCR) α 및 β 사슬의 불변 영역을 포함하였다(Kuwana 등의 문헌[Biochem Biophys Res Commun., 149:960-968 (1987)). 1993년, 이러한 설계는 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄 모두의 항원 결합 영역으로부터의 단쇄 가변 단편(scFv)으로부터의 엑토도메인, 막관통 도메인, 및 CD3-ζ 유래의 신호 전달 도메인을 갖는 엔도도메인을 포함하도록 변형되었다. 후기 CAR은 일반적으로 공동-자극 신호전달 엔도도메인을 갖는 유사한 구조적 설계를 따랐다. 따라서, 본원의 방법에 사용된 CAR 작제물은 항원 결합 도메인 또는 엑토도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 엔도도메인, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 엑토도메인은 scFv이다. scFv의 친화도는 CAR 기능을 예측한다(Hudecek 등의 문헌[Clin Cancer Res., 19(12):3153-64 (2013)], Chmielewski 등의 문헌[J Immunol., 173:7647-7653 (2004)]). 항원 결합 및 후속 활성화는 또한 CAR에 가요성 링커 서열을 첨가함으로써 변형될 수 있으며, 이는 2개의 상이한 항원을 인식할 수 있는 2개의 구별되는 scFv의 발현을 가능하게 한다(Grada 등의 문헌[Mol Ther Nucleic Acids, 2:e105 (2013))(탠덤 CAR(TanCAR)로 지칭됨). 탠덤 CARS는 각각의 항원을 개별적으로 낮은 수준으로 발현하는 암을 사멸시키는 데 더 효과적일 수 있고, 단일 항원 손실 변이체에 의한 종양 면역 탈출의 위험을 감소시킬 수도 있다. 다른 엑토도메인은 IL13Rα2(Kahlon, 등의 문헌[Cancer Res., 64:9160-9166 (2004)], Brown 등의 문헌[Clin Cancer Res., 18(8):2199-209 (2012)], Kong 등의 문헌[Clin Cancer Res., 18:5949-5960 (2012)], NKG2D-리간드 및 CD70 수용체, 펩티드 리간드(예를 들어, T1E 펩티드 리간드), 및 소위 "범용 엑토도메인"(예를 들어, 비오틴화 단클론 항체와 접촉한 표적을 인식하도록 설계된 아비딘 엑토도메인, 또는 FITC 표지 단클론 항체와 접촉한 표적을 인식하도록 설계된 특이적인 scFv(Zhang, 등의 문헌[Blood, 106:1544-1551 (2005)], Barber, 등의 문헌[Exp Hematol., 36:1318-1328 (2008)], Shaffer 등의 문헌[Blood, 117:4304-4314 (2011)], Davies등의 문헌[Mol Med., 18:565-576 (2012)], Urbanska등의 문헌[Cancer Res., 72:1844-1852 (2012)], Tamada등의 문헌[Clin Cancer Res.,18:6436-6445 (2012)])을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 힌지 영역을 포함한다. 엑토도메인은 CAR 특이성에 중요하지만, 엑토도메인을 막관통 도메인(힌지 영역)에 연결하는 서열은 CAR의 길이 및 유연성에서 차이를 생성함으로써 CAR-T 세포 기능에도 영향을 미칠 수 있다. 힌지는, 예를 들어 IgG1과 같은 면역글로불린으로부터 유래된 CH2CH3 힌지, 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, Hudecek 등의 문헌[(Hudecek, 등, Clin Cancer Res., 19(12):3153-64 (2013)])은 CH2-CH3 힌지[229 아미노산(AA)], CH3 힌지(119 AA), 및 짧은 힌지(12AA)의 3세대 ROR1 특이적 CAR를 발현하는 T 세포의 효과기 기능에 대한 영향을 비교하였고, '짧은 힌지' CAR을 발현하는 T 세포가 우수한 항종양 활성을 가짐을 발견한 반면, 다른 연구자들은 CH2-CH3가 1세대 CD30 특이적 CAR의 에피토프 인식을 손상시킴을 발견하였다(Hombach, 등의 문헌[Gene Ther., 7:1067-1075 (2000)]).
힌지(또는 힌지 도메인이 없는 경우 엑토도메인)와 신호 전달 엔도도메인 사이에는 통상적으로 막관통 도메인이 있으며, 가장 통상적으로는 CD3-ζ, CD4, CD8, 또는 CD28 분자로부터 유래된다. 힌지와 마찬가지로, 막관통 도메인은 CAR-T 세포 효과기 기능에도 영향을 미칠 수 있다.
항원 인식 시, CAR 엔도도메인은 활성화 및 공자극 신호를 T 세포에 전달한다. T 세포 활성화는 세포질 도메인에 존재하는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)의 TCR 복합체의 세포질 CD3-ζ 도메인에 대한 인산화에 의존한다(Irving 등의 문헌[Cell, 64:891-901 (1991)]). 대부분의 CAR 엔도메인은 CD3-ζ로부터 유래된 활성화 도메인을 함유하지만, 다른 것들은 IgE-γ 도메인에 대한 Fc 수용체와 같은 ITAM-함유 도메인을 포함할 수 있다(Haynes 등의 문헌[J Immunol., 166:182-187 (2001)]).
CAR을 발현하는 세포의 표적 특이성은 항체/엑토도메인에 의해 인식되는 항원에 의해 결정된다. 개시된 조성물 및 방법은 임의의 항원을 표적으로 하는 작제물, 및 작제물을 발현하는 세포를 생성하는 데 사용될 수 있다. 면역요법, 특히 암 면역요법의 맥락에서, 수많은 항원, 및 이들을 표적화하기 위한 적절한 엑토도메인이 잘 알려져 있다. 천연 TCR과는 달리, scFv-기반 CAR의 대부분은 세포의 MHC에 의해 가공되고 제시되는 내부 항원보다는 세포 표면에 발현된 표적 항원을 인식하지만, CAR은 탄수화물 및 당지질을 포함하는 단백질 에피토프 이외의 구조를 인식할 수 있고 따라서 잠재적인 표적 항원의 풀을 증가시킬 수 있다는 점에서 고전 TCR에 비해 이점을 갖는다 Dotti 등의 문헌[Immunol Rev. 2014 January; 257(1): doi:10.1111/imr.12131 (35 pages)]. 바람직한 표적은 암 세포 또는 그 주변 간질에서만 발현되는 항원(Cheever 등의 문헌[Clin Cancer Res., 15:5323-5337 (2009)]), 예컨대 신경교종 세포에 특이적인 EGFR의 스플라이스 변이체(EGFRvIII)를 포함한다(Sampson 등의 문헌[Semin Immunol., 20(5):267-75 (2008)]). 그러나, 인간 항원은 이러한 요건을 충족하고, 표적 항원의 대부분은 정상 세포(예를 들어, GD2, CAIX, HER2)에서 낮은 수준으로 그리고/또는 계통 제한 방식(예: CD19, CD20)으로 발현된다.
바람직한 표적, 및 이들을 표적으로 하는 CAR은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Dotti 등의 문헌[Immunol Rev. 2014 January ; 257(1): . doi:10.1111/imr.12131 (35 pages) 참조). 예를 들어, 혈액암에 대한 CAR 표적은, 이에 한정되지는 않으나, CD 19(예를 들어, B-세포)(Savoldo 등의 문헌[J Clin Invest., 121:1822-1826 (2011)], Cooper 등의 문헌[Blood, 105:1622-1631 (2005)]; Jensen, 등의 문헌[Biol Blood Marrow Transplant(2010)], Kochenderfer, 등의 문헌[Blood, 119:2709-2720 (2012)], Brentjens, 등의 문헌[Molecular Therapy, 17:S157 (2009)], Brentjens, 등의 문헌[Nat Med., 9:279-286 (2003)], Brentjens, 등의 문헌[Blood, 118:4817-4828 (2011)], Porter, 등의 문헌[N Engl J Med., 365:725-733 (2011)], Kalos, 등의 문헌[Sci Transl Med., 3:95ra73 (2011), Brentjens 등의 문헌[Sci Transl Med., 5:177ra38 (2013)], Grupp 등의 문헌[N Engl J Med (2013)]); CD20(예를 들어, B-세포)(Jensen, 등의 문헌[Biol Blood Marrow Transplant(2010)], Till 등의 문헌[Blood, 112:2261-2271 (2008)], Wang 등의 문헌[Hum Gene Ther., 18:712-725 (2007)], Wang, 등의 문헌[Mol Ther., 9:577-586 (2004)], Jensen, 등의 문헌[Biol Blood Marrow Transplant, 4:75-83 (1998)]); CD22(예를 들어, B-세포) (Haso, 등의 문헌[Blood, 121:1165-1174 (2013)); CD30(예를 들어, B-세포)(Di Stasi, 등의 문헌[Blood, 113:6392-6402(2009)], Savoldo, 등의 문헌[Blood, 110:2620-2630 (2007)], Hombach 등의 문헌[Cancer Res., 58:1116-1119 (1998)]); CD33(예를 들어, 골수)(Finney, 등의 문헌[J Immunol., 161:2791-2797 (1998)]); CD70(예를 들어, B-세포/T-세포)(Shaffer, 등의 문헌[Blood, 117:4304-4314 (2011)]); CD123(예를 들어, 골수성)(Tettamanti, 등의 문헌[Br J Haematol, 161:389-401 (2013)]); 카파(예를 들어, B-세포)(Vera, 등의 문헌[Blood, 108:3890-3897 (2006)]); 루이스 Y(예를 들어, 골수성)(Peinert, 등의 문헌[Gene Ther., 17:678-686(2010)], Ritchie, 등의 문헌[Mol Ther (2013)]); NKG2D 리간드(예를 들어, 골수성) (Barber 등의 문헌[Exp Hematol., 36:1318-1328 (2008)], Lehner 등의 문헌[PLoS One., 7:e31210 (2012)], Song 등의 문헌[Hum Gene Ther., 24:295-305 (2013)], Spear 등의 문헌[J Immunol. 188:6389-6398 (2012)]); ROR1(예를 들어, B-세포)(Hudecek, 등의 문헌[Clin Cancer Res. (2013)])을 포함한다.
고형 종양에 대한 CAR 표적은, 이에 한정되지는 않으나, B7H3(예를 들어, 육종, 신경교종)(Cheung, 등의 문헌[Hybrid Hybridomics, 22:209-218 (2003)); CAIX(예를 들어, 신장)(Lamers 등의 문헌[J Clin Oncol., 24:e20-e22. (2006)]), Weijtens 등의 문헌[Int J Cancer, 77:181-187 (1998)]); CD44 v6/v7(예를 들어, 자궁경부)(Hekele, 등의 문헌[Int J Cancer, 68:232-238 (1996)]), Dall 등의 문헌[Cancer Immunol Immunother 54:51-60 (2005)]; CD171(예를 들어, 신경아세포종)(Park, 등의 문헌[Mol Ther., 15:825-833 (2007)]); CEA(예를 들어, 결장)(Nolan, 등의 문헌[Clin Cancer Res., 5:3928-3941 (1999)]); EGFRvIII(예를 들어, 신경교종)(Bullain, 등의 문헌[J Neurooncol. (2009)], Morgan, 등의 문헌[Hum Gene Ther., 23:1043-1053 (2012)]); EGP2(예를 들어, 암종)(Meier, 등의 문헌[Magn Reson Med, 65:756-763 (2011)], Ren-Heidenreich 등의 문헌[Cancer Immunol Immunother, 51:417-423 (2002)]); EGP40(예를 들어, 결장)(Daly 등의 문헌[Cancer Gene Ther., 7:284-291 (2000)]; EphA2(예를 들어, 신경교종, 폐)(Chow, 등의 문헌[Mol Ther., 21:629-637 (2013)]); ErbB2(HER2)(예를 들어, 유방, 폐, 전립선, 신경교종)(Zhao 등의 문헌[J Immunol., 183:5563-5574 (2009)], Morgan 등의 문헌[Mol Ther., 18:843-851(2010)], Pinthus, 등의 문헌[114:1774-1781 (2004)], Teng 등의 문헌[Hum Gene Ther., 15:699-708 (2004)], Stancovski 등의 문헌[J Immunol., 151:6577-6582 (1993)], Ahmed 등의 문헌[Mol Ther., 17:1779-1787 (2009)], Ahmed 등의 문헌[Clin Cancer Res., 16:474-485 (2010)], Moritz 등의 문헌[Proc Natl Acad Sci U.S.A., 91:4318-4322 (1994)]); ErbB 수용체 계열(예를 들어, 유방, 폐, 전립선, 신경교종)(Davies, 등의 문헌[Mol Med., 18:565-576 (2012)]); ErbB3/4(예를 들어, 유방, 난소)(Muniappan 등의 문헌[Cancer Gene Ther., 7:128-134 (2000)], Altenschmidt 등의 문헌[Clin Cancer Res., 2:1001-1008 (1996)]); HLA-A1/MAGE1(예를 들어, 흑색종)(Willemsen, 등의 문헌[Gene Ther., 8:1601-1608 (2001), Willemsen 등의 문헌[J Immunol., 174:7853-7858 (2005)); HLA-A2/NY-ESO-1(예를 들어, 육종, 흑색종) (Schuberth, 등의 문헌[Gene Ther., 20:386-395 (2013)]); FR-α(예를 들어, 난소)(Hwu, 등의 문헌[J Exp Med., 178:361-366 (1993)], Kershaw, 등의 문헌[Nat Biotechnol., 20:1221-1227 (2002)], Kershaw 등의 문헌[Clin Cancer Res., 12:6106-6115 (2006)], Hwu 등의 문헌[Cancer Res., 55:3369-3373 (1995)]); FAP(예를 들어, 암 관련 섬유아세포)(Kakarla, 등의 문헌[Mol Ther (2013)]); FAR(예를 들어, 횡문근육종) (Gattenlohner, 등의 문헌[Cancer Res., 66:24-28 (2006)]); GD2(예를 들어, 신경아세포종, 육종, 흑색종)(Pule 등의 문헌[Nat Med., 14:1264-1270 (2008)], Louis 등의 문헌[Blood, 118:6050-6056 (2011), Rossig 등의 문헌[Int J Cancer., 94:228-236 (2001)]); GD3(예를 들어, 흑색종, 폐암)(Yun 등의 문헌[Neoplasia., 2:449-459 (2000)); HMW-MAA(예를 들어, 흑색종)(Burns 등의 문헌[Cancer Res., 70:3027-3033 (2010)]); IL11Rα(예를 들어, 골육종)(Huang, 등의 문헌[Cancer Res., 72:271-281 (2012)]); IL13R2α(예를 들어, 교아세포종)(Kahlon, 등의 문헌[Cancer Res., 64:9160-9166 (2004)], Brown 등의 문헌[Clin Cancer Res. (2012)], Kong 등의 문헌[Clin Cancer Res., 18:5949-5960 (2012)], Yaghoubi 등의 문헌[Nat Clin Pract Oncol., 6:53-58 (2009)]); 루위스 Y(예를 들어, 유방/난소/췌장)(Peinert 등의 문헌[Gene Ther., 17:678-686(2010), Westwood 등의 문헌[Proc Natl Acad Sci U.S.A., 102:19051-19056 (2005)], Mezzanzanica 등의 문헌[Cancer Gene Ther., 5:401-407 (1998)]); 메소텔린(예를 들어, 중피종, 유방, 췌장)(Lanitis 등의 문헌[Mol Ther., 20:633-643 (2012)], Moon 등의 문헌[,Clin Cancer Res., 17:4719-4730 (2011)]); Mue1(예를 들어, 난소, 유방, 전립선)(Wilkie, 등의 문헌[J Immunol., 180:4901-4909 (2008)]; NCAM(예를 들어, 신경아세포종, 결장직장)(Gilham, 등의 문헌[J Immunother., 25:139-151 (2002)]); NKG2D 리간드(예를 들어, 난소, 육종)(Barber 등의 문헌[Exp Hematol, 36:1318-1328 (2008)], Lehner 등의 문헌[PLoS One, 7:e31210 (2012)], Song 등의 문헌[Gene Ther., 24:295-305 (2013)], Spear 등의 문헌[J Immunol., 188:6389-6398 (2012)]); PSCA(예를 들어, 전립선, 췌장)(Morgenroth 등의 문헌[Prostate, 67:1121-1131 (2007)], Katari 등의 문헌[HPB, 13:643-650 (2011)]); PSMA(예를 들어, 전립선)(Maher, 등의 문헌[Nat Biotechnol., 20:70-75 (2002)], Gong 등의 문헌[Neoplasia., 1:123-127 (1999)]); TAG72(예를 들어, 결장)(Hombach, 등의 문헌[Gastroenterology, 113:1163-1170 (1997)], McGuinness, 등의 문헌[Hum Gene Ther., 10:165-173 (1999)]); VEGFR-2(예를 들어, 종양 혈관구조)(문헌[J Clin Invest., 120:3953-3968(2010)], Niederman 등의 문헌[Proc Natl Acad Sci U.S.A., 99:7009-7014 (2002)])를 포함한다.
b. 대사 안정성
일부 구현예에서, 세포(예를 들어, CAR 세포)의 대사 안정성은 생체 내에서 제한하는 성장 인자를 만들 수 있는 능력을 세포에 장착함으로써 개선된다. 일부 구현예에서, BCL-XL과 같은 항-세포자멸성 인자를 암호화하는 핵산 화물은 세포에 일시적으로 전달된다. B-세포 림프종-초대형(Bcl-XL, 또는 BCL2-유사 1 이소형 1)은 미토콘드리아 내의 막관통 단백질이다. 이는 Bcl-2 계열 단백질 중 하나이며, 카스파제 활성화를 유도하는 시토크롬 c와 같은 미토콘드리아 내용물의 방출을 방지함으로써 내인성 세포자멸사 경로에서 생존-유도성 단백질로서 작용한다. BCL-XL을 암호화하는 아미노산 및 핵산 서열 모두는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, UniProtKB - Q07817(B2CL1_HUMAN), 이소형 Bcl-X(L)(식별자: Q07817-1)(아미노산 서열); ENA|U72398|U72398.1 인간 Bcl-x 베타(bcl-x) 유전자, 완전한 cds(게놈 핵산 서열); ENA|Z23115|Z23115.1 H.사피언스 bcl-XL mRNA　(mRNA/cDNA 핵산 서열)을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 화물은 IL-2와 같은 증식 유도 인자를 암호화한다. IL-2를 암호화하는 아미노산 및 핵산 서열 모두는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, UniProtKB - P60568(IL2_HUMAN)(아미노산 서열); ENA|X00695|X00695.1 인간 인터류킨-2 (IL-2) 유전자 및 5'-플랭킹 영역(유전자 핵산 서열); 및 ENA|V00564|V00564.1 인터류킨-2(IL-2)를 암호화하는 인간 mRNA(mRNA/cDNA 핵산 서열)을 포함한다.
그러나, 분비된 IL-2의 생산은 또한 림프종 및 Treg 세포의 증식을 자극하고, 메모리 T 세포의 형성을 손상시키는 원치 않는 부작용을 가질 수 있다(Zhang 등의 문헌[Nature Medicine,　11:1238-1243 (2005)]). 또한, 종양 침윤성 림프구(TIL)로 치료한 환자에서 IL-2의 사용은 독성을 증가시켰다(Heemskerk 등의 문헌[Human Gene Therapy, 19:496-510 (2008)]). 이러한 가능성을 피하기 위해, IL-2에 추가적으로 또는 대안적으로, 핵산 화물은, 외인성 사이토카인 비의존적, 세포 내인성, STAT5 사이토카인 신호를 부여하는 IL-7Rα/CD127에 테더링된 인터류킨-7(IL-7)으로 구성된 것과 같은 키메라 γc 사이토카인 수용체(CγCR)를 암호화할 수 있다(Hunter 등의 문헌[Molecular Immunology, 56:1-11 (2013)]). 설계는, Shc 활성을 향상시키기 위해 IL-2Rβ/CD122 세포질 사슬을 IL-7Rα/CD127의 세포질 사슬과 교환할 수 있다는 점에서 모듈식이다. 작제물은 인간 CD8+ T 세포에서 야생형 IL-2 신호 전달을 모방하며(Hunter 등의 문헌[Molecular Immunology, 56:1-11 (2013)]), 따라서, 원하지 않는 부작용 없이 IL-2 mRNA와 유사하게 작용해야 한다.
추가적으로 그리고 대안적으로, 다른 항세포자멸 분자 및 사이토카인이 천연 상태에서 세포 생존력을 보존하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 인자는 다음을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다:
· 골수성 세포 백혈병 1(MCL-1)(예를 들어, UniProtKB - Q07820(MCL1_HUMAN)(아미노산 서열); ENA|AF147742|AF147742.1 호모 사피언스 골수 세포 분화 단백질(MCL1) 유전자, 프로모터 및 완전한 cds(유전체 핵산 서열); 항세포자멸 인자인 ENA|AF118124|AF118124.1 호모 사피엔스 골수 세포 백혈병 서열 1(MCL1) mRNA, 완전한 cds.(mRNA/cDNA 핵산 서열));
· IL-7(예를 들어, UniProtKB - P13232 (IL7_HUMAN)(아미노산 서열); ENA|EF064721|EF064721.1 호모 사피엔스 인터류킨 7(IL7) 유전자, 완전한 cds.(게놈 핵산 서열); T 세포 생존 및 발달에 중요한 ENA|J04156|J04156.1 인간 인터류킨 7(IL-7) mRNA, 완전한 cds.(mRNA/cDNA 핵산 서열), 및
· IL-15(예를 들어, UniProtKB - P40933 (IL15_HUMAN)(아미노산 서열); ENA|X91233|X91233.1 H.사피엔스 IL15 유전자(게놈 핵산 서열); T 및 NK 세포 생존을 촉진하는, ENA|U14407|U14407.1 인간 인터류킨 15(IL15) mRNA, 완전한 cds.(mRNA/cDNA 핵산 서열))(Opferman 등의 문헌[Nature, 426: 671-676 (2003)]; Meazza, 등의 문헌[Journal of Biomedicine & Biotechnology, 861920, doi:10.1155/2011/861920 (2011)]; Michaud 등의 문헌[Journal of Immunotherapy, 33:382-390 (2010)]). 이들 사이토카인 mRNA는 독립적으로 사용되거나 BCL-XL, IL-2, 및/또는 CγCR mRNA와 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, MCL-1, IL-7, IL-15, 또는 이들의 조합을 암호화하는 mRNA가 세포에 전달된다.
c. 억제 CAR(iCAR)
일부 구현예에서, T 세포 치료제는 일부 암의 치료에 대한 장기적인 효능 및 치유 가능성을 입증한 CAR 세포에 전달되지만, 이들의 사용은 공여자 림프구 주입 후 이식편 대 숙주 질환을 연상시키는 비암성 조직에 대한 손상에 의해 제한된다. 개시된 조성물 및 방법 중 어느 하나는, 면역 반응을 억제하기 위해, 비특이적 면역억제(예를 들어, 면역 반응을 억제하기 위해 T 세포 상에 세포증식억제 또는 세포독성 효과를 발휘하는 고용량 코르티코스테로이드 요법), 비가역적 T 세포 제거(예를 들어, 소위 자살 유전자 조작 전략), 또는 이들의 조합과 조합하여 사용될 수 있다. 그러나, 일부 바람직한 구현예에서, 오프 타겟 효과는 억제 키메라 항원 수용체(iCAR)를 암호화하는 작제물을 CAR 세포 내에 도입함으로써 감소된다. 종양 및 표적 외 조직 둘 다에 특이성을 갖는 T 세포는 표적 외 조직을 보호하기 위해 T 세포 내로 도입된 항원 특이적 iCAR을 사용함으로써 종양에만 한정될 수 있다(Fedorov 등의 문헌[[Science Translational Medicine, 5:215ra172 (2013)]). iCAR은 활성화 수용체(예를 들어, CAR)의 동시 결합에도 불구하고, T 세포 반응성을 제한하기 위해 강력한 급성 억제성 신호 전달 도메인과 조합된 표면 항원 인식 도메인을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, iCAR은 항원 인식 시 T 세포 기능을 특이적으로 억제하는 막관통 영역을 통해 면역 수용체(예를 들어, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4(CD244), BTLA(CD272), KIR, TIM-3, TGF 베타 수용체 우성 음성 유사체 등)의 신호전달 도메인에 융합된 억제 항원에 특이적인 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다. CAR 세포가 억제 항원을 발현하지 않는 세포(예를 들어, 암 세포)와 접촉하면, iCAR 형질도입된 T 세포는 CAR의 표적 항원에 대한 CAR-유도 반응을 탑재할 수 있다. CTLA-4 또는 PD-1의 억제성 신호 전달 도메인을 갖는 PSMA에 특이적인 scFv를 사용하는 DNA iCAR는 (Fedorov 등의 문헌[Science Translational Medicine, 5:215ra172 (2013)])에서 논의된다.
설계 고려사항은 PD-1이 CTLA-4보다 더 강한 억제자였고, CTLA-4가 Y165G 돌연변이체를 사용하지 않는 한 세포질 국소화를 나타냈으며, iCAR 발현 수준이 중요하다는 관찰을 포함한다.
iCAR은 세포 유형 특이적 표면 분자에 대해 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, iCAR은 특정 조직 또는 세포 유형에 대한 T 세포, NK 세포, 또는 다른 면역 세포 반응을 방지하도록 설계된다.
d. 내인성 억제성 신호 전달 감소
일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 항원의 발현을 방지하기 위해 세포를 재프로그래밍하는 핵산 화물과 접촉된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 핵산 화물은 CTLA-4 또는 PD-1과 같은 항원을 암호화하는 mRNA의 발현을 방지하는 간섭 RNA이거나 이를 암호화한다. 이 방법은 범용 공여자 세포를 제조하는 데 사용될 수 있다. 동종 항원의 발현을 변경시키는 데 사용되는 RNA는 단독으로 사용되거나 표적 세포의 탈분화를 초래하는 RNA와 조합하여 사용될 수 있다.
위 섹션은, 예를 들어, 온-표적/오프-종양 세포독성을 제한하기 위해 인공 iCAR 내 CTLA-4 또는 PD-1로부터 유래한 억제성 신호 전달 도메인을 이용한 조성물 및 방법을 제공하지만, 추가적으로 또는 대안적으로, CAR 세포에서 내인성 억제성 신호 전달의 발현을 감소시킴으로써 CAR 세포가 적대적 종양 미세환경의 억제 신호에 내성이 되도록 함으로써 전반적인 CAR 세포 온-종양 효과기 효율을 증가시킬 수 있다.
CTLA-4 및 PD-1은 활성화 및 기능의 상이한 단계에서 T 세포를 억제한다. 녹아웃 마우스는 특이적 항원 노출 없이 고도로 활성인 조직 침윤성 T 세포로 인해 자발적으로 기관 손상을 발생시키므로, CTLA-4는 자가 항원에 대한 T 세포 반응을 조절한다(Tivol 등의 문헌[Immunity, 3:541-547 (1995)]; Waterhouse 등의 문헌[Science, 270:985-988 (1995)]). 흥미롭게도, Treg 세포에서 CTLA-4의 조건부 녹아웃은, Treg 내에서 정상적으로 기능한다는 것을 나타내는 전역 녹아웃을 반복한다(Wing 등의 문헌[Science, 322:271-275 (2008)]). 대조적으로, PD-L1 녹아웃 마우스는 자가면역성이지만, 정상적인 기관에 대한 대량의 염증 세포 침윤이 자발적으로 발생하지 않으며, 이는 이것의 주요 생리학적 기능이 유도 가능한 방식으로 진행 중인 조직 염증에 대한 음성 피드백 조절을 매개하는 것임을 나타낸다(Dong, 등의 문헌[Immunity, 20:327-336 (2004)]). 실제로, "적응성 내성" 가설에 따르면, 대부분의 종양은 CART 세포를 포함하는 효과기 T 세포에 의해 방출되는 주요 사이토카인인 IFNγ에 반응하여 PD-L1을 상향조절한다(Greenwald 등의 문헌[Annu Rev Immunol, 23:515-548 (2005)]; Carreno, 등의 문헌[Annu Rev Immunol, 20:29-53 (2002)]; Chen 등의 문헌[The Journal of Clinical Investigation, 125:3384-3391 (2015)]; Keir, 등의 문헌[Annu Rev Immunol, 26:677-704 (2008)]; Pentcheva-Hoang 등의 문헌[Immunological Reviews, 229:67-87 (2009)]). 그런 다음, PD-L1은 T 세포의 증식, 사이토카인 및 퍼포린 생산을 감소시키는 억제 신호를 T 세포에 전달한다(Butte 등의 문헌[Immunity, 27:111-122 (2007)]; Chen 등의 문헌[Immunology, 4:336-347 (2004)]; Park 등의 문헌[Blood, 116:1291-1298 (2010)]; Wherry 등의 문헌[Nat Immunol 12:492-499 (2011)]; Zou 등의 문헌[Immunology, 8:467-477 (2008)]). 또한, 암 세포 상에서 B7-H1을 통한 T 세포로부터의 역방향 신호전달은 Fas-L 신호전달에 대항하는 항-세포자멸성 효과를 유도한다(Azuma 등의 문헌[Blood, 111:3635-3643 (2008)]). Azuma 등의 문헌[Blood, 111:3635-3643 (2008)]
암세포에 의한 B7-H1의 상향 조절 및 이의 발현과 암 진행 및 불량한 임상 결과와의 연관성을 고려하여(Flis 등의 문헌[Journal of Immunotherapy, 30:251-260 (2007)]; Nishimura 등의 문헌[Immunity, 11:141-151 (1999)]; Wang 등의 문헌[Curr Top Microbiol Immunol, 344:245-267 (2011)), PD-1 및 CTLA-4 경로에 길항적인 항체는 고형 종양, 특히 흑색종에 상당한 효과를 보이며, 이들 두 가지 조합은 더욱 큰 활성을 보인다. 항-CTLA-4 항체인 이필리무맙은, 주로 Treg 세포의 억제를 통해서, 전이성 흑색종에서 종양으로의 T 세포 침윤을 증가시키고 종양 내 CD8+:Treg 비율을 증가시킴으로써 전체 생존율을 개선한다(Hamid 등의 문헌[J Transl Med, 9:204 (2011)]; Ribas 등의 문헌[Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research, 15:6267-6276 (2009)] Twyman-Saint 등의 문헌[Nature, 520:373-377 (2015)]). 항-PD-1 항체인 니볼루맙은 전이성 흑색종에서 30-40%의 전체 반응률을 보이는데(Robert 등의 문헌[The New England Journal of Medicine, 372:320-330 (2015)]; Topalian 등의 문헌[J Clin Oncol, 32:1020-1030 (2014)]), 전이성 신장암, 비소세포 폐암 및 재발성 호지킨 림프종을 포함하는 다른 고형 종양에 대한 초기 단계 임상 시험에서 유사한 결과를 가진다(Ansell 등의 문헌[The New England Journal of Medicine, 372:311-319 (2015)]; Brahmer 등의 문헌[J Clin Oncol, 28:3167-3175(2010)]; Topalian 등의 문헌[The New England Journal of Medicine, 366:2443-2454 (2012)]). 마우스 흑색종 모델에서 항-CTLA-4 항체에 대한 내성은 PD-L181의 상향 조절에 기인하기 때문에, 이필리무맙과 니볼루맙 둘 다의 병용은 마우스 모델과 인간 환자 둘 다에서 추가적인 효능을 보여준다(Larkin, 등의 문헌[The New England Journal of Medicine, 373:23-34 (2015)]; Spranger 등의 문헌[J Immunother Cancer, 2, 3, doi:10.1186/2051-1426-2-3 (2014); Yu 등의 문헌[Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research, 16:6019-6028 (2010)]). 관문 억제 경로의 중요성을 고려할 때, PD-1/CTLA-4 억제는 브레이크를 해제하는 반면, 키메라 항원 수용체는 가스 페달을 밟는 것으로 여겨진다. 중요한 것은, 일시적인 전달이 브레이크를 일시적으로만 해제하는 데 사용될 수 있어서, 이들 세포는 미래의 자가면역 질환을 초래하지 않을 것이다.
i. CRISPRi
영구적인 게놈 변형 및 PD-1 및 CTLA-4와 같은 억제 신호의 불활성화를 피하기 위해, dCAS9 CRISPRi 시스템(Larson 등의 문헌[Nat Protoc, 8:2180-2196 (2013)])을 사용할 수 있다. 효소적으로 비활성인 dCAS9-KRAB-억제 도메인, 융합 단백질, 및 억제성 신호 전달 단백질(예를 들어, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4(CD244), BTLA(CD272), KIR, TIM-3, TGF 베타 수용체 우세 음성 유사체 등)에 대한 sgRNA를 암호화하는 핵산을 CAR 세포 내로 공동 전달할 수 있다. 하나 또는 다수의 sgRNA가 사용될 수 있다. sgRNA는 근위 프로모터 영역 및 코딩 영역(비주형 가닥)을 표적화하도록 설계될 수 있다. 대안적인 접근법은, 전기천공 및 발현을 위해 더 작은 RNA인 단일 성분 Cpf1 CRISPR 시스템을 이용한다(Zetsche 등의 문헌[Cell, doi:10.1016/j.cell.2015.09.038 (2015)]). 또한, 전술한 RNA 성분 중 어느 하나는 벡터, 예를 들어 플라스미드와 같은 DNA 발현 작제물에 의해 암호화될 수도 있다. 따라서, RNA, DNA, 또는 이들의 조합은 핵산 화물로서 작용할 수 있다.
이필리무맙을 사용한 CTLA-4의 광범위한 억제는 자가면역 후유증을 초래하지만, 이러한 부작용은 CAR 세포 소실 및 일시적 mRNA 전달 성질을 제한함으로써 감소될 것으로 여겨진다. 억제 기능은 시간에 따라 회복될 것이다.
ii. 억제 RNA
세포에 전달될 수 있는 핵산 화물은 억제성 신호 전달 분자 mRNA를 표적화하고 이의 발현 또는 번역을 감소시키거나 억제하도록 설계된 기능적 핵산 또는 폴리펩티드이거나 이를 암호화할 수 있거나; 억제성 신호 전달 분자 단백질 발현을 감소시키거나 억제하거나, 활성을 감소시키거나 분해를 증가시킬 수 있다. 적합한 기술은, 이에 한정되지는 않으나, 안티센스 분자, siRNA, miRNA, 앱타머, 리보자임, 삼중체 형성 분자, RNAi 등을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 억제성 신호 전달을 감소시키는 길항제 폴리펩티드를 암호화한다.
일부 구현예에서, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4(CD244), BTLA(CD272), KIR, TIM-3, TGF 베타 수용체 우세 음성 유사체 등의 발현을 감소시키거나 침묵시키는 데 적합한 기능적 RNA이거나 이를 암호화하는 화물은 단독으로 또는 조합되어 세포에 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 화물은 CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4(CD244), BTLA(CD272), KIR, TIM-3, TGF 베타 수용체 우세 음성 유사체, 또는 면역 억제 경로 내의 다른 단백질의 생체이용률을 감소시키거나 이의 길항제 또는 다른 음성 조절제 또는 억제제로서 작용하는 폴리펩티드를 암호화하는 RNA 또는 DNA이다. 단백질은 측분비, 내분비 또는 자가분비일 수 있다. 이는 세포 내에서 세포를 조절할 수 있다. 이는 분비되고 발현 세포 및/또는 다른 (예를 들어, 이웃하는) 세포를 조절할 수 있다. 이는 발현 세포 및/또는 다른 세포를 조절하는 막관통 단백질일 수 있다. 단백질은 융합 단백질, 예를 들어 Ig 융합 단백질일 수 있다.
e. 친세포자멸성 인자
세포자멸성 경로를 활성화하고 재활성화하기 위한 조성물 및 방법이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 핵산은 내인성 세포자멸사 경로를 활성화, 재활성화 또는 달리 강화 또는 증가시키는 인자 또는 제제이거나 이를 암호화한다. 바람직하게는, 인자는 암(예를 들어, 종양) 세포에서 내인성 세포자멸사 경로를 활성화, 재활성화 또는 그렇지 않으면 강화하며, 보다 바람직하게는 암 세포에 특이적이거나 표적화된다.
일부 구현예에서, 항-세포자멸성 인자 또는 전-증식 인자, 예컨대 전술한 것 또는 당업계에 달리 공지된 것의 전달 후, 세포는 미처리 세포보다 유도된 세포자멸사에 대해 더 내성이 있거나 덜 민감하다. 친세포자멸성 인자는, 예를 들어, 치료된 T 세포에 비해 미치료 세포에서 세포자멸사를 유도하거나 증가시킬 수 있고, 바람직하게는 암 세포에 대해 선택적이다. 본 요법은 암세포에 대해 하나는 세포적 그리고 하나는 분자적인 양면 공격을 초래한다.
내인성 세포자멸사 경로는 BCL-2 계열 구성원을 표적화함으로써 활성화되거나, 재활성화되거나, 그렇지 않으면 강화될 수 있다. BCL-2 계열 구성원은 기능 및 Bcl-2 상동성(BH) 도메인에 기초하여 다음의 3개의 하위군으로 분류된다: 다중 도메인 항-세포자멸성(예를 들어, BCL-2 또는 BCL-XL), 다중 도메인 친-세포자멸성(예를 들어, BAX 및 BAK), 및 BH3-단독 친-세포자멸성(예를 들어, BIM) 단백질. BIM과 같은 BH3-단독 하위군의 구성원은 세포 전체에 걸쳐 위치하는 사멸 파수꾼으로서 기능하며, 미토콘드리아에 위치한 핵심 세포자멸성 조직에 세포 손상의 다양한 생리학적 및 병리학적 신호를 전달하도록 준비된다(Danial 등의 문헌[Cell, 116:205-219 (2004)]).
일부 구현예에서, 친-세포자멸성 인자는 친-세포자멸성 BH3-모사체이다. 다양한 친-세포자멸성 BH3-모사체는 BIM의 고유 친-세포자멸성 활성을 시뮬레이션할 수 있고 세포자멸성 경로의 여러 지점을 조작할 수 있는 능력을 제공한다. 예를 들어, BIM SAHB(BCL-2 도메인의 안정화된 알파 나선), ABT-737, 및 ABT-199는 항-세포자멸성 단백질의 BH1, BH2 및 BH3 도메인의 합류에 의해 형성된 소수성 그로브와 친-세포자멸성 BH3-단독 나선 도메인 사이의 상호작용의 구조적 연구에 의해 설계된 친-세포자멸성 BH3-모사체이다(Oltersdorf 등의 문헌[Nature, 435:677-681 (2005)]).
D. 표적 세포
일부 구현예에서, 하나 이상의 특정 세포 유형 또는 조직은 개시된 복합체의 표적이다. 표적 세포는 시험관 내, 생체 외 또는 대상체(즉, 생체 내)에 존재할 수 있다. 본원에서 논의된 적용은 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 생체 외 적용을 위해, 세포를 수집하거나 단리하고 배양물에서 처리할 수 있다. 생체 외 처리된 세포는 이를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량으로 투여될 수 있다. 생체 내 적용을 위해, 화물은, 예를 들어, 조성물의 순환, 국소 전달 등에 기초하여 표적 세포에 수동적으로 전달될 수 있거나, 예를 들어, 추가적인 세포, 조직, 기관 특이적 표적화 모이어티를 이용하여 능동적으로 표적화될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 화물은 다른 세포를 배제하기 위해 표적 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 화물은 표적 세포 및 비-표적 세포에 전달된다.
표적 세포는 원하는 치료 및 요법, 및 핵산 화물의 의도된 효과에 기초하여 실무자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 핵산 화물이 세포 사멸을 유도하도록 의도되는 경우, 표적 세포는 암세포일 수 있고; 핵산 화물이 게놈 변경을 유도하도록 의도되는 경우, 표적 세포는 줄기 세포일 수 있고; 핵산 화물이 키메라 항원 수용체를 암호화하는 경우, 표적 세포는 면역 세포일 수 있다.
3E10 scFv는 이전에 ENT2 의존적 방식으로 세포 핵 내로 침투될 수 있는 것으로 밝혀졌으며, ENT2 결핍 세포에서 핵 흡수의 효율은 크게 손상된다(Hansen 등의 문헌[J Biol Chem 282, 20790-20793 (2007)]). ENT2(SLC29A2)는 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오시드 및 핵염기의 수송에 참여하는 나트륨 독립 수송체이며, ENT1보다 니트로벤질메르캅토푸린 리보시드(NBMPR)에 덜 민감하다.
일부 구현예에서, 표적 세포는 이들의 혈장 구성원, 이들의 핵막, 또는 둘 다에서 ENT2를 발현한다. ENT2의 발현은 비교적 보편적이지만, 풍부도는 조직 및 세포 유형 간에 상이하다. 이는 뇌, 심장, 태반, 흉선, 췌장, 전립선 및 신장에서 확인되었다(Griffiths 등의 문헌[Biochem J, 1997. 328 (Pt 3): p. 739-43, Crawford 등의 문헌[J Biol Chem, 1998. 273(9): p. 5288-93]). 다른 수송체에 비해, ENT2는 골격근에서 가장 높은 mRNA 발현 중 하나를 갖는다(Baldwin 등의 문헌[Pflugers Arch, 2004. 447(5): p. 735-43], Govindarajan 등의 문헌[Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2007. 293(5): p.R1809-22]). 따라서, 일부 구현예에서, 표적 세포는 뇌, 심장, 태반, 흉선, 췌장, 전립선, 신장, 또는 골격근이다. 골격근에 의한 ENT2의 높은 발현으로 인해, 개시된 조성물 및 방법은 이들 세포에 핵산 화물을 전달하는 데 특히 효과적일 수 있고/있거나, 더 낮은 수준의 ENT2를 발현하는 다른 세포와 비교하여 이들 세포에 더 높은 수준의 화물이 전달될 수 있다.
추가적인, 비제한적인, 예시적인 표적 세포가 아래에서 논의된다.
1. 전구세포 및 줄기 세포
세포는 조혈 전구 세포 또는 줄기 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 특히 유전자 편집 및 유전자 요법과 관련된 표적 세포는 CD34+ 조혈 줄기 세포이다. CD34+ 세포와 같은 조혈 줄기 세포(HSC)는 적혈구를 포함한 모든 혈구 유형을 생성할 수 있는 다능성 줄기 세포이다.
줄기 세포는 당업자에 의해 단리되고 농축될 수 있다. CD34+ 및 다른 세포의 이러한 단리 및 농축 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 제4,965,204호; 제4,714,680호; 제5,061,620호; 제5,643,741호; 제5,677,136호; 제5,716,827호; 제5,750,397호 및 제5,759,793호에 개시되어 있다. 조혈 전구 세포 및 줄기 세포가 풍부한 조성물의 맥락에서 본원에서 사용되는 바와 같이, "농축된"은 세포의 천연 공급원에서 발견되는 것보다 더 높은 바람직한 요소(예를 들어, 조혈 전구 세포 및 줄기 세포)의 비율을 나타낸다. 세포 조성물은 세포의 천연 공급원에 걸쳐 적어도 1차 규모, 바람직하게는 2차 또는 3차, 보다 바람직하게는 10차, 100차, 200차 또는 1000차 규모만큼 농축될 수 있다.
인간에서, CD34+ 세포는 골수 공간으로부터 말초 순환 내로 조혈 줄기 세포를 이동시키기에 충분한 양으로 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구-단핵구 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 줄기 세포 인자(SCF)와 같은 조혈 성장 인자를 공여자에게 피하로 또는 정맥 내로 주사함으로써 시행되는 사이토카인 이동 후 제대혈, 골수 또는 혈액으로부터 회수될 수 있다. 초기에, 골수 세포는 임의의 적절한 골수의 공급원, 예를 들어, 경골, 대퇴, 척추 및 기타 골강으로부터 수득될 수 있다. 골수의 단리를 위해, 적절한 용액을 사용해 뼈를 관류할 수 있는데, 이 용액은 일반적으로 약 5 내지 25 mM의 저농도의 허용 가능한 완충액과 함께, 태아 송아지 혈청 또는 다른 자연 발생 인자로 편리하게 보충되는 균형 잡힌 염 용액일 것이다. 편리한 완충제는 Hepes, 인산염 완충제, 젖산 완충제 등을 포함한다.
세포는 양성 및 음성 선택 기술에 의해 선택될 수 있다. 세포는 조혈 전구 세포 또는 줄기 세포 표면 항원, 예를 들어 CD34에 결합하는 상업적으로 이용 가능한 항체를 사용하여, 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체는 원하는 세포 유형을 회수하기 위해 이용되는 자기 비드 및 면역원성 절차에 접합될 수 있다. 다른 기술은 형광 활성화 세포 분류(FACS)의 사용을 포함한다. 비백혈병 개체의 조혈계 내의 전구 세포 상에서 발견되는 CD34 항원은 단클론 항체 My-10에 의해 인식되는 세포 집단에서 발현되고(즉, CD34 항원을 발현함), 골수 이식을 위해 줄기 세포를 단리하는데 사용될 수 있다. HB-8483으로 American Type Culture Collection(Rockville, Md.)에 기탁된 My-10은 항-HPCA 1으로서 상업적으로 이용 가능하다. 또한, 인간 골수로부터 분화되고 "전이된" 세포의 음성 선별은 실질적으로 원하는 임의의 세포 마커에 대하여 선별하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 전구 세포 또는 줄기 세포, 가장 바람직하게는 CD34+ 세포는 CD3- , CD7-, CD8-, CD10-, CD14-, CD15-, CD19-, CD20-, CD33-, 클래스 II HLA+ 및 Thy-1+ 중 어느 하나인 것을 특징으로 할 수있다.
일단 전구 세포 또는 줄기 세포가 단리되면, 이들은 임의의 적절한 배지에서 성장함으로써 전파될 수 있다. 예를 들어, 전구 세포 또는 줄기 세포는 조건 배지에서 인자의 분비와 연관된 골수 또는 간으로부터 수득될 수 있는 것과 같은, 기질 세포로부터 성장하거나, 줄기 세포의 증식을 지지하는 세포 표면 인자를 포함하는 배지에서 성장될 수 있다. 기질 세포는 원하지 않는 세포의 제거를 위해 적절한 단클론 항체를 사용하여 조혈 세포를 유리시킬 수 있다.
단리된 세포를 항체 및 핵산 화물 복합체와 생체 외 접촉시킨다. 화물이 전달된 세포는 변형된 세포로서 지칭될 수 있다. 복합체의 용액은 단순히 배양 중에 세포에 첨가될 수 있다. S 단계에서 세포를 동기화하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 이중 티미딘 블록에 의해 배양된 세포를 동기화하는 방법이 당업계에 공지되어 있다(Zielke 등의 문헌[Methods Cell Biol., 8:107-121 (1974)]).
변형된 세포는 대상체에게 투여하기 전에 배양물 내에서 유지되거나 확장될 수 있다. 세포 유형에 따른 배양 조건은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 특히 CD34+의 유지를 위한 조건은 잘 연구되었으며, 몇 가지 적절한 방법이 이용 가능하다. 생체 외 다능성 조혈 세포 확장에 대한 일반적인 접근법은 인터류킨-3과 같은 초기 작용 사이토카인의 존재 하에 정제된 전구 세포 또는 줄기 세포를 배양하는 것이다. 또한, 생체 외 조혈 전구 세포를 유지하기 위한 영양 배지에서, 트롬보포이에틴(TPO), 줄기 세포 인자(SCF), 및 flt3 리간드(Flt-3L; 즉, flt3 유전자 산물의 리간드)의 조합의 포함은 시험관 내 원시(즉, 상대적으로 비분화된) 인간 조혈 전구 세포를 확장시키는 데 유용하고 이러한 세포는 SCID-hu 마우스에 생착될 수 있다는 것이 밝혀졌다(Luens 등의 문헌[1998, Blood 91:1206-1215]). 다른 공지된 방법에서, 세포는 쥣과 프로락틴-유사 단백질 E(mPLP-E) 또는 쥣과 프로락틴-유사 단백질 F(mPIP-F; 집합적으로 mPLP-E/IF)를 포함하는 생체 외 영양 배지에서 (예를 들어, 수 분, 수 시간, 또는 3, 6, 9, 13일 또는 그 이상 동안) 유지될 수 있다(미국 특허 제6,261,841호). 다른 적절한 세포 배양 및 확장 방법도 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 세포는 또한 미국 특허 제5,945,337호에 기술된 바와 같이, 무혈청 배지에서 성장할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 변형된 조혈 줄기 세포는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용해 대상체에게 투여하기 전에 인터류킨 및 성장 인자의 특이적 조합을 사용하여 CD4+ 세포 배양물로 생체 외 분화된다. 세포는 단리된 조혈 줄기 세포의 원래 집단과 비교하여 더 많은 수로, 바람직하게는 적어도 5배, 더 바람직하게는 적어도 10배, 및 더욱 더 바람직하게는 적어도 20배의 세포 확장으로 생체 외 확장될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 세포는 탈분화 체세포일 수 있다. 체세포는 조혈 전구 세포가 되도록 유도될 수 있는 다능성 줄기 유사 세포가 되도록 재프로그램될 수 있다. 그런 다음, 조혈 전구 세포는 CD34+ 세포에 대해 전술한 바와 같은 조성물로 처리될 수 있다. 재프로그램될 수 있는 대표적인 체세포는, 이에 한정되지는 않으나, 섬유아세포, 지방세포 및 근육 세포를 포함한다. 유도된 줄기 유사 세포로부터의 조혈 전구 세포는 마우스에서 성공적으로 개발되었다(Hanna, J. 등의 문헌[Science, 318:1920-1923 (2007)]).
유도된 줄기 유사 세포로부터 조혈 전구 세포를 생산하기 위해, 체세포를 숙주로부터 수확한다. 바람직한 구현예에서, 체세포는 자가 섬유아세포이다. 세포를 배양하고 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc 전사 인자를 암호화하는 벡터로 형질도입한다. 형질도입된 세포를 배양하고, AP, SSEA1, 및 Nanog를 포함하지만 이에 한정되지 않는 배아 줄기 세포(ES) 형태 및 ES 세포 마커에 대해 스크리닝한다. 형질도입된 ES 세포를 배양하고 유도하여 유도된 줄기 유사 세포를 생산한다. 그런 다음, CD41 및 c-키트 마커(초기 조혈 전구 마커)뿐만 아니라 골수 및 적혈구 분화에 대한 마커에 대해서도 세포를 스크리닝한다.
그런 다음, 변형된 조혈 줄기 세포 또는, 예를 들어, 유도된 조혈 전구 세포를 포함하는 변형된 세포를 대상체에게 도입한다. 세포의 전달은 다양한 방법을 사용하여 영향을 받을 수 있으며, 가장 바람직하게는 주입에 의한 정맥내 투여뿐만 아니라 골막, 골수 및/또는 피하 부위 내로의 직접 데포 주사를 포함한다.
변형된 세포를 투여받는 대상체는 세포의 생착을 향상시키기 위한 골수 컨디셔닝을 위해 치료될 수 있다. 수용자는 세포의 투여 전에 방사선 또는 화학요법 치료를 사용하여 생착을 향상시키기 위해 치료될 수 있다. 투여 시, 세포는 일반적으로 생착하는 데 일정 시간이 소요될 것이다. 조혈 줄기 또는 전구 세포의 상당한 생착을 달성하는 데는 통상적으로 수주 내지 수개월이 소요된다.
변형된 조혈 줄기 세포의 높은 생착 백분율은 유의한 예방 효과 또는 치료 효과를 달성하기 위해 필요하지 않을 수 있다. 생착된 세포는 생착 후에 시간이 지남에 따라 확장하여 변형된 세포의 백분율을 증가시킬 것으로 여겨진다. 일부 경우에, 예방 효과 또는 치료 효과를 제공하기 위해 단지 적은 수 또는 적은 백분율의 변형된 조혈 줄기 세포의 생착만이 필요할 것으로 여겨진다.
바람직한 구현예에서, 대상체에게 투여될 세포는 자가유래, 예를 들어, 대상체로부터 유래되거나, 합성될 것이다.
2. 배아
일부 구현예에서, 조성물 및 방법은 시험관 내에서 배아 세포에 화물을 전달하는 데 사용될 수 있다. 본 방법은 통상적으로 배아 내로의 화물 형질도입을 개선하기 위해 시험관 내에서 유효량의 항체-화물 DNA와 배아를 접촉시키는 단계를 포함한다. 배아는 단일 세포 접합체일 수 있지만, 수정 이전 및 수정 도중에 수컷 및 암컷 생식세포의 치료물 및 접합체뿐만 아니라 상실배와 배반포도 포함하는 2, 4, 8 또는 16개의 세포를 갖는 배아도 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 시험관 내 수정 중 또는 그 후 배양 0-6일차에 배아가 조성물과 접촉된다.
접촉은 배아가 담겨진 액체 배지에 조성물을 첨가하는 것일 수 있다. 예를 들어, 조성물은 배아 배양 배지 내로 직접 피펫팅될 수 있고, 그 결과 이들은 배아에 의해 흡수된다.
3. 면역 세포
일부 구현예에서, 표적 세포는 하나 이상의 유형의 면역 세포이다. 예를 들어, 상이한 유형의 세포가 사용되거나 달리 면역화 및 CAR-기반 요법에 대해 표적화될 수 있다. 바람직한 표적화/조작된 T 세포는 종양 및 입양 요법의 목적에 따라 달라질 수 있다. 효과기 T 세포는 높은 수준의 효과기 사이토카인을 분비하고 시험관 내에서 종양 표적을 능숙하게 사멸시켰기 때문에 통상적으로 바람직하다(Barrett 등의 문헌[Annu Rev Med., 65: 333-347 (2014)]). 강력한 CAR 매개 세포독성을 갖는 2개의 상보성 림프구 집단은 CD3-CD56+ NK 세포 및 CD3+CD8+ T 세포이다. CD4+ 헬퍼 T 세포가 있는 CD8+ T 세포의 사용은 억제 T-reg 세포의 존재의 증가 및 CD8+ T 세포 세포독성의 약화를 초래한다. 재프로그램된 CD8+ T 세포는 림프절에서 활성화의 필요 없이 종양 세포에 직접 작용하도록 사전 활성화되기 때문에, CD4+ T 세포 지원은 필수적이지 않다.
또한, 미처리 T 세포(Rosenberg 등의 문헌[Adv Cancer Res., 25:323-388 (1977)]), 중심기억 T 세포(TCM 세포)(Berger 등의 문헌[J. Clin. Invest., 118:294-305 (2008)]), Th17 세포(Paulos 등의 문헌[Sci. Transl. Med., 2:55-78 (2010)]), 및 T 줄기 기억 세포(Gattinoni 등의 문헌[Nat. Med., 17:1290-1297 (2012)])의 주입은, 모두, 예를 들어 이들의 높은 복제 용량으로 인해 특정 응용 분야에서 특정 이점을 가질 수 있다는 증거가 있다. 종양 침윤 림프구(TIL)는 또한 이들의 항원 특이성으로 인해 소정의 이점을 가지며 본원에 개시된 전달 전략에 사용될 수 있다.
때때로 CAR 세포, CAR 면역, 세포, 및 CART 세포(또는 CAR T 세포)로 지칭되지만, 본원에 개시된 CAR 및 다른 전달 전략은 다른 세포 유형, 특히, 본원에서 논의되고 다른 곳에서 설명된 것들을 포함하는 상이한 유형의 면역 세포(예를 들어, 림프구, 자연 살상 세포, 수지상 세포, B 세포, 항원 제시 세포, 대식세포, 등)에서도 수행될 수 있다는 것이 명백할 것이다(예를 들어, Barrett 등의 문헌[Annu Rev Med., 65: 333-347 (2014)] 참조).
4. 암 세포 및 종양
일부 구현예에서, 표적 세포는 암세포이다. 이러한 구현예에서, 종양 요법을 포함하여, 암의 맥락에서 유용할 수 있는 치료 방법이 제공된다. 아래의 실시예는, DNA 화물이 종양에 제한되지 않고 다수의 조직에 더 일반적으로 전달될 수 있는 반면, RNA 전달은 종양 조직에 대해 더욱 선택적일 수 있음을 나타낼 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 암세포가 표적 세포인 경우, 화물은 RNA(예를 들어, RNA 단독)로 구성될 수 있다.
암세포에 전달될 수 있는 화물은, 이에 한정되지는 않으나, 하나 이상의 친-세포자멸성 인자, 면역원성 인자, 또는 종양 억제자의 발현을 위한 작제물; 유전자 편집 조성물, 종양유전자를 표적으로 하는 억제 핵산; 뿐만 아니라 본원에서 및 다른 곳에서 논의된 다른 전략을 포함한다. 일부 구현예에서, 화물은 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 친-세포자멸성 인자, 또는 면역원성 인자를 암호화하는 mRNA이다. 다른 구현예에서, 화물은 siRNA이며, 종양유전자 또는 다른 암 유발 전사체의 발현을 감소시킨다.
성숙한 동물에서, 일반적으로 대부분의 기관 및 조직에서 세포 재생과 세포 사멸 사이에서 균형이 유지된다. 신체에서 성숙한 세포의 다양한 유형은 주어진 수명을 갖는다; 이들 세포가 사멸함에 따라, 다양한 유형의 줄기 세포의 증식 및 분화에 의해 새로운 세포가 생성된다. 정상적인 환경 하에서, 새로운 세포의 생산은 특정 유형의 세포의 수가 일정하게 유지되도록 조절된다. 그러나, 때때로, 정상적인 성장-조절 기전에 더 이상 반응하지 않는 세포가 발생한다. 이들 세포는 상당한 크기로 확장하여 종양 또는 신생물을 생성할 수 있는 세포의 클론을 생성한다. 무한한 성장을 할 수 없고 건강한 주변 조직을 광범위하게 침범하지 않는 종양은 양성이다. 계속 성장하고 점진적으로 침습적이 되는 종양은 악성이다. 암이라는 용어는 구체적으로 악성 종양을 지칭한다. 조절되지 않은 성장 이외에, 악성 종양은 전이를 나타낸다. 이러한 과정에서, 작은 클러스터의 암성 세포들이 종양으로부터 이탈하고, 혈액 또는 림프관에 침입하고, 다른 조직으로 운반되어, 여기서 이들은 계속 증식한다. 이러한 방식으로, 하나의 부위에서의 원발성 종양은 다른 부위에서의 이차 종양을 야기할 수 있다.
본원에 기술된 조성물 및 방법은 대상체에서 종양의 성장을 지연시키거나 억제하고/하거나, 종양의 성장 또는 크기를 감소시키고/시키거나, 종양의 전이를 억제하거나 감소시키고/시키거나 종양 발달 또는 성장과 관련된 증상을 억제하거나 감소시킴으로써 양성 또는 악성 종양을 가진 대상체를 치료하는 데 유용할 수 있다.
치료될 수 있는 악성 종양은 본원에서 종양이 유래된 조직의 배아 기원에 따라 분류된다. 암종은 피부 또는 내부 기관 및 샘의 상피 내벽과 같은 내배엽 또는 외배엽 조직으로부터 발생하는 종양이다. 개시된 조성물은 암종을 치료하는 데 특히 효과적이다. 덜 빈번하게 발생하는 육종은 골, 지방 및 연골과 같은 중배엽 결합 조직으로부터 유래된다. 백혈병 및 림프종은 골수의 조혈 세포의 악성 종양이다. 백혈병은 단일 세포로서 증식하는 반면, 림프종은 종양 덩어리로서 성장하는 경향이 있다. 악성 종양은 암을 확립하기 위해 신체의 많은 기관 또는 조직에서 나타날 수 있다.
제공된 조성물 및 방법으로 치료될 수 있는 암의 유형은, 이에 한정되지는 않으나, 골, 방광, 뇌, 유방, 경부, 결장, 식도, 신장, 간, 폐, 비인두, 췌장, 전립선, 피부, 위 및 자궁의 혈관암과 같은 암, 예컨대, 다발성 골수종, 선암종 및 육종을 포함한다. 일부 구현예에서, 개시된 조성물은 다수의 암 유형을 동시에 치료하는 데 사용된다. 조성물은 또한 다수의 위치에서 전이 또는 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다.
3E10 / 3E10 변이체-치료용 폴리뉴클레오티드 조성물
일 측면에서, 본 개시는 치료용 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 전술한 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 기술된 바와 같은 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 사이에 형성된 복합체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 2:1의 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 실시예 18 및 20에 보고된 바와 같이, 본원에 기술된 조성물에서 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 사용하면 치료용 폴리뉴클레오티드가 분해되지 않게 보호한다.
또한, 도 19a 및 19c에 도시된 바와 같이, 부모 3E10 항체는 mRNA를 RNAse A 매개 RNA 분해로부터 2:1 및 20:1의 몰비로 보호하였지만, 20:1 몰비에 의해 제공되는 보호는 2:1로 주어진 보호를 초과하였다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 약 2:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 약 5:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 약 7.5:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 약 10:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 약 15:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 약 20:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 약 25:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 약 30:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 약 40:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 약 50:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다.
또한, 도 21에 도시된 바와 같이, 더 높은 화학량론 비율을 사용하면 더 긴 폴리뉴클레오티드를 분해로부터 더 잘 보호한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 약 50:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 약 75:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 약 100:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 약 125:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 약 150:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 약 200:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 더 긴 폴리뉴클레오티드는 적어도 1000개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 단일-가닥 폴리뉴클레오티드의 경우 1000개의 뉴클레오티드, 또는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 경우 1000개의 염기쌍이다. 일부 구현예에서, 더 긴 폴리뉴클레오티드는 적어도 1500개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 더 긴 폴리뉴클레오티드는 적어도 2000개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 더 긴 폴리뉴클레오티드는 적어도 2500개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 더 긴 폴리뉴클레오티드는 적어도 3000개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 더 긴 폴리뉴클레오티드는 적어도 4000개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 더 긴 폴리뉴클레오티드는 적어도 5000개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 더 긴 폴리뉴클레오티드는 적어도 7500개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 더 긴 폴리뉴클레오티드는 적어도 10,000개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 약 3:1, 적어도 약 4:1, 적어도 약 5:1, 적어도 약 6:1, 적어도 약 7:1, 적어도 약 8:1, 적어도 약 9:1, 적어도 약 10:1, 적어도 약 11:1, 적어도 약 12:1, 적어도 약 13:1, 적어도 약 14:1, 적어도 약 15:1, 적어도 약 16:1, 적어도 약 17:1, 적어도 약 18:1, 적어도 약 19:1, 적어도 약 20:1, 적어도 약 21:1, 적어도 약 22:1, 적어도 약 23:1, 적어도 약 24:1, 적어도 약 25:1, 적어도 약 26:1, 적어도 약 27:1, 적어도 약 28:1, 적어도 약 29:1, 적어도 약 30:1, 적어도 약 31:1, 적어도 약 32:1, 적어도 약 33:1, 적어도 약 34:1, 적어도 약 35:1, 적어도 약 36:1, 적어도 약 37:1, 적어도 약 38:1, 적어도 약 39:1, 적어도 약 40:1, 적어도 약 41:1, 적어도 약 42:1, 적어도 약 43:1, 적어도 약 44:1, 적어도 약 45:1, 적어도 약 50:1, 적어도 약 55:1, 적어도 약 60:1, 적어도 약 70:1, 적어도 약 75:1, 적어도 약 80:1, 적어도 약 85:1, 적어도 약 90:1, 적어도 약 95:1, 적어도 약 100:1, 적어도 약 110:1, 적어도 약 120:1, 적어도 약 125:1, 적어도 약 130:1, 적어도 약 140:1, 적어도 약 150:1, 적어도 약 160:1, 적어도 약 170:1, 적어도 약 175:1, 적어도 약 180:1, 적어도 약 190:1, 적어도 약 200:1, 또는 그 이상인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 2:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 5:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 7.5:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 10:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 15:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 20:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 25:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 30:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 40:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 50:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 75:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 100:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 125:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 150:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 200:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 적어도 3:1, 적어도 4:1, 적어도 5:1, 적어도 6:1, 적어도 7:1, 적어도 8:1, 적어도 9:1, 적어도 10:1, 적어도 11:1, 적어도 12:1, 적어도 13:1, 적어도 14:1, 적어도 15:1, 적어도 16:1, 적어도 17:1, 적어도 18:1, 적어도 19:1, 적어도 20:1, 적어도 21:1, 적어도 22:1, 적어도 23:1, 적어도 24:1, 적어도 25:1, 적어도 26:1, 적어도 27:1, 적어도 28:1, 적어도 29:1, 적어도 30:1, 적어도 31:1, 적어도 32:1, 적어도 33:1, 적어도 34:1, 적어도 35:1, 적어도 36:1, 적어도 37:1, 적어도 38:1, 적어도 39:1, 적어도 40:1, 적어도 41:1, 적어도 42:1, 적어도 43:1, 적어도 44:1, 적어도 45:1, 적어도 50:1, 적어도 55:1, 적어도 60:1, 적어도 70:1, 적어도 75:1, 적어도 80:1, 적어도 85:1, 적어도 90:1, 적어도 95:1, 적어도 100:1, 적어도 110:1, 적어도 120:1, 적어도 125:1, 적어도 130:1, 적어도 140:1, 적어도 150:1, 적어도 160:1, 적어도 170:1, 적어도 175:1, 적어도 180:1, 적어도 190:1, 적어도 200:1, 또는 그 이상인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 110:1, 120:1, 125:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 175:1, 180:1, 190:1, 200:1, 또는 그 이상인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 200:1 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 150:1 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 100:1 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 50:1 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 40:1 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 30:1 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 25:1 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 20:1 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 15:1 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 10:1 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 200:1 이하, 약 175 이하:1, 약 150 이하:1, 약 125 이하:1, 약 100명 이하:1, 약 75 이하:1, 약 50 이하:1, 약 45개 이하:1, 약 40 이하:1, 약 35 이하:1, 약 30개 이하:1, 약 35 이하:1, 약 30개 이하:1, 약 25명 이하:1, 약 20명 이하:1, 또는 그 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 200:1 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 150:1 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 100:1 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 50:1 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 40:1 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 30:1 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 25:1 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 20:1 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 15:1 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 10:1 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 200:1 이하, 175:1 이하, 150:1 이하, 125:1 이하, 100:1 이하, 75:1 이하, 50:1 이하, 45:1 이하, 40:1 이하, 35:1 이하, 30:1 이하, 35:1 이하, 30:1 이하, 25:1 이하, 20:1 이하, 또는 그 이하인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 2:1 내지 200:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 2:1 내지 175:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 2:1 내지 150:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 2:1 내지 125:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 2:1 내지 100:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 2:1 내지 75:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 2:1 내지 50:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 2:1 내지 40:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 2:1 내지 30:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 2:1 내지 25:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 2:1 내지 20:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 2:1 내지 15:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 2:1 내지 10:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 2:1 내지 7.5:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 2:1 내지 5:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 2:1 내지 3:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 3:1 내지 200:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 3:1 내지 175:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 3:1 내지 150:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 3:1 내지 125:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 3:1 내지 100:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 3:1 내지 75:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 3:1 내지 50:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 3:1 내지 40:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 3:1 내지 30:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 3:1 내지 25:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 3:1 내지 20:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 3:1 내지 15:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 3:1 내지 10:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 3:1 내지 7.5:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 3:1 내지 5:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 5:1 내지 200:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 5:1 내지 175:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 5:1 내지 150:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 5:1 내지 125:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 5:1 내지 100:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 5:1 내지 75:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 5:1 내지 50:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 5:1 내지 40:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 5:1 내지 30:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 5:1 내지 25:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 5:1 내지 20:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 5:1 내지 15:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 5:1 내지 10:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 5:1 내지 7.5:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 7.5:1 내지 200:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 7.5:1 내지 175:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 7.5:1 내지 150:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 7.5:1 내지 125:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 7.5:1 내지 100:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 7.5:1 내지 75:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 7.5:1 내지 50:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 7.5:1 내지 40:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 7.5:1 내지 30:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 7.5:1 내지 25:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 7.5:1 내지 20:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 7.5:1 내지 15:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 7.5:1 내지 10:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 10:1 내지 200:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 10:1 내지 175:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 10:1 내지 150:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 10:1 내지 125:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 10:1 내지 100:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 10:1 내지 75:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 10:1 내지 50:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 10:1 내지 40:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 10:1 내지 30:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 10:1 내지 25:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 10:1 내지 20:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 10:1 내지 15:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 15:1 내지 200:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 15:1 내지 175:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 15:1 내지 150:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 15:1 내지 125:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 15:1 내지 100:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 15:1 내지 75:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 15:1 내지 50:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 15:1 내지 40:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 15:1 내지 30:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 15:1 내지 25:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 15:1 내지 20:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 20:1 내지 200:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 20:1 내지 175:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 20:1 내지 150:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 20:1 내지 125:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 20:1 내지 100:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 20:1 내지 75:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 20:1 내지 50:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 20:1 내지 40:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 20:1 내지 30:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 20:1 내지 25:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 25:1 내지 200:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 25:1 내지 175:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 25:1 내지 150:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 25:1 내지 125:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 25:1 내지 100:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 25:1 내지 75:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 25:1 내지 50:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 25:1 내지 40:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 25:1 내지 30:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다.
또 다른 실시예들에서, 약 2:1 내지 약 200:1의 범위에 속하는 다른 범위들이 고려된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 1:1 내지 약 200:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 1:1 내지 약 175:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 1:1 내지 약 150:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 1:1 내지 약 125:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 1:1 내지 약 100:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 1:1 내지 약 75:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 1:1 내지 약 50:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 1:1 내지 약 30:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 1:1 내지 약 20:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 1:1 내지 약 10:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 약 1:1 내지 약 5:1인 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 갖는다.
개시된 조성물 및 방법은 다음의 번호가 매겨진 단락을 통해 추가로 이해될 수 있다.
1. 다음을 포함하거나 다음으로 이루어진 조성물:
(a) 3E10 단클론 항체, 이의 세포 침투 단편; 1가, 2가, 또는 다가 단쇄 가변 단편(scFv); 또는 디아바디; 또는 이의 인간화 형태 또는 변이체; 및
(b) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 기능적 핵산, 기능적 핵산을 암호화하는 핵산, 또는 이들의 조합을 포함하는 핵산 화물.
2. 단락 1에 있어서, (a)는:
(i) 서열번호 7-11, 14 또는 53-58 중 어느 하나의 CDR과 조합된, 서열번호 1-6, 12, 13, 46-48 또는 50-52 중 어느 하나의 CDR;
(ii) 서열번호 24-30, 44 또는 45 중 어느 하나로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 경쇄 CDR과 조합된, 서열번호 15-23, 42 또는 43 중 어느 하나로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 중쇄 CDR;
(iii) (i) 또는 (ii)의 인간화된 형태;
(iv) 서열번호 7 또는 8과 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된, 서열번호 1 또는 2 중 어느 하나와 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(v) 인간화 형태 또는 (iv); 또는
(vi) 서열번호 9-11 또는 53-58과 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된, 서열번호 3-6, 46-48 또는 50-52 중 어느 하나와 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 조성물.
3. 단락 1 또는 2에 있어서, (a)는 ATCC 수탁 번호 PTA 2439 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체 3E10과 동일하거나 상이한 에피토프 특이성을 포함하는, 조성물.
4. 단락 1 내지 3 중 어느 한 단락에 있어서, (a)는 단클론 항체 3E10의 파라토프를 갖는 재조합 항체인, 조성물.
5. 다음을 포함하는 조성물:
(a) 결합 단백질로서,
(i) 서열번호 7-11, 14 또는 53-58 중 어느 하나의 CDR과 조합된, 서열번호 1-6, 12, 13, 46-48 또는 50-52 중 어느 하나의 CDR;
(ii) 서열번호 24-30, 44 또는 45로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 경쇄 CDR과 조합된, 서열번호 15-23, 42 또는 43으로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 중쇄 CDR;
(iii) (i) 또는 (ii)의 인간화된 형태;
(iv) 서열번호 7 또는 8과 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된, 서열번호 1 또는 2 중 어느 하나와 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(v) 인간화 형태 또는 (iv); 또는
(vi) 서열번호 9-11 또는 53-58과 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된, 서열번호 3-6, 46-48 또는 50-52 중 어느 하나와 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 결합 단백질, 및
(b) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 기능적 핵산, 기능적 핵산을 암호화하는 핵산, 또는 이들의 조합을 포함하는 핵산 화물.
6. 단락 1 내지 5 중 어느 한 단락에 있어서, (a)는 이중특이적인, 조성물.
7. 단락 6에 있어서, (a)는 관심 세포 유형을 표적으로 하는, 조성물.
8. 단락 1 내지 7 중 어느 한 단락에 있어서, (a) 및 (b)는 비공유 결합되어 있는, 조성물.
9. 단락 1 내지 8 중 어느 한 단락에 있어서, (a) 및 (b)는 복합체 내에 있는, 조성물.
10. 단락 1 내지 9 중 어느 한 단락에 있어서, (b)는 DNA, RNA, PNA 또는 다른 변형된 핵산, 또는 핵산 유사체, 또는 이들의 조합을 포함하는, 조성물.
11. 단락 1 내지 10 중 어느 한 단락에 있어서, (b)는 mRNA를 포함하는, 조성물.
12. 단락 1 내지 11 중 어느 한 단락에 있어서, (b)는 벡터를 포함하는, 조성물.
13. 단락 12에 있어서, 벡터는 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 관심 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
14. 단락 13에 있어서, 벡터는 플라스미드인, 조성물.
15. 단락 1 내지 14 중 어느 한 단락에 있어서, (b)는 Cas 엔도뉴클레아제, gRNA, 또는 이들의 조합을 암호화하는 핵산을 포함하는, 조성물.
16. 단락 1 내지 15 중 어느 한 단락에 있어서, (b)는 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는, 조성물.
17. 단락 1 내지 16 중 어느 한 단락에 있어서, (b)는 기능적 핵산을 포함하는, 조성물.
18. 단락 1 내지 17 중 어느 한 단락에 있어서, (b)는 기능적 핵산을 암호화하는 핵산을 포함하는, 조성물.
19. 단락 17 또는 18에 있어서, 기능적 핵산은 안티센스 분자, siRNA, miRNA, 앱타머, 리보자임, RNAi, 또는 외부 가이드 서열인, 조성물.
20. 단락 1 내지 19 중 어느 한 단락에 있어서, (b)는 복수의 단일 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
21. 단락 1 내지 19 중 어느 한 단락에 있어서, (b)는 복수의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 상이한 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
22. 단락 1 내지 21 중 어느 한 단락에 있어서, (b)는 길이가 약 1 내지 25,000개 핵염기 사이인 핵산 분자를 포함하거나 이로 이루어진, 조성물.
23. 단락 1 내지 22 중 어느 한 단락에 있어서, (b)는 단일 가닥 핵산, 이중 가닥 핵산, 또는 이들의 조합을 포함하거나 이로 구성되는, 조성물.
24. 단락 1 내지 23 중 어느 한 단락에 있어서, 담체 DNA를 더 포함하는, 조성물.
25. 단락 24에 있어서, 담체 DNA는 비암호화 DNA인, 조성물.
26. 단락 24 또는 25에 있어서, (b)는 RNA로 구성되는, 조성물.
27. 단락 1 내지 26 중 어느 한 단락의 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
28. 단락 27에 있어서, (a) 및 (b)의 복합체를 캡슐화하는 중합체 나노입자를 추가로 포함하는 조성물.
29. 단락 28에 있어서, 표적화 모이어티, 세포 침투 펩티드, 또는 이들의 조합은 나노입자와 연결되거나, 결합되거나, 접합되거나, 달리 직접 또는 간접적으로 부착되는, 조성물.
30. 핵산 화물을 세포에 전달하는 방법으로서, 단락 1 내지 29 중 어느 하나의 조성물의 유효량과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
31. 단락 30에 있어서, 상기 접촉은 생체 외에서 일어나는, 방법.
32. 단락 31에 있어서, 세포는 조혈 줄기 세포 또는 T 세포인, 방법.
33. 단락 30 내지 32 중 어느 한 단락에 있어서, 세포를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
34. 단락 33에 있어서, 세포는 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하기 위해 유효량으로 대상체에게 투여되는, 방법.
35. 단락 30에 있어서, 접촉은 필요로 하는 대상체에게 투여한 후 생체 내에서 일어나는, 방법.
36. 단락 33 내지 35 중 어느 한 단락에 있어서, 대상체는 질환 또는 장애를 갖는, 방법.
37. 단락 36에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 유전 질환, 암, 또는 감염 또는 감염성 질환인, 방법.
38. 단락 36 또는 37에 있어서, (b)는 대상체에서 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 감소시키기 위해 유효량으로 대상체의 세포 내로 전달되는, 방법.
39. 단락 1 내지 29 중 어느 한 단락의 조성물을 제조하는 방법으로서, 세포와 접촉하기 전에 (a) 및 (b)의 조성물을 유효 시간 동안 및 적절한 온도에서 인큐베이션 및/또는 혼합하여 (a)와 (b)의 복합체를 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
40. 단락 1 내지 29 중 어느 한 단락의 조성물을 제조하는 방법으로서, (a)와 (b)를 약 1분 내지 약 30분, 약 10분 내지 약 20분, 또는 약 15분 동안 선택적으로 실온 또는 37℃에서 인큐베이션 및/또는 혼합하는 단계를 포함하는, 방법.
41. 단락 1 내지 40 중 어느 한 단락에 있어서, 3E10 단클론 항체, 이의 세포 침투 단편; 1가, 2가, 또는 다가 단쇄 가변 단편(scFv); 또는 디아바디; 또는 서열번호 92 또는 93의 핵산 결합 포켓을 포함하는 이의 인간화된 형태 또는 변이체 또는 핵산에 결합하는 능력이 동일하거나 개선된 이의 변이체인, 조성물 및 방법.
42. 단락 1 내지 41 중 어느 한 단락에 있어서, 중쇄 아미노산 서열 또는 이의 CDR의 D31 또는 N31에 상응하는 아미노산 잔기는 R로 치환되는, 조성물 또는 방법.
43. 단락 1 내지 42 중 어느 한 단락에 있어서, 중쇄 아미노산 서열 또는 이의 CDR의 D31 또는 N31에 상응하는 아미노산 잔기는 L로 치환되는, 조성물 또는 방법.
44. 다음을 포함하는 결합 단백질:
(i) 서열번호 7-11, 14 또는 53-58 중 어느 하나의 CDR과 조합된, 서열번호 1-6, 12, 13, 46-48 또는 50-52 중 어느 하나의 CDR의 변이체;
(ii) 서열번호 24-30, 44 또는 45로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 경쇄 CDR과 조합된, 서열번호 15-23, 42 또는 43으로부터 선택된 제2 및 제3 중쇄 CDR과 조합된, 제1 중쇄 CDR의 변이체;
(iii) (i) 또는 (ii)의 인간화된 형태;
(iv) 서열번호 7 또는 8과 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된, 서열번호 1 또는 2 중 어느 하나와 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(v) 인간화 형태 또는 (iv); 또는
(vi) 서열번호 9-11 또는 53-58과 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된, 서열번호 3-6, 46-48 또는 50-52 중 어느 하나와 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
(여기서, D31 또는 N31에 상응하는 아미노산 잔기는 R 또는 L로 치환됨).
45. 단락 44에 있어서, 서열번호 92 또는 93의 핵산 결합 포켓, 또는 핵산에 결합하는 능력이 동일하거나 개선된 이의 변이체를 포함하는, 결합 단백질.
실시예
아래의 실험과 관련하여, D31N 변이체(예를 들어, 실시예 4)로 표시된 경우를 제외하고는, 표준 3E10 서열을 사용하였다. 표준 3E10 및 D31N 변이체 둘 다를 전장 항체로서 사용하였다.
실시예 1: 3E10은 1시간 후에 PNA의 세포 흡수를 증가시킨다.
재료 및 방법
PNA 단독(1 nmole)(MW=9984.39; 29개의 뉴클레오티드 길이), 또는 3E10과 복합체를 이룬 PNA(0.75 mg)를 실온에서 5분 동안 혼합하였다. 그런 다음, 200,000개의 K562 세포를 무혈청 배지에서 3E10의 현탁액 또는 PNA 단독에 첨가하였다. 추가적인 무혈청 배지를 500 ul의 최종 부피가 되도록 첨가하였다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 원심분리하고 PBS로 3회 세척한 후 유세포 계측법으로 분석하였다. PNA를 형광 염료인 테트라메틸로다민(TAMRA)에 부착하여 표지하였다.
결과
결과는 유세포 계측 점도표(도 1a-1c)에 예시되어 있다. 흡수 %를 정량화하였다(도 1d). 결과는 3E10과 혼합될 때 PNA의 흡수 증가를 보여준다.
실시예 2: 3E10은 24시간 후에 PNA의 세포 흡수를 증가시킨다.
재료 및 방법
PNA 단독(1 nmole)(MW=9984.39; 29개의 뉴클레오티드 길이), 또는 3E10과 복합체를 이룬 PNA(0.75 mg)를 실온에서 5분 동안 혼합하였다. 그런 다음, 200,000개의 K562 세포를 무혈청 배지에서 3E10의 현탁액 또는 PNA 단독에 첨가하였다. 추가적인 무혈청 배지를 500 ul의 최종 부피가 되도록 첨가하였다. 세포를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 원심분리하고 PBS로 3회 세척한 후 유세포 계측법으로 분석하였다.
20,000개의 U2OS 세포를 8-웰 챔버 슬라이드에 시딩하고 24시간 동안 접착시켰다. 이어서, 세포에 PNA 단독(1 nmole) 또는 3E10(10 uM)과 복합체화된 PNA를 처리하였다. 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 고정 및 핵 염색 전에 PNA 또는 3E10과 혼합된 PNA를 PBS로 세척하였다. 이어서 PNA 흡수를 유세포 계측법에 의해 정량화하고 형광 현미경을 사용하여 이미지화하였다. PNA를 형광 염료인 테트라메틸로다민(TAMRA)에 부착하여 표지하였다.
결과
결과는 유세포 계측 점도표(도 2a-2c)에 예시되어 있다. 흡수 %를 정량화하였다(도 2d). 결과는 3E10과 혼합될 때 PNA의 흡수 증가를 보여준다.
형광 현미경은 뚜렷한 분홍색의 생성에 의해 입증되는 핵 DNA(파란색의 DAPI) 및 PNA(적색의 Tamra)의 공동-국소화를 보여주었다.
실시예 3: 3E10은 24시간 후에 siRNA의 세포 흡수를 증가시킨다.
재료 및 방법
(플루오레세인 아미다이트, FAM에 부착을 통해) 표지된 siRNA(1 nmole), 또는 3E10과 복합체화된 siRNA(0.75 mg)를 실온에서 5분 동안 혼합하였다. 그런 다음, 200,000개의 K562 세포를 무혈청 배지에서 3E10의 현탁액 또는 siRNA 단독에 첨가하였다. 추가적인 무혈청 배지를 500 ul의 최종 부피가 되도록 첨가하였다. 세포를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 원심분리하고 PBS로 3회 세척한 후 유세포 계측법으로 분석하였다.
결과
결과는 유세포 계측 점도표(도 3a-3c)에 예시되어 있다. 흡수 %를 정량화하였다(도 3d). 결과는 3E10과 혼합될 때 증가된 siRNA의 흡수를 보여준다.
실시예 4: 3E10은 24시간 후에 mRNA의 세포 흡수를 증가시킨다.
재료 및 방법
(시아닌 5, Cy5에 부착을 통해) 표지된 mRNA(2 ug) 단독 또는 3E10과 복합체화된 표지된 mRNA(2.5, 5 및 10 uM)를 실온에서 5분 동안 혼합하였다. 3E10 + mRNA의 현탁액 또는 mRNA 단독을 무혈청 배지에서 200,000 K562 세포에 첨가하였다. 추가적인 무혈청 배지를 500 ul의 최종 부피가 되도록 첨가하였다. 세포를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 원심분리하고 PBS로 3회 세척한 후 유세포 계측법으로 분석하였다.
결과
결과는 유세포 계측 점도표(도 4a-4h)에 예시되어 있다. 흡수 %를 정량화하였다(도 4i). 결과는 3E10과 혼합될 때 증가된 mRNA의 흡수를 보여준다. 3E10의 D31N 변이체에 의한 mRNA의 전달은 가장 높은 수준의 mRNA 세포 흡수를 초래하였다는 점에 주목한다.
형광 현미경은 녹색 형광 단백질(GFP) 리포터를 암호화하는 동일한 Cy5 표지된 mRNA의 번역 후 U2OS 세포에서 기능적 GFP 발현을 나타냈다.
실시예 5: 3E10은 1시간 후에 mRNA의 세포 흡수를 증가시킨다.
재료 및 방법
표지된 mRNA(Cy5)(2 ug) 또는 3E10의 D31N 변이체와 복합체화된 표지된 mRNA(0.1-10 uM)를 실온에서 5분 동안 혼합하였다. 3E10 + mRNA의 현탁액 또는 mRNA 단독을 무혈청 배지에서 200,000 K562 세포에 첨가하였다. 추가적인 무혈청 배지를 500 ul의 최종 부피가 되도록 첨가하였다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 원심분리하고 PBS로 3회 세척한 후 유세포 계측법으로 분석하였다.
결과
결과는 유세포 계측 점도표(도 5a-5h)에 예시되어 있다. 흡수 %를 정량화하였다(도 5i).
실시예 6: 3E10은 플라스미드 DNA의 세포 흡수를 증가시킨다
재료 및 방법
GFP 리포터 플라스미드 DNA(250 ug)를 실온에서 5분 동안 3E10(10 uM)과 복합체화하였다. 3E10 + 플라스미드 DNA의 현탁액, 또는 플라스미드 DNA 단독을 무혈청 배지에서 200,000 K562 세포에 첨가하였다. 추가적인 무혈청 배지를 500 ul의 최종 부피가 되도록 첨가하였다. 세포를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 원심분리하고 PBS로 3회 세척하였다. 초기 처리 후 72시간 시점에, 세포를 이미지화하고 GFP 발현에 대해 분석하였다.
결과
결과는, 녹색 형광에 의해 측정된 바와 같이, 3E10이 플라스미드 DNA와 조합되었을 때, GFP 플라스미드가 세포에 의해 강력하게 흡수되었음을 나타내며, 이는 GFP 작제물의 흡수 및 기능적 발현을 나타낸다. 플라스미드 DNA만을 사용한 경우, 흡수 또는 녹색 형광은 관찰되지 않았다. (도 6).
실시예 7: 3E10은 생체 내 mRNA 전달을 매개한다
재료 및 방법
GFP를 암호화하는 mRNA 10 ug를 0.1 mg의 3E10과 실온에서 15분 동안 혼합하였다. 3E10과 복합체화된 mRNA를 100 mm3로 측정된 EMT6 옆구리 종양을 가진 BALB/c 마우스에 전신 주사하였다. 처리 후 20시간차에, 종양을 수확하고, IVIS 이미지를 사용하여 mRNA 발현(GFP)에 대해 분석하였다.
결과
종양에서 어떠한 GFP 발현도 생성하지 않은 자유롭게 주사된 mRNA에 비해, 3E10 매개 mRNA의 전달은 종양에서 유의하게 더 높은 수준의 GFP 발현을 초래하였다. 간, 비장, 심장 및 신장을 포함하여, 어느 하나의 치료 방법을 이용하여 검사한 정상 조직에서는 검출 가능한 GFP의 발현이 없었다. 결과는 기능적 번역 및 발현을 통해 mRNA가 종양 내로 강력하게 전달됨을 나타낸다.
실시예 8: 3E10은　 생체 내 　siRNA 전달을 매개한다
재료 및 방법
형광 표지된 40 ug의 siRNA를 실온에서 15분 동안 증가하는 용량의 3E10(0.25, 0.5, 및 1 mg)과 혼합하였다. 3E10과 복합체화된 siRNA를 100 mm3 으로 측정된 EMT6 옆구리 종양을 가진 BALB/c 마우스에 전신 주사하였다. 처리 20시간 후에 종양을 수확하고, IVIS 이미지화를 사용하여 siRNA 전달을 분석하였다.
형광 표지된 40 ug의 siRNA를 실온에서 15분 동안 1 mg 3E10 또는 0.1 mg의 3E10의 D31N 변이체와 혼합하였다. 3E10과 복합체화된 siRNA를 100 mm3 으로 측정된 EMT6 옆구리 종양을 가진 BALB/c 마우스에 전신 주사하였다. 처리 20시간 후에 종양을 수확하고, IVIS 이미지화를 사용하여 siRNA 전달을 분석하였다.
결과
도 7a에 도시된 바와 같이, 3E10의 용량을 증가시키면 종양에서 siRNA가 더 많이 축적된다. 도 7b에 도시된 바와 같이, 10배 더 낮은 용량의 D31N 3E10은 3E10과 유사한 수준의 siRNA 전달을 초래하였다.
실시예 9: 담체 DNA는 비-종양 조직으로 mRNA를 강화한다
재료 및 방법
형광 표지된 mRNA 2 ug를 담체 DNA(5 ug)가 있거나 없는 20 ug의 3E10-D31N과 실온에서 15분 동안 혼합하였다. 3E10과 복합체화된 mRNA를 E15.5에서 태아에게 주사하였다. 처리 후 24-48시간에, 태아를 수확하고, IVIS 이미지화를 사용하여 mRNA 전달을 분석하였다.
결과
담체 DNA가 없으면, mRNA와 복합체화된 3E10-D31N은 24시간 시점에 태아로부터 신속하게 제거되었다. 그러나, 담체 DNA의 첨가는 48시간 시점에 태아의 다수의 조직에서 검출 가능한 mRNA 신호를 초래하였다.
위의 실시예는 DNA 화물 전달이 다수의 조직에 대해 더 일반적이고 종양으로 제한되지 않을 수 있는 반면, RNA 전달은 종양 조직에 대해 더욱 선택적일 수 있음을 나타낼 수 있다.
실시예 10: mRNA 및 담체 DNA와 복합체화된 3E10(D31N)은 지속적인 수준의 단백질 발현을 초래한다
재료 및 방법
10 ug의 루시퍼라아제 mRNA 및 10 ug의 단일 가닥 담체 DNA(60 nts)를 100 ug의 3E10(WT) 또는 3E10(D31N)과 실온에서 15분 동안 혼합하였다. 3E10과 복합체화된 mRNA를 각 마우스의 우측 사두근에 근육내(IM) 주사하였다. 루시퍼라아제 발현을 6일 동안 모니터링하였다.
결과
도 8에서 알 수 있듯이, mRNA 및 담체 DNA와 복합체를 이룬 3E10(D31N)의 투여는 지속적인 수준의 루시퍼라아제 발현을 야기한 반면, mRNA 및 담체 DNA와 복합체를 이룬 3E10(WT)은 배경을 초과하는 임의의 주목할 만한 신호를 생성하지 못했다.
실시예 11: IV 주사된 3E10의 생체 내 분포.
근육으로 IV 주사된 3E10의 분포를 조사하였다. VivoTag680(Perkin Elmer)으로 표지된 200 μg의 3E10, WT 또는 D31N을 마우스에게 정맥내 주사하였다. 주사 후 4시간 시점에, 근육을 수확하고, IVIS(Perkin Elmer)에 의해 이미지화하였다(도 9a 및 9b). IVIS 이미지의 정량화는 3E10-D31N이 3E10-WT와 비교했을 때 근육에 대한 더 높은 분포를 달성함을 입증한다(도 9c).
조직에 대한 3E10-D31N의 용량 의존적 생체분포를 조사하였다. 마우스에게 VivoTag680(Perkin Elmer)으로 표지된 100 μg 또는 200 μg의 3E10-D31N을 정맥내 주사하였다. 주사 후 24시간 시점에, 조직을 수확하고, IVIS(Perkin Elmer)에 의해 이미지화하였다. 조직 분포의 정량화는, 간을 포함하는 다수의 조직에서의 상응하는 증가 없이 용량 의존적으로 근육 축적에서 2배 증가를 보여주었다(도 10).
종양에 대한 3E10의 분포. 옆구리 동계 결장 종양(CT26)을 가진 마우스에게 VivoTag680(Perkin Elmer)으로 표지된 200 μg의 3E10, WT 또는 D31N을 정맥내 주사하였다. 주사 후 24시간 시점에, 종양을 수확하고, IVIS(Perkin Elmer)에 의해 이미지화하였다(도 11a-11b). 종양 분포의 정량화는 3E10-D31N이 3E10-WT와 비교했을 때 종양에서 더 높은 축적을 가짐을 입증하였다(도 11c).
3E10과 비공유 결합된 ssDNA의 분포를 조사하였다. 옆구리 동계 결장 종양(CT26)을 가진 마우스에게 40 ug의 표지된 ssDNA(IR680)와 혼합된 200 ug의 3E10, WT 또는 D31N을 정맥 내 주사하였다. 주사 후 24시간에, 종양을 수확하고, IVIS(Perkin Elmer)에 의해 이미지화하였다(도 12a-12c). 조직 분포의 정량화는 3E10-D31N에 의한 ssDNA의 전달이 3E10-WT와 비교했을 때 더 높은 종양 축적을 초래하였음을 입증하였다(도 12d).
실시예 12: RIG-I 리간드의 3E10 매개 전달 및 RIG-I 활성의 자극.
재료 및 방법
RIG-I 리포터 세포(HEK-Lucia RIG-I, Invivogen)를 웰당 50,000개의 세포로 시딩하고, RIG-I 리간드(1 ug) 또는 3E10-D31N과 복합체화된 리간드(20 ug)로 처리하였다. 이 검정은 인터페론의 유도가 있을 때 활성화되는 루시퍼라아제 리포터를 갖는 세포주를 사용한다.
결과
모든 경우에, RIG-I 리간드 단독으로는 IFN- 분비를 자극하지 않았다. 그러나, 3E10-D31N을 이용한 RIG-리간드의 전달은 대조군을 초과하는 IFN-분비를 자극하였고, 저분자량 및 고분자량(LMW 및 HMW) 둘 다에서 폴리(I:C)에 대해 가장 높은 분비가 관찰되었다.
실시예 13: 3E10 및 이의 조작된 변이체의 분자 모델링.
WT 중쇄 scFv 서열
E VQLVESGGGL VKPGGSRKLS CAASGFTFSD YGMHWVRQAP EKGLEWVAYI SSGSSTIYYA DTVKGRFTIS RDNAKNTLFL QMTSLRSEDT AMYYCARRGL LLDYWGQGTT LTVS (서열번호 92)
경쇄 scFv 서열
D IVLTQSPASL AVSLGQRATI SCRASKSVST SSYSYMHWYQ QKPGQPPKLL IKYASYLESG VPARFSGSGS GTDFTLNIHP VEEEDAATYY CQHSREFPWT FGGGTKLEIK RADAAPGGGG SGGGGSGGGGS (서열번호 93)
3E10(Pymol)의 분자 모델링은 추정 핵산 결합 포켓(NAB1)을 보여주었다(도 14a-14b). CDR1의 잔기 31에서 아스파르트산의 아스파라긴으로의 돌연변이는 이러한 잔기의 양이온 전하를 증가시키고 생체 내에서 핵산 결합 및 전달을 향상시켰다(3E10-D31N).
CDR1의 잔기 31에서 아스파르트산의 아르기닌(3E10-D31R)으로의 돌연변이는 양이온 전하를 추가로 증가시킨 반면, 리신(3E10-D31K)으로의 돌연변이는 전하 배향을 변화켰다(도 14a).
분자 모델링으로부터 예측된 NAB1 아미노산은 위의 중쇄 및 경쇄 서열에 밑줄이 그어져 있다. 도 14b는 점으로 도시된 NAB1 아미노산 잔기를 갖는 3E10-scFv(Pymol)의 분자 모델링을 보여주는 도면이다.
실시예 14: 3E10은 단일 및 이중 가닥 DNA에 결합한다
단일 가닥(ssDNA) 또는 이중 가닥 DNA(dsDNA)에 대한 3E10-WT 및 3E10-D31N의 결합을 ELISA에 의해 측정하였다. 항체는 DNA와 직접 상호작용한다. 3E10-WT 및 3E10 D31N 모두 ssDNA 또는 dsDNA와 용량 의존적 상호작용을 나타냈다. 모든 경우에, 3E10-D31N은 3E10-WT에 비해 우월한 결합을 나타냈다(도 15a 및 15b).
실시예 15: 3E10-D31N은 티민 및 구아닌 뉴클레오티드를 함유하는 DNA 서열에 우선적으로 결합한다
전체적으로 티민, 구아닌, 시토신 또는 아데닌으로 이루어진 단일 가닥 DNA에 대한 3E10-WT 및 3E10-D31N의 결합을 ELISA에 의해 측정하였다. 모든 경우에, 3E10-D31N은 티민 또는 구아닌으로 이루어진 서열에 대한 결합의 현저한 증가와 함께, 강화된 결합을 나타냈다(도 16).
실시예 16: 3E10의 변이체는 단일-가닥 DNA에 대한 결합을 보여준다
전체적으로 티민, 구아닌, 시토신 또는 아데닌으로 구성된 단일 가닥 DNA에 대한 3E10 변이체의 결합을 ELISA에 의해 측정하였다. 모든 경우에, 아데닌으로만 구성된 ssDNA를 제외하고, 변이체 3E10-D31K는 3E10-D31N에 비해 우월한 결합을 나타냈다. 각각의 변이체에 대한 투여량은 좌측에서 우측으로 100 nM, 200 nM, 및 400 nM의 3E10 또는 3E10 변이체 항체였다(도 17a-17d).
실시예 17: 3E10-WT 및 3E10-D31N은 RNA에 결합한다
전체적으로 아데닌, 시토신, 우라실, 구아닌, 또는 이노신 뉴클레오티드로 구성된 단일 가닥 RNA에 대한 3E10-WT 및 3E10-D31N의 결합을 ELISA에 의해 측정하였다. 모든 경우에, 3E10-D31N은 3E10-WT에 비해 우월한 결합을 나타냈다(도 18a-18b).
실시예 18: 3E10-D31N은 mRNA를 분해로부터 보호한다
다음으로, 3E10(D31N)으로 mRNA를 복합체화하는 것이 mRNA를 분해로부터 보호할 것인지 여부를 조사하였다. 간략하게, 3E10(D31N) 및 길이가 720 뉴클레오티드인 녹색 형광 단백질을 암호화하는 mRNA의 복합체를 3E10(D31N)과 mRNA를 20:1의 몰비로 혼합하여 형성하였다. 그런 다음, 유리 mRNA 및 3E10-mRNA 복합체를 1% 혈청, 10% 혈청, 또는 16 μg/mL RNAse A와 함께 인큐베이션하였다. 반응의 겔 전기영동 분석을 수행하였다(도 13a). 도 19a에 도시된 바와 같이, 유리 mRNA를 1% 혈청, 10% 혈청, 및 RNAse A 각각으로 인큐베이션하여 분해하였다. 그러나, 복합체화된 mRNA를 1% 혈청, 10% 혈청, 또는 RNAse A 중 어느 하나와 인큐베이션했을 때 명백한 RNA 분해는 관찰되지 않았으며, 이는 3E10(D31N)이 mRNA를 분해로부터 보호함을 시사한다.
대조적으로, RNAse A는 네이키드 mRNA 또는 이소형 항체 대조군과 혼합된 mRNA를 신속하게 분해시켰다 (도 19b).
다음으로, 더 낮은 몰비로 복합체화된 mRNA가 RNA 분해에 대해서도 보호되는지 여부를 조사하였다. 간략하게, 3E10(D31N) 및 녹색 형광 단백질을 암호화하는 720 nt mRNA(GFP_mRNA)의 복합체를 3E10(D31N)과 mRNA를 2:1 몰비로 혼합하여 형성하였다. 그런 다음, 유리 mRNA 및 3E10-mRNA 복합체를 전술한 조건 하에서 RNAse A와 함께 인큐베이션하였다. 반응의 겔 전기영동 분석을 수행하였다(도 19c). 도 19c에 도시된 바와 같이, RNAse A로 인큐베이션함으로써 유리 mRNA를 완전히 분해시켰다. 그러나, mRNA를 3E10(D31N)과 2:1 몰비로 복합체화하면, 웰 내에 RNA 신호가 존재함으로써 나타나는 바와 같이, mRNA가 분해에 대해 어느 정도 보호되어, 온전한 3E10(D31N)-mRNA 복합체가 존재함을 나타냈다. 2:1 몰비로 제공된 보호는 20:1 몰비로 복합체화될 때 mRNA를 제공하는 보호보다 적은 것으로 보인다.
실시예 19: 3E10-D31N + 폴리(I:C)는 흑색종 세포 사멸을 매개한다
마우스 흑색종 세포(B16)에 완충액 대조군, 폴리(I:C), 3E10(WT 또는 D31N), 또는 3E10(WT 또는 D31N)과 복합체화된 폴리(I:C)를 처리하였다. 처리 24시간 후, 세포 생존력을 CellTiter-Glo로 측정하였다. 모든 경우에서 3E10(WT 또는 D31N)과의 폴리 (I:C)의 복합체화는 대조군에 비해 세포 생존력을 감소시켰다(도 20a-20b).
실시예 20: 3E10(D31N)은 RNA 분해에 대해 mRNA를 크기 의존적 방식으로 보호한다.
또한, 복합체화될 때 3E10-D31N이 더 큰 mRNA 분자를 효소 분해로부터 보호할 것인지 여부와, 더 큰 화학양론 양의 3E10-D31N이 필요한지 여부를 조사하였다. 간략하게, 3E10-D31N과 큰 단백질을 암호화하는 14 kb mRNA(HMW mRNA)의 복합체를 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1, 및 100:1의 몰비로 3E10-D31N과 mRNA를 혼합함으로써 형성하였다. 그런 다음, 단백질 분해를 용이하게 하기 위해, 유리 mRNA 및 3E10-mRNA 복합체를 37℃에서 6 μg/mL RNAse A와 함께 10분 동안 단백질분해효소 K와 함께 인큐베이션하였다. 도 21은 보호 분석의 아가로오스 겔 전기영동 분석을 보여준다. 도 21에 도시된 바와 같이, 1:1, 2:1, 5:1, 및 10:1 몰비(3E10:mRNA)로 복합체화된 HMW mRNA 뿐만 아니라, 유리 HMW mRNA는 RNAse A와 함께 인큐베이션함으로써 완전히 분해되었다. 그러나, 도 21에 도시된 바와 같이, HMW mRNA를 3E10과 20:1 및 100:1의 몰비로 복합체화하면 RNAse A에 의한 분해로부터 mRNA의 보호를 증가시킬 수 있으며, 이는 겔 상의 분해되지 않은 mRNA와 유사한 거리에서 밴드가 이동하는 것으로 표시되었다. 실시예 18의 결과와 결합된 이들 결과에 의하면, 3E10이 크기 의존적 방식으로 폴리뉴클레오티드를 보호함을 시사한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 개시된 발명이 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 인용된 간행물 및 이들 간행물이 인용된 재료는 구체적으로 참조로서 통합된다.
당업자는 본원에 기술된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 등가물을 통상적인 실험을 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음의 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> YALE UNIVERSITY GENNAO BIO, INC. QUIJANO, ELIAS GLAZER, PETER TURNER, BRUCE QUINTO, STEPHEN <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR DELIVERY OF NUCLEIC ACIDS TO CELLS <130> 127689-5004-WO03 <150> 63/121,782 <151> 2020-12-04 <150> 63/156,070 <151> 2021-03-03 <160> 94 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Leu Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 2 Glu Val Gln 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400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 83 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 83 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 1 5 10 15 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 100 105 110 Lys <210> 84 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 84 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 85 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 85 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 1 5 10 15 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 100 105 110 Lys <210> 86 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 86 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 1 5 10 15 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 100 105 110 Lys <210> 87 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 87 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Thr Val Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 88 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 88 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp 1 5 10 15 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr 20 25 30 <210> 89 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 89 Arg Ala Ser Lys Thr Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp 1 5 10 15 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr 20 25 30 <210> 90 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 90 Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser 1 5 10 15 Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 20 25 30 Leu <210> 91 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X = any amino acid, but preferentially is a basic residue (R or K) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> X = any amino acid, but preferentially is a basic residue (R or K) <400> 91 Xaa Arg Ala Ser Lys Thr Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10 15 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Xaa Lys Tyr 20 25 30 <210> 92 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 92 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Leu Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser 115 <210> 93 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 93 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Ala Asp Ala Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser 130 <210> 94 <211> 89 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 94 ggagcaaaag cagggugaca aagacauaau ggauccaaac acugugucaa gcuuucaggu 60 agauugcuuu cuuuggcaug uccgcaaac 89

Claims (57)

  1. (a) 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 (b) 치료용 폴리뉴클레오티드의 비공유 복합체를 포함하는 조성물로서, 여기서 상기 조성물은 적어도 2:1의 (i) 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 (ii) 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 포함하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 조성물은 적어도 5:1의 (i) 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 (ii) 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 포함하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 조성물은 적어도 20:1의 (i) 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 (ii) 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 포함하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 조성물은 적어도 50:1의 (i) 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 (ii) 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 포함하는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 조성물은 적어도 100:1의 (i) 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 (ii) 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 포함하는, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 200:1 이하의 (i) 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 (ii) 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 포함하는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 100:1 이하의 (i) 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 (ii) 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 포함하는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 조성물은 2:1 내지 200:1의 (i) 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 (ii) 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 포함하는, 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 조성물은 5:1 내지 200:1의 (i) 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 (ii) 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 포함하는, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 조성물은 2:1 내지 50:1의 (i) 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 (ii) 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 포함하고, 치료용 폴리뉴클레오티드는 2000 이하의 뉴클레오티드 길이인, 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 조성물은 2:1 내지 30:1의 (i) 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 (ii) 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 포함하고, 치료용 폴리뉴클레오티드는 1000 이하의 뉴클레오티드 길이인, 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 20:1 내지 200:1의 (i) 3E10 항체 또는 이의 변이체, 또는 이의 항원 결합 단편 대 (ii) 치료용 폴리뉴클레오티드의 몰비를 포함하고, 치료용 폴리뉴클레오티드는 적어도 2000 뉴클레오티드 길이인, 조성물.
  13. 다음을 포함하거나 다음으로 이루어진 조성물:
    (a) 3E10 단클론 항체, 이의 세포 침투 단편; 1가, 2가, 또는 다가 단쇄 가변 단편(scFv); 또는 디아바디; 또는 이의 인간화 형태 또는 변이체; 및
    (b) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 기능적 핵산, 기능적 핵산을 암호화하는 핵산, 또는 이들의 조합을 포함하는 핵산 화물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, (a)는:
    (i) 서열번호 7-11, 14 또는 53-58 중 어느 하나의 CDR과 조합된, 서열번호 1-6, 12, 13, 46-48 또는 50-52 중 어느 하나의 CDR;
    (ii) 서열번호 24-30, 44 또는 45 중 어느 하나로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 경쇄 CDR과 조합된, 서열번호 15-23, 42 또는 43 중 어느 하나로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 중쇄 CDR;
    (iii) (i) 또는 (ii)의 인간화된 형태;
    (iv) 서열번호 7 또는 8과 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된, 서열번호 1 또는 2 중 어느 하나와 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
    (v) 인간화 형태 또는 (iv); 또는
    (vi) 서열번호 9-11 또는 53-58과 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된, 서열번호 3-6, 46-48 또는 50-52 중 어느 하나와 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, (a)는 ATCC 수탁 번호 PTA 2439 하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체 3E10과 동일하거나 상이한 에피토프 특이성을 포함하는, 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, (a)는 단클론 항체 3E10의 파라토프를 갖는 재조합 항체인, 조성물.
  17. 다음을 포함하는 조성물:
    (a) 결합 단백질로서,
    (i) 서열번호 7-11, 14 또는 53-58 중 어느 하나의 CDR과 조합된, 서열번호 1-6, 12, 13, 46-48 또는 50-52 중 어느 하나의 CDR;
    (ii) 서열번호 24-30, 44 또는 45로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 경쇄 CDR과 조합된, 서열번호 15-23, 42 또는 43으로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 중쇄 CDR;
    (iii) (i) 또는 (ii)의 인간화된 형태;
    (iv) 서열번호 7 또는 8과 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된, 서열번호 1 또는 2 중 어느 하나와 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
    (v) 인간화 형태 또는 (iv); 또는
    (vi) 서열번호 9-11 또는 53-58과 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된, 서열번호 3-6, 46-48 또는 50-52 중 어느 하나와 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 결합 단백질, 및
    (b) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 기능적 핵산, 기능적 핵산을 암호화하는 핵산, 또는 이들의 조합을 포함하는 핵산 화물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, (a)는 이중특이적인, 조성물.
  19. 제18항에 있어서, (a)는 관심 세포 유형을 표적으로 하는, 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 및 (b)는 비공유 결합된, 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 및 (b)는 복합체 내에 있는, 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 DNA, RNA, PNA 또는 다른 변형된 핵산, 또는 핵산 유사체, 또는 이들의 조합을 포함하는, 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 mRNA를 포함하는, 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 벡터를 포함하는, 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 벡터는 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 관심 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드인, 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 Cas 엔도뉴클레아제, gRNA, 또는 이들의 조합을 암호화하는 핵산을 포함하는, 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는, 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 기능적 핵산을 포함하는, 조성물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 기능적 핵산을 암호화하는 핵산을 포함하는, 조성물.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 기능적 핵산은 안티센스 분자, siRNA, miRNA, 앱타머, 리보자임, RNAi, 또는 외부 가이드 서열인, 조성물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 복수의 단일 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 복수의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 상이한 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 길이가 약 1 내지 25,000개 핵염기인 핵산 분자를 포함하거나 이로 구성되는, 조성물.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 단일 가닥 핵산, 이중 가닥 핵산, 또는 이들의 조합을 포함하거나 이로 구성되는, 조성물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 DNA를 추가로 포함하는, 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 상기 담체 DNA는 비암호화 DNA인, 조성물.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, (b)는 RNA로 구성되는, 조성물.
  39. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  40. 제39항에 있어서, (a) 및 (b)의 복합체를 캡슐화하는 중합체 나노입자를 추가로 포함하는, 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 표적화 모이어티, 세포 침투 펩티드, 또는 이들의 조합은 상기 나노입자와 연결되거나, 결합되거나, 접합되거나, 달리 직접 또는 간접적으로 부착되는, 조성물.
  42. 핵산 화물을 세포에 전달하는 방법으로서, 상기 세포를 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 접촉은 생체 외에서 발생하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 세포는 조혈 줄기 세포 또는 T 세포인, 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 세포는 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하기 위해 유효량으로 대상체에게 투여되는, 방법.
  47. 제42항에 있어서, 상기 접촉은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여한 후 생체 내에서 발생하는, 방법.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 질환 또는 장애를 갖는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 유전 장애, 암, 또는 감염 또는 감염성 질환인, 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, (b)는 상기 대상체에서 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 감소시키기 위해 유효량으로 상기 대상체의 세포 내로 전달되는, 방법.
  51. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물을 제조하는 방법으로서, 세포와 접촉하기 전에 (a) 및 (b)를 유효 시간 동안 적절한 온도에서 인큐베이션 및/또는 혼합하여 (a)와 (b)의 복합체를 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
  52. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물을 제조하는 방법으로서, 선택적으로 실온 또는 37℃에서 약 1분 내지 약 30분, 약 10분 내지 약 20분, 또는 약 15분 동안 (a)와 (b)를 인큐베이션 및/또는 혼합하는 단계를 포함하는, 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조성물 또는 방법으로서, 3E10 단클론 항체, 이의 세포 침투 단편; 1가, 2가, 또는 다가 단쇄 가변 단편(scFv); 또는 디아바디; 또는 서열번호 92 또는 93의 핵산 결합 포켓을 포함하는 이의 인간화 형태 또는 변이체, 또는 핵산에 결합하는 동일하거나 개선된 능력을 갖는 이의 변이체인, 조성물 또는 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 조성물 또는 방법으로서, 중쇄 아미노산 서열 또는 이의 CDR의 D31 또는 N31에 상응하는 아미노산 잔기는 R로 치환되는, 조성물 또는 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 조성물 또는 방법으로서, 중쇄 아미노산 서열 또는 이의 CDR의 D31 또는 N31에 상응하는 아미노산 잔기는 L로 치환되는, 조성물 또는 방법.
  56. 다음을 포함하는 결합 단백질:
    (i) 서열번호 7-11, 14 또는 53-58 중 어느 하나의 CDR과 조합된, 서열번호 1-6, 12, 13, 46-48 또는 50-52 중 어느 하나의 CDR의 변이체;
    (ii) 서열번호 24-30, 44 또는 45로부터 선택된 제1, 제2 및 제3 경쇄 CDR과 조합된, 서열번호 15-23, 42 또는 43으로부터 선택된 제2 및 제3 중쇄 CDR과 조합된, 제1 중쇄 CDR의 변이체;
    (iii) (i) 또는 (ii)의 인간화된 형태;
    (iv) 서열번호 7 또는 8과 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된, 서열번호 1 또는 2 중 어느 하나와 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
    (v) 인간화 형태 또는 (iv); 또는
    (vi) 서열번호 9-11 또는 53-58과 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 조합된, 서열번호 3-6, 46-48 또는 50-52 중 어느 하나와 적어도 85%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄,
    (여기서, D31 또는 N31에 상응하는 아미노산 잔기는 R 또는 L로 치환됨).
  57. 제56항에 있어서, 서열번호 92 또는 93의 핵산 결합 포켓, 또는 핵산에 결합하는 능력이 동일하거나 개선된 이의 변이체를 포함하는, 결합 단백질.
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