CN113527519A - 用于递送rna的靶向外泌体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于递送RNA的靶向外泌体，所述外泌体的构建过程如下：将外泌体多肽在C端与识别特定RNA序列的RNA结合多肽融合，在N端与靶向目标细胞的靶向部分融合，构建表达表达载体表达上述融合蛋白，另外构建可以表达含有特定RNA序列的载体，将上述两载体导入可以产生外泌体的细胞中。本发明的研究成果提供了一种递送RNA的新思路。

Description

用于递送RNA的靶向外泌体
发明领域
本发明属于生物医药领域，涉及用于递送RNA的靶向外泌体。
背景内容
外泌体(exosomes)是由细胞分泌的直径为30～150nm的囊泡，细胞质膜凹陷形成的细胞内小泡，具有与细胞膜相同的膜结构，可以携带诸如RNA、蛋白质等大量成分，与细胞的生物学功能及细胞间的信号传递有着密切的关系。因其特殊的结构，相较人工合成的药物载体，外泌体作为药物载体进行药物运输有独特的优势，主要体现在外泌体的膜结构与细胞膜相同，可以提高药物进入细胞的效率，甚至可以透过血脑屏障，同时外泌体引起的有害免疫反应极低，有很好的渗透滞留(EPR)效应从而具有缓释效果等。目前已经尝试用外泌体携带miRNA、siRNA、化学小分子药物等进行基因治疗和肿瘤治疗等研究。但是如何将大分子mRNA递送至外泌体从而产生携带mRNA的外泌体是本申请需要解决的问题。
发明内容
本申请涉及一种新型的RNA递送方法，以外泌体作为运载工具递送RNA。主要通过改造外泌体膜蛋白，将外泌体膜蛋白与识别特定RNA序列的蛋白融合，同时融合可以识别目标细胞膜蛋白的特定蛋白。使外泌体可以更容易被目标细胞胞吞。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种MS2蛋白识别序列，所述识别序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种包含前面所述的识别序列的RNA，所述RNA不是天然存在的RNA或其修饰。
本发明保护的包含识别序列的RNA是指那些天然并不存在识别序列但通过序列改造生成的包含识别序列的RNA。
本发明的所述RNA包括mRNA、miRNA、siRNA。
在本发明的具体实施例中，所述RNA是mRNA。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种融合多肽，所述融合多肽包含RNA结合多肽以及细胞外囊泡多肽。
进一步，所述RNA结合多肽连接于细胞外囊泡多肽的C端。
进一步，细胞外囊泡是外泌体。
优选地，外泌体多肽可以包括但不限于：CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71、CD133、CD138、CD235a、ALIX、AARDC1、Syntenin-1、Syntenin-2、Lamp2b、TSPAN8、syndecan-1、syndecan-2、syndecan-3、syndecan-4、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受体、白介素受体、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II成分、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B、其它外泌体多肽及其任何组合组成的组。
在本发明的具体实施方案中，所述外泌体多肽是Lamp2b。
优选地，所述RNA是包含如SEQ ID NO.1所示的序列。所述RNA是天然存在的RNA或者前面所述的经序列改造后的非天然RNA。
进一步，RNA结合多肽识别RNA上的特定序列，所述特定序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的具体实施方案中，RNA结合多肽是MS2蛋白。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了包含前面所述的融合多肽的靶向多肽，所述靶向多肽还包含靶向部分，所述靶向部分将RNA靶向递送到目标细胞、目标组织、目标器官和/或目标区室。
进一步，所述靶向部分连接在所述细胞外囊泡多肽的N端。
进一步，所述靶向部分可以识别目标细胞膜蛋白。
所述靶向部分可以是蛋白质、肽、单链抗体或抗体的任何其它衍生物等。
所述靶向部分可以是识别特定细胞表面抗原的单链抗体，或能够与细胞膜表面抗原相互作用的多肽段。
所述靶向部分包括但不限于：GE11、T7、RVG，识别CD19的单链抗体、识别BCMA的单链抗体。
本发明的融合多肽还可以包含各种另外的部分以增强生物活性递送。此类部分和/或结构域可以包括功能结构域的以下非限制性实例：(i)多聚化结构域，其使融合多肽二聚、三聚或多聚化以改善后面的细胞外囊泡形成和/或加载，(ii)连接肽，如上所述的，其用以避免空间位阻并提供灵活性，(iii)释放结构域，例如具有自我切割活性的顺式切割元件(如内含肽)，其可用于释放融合多肽，(iv)RNA切割结构域，其用于改善RNA在受体细胞中的释放，例如编码核酸酶的结构域，例如Cas6、Cas13，(v)内体逃逸结构域，例如HA2、VSVG、GALA、B18等，和/或(vi)核定位信号(NLS)。
多聚化结构域使融合多肽能够二聚化、三聚化或任何高阶的多聚化，这增加了融合多肽到细胞外囊泡中的分选和运输，还可以有助于增加由产细胞外囊泡细胞产生的囊泡的产量。
连接肽可用于提供增加的融合多肽结构和相应的多核苷酸结构的灵活性，并且还可用于确保避免空间位阻和保持融合多肽的功能性。释放结构域可以包含在融合多肽中，以便能够从原始融合多肽释放特定部分或结构域。
合适的释放结构域可以是顺式切割序列例如内含肽、光诱导的单体或二聚体释放结构域例如Kaede、KikGR、EosFP、tdEosFP、mEos2、PSmOrange、GFP样的Dendra蛋白Dendra和Dendra2、CRY2-CIBN等。
切割结构域的非限制性实例包括核酸内切酶例如Cas6、Cas13、工程化改造的PUF核酸酶、位点特异性RNA核酸酶等。
本发明的融合多肽还可以包括内体逃逸结构域以驱动内体逃逸并由此增强细胞外囊泡本身和RNA分子的生物活性递送。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种细胞外囊泡，所述细胞外囊泡包含前面所述的融合多肽或前面所述的靶向多肽。
进一步，所述细胞外囊泡还包含RNA。
更进一步，所述RNA包含SEQ ID NO.1所示的序列。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种细胞外囊泡群体，所述细胞外囊泡群体包含前面所述的细胞外囊泡。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包含第一多核苷酸和/或第二多核苷酸；所述第一多核苷酸编码前面所述的融合多肽，所述第二多核苷酸编码RNA，所述RNA包含SEQ ID NO.1所示的序列。优选地，所述RNA是前面所述的经序列改造后的非天然存在的RNA。
本发明还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包含第三多核苷酸和/或第二多核苷酸；所述第三多核苷酸编码前面所述的靶向多肽，所述第二多核苷酸编码RNA，所述RNA包含SEQ ID NO.1所示的序列。优选地，所述RNA是前面所述的经序列改造后的非天然存在的RNA。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了包含前面所述的多核苷酸序列的载体。
本发明的载体的实例包括质粒、任何环状DNA多核苷酸、微环、病毒，例如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种细胞，所述细胞包含前面所述的RNA、前面所述的融合多肽、前面所述的靶向多肽、前面所述的细胞外囊泡、前面所述的多核苷酸、前面所述的载体。
本发明细胞或后续提到的能够分泌细胞外囊泡的细胞包括但不限于原代细胞、细胞系、存在于多细胞生物的细胞、或基本上任何其它类型的细胞来源。本发明的细胞包括体内产生细胞外囊泡的细胞。根据本发明的细胞可以选自广泛范围的细胞和细胞系，例如间充质干细胞或基质细胞(可从例如骨髓、脂肪组织、脐带胶质(Wharton'sjelly)、围产期组织、胎盘、牙芽、脐带血、皮肤组织等获得)、成纤维细胞、羊膜细胞且更具体地说是任选地表达各种早期标记物的羊膜上皮细胞、骨髓抑制细胞、M2极化巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞、成纤维细胞等。特别关注的细胞系包括人脐带内皮细胞(HUVEC)、人胚肾(HEK)细胞、内皮细胞系例如微血管内皮细胞或淋巴内皮细胞、红细胞、红系祖细胞、软骨细胞、不同来源的MSC、羊膜细胞、羊膜上皮(AE)细胞、通过羊膜穿刺术或从胎盘获得的任何细胞、气道上皮细胞或肺泡上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞等。此外，免疫细胞例如B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞(DC)也在本发明的范围内，并且基本上能够产生细胞外囊泡的任何类型的细胞也包括在本文中。通常，细胞外囊泡基本上可以源自任何细胞来源，无论是原始细胞来源还是永生化细胞系。细胞外囊泡源细胞可以是任何胚胎的、胎儿的和成年的体干细胞类型，包括诱导多能干细胞(iPSC)和通过任何方法衍生的其它干细胞。当治疗神经系统疾病时，可以考虑利用例如原代神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和神经祖细胞作为源细胞。对于待治疗的患者而言，细胞本质上可以是同种异体的、自体的、甚至异种的，即细胞可以来自患者本人或者来自无关的、匹配的或不匹配的供体。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种制备前面所述的细胞外囊泡的方法，所述的方法包括以下步骤：将前面所述的多核苷酸或前面所述的载体引入到产生细胞外囊泡的细胞中。
进一步，所述方法还包括在所述产生细胞外囊泡的细胞中表达前面所述的融合多肽，从而产生细胞外囊泡。
进一步，所述方法还包括分离纯化所述细胞外囊泡。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种制备前面所述的细胞的方法，所述方法包括将前面所述的多核苷酸或前面所述的载体导入细胞中。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种用于细胞内递送RNA的体外方法，所述方法包括使靶细胞与前面所述的细胞外囊泡、前面所述的细胞外囊泡群体、前面所述的多核苷酸，或前面所述的载体接触的步骤。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种用于向细胞外囊泡中递送RNA的方法，所述方法包括将前面所述的多核苷酸或前面所述的载体引入到产生细胞外囊泡的细胞中。
进一步，所述方法还包括在所述产生细胞外囊泡的细胞中表达前面所述的融合多肽，从而产生细胞外囊泡。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含前面所述的融合多肽、前面所述的靶向多肽、前面所述的细胞外囊泡、前面所述的多核苷酸、前面所述的载体，或前面所述的细胞。
进一步，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂或载体。
术语“药学上可接受的载体”是指不会对受试者造成明显刺激并且不会消除组合物中所施用的细胞外囊泡的生物学活性和性质的载体或稀释剂。药学上可接受的载体可以增强或稳定组合物，或者可以用于促进组合物的制备。药学上可接受的载体可以包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。可以选择载体以最小化受试者的不良副作用和/或最小化一种或多种活性成分的降解。这些配制品中的任何一种中也可以包含佐剂。
术语“药学上可接受的赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分的施用的惰性物质。肠胃外施用的配制品可以例如含有赋形剂如无菌水或盐水，聚亚烷基二醇如聚乙二醇，植物油或氢化萘。其他示例性赋形剂包括但不限于碳酸氢钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒和表面活性剂(包括例如聚山梨酯20)。
本发明的药物组合物可以通过本领域已知的多种方法施用。给予的途径和/或方式可以根据所期望的结果而变化。在一些实施例中，施用是玻璃体内、静脉内、肌内、腹膜内或皮下施用。药学上可接受的载体应适合于玻璃体内、静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。在一些实施例中，包含至少一种细胞外囊泡和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物可以处于适于肠胃外施用的形式。在一些实施例中，药物组合物可以是无菌可注射的水性或悬浮液的形式，其可以根据已知程序进行配制。无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的缓冲液中的无菌可注射悬浮液。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了SEQ ID NO.1所示的特定序列在将RNA递送至细胞外囊泡中的应用；优选地，所述细胞外囊泡是外泌体。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了SEQ ID NO.1所示的特定序列在制备包含RNA的细胞外囊泡中的应用；优选地，所述细胞外囊泡是前面所述的细胞外囊泡或前面所述的细胞外囊泡群体。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了前面所述的融合多肽、前面所述的靶向多肽、前面所述的多核苷酸、前面所述的载体在将RNA递送至细胞外囊泡中的应用；优选地，所述细胞外囊泡是外泌体。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了前面所述的融合多肽、前面所述的靶向多肽、前面所述的多核苷酸、前面所述的载体制备包含RNA的细胞外囊泡中的应用；优选地，所述细胞外囊泡是前面所述的细胞外囊泡或前面所述的细胞外囊泡群体。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了前面所述的融合多肽、前面所述的靶向多肽、前面所述的细胞外囊泡、前面所述的细胞外囊泡群体、前面所述的多核苷酸、前面所述的载体、前面所述的细胞在制备用于基因治疗的递送系统中的应用。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了前面所述的融合多肽、前面所述的靶向多肽、前面所述的细胞外囊泡、前面所述的细胞外囊泡群体、前面所述的多核苷酸、前面所述的载体、前面所述的细胞在制备治疗疾病的药物中的应用。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了前面所述的融合多肽、前面所述的靶向多肽、前面所述的多核苷酸、前面所述的载体在制备前面所述的细胞中的应用。
本发明还提供了一种治疗或预防疾病的方法，该方法包括给有需要的受试者施用有效量的前面所述的细胞外囊泡或其群体、或前面所述的药物组合物。
本发明的疾病的非限制性实例包括：克罗恩病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、结节病、特发性肺纤维化、牛皮癣、肿瘤坏死因子(TNF)受体相关周期性综合征(TRAPS)、白介素1受体拮抗剂缺乏症(DIRA)、子宫内膜异位症、自身免疫肝炎、硬皮病、肌炎、中风、急性脊髓损伤、血管炎、格林-巴利综合征、急性心肌梗塞、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、败血症、脑膜炎、脑炎、肝衰竭、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、肾衰竭、心力衰竭或任何急性或慢性器官衰竭以及相关的潜在病因、移植物抗宿主病、Duchenne型肌营养不良症和其它肌肉萎缩症、溶酶体贮积症(例如戈谢病(Gaucher disease)、法布瑞氏症(Fabry's disease)、MPSI、II(亨特综合征(Hunter syndrome))和III、尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease)A、B和C型、庞贝病(Pompe disease)等)、神经退行性疾病(包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和其它三核苷酸重复相关疾病、痴呆、肌萎缩侧索硬化(ALS))、癌症引起的恶病质、厌食症、2型糖尿病和各种癌症。几乎所有类型的癌症都是本发明的相关疾病靶标，例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病、肾上腺皮质癌、艾滋病相关癌症、艾滋病相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、小脑或脑癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、脑干胶质瘤、脑癌、脑瘤(小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层瘤、视觉通路下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤(儿童、胃肠道)、原发灶不明肿瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性骨髓增殖性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌(眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤)、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、生殖细胞瘤(颅外、性腺外或卵巢)、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质瘤(脑干胶质瘤、脑星形细胞瘤、视觉通路下丘脑胶质瘤)、胃类癌、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病(急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、毛细胞白血病)、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发性)、肺癌(非小细胞、小细胞)、淋巴瘤、艾滋病相关淋巴瘤、布基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、成神经管细胞瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、原发灶隐匿转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、骨髓性白血病、慢性粒细胞白血病(急性、慢性)、骨髓瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮间质瘤)、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜能瘤、胰腺癌、胰岛细胞癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、涎腺癌、肉瘤(尤因(Ewing)家族肿瘤肉瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤)、西泽里(Sezary)综合征、皮肤癌(非恶性肿瘤、黑色素瘤)、小肠癌、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、巨球蛋白血症和/或肾母细胞瘤。
术语“细胞外囊泡”应理解为涉及可从细胞以任何形式获得的任何类型的囊泡，例如微囊泡(例如从细胞的质膜脱落的任何囊泡)、外泌体(例如源自内溶酶体途径的任何囊泡)、凋亡小体(例如可从凋亡细胞获得)、微粒(可源自例如血小板)、核外颗粒体(可源自例如血清中的中性粒细胞和单核细胞)、前列腺小体(例如可从前列腺癌细胞获得)或心脏小体(例如可从心脏细胞获得)等。细胞外囊泡的大小可以相差很大，但是细胞外囊泡通常具有纳米级的流体动力学直径，即直径小于1000nm。显然，细胞外囊泡可以源自体内、离体和体外的任何细胞类型。优选的细胞外囊泡包括外泌体和微囊泡，但是其它细胞外囊泡在各种情况下也可以是有利的。此外，所述术语还应理解为涉及细胞外囊泡模拟物、通过例如膜挤出、超声处理或其它技术等获得的基于细胞膜的囊泡。对于本领域技术人员显而易见的是，当描述细胞外囊泡的医学和科学用途和应用时，本发明通常涉及多个细胞外囊泡，即，可以包含数千个、数百万个、数十亿个或甚至数万亿个细胞外囊泡的细胞外囊泡群体。
术语“群体”应理解为涵盖构成该群体的多个实体。换句话说，当多个单个细胞外囊泡存在时，构成细胞外囊泡群体。因此，本领域技术人员将清楚，本发明既涉及单个的细胞外囊泡，也涉及包含细胞外囊泡的群体。在体内应用时，细胞外囊泡的剂量可以根据待治疗的疾病、给药途径、递送的RNA的治疗活性、效果和效力、细胞外囊泡上存在的任何靶向部分、制剂配方等自然显著地改变。此外，本发明的细胞外囊泡还可以包含除RNA分子之外的其它治疗剂。在一些实施例中，所述其它治疗剂可以是至少一种治疗性小分子药物。在一些实施例中，所述治疗性小分子药物可以选自由DNA损伤剂、抑制DNA合成的制剂、微管和微管蛋白结合剂、抗代谢物、氧化损伤诱导剂、抗血管产生剂、内分泌治疗剂、抗雌激素、免疫调节剂(例如Toll样受体激动剂或拮抗剂)、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、信号转导抑制剂(例如激酶抑制剂)、热休克蛋白抑制剂、类维生素A、生长因子受体抑制剂、抗有丝分裂化合物、抗炎剂、细胞周期调节剂、转录因子抑制剂和凋亡诱导剂及其任意组合组成的组。在其它实施例中，所述其它治疗剂可以是其它基于核酸的治疗剂。此类其它基于核酸的治疗剂可以选自由单链RNA或DNA、双链RNA或DNA、寡核苷酸(例如siRNA)、剪接转换RNA(splice-switching RNA)、CRISPR引导链、短发夹RNA(shRNA)、miRNA、反义寡核苷酸、多核苷酸(例如mRNA)、质粒或任何其它RNA或DNA载体组成的组。特别受关注的是化学合成和/或包含化学修饰的核苷酸(例如2'-O-Me、2'-O-烯丙基、2'-O-MOE、2'-F、2'-CE、2'-EA 2'-FANA、LNA、CLNA、ENA、PNA、硫代磷酸酯、三环DNA(tricyclo-DNA)等)的基于核酸的制剂。在另一些实施例中，根据本发明的细胞外囊泡可以包含可以是蛋白质和/或肽的其它治疗剂。此类蛋白质和/或肽可以存在于细胞外囊泡内部、插入到细胞外囊泡膜中或与细胞外囊泡膜结合，或者可以从细胞外囊泡突出到囊泡外环境中。此类治疗性蛋白质和/或肽制剂可以选自一组非限制性实例，包括：抗体、胞内抗体、单链可变片段(scFv)、亲和体、双特异性和多特异性抗体或结合剂、亲和体、重复蛋白(darpins)、受体、配体、用于例如酶替代疗法或基因编辑的酶、肿瘤抑制因子(非限制性实例包括p53、p21、pVHL、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7和/或ST15)病毒或细菌抑制剂、细胞成分蛋白、DNA和/或RNA结合蛋白、DNA修复抑制剂、核酸酶、蛋白酶、整合酶、转录因子、生长因子、凋亡抑制剂和诱导剂、毒素(例如假单胞菌外毒素)、结构蛋白、神经营养因子(例如NT3/4)、脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)及其各个亚基(例如2.5Sβ亚基)、离子通道、膜转运蛋白、蛋白稳态因子、与细胞信号传导有关的蛋白、翻译和转录相关蛋白、核苷酸结合蛋白、蛋白结合蛋白、脂质结合蛋白、糖胺聚糖(GAG)和GAG结合蛋白、代谢蛋白、细胞应激调节蛋白、炎症和免疫系统调节蛋白、线粒体蛋白和热休克蛋白等。
在一些实施例中，使细胞与有效量的细胞外囊泡或药物组合物接触包括将细胞外囊泡或药物组合物添加至体外细胞培养物中或将细胞外囊泡或药物组合物施用于受试者。
术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用，是指用本文描述的方法和组合物向其提供治疗(包括预防性治疗)的任何人或非人动物。对于治疗对特定动物如人受试者具有特异性的病状或疾病状态，术语“受试者”是指该特定动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如，哺乳动物和非哺乳动物)，例如任何哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括人、小鼠、大鼠、兔、狗、猴和猪。在一些实施例中，受试者是人。
附图说明
图1显示pLenti-EF1α-Lamp2b-MS2载体的结构示意图；
图2显示pLenti-EF1α-MS2-Neo载体的结构示意图；
图3显示pLenti-EF1α-RVG-Lamp2b-MS2载体的结构示意图；
图4显示外泌体侵染细胞后的荧光图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实验例1构建相关载体
本申请涉及两种载体，一种载体(如图1所示)表达蛋白包括Lamp2b(或PDGFT)，其N端(由BsmBI酶切位点插入)可表达包括但不限于识别神经元细胞的RVG蛋白，或识别EGFR受体的GE11蛋白，或其他特定单链抗体等，其C端表达MS2蛋白，用于识别含有acaugaggaucacccaug(SEQ ID NO.1)序列的mRNA；另一种载体则表达含有acaugaggaucacccaug序列的mRNA，以GFP为例，如图2所示，GFP由BsiWI与NheI酶切位点插入，可更换为其他目的基因或RNA序列。
如图1所示为表达外泌体膜蛋白载体pLenti-EF1α-Lamp2b-MS2(核苷酸序列如SEQID NO.2所示)，该载体可用于包装慢病毒，并含有puromycin筛选标记，载体含有EF1α启动子，启动表达Lamp2b-MS2融合蛋白，Lamp2b蛋白N端上膜信号后设计有BsmBI酶切位点，可无缝接入例如识别神经元细胞的RVG蛋白等，载体包含有WPRE原件，可增加相应蛋白表达。
如图2所示为表达含有MS2识别序列(acaugaggaucacccaug)的目的mRNA载体(以EGFP为例，pLenti-EF1α-EGFP-MS2-Neo载体，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，可通过BsiWI及NheI酶切位点连入其他目的基因mRNA序列用于蛋白表达，同样可连入具有功能的功能性miRNA序列，例如：miRNA200cluster(miRNA200、miRNA200b、miRNA200c、miRNA141、miRNA429)，该载体含有NeoR抗性基因，可用G418进行抗性筛选，载体同样可用于包装慢病毒。
实验例2构建产生外泌体的工程细胞株
1、步骤
1)以含有识别神经元细胞的RVG蛋白载体(如图3所示，pLenti-EF1α-RVG-Lamp2b-MS2，RVG的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)包装慢病毒，感染HEK293T细胞，并使用嘌呤霉素进行筛选，获得稳转细胞株(记为293T-RVG-Lamp2b-MS2)。
2)以含有目的mRNA的载体(如图2所示，pLenti-EF1α-EGFP-MS2-Neo)包装慢病毒，感染293T-RVG-Lamp2b-MS2细胞，使用G418筛选获得稳转细胞株(记为293T-RVG-Lamp2b-MS2-EGFP)。
3)挑取步骤2)中的单克隆扩大培养293T-RVG-Lamp2b-MS2-EGFP细胞，并收集上清，浓缩外泌体，使用浓缩后的外泌体侵染细胞，观察荧光。
2、结果
如图4所示，使用浓缩的外泌体连续三天侵染细胞，可观察到明显的荧光，说明外泌体可将mRNA递送到细胞中。
序列表
<110> 呈诺再生医学科技（珠海横琴新区）有限公司
<120> 用于递送RNA的靶向外泌体
<141> 2021-08-11
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acaugaggau cacccaug 18
<210> 2
<211> 11515
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt agttctcgag cttttggagt 3660
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caaaatggca gatgaatttc acagttcgct atgaaactac aaataaaact tataaaactg 4080
taaccatttc agaccatggc actgtgacat ataatggaag catttgtggg gatgatcaga 4140
atggtcccaa aatagcagtg cagttcggac ctggcttttc ctggattgcg aattttacca 4200
aggcagcatc tacttattca attgacagcg tttcattttc ctacaacact ggtgataaca 4260
caacatttcc tgatgctgaa gataaaggaa tccttactgt tgatgaactt ttggccatca 4320
gaatcccatt gaatgacctt tttagatgca atagtttatc aactttggaa aagaatgatg 4380
ttgtccaaca ctactgggat gttcttgtac aagcttttgt ccaaaatggc acagtgagca 4440
caaatgagtt cctgtgtgat aaagacaaaa cttcaacagt ggcacccacc atacacacca 4500
ctgtgccatc tcctactaca acacctactc caaaggaaaa accagaagct ggaacctatt 4560
cagttaataa tggcaatgat acttgcctgc tggctaccat ggggctgcag ctgaacatca 4620
ctcaggataa ggttgcttca gttattaaca tcaaccccaa tacaactcac tccacaggca 4680
gctgccgttc tcacactgct ctacttagac tcaatagcag cactattaag tatcttgact 4740
ttgtctttgc tgtgaaaaat gaaaaccgat tttatctgaa ggaagtgaac atcagcatgt 4800
atttggttaa tggctccgtt ttcagcattg caaataacaa tctcagctac tgggatgccc 4860
ccctgggaag ttcttatatg tgcaacaaag agcagactgt ttcagtgtct ggagcatttc 4920
agataaatac ctttgatcta agggttcagc ctttcaatgt gacacaagga aagtattcta 4980
cagcccaaga gtgttcgctg gatgatgaca ccattctaat cccaattata gttggtgctg 5040
gtctttcagg cttgattatc gttatagtga ttgcttacgt aattggcaga agaaaaagtt 5100
atgctggata tcagactctg ggaagcggag ggtcgacgtc ggggtcgggg aagccggggt 5160
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gggggacggg agatgtgacc gttgccccta gcaatttcgc aaatggcgtt gcagaatgga 5280
tctctagcaa cagcagaagc caagcgtaca aagtaacgtg ttccgttcgc caaagctccg 5340
cccaaaaacg gaagtataca ataaaggttg aggtgccgaa agtagccact caaacagttg 5400
gtggggtaga attgcccgta gcggcatggc ggtcatatct caatatggaa ctcactatcc 5460
caatcttcgc cacgaatagc gattgtgagc tgatagttaa ggctatgcaa ggtcttctca 5520
aagatggaaa ccctattcca tctgctatcg ccgccaacag cgggatatac gtcaaacaaa 5580
ctcttaactt tgatttactc aaactggctg gggatgtaga aagcaatcca ggtccatcta 5640
gaatgaccga gtacaagccc acggtgcgcc tcgccacccg cgacgacgtc cccagggccg 5700
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acatcggcaa ggtgtgggtc gcggacgacg gcgccgcggt ggcggtctgg accacgccgg 5880
agagcgtcga agcgggggcg gtgttcgccg agatcggccc gcgcatggcc gagttgagcg 5940
gttcccggct ggccgcgcag caacagatgg aaggcctcct ggcgccgcac cggcccaagg 6000
agcccgcgtg gttcctggcc accgtcggcg tttcgcccga ccaccagggc aagggtctgg 6060
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tggagacctc cgcgccccgc aacctcccct tctacgagcg gctcggcttc accgtcaccg 6180
ccgacgtcga ggtgcccgaa ggaccgcgca cctggtgcat gacccgcaag cccggtgcct 6240
gagaattcga tatcaagctt atcgataatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat 6300
tgactggtat tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc 6360
ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct 6420
ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca 6480
ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt 6540
ccgggacttt cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg 6600
cccgctgctg gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga 6660
aatcatcgtc ctttccttgg ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt 6720
ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc 6780
cggctctgcg gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt 6840
gggccgcctc cccgcatcga taccgtcgac ctcgagacct agaaaaacat ggagcaatca 6900
caagtagcaa tacagcagct accaatgctg attgtgcctg gctagaagca caagaggagg 6960
aggaggtggg ttttccagtc acacctcagg tacctttaag accaatgact tacaaggcag 7020
ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc 7080
aacgaagaca agatatcctt gatctgtgga tctaccacac acaaggctac ttccctgatt 7140
ggcagaacta cacaccaggg ccagggatca gatatccact gacctttgga tggtgctaca 7200
agctagtacc agttgagcaa gagaaggtag aagaagccaa tgaaggagag aacacccgct 7260
tgttacaccc tgtgagcctg catgggatgg atgacccgga gagagaagta ttagagtgga 7320
ggtttgacag ccgcctagca tttcatcaca tggcccgaga gctgcatccg gactgtactg 7380
ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac 7440
tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt 7500
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gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 7680
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ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 8160
ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 8220
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cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt 8400
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tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc 8520
cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tctgcctctg 8580
agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagctcc 8640
cgggagcttg tatatccatt ttcggatctg atcagcacgt gttgacaatt aatcatcggc 8700
atagtatatc ggcatagtat aatacgacaa ggtgaggaac taaaccatgg ccaagttgac 8760
cagtgccgtt ccggtgctca ccgcgcgcga cgtcgccgga gcggtcgagt tctggaccga 8820
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cgtgaccctg ttcatcagcg cggtccagga ccaggtggtg ccggacaaca ccctggcctg 8940
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cttccgggac gcctccgggc cggccatgac cgagatcggc gagcagccgt gggggcggga 9060
gttcgccctg cgcgacccgg ccggcaactg cgtgcacttc gtggccgagg agcaggactg 9120
acacgtgcta cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat 9180
cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt 9240
cgcccacccc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 9300
aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 9360
caatgtatct tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg 9420
gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc 9480
cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc 9540
gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat 9600
cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac 9660
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gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 9840
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gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 10020
ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 10080
cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 10140
cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 10200
gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 10260
aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 10320
tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 10380
gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 10440
tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 10500
gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 10560
tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat 10620
ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg 10680
ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc 10740
tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc 10800
aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc 10860
gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc 10920
gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc 10980
ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa 11040
gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat 11100
gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata 11160
gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca 11220
tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag 11280
gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc 11340
agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc 11400
aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata 11460
ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgt 11515
<210> 3
<211> 10916
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgacggatc gggagatctc ccgatcccct atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga 60
tgccgcatag ttaagccagt atctgctccc tgcttgtgtg ttggaggtcg ctgagtagtg 120
cgcgagcaaa atttaagcta caacaaggca aggcttgacc gacaattgca tgaagaatct 180
gcttagggtt aggcgttttg cgctgcttcg cgatgtacgg gccagatata cgcgttgaca 240
ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 300
tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 360
cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 420
ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 480
gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 540
ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 600
catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt 660
tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca 720
ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg 780
cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagcgcg ttttgcctgt actgggtctc 840
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 900
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 960
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 1020
cccgaacagg gacttgaaag cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg 1080
gcttgctgaa gcgcgcacgg caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat 1140
tttgactagc ggaggctaga aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg 1200
gagaattaga tcgcgatggg aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa 1260
attaaaacat atagtatggg caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct 1320
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aggatcagaa gaacttagat cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca 1440
aaggatagag ataaaagaca ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa 1500
aagtaagacc accgcacagc aagcggccgc tgatcttcag acctggagga ggagatatga 1560
gggacaattg gagaagtgaa ttatataaat ataaagtagt aaaaattgaa ccattaggag 1620
tagcacccac caaggcaaag agaagagtgg tgcagagaga aaaaagagca gtgggaatag 1680
gagctttgtt ccttgggttc ttgggagcag caggaagcac tatgggcgca gcgtcaatga 1740
cgctgacggt acaggccaga caattattgt ctggtatagt gcagcagcag aacaatttgc 1800
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ggggttgctc tggaaaactc atttgcacca ctgctgtgcc ttggaatgct agttggagta 1980
ataaatctct ggaacagatt tggaatcaca cgacctggat ggagtgggac agagaaatta 2040
acaattacac aagcttaata cactccttaa ttgaagaatc gcaaaaccag caagaaaaga 2100
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caaattggct gtggtatata aaattattca taatgatagt aggaggcttg gtaggtttaa 2220
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gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg 3480
ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg 3540
gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt 3600
gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt agttctcgag cttttggagt 3660
acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg 3720
gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt 3780
tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag tggttcaaag tttttttctt 3840
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gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 3960
gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 4020
aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 4080
agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 4140
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cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 4500
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tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc 5880
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gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg 6060
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tgggccgcct ccccgcatcg ataccgtcga cctcgagacc tagaaaaaca tggagcaatc 6300
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caacgaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca cacaaggcta cttccctgat 6540
tggcagaact acacaccagg gccagggatc agatatccac tgacctttgg atggtgctac 6600
aagctagtac cagttgagca agagaaggta gaagaagcca atgaaggaga gaacacccgc 6660
ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg agagagaagt attagagtgg 6720
aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac atggcccgag agctgcatcc ggactgtact 6780
gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 6840
ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg 6900
tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc 6960
agggcccgtt taaacccgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt 7020
tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc 7080
ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg 7140
tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga 7200
tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga aagaaccagc tggggctcta gggggtatcc 7260
ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac 7320
cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc 7380
cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt 7440
tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg 7500
gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag 7560
tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt 7620
ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt 7680
taacgcgaat taattctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc 7740
ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag 7800
tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc 7860
atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct 7920
ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctctgcctct 7980
gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaaaagctc 8040
ccgggagctt gtatatccat tttcggatct gatcagcacg tgttgacaat taatcatcgg 8100
catagtatat cggcatagta taatacgaca aggtgaggaa ctaaaccatg gccaagttga 8160
ccagtgccgt tccggtgctc accgcgcgcg acgtcgccgg agcggtcgag ttctggaccg 8220
accggctcgg gttctcccgg gacttcgtgg aggacgactt cgccggtgtg gtccgggacg 8280
acgtgaccct gttcatcagc gcggtccagg accaggtggt gccggacaac accctggcct 8340
gggtgtgggt gcgcggcctg gacgagctgt acgccgagtg gtcggaggtc gtgtccacga 8400
acttccggga cgcctccggg ccggccatga ccgagatcgg cgagcagccg tgggggcggg 8460
agttcgccct gcgcgacccg gccggcaact gcgtgcactt cgtggccgag gagcaggact 8520
gacacgtgct acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa 8580
tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct 8640
tcgcccaccc caacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca 8700
caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca 8760
tcaatgtatc ttatcatgtc tgtataccgt cgacctctag ctagagcttg gcgtaatcat 8820
ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag 8880
ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg 8940
cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa 9000
tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca 9060
ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 9120
taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 9180
agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 9240
cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 9300
tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 9360
tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 9420
gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 9480
acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 9540
acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 9600
cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 9660
gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 9720
gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 9780
agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 9840
ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 9900
ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat 9960
atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga 10020
tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac 10080
gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg 10140
ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg 10200
caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt 10260
cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct 10320
cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat 10380
cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta 10440
agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca 10500
tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat 10560
agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac 10620
atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa 10680
ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt 10740
cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg 10800
caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat 10860
attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgt 10916
<210> 4
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtaactcga ctatgggcag tggatacacc atttggatgc ccgagaatcc gagaccaggg 60
acaccttgtg acatttttac caatagcaga gggaagagag catccaacgg gggcagtgga 120
tctggatccg gtggctcgag t 141

Claims (12)

1.一种MS2蛋白识别序列，其特征在于，所述识别序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种包含权利要求1所述的识别序列的RNA，所述RNA不是天然存在的RNA或其修饰；优选地，所述RNA是mRNA。
3.一种融合多肽，其特征在于，所述融合多肽包含RNA结合多肽以及细胞外囊泡多肽；优选地，所述RNA结合多肽连接于细胞外囊泡多肽的C端；优选地，细胞外囊泡是外泌体；优选地，细胞外囊泡多肽是Lamp2b；优选地，所述RNA包含如SEQ ID NO.1所示的序列；优选地，所述RNA是权利要求2所述的RNA；优选地，所述RNA结合多肽识别RNA上的特定序列，所述特定序列如SEQ ID NO.1所示；优选地，所述RNA结合多肽是MS2蛋白。
4.包含权利要求3所述的融合多肽的靶向多肽，其特征在于，所述靶向多肽还包含靶向部分，所述靶向部分将RNA靶向递送到目标细胞、目标组织、目标器官和/或目标区室；优选地，所述靶向部分连接在所述细胞外囊泡多肽的N端。
5.一种细胞外囊泡，其特征在于，所述细胞外囊泡包含权利要求3所述的融合多肽或权利要求4所述的靶向多肽；
优选地，所述细胞外囊泡还包含RNA；优选地，所述RNA包含如SEQ ID NO.1所示的序列；优选地，所述RNA是权利要求2所述的RNA。
6.一种细胞外囊泡群体，其特征在于，所述细胞外囊泡群体包含权利要求5所述的细胞外囊泡。
7.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含第一多核苷酸和/或第二多核苷酸，或包含第三多核苷酸和/或第二多核苷酸；所述第一多核苷酸编码权利要求1所述的融合多肽，所述第三多核苷酸编码权利要求4所述的靶向多肽，所述第二多核苷酸编码RNA，所述RNA包含如SEQ ID NO.1所示的序列；优选地，所述RNA是权利要求2所述的RNA。
8.包含权利要求7所述的多核苷酸序列的载体。
9.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求2所述的RNA、权利要求3所述的融合多肽、权利要求4所述的靶向多肽、权利要求5所述的细胞外囊泡、权利要求7所述的多核苷酸、权利要求8所述的载体。
10.一种方法，其特征在于，所述方法包括以下任一项：
1)一种制备权利要求5所述的细胞外囊泡的方法；
2)一种制备权利要求9所述的细胞的方法；
3)一种用于细胞内递送RNA的体外方法；
4)一种用于向细胞外囊泡递送RNA的方法；
优选地，1)中所述的方法包括以下步骤：将权利要求7所述的多核苷酸或权利要求8所述的引入到产生细胞外囊泡的细胞中；优选地，所述方法还包括在所述产生细胞外囊泡的细胞中表达权利要求3所述的融合多肽，从而产生细胞外囊泡；优选地，所述方法还包括分离纯化所述细胞外囊泡。
优选地，2)中的方法包括以下步骤：将权利要求7所述的多核苷酸或权利要8所述的载体导入细胞中；
优选地，3)中的方法包括以下步骤：使靶细胞与权利要求5所述的细胞外囊泡、权利要求6所述的细胞外囊泡群体、权利要求7所述的多核苷酸，或权利要求8所述的载体接触；
优选地，4)中的方法包括以下步骤：将权利要求7所述的多核苷酸或权利要求8所述的引入到产生细胞外囊泡的细胞中；优选地，所述方法还包括在所述产生细胞外囊泡的细胞中表达权利要求3所述的融合多肽，从而产生细胞外囊泡；
优选地，所述细胞外囊泡是外泌体。
11.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求3所述的融合多肽、权利要求4所述的靶向多肽、权利要求5所述的细胞外囊泡、权利要求6所述的细胞外囊泡群体、权利要求7所述的多核苷酸、权利要求8所述的载体，或权利要求9所述的细胞；优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂或载体。
12.一种应用，其特征在于，所述应用包括以下任一项：
1)权利要求1所述的识别序列或权利要求2所述的RNA在将RNA递送至细胞外囊泡中的应用；优选地，所述细胞外囊泡是外泌体；优选地，所述RNA包含如SEQ ID NO.1所示的序列；优选地，所述RNA是权利要求2所述的RNA；
2)权利要求1所述的识别序列或权利要求2所述的RNA在制备包含RNA的细胞外囊泡中的应用；优选地，所述细胞外囊泡是权利要求5所述的细胞外囊泡或权利要求6所述的细胞外囊泡群体；
3)权利要求3所述的融合多肽、权利要求4所述的靶向多肽、权利要求7所述的多核苷酸、权利要求8所述的载体在将RNA递送至细胞外囊泡中的应用；优选地，所述细胞外囊泡是外泌体；优选地，所述RNA包含如SEQ ID NO.1所示的序列；优选地，所述RNA是权利要求2所述的RNA；
4)权利要求3所述的融合多肽、权利要求4所述的靶向多肽、权利要求7所述的多核苷酸、权利要求8所述的载体制备包含RNA的细胞外囊泡中的应用；优选地，所述细胞外囊泡是权利要求5所述的细胞外囊泡或权利要求6所述的细胞外囊泡群体；优选地，所述RNA包含如SEQ ID NO.1所示的序列；优选地，所述RNA是权利要求2所述的RNA；
5)权利要求1所述的识别序列、权利要求2所述的RNA、权利要求3所述的融合多肽、权利要求4所述的靶向多肽、权利要求5所述的细胞外囊泡、权利要求6所述的细胞外囊泡群体、权利要求7所述的多核苷酸、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的细胞在制备用于基因治疗的递送系统中的应用；
6)权利要求1所述的识别序列、权利要求2所述的RNA、权利要求3所述的融合多肽、权利要求4所述的靶向多肽、权利要求5所述的细胞外囊泡、权利要求6所述的细胞外囊泡群体、权利要求7所述的多核苷酸、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的细胞在制备治疗疾病的药物中的应用；
7)权利要求3所述的融合多肽、权利要求4所述的靶向多肽、权利要求7所述的多核苷酸、权利要求8所述的载体在制备权利要求9所述的细胞中的应用。
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