CN114703195B - 编码蛋白PANX1和其变体PANX1-TS的mRNA、及其应用 - Google Patents

编码蛋白PANX1和其变体PANX1-TS的mRNA、及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了编码蛋白PANX1的mRNA以及编码蛋白PANX1变体PANX1‑TS的mRNA‑TS，其序列分别如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，同时本发明还提供了含有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的mRNA的重组表达载体、工程化细胞及脂质纳米颗粒。更重要的是，本发明在体外制备了含有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的mRNA，并将其灌输供体肝脏，移植到受体小鼠2天后发现，本发明提供的mRNA能够有效预防肝移植后受体病原菌尤其是MRSA的感染，为导致器官移植患者术后死亡的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的预防和治疗提供了有效途径，提高了患者的生存率。

Description

编码蛋白PANX1和其变体PANX1-TS的mRNA、及其应用
技术领域
本发明属于PANX1基因治疗技术领域，涉及编码蛋白PANX1和其变体PANX1-TS的mRNA以及其在制备药物中的应用。
背景技术
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染是导致器官移植患者术后死亡的重要原因之一。与等其他供体器官移植相比，肝移植患者感染MRSA的风险最高。高达23％的患者发生肝移植后MRSA感染，感染者的30天死亡率高达21％。在临床上，侵入性操作、胆道并发症和广谱抗生素的使用已经确定为MRSA感染的高危因素。在基因水平，目前的研究发现C7和MBL2等几个基因在受者术后感染中起重要作用。此外，肝脏不仅是代谢器官，也是最大的免疫器官，肝移植后受者的免疫状态可能受供者而非受者的肝脏影响。因此，供体肝脏中的遗传易感风险因素，尤其是那些涉及先天免疫防御的风险因素，可能会增加肝移植后MRSA感染的易感性。
目前，基因的递送技术通常利用病毒载体及非病毒载体。其中，非病毒载体的mRNA递送技术具有很高的应用潜力。mRNA的生产过程主要是基于线性化的质粒DNA为模板，然后体外转录合成相应的mRNA，在通过两端的加帽及加poly(A)。与其他递送技术相比，mRNA生产简单，成本不高；mRNA表达蛋白的速度快，跳过了DNA转录过程；mRNA不会整合到细胞基因组长，具有较高的临床安全性。目前，利用mRNA作为病毒疫苗或肿瘤疫苗已成为研究的热点。
但是现有技术并未有通过mRNA递送技术将PANX1基因或其变体递送给供体肝脏以实现抑制肝移植后的病原菌尤其是MRSA感染的记载。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明提供了编码蛋白PANX1的mRNA或编码蛋白PANX1变体PANX1-TS的mRNA-TS，通过使用一条mRNA即可表达PANX1基因编码的蛋白PANX1或其变体PANX1-TS，同时只需要体外转录及脂质体包裹就能制备表达mRNA药物，起到有效预防肝移植后受体病原菌尤其是MRSA的感染。
本发明第一方面，提供了编码蛋白PANX1的mRNA，所述mRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，本发明还提供了含有上述mRNA的重组表达载体，所述重组表达载体的序列如SEQ ID NO.3。
本发明第二方面，提供了编码蛋白PANX1变体PANX1-TS的mRNA-TS，所述mRNA-TS的序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，本发明还提供了含有上述mRNA-TS的重组表达载体，所述重组表达载体的序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明第三方面，提供了工程化细胞，所述工程化细胞中含有上述第一方面或第二方面中的重组表达载体。
本发明第四方面，还提供了一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒中包含本发明第一方面中编码蛋白PANX1的mRNA或本发明第二方面中编码蛋白PANX1变体PANX1-TS的mRNA-TS。
进一步地，所述脂质体包括但不限于，DMG-PEG2000，胆固醇，DODAP。
本发明第五方面，还提供了一种降低肝移植后受体病原菌感染的药物，所述药物包含本发明第四方面所述的脂质纳米颗粒。
本发明第六方面，还提供了本发明第一方面所述的mRNA或本发明第二方面所述的mRNA-TS在制备降低肝移植后受体病原菌感染的药物中的应用。
进一步地，所述病原菌包括但不限于MRSA、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌等。
本发明相对于现有技术具有的有益效果：
1)在肝脏移植手术前，给供体肝脏外源的高表达PANX1，会降低肝移植术后的细菌的感染，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌等，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的感染，提高患者的生存率。
2)为了提高PANX1对下游通路的激活作用，本发明在其C-端添加额外的酪氨酸和丝氨酸磷酸化的位点序列LVEPLTPSGEAPNQALLR，并将其命名为PANX1-TS。经过试验发现，相对Native对照组而言，mRNA、mRNA-TS灌注组的小鼠生存时间明显延长，各个器官菌载量较少，肝功能等其它器官损伤程度明显减轻。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是本发明PANX1的mRNA质粒结构图谱；
图2是本发明PANX1-TS的mRNA质粒结构图谱；
图3是本发明通过像供体肝脏灌输mRNA-PANX1进行高表达PANX1，然后将高表达PANX1的肝脏移植到受体小鼠中，在进行MRSA感染或者其它病原菌的感染，观察小鼠的存活率。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施案例所描述的内容仅用于说明和解释本发明，并不用于限制权利要求书中所详细描述的本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备如无特别说明，均为常规方法，所使用的试验材料如无特别说明，均可从商业公司获取。
实施例1
1、基因片段合成
从NCBI上查询PANX1蛋白，然后根据人密码子进行相应优化，获得优化后的PANX1蛋白mRNA，序列如SEQ ID NO.1所示。
并在上下游加入与pUC57互补配对的长15bp的序列，最后通过合成直接获得DNA序列。
2、重组质粒pUC57-PANX1的制备方法如下，
pUC57载体用SacI和HindIII双酶切，酶切体系20μL：pUC57载体＜1μg，HindIII 1μL，SacI 1μL，10×CutSmart Buffer 2μL，ddH2O将体系补足20μL。37℃水浴1h酶切质粒，载体片段需加0.5μL CIP，37℃水浴30min去磷酸化。将酶切混合物通过DNA纯化柱子纯化后，以30μL Elution Buffer洗脱。
分别取PANX1基因片段与双酶切载体pUC57载体片段按照连接体系：载体50ng，插入片段摩尔数：载体片段摩尔数＝3:1，2×recombinase mix 5μL，ddH2O将体系补足10μl，50℃连接30分钟。将连接产物按体积1:10与大肠杆菌DH5α的感受态细胞轻柔混匀，冰浴30min，42℃热击45s，冰浴1min，加入预热的LB培养基涂布于LB平板(LB-Amp平板：含50μg/mL Amp的LB平板)，37℃培养16-20h。
酶切验证：筛选阳性菌提取质粒，按照上述酶切体系以SacI和HindIII进行酶切，将酶切混合物与6×Loading Buffer混合进行电泳(1％琼脂糖，94V)。
测序验证：提取酶切验证符合预期的质粒送测序公司测序。将测序验证后完全正确的携带阳性质粒的大肠杆菌保存于-80℃，携带阳性质粒图谱如图1所示，含有氨苄霉素抗性基因(Amp)、T7启动子基因、humanβ-globulin5’UTR基因、PANX1基因、humanβ-globulin3’UTR基因；B是本发明的mRNA-PANX1-C-ter质粒结构图谱，含有氨苄霉素抗性基因(Amp)、T7启动子基因、humanβ-globulin 5’UTR基因、6×PANX1-C-ter基因、humanβ-globulin 3’UTR基因，序列如SEQ ID NO.3所示。
3、pUC57-PANX1质粒用HindIII酶切线性化及回收方法如下，
pUC57-PANX1质粒10μg，HindIII 1μL，10×NEBuffer 3.1 5μL，ddH2O将体系补足50μL，50℃水浴1h酶切质粒。将酶切混合物与6×Loading Buffer混合，电泳(1％琼脂糖，94V)并胶回收相应长度的片段，以30μL Elution Buffer洗脱。
实施例2
线性化后pUC57-PANX1质粒使用T7 RNA聚合酶开始的体外转录反应(IVT)，TurboDNase酶对模板DNA进行降解，和加帽酶(Vaccinia capping enzyme)将7-甲基化鸟苷酸帽结构(7-methylguanylate cap structure，称为Cap 0)加至转录的mRNA的5’端，具体方法如下。
10X Reaction Buffer 2μL，NTP每种0.5mM，线性化pUC57-PANX11μg，T7RNAPolymerase 2μL，补水至20μL，37℃反应1小时后加入，1μLTURBOTMDNas，10XCappingBuffer 4μL，GTP(10mM)2μL，SAM(2mM)2μL，Vaccinia Capping Enzyme 2μL，总体积补水至总体积40μL，37℃反应1小时。使用加帽酶将7-甲基化鸟苷酸帽结构加至转录的mRNA的5’端,使用Poly(A)Polymerase在mRNA的3’端加入poly(A)。后补水至200μL再加入7.5M氯化锂120μL混匀后，14000g 4℃离心10分钟，弃上清后用70％酒精清洗沉淀，14000g 4℃离心2分钟，弃上清后风干2分钟，溶解在40μL水内。用分光光度计定量并用Aglient 2000验证RNA的长度。
mRNA-PANX1与脂类包裹步骤：mRNA与脂类(组成包括DMG-PEG2000，cholesterol，DODAP，5A2-SC8)通过Nanoassemblr混合器进行快速的混合，从而引起脂类的沉淀及在电荷作用mRNA包裹进入LNP内。mRNA-LNP复合物随后通过浓缩及换液至制剂溶液中。
实施例3
Western blot检测mRNA-PANX1在供体肝脏中的表达情况。将供体肝脏灌输mRNA-PANX1，移植到受体小鼠2天后，切取部分肝脏进行WB检测PANX1度表达情况。具体方法：
1)供体肝灌注：供肝获取后，将供肝连接至常温机械灌注系统，机械灌注系统温度维持在35-38℃，灌注液中加入携带表达PANX1 mRNA的LNP，灌注液通过膜氧合器(含氧)氧合后流入门静脉，以2mL/g/min(按肝脏湿重)的速率持续循环灌注，维持门静脉压为10-12mm H2O，持续灌注4-6小时。
2)供体肝移植：采用“二袖套法”将mRNA-PANX1灌注的供体肝脏原位移植入受体小鼠腹腔，术后动物恒温毯复温，复苏后自由进食水，分笼单独喂养，移植2天后二氧化碳处死，取样行进一步检测。
3)蛋白样品的处理：在72小时后的肝细胞中加入200μL细胞RIPA裂解液后，通过组织研磨进行裂解，待裂解完全后加入SDS loading buffer,95℃金属浴5分钟。放在冰上备用。
4)Western blot检测：
电泳：precast SDS-PAGE胶，蛋白上样量20μL，电泳条件为200V，30min。
电转：使用NC膜，在genscript快速转膜仪中转膜10分钟。
封闭：使用1X PBST配制5％Fat-free milk作为封闭液,室温封闭20分钟。
一抗孵育：使用封闭液将PANX1抗体(Proteintech)以1：1000进行稀释，在室温下孵育1小时。用1X PBST洗3次，每次5分钟。
二抗孵育：使用封闭液稀释二抗，稀释比为1：10000，在室温下孵育1小时。用1XPBST洗3次，每次5分钟。
显影：显影液A液：B液＝1：1，在成像系统中进行显影。
实施例5
在蛋白PANX1的C-端添加额外的酪氨酸和丝氨酸磷酸化的位点序列LVEPLTPSGEAPNQALLR，并将其命名为PANX1-TS，获得优化后的PANX1-TS蛋白mRNA，序列如SEQ ID NO.2所示，并按照实施例1中的质粒构建方法获得携带阳性质粒图谱如附图2所示，序列如SEQ ID NO.4所示。
同时，按照实施例1-3记载的方法对其在细胞中的表达情况进行验证。
实施例4
构建小鼠肝移植模型，依据供肝是否经mRNA灌注分为Native对照组和mRNA-PANX1,mRNA-PANX1-TS灌注组，移植后7天待小鼠状态稳定后，分别使用MRSA(107、尾静脉注射)感染两组小鼠，观察小鼠的生存状况，检测小鼠的肝肾功能，血常规以及各个器官的菌载量，以及各个器官的HE染色等技术指标，结果如图3所示，表明mRNA-PANX1-TS灌注组的小鼠生存时间明显延长，各个器官菌载量较少，肝功能等其它器官损伤程度明显减轻。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 李浩、蒋望
<120> 编码蛋白PANX1和其变体PANX1-TS的mRNA、及其应用
<130> 202203
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1465
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 1
acatttgctt ctgacacaac tgtgttcact agcaacctca aacagacacc atggccatcg 60
ctcaactggc cacggagtac gtgttctcgg atttcttgct gaaggagccc acggagccca 120
agttcaaggg gctgcgactg gagctggctg tggacaagat ggtcacgtgc attgcggtgg 180
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taagctgttt ctctccaagt tctttctcct ggcgtcaggc tgcctttgtg gattcatatt 300
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acatgagaga tggagcctgc tcagttccag gtgttaccga gaacttaggg caaagtttgt 600
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<211> 1516
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aactcactgc agagcgagtc tggaaacctc ccactgtggc tgcataagtt tttcccctac 840
atcctgctgc tctttgcgat cctcctgtac ctgcccccgc tgttctggcg tttcgcagct 900
gctcctcata tttgctcaga cttgaagttt atcatggaag aacttgacaa agtttacaac 960
cgtgcaatta aggctgcaaa gagtgcgcgt gaccttgaca tgagagatgg agcctgctca 1020
gttccaggtg ttaccgagaa cttagggcaa agtttgtggg aggtatctga aagccacttc 1080
aagtacccaa ttgtggagca gtacttgaag acaaagaaaa attctaataa tttaatcatc 1140
aagtacatta gctgccgcct gctgacactc atcattatac tgttagcgtg tatctacctg 1200
ggctattact tcagcctctc ctcactctca gacgagtttg tgtgcagcat caaatcaggg 1260
atcctgagaa acgacagcac cgtgcccgat cagtttcagt gcaaactcat tgccgtgggc 1320
atcttccagt tgctcagtgt cattaacctt gtggtttatg tcctgctggc tcccgtggtt 1380
gtctacacgc tgtttgttcc attccgacag aagacagatg ttctcaaagt gtacgaaatc 1440
ctccccactt ttgatgttct gcatttcaaa tctgaagggt acaacgattt gagcctctac 1500
aatctcttct tggaggaaaa tataagtgag gtcaagtcat acaagtgtct taaggtactg 1560
gagaatatta agagcagtgg tcaggggatc gacccaatgc tactcctgac aaaccttggc 1620
atgatcaaga tggatgttgt tgatggcaaa actcccatgt ctgcagagat gagagaggag 1680
caggggaacc agacggcaga gctccaaggt atgaacatag acagtgaaac taaagcaaat 1740
aatggagaga agaatgcccg acagagactt ctggattctt cttgctgata actcgctttc 1800
ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac taaactgggg 1860
gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt tattttcatt 1920
gcaagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca 1980
attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg 2040
agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg 2100
tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc 2160
tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 2220
tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 2280
aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 2340
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 2400
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 2460
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 2520
agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 2580
tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 2640
aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 2700
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 2760
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gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 3060
aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 3120
gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 3180
gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 3240
cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 3300
gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 3360
gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 3420
ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 3480
tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 3540
ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 3600
cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 3660
accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 3720
cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 3780
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acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 3960
atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 4020
tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 4080
aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 4140
cgtatcacga ggccctttcg tc 4162
<210> 4
<211> 4213
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 4
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctctaa tacgactcac 420
tatagggcga attaattcga gctcggtacc cagcttgaca tttgcttctg acacaactgt 480
gttcactagc aacctcaaac agacaccatg gccatcgctc aactggccac ggagtacgtg 540
ttctcggatt tcttgctgaa ggagcccacg gagcccaagt tcaaggggct gcgactggag 600
ctggctgtgg acaagatggt cacgtgcatt gcggtggggc tgcccctgct gctcatctcg 660
ctggccttcg cgcaggagat ctcgattggt acacagataa gctgtttctc tccaagttct 720
ttctcctggc gtcaggctgc ctttgtggat tcatattgct gggcggctgt tcagcagaag 780
aactcactgc agagcgagtc tggaaacctc ccactgtggc tgcataagtt tttcccctac 840
atcctgctgc tctttgcgat cctcctgtac ctgcccccgc tgttctggcg tttcgcagct 900
gctcctcata tttgctcaga cttgaagttt atcatggaag aacttgacaa agtttacaac 960
cgtgcaatta aggctgcaaa gagtgcgcgt gaccttgaca tgagagatgg agcctgctca 1020
gttccaggtg ttaccgagaa cttagggcaa agtttgtggg aggtatctga aagccacttc 1080
aagtacccaa ttgtggagca gtacttgaag acaaagaaaa attctaataa tttaatcatc 1140
aagtacatta gctgccgcct gctgacactc atcattatac tgttagcgtg tatctacctg 1200
ggctattact tcagcctctc ctcactctca gacgagtttg tgtgcagcat caaatcaggg 1260
atcctgagaa acgacagcac cgtgcccgat cagtttcagt gcaaactcat tgccgtgggc 1320
atcttccagt tgctcagtgt cattaacctt gtggtttatg tcctgctggc tcccgtggtt 1380
gtctacacgc tgtttgttcc attccgacag aagacagatg ttctcaaagt gtacgaaatc 1440
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caggggaacc agacggcaga gctccaaggt atgaacatag acagtgaaac taaagcaaat 1740
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cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 3720
ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 3780
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caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 4020
ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 4080
gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 4140
cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 4200
aggccctttc gtc 4213

Claims (8)

1. 编码蛋白PANX1变体PANX1-TS的mRNA-TS，其特征在于，所述mRNA-TS的序列如SEQIDNO.2所示。
2. 重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中含有权利要求1所述的mRNA-TS，所述重组表达载体的序列如SEQ ID NO.4所示。
3.工程化细胞，其特征在于，所述工程化细胞中含有权利要求2所述的重组表达载体。
4.一种脂质纳米颗粒，其特征在于，所述脂质纳米颗粒中包含权利要求1所述的mRNA-TS。
5.根据权利要求4所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述脂质体包括但不限于，DMG-PEG2000，胆固醇，DODAP。
6.一种降低肝移植后受体病原菌感染的药物，其特征在于，所述药物包含权利要求5所述的脂质纳米颗粒。
7.编码蛋白PANX1变体PANX1-TS的mRNA-TS在制备降低肝移植后受体病原菌感染的药物中的应用，其特征在于，所述mRNA-TS的序列如SEQ IDNO.2所示。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述病原菌包括但不限于MRSA、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌或鲍曼不动杆菌。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015188288A1 (es) * 2014-06-12 2015-12-17 Pontificia Universidad Católica De Chile Moduladores específicos de hemicanales de conexinas
CN109504761A (zh) * 2018-12-12 2019-03-22 复旦大学 检测女性原发不孕的panx1基因及检测该基因突变的试剂盒
CN113616794A (zh) * 2021-08-30 2021-11-09 南通大学 Panx1蛋白在制备神经病理性疼痛防治药物中的作用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090175827A1 (en) * 2006-12-29 2009-07-09 Byrom Mike W miR-16 REGULATED GENES AND PATHWAYS AS TARGETS FOR THERAPEUTIC INTERVENTION

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015188288A1 (es) * 2014-06-12 2015-12-17 Pontificia Universidad Católica De Chile Moduladores específicos de hemicanales de conexinas
CN109504761A (zh) * 2018-12-12 2019-03-22 复旦大学 检测女性原发不孕的panx1基因及检测该基因突变的试剂盒
CN113616794A (zh) * 2021-08-30 2021-11-09 南通大学 Panx1蛋白在制备神经病理性疼痛防治药物中的作用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Reduced pannexin 1–IL-33 axis function in donor livers increases risk of MRSA infection in liver transplant recipients：互联网学术，申请人的追踪;Hao Li等;Sci. Transl. Med(第11期);eaaz6169 *

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