CN112334156A - 用于亲和纯化的工程细胞外囊泡 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及装载有药物的细胞外囊泡(特别是外泌体)的基于亲和力的分离和纯化，其中外泌体被工程化以能够实现亲和纯化。

Description

用于亲和纯化的工程细胞外囊泡
技术领域
本发明涉及装载有药物的细胞外囊泡(EV)(特别是外泌体)的基于亲和力的分离和纯化，其中EV被工程化以能够实现亲和纯化。
背景技术
细胞外囊泡(EV)是由产生EV的细胞释放到细胞外环境中的纳米大小的囊泡(流体动力学直径通常小于1000nm)。EV并且特别是外泌体(其通常由不同的参数定义，例如在其膜上各种四跨膜蛋白的存在或其大小)已经被证明能够将蛋白质生物(诸如抗体和siRNA)转运到靶细胞中，使得能够实现利用EV的特性与重组蛋白的特异性相结合的全新形式的先进生物疗法。
制备和分离EV(例如外泌体)的常规的小规模方法涉及一系列差速离心步骤，以将囊泡与EV释放到其中的培养基中存在的细胞或细胞碎片分离。典型地，施加以例如3,000g、10,000g和70,000g或100,000g的一系列离心，在离心后，将管的底部的所得沉淀用盐水溶液重悬至其原始体积的一部分，以构成浓缩的EV或外泌体溶液。然而，由于多种原因，这些方法基本上不适合于临床应用：(1)整个过程所需的延长的时间长度，(2)关于规模扩大、在GMP环境中的可操作性以及与该GMP环境的依从性的问题，(3)被细胞碎片污染的重大风险，(4)由于操作者的可变性导致的差的再现性，(5)由于囊泡的沉淀导致的EV/外泌体的聚集，(6)在加工结束时的低回收率，以及(7)对囊泡形态以及由此对潜在地生物分布和活性的负面影响。因此，需要纯化EV的改进的方法，并且允许生产治疗质量的囊泡制剂。为此，PCT申请WO2000/044389公开了用于通过色谱技术(诸如阴离子交换色谱和/或凝胶渗透色谱)从生物样品制备膜囊泡的方法。WO2014/168548公开了一种用于EV的显著改进的分离和纯化方法，即，使用过滤和各种形式的液相色谱的顺序组合，例如超滤和尺寸排阻液相色谱的组合。然而，这些技术主要是利用EV的物理化学特性，例如它们的大小和电荷，而不管被工程化到EV中或上的特定部分或结构域的存在和/或EV中药物货物的存在。因此，在本领域中非常需要用于纯化EV的改进的、特定的和以药物为中心的方法，用于例如治疗应用，特别是用于装载有特定药物货物的EV的纯化和富集。
发明内容
因此，本发明的一个目的是克服与EV(并且特别是来自装载有各种类型的药物货物的EV群体的EV)的分离和纯化相关的上述问题。此外，本发明旨在满足本领域内的其他现有需要，例如开发用于以高产率和高特异性进行EV纯化的普遍适用的亲和纯化策略。
本发明通过本发明的蛋白质工程实现了这些和其他目的，该蛋白质工程使得能够使用单个融合蛋白构建体将药物加载到EV中和对这样的EV进行基于亲和力的纯化。在第一方面中，本发明涉及这样的本发明的融合蛋白，其包含至少以下组分：(i)EV多肽(也可互换地被称为外泌体多肽、EV蛋白、外泌体蛋白和类似术语)、(ii)纯化部分和(iii)载药部分。在第二方面中，本发明涉及融合蛋白与感兴趣的药物(DOI)之间的复合物。融合蛋白与DOI之间的相互作用通常基于融合蛋白的载药部分与DOI的位点、区域、结构域或结构或化学特征之间的非共价相互作用。
在高度创造性的方面中，本发明涉及包含本发明的融合蛋白的细胞外囊泡(EV)。此外，如上所述，融合蛋白能够借助于其载药部分与DOI相互作用，并且因此EV可以进一步包含DOI，其可以与融合蛋白以复合物的形式存在，但其也可以已经从融合蛋白释放或解离，并且作为游离的DOI存在于EV中。根据本发明，优选的DOI包括基于蛋白质、肽和/或核酸(NA)的试剂，例如各种形式的RNA治疗剂，诸如mRNA、miRNA、短发夹RNA、引导RNA、单引导RNA或其组合，例如Cas-CRISPR核糖核蛋白。本发明的EV优选地为外泌体或微囊泡，或者可从内溶酶体途径或质膜获得的任何其他类型的EV。
在进一步的方面中，本发明涉及编码本文的融合蛋白的多核苷酸，以及包含这样的多核苷酸的载体和细胞。本发明的细胞可以进一步包含所述融合蛋白以及编码DOI的多核苷酸。
在进一步的重要方面中，本发明涉及用于产生包含根据本发明的融合蛋白的EV的方法。这些方法通常包含以下步骤：提供包含根据本发明的融合蛋白的EV的群体，并且将这样的群体暴露于亲和纯化系统，例如允许包含在EV中的纯化结构域与固相上的配体结合的色谱系统，允许捕获包含融合蛋白和通常为DOI的EV。更具体地，这样的方法通常包含以下步骤：(i)将编码所讨论的融合蛋白的多核苷酸引入到产生EV的细胞中，以及(ii)允许产生EV的细胞产生包含该融合蛋白的EV。此外，可以将编码感兴趣的药物(DOI)的多核苷酸引入到产生EV的细胞中，以便允许产生EV的细胞产生包含融合蛋白的EV，其中融合蛋白的载药部分与DOI结合并将其转运到EV中，从而产生包含融合蛋白和DOI两者的EV，通常最初作为复合物的一部分，但作为DOI从融合蛋白中释放的结果，作为单一实体。编码DOI的多核苷酸可以编码各种类型的药物货物，包括蛋白质、肽、mRNA、短发夹RNA、miRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、反义寡核苷酸、引导RNA、单引导RNA、环状RNA、piRNA、tRNA、rRNA、snRNA、IncRNA、核酶、DNA和/或其任何组合或衍生物。化学修饰的寡核苷酸货物是特别优选的。
在又一个方面中，本发明涉及一种纯化包含DOI的EV的方法。该方法通常包含以下步骤：(i)提供根据本发明的EV，(ii)允许包含在EV中的融合蛋白的纯化部分结合纯化配体；以及(iii)去除未与纯化配体结合的EV。
在进一步的方面中，本发明涉及一种包含EV和药学上可接受的载体的药物组合物，以及使用该药物组合物或EV(和EV的群体)的医学用途和医学治疗。
附图说明
图1示出了包含融合蛋白的EV(诸如外泌体)的示意图，该融合蛋白包含载药部分、外泌体蛋白和纯化结构域。此外，EV包含药物货物分子，在这种情况下，作为非限制性示例，是发夹RNA形式的RNA货物分子，其被载药部分结合并穿梭到EV中，该EV随后使用融合蛋白的纯化结构域进行纯化。
图2比较了来自使用两种不同纯化工艺纯化的EV批次的产量。EV被基因工程化为包含融合蛋白，该融合蛋白包含作为外泌体蛋白的CD63、作为纯化结构域的ZZ结构域和作为用于mRNA药物加载的载药部分的Cas6。借助于Cas6 mRNA负载结构域，将纳米荧光素酶mRNA装载到外泌体中，并且使用生物发光读数来评估在外泌体介导的递送后翻译的总mRNA。如在图2中可以看到的，TFF和珠洗脱尺寸排阻色谱法(BE-SEC纯化)的组合得到约5E8的RLU，而基于IgG柱的亲和色谱过程导致约3.2E9的RLU，这是由于最终EV群体中纳米荧光素酶mRNA的较高的富集。
图3示出了包含融合蛋白的EV的示意图，该融合蛋白包含载药部分、外泌体蛋白、纯化结构域，以及插入在纯化结构域和外泌体蛋白之间的用于酶促切割的切割结构域。该设计使得能够使用纯化结构域进行基于亲和力的捕获，随后同时去除纯化结构域并洗脱装载有药物的EV。shRNA用于举例说明药物货物分子，但该方法同样适用于其他形式的药物货物，诸如sgRNA、反义寡核苷酸、miRNA、mRNA、蛋白质、肽等。
图4示出了使用以下项的在纯化后的最终EV群体中单引导RNA(sgRNA)阳性EV的百分比：(i)TFF和BE-SEC(BE-SEC纯化)、(ii)基于MBP的亲和纯化(MBP亲和纯化)或(iii)使用融合蛋白的基于MBP的纯化，该融合蛋白进一步包含用于酶促去除MBP结构域的TEV切割结构域(MBP-TEV亲和纯化)。基于MBP的亲和捕获(在有或没有TEV切割接头的情况下)导致IGF2BP1 sgRNA占纯化后所有EV的约90％，而BE-SEC纯化的EV为约40％的IGF2BP1 sgRNA阳性(图4)。
具体实施方式
本发明涉及本发明的融合蛋白以及相关方面和实施例，其使得能够产生和亲和纯化装载有药物的EV，特别是外泌体。
在本发明的特征、方面、实施例或替代方案是根据马库什组描述的情况下，本领域技术人员将认识到本发明也因此根据马库什组的任何个体成员或成员的亚组来描述。本领域技术人员将进一步认识到，本发明也因此根据马库什组的个体成员或成员的亚组的任何组合来描述。另外，应注意，结合本发明的方面和/或实施例中的一种描述的实施例和特征也经必要修改适用于本发明的所有其他方面和/或实施例。
在第一方面中，本发明涉及一种融合蛋白，其包含至少以下组分：(i)EV多肽、(ii)纯化部分(可互换地被称为“纯化结构域”)和(iii)载药部分。在一个重要的实施例中，载药部分是核酸(NA)结合蛋白或蛋白结合结构域，其能够将NA(例如RNA试剂)或蛋白(例如基于蛋白的药物，诸如酶、肿瘤抑制剂或抗体)装载到EV中。因此，本发明的融合蛋白具有三种功能性，即(1)EV多肽驱动整个融合蛋白转运到EV中，(2)载药部分能够使融合蛋白将一种或多种感兴趣的药物(DOI)携带到EV中或上，并且(3)纯化部分能够实现仅含有感兴趣的药物的EV的纯化和分离。因此，这种三功能构建体解决了EV领域的重大挑战，即分离富含DOI的纯EV群体，这意味着最终药物物质和药物产品将含有更少(如果有的话)空的、未装载药物的EV。
驱动融合蛋白的装载并且因此驱动DOI装载到EV中的EV多肽可以选自包含以下非限制性示例的群组：CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71(也被称为转铁蛋白受体)及其内泌体分选结构域，即转铁蛋白受体内泌体分选结构域、CD133、CD138(syndecan-1)、CD235a、ALIX、Syntenin-1、Syntenin-2、Lamp2a、Lamp2b、TSPAN8、syndecan-1、syndecan-2、syndecan-3、syndecan-4、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受体、白介素受体、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II组分、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、ARRDC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、PTGFRN、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、TSG101、VTI1A、VTI1B、纤连蛋白、Rab7、14-3-3ζ/δ、14-3-3ε、HSC70、HSP90、HSPA13以及任何其他EV多肽，以及其任何组合、衍生物、片段、结构域或区域。
在优选的实施例中，EV多肽是跨膜或膜相关多肽。跨膜外泌体蛋白的使用使得可以在EV膜的腔侧上配置载药部分并且在囊外侧上配置纯化部分。这种配置支持将例如敏感的基于RNA的药物(诸如mRNA或shRNA)或其他敏感的治疗剂(例如Cas9核酸酶)装载到EV中，在该EV中它们被保护免于降解，同时将纯化标签暴露在外部，以使得能够接近亲和纯化配体或部分并与该亲和纯化配体或部分结合。合适的跨膜或膜相关EV多肽可以选自包含以下的群组：CD63、CD81、CD9、CD82、CD44、CD47、CD55、LAMP2B、ICAM、整联蛋白、ARRDC1、膜联蛋白以及任何其他EV多肽，以及其任何组合、衍生物、结构域或区域。非限制性示例可以是诸如CD63之类的蛋白质，其具有4个跨膜结构域以及在EV的内部存在的蛋白的N末端和C末端。因此，一个或多个载药部分(例如RNA结合蛋白)可以融合到N末端和/或C末端上，而纯化部分可以被引入到一个或多个囊泡外区域中，诸如例如在第1环和/或第2环中。在一个特别优选的实施例中，融合蛋白可以如下示意性地描述(N末端至C末端)：
CD63-ZZ结构域插入到CD63-RNA结合蛋白的第1环和第2环中。
在该特定实施例中，RNA结合蛋白可以是例如Cas6、Cas9、PUF、TARRNA结合蛋白(TRBP)，或任何其他类型的RNA结合蛋白或其他类型的载药蛋白(诸如介导例如蛋白-蛋白相互作用的区域或结构域或多肽)。可替代地，也可以将载药部分和纯化标签都工程化到所讨论的融合蛋白的囊泡外部分中，例如CD63或CD81或CD9等。这样的融合构建体的结构可以是在蛋白质的第1环或第2环中引入纯化标签以及在蛋白质的第2环或第3环中引入载药部分，反之亦然。
在其他类似的实施例中，可以利用具有单个跨膜区域的外泌体蛋白。这样的跨膜外泌体蛋白的合适的示例包括CD63、CD47、Lamp2b、ARRDC1、L1CAM等。在这样的跨膜外泌体蛋白的情况下，载药部分有利地融合到蛋白的腔末端上，并且纯化部分融合到蛋白的囊泡外末端。
在替代的实施例中，EV多肽可以是融合到将融合蛋白定位于外泌体膜的跨膜多肽的非跨膜多肽。这样的非跨膜EV多肽的合适的示例包括ALIX、syntenin-1、syntenin-2、Lamp2b、svndecan-1、syndecan-2、syndecan-3、syndecan-4和任何其他非跨膜外泌体蛋白。这些非跨膜外泌体蛋白可以有利地与例如细胞因子受体、共受体或信号转导物(例如TNF受体1或2或gp130或IL23R或IL17R等)的跨膜结构域融合，以使得它们能够锚定到EV膜中。类似地，也可以将非跨膜EV多肽与跨膜EV多肽融合，从而进一步增强融合蛋白的外泌体转运。
在本发明的一个优选的实施例中，融合蛋白的NA结合蛋白选自包含以下的群组：mRNA结合蛋白、miRNA结合蛋白、pre-rRNA结合蛋白、tRNA结合蛋白、小核或核仁RNA结合蛋白、非编码RNA结合蛋白、转录因子、核酸酶、RISC蛋白，以及其任何组合、衍生物、结构域、区域、位点或部分，它们可以实现相同的目的，即与感兴趣的NA分子结合。
特别合适的NA结合蛋白可以选自PUF、PUF531、PUFx2(即，包含PUF蛋白的至少两个RNA结合结构域的融合蛋白)、DDX3X、EEF2、EEF1A1、HNRNPK、HNRNPM、HNRNPA2B1、HNRNHPH1、HNRNPD、HNRNPU、HNRNPUL1、NSUN2、Cas6、Cas13、Cas9、WDR1、HSPA8、HSP90AB1、MVP、PCB1、MOCS3、DARS、ELC2、EPRS、GNB2L1、IARS、NCL、RARS、RPL12、RPS18、RPS3、RUVBL1、TUFM、hnRNPA1、hnRNPA2B1、DDX4、ADAD1、DAZL、ELAVL4、ELAVL1、IGF2BP3、HNRNPQ、RBFOX1、RBFOX2、U1A、PPR家族、ZRANB2、NUSA、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、Lin28、KSRP、SAMD4A、TDP43、FUS、FMK1、FXR1、FXK2、EIF4A1-3、MS2外壳蛋白，以及其任何结构域、部分或衍生物。
更广泛地说，RNA结合蛋白和结构域的特定亚类可以用作载药部分，例如mRNA结合蛋白(mRBP)、pre-rRNA结合蛋白、tRNA结合蛋白、小核或核仁RNA结合蛋白、非编码RNA结合蛋白、miRNA结合蛋白、shRNA结合蛋白和转录因子(TF)。此外，各种结构域和衍生物可以用作NA结合结构域，以将NA货物转运到EV中。示例包括DEAD、KH、GTP_EFTU、dsrm、G-patch、IBN_N、SAP、TUDOR、RnaseA、MMR-HSR1、KOW、RnaseT、MIF4G、zf-RanBP、NTF2、PAZ、RBM1CTR、PAM2、Xpol、Piwi、CSD、核糖体L7Ae以及其任何组合、衍生物、结构域、区域、位点、突变的变体或部分。这样的RNA结合结构域可以以多个存在，单独存在或与其他结合存在，并且因此也可以形成更大的RNA结合蛋白构建体的一部分，只要它们的关键功能(即转运感兴趣的NA货物(例如mRNA或短RNA)的能力)被维持。
本发明的NA结合结构域已经被选择以允许NA结合结构域与NA货物分子之间的可编程的、可修饰的亲和力，使得能够产生包含融合多肽的EV，该融合多肽包含NA结合结构域和至少一种NA货物分子，其中该融合多肽构建体的NA结合结构域以可编程的、可逆的、可修饰的方式与NA货物分子相互作用，从而允许装载到EV中和释放EV中和/或靶细胞中或与该靶细胞相关的NA货物分子。例如，当NA货物分子旨在在受体细胞中释放时，这将是优点。然后可以调节定义的结合时间，以在需要时释放RNA分子，但不在生产者细胞中释放。这对于本发明尤其重要，以便不仅确保货物核酸与EV稳定结合，同时发生纯化过程，使得纯化的EV保留其货物，而且还确保货物核酸在递送至靶/受体细胞时是可释放的并且因此是功能性的(生物活性的)。
因此，在有利的实施例中，本发明涉及融合到外泌体蛋白的真核NA结合蛋白。在优选的实施例中，NA结合结构域来自蛋白质的PUF家族，例如PUF531、工程化的PUF和/或PUFx2。重要的是，由于PUF蛋白的序列特异性(其能够实现mRNA药物货物的高度受控的和特异性的装载)，因此优选地将PUF蛋白用于EV介导的mRNA的递送。有利的融合蛋白构建体包括以下非限制性示例：CD63-PUF531、CD63-PUFx2、工程化的CD63-PUF、CD81-PUF531、CD81-PUFx2、工程化的CD81-PUF、CD9-PUF531、CD9-PUx2、工程化的CD9-PUF和其他基于跨膜的融合蛋白，优选地基于融合到一种、两种或多种PUF蛋白的四跨膜外泌体蛋白。包含PUF蛋白和至少一种可溶性外泌体蛋白的有利的融合蛋白包括以下非限制性示例：syntenin-PUF531、syntenin-PUx2、工程化的syntenin-PUF、syndecan-PUF531、syndecan-PUx2、工程化的syndecan-PUF、Alix-PUF531、Alix-PUx2、工程化的Alix-PUF、以及融合到PUF蛋白的任何其他可溶性外泌体蛋白。
类似地，可以将Cas6可以识别的RNA序列工程化为插入到感兴趣的NA分子中。可以对Cas13进行工程化以仅结合其定义的RNA靶并且不降解。通过改变sgRNA分子的序列，可以调节Cas13-sgRNA复合物以结合20至30个核苷酸之间的任何RNA序列。与基于PUF的NA结合结构域一样，Cas蛋白代表可释放的、可逆的NA结合结构域，对靶NA货物分子具有可编程的、可修饰的序列特异性，能够在较低的总亲和力下实现较高的特异性，从而允许NA货物装载到EV中和该NA货物在靶位置中释放。这样的PUF和Cas核酸结合结构域特别适于将mRNA装载到EV中以用于通过本发明进行纯化。
如上所述，在本发明中采用PUF蛋白和CRISPR相关多肽(Cas)(具体地是Cas6和Cas13)和/或各种类型的NA结合适配体的实施例具有在NA结合结构域与NA货物分子之间实现可编程的、较低亲和力的相互作用的有利效果。这使得本发明能够在产生EV的细胞中有效地装载EV，同时还使得能够在合适的位置(通常在靶细胞内部)释放NA货物，其中NA货物分子与NA结合结构域之间的相互作用的较低的亲和力和可释放性质是高度有利的。详细地说，本发明允许序列特异性低亲和力或中亲和力结合至较长并且由此更特异性的核苷酸段，例如长度为6nt或长度为8nt。结合位点的较长的长度使得能够引入一系列不同的突变，这些突变产生具有一系列修饰的结合亲和力的结合位点，从而产生上述可编程的较低亲和力相互作用。例如，在6或8个核苷酸区域中引入单个点突变将微妙地改变结合亲和力，从而提供更大的范围以引入一个或多个影响蛋白质对核酸的结合亲和力的突变。类似地，需要较长段的待结合的核苷酸导致能够与较长的核苷酸序列相互作用的氨基酸的数目较大，并且因此提供了使那些相互作用的氨基酸突变并再次产生具有多种结合亲和力的较大范围的可能蛋白质突变体的更多可能性。PUF、Cas6和Cas13的较长的核苷酸结合位点和较大的蛋白质结合位点都在通过突变能够实现广泛的亲和力方面提供了优点。
因此，如果需要改进该货物核酸的释放，该较长的序列提供了更大的可能性来工程化核酸和/或结合蛋白以使结合亲和力特异性地适合于感兴趣的个体货物。控制与核苷酸货物结合的亲和力并且因此修饰和控制核苷酸货物的可释放性的能力是本发明的显著优点，导致装载有NA的EV的成功纯化以及处于生物活性状态(未结合)的那些核酸的随后递送和释放。这对于从NA结合结构域释放时仅具有生物活性的mRNA来说尤其重要，使得它然后可以被主动翻译。除了将基于NA的药物货物分子装载到EV中之外，本发明还非常适合于装载基于氨基酸的药物分子。基于多肽的药物的装载通常可以有利地通过使用基于多肽的DOI与外泌体蛋白之间的单一融合蛋白来实现，但是在例如可溶性治疗蛋白和/或肽DOI的情况下，(i)本发明的融合蛋白的载药部分与(ii)肽和/或蛋白质形式的DOI之间典型的非共价相互作用可以是优选的E-V装载方法。在基于氨基酸的DOI的装载的背景下有利使用的本发明的载药部分的非限制性示例包括：作为用于装载包含核定位信号(输入蛋白与其结合)的DOI的手段的输入蛋白；作为用于装载DOI的手段的在蓝光下的CRY2-CIBN相互作用，其中CRY2和外泌体蛋白与CIBN和DOI之间的融合(反之亦然)允许贩运至外泌体；DOI与其接种到本发明的融合蛋白上的结合基序之间的任何pH依赖性相互作用；在该特定实施例中用作载药结构域的Fc结合多肽，其中其能够结合至具有Fc结构域的多肽并且装载该多肽，例如被人工地工程化以包含Fc结构域的抗体或蛋白质；Spy-Catcher Spy-Tag系统，其中将Tag或Catcher融合到DOI，并且将其结合配偶体融合到融合蛋白：和/或SnoopTag-SnoopCatcher系统。
重要的是，本发明的融合蛋白的本发明的设计使得能够实现仅含有载药部分并且因此含有DOI的EV的基于亲和力的纯化。本发明的合适的纯化部分包括以下非限制性示例：受体、抗体结合多肽、Fc结合多肽、多组氨酸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、钙调蛋白结合肽(CBP)、蛋白内含子-几丁质结合结构域(I-CBD)、链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、FLAG表位标签、HA表位标签、T7标签、S-标签、CLIP、DHFR、纤维素结合结构域，以及其任何组合、衍生物、结构域或部分。
在一个特别有利的实施例中，Fc-结合多肽选自包含以下的群组：蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、蛋白LG、Z结构域、ZZ结构域、人FCGRI、人FCGR2A、人FCGR2B、人FCGR2C、人FCGR3A、人FCGR3B、人FCGRB、人FCAMR、人FCERA、人FCAR、小鼠FCGRI、小鼠FCGRIIB、小鼠FCGRIII、小鼠FCGRIV、小鼠FCGRn、FcIII肽，以及其任何组合、衍生物、结构域或部分。
与融合蛋白通常的情况一样，通常包括在融合蛋白中的三种组分(即载药部分、外泌体蛋白和纯化结构域)可以在融合蛋白中以连续的方式直接连接，或者它们可以使用各种接头、释放结构域或释放位点、切割位点或切割结构域彼此连接和/或附着。例如，在某些实施例中，当期望去除纯化结构域时，可以在外泌体蛋白与纯化结构域之间引入切割接头，从而使得能够切割(例如通过酶促活性)切割接头并且由此去除纯化结构域。用于纯化结构域去除的这样的切割接头的合适的示例是TEV接头或SUMO接头，它们可以分别被两种不同类型的蛋白酶切割。融合蛋白的另一种有利修饰需要在载药部分与外泌体蛋白之间插入释放结构域，以使得DOI一旦已经被装载到EV(诸如外泌体)中就释放。这样的药物释放接头的合适的示例是内含子。
在进一步的方面中，本发明涉及一种如本文所述的融合蛋白与DOI之间的复合物。该复合物可以被视为两种组分(即融合蛋白和感兴趣的药物(DOI))的系统。通常，复合物(即系统)的两种组分之间的相互作用基于载药部分与DOI之间的非共价相互作用。包括在这样的复合物中的DOI可以是例如一种或多种NA试剂、一种或多种蛋白质、和/或一种或多种肽、或其任何组合，例如核糖核蛋白复合物，诸如例如Cas9-sgRNA。在NA试剂的情况下，这样的NA试剂可以选自包含以下非限制性示例的群组：单链RNA或DNA、双链RNA或DNA、寡核苷酸(诸如siRNA)、剪接转换RNA、pri-miRNA、pre-miRNA、环状RNA、piRNA、tRNA、rRNA、snRNA、IncRNA、CRISPR引导链(gRNA、sgRNA)、短发夹RNA(shRNA)、miRNA、环状二核苷酸、反义寡核苷酸、核酶、多核苷酸(诸如mRNA)、小环DNA、质粒、质粒DNA或任何其他RNA或DNA载体。特别感兴趣的是化学合成和/或包含化学修饰的核苷酸(诸如2′-O-Me、2′-O-烯丙基、2′-O-MOE、2′-F、2′-CE、2′-EA2′-FANA、LNA、CLNA、ENA、PNA、硫代磷酸酯、三环DNA、DNA混合物等)的基于核酸的试剂。
在有利的实施例中，NA可以包含至少一个天然存在的和/或至少一个人工引入的区域、结构域、组分或位点，该NA结合蛋白与它们结合。这样的区域、结构、结构域、位点或序列可以天然地存在于NA试剂中，或者可以通过例如基因工程被引入到NA试剂中。NA结合蛋白可以与其结合的天然存在的NA区域、结构或位点的非限制性示例是例如shRNA或特定核苷酸序列的发夹结构。人工引入的区域、结构、结构域、功能性、位点或序列可以基本上是NA结合蛋白可以与其结合和附着的任何这样的特征，例如特定的核苷酸序列、特定的核苷酸修饰、茎环、发夹、钝端，以及能够被引入到NA试剂(并且特别是RNA试剂)中的各种其他特征。在一个有利的实施例中，NA试剂可以编码治疗性蛋白质，例如NA试剂可以是编码感兴趣的蛋白质的信使RNA(mRNA)。治疗性蛋白基本上可以是任何类型或性质的。可以由NA(在该实施例中有利地为mRNA)货物分子编码的感兴趣的蛋白质(PoI)的非限制性示例包括以下：抗体、胞内抗体(intrabodies)、单链可变片段(scFv)、亲和体、双特异性和多特异性抗体或结合物、受体、配体、用于例如酶替代疗法或基因编辑的酶、肿瘤抑制剂、病毒或细菌抑制剂、细胞组分蛋白、DNA和/或RNA结合蛋白、DNA修复抑制剂、核酸酶、蛋白酶、整合酶、转录因子、生长因子、凋亡抑制剂和诱导剂、毒素(例如假单胞菌外毒素)、结构蛋白、神经营养因子(诸如NT3/4)、脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)及其个体亚单位(诸如2.5Sβ亚单位)、离子通道、膜转运蛋白、蛋白稳态因子、参与细胞信号传导的蛋白、翻译和转录相关蛋白、核苷酸结合蛋白、蛋白结合蛋白、脂质结合蛋白、糖胺聚糖(GAG)和GAG结合蛋白、代谢蛋白、细胞应激调节蛋白、炎症和免疫系统调节蛋白、线粒体蛋白和热休克蛋白等。在一个优选的实施例中，所编码的蛋白质是具有完整的核酸酶活性的CRISPR相关(Cas)多肽，其与RNA链相关(即携带该RNA链)，该RNA链使得Cas多肽一旦被EV递送就能够在靶细胞中执行其核酸酶活性。可替代地，在另一个优选的实施例中，Cas多肽可以是无催化活性的，以使得能够实现靶向的基因工程。另一种替代方案可以是任何其他类型的CRISPR效应子，诸如单RNA引导的核酸内切酶Cpf1。包括Cpf1是本发明的特别优选的实施例，因为它通过交错的双链断裂切割靶DNA，因此Cpf1可以从诸如氨基酸球菌属或毛螺菌属之类的物种获得。在又一个示例性的实施例中，Cas多肽也可以融合到转录激活因子(诸如P3330核心蛋白)，以特异性地诱导基因表达。附加的优选的实施例包括选自包含以下的群组的蛋白质：用于溶酶体贮积障碍的酶，例如葡糖脑苷脂酶(诸如伊米苷酶、α-半乳糖苷酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶和艾杜硫酸酯酶)、芳基硫酸酯酶、加硫酶、酸-α葡萄糖苷酶、鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、半乳糖神经酰胺酶、神经酰胺酶、α-N-乙酰半乳糖胺酶、β-半乳糖苷酶、溶酶体酸性脂肪酶、酸性鞘磷脂酶、NPC1、NPC2、肝素磺酰胺酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶、肝素-α-氨基葡萄糖苷-N-乙酰基转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸盐硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸盐硫酸酯酶、透明质酸酶、αN-乙酰神经氨酸酶、GlcNAc磷酸转移酶、粘脂蛋白1、棕榈酰蛋白硫酯酶、三肽基肽酶I、棕榈酰蛋白硫酯酶1、三肽基肽酶1、battenin、linclin、α-D-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、天冬氨酰葡糖胺酶、α-L-岩藻糖苷酶、胱氨酸转运蛋白、组织蛋白酶K、唾液酸转运蛋白、LAMP2和己糖胺酶。在其他优选的实施例中，PoI可以是例如改变炎性反应的细胞内蛋白例如表观遗传蛋白质(诸如甲基化酶和溴化结构域)，或改变肌肉功能的细胞内蛋白(例如转录因子(诸如MyoD或Myf5))，调节肌肉收缩性的蛋白质(例如肌球蛋白、肌动蛋白、钙/结合蛋白质(诸如肌钙蛋白))，或结构蛋白(诸如肌营养不良蛋白、抗肌萎缩蛋白相关蛋白、肌联蛋白、伴肌动蛋白、肌营养不良蛋白相关蛋白(诸如小肌养蛋白、互生蛋白、syncoilin、结蛋白、肌聚糖、肌营养不良蛋白聚糖、氢乙罂粟碱样蛋白(sarcospan)、聚集蛋白和/或福山蛋白(fukutin))。PoI通常是人类来源的蛋白质或肽，除非通过它们的名称、任何其他命名法或如本领域技术人员已知的那样另有说明，并且它们可以在各种公开可获得的数据库(诸如Uniprot、RCSB等)中找到。
自然地，根据本发明由NA试剂编码的所有类型的蛋白质可以被修饰、工程化、截短、衍生化和融合到各种融合配偶体。由NA试剂编码的特别有利的蛋白质(通常以mRNA的形式)包括：溶酶体酶或转运蛋白，诸如NPC1、NPC2、GBA、GLA、胱氨酸转运蛋白、Lamp2、Limp2和乙酰己糖胺酶；尿素循环酶，诸如ASS、ASL和ARG1；结构蛋白，诸如肌营养不良蛋白、小肌营养不良蛋白、微肌营养不良蛋白、抗肌萎缩蛋白相关蛋白、原纤蛋白等；遗传性代谢错误(IEM)中缺乏的酶和蛋白质、抗体、胞内抗体、抗体结构域、抗体衍生物、单链抗体、单结构域抗体、scFv、肿瘤抑制剂、转录因子、核酸酶(诸如Cas9、Cpf1、Cas6、TALENS、TALES和锌指)等。如本领域技术人员将清楚的，可以在根据本发明的本发明EV设计的帮助下装载和递送的蛋白质的列表基本上是无限制的，并且以上仅用作特别适合作为mRNA货物分子递送的蛋白质的非限制性示例。
在进一步的方面中，本发明涉及包含本文本发明的融合蛋白的EV。重要的是，在某些实施例中，EV可以以单个囊泡的形式存在，但EV通常以大量存在，即存在于包含从数千至数百万至数十亿至数万亿以及甚至更多EV的群体中。在有利的实施例中，EV包含融合蛋白，其中融合蛋白以与DOI(诸如RNA分子或蛋白质)的复合物的形式存在于EV中。在某些实施例中，DOI可以在载药部分的帮助下转运到EV中，随后在EV中和/或在靶环境中(例如在靶细胞的内部或外部)将DOI从复合物解离。因此，取决于DOI和融合蛋白的设计、性质和活性，DOI与融合蛋白之间的所述复合物可以是持久的或相对短暂的。然而，融合蛋白与DOI之间的这样的复合物的关键成功标准是DOI被有效地装载到EV中，由于纯化结构域的存在，亲和纯化能够被实现，并且DOI能够发挥其活性，例如将mRNA DOI翻译成蛋白质或将抗体DOI与其靶抗原结合。
术语“细胞外囊泡”或“EV”或“外泌体”或“基因修饰的/基因工程化的外泌体”或“修饰的外泌体”在本文中可互换使用，并且应理解为涉及可从任何形式的细胞获得的任何类型的囊泡，例如微囊泡(例如从细胞的质膜脱落的任何囊泡)、外泌体(例如源自内泌体、溶酶体和/或内溶酶体途径的任何囊泡)、凋亡体、ARMM(含有蛋白1{ARRDC1]介导的微囊泡的抑制蛋白结构域)、微粒和囊泡结构等。术语“基因修饰的”和“基因工程化的”EV表示EV源自基因修饰的/工程化的细胞，该细胞通常包含重组或外源NA和/或蛋白质产物，该产物被整合到由这些细胞产生的EV中。术语“修饰的EV”表示囊泡已使用基因或化学方法进行修饰，例如通过产生EV的细胞的基因工程或通过例如化学缀合进行修饰，以例如将部分附着于外泌体表面。EV的尺寸可能有很大变化，但EV通常具有纳米尺寸的流体动力学直径，即低于1000nm的直径。很明显，EV可以源自体内、离体和体外的任何细胞类型。优选的EV包括外泌体和微囊泡，但其他EV在各种情况下也可能是有利的。此外，所述术语还应被理解为涉及细胞外囊泡模拟物、通过例如膜挤出、声处理或其他技术等获得的基于细胞膜的囊泡。此外，当本文的教导以单数形式提及EV和/或提及EV作为离散的天然纳米颗粒样囊泡时，应理解所有这样的教导对于多种EV和EV的群体同等相关且适用于该多种EV和EV的群体。
如上所述，融合蛋白的纯化部分优选地至少部分地存在于EV的外部，以使得能够实现例如被工程化为装载有DOI的EV的基于亲和力的纯化。通常，融合蛋白的纯化部分被设计成能够与纯化配体、纯化基质或纯化设备或机器(可互换地联合被称为纯化结合物或纯化配体)相互作用。这样的纯化配体可以是与特定纯化部分以高特异性相互作用的特异性配体(例如，与抗体的Fc-部分相互作用的Fc结合多肽(诸如Z结构域)，其中所述抗体附着于色谱基质)，或者可以是例如与各种金属原子(例如镍原子)相互作用的His标签。
在高度优选的实施例中，根据本发明的EV是外泌体、微囊泡(MV)或从内泌体、内溶酶体和/或溶酶体途径或从亲代细胞的质膜分泌的任何其他类型的囊泡。一般而言，本发明涉及由细胞分泌、产生和/或衍生的任何类型的囊泡结构，包括但不限于外泌体、微囊泡、ARRDC1介导的微囊泡(ARMM)、挤出的囊泡、挤出的细胞和/或细胞膜、各种基于脂质的囊泡，包括EV与脂质之间的杂化物等。
在附加的方面中，本发明涉及一种编码本文融合蛋白的多核苷酸。多核苷酸构建体可以以各种不同的形式存在和/或存在于不同的载体中。例如，多核苷酸可以基本上是线性的、环状的和/或具有任何二级和/或三级和/或更高阶的结构。此外，本发明还涉及包含该多核苷酸的载体，例如载体，诸如质粒、任何环状或线性DNA多核苷酸、小环、病毒(诸如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒)、mRNA和/或修饰的mRNA。
在进一步的方面中，本发明涉及包含(i)至少一种根据本发明的多核苷酸构建体和/或(ii)至少一种根据本发明的融合蛋白的细胞。此外，本发明还涉及包含根据本发明的EV(即当EV形成但尚未从产生EV的细胞释放时的EV)的细胞。产生EV的细胞可以以例如原代细胞、细胞系、存在于多细胞生物中的细胞或基本上任何其他类型的细胞源和产生EV的细胞材料的形式存在。术语“源细胞”或“EV源细胞”或“亲代细胞”或“细胞源”或“产生EV的细胞”或任何其他类似术语可以被理解为涉及能够在合适的条件下产生EV的任何类型的细胞，例如在悬浮培养中或在贴壁培养中或任何在其他类型的培养系统中。根据本发明的源细胞还可以包括在体内产生外泌体的细胞。根据本发明的源细胞可以选自宽范围的细胞和细胞系，其可以在悬浮或贴壁培养物中生长或适于悬浮生长。本发明的源细胞可以选自包含以下的群组：间充质干细胞或基质细胞(可从例如骨髓、脂肪组织、华顿氏胶、围产期组织、胎盘、牙芽、脐带血、皮肤组织等获得)、成纤维细胞、羊膜细胞(并且更具体地任选地表达各种早期标记物的羊膜上皮细胞)，髓样抑制细胞、M2极化的巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞、成纤维细胞等。特别感兴趣的细胞系包括人脐带内皮细胞(HUVEC)、人胚胎肾(HEK)细胞、内皮细胞系(诸如微血管或淋巴内皮细胞)、红细胞、红系祖细胞、软骨细胞、不同来源的MSC、羊膜细胞、羊膜上皮(AE)细胞、通过羊膜穿刺术获得的或来自胎盘的任何细胞、来自气道或肺泡的上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞等。此外，免疫细胞(诸如B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞(DC))也在本发明的范围内，并且基本上任何类型的能够产生EV的细胞也涵盖在本文中。通常，EV基本上可以源自任何细胞源，无论是原代细胞源还是永生化的细胞系。EV源细胞可以是任何胚胎、胎儿和成人体细胞干细胞类型，包括诱导的多能干细胞(iPSC)和通过任何方法获得的其他干细胞。当治疗神经系统疾病时，人们可以考虑利用例如原代神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和神经祖细胞作为源细胞。源细胞可以是待治疗的患者的同种异体、自体或甚至异种性质，即细胞可以来自患者自身或来自不相关的、匹配的或不匹配的供体。在某些情况下，从医学角度来看，同种异体细胞可能是优选的，因为它们可以提供免疫调节作用，该免疫调节作用可能无法从患有某种适应症的患者的自体细胞中获得。例如，在治疗炎性或退行性疾病的背景下，同种异体MSC或AE作为产生外泌体的细胞源可能非常有益，这是因为它们的EV并且特别是它们的外泌体的固有的免疫调节作用。特别感兴趣的细胞系包括人脐带内皮细胞(HUVEC)、人胚胎肾(HEK)细胞(诸如HEK293细胞、HEK293T细胞、无血清HEK293细胞、悬浮HEK293细胞)、内皮细胞系(诸如微血管或淋巴内皮细胞)、红细胞、红系祖细胞、软骨细胞、不同来源的MSC、羊膜细胞、羊膜上皮(AE)细胞、通过羊膜穿刺术获得的或来自胎盘的任何细胞、气道或肺泡上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞等。
此外，根据本发明的细胞通常可以包含编码本文的三结构域融合蛋白的多核苷酸以及编码DOI的另一种或相同的多核苷酸。因此，源细胞可以被转染以便产生单一、双重或多重稳定的源细胞系。单一稳定的细胞系是有利的，因为EV的产生通过仅需要转染单一构建体被简化。例如，在一个实施例中，DOI可以由插入到产生EV的细胞中的多核苷酸构建体来编码。DOI可以例如在有利的实施例中是NA试剂，诸如mRNA、短发夹RNA、miRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、反义寡核苷酸、引导RNA、单引导RNA、环状RNA、piRNA、tRNA、rRNA、snRNA、IncRNA、核酶、DNA和/或其任何组合或衍生物。可替代地，DOI可以是例如蛋白质和/或肽的形式，该蛋白质和/或肽然后由多核苷酸构建体编码，该多核苷酸构建体可以是与编码本文融合蛋白的构建体相同或不同的构建体。
在附加的方面中，本发明涉及用于产生包含根据本发明的融合蛋白的EV的方法。该方法通常可以包含以下步骤：(i)将编码融合蛋白(即，至少包含外泌体蛋白、纯化结构域和载药部分的融合蛋白)的多核苷酸引入到产生EV的细胞中；以及(ii)允许该产生EV的细胞产生包含该融合蛋白的EV。在进一步的方面中，本发明还涉及一种用于产生包含DOI的EV的方法，该方法包含以下步骤：(i)将编码融合蛋白的多核苷酸和编码DOI的多核苷酸引入到产生EV的细胞中；以及(ii)允许该产生EV的细胞产生包含如由该多核苷酸编码的融合蛋白和DOI的EV，其中该融合蛋白的载药部分与DOI结合并将其转运到EV中。如上所述，编码DOI的多核苷酸可以编码DOI，该DOI可以为例如蛋白质、肽、mRNA、短发夹RNA、miRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、反义寡核苷酸、引导RNA、单引导RNA、环状RNA、piRNA、tRNA、rRNA、snRNA、IncRNA、核酶、DNA和/或其任何组合或衍生物。
优选地，用编码本发明的融合蛋白的构建体稳定地转染源细胞，使得产生稳定的细胞系。这有利地导致具有一致的质量和产量的EV的产生。可以使用用于将多核苷酸引入到细胞中的基本上任何非病毒或病毒方法，用至少一种多核苷酸构建体对产生EV的细胞进行基因修饰。可以使用用于将多核苷酸引入到细胞中的基本上任何非病毒或病毒方法将编码融合蛋白的多核苷酸和编码DOI的多核苷酸引入到产生EV的细胞中。用于引入多核苷酸的合适的方法包括使用聚阳离子(诸如PEI)的转染、基于脂质(诸如脂质体(RTM))的转染试剂、慢病毒转导、CRISPR-Cas引导的插入、Flp-In系统、转座子系统、电穿孔、DEAE-葡聚糖转染和磷酸钙转染。用于将多核苷酸引入到产生EV的细胞中的方法的选择将取决于各种参数，包括细胞源的选择、多核苷酸载体的性质和特征(例如，如果载体是质粒或小环或例如线性DNA多核苷酸或mRNA)，以及所需的顺应性和控制的水平。类似地，使用细胞系开发领域中众所周知的技术(包括hTERT介导的永生化、转录因子永生化、E1/E2永生化或其他病毒介导的永生化技术等)，可以实现产生EV的细胞的永生化，以产生稳定的细胞系。
在进一步的方面中，本发明涉及一种纯化包含DOI的EV的方法。该方法通常包含以下步骤：(i)提供包含根据本发明的融合蛋白的EV，(ii)允许包含在EV中的融合蛋白的纯化结构域结合纯化配体，以使得能够分离和/或纯化EV，以及(iii)去除未与纯化配体结合的EV。
在优选的实施例中，纯化配体附着于固相，以使得能够实现例如色谱法和/或基于膜的纯化。亲和色谱法通常基于固定化的配体与靶生物分子上(在这种情况下在靶EV或外泌体上)的结构元件之间的高度选择性的相互作用。亲和色谱法的高选择性可以由例如层析基质上的纯化配体与形成包含在本发明的EV中的融合蛋白的一部分的纯化结构域之间的多分子相互作用(包括氢键、疏水相互作用、离子相互作用和/或范德华相互作用)提供。用于含有融合蛋白的EV的基于亲和力的纯化的合适的纯化结构域包括受体、抗体结合多肽、Fc结合多肽、多组氨酸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、钙调蛋白结合肽(CBP)、蛋白内含子-几丁质结合结构域(I-CBD)、链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、FLAG表位标签、HA表位标签、T7标签、S-标签、CLIP标签、DHFR、纤维素结合结构域，以及其任何组合、衍生物、结构域或部分。在特别有利的实施例中，纯化结构域是Fc结合多肽，其可以选自包含以下的群组：蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、蛋白LG、Z结构域、ZZ结构域、人FCGRI、人FCGR2A、人FCGR2B、人FCGR2C、人FCGR3A、人FCGR3B、人FCGRB、人FCAMR、人FCERA、人FCAR、小鼠FCGRI、小鼠FCGRIIB、小鼠FCGRIII、小鼠FCGRIV、小鼠FCGRn、FcIII肽，以及其任何组合、衍生物、结构域或部分。如上所述，除了纯化结构域之外，本发明的融合蛋白可以包括切割位点，这使得能够在被例如亲和色谱柱上的纯化配体捕获后去除纯化结构域本身。在这样的切割反应之后，可以使用例如尺寸排阻色谱法(使用例如Captocore 700树脂，以允许珠洗脱色谱法)或带电荷的膜/离子交换色谱法(例如使用Sartobind Q或Mustang Q离子交换剂)去除催化切割的酶。
一般而言，本发明的工程化的EV的亲和纯化将导致非常纯的、高度药物富集的EV群体。然而，在亲和纯化步骤的上游和/或下游均可以包括附加的分离、纯化和/或抛光步骤。合适的互补纯化步骤包括尺寸排阻液相色谱法、珠洗脱液相色谱法、离子交换纯化(诸如阴离子交换)、带电荷的膜分离和本领域中使用的各种其他纯化和/或抛光策略。
在附加的方面中，本发明涉及包含如本文所述的EV的药物组合物。通常，EV由产生EV的细胞源产生，这也导致DOI并入到EV中。然后通常将EV(即EV的群体)配制在药学上可接受的组合物中，该组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂或类似物。此外，EV和/或药物组合物可以用于医学中以治疗各种疾病、障碍、小病或疾病。更具体地，本发明涉及在预防和/或治疗和/或减轻多种疾病中的用途。疾病和病症的非限制性示例包括以下非限制性示例：克罗恩病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、结节病、特发性肺纤维化、银屑病、肿瘤坏死因子(TNF)受体相关周期性综合征(TRAPS)、白介素-1受体拮抗剂缺乏(DIRA)、子宫内膜异位、自身免疫性肝炎、硬皮病、肌炎、中风、急性脊髓损伤、血管炎、格林-巴利综合征、急性心肌梗死、ARDS、脓毒症、脑膜炎、脑炎、肝衰竭、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、肾衰竭、心力衰竭或任何急性或慢性器官衰竭以及相关的基础病因、移植物抗宿主病、杜氏肌营养不良和其他肌营养不良、所有溶酶体贮积病(诸如I型、II型和/或III型戈谢病，法布里病，MPSI、II(亨特综合征)和III，A、B和C型尼曼匹克症，庞贝病，胱氨酸病等)、尿素循环障碍(诸如N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏、氨基甲酰磷酸合成酶缺乏、鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症、瓜氨酸血症(精氨酸琥珀酸合成酶缺乏)、精氨酸琥珀酸尿症(精氨酸琥珀酸裂解酶缺乏)、精氨酸血症(精氨酸酶缺乏)、高鸟氨酸血症、高氨血症、高瓜氨酸尿症(HHH)综合征(线粒体鸟氨酸转运蛋白缺乏)、瓜氨酸血症II(柠檬素(一种天冬氨酸谷氨酸转运蛋白)缺乏)、赖氨酸尿蛋白不耐受(y+L氨基酸转运蛋白1突变)、乳清酸尿症(尿苷单磷酸合成酶UMPS缺乏))、神经退行性疾病(包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、GBA相关帕金森氏病、亨廷顿氏病和其他三核苷酸重复相关疾病)、痴呆、ALS、癌症诱导的恶病质、厌食症、2型糖尿病和各种癌症。实际上所有类型的癌症都是本发明的相关疾病靶，例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、小脑或脑、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、脑干神经胶质瘤、脑癌、脑肿瘤(小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤(儿童期、胃肠道)、不明原发癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生性障碍、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌(眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤)、胆囊癌、胃(Gastric)(胃(Stomach))癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞瘤(颅外、性腺外或卵巢)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤(脑干神经胶质瘤、脑星形细胞瘤、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤)、胃类癌、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病((急性淋巴细胞性(也被称为急性淋巴细胞白血病)、急性髓性(也被称为急性髓性白血病)、慢性淋巴细胞性(也被称为慢性淋巴细胞白血病)、慢性髓性(也被称为慢性髓性白血病)、毛细胞白血病))、唇癌和口腔癌、腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发性)、肺癌(非小细胞、小细胞)、淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、髓母细胞瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、具有隐匿性原发性的转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、髓性白血病、慢性髓性白血病(急性、慢性)、骨髓瘤、鼻腔鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮-间质肿瘤)、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(尤文氏家族肿瘤肉瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤)、塞扎里综合征、皮肤癌(非黑色素瘤、黑色素瘤)、小肠癌、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症和/或肾母细胞瘤。
根据本发明的EV可以通过各种不同的给药途径被施用给人或动物受试者，该给药途径为例如耳(耳)、颊、结膜、皮肤、牙科、电渗析、宫颈内、窦内、气管内、肠内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸润、间质、腹内、羊膜内、动脉内、关节内、胆管内、支气管内、囊内(intrabursal)、心内、软骨内、尾内(intracaudal)、海绵体内、腔内、脑内、侧脑室内、脑池内、角膜内、冠内(牙科)、冠状动脉内、海绵体内(intracorporus cavernosum)、皮内、椎间盘内、导管内、十二指肠内、硬膜内、表皮内、食管内、胃内、牙龈内、回肠内、病变内、腔内、淋巴管内、髓内、脑膜内、肌内、眼内、卵巢内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、窦内、脊柱内、滑膜内、腱内、睾丸内、鞘内、胸内、小管内、瘤内、鼓室内、子宫内、血管内、静脉内、静脉推注、静脉滴注、心室内、膀胱内、玻璃体内、离子电渗疗法、冲洗、喉、鼻、鼻胃、封闭敷裹技术、眼科、口腔、口咽、其他、肠胃外、经皮、关节周、硬膜外、神经周、牙周、直肠、呼吸(吸入)、眼球后、软组织、蛛网膜下、结膜下、皮下、舌下、粘膜下、局部、透皮、经粘膜、经胎盘、经气管、经鼓室、输尿管、尿道、和/或阴道给药，和/或上述给药途径的任何组合，其通常取决于待治疗的疾病和/或EV的特征、所讨论的NA货物分子或EV群体本身。
本发明及其各个方面、实施例、替代方案和变型现在将通过所附的示例进一步举例说明，在不脱离本发明的范围和主旨的情况下，这些示例自然也可以进行相当大的修改。
示例1：装载有mRNA的MSC衍生的外泌体的亲和纯化
华顿氏胶来源的MSC在常规的组织培养瓶中培养，并且使用PEI转染进行瞬时转染，以使得能够装载和表达包含以下结构域的融合蛋白：外泌体蛋白CD63、作为纯化结构域的Z结构域(从葡萄球菌蛋白A获得)和作为能够将mRNA结合并装载到外泌体中的载药部分的Cas6蛋白。还将WJ-MSC与编码mRNA(其编码纳米荧光素酶)的构建体共转染。在图1中示意性地示出了工程化的EV。
在48小时后收获来自转染的细胞的含EV的上清液。出于比较的目的，使用两种不同的下游纯化途径来分离和纯化EV：(1)切向流过滤(TFF)和使用Captocor柱(通用电气医疗生命科学(GE Healthcare Life Sciences))的珠洗脱液相色谱法的组合，以及(2)切向流过滤(TFF)和IgG Sepharose 6快速流动亲和树脂(通用电气医疗生命科学)的组合。使用方法(1)，含EV的培养基被收集，并且以300g经受低速旋转5分钟，随后以2000g旋转10分钟，以去除较大的颗粒和细胞碎片。然后上清液用0.22μm注射器过滤器过滤，并且经受不同的纯化方法。使用带有100kDa截止过滤器的Vivaflow 50R切向流(TFF)装置(赛多利斯(Sartorius))或带有100或300kDa截止中空纤维过滤器的KR2i TFF系统(仕必纯(SpectrumLabs))进行TFF。随后将预浓缩的介质装载到珠洗脱液柱(HiTrap Capto Core700柱，通用电气医疗生命科学)上，其连接到
Figure BDA0002830231470000202
plus(通用电气医疗生命科学)。用于柱平衡、样品装载和柱原位清洗程序的流速设置是根据制造商的说明选择的。样品根据UV吸光度色谱图被收集，并且使用Amicon Ultra-1510kDa分子量截止旋转过滤器(密理博(Millipore))浓缩至最终体积。
使用方法(2)，如上所述进行TFF步骤，随后使EV制剂运行通过IgG Sepharose6快速流动亲和树脂(通用电气医疗生命科学)。将细胞培养上清液装载到IgG Sepharose FastFlow 6(其被连接至
Figure BDA0002830231470000201
plus)上。用于柱平衡、样品装载和柱清洗的流速设置是根据制造商的说明选择的。使用含有005M的Tris-HCl和0.15M的NaCl的结合缓冲液，其中pH设置为7.6。使用pH为约6的包含0.5M的HAc的洗脱缓冲液来洗脱包含Z结构域纯化部分的IgG结合的EV。还单独地评估了使用分离的Z结构域本身的竞争性洗脱，具有良好的结果。样品根据UV吸光度色谱图进行收集，并且使用Amicon Ultra-1510kDa分子量截止旋转过滤器(密理博)浓缩至100μl的最终体积，并在-80℃下储存以用于进一步的下游分析。
使用qPCR评估所得的EV群体中纳米荧光素酶mRNA的富集。使用标准方法从1E10EV中提取RNA，并且使用oligo dT进行逆转录，以评估全长RNA分子的量。使用qPCR通过绝对定量来计算装载的RNA分子的数目。使用标准的蛋白质印迹法在细胞和EV中检测CD63-ZZ-Cas6的表达。使用基于TFF和Captocor的下游纯化，在存在于最终群体中的约15％的EV中存在mRNA分子。使用将TFF和IgG Sepharose 6树脂结合的纯化方法，EV的最终群体具有存在于所有EV的约65％中的纳米荧光素酶mRNA，因此导致在最终产品中的约4至5倍的更高的药物富集。
还在体外摄取测定中评估了WJ-MSC外泌体。简而言之，将Huh7细胞接种在细胞培养板中，随后暴露于装载有mRNA的工程化的外泌体持续4小时。通过收获细胞并测量总生物发光输出来测量由纳米荧光素酶mRNA产生的生物发光。来自用使用IgG Sepharose 6柱纯化的工程化的EV处理的细胞的信号比来自使用TFF-Captocor纯化方法纯化的EV的信号高约5倍(图2)。
示例2：装载有mRNA的HEK衍生的外泌体的亲和纯化
人胚胎肾细胞293(HEK293)用慢病毒系统稳定地转导，以使得能够表达包含以下结构域的融合蛋白：外泌体蛋白Lamp2B、作为N-末端中的纯化结构域的六聚组氨酸(H6)标签和作为载药部分的来自Tar RNA结合蛋白2(TBPR2)的双链RNA结合结构域(RBD)。还评估了包含可自切割的蛋白内含子蛋白元件的变体融合蛋白，其中还评估了在Lamp2b与RBD之间引入的内含子。HEK293细胞还与编码对于C-MYC癌基因特异性的shRNA的质粒瞬时共转染。融合蛋白的TRBP2载药结构域使得能够将shRNA装载到外泌体中，随后是shRNA药物货物的内含子介导的释放。
在质粒转染48小时后，收获来自转染的细胞的含EV的上清液。出于比较的目的，使用两种不同的下游纯化途径来分离和纯化EV：(1)切向流过滤(TFF)和使用Captocor柱(通用电气医疗生命科学)的珠洗脱液相色谱法的组合，以及(2)切向流过滤(TFF)和带HisTrapHP组氨酸标签的蛋白质纯化柱(通用电气医疗生命科学)的组合。使用方法(1)，含EV的培养基被收集，并且以300g经受低速旋转5分钟，随后以2000g旋转10分钟，以去除较大的颗粒和细胞碎片。然后上清液用0.22μm注射器过滤器过滤，并且经受不同的纯化方法。使用带有100kDa截止过滤器的Vivaflow 50R切向流(TFF)装置(赛多利斯)或带有100或300kDa截止中空纤维过滤器的KR2i TFF系统(仕必纯)进行TFF。随后将预浓缩的介质装载到珠洗脱液柱(HiTrap Capto Core 700柱，通用电气医疗生命科学)上，其连接到
Figure BDA0002830231470000211
plus(通用电气医疗生命科学)。用于柱平衡、样品装载和柱原位清洗程序的流速设置是根据制造商的说明选择的。样品根据UV吸光度色谱图被收集，并且使用Amicon Ultra-15 10kDa分子量截止旋转过滤器(密理博)浓缩至最终体积。
使用方法(2)，如上所述进行TFF步骤，随后使EV制剂运行通过装有Ni Sepharose高性能亲和树脂的带Histrap HP组氨酸标签的蛋白质纯化柱(通用电气医疗生命科学)。本质上，该树脂与带有偶联的螯合基团的琼脂糖珠高度交联(该螯合基团预装入有镍(Ni-NTA))。柱平衡、样品装载和柱清洗方案是根据制造商的说明选择的。存在于工程化的EV外部的组氨酸标签在20mM的磷酸钠、300mM的氯化钠(在PBS中)和10mM的咪唑(pH 74)的结合缓冲液下与预装入的镍选择性地结合。使用含有在PBS(pH 7.4)中的20至40mM的咪唑的缓冲液来洗涤柱。然后，使用含有在PBS(pH 74)中的300mM的咪唑的洗脱缓冲液从HisTrap柱中洗脱带His标签的EV。
作为两种替代方法，将融合蛋白修饰为包含在组氨酸与外泌体蛋白LAMP2B之间引入的TEV接头肽或SUMO接头肽(图3示出了EV的示意图)。这允许我们对捕获的EV使用基于非咪唑的洗脱策略，即所谓的靶向的蛋白水解剪切程序。因此，在带polyHis标签的EV的Ni-NTA亲和力结合之后，使用洗脱缓冲液，该洗脱缓冲液含有在0.1至0.5M的NaCl中的TEV或SUMO蛋白酶(基于酶促活性确定的浓度)(对于TEV蛋白酶切割，以及40mM的Tris/HClpH7.5、2mM的MgCl2、250mM的蔗糖，并且对于SUMO蛋白酶介导的切割，以及25mM的Tris-HCl(pH 8.0)、0.1％的Igepal、50％(v/v)的甘油)，该洗脱缓冲液触发了作为蛋白水解切割的结果的捕获的工程化的EV的洗脱。
为了定量装载的shRNA的量，使用标准方法从1E10 EV中提取RNA。为了绝对定量外泌体中的抗c-myc shRNA，制备了合成的shRNA的标准曲线。c-myc shRNA的量通过由NTA确定的颗粒的数目或通过由Micro BCA蛋白测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific))测量的蛋白质的总量进行标准化。使用蛋白质印迹法在细胞和EV两者中检测Hisx6-Lamp2b-TRBP2的表达。使用基于TFF和Captocor的下游纯化方法，在存在于最终群体中的约45％的EV中存在shRNA分子。使用将TFF与HisTrap HP纯化柱结合的纯化方法，EV的最终群体具有存在于所有EV的约90％中的c-my shRNA，因此导致在最终产品中的约2倍的更高的药物富集。类似地，用包含载药部分、外泌体蛋白、SUMO或TEV切割接头和poly-His的融合蛋白修饰的EV显示出所讨论的shRNA的类似富集，然而，使用这两种构建体使得能够酶促去除纯化结构域(在这种情况下为His标签)。
还在体外测定中评估了工程化的HEK293 EV。简而言之，将Huh7细胞接种在细胞培养板中，随后暴露于装载有shRNA的工程化的EV持续4小时。通过收获细胞并使用qPCR评估敲除来评估c-myc RNA的减少。当用使用HisTrap HP纯化柱纯化的EV处理细胞时检测到的c-myc RNA的量比来自用使用TFF-Captocor纯化方法纯化的EV处理的细胞的RNA低约50％(数据未示出)。
示例3：装载有sgRNA的ASC衍生的外泌体的亲和纯化
将人羊膜上皮干细胞(hAE)在24个具有圆柱形底部的深孔板中培养，并且使用PEI进行瞬时转染，以使得能够表达融合蛋白，该融合蛋白包含作为载药蛋白的Cas9(来自化脓性链球菌)、外泌体蛋白syntenin、将融合蛋白锚定到EV膜中的跨膜gp130结构域和麦芽糖结合蛋白(MBP)标签。AE细胞还与编码抗IGF2BP1基因的sgRNA的质粒共转染。两种质粒的共表达使得sgRNA能够通过Cas9结合并且RNA货物能够装载到EV中。
在48小时后收获来自转染的细胞的含EV的上清液。如示例1和示例2，使用两种不同的下游纯化工艺来分离和纯化EV((1)结合珠洗脱LC的TFF和(2)TFF，随后是MBPTrap HP亲和树脂(通用电气医疗生命科学)。使用第二种方法，如上所述进行TFF步骤，随后使EV制剂运行通过预包装有糊精sepharose高性能亲和树脂的MBP Trap高纯化柱(通用电气医疗生命科学)。柱平衡、样品装载和柱清洗是根据制造商的说明选择的。在20mM的Tris-HCl、200mM的NaCl、1mM的EDTA(pH7.4)的结合缓冲液下，存在于工程化的EV外部上的MBP标签与预包装的糊精sepharasoe选择性地结合。然后使用含有10mM的麦芽糖的洗脱缓冲液从MBPTrap HP柱中洗脱带MBP标签的EV。如示例2中，在替代的融合蛋白设计中，包括TEV肽接头以使得能够酶促去除MBP标签。
为了定量装载的sgRNA的量，从1E10 EV中提取RNA，随后针对合成的sgRNA的标准曲线进行定量。IGF2BP1 sgRNA的量通过由NTA确定的颗粒的数目或通过由Micro BCA蛋白质测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司)测量的蛋白质的总量进行标准化。使用蛋白质印迹法在细胞和EV两者中检测MBP-gpr130-syntenin-Cas9的表达。结合珠洗脱色谱法的TFF导致在存在于最终群体中的约40％的EV中存在sgRNA货物分子。使用将TFF和基于MBP的亲和捕获结合的纯化方法(并且在替代的方法中，随后酶促去除MBP标签)，EV的最终群体具有存在于所有EV的约90％中的IGF2BP1 sgRNA，因此导致在最终EV群体中的高于约2倍的更高的药物货物装载(图4)。

Claims (36)

1.一种融合蛋白，包含(i)EV多肽、(ii)纯化结构域和(iii)载药部分。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述载药部分是核酸(NA)结合蛋白或蛋白结合结构域。
3.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述EV多肽选自包含以下的群组：CD9、CD53、CD63、CD81、CD82、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71、CD133、CD138、CD235a、ALIX、Syntenin-1、Syntenin-2、Lamp2b、TSPAN8、syndecan-1、syndecan-2、syndecan-3、syndecan-4、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受体、白介素受体、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II组分、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、ARRDC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B以及任何其他EV多肽，以及其任何组合、衍生物、结构域、突变的变体和/或区域。
4.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述EV多肽是跨膜或膜相关多肽。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述跨膜或膜相关EV多肽选自包含以下的群组：CD63、CD81、CD9、CD82、CD44、CD47、CD55、LAMP2B、ICAM、整联蛋白以及任何其他EV多肽，以及其任何组合、衍生物、结构域、突变的变体或区域。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的融合蛋白，其中所述EV多肽是融合到将所述融合蛋白定位于所述外泌体膜的跨膜或膜相关多肽的非跨膜多肽。
7.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中所述非跨膜EV多肽融合到将所述融合蛋白定位于所述外泌体膜的跨膜多肽。
8.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述NA结合蛋白选自包含以下的群组：mRNA结合蛋白、miRNA结合蛋白、pre-rRNA结合蛋白、tRNA结合蛋白、小核或核仁RNA结合蛋白、非编码RNA结合蛋白、转录因子、核酸酶、RISC蛋白，以及其任何组合、衍生物、结构域或部分。
9.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述NA结合蛋白是以下中的任何一个：PUF、PUF531、PUFx2、DDX3X、EEF2、EEF1A1、HNRNPK、HNRNPM、HNRNPA2B1、HNRNHPH1、HNRNPD、HNRNPU、HNRNPUL1、NSUN2、Cas6、Cas13、Cas9、WDR1、HSPA8、HSP90AB1、MVP、PCB1、MOCS3、DARS、ELC2、EPRS、GNB2L1、IARS、NCL、RARS、RPL12、RPS18、RPS3、RUVBL1、TUFM、hnRNPA1、hnRNPA2B1、DDX4、ADAD1、DAZL、ELAVL4、ELAVL1、IGF2BP3、HNRNPQ、RBFOX1、RBFOX2、U1A、PPR家族、ZRANB2、NUSA、IGF2BP1、IGF2BP2、Lin28、KSRP、SAMD4A、TDP43、FUS、FMR1、FXR1、FXR2、EIF4A1-3、MS2外壳蛋白、DEAD、KH、GTP_EFTU、dsrm、G-patch、IBN_N、SAP、TUDOR、RnaseA、MMR-HSR1、KOW、RnaseT、MIF4G、zf-RanBP、NTF2、PAZ、RBM1CTR、PAM2、Xpo1、Piwi、CSD，以及其任何组合、衍生物、结构域、区域、位点、突变的变体或部分。
10.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述纯化结构域是受体、抗体结合多肽、Fc结合多肽、多组氨酸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、钙调蛋白结合肽(CBP)、蛋白内含子-几丁质结合结构域(I-CBD)、链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、FLAG表位标签、HA表位标签、T7标签、S-标签、CLIP、DHFR、纤维素结合结构域，以及其任何组合、衍生物、结构域或部分。
11.根据权利要求10所述的融合蛋白，其中所述Fc结合多肽选自包含以下的群组：蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、蛋白LG、Z结构域、ZZ结构域、人FCGRI、人FCGR2A、人FCGR2B、人FCGR2C、人FCGR3A、人FCGR3B、人FCGRB、人FCAMR、人FCERA、人FCAR、小鼠FCGRI、小鼠FCGRIIB、小鼠FCGRIII、小鼠FCGRIV、小鼠FCGRn、FcIII肽，以及其任何组合、衍生物、结构域或部分。
12.一种根据权利要求1至11中任一项所述的融合蛋白与感兴趣的药物之间的复合物，其中所述融合蛋白的所述载药部分能够结合所述感兴趣的药物。
13.根据权利要求12所述的复合物，其中所述感兴趣的药物是NA试剂、蛋白质和/或肽。
14.根据权利要求12至13中任一项所述的复合物，其中所述NA试剂选自包含以下的群组：shRNA、miRNA、mRNA、gRNA、sgRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、环状RNA、piRNA、tRNA、rRNA、snRNA、IncRNA、反义寡核苷酸、核酶、双链DNA、单链DNA、小环DNA和/或质粒DNA。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的复合物，其中所述NA试剂包含至少一个天然存在的或人工引入的区域或位点，所述NA结合蛋白与所述区域或位点结合。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的复合物，其中所述NA试剂编码治疗性蛋白。
17.根据权利要求16所述的复合物，其中所述治疗性蛋白选自包含以下的群组：抗体、抗体片段、抗体衍生物、单结构域抗体、胞内抗体、单链可变片段、亲和体、酶、转运蛋白、肿瘤抑制剂、病毒或细菌抑制剂、细胞组分蛋白、DNA和/或RNA结合蛋白、DNA修复抑制剂、核酸酶、蛋白酶、整合酶、转录因子、生长因子、凋亡抑制剂和诱导剂、毒素、结构蛋白、神经营养因子、膜转运蛋白、核苷酸结合蛋白、热休克蛋白、CRISPR相关蛋白，以及其任何组合。
18.一种细胞外囊泡(EV)，包含根据权利要求1至11中任一项所述的融合蛋白。
19.根据权利要求18所述的EV，其中所述融合蛋白以与感兴趣的药物的复合物的形式存在。
20.根据权利要求19所述的EV，其中所述感兴趣的药物在所述EV中和/或在靶环境中从所述复合物解离。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的EV，其中所述融合蛋白的所述纯化部分至少部分地存在于所述EV的外部。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的EV，其中所述融合蛋白的所述纯化部分能够与纯化配体相互作用。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的EV，其中所述EV是外泌体。
24.一种多核苷酸，编码根据权利要求1至11中任一项所述的融合蛋白。
25.一种细胞，包含根据权利要求24所述的多核苷酸和/或根据权利要求1至11中任一项所述的融合蛋白。
26.根据权利要求25所述的细胞，进一步包含编码感兴趣的药物的多核苷酸。
27.根据权利要求25至26中任一项所述的细胞，其中编码感兴趣的药物的所述多核苷酸编码蛋白质、肽、mRNA、短发夹RNA、miRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、反义寡核苷酸、引导RNA、单引导RNA、环状RNA、piRNA、tRNA、rRNA、snRNA、IncRNA、核酶、DNA和/或其任何组合或衍生物。
28.一种用于产生包含根据权利要求1至11中任一项所述的融合蛋白的EV的方法，所述方法包含以下步骤：
(i)将根据权利要求24所述的多核苷酸引入到产生EV的细胞中；以及，
(ii)允许所述产生EV的细胞产生包含所述融合蛋白的EV。
29.一种用于产生包含感兴趣的药物的EV的方法，所述方法包含以下步骤：
(i)将根据权利要求24所述的多核苷酸和编码感兴趣的药物的多核苷酸引入到产生EV的细胞中；以及，
(ii)允许所述产生EV的细胞产生包含所述融合蛋白的EV，其中所述融合蛋白的载药部分与所述感兴趣的药物结合并将其转运到EV中。
30.根据权利要求29所述的方法，其中编码感兴趣的药物的所述多核苷酸编码蛋白质、肽、mRNA、短发夹RNA、miRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、反义寡核苷酸、引导RNA、单引导RNA、环状RNA、piRNA、tRNA、rRNA、snRNA、IncRNA、核酶、DNA和/或其任何组合或衍生物。
31.根据权利要求29所述的方法，其中使用非病毒或病毒转染将根据权利要求24所述的多核苷酸和/或编码感兴趣的药物的多核苷酸引入到所述产生EV的细胞中。
32.一种纯化包含感兴趣的药物的EV的方法，所述方法包含以下步骤：
(I)提供根据权利要求18至23中任一项所述的EV；
(ii)允许包含在所述EV中的融合蛋白的纯化部分结合纯化配体；以及，
(iii)去除未与所述纯化配体结合的EV。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述纯化配体附着于固相。
34.根据权利要求32至33中任一项所述的方法，其中所述纯化使用色谱法进行。
35.一种药物组合物，包含根据权利要求18至23中任一项所述的EV和药学上可接受的载体。
36.根据权利要求35所述的药物组合物或根据权利要求18至23中任一项所述的EV，用于医学中。
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