CN109715211B - 包含治疗性多肽的外来体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于细胞外囊泡(EV)介导的治疗性多肽的细胞内和膜内递送的本发明释放机制。更具体地说，本发明涉及包含多肽构建体的EV，该多肽构建体包含可释放地附着于外来体多肽的治疗性多肽。此外，本发明涉及与所述本发明EV有关的制造方法、药物组合物、医疗用途和应用，以及各种其他实施方案。

Description

包含治疗性多肽的外来体
技术领域
本发明涉及细胞外囊泡（EV）疗法，其中EV包含至少一种目标多肽（PoI）。
背景技术
抗体与其抗原之间精密的特异性，或任何类型的基于蛋白的生物药物与其靶标之间精密的特异性，是治疗性干预的理想基础。然而，由于大分子物质进入细胞内环境的途径受到高度限制，抗体和蛋白生物制剂的治疗性应用受限于细胞外靶标。各种载体被研究用于将治疗性多肽递送至细胞内部，且最近的研究已显示出例如细胞渗透性肽(例如Dinca等人的综述，Int J Mol Sci，2016)和靶向现有转运途径的双特异性抗体(Yu et al., SciTrans Med, 2014)都具有实用性。
在基本专利申请WO2013/084000中，采用了完全不同的方法，其公开了外来体在生物治疗药物的细胞内递送的应用。更具体地说，WO2013/084000公开了基于多肽的疗法是如何可通过外源性和内源性载入技术被载入到外来体中。外来体的外源性载入可通过将目标多肽电穿孔或转染至从母细胞中分离后的外来体中实施，而内源性载入则是基于使用编码目标多肽的构建体转染母细胞，然后过度表达构建体并收获包含生物治疗性多肽的外来体。
另一项突破性的专利申请(WO2014/168548)公开了治疗性递送囊泡，例如外来体，其膜上附着多肽构建体，所述多肽构建体包含融合到至少一种治疗性多肽的至少一种载体多肽，所述治疗性多肽至少部分存在于囊泡外部，以便将其展示到囊泡外环境。其他专利申请也试图使用外来体来递送蛋白生物制剂，例如，在WO2015/138878中，肝素结合表皮生长因子(Hb-EGF)。
然而，成功细胞内递送生物活性蛋白生物制剂(尤其是预期与特定细胞内靶标相互作用的抗体/细胞内抗体和其他多肽)往往需要目标治疗多肽以其游离和非缀合形式进行高效地递送。外来体后分离的外源性载入往往是复杂且低效的多肽载入策略，同样地，现有技术的内源性载入策略隐含着腔内EV载入要么是低效的，要么是目标多肽(PoI)不是以其生物活性的非缀合形式存在。最近，WO2016/178532描述了一种建立蛋白携带EV的光遗传学方法，其中两个复杂的二聚体光遗传学构建体被引入母细胞中。在外源性施用的光暴露下，两种不同的光遗传学蛋白缔合，且在停止光暴露时，蛋白解离。这种方法需要将生物材料持续长期的暴露在光源中，以将蛋白运输外来体中，然后从其外来体转运蛋白中将其释放出来。因此，该方法存在可扩展性问题、潜在毒性问题，且执行起来也非常麻烦，部分原因是长期外源光照的施用。此外，二聚体构建体意味着需要多个载体，并且除了蛋白之间的不完全缔合和解离风险之外，蛋白错折叠、毒性蛋白聚集和翻译错误的风险也大大增加。
发明内容
因此，本发明的目的是克服上述与蛋白生物制剂到靶细胞的递送有关的问题，并满足本领域现存的需要，例如，用抗体或细胞内抗体、用于酶替代疗法的酶或基因编辑酶，或预期在靶细胞或靶组织有中具有生物活性效应的任何其他类型的多肽能够达到细胞内靶标。本发明通过利用基于细胞外囊泡(EV)的疗法来实现这一目的，其基于外来体或任何其他类型的EV，其包含至少一种目标多肽/蛋白(PoI)，其中PoI从基于内源性可活化多肽的释放系统中释放出来，并随后被递送到靶细胞中，例如，特异性地进入适宜的细胞区室或进入靶细胞的细胞器。本发明中的释放系统基于外来体多肽与允许PoI内源性可激活可释放性附着的结构域之间的融合蛋白，这意味着PoI可以通过内源性激活触发释放到一个或多个例如EV的腔内，进入EV的膜，或进入靶细胞或靶组织的任何区室或细胞器。重要的是，基于多肽的释放结构域的内源性激活意味着该方法具有高度的可扩展性，在生物材料长时间暴露于有潜在毒性的外源刺激或条件的过程中不包括额外的步骤，并且可以跨治疗平台转移。在不受任何理论约束的情况下，推测内源性激活可能是例如pH值下降、对结合配偶体的竞争以及通常细胞生物学条件的任何改变的结果，所述变化可能有助于通过激活基于多肽的释放结构域来触发PoI的释放。
这种高度复杂的方法将未缀合的目标治疗性多肽递送到EV的腔或膜中，使得治疗性目标生物活性多肽能够非常有效递送到细胞内环境和/或靶细胞的任何类型的细胞膜结构(例如质膜、细胞器(如细胞核、溶酶体或内质网(ER))的膜或任何其他类型的膜区室)。因此，本发明可应用于任何类型的细胞内和/或膜内递送多肽，例如用于任何类型蛋白或肽的导入或替换。一个非限制性的实例可能是在疾病(包括例如遗传异常，例如溶酶体贮积症)中缺失或未激活的酶，或是任何类型的需要被替换或在靶标中以更高浓度存在的细胞内或整合的膜蛋白。作为进一步的非限制性示例，本发明在癌症的治疗方面十分有用，其中本发明的EV可用于向细胞内环境中引入抑癌蛋白(或其变体或衍生物)，如p53或p21，或结合并抑制致瘤通路的任何类型的多肽(例如细胞内抗体或抗体)。然而，其他非限制性的实例包括递送转录因子或信号通路组分，以调节炎症反应或诱导组织修复，或递送RNA结合蛋白，这些蛋白可能随之携带一条或两条RNA链，这些RNA链本身可能赋予治疗活性。
因此，本发明涉及除其他外，包含至少一种PoI的EV，其中所述至少一种PoI通过内源可激活释放系统附着于外来体多肽。为清楚起见，本发明因此涉及包含已通过释放系统释放到EV的腔内和/或释放到EV膜的PoI的两种EV，以及包含仍然以可释放形式附着于基于内源可激活多肽的释放系统的PoI的EV。本发明中多肽构建体的模块性(包含目标多肽、基于多肽的内源可激活释放结构域和外来体多肽)使得可以高度可控内源性产生EV用于递送未缀合PoI(如上所述，可作为可溶性PoI或膜相关PoI，其中PoI可以跨膜的方式面对外部环境或内部环境或二者)。这与现有技术完全不同，现有技术仅仅描述了内源性载入PoI，其要么是永久性地与外来体蛋白缀合，要么是在不借助任何外来体多肽的情况下载入EV中的PoI，或者由于长期暴露于外源光源而运输和释放到EV中的PoI，这意味着与本发明中的载入和EV产生相比，载入和产生过程极其低效、繁琐，不可扩展和/或潜在毒性。
此外，本发明涉及几种用于载入和产生包含PoI的EV的新方法、包含允许该产生的多核苷酸和/或多肽构建体的细胞以及由此本发明的多核苷酸和/或多肽构建体。更详细地说，本发明涉及使用顺式裂解多肽(即包含触发释放肽所需的部分进而释放PoI的特定氨基酸序列的多肽或肽(其可通过多种机制进行，例如剪接或裂解))，和核定位信号(NLS)结合的多肽(NLSBP)(例如输入蛋白α多肽)，用于腔内和/或膜相关的未缀合目标多肽(PoI)的EV介导的递送。在一个单独的实施方案中，本发明人已经考虑使用简单的基于单体多肽的释放系统，该系统可以通过非常快速的光增强来触发(而不是像WO2016/178532中那样的延长的基于光暴露的运输和释放系统)。
本发明还涉及未缀合PoI的细胞内递送方法，其中这些方法包括将靶细胞与EV接触的步骤，EV包含(i)通过内源性触发释放结构域可释放地附着于外来体多肽的PoI；或(ii)通过从外来体多肽(通常位于EV的腔内或膜内)内源性激活释放的PoI。EV通常会进入靶细胞并递送其多肽货物，从而产生治疗性多肽的细胞内或膜内的高效递送。因此，EV及其产生和细胞内递送的方法具有广泛的医学潜力，例如在预防和/或治疗大量疾病和失调方面，特别是在肿瘤学、炎症和自身免疫、神经性炎症和神经退行性疾病、遗传病、溶酶体贮积病、器官损伤和衰竭、肌营养不良例如DMD、心血管和代谢病症、肾脏和肝脏疾病例如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)等。
附图说明
图1显示了多肽构建体的示意图，该多肽构建体包含用于释放目标多肽(PoI)的顺式裂解释放系统(例如内含肽)。
图2显示了多肽构建体的一般图解，该多肽构建体包含用于释放PoI的单体短期光诱导的裂解释放系统。短期的光增强导致释放系统的裂解，从而释放PoI，而不会产生任何毒性效应，也不会出现可扩展性问题。
图3显示用富含内含肽-GBA富集的融合蛋白的EV处理的GBA缺陷细胞的结果。在生物活性GBA的递送后，受体细胞的葡萄糖脑苷酯水平下降。在NPC1缺乏的成纤维细胞中用转运蛋白NPC1进行了类似的实验。
图4描述了用于释放PoI的包含基于GFP样Dendra蛋白的光诱导的裂解释放系统的多肽构建体。Dendra是单体释放系统，它可以由光的短期增强激活。
图5显示了非同源末端连接(NHEJ)测定法的结果。用包含指引RNA(gRNA)的外来体和包含CD81作为外来体多肽、Keade作为基于单体光诱导裂解的释放系统和Cas9作为PoI的多肽构建体。从细胞培养物中获得外来体，所述细胞培养物在外来体产生过程中暴露或不暴露于蓝光的短期增强。只有从暴露于光下（这引发了Kaede的裂解进而释放了Cas9）的细胞中获得的外来体才显示出阳性细胞的百分比增加。
图6显示了高分辨熔解(HRM)分析的由暴露于光下的细胞中收获的EV处理的细胞的结果。由于生物活性Cas9和gRNA的有效细胞内递送，包含与图5中相同的多肽构建体的EV诱导了AAVS位点中Cas9介导的突变。
图7显示了包含多肽构建体的EV的NHEJ测定法的效果，所述多肽构建体包含通过单体光诱导释放多肽Dendra2融合于CD63的Cas9，所述单体光诱导释放多肽Dendra2在UV/蓝光照射后在EV中产生有功能的Cas9。
图8显示了从暴露于UV/蓝光下的细胞中收获的EV处理细胞的HRM结果。由于有生物活性的Cas9和gRNA在细胞内的有效递送，包含与图7中相同的多肽构建体的EV诱导了AAVS位点中Cas 9介导的突变。
图9显示了通过用WASP靶向单链可变片段(scFv)-KikGR-CD63多肽构建体载入的EV实现的对NfKB应答的强烈下调，所述WASP靶向单链可变片段(scFv)-KikGR-CD63多肽构建体暴露于UV光以释放靶标骨髓来源的巨噬细胞中的scFv。
图10显示了被刺激以表达IL2-受体并同时用针对IL2R-α亚基的scFv载入的EV处理的Jurkat细胞的结果。根据FACS分析，只有阳性对照和用scFv-Dendra2-CD63 (并暴露于紫外光)加载的EV才能诱导下调Jurkat细胞的细胞表面IL2R。
图11显示了erbB-2阳性卵巢癌细胞系SKOV3的结果，该细胞用载入了靶向肿瘤蛋白erb-2的scFv的EV处理。在处理后48小时测定细胞死亡情况。只有载入了scFv-Dendra2-CD63 (并随后暴露于紫外线下)的EV才能诱导细胞死亡，其水平与阳性对照相当。
图12显示了使用基于NLSBP-NLS的释放系统将NRF2转录因子载入EV的结果，以及在受体细胞中诱导靶基因HMOX1表达的相关效应。NLSBP (KPNA 1 a.k.a.输入蛋白α5)与外来体蛋白CD63融合，并与NRF2共表达于EV源细胞(不同类型的免疫细胞检测效果良好)。通过蛋白印迹，与单独表达NRF2相比，共表达导致NRF2分类的EV显著增加。用此策略递送载入NRF2的EV导致诱导EV受体细胞中靶基因表达。
图13显示了类似于图5中的实验，但是此处是用顺式裂解的内含肽(包含氨基酸序列Val-Val-Val-His-Asn)作为释放系统，融合于CD63、CD81(数据未显示)和内居蛋白(数据未显示)以及Cas9。如图13所示，只有未突变的内含肽诱导NHEJ的相关水平。
图14显示了使用基于内含肽的多肽释放系统对Cre重组酶在外来体内富集的蛋白印迹分析。通道1-3显示外来体和通道5-7显示其各自的完整细胞裂解物。通道1和5 -可溶性NLSCre; 通道2和6 CD63-内含肽-Cre; 通道3和7 CD63-内含肽-NLSCre; 通道4蛋白梯.红色– Alix载入对照; 绿色 – Cre重组酶。
发明详述
本发明涉及包含多肽构建体的EV，所述多肽构建体继而包含：(i)至少一种POI，(ii)至少一种外来体多肽，和(iii)至少一种基于多肽的释放系统，其中借助于释放系统至少一种PoI可释放地附着于至少一种外来体多肽，其中释放系统是内源性激活的，因此PoI被自动地释放，不依赖于任何外源刺激物。此外，本发明还涉及包含至少一种PoI的EV，所述PoI借助于EV中(本质上在EV的腔内或者与EV膜相关(例如进入))的释放系统从至少一种外来体多肽中释放。此外，本发明涉及下文将更详细地描述的各种相关方面，例如多核苷酸和多肽构建体和包含这种构建体的细胞、用于体外和体内目标多肽/蛋白的细胞内递送的产生方法和方法、以及这种EV和含有这种EV的药物组合物的医学应用。
为方便和清楚起见，下面收集并描述了此处使用的某些术语。除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的技术人员的通常理解的含义相同的含义。
当以马库什集合描述本发明的特征、方面、实施方案或备选方案时，本领域的技术人员将认识到，本发明也因此以所述马库什集合的任何单个成员或成员子集的方式被描述。本领域的技术人员将进一步认识到，本发明也因此以马库什集合的单个成员或成员子集的任何组合的方式被描述。此外，应当指出，与本发明的方面和/或实施方案之一关联地描述的实施方案和特征也加以必要的变更地适用于本发明的所有其他方面和/或实施方案。例如，与EV关联地描述的各种至少一种目标多肽(PoI)应被理解为也在多肽构建体的情况中或在包含EV的药物组合物的情况中或作为根据本发明的多核苷酸构建体的表达产物而被公开和关联。此外，与某些方面关联地描述的某些实施方案，例如EV的给药途径，如与治疗某些医疗适应症有关的方面所描述的，自然也可能与其他方面和/或实施方案有关，例如涉及本发明的药物组合物或细胞内递送方法。作为一般性说明，根据本发明，目标多肽(PoI)、外来体多肽、内源可激活释放系统和靶向部分、细胞源以及所有其他方面、实施方案和替代方案可以自由地组合成任何和所有可能的组合，而不偏离本发明的范围和要点。此外，本发明的任何多肽或多核苷酸或任何多肽序列或多核苷酸序列(分别为氨基酸序列或核苷酸序列)，只要任何给定分子保留执行与其相关的技术效果的能力，就可以大程度偏离原始多肽、多核苷酸和序列。只要保留了它们的生物学特性，本申请的多肽和/或多核苷酸序列与天然序列相比可能会偏离多达50%(例如使用BLAST或ClustalW计算)，尽管优选尽可能高的序列同一性。例如，至少一种目标多肽和至少一种基于肽/多肽的释放系统和至少一种外来体多肽的组合(融合)隐含着各个多肽的某些片段可以被替换和/或修饰，这意味着只要关键特征保留，与天然序列偏差就可能相当大。因此，类似的推理自然适用于编码这类多肽的多核苷酸序列。
术语“胞外囊泡”或“EV”或“外来体”应理解为涉及例如可从细胞中获得的任何类型的囊泡，例如微泡(例如从细胞质膜脱落的任何囊泡)、外来体(例如来自内切溶酶体通路的任何囊泡)、凋亡小体(其可从凋亡细胞中获得)、微粒(来自例如血小板)、核外粒体(可来自例如血清中的中性粒细胞和单核细胞)、前列腺小体(例如可从前列腺癌细胞中获得)或心脏小体(例如可来自心脏细胞)等。此外，上述术语还应理解为涉及脂蛋白颗粒例如LDL、VLDL、HDL和乳糜微粒、以及细胞外囊泡类似物、细胞膜囊泡等，其通过膜挤压或其他技术获得。本质上，本发明可以涉及任何类型的基于脂质的结构(具有囊泡形态或任何其他类型的合适的形态)，其可以作为目标多肽(PoI)和含有这种PoI的多肽构建体的递送或运输载体。本领域技术人员会清楚，在描述EV的医疗和科学用途及应用时，本发明通常涉及多个EV，即可能包含数千、数百万、数十亿、数万亿、甚至数十万亿或数百万亿(例如103-1018)的EV的EV群体，或者甚至更大的EV群体(>1018个EV颗粒)。同样，术语“群体”(例如可能涉及包含某种类型的PoI的EV和/或包含PoI的某种类型的多肽构建体)应理解为包括构成这种群体的多个实体(通常被视为颗粒)。换句话说，各个EV在大量存在时构成EV群体。因此，自然地，本发明既涉及包括各种PoI的各个EV，也涉及包含EV的群体，所述EV继而包含各种PoI，这对于技术人员来说是清楚的。
术语“外来体多肽”、“外来体蛋白”、“EV多肽”和“EV蛋白”在此可互换使用，并应理解为涉及可用于将多肽构建体(除了外来体蛋白，该多肽构建体通常包含至少一种目标多肽和至少一种基于多肽的释放系统)的任何多肽运输至适当的囊泡结构，即至合适的EV。更具体地说，术语“外来体多肽”应理解为包含任何多肽，其能够运送、运输或穿梭多肽构建体(如上所述，其通常包含至少一种PoI和至少一种基于多肽的释放系统，但也可能包括靶向肽/多肽)到囊泡结构(例如外来体)。这类外来体多肽的实例是例如CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71、CD133、CD138、CD235a、ALIX、内居蛋白-1、内居蛋白-2、Lamp2b、TSPAN8、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受体、白细胞介素受体、免疫球蛋白、MHC-I 或MHC-II组分、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B、及其任何组合，但能够将多肽构建体运送到EV的许多其他多肽都包含在本发明的范围内。EV蛋白通常来源于人类，且可以在各种公共可得的数据库中找到，如Uniprot、RCSB等。
术语“目标多肽”、“目标蛋白”、“目标治疗性多肽”、“PoI”、“生物治疗药物”、“生物药”和“蛋白生物药”在本文中可互换使用，并且应理解为涉及可用于治疗目的的任何多肽，其通过例如结合靶标和/或以任何其他方式与相互作用配偶体相互作用和/或替代蛋白和/或增补或补充现有细胞内蛋白，从而发挥其治疗作用。所述术语可以代表目标治疗性多肽的以下非限制性实例：抗体、细胞内抗体、单链可变片段(scFv)、亲和体、双或多特异性抗体或结合剂、受体、配体、用于例如酶置换疗法或基因编辑的酶、肿瘤抑制剂、病毒或细菌抑制剂、细胞组分蛋白、DNA和/或RNA结合蛋白、DNA修复抑制剂、核酸酶、蛋白酶、整合酶、转录因子、生长因子、凋亡抑制剂和诱导剂、毒素(例如假单胞菌外毒素)、结构蛋白、神经营养因子如NT3/4、脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)及其各个亚基如2.5S β亚基、离子通道、膜转运蛋白、蛋白稳定因子、参与细胞信号转导的蛋白、翻译和转录相关蛋白、核苷酸结合蛋白、蛋白结合蛋白、脂质结合蛋白、糖胺聚糖(GAG)和GAG结合蛋白、代谢蛋白、细胞应力调节蛋白、炎症和免疫系统调节蛋白、线粒体蛋白和热休克蛋白等。在一个优选的实施方案中，PoI是具有完整核酸酶活性的CRISPR相关(Cas)多肽，其与(即携带它的)RNA链缔合，该RNA链使得Cas多肽一旦被EV递送就能在靶细胞中实施其核酸酶激活。或者，在另一个优选的实施方案中，Cas多肽可以是无催化活性的，以实现靶向的基因工程改造。另一种选择可以是任何其它类型的CRISPR效应物，例如单个RNA导向的核酸内切酶Cpf1。Cpf1作为PoI的内化是本发明的特别优选的实施方案，因为它通过交错的双链断裂裂解靶DNA，Cpf1可以从诸如酸性氨基球菌或毛螺旋菌科的菌种中获得。在另外一个示例性实施方案中，Cas多肽还可以与转录激活因子(例如P3330核心蛋白)融合，以特异性地诱导基因表达。其它优选的实施方案包括选自以下的PoI：针对溶酶体贮积病的酶，例如葡糖脑苷脂酶例如伊米苷酶、α-半乳糖酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶和艾杜硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶、戈硫酯酶、酸-α葡糖苷酶、神经磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、半乳糖基神经酰胺酶、神经酰胺酶、α-N-乙酰基半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、溶酶体酸脂酶、酸性神经磷脂酶、NPC1、NPC2、乙酰肝素硫酸胺酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶、乙酰肝素-α-氨基葡糖苷-N-乙酰转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖 6-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、透明质酸酶、α-N-乙酰神经氨酸酶、GlcNAc磷酸转移酶、粘膜脂质蛋白1、棕榈酰基-蛋白硫酯酶、三肽基肽酶I、battenin、linclin、α-D-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、天冬氨酸葡萄糖苷酶、α-L-岩藻糖苷酶、半胱氨酸蛋白、组织蛋白酶K、sialin、LAMP2和己糖氨酸酶。在其它优选的实施方案中，所述PoI可以是例如修饰炎症反应的细胞内蛋白，例如表观遗传蛋白诸如甲基转移酶和布罗莫结构域，或改变肌肉功能的细胞内蛋白，例如转录因子诸如MyoD或Myf5，调节肌肉收缩性的蛋白例如肌球蛋白，肌动蛋白，钙/结合蛋白例如肌钙蛋白，或结构蛋白例如肌萎缩蛋白，肌营养不良营养蛋白，肌联蛋白，伴肌动蛋白，肌萎缩蛋白相关蛋白如变异短杆菌素，互养蛋白，成束蛋白，肌间线蛋白，肌糖蛋白，肌营养不良蛋白聚糖，sarcospan，聚集蛋白和/或fukutin。PoI通常是人类来源的蛋白或肽，除非另外以它们的名称、任何其它命名方式或本领域技术人员已知的方式指示，并且它们可以在诸如UniProt、RCSb等的各种公共可用数据库中找到。
术语在“在……内释放的”如在“在EV内释放的”或“在靶细胞内释放的”情况中，可以理解为意指目标多肽(PoI)完全和/或部分从EV(或靶细胞)内释放，即PoI被释放到EV(或靶细胞)的腔内，全部或部分释放到EV(或靶细胞)的膜(例如到跨膜结构)，或在EV(或靶细胞)膜的外部上。所述术语也可理解为意指PoI释放到EV膜(或靶细胞)的外部上。此外，它还可能包括在任何生物系统例如特定组织或靶器官内释放。
术语“内源激活”、“内源触发”及其变体(例如“内源性可激活的”或“内源性触发的”)应理解为涉及POI在无任何外源刺激物的条件下被释放系统释放的激活、诱导和/或触发，即PoI的释放是在EV内部或细胞内部通过周围的外来体和/或细胞和/或生物环境的仅作用而触发(例如，由于pH值的变化、其他生理参数例如盐度的变化、结合配偶体之间的竞争、酶活性，如蛋白水解活性等)。
术语“来源细胞”或“EV来源细胞”或“母细胞”或“细胞来源”或“产生EV的细胞”或任何其他类似术语，应理解为涉及在适当的细胞培养条件下(例如悬浮培养中或贴壁培养中或任何其他类型的培养系统中)能够产生EV的任何类型的细胞。根据本发明，来源细胞可从广泛的细胞中选择，例如间充质干细胞或基质细胞(可从例如骨髓、脂肪组织、脐带胶样组织、围产期组织、牙齿、脐带血等获得)、羊膜细胞、羊膜上皮细胞、髓样抑制细胞中选择，以人胚肾(HEK)细胞为非限制性代表的永生化细胞系，树突状细胞(DC)或其他免疫系统细胞，如巨噬细胞、单核细胞、B-或T-细胞、NK细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞或嗜碱性粒细胞等。一般来说，EV可以来源于任何细胞，无论是原始细胞源还是永生化细胞系。EV来源细胞可以是任何胚胎、胎儿和成人干细胞类型，包括诱导的多能干细胞(iPSCs)和其他通过任何方法获得的干细胞。在治疗神经疾病时，人们可以考虑使用以下来源细胞：例如原代神经元、星状细胞、少突胶质细胞、小神经胶质细胞和神经祖细胞。来源细胞对于被治疗的患者本质上可以是异体的，自体的，甚至是异种的，即细胞可能来自患者自己，或者来自不相关的，匹配的或不匹配的供体。在某些情况下，从医学的角度来看，异体细胞可能是优选的，因为它们可以提供免疫调节效应，而这种效应可能无法从患有某种适应症的患者的自体细胞中获得。例如，在治疗外周或神经炎症方面，异体基因MSC可能是优选的，因为从这些细胞中获得的EV可以通过如巨噬细胞和/或中性粒细胞表型转换(分别从促炎性M1或N1表型转变为抗炎性M2或N2表型)进行免疫调节。相反，当使用EV治疗实体性或恶性血液肿瘤时，可优选选择免疫细胞例如DC作为产生EV的细胞来源。
在第一方面，本发明涉及包含至少一种目标多肽(PoI)的EV，其中所述至少一种PoI可释放地附着于外来体多肽。PoI附着至外来体多肽是可以释放的，使得目标治疗性多肽有效、无阻碍载入和内源性触发释放进入EV。PoI与外来体多肽之间的可释放附着是由本发明释放系统介导的特征，它在EV内和/或随后在靶细胞或靶组织内内源性可激活释放PoI，以优化载入和治疗活性。释放系统是基于多肽的系统，其可以选自各种可释放的多肽相互作用系统，所述系统可以不需要外源刺激物被激活或触发(即释放系统通常是由细胞或EV内或者基本上是在任何生物系统内的内源活性触发的)，例如，基于顺式裂解多肽的释放系统(例如基于内含肽)、基于核定位信号(NLS)-NLS结合蛋白(NLSBP)的释放系统或基于其他蛋白结构域的释放系统。在一个实施方案中，可以使用基于单体光诱导裂解的释放系统，其中仅利用非常短的光增强来启动单体蛋白结构域的内源性蛋白水解裂解并释放PoI。
在优选实施方案中，本发明涉及EV，其包含可释放地附着于内含肽释放系统的目标多肽，和/或已从EV内或靶细胞或靶器官内的内含肽释放系统释放的目标多肽(PoI)。采用内含肽释放系统的典型多肽构建体可大致描述如下(以下表示法不解释为说明任何C和/或N末端方向，只是为了说明目的)：
PoI-顺式裂解多肽-外来体蛋白
或者，该多肽构建体可按如下方式设计，以包含将显示在EV表面的靶向部分，以甚至通过靶向目标组织或细胞类型进一步提高其治疗潜力：
PoI-顺式裂解多肽-外来体蛋白-靶向部分。
基于顺式裂解多肽的释放系统可以是快速或慢速裂解释放系统。在某些情况下，个人可以选择使用快速裂解顺式裂解释放系统(例如快速裂解顺式裂解内含肽)，而慢速裂解释放系统在其他情况下可能是更有利的。一般情况下，可以采用慢速裂解释放系统以允许更长的时间将PoI载入到EV中，而当EV需要快速收获时，快速裂解系统可能是优选的。
在优选实施方案中，顺式裂解释放系统基于内含肽系统，其中内含肽的c端部分可包含氨基酸序列Val-Val-Val-His-Asn或Val-Val-Val-His-Asn-Cys。截短或以其他方式优化的内含肽，即一个或多个氨基酸被去除或替换以增强功能的内含肽，也可用于本发明的目的。如不受任何理论的束缚，推测截短或增加功能突变可能会增加内含肽的pH反应性，这进一步增加了其在从基于EV的递送系统释放生物活性PoI方面的效用，因为EV可能通过内吞过程内化到细胞内。然而，更广泛地说，顺式裂解释放系统可以从一组顺式裂解系统中选择，这些系统包含各种其他基于多肽的释放系统，例如分选酶A、N-末端蛋白酶、FrpC和半胱氨酸蛋白酶结构域或其他合适的顺式裂解释放系统以及它们的任意组合。顺式裂解释放蛋白可以有利地附着于腔内外来体多肽末端，以允许PoI释放进EV内或进入EV膜，尽管还可以使用其他附着点，例如整合附着点。
在本发明的一个实施方案中，PoI从外来体多肽(其引导PoI到EV)中的释放可以通过光诱导的裂解来实现。与现有技术不同的是，本发明采用基于单体光诱导裂解的释放系统，该系统在短光增强后经历内源性激活，且可选自单体蛋白，例如Kaede、KikGR、EosFP、tdEosFP、mEos2、PSmOrange和GFP-样Dendra蛋白 Dendra和Dendra2。与光遗传学二聚系统如CRY2-CIBN不同，单体蛋白如Dendra、Kaede、KikGR、EosFP、tdEosFP、mEos2、PSmOrange和Dendra2的优点是在PoI上只留下小的残余多肽结构域，这意味着所递送的PoI的生物活性不会受到负面影响。此外，与光遗传学二聚结构域相反，基于光诱导裂解的释放系统显著地更易于控制，这意味着PoI载入EV中是非常精确的。因此，本发明的基于光诱导裂解的释放系统仅通过暴露于合适波长的光(在Dendra、Keide、KikGr和大多数其他基于光诱导裂解的释放蛋白的情况下是UV或蓝光，而在PSmOrange的情况下是在红橙光谱中较长的波长)，就能够在期望的时间点和在体外或体内的期望位置高度可控地释放PoI。重要的是，基于裂解的光诱导释放系统仅仅需要非常短的光增强就能实现内源性的裂解过程，这意味着可以避免延长的和复杂的光暴露期的潜在毒性效应。基于光诱导裂解释放系统的多肽构建体可以大致描述如下(下面的表示法不被解释为说明任何C和/或N端方向，仅仅是为了说明目的)：
PoI-Dendra-外来体蛋白
PoI-Kaede-外来体蛋白
在EV产生过程中的适当时间，包含PoI、光诱导的裂解系统和外来体多肽的多肽构建体暴露于合适波长的光增强下，导致PoI的裂解和释放。在短期内暴露于紫外或蓝光下，Dendra或其他单体UV/蓝光反应性光诱导的裂解释放蛋白(其可能作为融合物插入PoI与外来体多肽之间)通过内肽骨架断裂被裂解，释放出PoI和外来体蛋白。小多肽结构域可能保留于PoI和外来体多肽上，但PoI的活性不受这些小残基存在的限制。
在本发明的另一个实施方案中，释放系统可基于核定位信号(NLS)结合多肽(NLSBP)和NLS之间的相互作用。NLSBP-NLS释放系统可以包含至少一种PoI，其包含至少一种经典或非经典NLS。作为另一种选择，可以使用NLS样序列(NLSLS)，其与NLSBP结合，但不触发NLSLS PoI的核输入。NLS可能是具有或不具有重叠RNA/DNA结合结构域的自然存在的NLSLS或NLS(正如注定用于细胞核的大多数Pol(例如转录因子和核酸酶)的情况一样)，或者是重组融合到固有地不含NLS的PoI上的NLS。外来体多肽继而被修饰成包含合适的NLSBP(例如来自输入蛋白α或β家族，例如转运蛋白αKPNA1，或核输入涉及的任何其他蛋白)，从而在NLS-NLSBP释放系统内源性激活时，在含NLS的PoI和含有NLSPB的外来体多肽之间形成可释放性附着。PoI释放的触发通常由不同NLS-NLSBP对之间的竞争驱动，从而导致PoI的释放。基于NLS-NLSBP释放系统的多肽构建体可大致描述如下(以下表示法不应解释为说明任何C和/或N末端方向，只是为了说明目的)：
PoI-NLS-NLSBP-外来体蛋白
如上所述，靶细胞中存在的NLSBPS将(当EV介导的含NLS的PoI递送时)向外竞争性含NLSBP的外来体多肽，从而导致PoI被内源性释放并运输至正确的细胞区室。自然，基于NLSBP-NLS的释放系统非常适合于意味着在细胞核和/或核仁中发挥其所需活性的目标多肽，但注定进入细胞质或其他细胞内区室的目标蛋白也与NLS-NLSBP释放系统兼容，尤其是当使用NLSLS而不是NLS时。NLSBP-NLS释放系统的非限制性示例可能包括以下几个方面：KPNA1-NRF2、KPNA6-STAT3、KPNB1-STAT3、KPNA2-和HSF1。NLSBP可以包含来自输入蛋白α和β家族的输入蛋白，以及其他NLS结合蛋白，包括KPNA1、KPNA2、KPNA3、KPNA4、KPNA5、KPNA6、KPNA7、KPNB1、IPO4、IPO5、IPO7、IPO8、IPO9、IPO11、IPO13、TPNO1、TNPO2、TNPO3、HIKESHI、SNUPN、HEATR3和其他RAN结合蛋白。含有NLS的蛋白可以从非限制性实例中选择，如转录因子、核酸酶和其他核蛋白如CREB、C/EBP、bZIP、bHLH、MyoD、cMyc、SERBP、NF-1、Cys4、GATA因子、OCT4、NANOG、KLF4、SOX2、HSF1、STAT3、SMAD3、p53、MEF2、SRF、NFkB、CAS9、锌指核酸酶、hnRNPA1、hnRNPA2、NUP153、RPL23A、RPS7、RPL5、RPL23A、H2A、H2B、H3和H4组蛋白、TNRC6A、SRP19、SNAI1、PRKCI、HSP70、U1 snRNP、U2 snRNP、U4 snRNP、U5 snRNP、和U6 snRNP。一般来说，合适的PoI的非限制性实例是例如核酸酶例如Cas和Cas9(这是一种来自化脓性链球菌等细菌的RNA引导的DNA内切酶)；转录相关蛋白，如NF-κB 和 NRF2；DNA结合蛋白，如组蛋白和聚合酶；RNA结合蛋白，如hnRNPA 1-2和MS2外壳蛋白，其可用于运输各种类型的RNA；抗体和/或有核靶标的细胞内抗体；用于酶替代疗法的酶，如NPC 1、NPC2和GBA等。本发明的优选示例是将KPNA 1与CD63融合，并在适当的EV源细胞(例如MSC或羊膜上皮细胞)中与MyoD共表达，从而获得在治疗例如DMD方面具有很强适用性的治疗性EV。
如上所述，本发明涉及基于EV的疗法，其基本上包含任何目标多肽(PoI)，通常用于治疗或预防目的，但还可能用于美容用途。PoI或多种PoI(在使用多种(即多于一种)PoI的情况下)可以是任何合适的多肽，即包含多个氨基酸的任何分子，即蛋白或肽。PoI可以选自以下治疗、预防或美容性多肽的非限制性实例中任一种：抗体、细胞内抗体、单链可变片段(scFv)、亲和体、双或多特异性抗体或结合剂、受体、配体、酶例如溶酶体贮积疾病(LSD)中缺乏和/或缺陷的酶，肿瘤抑制剂例如p53、pVHL、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7和ST14、病毒或细菌抑制剂、细胞组分蛋白、DNA和/或RNA结合蛋白、核酸酶如Cas、Cas9和Cpf1、蛋白酶、整合酶、转录因子、生长因子、凋亡抑制剂和诱导剂、结构蛋白、离子通道、膜转运蛋白、蛋白稳定因子、参与细胞信号转导的蛋白、翻译和转录相关的蛋白、核酸结合蛋白、蛋白结合蛋白、脂质结合蛋白、葡萄糖胺聚糖(GAG)和GAG结合蛋白、代谢蛋白、细胞应力调节蛋白、炎症和免疫系统调节蛋白、线粒体蛋白和热休克蛋白等。EV能够以高效的方式到达细胞内环境的事实意味着大量的细胞内靶标适于药物。因此，目标治疗性蛋白(PoI)通常是结合细胞内靶标的蛋白(例如针对致癌蛋白如c-Myc的细胞内抗体或结合其细胞内相互作用配偶体的诱饵受体)，或用于在细胞内发挥期望效果的PoI (例如，PoI可以是肌萎缩蛋白，作为杜氏肌营养不良(DMD)的治疗)，用于替换缺失或缺陷蛋白的PoI (例如酶例如NPC1、GBA或AGAL用于酶置换治疗，亨廷顿蛋白或BDNF用于治疗例如亨廷顿病或其它神经退行性疾病)、用于治疗癌症的肿瘤抑制剂例如p53、或用于治疗炎性疾病的NFkB抑制剂。借助于本发明EV递送的针对细胞内抗体的目标靶标可包含病理形式的α-突触核蛋白、LRRK2、τ、β淀粉样蛋白、APP、C9orf72、SOD1、TDP43、FUS和朊病毒蛋白。具有相当大治疗潜力的一类PoI是RNA结合蛋白(RBP)，其可用于帮助细胞内递送RNA治疗药物如mRNA、RNAi试剂(例如短发夹RNA或微小RNA)的，或用于剪接-转换或沉默的反义试剂。RNA结合蛋白的非限制性实例是hnRNPA1、HnRNPA2B1、DDX4、ADAD1、DAZL、ELAVL4、IGF2BP3、SADM4A、TDP43、FUS、FMRP1、FXR1、FXR2、EIF4A1-3、MS2外壳蛋白以及它们的任何结构域、部分或衍生物。更广泛地说，RNA结合蛋白和结构域的特定亚类，例如mRNA结合蛋白(mRBP)、预rRNA结合蛋白、tRNA结合蛋白、小核或核仁RNA结合蛋白、非编码RNA结合蛋白和转录因子(TF)。此外，各种结构域和衍生物也可作为用于运输RNA货物的PoI。RNA结合PoI的非限制性实例包括小RNA结合结构域(RBD)(其可以是单链和双链RBDS(ssRBDS和dsRBDS)，例如DEAD、KH、GTP_EFTU、dsrm、G-patch、IBN_N、SAP、TUDOR、RnaseA、MMR-HSR1、KOW、RnaseT、MIF4G、zf-RanBP、NTF2、PAZ、RBM1CTR、PAM2、Xpo1、Piwi、CSD、和核糖体_L7Ae。这种RNA结合结构域可以多数形式存在，单独或与其它结合存在，并且还可以形成较大的RNA结合蛋白构建体的一部分，只要它们的关键功能(即，运输目标RNA货物的能力，例如mRNA或短RNA)得以维持。
此外，如上所述，根据本发明的外来体多肽基本上可以是任何合适的多肽，其允许将至少一种PoI转运到EV。如上所述，PoI在被运入EV后的实际定位可能会变化，取决于外来体多肽的性质和/或PoI的性质，即PoI可能被运入EV的腔内，进入EV膜内，进入膜相关的位置，和/或EV的任何其他合适的部分。这种外来体多肽的非限制性实例有是例如CD81、Itab1、Mfge8、CD63、CD151、Hspg2、Lgals3bp、Col6a1、Agrn、Tspan14、Lamc1、Lamb1、Tfrc、CD47、CD82、Slit2、内居蛋白、Alix、多配体蛋白聚糖、突触结合蛋白、Lamp2、Lamp2b、CD13、CD86、Flotillin、Syntaxin-3、LiCAM、LFA-1、Mac-1 α和β、Vti-1A和 B、ICAM-1、CD2、CD18、CD37、CD36、CD53、CD82、CXCR4、FcR、CD40、CD40L、CD41a、CD44、CD45、和tetraspanin、GluR2/3、HLA-DM、免疫球蛋白、MHC-I or MHC-II及其组分，以及TCRβ，以及大量能够将包含PoI的多肽构建体转运到EV的其他多肽。
在另一个实施方案中，本发明的EV还包含至少一种靶部分。典型的是，靶部分存在于EV的表面(即从EV膜向囊泡外环境突出)，通常以靶部分与EV蛋白之间的融合蛋白的形式存在，以便于在体内和/或体外送达正确的组织或细胞类型。EV还可进一步包含渗透促进剂，以增加对选定组织或区室的渗透。这种渗透促进剂可以是在EV表面表达的肽或多肽，其与合适的外来体多肽作为融合构建体。渗透促进剂可以是例如，细胞穿透肽（CPP）(例如Tat、转运子、转运子10、多Arg、MPG、Pep-1、穿透素等)、抗体(可能靶向促进内化的细胞表面受体，例如转铁蛋白受体或胰岛素受体)，或亲和体，或任何可以增加EV的内化和/或组织渗透的其他类型的分子。与靶部分类似，渗透促进剂可以通过在外来体多肽和至少一种渗透促进剂之间建立融合构建体而在EV表面表达。
在另一个方面，本发明涉及大量产生具有强治疗效果的EV的高效方法。根据本发明，所述方法包括以下步骤：(a)向源细胞中引入至少一种编码至少一种PoI的多核苷酸构建体、基于内源性可激活多肽的释放系统和外来体多肽，以及(b)表达来自所述多核苷酸构建体的相应多肽。通常，该方法还包括收集由源细胞产生(即释放)的EV的步骤(c)，PoI通过内源性触发基于蛋白的释放结构域释放PoI进入上述EV。
将合适的多核苷酸构建体引入源细胞(细胞培养通常包括适合的产生EV的细胞类型用于产生EV)可以通过各种常规技术来实现，如转染、病毒介导的转化、电穿孔等。转染可以使用常规的转染试剂进行，如脂质体、CPP、阳离子脂质或聚合物、磷酸钙、树突状聚合物等。病毒介导的转染也是一种非常合适的方法，可以使用常规的病毒载体，如腺病毒或慢病毒载体。病毒介导的转化在建立稳定的细胞系用于细胞建库时尤其相关，即建立产生EV的细胞源的主细胞库(MCBS)和工作细胞库(WCBS)。
在某些情况下，在源细胞中引入多于一种多核苷酸构建体可能是有利的。例如，当使用NLS-NLSBP释放系统时，情况可能是这样。在这种情况下，由多核苷酸构建体编码的多肽构建体将被单独翻译，随后在翻译后的源细胞内多肽(例如，包含NLS的PoI和与NLSBP融合的外来体蛋白)之间发生期望的特定相互作用。另一方面，如果采用单体系统，例如基于Dendra的释放系统或顺式裂解释放系统(例如，内含肽释放系统)，则将单个多核苷酸构建体导入源细胞以编码单个多肽构建体可能更有利。在另一个实施方案中，细胞培养物的细胞的EV产量可以通过将细胞暴露于可能导致EV产量增加的不同条件增加。血清饥饿、低氧、暴露于细胞因子(如TNFα或干扰素)、抗生素(如巴弗洛霉素)和其他物质是可用于提高EV产量、产率和质量的方法。
在其他方面，本发明还涉及本发明多核苷酸和多肽构建体。根据本发明的多核苷酸结构通常包含核苷酸区段，其编码至少一种PoI、至少一种基于内源可激活多肽的释放系统或部分基于多肽的释放系统以及至少一种外来体多肽。一个非限制性的实例可以是编码酶PoI(如NPC 1或GBA)的多核苷酸构建体用于治疗溶酶体贮积病，是顺式裂解的内含肽，以及外来体多肽，如CD81，内居蛋白或CD63。因此，本发明自然还涉及相应的多肽构建体，即包含至少一种PoI、至少一种基于内源性触发多肽的释放系统或部分基于多肽释放的系统以及至少一种外来体多肽的多肽构建体。此外，本发明还涉及包含上述多核苷酸结构和/或上述多肽的EV产生的细胞(通常是以细胞培养的形式存在的细胞，但也包括由此的单个细胞)。
在另一个方面，本发明涉及在体外或体内将PoI递送到细胞内环境或靶细胞膜中的方法。所述方法包括：将靶细胞与EV相接触，EV包括(i)使用基于内源可激活肽的释放系统可释放地附着于外来体多肽上的PoI，或(ii) 在EV内或是在靶细胞内已从外来体多肽释放的PoI。重要的是，与现有技术不同的是，本发明的PoI以本质上非缀合的形式被递送到靶细胞中，即所述的PoI不与可能阻碍PoI活性的大的外来体蛋白(或在二聚体光遗传学蛋白，一种发光遗传学二聚体的情况下)缀合。例如，WO2014/168548教导包含与外来体蛋白缀合的目标治疗性多肽的外来体，这对于某些类型的治疗蛋白是一种很好的策略，这些治疗蛋白尽管与外来体蛋白缀合，但仍能发挥其预期的活性。然而，本发明的方法使得能够通过本发明可控的内源可激活释放系统来递送范围更广的治疗性PoI，所述系统将PoI释放至其期望位置，而不需要任何外源刺激物。
在本发明所述的某些实施方案中，PoI可以是借助基于内源性触发蛋白的释放系统与外来体多肽缀合的整合膜蛋白。整合膜PoI可以存在于EV的外表面、内表面或两者上。在不受任何理论约束的情况下，推测在摄取到靶细胞后，包含多肽构建体进而包含整合膜PoI的EV被运输到内质网(ER)。EV的含量，即包含整合膜POI的多肽构建体可在ER处进行处理和分类，然后再通过ER介导运输至靶细胞的适当区室。因此，包含借助于基于多肽的释放系统缀合到整合质膜蛋白(例如G-蛋白偶联受体(GPCR))的外来体蛋白的多肽构建体会被运送到靶细胞的质膜，而原生存在于溶酶体膜(即溶酶体膜蛋白)中的膜蛋白则会被运送到靶细胞的溶酶体。膜PoI的一个特别重要的实例是NPC1，它是胆固醇的膜转运蛋白且当其缺陷时导致贮积病Niemann-Pick's病。
如上所述，PoI的释放由基于内源性可激活多肽的释放系统介导，该系统与PoI和/或外来体多肽融合。在一个有利的实施方案中，编码后续多肽构建体的多核苷酸构建体被设计成将释放系统置于PoI和外来体多肽之间。这种安排使得能够容易制备构建体，并在所需位置有效释放PoI。
在另一方面，本发明涉及包含根据本发明的EV的药物组合物。通常，本发明药物组合物包含至少一种类型的治疗性EV(即具有包含某种期望PoI的EV群体)，所述药物组合物用至少一种药学上可接受的赋形剂配制。所述至少一种药学上可接受的赋形剂可选自任何药学上可接受的材料、组合物或载体，例如固体或液体填料、稀释剂、赋形剂、载体、溶剂或胶囊化材料，可用于例如延缓、维持将治疗性递送囊泡从一个器官或身体的一部分携带或运输至另一个器官或身体的一部分(例如，从血液到任何组织和/或器官和/或目标身体部分)的活性。
本发明还涉及包含PoI的EV的美容应用。因此，本发明涉及包含适当EV的护肤产品，例如霜、洗剂、凝胶剂、乳剂、软膏、糊剂、粉末、涂抹剂、防晒霜、洗发水等，以改善和/或减轻例如皮肤干燥、皱纹、褶皱、隆起和/或皮肤皱痕的症状和问题。在一个同时具有美容和治疗性质的实施方案中，根据本发明的EV可以包含作为PoI的肉毒杆菌毒素(例如保妥适(botox)例如肉毒杆菌毒素A-G型)(肉毒毒素不一定仅用于美容应用，也可以用于例如治疗偏头痛和肌张力障碍)。在优选实施方案中，将可从具有再生特性(例如间充质干细胞)的合适的外来体产生细胞获得的EV(包括至少一种类型的PoI)包含于美容霜、洗剂或凝胶中，用于皱纹、褶皱、隆起和/或皮肤皱痕的美容或治疗性缓解。
在另一个方面，本发明涉及根据本发明的EV用于药物。当然，当根据本发明包含PoI的EV被用于药物时，它实际上通常是正在被使用的一群EV。给患者注射的EV剂量将取决于已载入EV中的PoI量、需要治疗或缓解的疾病或症状、给药途径、PoI本身的药理作用以及各种其他相关参数。
本发明EV可用于预防和/或治疗目的，例如用于各种疾病和病症的预防和/或治疗和/或缓解。其中可应用的本发明EV的非限制疾病实例包含克罗恩病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、类风湿关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、结节病、特发性肺纤维化、银屑病、肿瘤坏死因子(TNF)受体相关性周期综合征(TRAPS)、白介素-1受体拮抗剂缺乏症(DIRA)、子宫内膜异位症、自身免疫性肝炎、硬皮病、肌炎、中风、急性脊髓损伤、血管炎、吉兰-巴雷综合征、急性心肌梗死、ARDS、脓毒症、脑膜炎、脑炎、肝衰竭、肾功能衰竭、移植物抗宿主病、杜氏肌营养不良症和其他肌肉营养不良症、溶酶体贮积病例如戈谢病、法布里氏病、MPS I、II(Hunter综合征)和III、尼曼-皮克病、糖原贮积症Ⅱ型等神经变性疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和其他三核苷酸重复相关疾病、痴呆、ALS、癌性诱导的恶病质、厌食症、2型糖尿病和各种癌症。
实际上，所有类型的癌症都是本发明相关靶标，例如急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形胶质细胞瘤、小脑或脑、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、脑干胶质瘤、脑癌、脑肿瘤(小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤，视路胶质瘤和下丘脑神经胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤(儿童期、胃肠道)、原发灶不明性转移性癌肿、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促纤维增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌症(眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤)、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤(颅外、性腺外或卵巢)、妊娠性滋养层细胞瘤、神经胶质瘤(脑干胶质瘤、脑星形细胞瘤、视路胶质瘤和下丘脑神经胶质瘤)、胃癌、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝癌、霍奇金淋巴瘤、咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病(急性淋巴细胞白血病(又称急性淋巴细胞白血病)、急性髓系白血病(亦称急性髓系白血病)、慢性淋巴细胞白血病(亦称慢性淋巴细胞白血病)、慢性髓系白血病(亦称慢性髓系白血病)、毛细胞白血病))、唇部和口腔、腔癌、脂肉瘤、肝癌(原发性)，肺癌（非小细胞、小细胞）、淋巴瘤（AIDS相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤（除霍奇金淋巴瘤外的所有淋巴瘤的旧式分类）、原发性中枢神经系统淋巴瘤）、髓母细胞瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、具有隐匿性原发性的转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌腺瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、霉菌病、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病（急性、慢性）、骨髓瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、咽癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌（表面上皮间质瘤）、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌（肾癌）、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、涎腺癌、肉瘤（尤文家族肿瘤肉瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤）、恶性网状细胞血症性红皮病、皮肤癌（非黑色素瘤、黑色素瘤）、小肠癌、鳞状细胞、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌，甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症和/或肾母细胞瘤。
根据本发明EV可通过各种不同的给药途径应用于人或动物，例如耳廓(耳)、颊、结膜、皮肤、牙、电渗、宫颈、内渗、气管内、肠内、硬脑膜外、羊膜外、体外、血液透析、渗透、间质、腹内、羊膜内、动脉内，关节内、胆道内、支气管内、囊内、心内、软骨内、尾侧、海绵囊内、腔内、脑内、脑池内、角膜内、冠内(牙)、冠脉内、阴茎海绵体内、皮内、椎间盘内、导管内、十二指肠内、硬膜内、表皮内、食管内、胃内、舌内、臀肌内、病灶内、管腔内、淋巴管内、髓内、内膜内、肌肉内、眼内、动脉内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、肾内、脊柱内、滑膜内、腱内、睾丸内、鞘内、胸内、小管内、肿瘤内、鼓室内、子宫内、血管内、静脉内、静脉推注、静脉滴注、心室内、膀胱内、玻璃体内、离子电渗疗法、灌洗、经喉、经鼻、鼻饲、闭塞性敷料技术、眼科、口腔、口咽、其他、肠外、经皮、关节周围、硬膜外、神经周围、牙周、直肠、呼吸（吸入）、眼球后、软组织、蛛网膜下腔、结膜下、皮下、舌下、粘膜下、局部、经皮、经粘膜、经胎盘、经气管、经鼓室、输尿管、尿道和/或阴道给药、和/或上述给药途径的任何组合。
在另一方面，本发明涉及如上所述的一种产生EV(或更准确地产生EV群体)的方法，该方法包括以下步骤：(a)向细胞源(通常是细胞培养物)引入一种或多种多核苷酸构建体，其编码至少一种PoI、基于内源可激活多肽的释放系统和外来体多肽，(b)表达由多核苷酸构建体编码的多肽构建体，以及(c)收集细胞产生的EV。如果利用单体光诱导裂解系统释放PoI，那么在产生方法中增加一个额外的步骤，使EV短期暴露于合适波长的光下。光暴露步骤可以发生在细胞内EV仍在形成时，当EV刚刚释放到细胞培养基中时，当EV已被进一步加工时(例如通过切线流过滤(TFF)、超滤、珠-洗提色谱、大小排阻色谱法或其任何组合)，或者在基本上任何合适的时间，这取决于细胞源、EV的产生特点和EV本身。适宜的培养体系包括常规的2D细胞培养、3D细胞培养、生物反应器、中空纤维生物反应器等。
该方法还可包括使源细胞暴露于血清饥饿、缺氧、菌丝霉素或细胞因子例如TNF-α和/或IFN-γ，以影响所得的EV的产率或特性。EV的产生规模和时间表将在很大程度上取决于EV产生的细胞或细胞系，因此可以由本领域技术人员相应地加以调整。
产生方法还可包括纯化步骤，其中EV通过选自以下的程序纯化：液相色谱(Lc)、珠-洗提LC、大小排阻LC、高效液相色谱(HPLC)、自旋过滤、切线流过滤、中空纤维过滤、离心、免疫沉淀等或其任何组合。
在一个有利的实施方案中，使用过滤(优选超滤(UF)、切向流过滤(TFF)或中空纤维过滤)和珠-洗脱或大小排阻液相色谱(LC)的顺序组合来进行EV的纯化。这种纯化步骤的组合导致了纯化的优化，这继而导致了优越的治疗活性。此外，与常规用于纯化外来体的超离心法(UC)相比，序贯过滤-色谱法能够更快和有可能扩展到更高的制造量，这是目前限制现有UC技术方法的一个重大缺陷。
应当理解的是，上述示例性方面、实施方案、备选方案和变体可以在不偏离本发明范围的情况下进行修改。现在，本发明将以所附实施例进一步例述，这些实施例自然也可以在不偏离本发明的范围和要点的情况下进行相当大的修改。
实验部分
材料与方法
构建体设计和克隆
评价了多种顺式裂解基于内源性可激活多肽的释放系统(例如缓慢裂解内含肽、快速裂解内含肽、分选酶A和FrpC)，连同几种PoI(例如Cre、NPC1、IL10、RNA结合的MS2外壳蛋白)和外来体多肽(CD81、CD63、CD9、内居蛋白、多配体蛋白聚糖、Alix、CD133等)。同样，评估了各种NLS-NLSBP释放系统和单体光诱导释放系统，以及PoI和EV蛋白。NLS-NLSBP系统包括：KPNA1-NRF2，KPNA6-STAT3，KPNB1-STAT3，KPNA2-HSF1。NLSBP包括来自输入蛋白α和β家族的输入蛋白，以及其他NLS结合蛋白，包括KPNA1、KPNA2、IPO8、TPNO1、HIKESHI、SNUPN、HEATR3和其他RAN结合蛋白。NLS包括含有多种转录因子、核酸酶和其它核蛋白的蛋白，例如bHLH、MyoD、cMyc、HSF1、STAT3、p53、NFkB、Cas9、HSP70、和U1 snRNP。单体光诱导裂解系统包括：Kaede、KikGR、EosFP和Dendra。PoI包括NPC1、GBA、AGAL、Huntingtin、BDNF、NFkB超抑制剂、RNA结合蛋白和结构域，例如hnRNPA1、MS2外壳蛋白、G-patch等。在RNA结合蛋白的情况中，这些蛋白与目标多核苷酸组合，所述RNA结合蛋白被拖入EV。评价了大量的外来体蛋白：CD81、CD63、CD9、多配体蛋白聚糖、Alix、CD133、内居蛋白-1、内居蛋白-2、Lamp2b、TSPAN8和TSPAN14及其变体和结构域。
在评估顺式裂解释放系统构建体和单体光诱导裂解系统时，通常会通过合成产生ORF，并将其克隆到哺乳动物表达载体pSF-CAG-Amp。简单来说，根据厂家说明用NotI和Sall酶消化合成的DNA和载体质粒（NEB）。经限制性酶切并纯化的DNA片段按照厂家说明(NEB)用T4连接酶连接在一起。通过在补充氨苄西林的培养板上进行细菌转化，选择成功的连接事件。转染质粒由‘maxi-prep’按照厂家说明产生。
在NLS-NLSBP释放系统的情况中，ORF序列通常是购买的(Origene Technologies，Inc.)并扩增和克隆到双顺反子表达载体(Clonetech, Laboratories Inc.)的MSC A位点。因此，在翻译后，NLSBP蛋白以嵌合体的形式表达，并与外来体多肽融合。NLS融合到缺乏NLS的PoI上，或者当NLS已经存在于POI上时则照原样使用(偶尔具有遗传修饰)。大多数克隆是使用NEBuilder HiFi DNA组装克隆试剂盒(NEB, Inc.)进行的，并经Sanger测序(SourceBioScience)确认。pIRES载体使两种转基因同时双顺反子表达，确保EV产生的细胞同时表达这两种转基因。将质粒转化到NEB 5-α感受态大肠杆菌细胞(NEB, Inc.)并根据厂家说明在摇床中过夜生长。使用‘maxi-prep’试剂盒依照厂家说明(Macherey-Nagel)分离和纯化质粒。
·细胞培养和转染
根据实验设计和测定，在某些情况下，在常规的2D细胞培养中进行无病毒瞬时转染和外来体产生，而在其他情况下，病毒介导的转导则用于建立稳定的细胞系，这些细胞系通常在不同类型的生物反应器中培养。为了简要起见，本文只提到了几个实例。
按照ATCC的建议，通常将HEK293T细胞接种到15 cm培养皿中(每个培养皿9x106个细胞)，并在含血清的DMEM中过夜培养。第二天，将脂质复合的DNA直接加入细胞以进行细胞的瞬时转染。简而言之，将DNA和聚乙烯亚胺(PEI)分别在OptiMEM中孵育5 min，之后将之结合在一起在室温下持续20 min。脂质复合的DNA与细胞共孵育6h后，随后将条件培养基改为OptiMEM共孵育48h。在培养皿、培养瓶和其他细胞培养容器中评价的其他细胞和细胞系包括骨髓来源的间充质基质细胞(BM-MSC)和沃顿氏胶质来源的MSC (WJ-MSC)、羊膜细胞、成纤维细胞、各种内皮细胞和上皮细胞以及各种免疫细胞和细胞系。
在病毒转导和针对PoI、释放系统和外来体多肽的不同组合的稳定细胞系的建立的情况下，细胞来源如BM-MSC、WJ-MSC、成纤维细胞、羊膜细胞、成纤维细胞、各种内皮细胞和上皮细胞被病毒转导，通常使用慢病毒(LV)。通常在感染前24小时，将100000个细胞(例如成纤维细胞、MSC等)或者200000个细胞(例如HEK293T)接种于6孔板。加入2μl的LV和任选聚凝胺(或海地美溴铵，终浓度为8μg/ml)，转导24小时后，将转导细胞的细胞培养基换成新鲜的完全培养基。在转导72h后，进行嘌呤霉素筛选(4-6µg/ml)，通常持续7天，随后分析多肽构建体的稳定表达。
稳定的细胞在2D培养或在生物反应器中培养，通常是中空纤维生物反应器，条件培养基随后被收集用于外来体制备。进行不同的制备和纯化步骤。标准工作流程包括以下步骤：上清液预澄清、基于过滤的浓缩、基于色谱的蛋白污染物去除、以及任选在适合的缓冲液中配制产生的外来体组合物用于体外和/或体内测定。
·测定和分析
蛋白印迹是评价EV中PoI富集的非常方便的分析方法。简单地说，SDS-PAGE是按照厂家说明(Invitrogen, Novex PAGE 4-12%凝胶)进行的，每孔上样1x1010外来体和20 ug细胞裂解物。来自SDS-PAGE凝胶的蛋白按厂家说明(Immobilon, Invitrogen)转移到PVDF膜上。根据供应商说明(Primary antibodies – Abcam, Secondary antibodies – Licor)将膜在Odyssey封闭缓冲液（Licor）中进行封闭，并用抗POI和外来体蛋白的抗体探测。分子探针在680 nm和800 nm波长可见。图14显示了Cre重组酶作为PoI和Alix作为外来体蛋白的组合。
对于EV尺寸的测定，采用带有分析软件的NanoSight仪器进行了纳米粒子跟踪分析(NTA)。对于所有的记录，我们使用了13或15的相机水平和所有后期采集设置的自动功能。电子显微镜和荧光显微镜常用于了解PoI的位置和释放，并对EV进行定量和分析。
EV用多种方法分离和纯化，通常是过滤法例如TFF和LC的结合。通常，含有EV的介质被收集并经过以300g低速旋转5分钟，然后2000g旋转10分钟以去除较大的颗粒和细胞碎片。上清液用0.22μm注射器过滤，并进行不同的纯化步骤。使用具有100 kDa截止滤波器的Vivaflow 50R切向流(TFF)装置(Sartorius)，或具有100或300 kDa截止中空纤维过滤器的KR2i TFF系统(SpectrumLabs)，将大体积渗滤和浓缩到约20ml。预先浓缩的培养基随后被载入连接到ÄKTAprime plus 或 ÄKTA Pure 25 色谱系统(GE Healthcare LifeSciences)的珠洗脱柱(HiScreen or HiTrap Capto Core 700 column, GE HealthcareLife Sciences)。根据厂家说明，选择了柱平衡、上样和适当柱清洗程序的流量设置。根据紫外吸收色谱收集样品，用Amicon Ultra-15 10 kDa分子量截留自旋滤器(Millipore)进行浓缩至最终体积100μl，并储存于-80℃以备进一步的下游分析。为了评价蛋白和RNA的洗脱谱，采用KR2i TFF系统，用100 kDa和300 kDa中空纤维过滤器对培养基进行浓缩和渗滤，并在Tricorn 10/300 Sepharose 4 Fast Flow (S4FF)柱 (GE Healthcare LifeSciences)进行样品分析。
·实施例
图3显示了用包含插入GBA酶和外来体蛋白CD63之间的缓慢裂解内含肽的多肽构建体富集的BM-MSC EV治疗的GBA缺陷患者来源的淋巴细胞的结果。用基于HPLC的测定法，受体细胞在EV介导的自由释放GBA递送后，显示出脂类葡萄糖脑苷酯水平的下降。使用了多肽构建体进行了类似的实验，所述多肽构建体包含脂质转运蛋白NPC1作为PoI、基于快速裂解内含肽的释放系统和外来体蛋白CD133。包含该多肽构建体的EV有效地将NPC 1递送至缺乏NPC1的成纤维细胞，从而使功能性胆固醇转运水平显著高于包含非功能性释放系统的对照EV。
在另一个实例中，基于内源性可激活的N-端蛋白酶的释放系统被用来将PoI p53与外来体蛋白多配体蛋白聚糖融合，其中成纤维细胞作为产生EV的母细胞。使用同样的EV多肽构建体，在体外EV介导的内源性激活的可释放递送p53至MDA-MB-231癌细胞的释放的效果显著优于不可释放性递送。
图5显示了非同源末端连接(NHEJ)测定法的结果。使用包含引导RNA(gRNA)和多肽构建体的纤维细胞来源的EV转染含有报告系统的HEK293T红细胞，所述多肽构建体包含CD81作为外来体多肽、Kaede作为基于单体光诱导裂解的释放系统和Cas9作为PoI。从细胞培养物中获得EV，所述细胞培养物在外来体产生过程中暴露或不暴露于蓝光。只有从暴露于光的短增强(这导致了Kaede的裂解从而释放Cas9)的细胞中获得的外来体才显示出阳性细胞的百分比增加。类似地，图6显示了高分辨熔解(HRM)分析从暴露于光的细胞中收集的EV处理的细胞的结果。由于生物活性Cas9和gRNA的有效细胞内递送，包含与图5中相同的多肽构建体的成纤维细胞EV，诱导AAVS位点中Cas9介导的突变。图7显示了NHEJ测定法中包含多肽构建体的羊膜上皮细胞来源的EV的效果，所述多肽构建体包含通过单体光诱导的释放多肽Dendra2融合至CD63的Cas9，其在UV/蓝光照射后在EV中产生功能性Cas9。图8显示了从暴露于UV/蓝光下的细胞中收集的WJ-MSC EV处理的细胞的HRM结果。其由于生物活性Cas9和gRNA的有效细胞内递送，包含与图7中相同的多肽构建体(但这次是在WJ-MSC来源的EV中)的EV诱导AAVs位点中Cas9介导的突变。图9显示了通过用WASP靶向单链可变片段(scFv)-KikGR-CD63多肽构建体载入的HEK EV实现的NfKB应答的强烈下调，所述WASP靶向单链可变片段(scFv)-KikGR-CD63多肽构建体暴露于UV光以释放靶标骨髓来源的巨噬细胞中的scFv。
图10显示了被刺激表达IL2-受体并同时用针对IL2R-α亚基的scFv载入的HEK EV处理的Jurkat细胞的结果。根据FACS分析，只有阳性对照和载入scFv-Dendra2-CD63 (并暴露于紫外光)的EV才能下调Jurkat细胞表面IL2R。图11显示了erbB-2阳性卵巢癌细胞系SKOV3的结果，SKOV3被载入了靶向肿瘤蛋白erb-2的scFv的EV处理。在处理后48小时测定细胞死亡情况。只有载入了scFv-Dendra2-CD63 (并随后短暂暴露于紫外线下)的EV才能诱导细胞死亡，其水平与阳性对照相当。
图12显示了使用基于NLSBP-NLS的释放系统将NRF2转录因子载入BM-MSC来源的EV的结果，以及在受体细胞中诱导靶基因HMOX1表达的相关效应。NLSBP (KPNA1，也称为输入蛋白α5)与外来体蛋白CD 63融合，并与NRF 2共表达于EV源细胞(除了BM-MSC，不同类型的免疫细胞检测效果良好)。通过蛋白印迹，与单独表达NRF2相比，共表达导致NRF2分类的EV显著增加。用此策略递送NRF2载入的EV导致EV在HEK细胞测定中靶基因的诱导表达。根据其他EV蛋白产生多肽构建体也会产生类似的效应，例如使用Alix和内居蛋白。图13显示了类似于图5中的实验，但是此处是用顺式裂解的内含肽(包含氨基酸序列Val-Val-Val-His-Asn)作为释放系统，融合于CD63、CD81(数据未显示)和内居蛋白(数据未显示)以及Cas9；使用氨基上皮细胞递送。如图13所示，只有未突变的内含肽诱导NHEJ的相关水平。
基于NLS-NLSBP多肽的内源激活释放系统的另一个实例包括将KPNA2与外来体蛋白CD47融合，并与转录因子HSF1在成纤维细胞中共同表达，从而将HSF1载入到外来体中。分离成纤维细胞来源的外来体，用于处理已经经历在其培养基中低钾或高钾浓度的小鼠原代小脑颗粒神经元。在诱导凋亡的低钾条件下，与不含NLS-NLSBP释放系统的对照外来体处理相比，载入HSF1的EV处理显著提高细胞存活率。

Claims (19)

1.包括至少一种多肽构建体的细胞外囊泡EV，所述多肽构建体包含：
(i)至少一种目标多肽；
(ii)至少一种外来体多肽；和
(iii)基于多肽的释放系统，
其中基于多肽的释放系统在内源性激活时从至少一种外来体多肽中释放至少一种目标多肽到EV的腔内，并且其中所述基于多肽的释放系统选自顺式裂解的释放系统和核定位信号(NLS)-核定位信号结合蛋白(NLSBP) (NLS-NLSBP)的释放系统，其中所述顺式裂解的释放系统选自缓慢裂解内含肽、快速裂解内含肽、包含氨基酸序列Val-Val-Val-His-Asn的顺式裂解的内含肽、分选酶A、FrpC和基于N-端蛋白酶的释放系统。
2.根据权利要求1所述的EV，其中目标多肽是治疗性多肽，其选自抗体、单链可变片段、亲和体、用于酶替代治疗或基因编辑的酶、肿瘤抑制剂、病毒或细菌抑制剂、细胞组分蛋白、DNA修复抑制剂、核酸酶、蛋白酶、整合酶、转录因子、生长因子、凋亡抑制剂和诱导剂、毒素、神经营养因子、膜转运蛋白、核苷酸结合蛋白、热休克蛋白、CRISPR相关蛋白及其任何组合。
3.根据权利要求2所述的EV，其中所述核苷酸结合蛋白是DNA和/或RNA结合蛋白。
4.根据权利要求2所述的EV，其中所述治疗性多肽是细胞内抗体。
5.根据权利要求2所述的EV，其中所述治疗性多肽是结构蛋白。
6.根据权利要求1所述的EV，其中所述外来体多肽选自：CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71、CD133、CD138、CD235a、ALIX、内居蛋白-1、内居蛋白-2、Lamp2b、TSPAN8、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、tetraspanin、Fc受体、白细胞介素受体、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II成分、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A和VTI1B。
7.根据权利要求1所述的EV，其中所述EV还包含至少一种目标多核苷酸。
8.根据权利要求7所述的EV，其中目标多核苷酸通过与RNA结合的目标多肽或DNA结合的目标多肽的相互作用而被转运到所述EV中。
9.包含至少一种目标多肽的EV，其中通过基于多肽的释放系统的内源激活从至少一种外来体多肽中释放所述目标多肽到EV的腔内，其中所述基于多肽的释放系统选自顺式裂解的释放系统和核定位信号(NLS)-核定位信号结合蛋白(NLSBP) (NLS-NLSBP)的释放系统，其中所述顺式裂解的释放系统选自缓慢裂解内含肽、快速裂解内含肽、包含氨基酸序列Val-Val-Val-His-Asn的顺式裂解的内含肽、分选酶A、FrpC和基于N-端蛋白酶的释放系统。
10.根据权利要求9所述的EV，其中所述EV进一步包含目标多核苷酸。
11.根据权利要求1或9所述的EV，其中所述EV还包含至少一种靶向部分。
12.用于产生根据前述权利要求中任一项所述的EV的方法，其包括：
i. 向EV产生细胞中引入编码至少一种多肽构建体的至少一种多核苷酸构建体，所述多肽构建体包含至少一种目标多肽、内源性可激活的基于多肽的释放系统和至少一种外来体多肽；
ii. 在所述EV产生细胞中表达由所述至少一种多核苷酸构建体编码的至少一种多肽构建体；以及，
iii. 从EV产生细胞中收集包含目标多肽的EV。
13.多核苷酸构建体，其编码：
i. 至少一种目标多肽；
ii. 至少一种内源性可激活的基于多肽的释放系统，其中所述基于多肽的释放系统选自顺式裂解的释放系统和核定位信号(NLS)-核定位信号结合蛋白(NLSBP) (NLS-NLSBP)的释放系统，其中所述顺式裂解的释放系统选自缓慢裂解内含肽、快速裂解内含肽、包含氨基酸序列Val-Val-Val-His-Asn的顺式裂解的内含肽、分选酶A、FrpC和基于N-端蛋白酶的释放系统；和，
iii. 至少一种外来体多肽。
14.多肽构建体，其包含：
i. 至少一种目标多肽；
ii. 至少一种内源性可激活的基于多肽的释放系统，其中所述基于多肽的释放系统选自顺式裂解的释放系统和核定位信号(NLS)-核定位信号结合蛋白(NLSBP) (NLS-NLSBP)的释放系统，其中所述顺式裂解的释放系统选自缓慢裂解内含肽、快速裂解内含肽、包含氨基酸序列Val-Val-Val-His-Asn的顺式裂解的内含肽、分选酶A、FrpC和基于N-端蛋白酶的释放系统；和，
iii. 至少一种外来体多肽。
15.一种EV，其包含(i)至少一种根据权利要求13所述的多核苷酸构建体和/或(ii)根据权利要求14所述的至少一种多肽构建体。
16.一种细胞，其包含(i)至少一种根据权利要求13所述的多核苷酸构建体和/或(ii)至少一种根据权利要求14所述的多肽构建体和/或(iii)至少一种根据权利要求1-11和/或15中任一项所述的EV。
17.用于细胞内递送至少一种目标多肽的体外方法，其包括将靶细胞与至少一种根据权利要求1-11或15中任一项所述的EV接触。
18.一种药物组合物，其包含(i)至少一种根据权利要求13所述的多核苷酸构建体和/或(ii)至少一种根据权利要求14所述的多肽构建体和/或(iii)至少一种根据权利要求1-11和/或15中任一项所述的EV和/或(iv)根据权利要求16所述的细胞。
19.根据权利要求1-11和/或15中任一项所述的EV在制备药物中的用途。
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