JP2021100416A - 治療的ポリペプチドを含むエクソソーム - Google Patents

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Abstract

【課題】標的細胞へのタンパク質生物物質の送達に関連する上で特定した問題を克服し、当業者における既存の必要性を満たす、例えば抗体若しくは細胞内抗体、酵素補充療法のための酵素若しくは遺伝子編集酵素、又は標的細胞若しくは標的組織において生物活性効果を有することを意図する他の任意の型のポリペプチドが、細胞内標的に届くことを可能にする方法の提供。【解決手段】ｉ）少なくとも１つの対象のポリペプチド（ＰｏＩ）；（ｉｉ）少なくとも１つのエクソソームポリペプチド；及び（ｉｉｉ）ポリペプチドに基づく放出系を含む少なくとも１つのポリペプチド構築物を含む細胞外小胞（ＥＶ）であって、前記ポリペプチドに基づく放出系が、内在的活性化により前記少なくとも１つのエクソソームポリペプチドから前記少なくとも１つのＰｏＩを放出し、前記ＰｏＩが、ＲＮＡ結合タンパク質及び／又はＤＮＡ結合タンパク質である、ＥＶである。【選択図】なし

Description

本発明は、細胞外小胞(EV)治療物質に関係し、EVは、少なくとも1つの対象のポリペプチド(PoI)を含む。
抗体とその抗原、又は更に言えばタンパク質に基づくバイオ医薬品の任意の型とその標的の間の優れた特異性は、治療的介入に理想的な基礎である。しかしながら、抗体及びタンパク質生物学の治療上の使用は、細胞内環境への大きい分子種の接近が非常に制限されるため、細胞外標的に限定されている。様々な媒体が、細胞内部への治療的ポリペプチドの送達のために開発中であり、最近の研究は、例えば細胞貫通性ペプチド(例えばDinca et al., Int J Mol Sci, 2016により概説されている)及び既存の輸送経路を標的する二重特異性抗体(Yu et al., Sci Trans Med, 2014)の実用性を示した。
有望な特許出願WO2013/084000では完全に異なる手法が採用され、その特許出願は、バイオ治療物質を細胞内送達するためのエクソソームの使用について開示している。より具体的には、WO2013/084000は、いかにしてポリペプチドに基づく治療物質を、外来的(exogenous)及び内在的(endogenous)搭載技術の両方によりエクソソーム内に搭載できるかについて開示している。エクソソームの外来的搭載は、親細胞から単離した後のエクソソーム内への対象のポリペプチドのエレクトロポレーション又はトランスフェクションを使用して実施し得るが、内在的搭載は、対象のポリペプチドをコードする構築物による親細胞のトランスフェクション、それに続く構築物の過剰発現及び生物治療的ポリペプチドを含むエクソソームの採取に基づく。
別の画期的な特許出願(WO2014/168548)は、少なくとも1つの治療的ポリペプチドに融合した少なくとも1つの担体ポリペプチドを含むポリペプチド構築物を膜に結合させ、そのポリペプチド構築物が小胞外部環境に提示されるように小胞の外側に少なくとも部分的に存在する、エクソソーム等の治療的送達小胞を開示している。他の特許出願は、WO2015/138878、ヘパリン結合上皮成長因子(HB-EGF)の場合等、タンパク質生物物質の送達にエクソソームを使用することを試みている。
しかしながら、特定の細胞内標的と相互作用することを目的とする生物活性タンパク質生物物質、特に抗体/細胞内抗体及び他のポリペプチドの成功した細胞内送達は、対象の治療的ポリペプチドが、自由な、コンジュゲートされていない形態で、高効力で送達されることをしばしば必要とする。単離後のエクソソームの外来的搭載は、ポリペプチドの搭載においてしばしば扱いにくく、効果的でない戦略であり、同様に先行技術の内在的搭載戦略は、腔内EV搭載が非効率的であるか又は対象のポリペプチド(PoI)が生物活性があるコンジュゲートしていない形態で存在しないかのいずれかであることを暗に示している。最近、WO2016/178532において、タンパク質を保有するEVを作製する光遺伝学的方法であって、2つの複合二量体光遺伝学的構築物が親細胞に導入される方法が説明されている。外来的に適用された光曝露のために、2つの異なる光遺伝学的タンパク質が結合し、光曝露を止めるとタンパク質は解離する。この方法は、エクソソームにタンパク質を輸送し、その後エクソソーム輸送体からタンパク質を放出させるために、光源に生物材料を非常に長時間曝露することが必要である。その結果、この方法は、拡張性に伴う問題、潜在的な毒性問題を被っており、更に、長時間にわたる光の外来的適用に一部起因して、実施に手間がかかる。更に、二量体構築物は、複数のベクターが必要であり、タンパク質間の不完全な会合及び解離のリスクに加えて、タンパク質ミスフォールディング、毒性タンパク質凝集及び翻訳エラーのリスクが実質的に増大することを意味する。
WO2013/084000 WO2014/168548 WO2015/138878 WO2016/178532
Dinca et al., Int J Mol Sci, 2016 Yu et al., Sci Trans Med, 2014
標的細胞へのタンパク質生物物質の送達に関連する上で特定した問題を克服し、当業者における既存の必要性を満たす、例えば抗体若しくは細胞内抗体、酵素補充療法のための酵素若しくは遺伝子編集酵素、又は標的細胞若しくは標的組織において生物活性効果を有することを意図する他の任意の型のポリペプチドが、細胞内標的に届くことを可能にすることが、それ故本発明の目的である。本発明は、少なくとも1つの対象のポリペプチド(PoI)/タンパク質を含むエクソソーム又は他の任意の型のEVに基づく、細胞外小胞(EV)に基づく治療物質であって、PoIが、内在的に活性化可能なポリペプチドに基づく放出系から放出され、標的細胞、例えば標的細胞の適切な細胞区画又はオルガネラへ特異的にその後送達される治療物質を活用することによりこれを達成する。本発明の放出系は、エクソソームポリペプチドとPoIの内在的に活性化可能で放出可能な結合を可能にするドメインとの融合タンパク質に基づき、このことは、PoIが、内在的活性化トリガーによって1つ以上の、例えばEVの内腔、EVの膜、又は標的細胞若しくは標的組織の任意の区画若しくはオルガネラ内に放出され得ることを意味する。重要なことに、ポリペプチドに基づく放出ドメインの内在的活性化は、本方法が高い拡張性があり、生物材料が潜在的に毒性の外来的刺激又は条件に非常に長期間曝露される間に追加の工程を全く含有せず、治療的プラットホーム全体で移動可能であることを意味する。どんな原理に束縛されるものでもないが、内在的活性化は、例えばpHの低下、結合パートナーとの競合、及びポリペプチドに基づく放出ドメインの活性化によりPoIの放出の起動を促し得る細胞生物学的条件の一般に任意の変化の結果であり得ると推測される。
コンジュゲートしていない対象の治療的ポリペプチドを内腔又はEVの膜内に送達するこの非常に精巧な手法は、細胞内環境及び/又は標的細胞の任意の型の細胞性膜構造(原形質膜、核、リソソーム若しくは小胞体[ER]等のオルガネラの膜又は他の任意の型の膜区画等)への治療的対象の生物活性ポリペプチドの極めて効率的な送達を可能にする。従って本発明は、例えば任意の型のタンパク質若しくはペプチドを導入又は置きかえるための、ポリペプチドの細胞内及び/又は膜内送達の任意の型に適用され得る。非限定的な例は、例えば、リソソーム蓄積症等の遺伝的異常を含めた疾患において存在しない若しくは不活性である酵素或いは置き換える又は標的中に一層高濃度で存在する必要がある任意の型の細胞内若しくは膜内在性タンパク質(integral membrane protein)であり得る。更なる非限定的な例として、本発明はがんの処置に非常に有用であり、本発明のEVは、細胞内環境にp53若しくはp21等の腫瘍抑制タンパク質(又はそのバリアント若しくは誘導体)又は腫瘍形成経路に結合し、阻害する任意の型のポリペプチド(細胞内抗体又は抗体等)を導入することに活用できる。更に他の非限定的な例は、炎症反応をモジュレートする若しくは組織修復を誘導するために転写因子若しくはシグナル伝達経路成分を送達する、又はそれ自体が治療活性を付与できる一本鎖若しくは二本鎖RNAを保有できるRNA結合タンパク質を送達することを含む。
従って、本発明は、少なくとも1つのPoIを含むEVにとりわけ関係し、少なくとも1つのPoIは、内在的に活性化可能な放出系を介してエクソソームポリペプチドに結合している。従って本発明は、明確に言えば、放出系によりEVの内腔及び/又はEVの膜内に放出されたPoIを含むEV並びに内在的に活性化可能なポリペプチドに基づく放出系に放出可能な方式でなお結合しているPoIを含むEVの両方に関する。本発明のポリペプチド構築物(対象のポリペプチド、ポリペプチドに基づく内在的に活性化可能な放出ドメイン及びエクソソームポリペプチドを含む)のモジュラリティーは、コンジュゲートされていないPoIを送達するためのEVの高度に制御可能な内在的産生を可能にする(上述の通り、可溶性PoIとして又は膜結合PoIとして、PoIは外部環境若しくは内部環境又は膜貫通様式で両方に面し得る)。これは、エクソソームタンパク質に永久にコンジュゲートされているPoI又はいかなるエクソソームポリペプチドも用いることなくEVに搭載されるPoI又は外来的光源への非常に長期の曝露の結果としてEVに輸送され、放出されるPoIのいずれかの内在的搭載についてしか記述していない先行技術と完全に対照的であり、このことは、搭載及び製造過程が、本発明の搭載及びEV製造と比較して極めて非効率的であり、扱いにくく、拡張性がなく及び/又は潜在的に毒性であることを意味する。
更に、本発明は、PoIを搭載する及びPoIを含むEVを製造するいくつかの新規の方法、そのような製造を可能にするポリヌクレオチド及び/又はポリペプチド構築物、従って発明のポリヌクレオチド及び/又はポリペプチド構築物を含む細胞に関係する。更に詳細には、本発明は、腔内及び/又は膜結合性のコンジュゲートされていない対象のポリペプチド(PoI)のEVに媒介される送達のための、シス切断性ポリペプチド(すなわち、ペプチドの所望の部分の放出を起動させてPoIを放出する[様々な機序、例えばスプライシング又は切断により起こり得る]特定の配列のアミノ酸を含むポリペプチド又はペプチド)並びに核局在化シグナル(NLS)結合ポリペプチド(NLSBP)(例えばインポーチンαポリペプチド)の使用に関する。別の一実施形態において、本発明者らは、(WO2016/178532等長い光曝露に基づく輸送及び放出系とは対照的に)非常に速い光加速により起動され得る単純な単量体ポリペプチドに基づく放出系の使用を考えた。
本発明は、コンジュゲートされていないPoIの細胞内送達の方法に更に関係し、そのような方法は、標的細胞を、(i)内在的に起動される放出ドメインを介してエクソソームポリペプチドに放出可能に結合されたPoI又は(ii)内在的活性化によってエクソソームポリペプチド(通常EVの内腔又は膜中にある)から放出されるPoIを含むEVと接触させる工程を含む。EVは、一般に標的細胞に入り、そのポリペプチド積荷を送達することができ、その結果治療的ポリペプチドの非常に効率的な細胞内又は膜内送達を得られる。従って、EV並びにその製造及び細胞内送達の方法は、例えば、多数の疾患及び病気、特に腫瘍学、炎症及び自己免疫、神経炎症性及び神経変性障害、遺伝的疾患、リソソーム蓄積疾患、器官傷害及び不全、DMD等の筋ジストロフィー、心血管及び代謝性障害、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)等の腎臓及び肝疾患、等の予防及び/又は処置において多くの医学的潜在性を有する。
対象のポリペプチド(PoI)を放出するためのシス切断性放出系(インテイン等)を含むポリペプチド構築物の略図である。 PoIを放出するための単量体短時間光誘導性切断放出系を含むポリペプチド構築物の概略図である。短時間の光加速は、いかなる毒性効果もなく及び拡張性の問題なしに放出系の切断並びにそれによるPoIの放出をもたらす。 インテインGBA富化融合タンパク質により富化されたEVで処理したGBA欠損細胞の結果を示す図である。レシピエント細胞は、生物活性GBA送達の後にグルコセレブロシドレベルの低下を呈する。類似の実験を、NPC1欠損線維芽細胞において輸送体NPC1で実施した。 PoIを放出するためのGFP様Dendraタンパク質に基づく光誘導性切断放出系を含むポリペプチド構築物を図示する。Dendraは、光の短時間加速により活性化され得る単量体放出系である。 非相同的末端結合(NHEJ)アッセイの結果を示す図である。レポータ系を含有するHEK293T赤血球を、ガイドRNA(gRNA)並びにエクソソームポリペプチドとしてCD81、単量体光誘導性切断に基づく放出系としてKaede及びPoIとしてCas9を含むポリペプチド構築物を含むエクソソームでトランスフェクトした。エクソソームは、エクソソーム産生過程の間に青色光の短時間加速に曝露した又はしなかったいずれかの細胞培養から得た。Kaedeの切断を誘導し、それによりCas9を放出する光に曝露した細胞から得たエクソソームだけが、陽性細胞のパーセンテージの増加を示した。 光に曝露した細胞から採取したEVで処理した細胞のハイレゾリューションメルティング(HRM)分析の結果を示す図である。図5と同じポリペプチド構築物を含むEVは、生物活性があるCas9及びgRNAの効率的な細胞内送達の結果としてAAVS座にCas9に媒介される突然変異を誘導した。 UV/青色光照射後にEVにおいて機能的Cas9を与える単量体光誘導性放出ポリペプチドDendra2によってCD63に融合されたCas9を含むポリペプチド構築物を含むEVのNHEJアッセイにおける効果を示す図である。 UV/青色光に曝露した細胞から採取したEVで処理した細胞のHRM結果を示す図である。図7と同じポリペプチド構築物を含むEVは、生物活性があるCas9及びgRNAの効率的な細胞内送達の結果としてAAVS座にCas9に媒介される突然変異を誘導した。 WASPを標的した一本鎖可変断片(scFv)-KikGR-CD63ポリペプチド構築物を搭載し、UV光に曝露してscFvを標的骨髄由来マクロファージ細胞内に放出するEVにより達成されたNfKB応答の強力な下方制御を示す図である。 IL2受容体を発現するために刺激され、IL2Rαサブユニットに対するscFvを搭載したEVで同時に処理されたJurkat細胞の結果を示す図である。FACS分析によると、陽性対照及びscFv-Dendra2-CD63を搭載した(及びUV光に曝露した)EVだけが、Jurkat細胞の細胞表面においてIL2Rの下方制御を誘導した。 腫瘍性タンパク質erb-2に対して標的したscFvを搭載するEVで処理したerbB-2陽性卵巣癌腫細胞系SKOV3の結果を示す図である。細胞死を、処置後48時間でアッセイした。scFv-Dendra2-CD63を搭載した(及びその後UV光に曝露した)EVだけが、陽性対照と同程度のレベルの細胞死を誘導した。 NLSBP-NLSに基づく放出系及びレシピエント細胞において標的遺伝子HMOX1発現を誘導する関連効果を使用してEVにNRF2転写因子を搭載した結果を示す図である。NLSBP(KPNA1、一名インポーチンα5)をエクソソームタンパク質CD63に融合し、NRF2と共にEV供給源細胞(様々な型の免疫細胞が、好結果で試験された)において同時発現させた。同時発現は、ウェスタンブロッティングにより推定されるように、NRF2単独の発現と比較して有意に増強されたNRF2のEVソーティングをもたらす。この戦略を使用してNRF2を搭載したEVの送達は、EVレシピエント細胞において標的遺伝子発現の誘導をもたらす。 図5と類似であるが、放出系としてシス切断性インテイン(アミノ酸配列Val-Val-Val-His-Asnを含む)をCD63、CD81(データ不掲載)、及びシンテニン(データ不掲載)並びにCas9に融合した実験を示す図である。図13から分かるように、突然変異されていないインテインだけが、NHEJの関連するレベルを誘導した。 インテインに基づく、ポリペプチドを放出可能な系を使用したエクソソーム内のCreリコンビナーゼ富化のウェスタンブロット分析の実例を示す図である。レーン1〜3は、エクソソーム及びレーン5〜7は、それらのそれぞれの全細胞溶解物を示す。レーン1及び5、可溶性NLSCre;レーン2及び6、CD63-インテイン-Cre;レーン3及び7、CD63-インテイン-NLSCre;4、タンパク質ラダー。赤色-Alixを搭載している対照;緑色-Creリコンビナーゼ。
本発明は、(i)少なくとも1つのPoI、(ii)少なくとも1つのエクソソームポリペプチド、及び(iii)少なくとも1つのポリペプチドに基づく放出系を含むポリペプチド構築物を含むEVに関係し、少なくとも1つのPoIは、放出系により、少なくとも1つのエクソソームポリペプチドに対し放出可能に結合されており、放出系は、内在的に活性化可能であり、従ってPoIの放出が、いかなる外来的刺激に左右されることもなく自動的に起動される。更に、本発明は、本質的にはEVの内腔にあるか又はEV膜と会合している(例えば中に)かいずれかのEV内の放出系により少なくとも1つのエクソソームポリペプチドから放出される、少なくとも1つのPoIを含むEVにも関する。更に、本発明は、以下でより詳細に記述されることになる様々な関連する態様、例えばポリヌクレオチド及びポリペプチド構築物及びそのような構築物を含む細胞、製造方法及びin vitro及びin vivoでの対象のポリペプチド/タンパク質の細胞内送達の方法、並びにそのようなEV及びそのようなEVを含有する医薬組成物の医療適用に関する。
利便性及び明確性のために、本明細書において利用される特定の用語を集め、後述する。別段の規定がない限り、本明細書において使用される技術的及び科学用語の全ては、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。
本発明の特徴、態様、実施形態又は代替物が、マーカッシュ群によって記述される場合、それにより当技術に熟達した者は、本発明が、マーカッシュ群の任意の個々のメンバー又はメンバーのサブグループによって記述されることを認識することになる。それによりまた、当技術に熟達した者は、本発明が、マーカッシュ群個々のメンバー又はメンバーのサブグループの任意の組合せによって記述されることを更に認識することになる。加えて、本発明の態様並びに/又は実施形態のうち1つに関連して記述される実施形態及び特徴も、本発明の他の全ての態様及び/又は実施形態について準用することに留意されたい。例えば、EVに関連して記述される少なくとも1つの様々な対象のポリペプチド(PoI)が、開示され、またポリペプチド構築物に関して若しくはEVを含む医薬組成物に関して、又は本発明のポリヌクレオチド構築物の発現産物として関連すると理解されるべきである。更にまた、特定の態様に関して記述されるある特定の実施形態、例えば、特定の医学的適応を処置することに関連する態様に関連して記述されるEVの投与経路は、本発明の医薬組成物又は細胞内送達方法に関連する態様/実施形態等他の態様及び/又は実施形態に関して当然ながら関連する可能性がある。概論として、本発明の対象のポリペプチド(PoI)、エクソソームポリペプチド、内在的に活性化可能な放出系、及び標的化部分、細胞供給源、並びに他の全ての態様、実施形態及び代替物は、本発明の範囲及び要旨から逸脱することなく、あらゆる考え得る組合せで自由に組み合わせることができる。更に、本発明の任意のポリペプチド若しくはポリヌクレオチド又は任意のポリペプチド若しくはポリヌクレオチド配列(それぞれアミノ酸配列又はヌクレオチド配列)は、所与の任意の分子がそれと関連する技術的効果を実施する能力を保持する限り、元のポリペプチド、ポリヌクレオチド及び配列から大幅に逸脱し得る。それらの生物学的特性が保持される限り、本適用によるポリペプチド及び/又はポリヌクレオチド配列は、天然の配列と比較して50%(例えばBLAST又はClustalWを使用して算出される)程度逸脱し得るが、できる限り高い配列同一性が好ましい。例えば対象の少なくとも1つのポリペプチド及び少なくとも1つのペプチド/ポリペプチドに基づく放出系及び少なくとも1つのエクソソームポリペプチドの組合せ(融合)は、それぞれのポリペプチドの特定の区分が、置き換え及び/又は修飾され得ることを意味し、このことは鍵となる特性が保存されている限り天然の配列からの逸脱が大きくなり得ることを意味する。従って、類似の論拠が、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に当然ながら適用される。
用語「細胞外小胞」又は「EV」又は「エクソソーム」は、例えば細胞から入手できる、例えば微小胞(例えば細胞の原形質膜から分離される任意の小胞)、エクソソーム(例えば、エンドリソソーム経路から得られる任意の小胞)、アポトーシス小体(例えばアポトーシスしている細胞から入手できる)、微小粒子(例えば血小板から得ることができる)、エクトソーム(例えば血清中の好中球及び単球から導き出せる)、プロスタソーム(prostatosome)(例えば前立腺がん細胞から入手できる)、又はカルディオソーム(cardiosome)(例えば心臓細胞から導き出せる)、等、任意の型の小胞に関すると理解されるものとする。更に、前記用語も、LDL、VLDL、HDL及びキロミクロン等のリポタンパク質粒子、並びに細胞外小胞模倣体、膜押出又は他の技術によって得られる細胞膜小胞、等に関すると理解されるものとする。本質的には、本発明は、対象のポリペプチド(PoI)及びそのようなPoIを含有するポリペプチド構築物の送達又は輸送媒体として作用し得る脂質に基づく任意の型の構造(小胞形態構造又は他の任意の適切な型の形態構造を持つ)に関し得る。EVの医薬的及び科学的な使用並びに適用について記述する場合、本発明が、複数のEV、すなわち数千、数100万、数10億、数兆、更に数1000兆又は数100京(例えば103〜1018)個のEVを含み得るEVの集団又は更により大きなEVの集団(EV粒子>1018個)に通常関することは当業者に明白であろう。同じ特質において、用語「集団」は、例えば特定の型のPoI及び/又はPoIを含む特定の型のポリペプチド構築物を含むEVに関し得、そのような集団を構成する複数の実体(一般に、粒子として計数される)を包含すると理解されるものとする。換言すれば、個々のEVは、複数で存在する場合、EV集団を構成する。従って、当然ながら当業者には明白であるように、本発明は、様々なPoIを含む個々のEV及び様々なPoIを含むEVを含む集団の両方に関係する。
用語「エクソソームポリペプチド」及び「エクソソームタンパク質」及び「EVポリペプチド」及び「EVタンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、それを活用してポリペプチド構築物(エクソソームタンパク質に加えて、少なくとも1つの対象のポリペプチド及び少なくとも1つのポリペプチドに基づく放出系を一般に含む)を適切な小胞構造、すなわち適切なEVへ輸送できる任意のポリペプチドに関すると理解されるものとする。より具体的には、用語「エクソソームポリペプチド」は、エクソソーム等の小胞構造へのポリペプチド構築物(上述の通り少なくとも1つのPoI及び少なくとも1つのポリペプチドに基づく放出系を一般に含むが、標的化ペプチド/ポリペプチドも含み得る)の輸送、輸送又は往復を可能にする任意のポリペプチドを含むと理解されるものとする。そのようなエクソソームポリペプチドの例は、例えばCD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71、CD133、CD138、CD235a、ALIX、シンテニン-1、シンテニン-2、Lamp2b、TSPAN8、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、MHC-I又はMHC-II成分、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B及びその任意の組合せであるが、EVへポリペプチド構築物を輸送できる他の多くのポリペプチドが、本発明の範囲に含まれる。EVタンパク質は、一般にヒト起源であり、Uniprot、RCSB、等など様々な一般公開されているデータベースに見ることができる。
用語「対象のポリペプチド」、「対象のタンパク質」、「対象の治療的ポリペプチド」、「PoI」、「生物治療の」、「生物学的」、及び「生物学的タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、例えば標的を結合することにより並びに/或いは他の任意の方法で相互作用パートナーと相互作用する及び/又はタンパク質を置き換える及び/又は既存の細胞内タンパク質を補充若しくは補い、それによって治療効果を発揮する治療目的に活用し得る任意のポリペプチドに関すると理解されるものとする。前記用語は、対象の治療的ポリペプチドの以下の非限定的な例を示し得る:抗体、細胞内抗体、一本鎖可変断片(scFv)、アフィボディ、生化学的な(bi-och)多重特異的抗体又は結合剤、受容体、リガンド、例えば酵素補充療法又は遺伝子編集ための酵素、腫瘍抑制剤、ウイルス又は細菌阻害剤、細胞構成タンパク質、DNA及び/又はRNA結合タンパク質、DNA修復阻害剤、ヌクレアーゼ、プロテイナーゼ、インテグラーゼ、転写因子、成長因子、アポトーシス阻害剤及び誘導剤、毒素(例えばシュードモナス外毒素)、構造タンパク質、NT3/4、脳由来神経栄養因子(BDNF)及び神経成長因子(NGF)等の神経栄養因子及び2.5Sβサブユニット等のその個々のサブユニット、イオンチャネル、膜輸送体、タンパク質恒常性因子、細胞のシグナル伝達に関係するタンパク質、翻訳及び転写関連タンパク質、ヌクレオチド結合タンパク質、タンパク質結合タンパク質、脂質結合タンパク質、グリコサミノグリカン(GAG)及びGAG結合タンパク質、代謝性タンパク質、細胞ストレス調節タンパク質、炎症及び免疫系調節タンパク質、ミトコンドリアタンパク質及び熱ショックタンパク質、等。好ましい一実施形態において、PoIは、Casポリペプチドが、EVによって一旦送達されると標的細胞においてそのヌクレアーゼ活性を実施することができるRNA鎖と関連する(すなわち、それを保有する)無傷のヌクレアーゼ活性を持つCRISPR関連(Cas)ポリペプチドである。別法として、別の好ましい実施形態において、Casポリペプチドは、標的した遺伝子工学を可能にするために触媒的に不活性である。更に別の方法は、単一RNA誘導性エンドヌクレアーゼCpfl等他の任意の型のCRISPRエフェクターであり得る。Cpf1は、ねじれ型の
二本鎖切断によって標的DNAを切断するので、PoIとしてのCpf1の包含は、本発明の特定の好ましい実施形態であり、Cpf1は、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)又はラクノスピラ(Lachnospiraceae)等の種から得ることができる。更に別の典型的な実施形態において、Casポリペプチドを、転写活性化因子(P3330コアタンパク質等)に融合して特異的に遺伝子発現を誘導することもできる。更なる好ましい実施形態は、リソソーム蓄積疾患の酵素、例えばイミグルセラーゼ等のグルコセレブロシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、α-L-イズロニダーゼ、イズロン酸2-スルファターゼ及びイデュルスルファーゼ、アリルスルファターゼ、ガルスルファーゼ、酸性αグルコシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、セラミダーゼ、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リソソーム酸リパーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、NPC1、NPC2、ヘパランスルファミダーゼ、N-アセチルグルコサミニダーゼ、ヘパラン-α-グルコサミニド-N-アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミン6-スルファターゼ、ガラクトース-6-硫酸スルファターゼ、ガラクトース-6-硫酸スルファターゼ、ヒアルロニダーゼ、α-N-アセチルノイラミニダーゼ、GlcNAcホスホトランスフェラーゼ、ムコリピン1、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼI、パルミトイル-タンパク質チオエステラーゼ1、トリペプチジルペプチダーゼ1、バテニン(battenin)、リンクリン(linclin)、α-D-マンノシダーゼ、β-マンノシダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、α-L-フコシダーゼ、シスチノシン、カテプシンK、シアリン、LAMP2及びヘキソサミニダーゼを含む群から選択されるPoIを含む。他の好ましい実施形態において、例えば、PoIは、炎症反応を修飾する細胞内タンパク質、例えばメチラーゼ及びブロモドメイン等の後成的タンパク質、又は筋肉機能を修飾する細胞内タンパク質、例えばMyoD若しくはMyf5等の転写因子、筋収縮を調節するタンパク質、例えばミオシン、アクチン、トロポニン等のカルシウム/結合タンパク質、又はジストロフィン、ユートロフィン、タイチン、ネブリン等の構造タンパク質、ジストロブレビン、シントロフィン、シンコイリン、デスミン、サルコグリカン、ジストログリカン、サルコスパン、アグリン及び/若しくはフクチン等のジストロフィン関連タンパク質であり得る。PoIは、その名前、他の任意の命名法によって、又は当技術に熟達した者に公知の通り特に明記しない限り、一般にヒト起源のタンパク質若しくはペプチドであり、それらはUniprot、RCSB、等など様々な一般公開されているデータベースに見ることができる。
用語「〜中に放出される」は、例えば「EV中に放出される」又は「標的細胞中に放出される」のような文脈において、EV(又は標的細胞)中に完全に及び/又は部分的に対象のポリペプチド(PoI)を放出することを意味すると理解され得る、すなわち、PoIは、EV(又は標的細胞)の内腔内に、EV(又は標的細胞)の膜内に完全若しくは部分的(例えば膜貫通配置)のいずれかに又はEV(又は標的細胞)膜の外側上へ放出される。前記用語は、EV膜(又は標的細胞)の外側上へのPoIの放出を意味すると理解することもできる。更に、それは任意の生体系、例えば特定の組織又は標的器官の中に放出されることも含み得る。
用語「内在的活性化」、「内在的起動」及びその変化形(例えば「内在的に活性化可能な」又は「内在的に起動される」)は、いかなる外来的刺激もない放出系によるPoIの放出の活性化、誘導及び/又は起動に関すると理解されるものとし、すなわち、PoIの放出は、周囲のエクソソーム及び/又は細胞及び/又は生物学的環境の単なる作用(例えばpHの変化、塩分等他の生理的パラメータの変化、結合パートナー間の競合、酵素活性、例えばタンパク質分解性活性、等の結果による)によりEV若しくは細胞中で起動される。
用語「供給源細胞」又は「EV供給源細胞」又は「親細胞」又は「細胞供給源」又は「EV産生細胞」又は他の任意の類似の用語は、適切な細胞培養状態、例えば懸濁培養又は付着培養又は他の任意の型の培養系の下でEVを産生する能力がある任意の型の細胞に関すると理解されるものとする。本発明の供給源細胞は、多様な細胞、例えば間葉系幹細胞若しくは間質細胞(例えば骨髄、脂肪組織、ホウォートンゼリー、周産期組織、歯蕾、臍帯血、等から入手できる)、羊膜細胞、羊膜上皮細胞、骨髄系サプレッサー細胞、1つの非限定的な例を示すヒト胎生腎(HEK)細胞の不死化細胞系、樹状細胞(DC)又はマクロファージ、単球、B細胞若しくはT細胞、NK細胞、好中球、好酸球、肥満細胞若しくは好塩基球等他の免疫系細胞、等から選択できる。一般に、EVは、本質的に任意の細胞供給源から得ることができ、それは、初代細胞供給源又は不死化細胞系である。EV供給源細胞は、人工多能性幹細胞(iPSC)及び任意の方法により得られる他の幹細胞を含めた任意の胚性、胎児性、成人性体細胞性幹細胞型であり得る。神経疾患を処置する場合、供給源細胞として、例えば一次ニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト、小膠細胞及び神経前駆細胞を活用することを考慮できる。供給源細胞は、処置しようとする患者に対する性質において同種異系、自己由来、又は更に異種のいずれかであり得、すなわち、細胞は、患者自身に由来の又は無関係の、一致する若しくは一致しないドナー由来であり得る。特定の文脈において、同種異系細胞は、特定の徴候を患っている患者の自己由来細胞からは得ることができない免疫調節性効果をもたらし得るので、医学的な見地から好ましい場合がある。例えば、末梢性又は神経性炎症を処置する文脈において、同種異系MSCは、そのような細胞から得られるEVとして好ましくあり得え、例えばマクロファージ及び/又は好中球表現型転換(炎症誘発性M1又はN1表現型からそれぞれ抗炎症症性M2又はN2表現型へ)による免疫調節を可能にできる。反対に、固形又は血液悪性腫瘍を処置するためにEVを活用する場合、EV産生細胞供給源としてDC等の免疫細胞を選択することが好ましい場合がある。
第1の態様において、本発明は、少なくとも1つの対象のポリペプチド(PoI)を含むEVに関し、少なくとも1つのPoIは、エクソソームポリペプチドに対して放出可能に結合されている。EV内への対象の治療的ポリペプチドの効率的且つ障害のない搭載及び内在的に起動される放出を可能にするために、エクソソームポリペプチドに対するPoIの結合は、放出可能である。PoIとエクソソームポリペプチドの間の放出可能な結合は、EV内部及び/又はその後の標的細胞若しくは標的組織内部へのPoIの内在的に活性化可能な放出が、搭載及び治療活性を最適化することを可能にする発明の放出系により媒介される特徴である。放出系は、外来的刺激を必要とせずに活性化又は起動され得る(すなわち、放出系が、細胞若しくはEV内又は本質的に任意の生体系内において内在的な活性により一般に起動される)様々な放出可能なポリペプチド相互作用系、例えばシス切断性ポリペプチドに基づく放出系(例えばインテインに基づく)、核局在化シグナル(NLS)-NLS結合タンパク質(NLSBP)に基づく放出系又は他のタンパク質ドメインに基づく放出系を含む群から選択され得るポリペプチドに基づく系である。一実施形態において、光の非常に短い加速だけが単量体タンパク質ドメインの内在的なタンパク質分解性切断を開始し、PoIを放出するために活用される場合、単量体光誘導性切断に基づく放出系が活用できる。
好ましい実施形態において、本発明は、インテイン放出系に放出可能に結合されている対象のポリペプチド、及び/又はインテイン放出系からEV内部若しくは標的細胞若しくは標的器官内部に放出される対象のポリペプチド(PoI)を含むEVに関する。インテイン放出系を利用する典型的なポリペプチド構築物を、以下に図式的に記述することができる(下の表記は、任意のC及び/又はN末端方向を例示するものと解釈されるべきではなく、単に実例目的であることを意味する):
PoI-シス切断性ポリペプチド-エクソソームタンパク質
別法として、ポリペプチド構築物は、EVの表面に示されることになる標的化部分を含み、対象の組織又は細胞型を標的することによりその治療的潜在性を更により増強させるように設計することができる:
PoI-シス切断性ポリペプチド-エクソソームタンパク質-標的化部分
シス切断性ポリペプチドに基づく放出系は、速い又は遅い切断放出系であり得る。特定の例において、速い切断シス切断性放出系(速い切断であるシス切断インテイン等)を活用することを選択できるが、他の設定において遅い切断放出系が有利になる場合もある。一般に、遅い切断放出系は、EVへのより長時間のPoIの搭載を可能にするのに利用できるが、EVを速やかに採取する必要がある場合、速い切断系が好ましい場合がある。
好ましい実施形態において、シス切断性放出系は、インテイン系に基づき、そこで、インテインのC末端部分は、アミノ酸配列Val-Val-Val-His-Asn又はVal-Val-Val-His-Asn-Cysを含み得る。短縮又は他の方法により最適化したインテイン、すなわち1つ以上のアミノ酸を除去又は置き換えて機能を増強したインテインを、本発明の目的のために使用することもできる。どんな原理に束縛されるものでもないが短縮又は機能増加突然変異は、インテインのpH応答性を増加させ、EVは、エンドサイトーシス過程によって細胞内に内部移行することができるので、その変異はEVに基づく送達システムからの生物活性PoIの放出においてその実用性を更に増加させ得ると推測される。しかしながら、より広く、シス切断性放出系は、他の様々なポリペプチドに基づく放出系、例えばソルターゼA、N末端プロテアーゼ、FrpC及びシステインプロテアーゼドメインを含むシス切断性系、又は他の適切なシス切断性放出系並びにその任意の組合せの群から選択できる。他の結合点、例えば内在性(integral)結合点を利用することもできるが、シス切断性放出タンパク質を、腔内エクソソームポリペプチド末端に有利に結合させて、EV内側又はEV膜内へのPoIの放出を可能にすることができる。
本発明の一実施形態において、PoIをEVへ導くエクソソームポリペプチドからのPoIの放出は、光誘導性切断により達成され得る。先行技術とは異なり、本発明は、短い光加速後に内在的活性化を受け、Kaede、KikGR、EosFP、tdEosFP、mEos2、PSmOrange並びにGFP様Dendraタンパク質Dendra及びDendra2等の単量体タンパク質を含む群から選択できる単量体光誘導性切断に基づく放出系を利用する。CRY2-CIBN等の光遺伝学的二量体化系とは異なり、Dendra、Kaede、KikGR、EosFP、tdEosFP、mEos2、PSmOrange及びDendra2等の単量体タンパク質は、PoI上に残りのポリペプチドドメインが少ししか残らないという利点を有し、このことは、送達されたPoIの生理活性が、負に影響を及ぼさないことを意味する。更に、光遺伝学的二量体化ドメインとは対照的に、光誘導性切断に基づく放出系は、制御にかなり容易であり、このことは、EV内へのPoIの搭載が、非常に正確であることを意味する。従って、本発明の光誘導性切断に基づいて放出される系は、適切な波長の光(Dendra、Kaede、KikGr及び他の大部分の光誘導性切断に基づく放出タンパク質の場合UV又は青色光のいずれか、PSmOrangeの場合赤色〜橙色スペクトルのより長い波長)に曝露するだけでin vitro並びにin vivo両方で、所望の時点及び所望の場所におけるPoIの高度に制御可能な放出を可能にする。重要なことに、切断に基づく光誘導性放出系は、切断の内在的過程を成し遂げるために光の非常に短い加速しか必要とせず、このことは、長く、扱いにくい光曝露期間の潜在的毒性効果を回避できることを意味する。光誘導性切断放出系に基づくポリペプチド構築物については、以下の通りに図式的に記述できる(下の表記は、任意のC及び/又はN末端方向を例示するものと解釈されるべきではなく、単に実例目的であることを意味する):
PoI-Dendra-エクソソームタンパク質
PoI-Kaede-エクソソームタンパク質
EV産生過程の間の適切な時間で、PoI、光誘導性切断系及びエクソソームポリペプチドを含むポリペプチド構築物は、適切な波長の光の加速に曝露され、その結果PoIの切断及び放出が生じる。UV又は青色光への短時間曝露と同時に、PoIとエクソソームポリペプチドの間に融合として挿入できるDendra又は他の単量体UV/青色光応答性光誘導性切断放出タンパク質は、内部ペプチド骨格切断によって切断され、PoI及びエクソソームタンパク質を放出する。少しのポリペプチドドメインが、PoI及びエクソソームポリペプチド両方に残る場合があるが、PoIの活性は、これらの少しの残基の存在により妨げられない。
本発明の更に別の実施形態において、放出系は、核局在化シグナル(NLS)結合ポリペプチド(NLSBP)とNLSとの相互作用に基づき得る。NLSBP-NLS放出系は、少なくとも1つの古典的又は非古典的NLSを含む少なくとも1つのPoIを含むことができる。更なる別法として、NLSBPに結合するが、NLSLS PoIの核内移行を起動させないNLS様配列(NLSLS)を使用することができる。NLSは、天然に存在するNLSLS又は重複するRNA/DNA結合ドメインを持つ若しくは持たないNLS(核に行くことになっている大部分のPoI、例えば転写因子及びヌクレアーゼの場合のような)、又はNLSを本質的に含まない、PoIに組換えにより融合されるNLSであり得る。エクソソームポリペプチドは、適切なNLSBP(例えば、インポーチンα若しくはβファミリー、例えばインポーチンαKPNA1、又は核内移行に関係する他の任意のタンパク質由来)を含むために次々に修飾され、その結果、NLS-NLSBP放出系の内在的活性化に関わるNLS含有PoIとNLSPB含有エクソソームポリペプチド間の放出可能な結合が得られる。PoIの放出のトリガーは、異なるNLS-NLSBP対間の競合により一般に駆動され、PoIの放出をもたらす。NLS-NLSBP放出系に基づくポリペプチド構築物を、以下に図式的に記述することができる(下の表記は、任意のC及び/又はN末端方向を例示するものと解釈されるべきではなく、単に実例目的であることを意味する):
PoI-NLS-NLSBP-エクソソームタンパク質
上述の通り、標的細胞中に存在するNLSBPは、NLSBP含有エクソソームポリペプチドを打ち負かすことになり(NLS含有PoIのEVに媒介される送達による)、その結果PoIは、内在的に遊離され、正しい細胞区画に輸送される。当然ながら、NLSBP-NLSに基づく放出系は、核及び/又は核小体においてそれらの所望の活性を発揮することになる対象のポリペプチドに非常に適しているが、細胞質又は他の細胞内区画へ行くことになる対象のタンパク質も、特にNLSの代わりにNLSLSを使用する場合、NLS-NLSBP放出系に適合する。NLSBP-NLS放出系の非限定的な例は、以下を含むことができる:KPNA1-NRF2、KPNA6-STAT3、KPNB1-STAT3、及びKPNA2-HSF1。NLSBPは、インポーチンα及びβファミリー由来のインポーチン並びにKPNA1、KPNA2、KPNA3、KPNA4、KPNA5、KPNA6、KPNA7、KPNB1、IPO4、IPO5、IPO7、IPO8、IPO9、IPO11、IPO13、TPNO1、TNPO2、TNPO3、HIKESHI、SNUPN、HEATR3を含めた他のNLS結合タンパク質、及び他のRAN結合タンパク質を含むことができる。NLS含有タンパク質は、CREB、C/EBP、bZIP、bHLH、MyoD、cMyc、SERBP、NF-1、Cys4、GATA-因子、OCT4、NANOG、KLF4、SOX2、HSF1、STAT3、SMAD3、p53、MEF2、SRF、NFkB、CAS9、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、hnRNPAI、hnRNPA2、NUP153、RPL23A、RPS7、RPL5、RPL23A、H2A、H2B、H3及びH4ヒストン、TNRC6A、SRP19、SNAI1、PRKCI、HSP70、U1 snRNP、U2 snRNP、U4 snRNP、U5 snRNP及びU6 snRNP等の転写因子、ヌクレアーゼ並びに他の核タンパク質等、非限定的な例から選択することができる。一般に、適切なPoIの非限定的な例は、例えば、Cas及びCas9(他の細菌のうちで化膿連鎖球菌[Streptococcus pyogenes]由来RNA誘導性DNAエンドヌクレアーゼである)等のヌクレアーゼ;NF-κΒ及びNRF2等の転写関連タンパク質;ヒストン及びポリメラーゼ等のDNA結合タンパク質;hnRNPAI-2及びそれを使用して様々な型のRNAを輸送できるMS2コートタンパク質等のRNA結合タンパク質;核標的を持つ抗体並びに/又は細胞内抗体、NPC1、NPC2及びGBA等の酵素補充療法のための酵素、等である。本発明の好ましい例は、CD63にKPNA1を融合させ、MSC又は羊膜上皮細胞等適切なEV供給源細胞においてMyoDと共に同時発現させ、それにより例えばDMDの処置において強い適用性を持つ治療的EVを得ることである。
上述の通り、本発明は、一般に治療又は予防的目的であるが、また潜在的に化粧用途のための、本質的に任意の対象のポリペプチド(PoI)を含むEVに基づく治療物質に関する。PoI(単数)又は複数(すなわち1つ以上)のPoIが活用される場合、PoIは、任意の適切なポリペプチド、すなわち複数のアミノ酸を含む任意の分子、すなわちタンパク質又はペプチドであり得る。PoIは、治療的、予防的又は化粧用ポリペプチドの以下の非限定的な例のいずれかから選択することができる:抗体、細胞内抗体、一本鎖可変断片(scFv)、アフィボディ、生化学的な多重特異性抗体又は結合剤、受容体、リガンド、リソソーム蓄積症(LSD)において欠失及び/若しくは欠損している酵素等の酵素、p53、pVHL、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7及びST14等の腫瘍抑制遺伝子、ウイルス若しくは細菌阻害剤、細胞成分タンパク質、DNA及び/若しくはRNA結合タンパク質、Cas、Cas9及びCpf1等のヌクレアーゼ、プロテイナーゼ、インテグラーゼ、転写因子、成長因子、アポトーシス阻害剤及び誘導剤、構造タンパク質、イオンチャネル、膜輸送体、タンパク質恒常性因子、細胞のシグナル伝達に関係するタンパク質、翻訳及び転写関連タンパク質、ヌクレオチド結合タンパク質、タンパク質結合タンパク質、脂質結合タンパク質、グリコサミノグリカン(GAG)及びGAG結合タンパク質、代謝性タンパク質、細胞ストレス調節タンパク質、炎症及び免疫系調節タンパク質、ミトコンドリアタンパク質及び熱ショックタンパク質、等。EVが、非常に効率的な様式で細胞内環境に届くことが可能になるという事実は、非常に多くの細胞内標的が新薬の開発につながることを意味する。従って、治療用の対象タンパク質(PoI)は、一般に細胞内標的に結合するタンパク質(例えばC-myc等の腫瘍形成タンパク質に対する細胞内抗体、又はその細胞内相互作用パートナーを結合するデコイ受容体)又は所望の効果を細胞内に発揮することになるPoI(PoIは、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー[DMD]の処置としてのジストロフィン、欠落若しくは欠損タンパク質を置きかえるためのPoI[酵素補充療法のための、NPC1、GBA若しくはAGAL、等のようなこれら酵素]、ハンチンチンタンパク質又は例えばハンチントン舞踏病若しくは他の神経変性障害の処置のためのBDNFであり得る)、がんの処置のためのp53等の腫瘍抑制遺伝子又は炎症性疾患の処置のためのNFkB阻害剤のいずれかである。本発明のEVにより送達される細胞内抗体の対象となる標的は、α-シヌクレイン、LRRK2、Tau、β-アミロイド、APP、C9orf72、SOD1、TDP43、FUS及びプリオンタンパク質の病理学的形態を含み得る。相当な治療的潜在性を持つPoIの1クラスは、RNA結合タンパク質(RBP)であり、そのタンパク質を使用して、mRNA、短ヘアピンRNA若しくはマイクロRNA等のRNAi剤、又はスプライシング切り替え若しくはサイレンシングためのアンチセンス剤等RNA治療物質の細胞内送達を補助することができる。RNA結合タンパク質の非限定的な例は、hnRNPAI、hnRNPA2B1、DDX4、ADAD1、DAZL、ELAVL4、IGF2BP3、SAMD4A、TDP43、FUS、FMR1、FXR1、FXR2、EIF4A1-3、MS2コートタンパク質及びその任意のドメイン、部分又は誘導体である。より広範には、RNA結合タンパク質の特定のサブクラス及びドメイン、例えばmRNA結合タンパク質(mRBP)、プレrRNA結合タンパク質、tRNA結合タンパク質、小核又は核小体RNA結合タンパク質、非コードRNA結合タンパク質及び転写因子(TF)である。更に、様々なドメイン及び誘導体が、RNA積荷を輸送するためのPoIとして使用され得る。RNA結合PoIの非限定的な例には、小RNA結合ドメイン(RBD)(DEAD、KH、GTP_EFTU、dsrm、G-patch、IBN_N、SAP、TUDOR、RnaseA、MMR-HSR1、KOW、RnaseT、MIF4G、zf-RanBP、NTF2、PAZ、RBM1CTR、PAM2、Xpo1、Piwi、CSD及びRibosomal_L7Ae等の一本鎖並びに二本鎖RBD[ssRBD及びdsRBD]の両方であり得る)がある。そのようなRNA結合ドメインは、主要な機能(すなわち、対象のRNA積荷、例えばmRNA又は短いRNAを輸送する能力)が維持される限り、複数、単独又は他との組み合わせで存在することができ、従ってより大きいRNA結合タンパク質構築物の部分を形成することもできる。
更に上述の通り、本発明のエクソソームポリペプチドは本質的に、EVへの少なくとも1つのPoIの輸送を可能にする任意の適切なポリペプチドであり得る。上述の通り、EVに輸送された後のPoIの実際の局在化は、エクソソームポリペプチドの性質及び/又はPoIの性質によって変化し得、すなわち、PoIは、EVの内腔、EV膜、膜関連位置、及び/又はEVの他の任意の適切な部分に輸送され得る。そのようなエクソソームポリペプチドの非限定的な例は、例えばCD81、Itabl、Mfge8、CD63、CD151、Hspg2、Lgals3bp、Col6a1、Agrn、Tspan14、Lamc1、Lambl、Tfrc、CD47、CD82、Slit2、シンテニン、Alix、シンデカン、シナプトタグミン、Lamp2、Lamp2b、CD13、CD86、フロチリン、シンタキシン-3、LiCAM、LFA-1、Mac-1α及びβ、Vti-1A及びB、ICAM-1、CD2、CD18、CD37、CD36、CD53、CD82、CXCR4、FcR、CD40、CD40L、CD41a、CD44、CD45、及びテトラスパニン、GluR2/3、HLA-DM、免疫グロブリン、MHC-I又はMHC-II及びその成分、及びTCRβ、並びにEVへPoIを含むポリペプチド構築物を輸送することができる多くの他のポリペプチドである。
更に別の実施形態において、本発明のEVは、少なくとも1つの標的化部分を更に含む。一般に、標的化部分は、一般に標的化部分とEVタンパク質との融合タンパク質の形態でEVの表面に存在して(すなわち、EV膜から小胞外部環境に突出する)、in vivo及び/又はin vitroで正しい組織若しくは細胞型に届くことを促進する。EVは、選択した組織又は区画への浸透を増加させるために浸透エンハンサーを更に含むこともできる。そのような浸透エンハンサーは、適切なエクソソームポリペプチドとの融合構築物としてEVの表面で発現されるペプチド又はポリペプチドであり得る。浸透エンハンサーは、例えば細胞浸透ペプチド(CPP)(Tat、トランスポータン、トランスポータン10、ポリ-Arg、MPG、Pep-1、ペネトラチン、等など)、抗体(内部移行を促進する細胞表面受容体を標的することができる、例えばトランスフェリン受容体又はインシュリン受容体)、若しくはアフィボディ、又はEVの内部移行及び/若しくは組織透過性を増加させることになる他の任意の型の分子であり得る。標的化部分と同様に、浸透エンハンサーは、エクソソームポリペプチドと少なくとも1つの浸透エンハンサーとの融合構築物を作製することによってEVの表面で発現させることができる。
更に別の態様において、本発明は、強い治療効果を持つEVを大量に製造する非常に有効な方法に関係する。本発明の方法は、(a)供給源細胞に、少なくとも1つのPoI、内在的に活性化可能なポリペプチドに基づく放出系、及びエクソソームポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド構築物を導入する工程と、(b)ポリヌクレオチド構築物から対応するポリペプチドを発現させる工程とを含む。一般に、本方法は、(c)供給源細胞により生成された(すなわち、放出された)EVを回収し、PoIが、タンパク質に基づく放出ドメインを内在的に起動させることによりそのEV内に放出される工程も含む。
供給源細胞(一般に、EVの製造に適切なEV産生細胞型を含む細胞培養)への適切なポリヌクレオチド構築物の導入は、トランスフェクション、ウイルス媒介形質転換、エレクトロポレーション、等など様々な従来通りの技術を使用して達成することができる。トランスフェクションは、リポソーム、CPP、陽イオン性脂質又はポリマー、リン酸カルシウム、デンドリマー、等など従来通りのトランスフェクション試薬を使用して実施できる。ウイルス媒介トランスフェクションも非常に適した方法論であり、アデノウイルス又はレンチウイルスベクター等従来通りのウイルスベクターを使用して実施できる。ウイルス媒介形質転換は、細胞バンキング用の安定な細胞系を作製する、すなわちEV産生細胞供給源のマスター細胞バンク(MCB)及び作業細胞バンク(WCB)を作製する場合、特に関連する。
特定の例において、供給源細胞に2つ以上のポリヌクレオチド構築物を導入することが、有利になり得る。これは、例えばNLS-NLSBP放出系を利用する場合の場合であり得る。そのような場合において、ポリヌクレオチド構築物によりコードされるポリペプチド構築物は別々に翻訳され、その後翻訳後供給源細胞内でポリペプチド間(例えば、NLSを含むPoIとNLSBPに融合されているエクソソームタンパク質)で望ましい特定の相互作用をすることになる。他方でDendraに基づく放出系又はシス切断性放出系(例えばインテイン放出系)等の単量体系を利用する場合、供給源細胞に単一ポリヌクレオチド構築物を導入して、単一ポリペプチド構築物をコードさせることが、より有利になる場合もある。更なる実施形態において、細胞培養の細胞によるEVの製造は、EV産生の増加を誘導し得る異なる条件に細胞を曝露することによって増強することができる。血清飢餓、低酸素、TNFα又はインターフェロン等のサイトカインへの曝露、バフィロマイシンのような抗生物質、及び他の物質は、EV製造、収率、更にはEVの品質を高めるために使用できる方法である。
更なる態様において、本発明は、発明のポリヌクレオチド及びポリペプチド構築物にも関係する。本発明のポリヌクレオチド構築物は、少なくとも1つのPoI、少なくとも1つの内在的に活性化可能なポリペプチドに基づく放出系又はポリペプチドに基づく放出系の一部及び少なくとも1つのエクソソームポリペプチドをコードするヌクレオチド区間を一般に含む。非限定的な例は、リソソーム蓄積疾患の処置のための酵素PoI(NPC1又はGBA等)、シス切断性インテイン及びCD81、シンテニン又はCD63等のエクソソームポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物になり得る。従って、本発明は、対応するポリペプチド構築物、すなわち少なくとも1つのPoI、少なくとも1つの内在的に起動されるポリペプチドに基づく放出系又はポリペプチドに基づく放出系の一部、及び少なくとも1つのエクソソームポリペプチドを含むポリペプチド構築物にも当然ながら関する。更に、本発明は、上述のポリヌクレオチド構築物及び/又は上述のポリペプチドを含むEV産生細胞(一般に細胞は、細胞培養の形態だけでなく、個々の細胞それ自体で存在する)にも関係する。
別の態様において、本発明は、in vitro又はin vivoで細胞内環境又は標的細胞の膜にPoIを送達する方法に関する。本方法は、標的細胞を(i)内在的に活性化可能なペプチドに基づく放出系を使用してエクソソームポリペプチドに放出可能に結合されたPoI又は(ii)エクソソームポリペプチドからEVの内側又は標的細胞の内側のいずれかに放出されたPoIのいずれかを含むEVと接触させる工程を含む。重要なことに、先行技術とは異なり、本発明のPoIは、実質的にコンジュゲートされていない形態で標的細胞に送達され、すなわち、問題のPoIは、PoIの活性を潜在的に妨げる可能性がある大きいエクソソームタンパク質(又は二量体光遺伝学的タンパク質の場合において、光遺伝学的二量体)にコンジュゲートされない。例えば、WO2014/168548は、エクソソームタンパク質にコンジュゲートされる対象の治療的ポリペプチドを含むエクソソームを教示しており、それは、エクソソームタンパク質にコンジュゲートされるにもかかわらず意図した活性を発揮する能力がある特定の型の治療用タンパク質に対する優れた戦略である。しかしながら、本発明の方法は、いかなる外来的刺激も必要とせずに所望の位置においてPoIを遊離させる本発明の制御可能で内在的に活性化可能な放出系によって、より広範囲の治療的PoIの送達を可能にする。
本発明のある特定の実施形態において、PoIは、内在的に起動されるタンパク質に基づく放出系によりエクソソームポリペプチドにコンジュゲートされている膜内在性タンパク質であり得る。膜内在性PoIは、EVの外側、内側又は両方の表面に提示され得る。どんな原理に束縛されるものでもないが、標的細胞への取り込みに続いて、膜内在性PoIを含むポリペプチド構築物を含むEVは、小胞体(ER)に輸送されると推測される。EVの内容物、すなわち膜内在性PoIを含むポリペプチド構築物は、ERでプロセッシング及びソーティングされ、続いて標的細胞の適当な区画へERに媒介されて輸送される。従って、ポリペプチドに基づく放出系により血漿膜内在性タンパク質(例えばGタンパク質共役受容体[GPCR])にコンジュゲートされているエクソソームタンパク質を含むポリペプチド構築物は、標的細胞の原形質膜に経路指定されることになり、一方でリソソーム膜中に天然に存在する膜タンパク質(すなわちリソソーム膜タンパク質)は、標的細胞のリソソームに経路指定されることになる。膜PoIの特に重要な例は、NPC1であり、これはコレステロールの膜輸送体であり、欠損している場合貯蔵障害であるニーマンピック病をもたらす。
PoIの放出は、上で概説した通り、PoI及び/又はエクソソームポリペプチドに融合される内在的に活性化可能なポリペプチドに基づく放出系に媒介される。有利な実施形態において、その後のポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド構築物は、PoIとエクソソームポリペプチドの間に放出系を置くような方法で設計される。この配置は、構築物の簡単な製造及び所望の位置におけるPoIの効率的な放出を可能にする。
更に別の態様において、本発明は、本発明のEVを含む医薬組成物に関係する。一般に、本発明の医薬組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤と製剤化される治療的EV(すなわち特定の所望のPoIを含む、有するEVの集団)の少なくとも1つの型を含む。少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤は、任意の薬学的に許容される材料、組成物又は媒体、例えば固体若しくは充填剤、希釈剤、賦形剤、担体、溶媒又は封入材料を含む群から選択することができ、それらは、例えば、治療的送達小胞を懸濁し、その活性を維持し又は保有し又はある器官若しくは身体の部分から別の器官若しくは身体の部分へ輸送する(例えば血液から任意の組織及び/又は器官及び/又は対象の身体部位)ことに関係し得る。
本発明は、PoIを含むEVの化粧用の適用にも関する。従って、本発明は、乾燥皮膚、しわ、たるみ、隆起、並びに/又は皮膚しわ等の症状及び問題を改善及び/又は軽減するための、適切なEVを含むクリーム、ローション、ゲル、乳液、軟膏、ペースト、粉末、塗布薬、日焼け止め、シャンプー、等などの皮膚手入れ製品に関係する。化粧用及び治療的両方の性質の実施形態において、本発明のEVは、PoIとしてボツリヌス毒素(例えばボトックス、例えばボツリヌス毒素A〜G型)を含むことができる(ボツリヌス毒素は、必ずしも化粧用の適用だけに使用できるというわけではなく、例えば片頭痛及び筋緊張異常の処置に適用される場合もある)。好ましい実施形態において、再生特性がある適切なエクソソーム産生細胞(間葉系幹細胞等の)から得られるEV(少なくとも1つの型のPoIを含む)は、しわ、線、たるみ、隆起及び/又は皮膚しわの化粧用若しくは治療的緩和に使用する化粧用クリーム、ローション若しくはゲルに含まれる。
更に別の態様において、本発明は、医薬に使用するための本発明のEVに関する。当然ながら、本発明のPoIを含むEVが、医薬に使用される場合、そのEVは、実際には通常、使用されるEVの集団である。患者に投与されるEVの用量は、EVに搭載されたPoIの量、処置又は軽減しようとする疾患若しくは症状、投与経路、PoI自体の薬理作用、及び他の様々な関連パラメータにより決まることになる。
本発明のEVは、予防的及び/又は治療的目的、例えば、様々な疾患並びに障害の予防及び/又は処置及び/又は緩和に使用され得る。本発明のEVが適用され得る疾患の非限定的なサンプルは、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、特発性肺線維症、乾癬、腫瘍壊死因子(TNF)受容体関連周期性症候群(TRAPS)、インターロイキン1受容体アンタゴニスト欠損症(DIRA)、子宮内膜症、自己免疫性肝炎、硬皮症、筋炎、脳卒中、急性脊髄損傷、脈管炎、ギラン-バレー候群、急性心筋梗塞、ARDS、敗血症、髄膜炎、脳炎、肝不全、腎不全、移植片対宿主病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー及び他の筋ジストロフィー、ゴーシェ病、ファブリー病、MPS I、II(ハンター症候群)及びIII、ニーマンピック病、ポンペ病、等などのリソソーム蓄積症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病及び他のトリヌクレオチド反復関連疾患を含めた神経変性疾患、痴呆、ALS、がん誘導悪液質、摂食障害、2型真性糖尿病並びに様々ながんを含む。
事実上、全ての型のがん、例えば、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌腫、AIDS関連がん、AIDS関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、小脳又は脳基底細胞癌腫、胆管がん、膀胱がん、骨腫瘍、脳幹部神経膠腫、脳がん、脳腫瘍(小脳神経膠星状細胞腫、大脳星細胞腫/悪性神経膠腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路及び視床下部神経膠腫)、乳がん、気管支腺腫/カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍(小児期、消化管)、原発巣不明の癌、中枢神経系リンパ腫、小脳神経膠星状細胞腫/悪性神経膠腫、子宮頸がん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸がん、皮膚T細胞性リンパ腫、線維形成性小細胞腫瘍、子宮体がん、上衣細胞腫、食道がん、頭蓋外胚細胞腫、性腺外生殖細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、眼がん(眼内黒色腫、網膜芽細胞腫)、胆嚢がん、胃部(胃)がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍(GIST)、胚細胞腫(頭蓋外、性腺外又は卵巣)、妊娠性絨毛性腫瘍、神経膠腫(脳幹、大脳星細胞腫、視覚路の神経膠腫及び視床下部神経膠腫)、胃カルチノイド、有毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞性(肝臓)がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、島細胞癌腫(内分泌すい臓)、カボジ肉腫、腎臓がん(腎細胞がん)、喉頭がん、白血病([急性リンパ性{急性リンパ球性白血病とも呼ばれる}、急性脊髄性{急性骨髄性白血病とも呼ばれる}、慢性リンパ性{慢性リンパ性白血病とも呼ばれる}、慢性骨髄性{慢性骨髄性白血病とも呼ばれる}、有毛細胞白血病])、唇及び口、腔がん、脂肪肉腫、肝臓がん(原発性)、肺がん(非小細胞、小細胞)、リンパ腫([エイズ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚T細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫{ホジキンリンパ腫以外の全てのリンパ腫の古い分類}、原発性中枢神経系リンパ腫])、髄芽細胞腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明転移性頸部扁平上皮がん、口がん、複合内分泌腺新生物症候群、多発性骨髄腫/形質細胞新生物、菌状息肉腫、脊髄形成異常/脊髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病(急性、慢性的)、骨髄腫、鼻腔及び副鼻腔がん、上咽頭癌腫、神経芽細胞腫、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫/骨悪性線維性組織球症、
卵巣がん、上皮性卵巣がん(表層上皮性間質性腫瘍)、卵巣胚細胞腫瘍、低悪性度卵巣腫瘍、すい臓がん、すい臓島細胞がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、クロム親和性細胞腫、松果体の星状細胞腫、松果体胚腫、松果体芽細胞腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腺腫、胸膜肺芽細胞腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん(腎臓がん)、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫(腫瘍肉腫、カボジ肉腫、軟部組織肉腫、子宮肉腫のユーイングファミリー)、セザリー症候群、皮膚がん(非黒色腫、黒色腫)、小腸がん、扁平上皮細胞、頸部扁平上皮がん、胃がん、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣がん、喉頭がん、胸腺腫及び胸腺癌腫、甲状腺がん、腎盂及び尿管の移行細胞がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、及び/又はウィルムス腫瘍が本発明の関連する標的である。
本発明のEVは、様々な異なる投与経路、例えば耳介(耳)、口腔、結膜、皮膚、歯、電気浸透、子宮頸管、洞内、気管内、腸内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸潤、間質、腹腔内、羊水内、動脈内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、心臓内、軟骨内、仙骨内、静脈内、腔内、脳内、大槽内、角膜内、歯冠内の(歯)、冠内、身体海綿体内、真皮内、円板内、管内、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、回腸内、病巣内、腔内、リンパ腺内、脊髄内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹膜内、胸膜内、前立腺内、肺内、洞内、脊椎内、滑膜内、腱内、精巣内、くも膜下腔内、胸腔内、尿細管内、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈、静脈ボーラス、点滴静注、心室内、膀胱内、硝子体内、イオン導入、潅注、喉頭部、経鼻、経鼻胃、密封包帯法、眼、経口、口咽頭、他の、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器(吸入)、眼球後、軟部組織、クモ膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮、経粘膜、経胎盤性、経気管、経鼓膜、尿管、尿道及び/又は膣投与並びに/又は上記投与経路の任意の組合せによってヒト又は動物対象に投与され得る。
更なる態様において、本発明は、上述の通り、(a)細胞供給源(一般に細胞培養)に少なくとも1つのPoI、内在的に活性化可能なポリペプチドに基づく放出系及びエクソソームポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチド構築物を導入する工程と、(b)ポリヌクレオチド構築物によりコードされるポリペプチド構築物を発現させる工程と、(c)細胞により生成されたEVを回収する工程とを含む、EVを製造する(又は、EVの集団をより正確に製造する)方法に関する。PoIを放出するために単量体光誘導切断系を活用する場合、次いで、適切な波長の光にEVを短時間曝露する追加の工程が、製造方法に追加される。光曝露工程は、EVが細胞培養培地に単に放出された場合、EVが、更に加工された(例えばタンジェンシャルフローフィルトレーション[TFF]、限外濾過、ビーズ溶離クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー又はその任意の組合せによる)場合、又は細胞供給源、EV製造の特徴及びEVそれ自体に応じて本質的に適切な場合はいつでも、EVが細胞内でなお形成されている間ずっと行われ得る。適切な培養系は、従来通りの2次元細胞培養、3次元細胞培養、バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、等がある。
本方法は、血清飢餓、低酸素、バフィロマイシン、又はTNF-α及び/若しくはIFNγ等のサイトカインに供給源細胞を曝露して、得られるEVの収量若しくは特性に影響を与える工程も含み得る。EV製造規模及びスケジュールは、EV産生細胞又は細胞系に大きく左右されることになり、従ってそれ故当技術に熟達した者により適応され得る。
製造方法は、精製工程を更に含むことができ、EVは、液体クロマトグラフィー(LC)、ビーズ溶出LC、サイズ排除LC、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、回転濾過、タンジェンシャルフローフィルトレーション、中空繊維濾過、遠心分離、免疫沈降、等又はその任意の組合せを含む群から選択される手順によって精製される。
有利な実施形態において、EVの精製は、濾過の連続した組合せ(好ましくは限外濾過[UF]、タンジェンシャルフローフィルトレーション[TFF]又は中空繊維濾過)及びビーズ溶出又はサイズ排除液体クロマトグラフィー(LC)を使用して実施される。精製工程のこの組合せにより、最適化された精製を得られ、優れた治療活性をもたらす。更に、エクソソームを精製するために日常的に利用される超遠心分離(UC)と比較して、連続的な濾過クロマトグラフィーは、大幅に速く、より大きな製造容積の規模にすることが可能であり、これは先行技術の中心である現在のUC方法論の有意な欠点である。
上記で例証された態様、実施形態、代替物及び変化形態は、本発明の範囲を逸脱しない範囲で修飾が可能なことが理解されるものとする。ここで本発明を、同書に記載された実施例により更に例示するが、当然ながらこれらもまた本発明の範囲及び要旨を逸脱することなく大幅な改変が可能である。
材料及び方法
- 構築物設計及びクローニング
様々なシス切断性の内在的に活性化可能なポリペプチドに基づく放出系(遅い切断インテイン、速い切断インテイン、ソルターゼA及びFrpC等)を、いくつかのPoI(Cre、NPC1、IL10、RNA結合MS2コートタンパク質等)及びエクソソームポリペプチド(CD81、CD63、CD9、シンテニン、シンデカン、Alix、CD133、等)と組み合わせて評価した。同様に、様々なNLS-NLSBP放出系及び単量体光誘導放出系を、PoI並びにEVタンパク質と一緒に評価した。NLS-NLSBP系は:KPNA1-NRF2、KPNA6-STAT3、KPNB1-STAT3、KPNA2-HSF1を含む。NLSBPは、インポーチンα及びβファミリー由来のインポーチン並びにKPNA1、KPNA2、IPO8、TPNO1、HIKESHI、SNUPN、HEATR3を含めた他のNLS結合タンパク質、及び他のRAN結合タンパク質を含む。NLS含有タンパク質は、bHLH、MyoD、cMyc、HSF1、STAT3、p53、NFkB、Cas9、HSP70及びU1 snRNP等様々な転写因子、ヌクレアーゼ並びに他の核タンパク質を含む。単量体光誘導切断系には:Kaede、KikGR、EosFP及びDendraがある。PoIには、NPC1、GBA、AGAL、ハンチンチン、BDNF、NFkB超リプレッサー、hnRNPAI、MS2コートタンパク質、G-パッチ等のRNA結合タンパク質及びドメイン、等がある。RNA結合タンパク質の場合において、これらは、対象のポリヌクレオチドと組み合わせられ、前記RNA結合タンパク質は、そのポリヌクレオチドをEVに引きずり込む。多数のエクソソームタンパク質:CD81、CD63、CD9、シンデカン、Alix、CD133、シンテニン-1、シンテニン-2、Lamp2b、TSPAN8及びTSPAN14、並びにそのバリアント及びドメインを評価した。
シス切断性放出系構築物及び単量体光誘導切断系を評価する場合、ORFを、合成により一般に生成し、哺乳動物の発現ベクターpSF-CAG-Ampにクローニングした。簡潔には、合成したDNA及びベクタープラスミドを、製造業者の説明書(NEB)の通り酵素Notl及びSallで消化した。制限消化し、精製したDNA断片を、製造業者の説明書(NEB)の通りT4リガーゼを使用して共にライゲートした。成功したライゲーション事象を、アンピシリンを補充したプレート上での細菌形質転換により選択した。トランスフェクション用プラスミドを、製造業者の説明書の通り、「maxi prep」により生成した。
NLS-NLSBP放出系の場合において、翻訳によりNLSBPタンパク質がエクソソームポリペプチドに融合されたキメラとして発現されるように、ORF配列を、通常購入し(Origene Technologies社)、増幅し、pIRESバイシストロニック発現ベクター(Clonetech, Laboratories Inc)のMSC A部位にクローニングした。時には遺伝子修飾を含めて、NLSを、NLSを欠いているPoIに融合し、又はすでにPoI上に存在する場合、現状のまま使用した。大部分のクローニングはNEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit(NEB社)を使用して実行し、サンガー配列決定法(Source Bioscience社)を使用して確認した。pIRESベクターは、両方の導入遺伝子の同時のバイシストロニック発現を可能にし、EVを産生する細胞が、両方の導入遺伝子を同時に発現するようになることを確実にする。プラスミドを、NEB 5-αコンピテント大腸菌細胞(NEB社)に形質転換し、製造業者の推奨に従って振盪培養器内で終夜成長させた。プラスミドを単離し、製造業者の説明書の通り「maxi-prep」キット(Macherey-Nagel社)を使用して精製した。
- 細胞培養及びトランスフェクション
実験設計及びアッセイに応じて、特定の場合において、非ウイルス性の一過性トランスフェクション及びエクソソーム製造を、従来通りの2次元細胞培養で実施し、他の場合においてウイルスに媒介される形質導入を利用して、安定な細胞系を創出し、それら細胞系は、典型的には、異なる型のバイオリアクターにおいて培養された。簡潔化のために、ほんの少数の例だけを、本明細書において言及する。
ATCCにより推奨されるように、HEK293T細胞を、典型的には、15cmシャーレに播種し(シャーレ当たり9×106個細胞)、血清含有DMEM中で終夜放置した。翌日、細胞を、細胞へ直接添加したリポプレックス化DNAで一過性にトランスフェクトした。簡潔には、DNA及びポリエチレンイミン(PEI)を、OptiMEM中で5分間別々にインキュベートし、その後室温で20分間一緒に組み合わせた。リポプレックス化したDNA及び細胞を、6時間同時インキュベートし、その後馴化培養培地をOptiMEMへ48時間交換した。シャーレ、フラスコ並びに他の細胞培養容器において評価した他の細胞及び細胞系は、骨髄由来間葉性間質細胞(BM-MSC)及びホウォートンゼリー由来MSC(WJ-MSC、羊膜細胞、線維芽細胞、様々な内皮及び上皮細胞並びに様々な免疫細胞及び細胞系を含んだ。
ウイルス形質導入並びにPoI、放出系及びエクソソームポリペプチドの様々な組合せの安定な細胞系を作製する場合において、BM-MSC、WJ-MSC、線維芽細胞、羊膜細胞、線維芽細胞、様々な内皮及び上皮細胞等の細胞供給源を、典型的には、レンチウイルス(LV)を使用してウイルス形質導入した。典型的には、感染24時間前に、100000個の細胞(例えば線維芽細胞、MSC、等)又は200000個の細胞(例えばHEK293T)を、6ウェルプレートに播いた。LV 2uL及び任意選択でポリブレン(又は臭化ヘキサジメトリン、ウェル上で終濃度8μg/mL)を添加し、形質導入24時間後に形質導入した細胞の細胞培地を、新鮮な完全培地に交換した。形質導入72時間後に、ピューロマイシン選択(4〜6pg/mL)を通常通り7日間実行し、その後ポリペプチド構築物の安定発現を分析した。
安定な細胞を、2次元培養又はバイオリアクターのいずれか、典型的には中空繊維バイオリアクター中で培養し、馴化培地をエクソソーム調製のためにその後に採取した。様々な調製及び精製工程を、実施した。標準的な作業の流れは、上清の事前清浄化、濾過に基づく濃縮、タンパク質汚染物質のクロマトグラフィーに基づく除去の工程並びにin vitro及び/又はin vivoアッセイに適切な緩衝液に得られたエクソソーム組成物を任意選択で調製する工程を含む。
- アッセイ及び分析学
ウェスタンブロットは、EV中のPoIの富化を評価するのに非常に簡便な分析方法である。簡潔には、SDS-PAGEを、製造業者(Invitrogen社、Novex PAGE 4〜12%ゲル)の説明書に従って実行し、その際1×1010個エクソソーム及び20ug細胞溶解物を、ウェル当たりローディングした。SDS-PAGEゲルからタンパク質を、製造業者(Immobilon、Invitrogen社)の説明書に従ってPVDF膜に移した。膜を、Odysseyブロッキング緩衝液(Licor)中でブロッキングし、供給元の説明書に従ってPoI及びエクソソームタンパク質に対する抗体でプローブした(一次抗体-Abeam、二次抗体-Licor)。分子プローブを、波長680及び800nmで可視化した。図14は、PoIとしてCreリコンビナーゼ及びエクソソームタンパク質としてAlixを組合せたこの実例を示す。
EVサイズ決定のために、ナノ粒子トラッキング解析(NTA)を、分析ソフトウェアを備えたNanoSight機器で実行した。全ての記録について、カメラレベル13又は15及び全ての取得後設定に自動機能を使用した。電子顕微鏡観察及び蛍光顕微鏡観察を頻繁に使用して、PoI位置及び放出を理解し、EVを定量化し、分析した。
EVを、様々な方法、典型的にはTFF及びLC等の濾過の組合せを使用して単離精製した。典型的には、、EV含有培地を回収し、300gで低速度回転に5分間、続いて2000g回転に10分間供して、より大きな粒子及び細胞残屑を除去した。上清を、次いで0.22μm注射器フィルターで濾過し、異なる精製工程に供した。大容量を透析濾過し、100kDa分画フィルターを用いるVivaflow 50Rタンジェンシャルフロー(TFF)デバイス(Sartorius社)又は100若しくは300kDa分画中空糸フィルターを用いるKR2i TFF系(SpectrumLabs社)を使用しておおよそ20mLになるまで濃縮した。予め濃縮した培地を、AKTAprimeプラス又はAKTA Pure 25クロマトグラフィー系(GE Healthcare Life Sciences社)に接続されたビーズ溶出カラム(HiScreen又はHiTrap Capto Core 700カラム、GE Healthcare Life Sciences社)にその後ローディングした。手順におけるカラム平衡、サンプルローディング及びカラム清掃の流速設定を、製造業者の説明書に従って選択した。サンプルを、UV吸光度クロマトグラムにより回収し、Amicon Ultra-15 10kDa分画分子量回転フィルター(Millipore社)を使用して最終容量100μLに濃縮し、更なる下流の分析用に-80℃で保存した。タンパク質及びRNA溶出プロファイルを評価するために、媒体を、100kDa及び300kDa中空糸フィルターを使用するKR2i TFF系で濃縮し、透析濾過し、サンプルを、Tricorn 10/300セファロース4 Fast Flow(S4FF)カラム(GE Healthcare Life Sciences社)で分析した。
- 実施例
図3は、GBA酵素とエクソソームタンパク質CD63の間に挿入された緩慢に切断されるインテインを含むポリペプチド構築物により富化されたBM-MSC EVで処置したGBA欠損患者由来リンパ球の結果を示す。HPLCに基づくアッセイを使用して、レシピエント細胞は、大量に放出されたGBAのEVに媒介される送達後に脂質グルコセレブロシドレベルの低下を表すことが示された。類似の実験を、PoIとして脂質輸送タンパク質NPC1、速い切断性インテインに基づく放出系、及びエクソソームタンパク質CD133を含むポリペプチド構築物を使用して実施した。このポリペプチド構築物を含むEVは、NPC1欠損線維芽細胞にNPC1を効率的に送達し、これにより非機能的放出系を含む対照EVとは対照的に有意により高いレベルの機能的コレステロール輸送を引き起こした。
別の例において、EV産生親細胞として線維芽細胞を用いて、内在的に活性化可能なN末端プロテアーゼに基づく放出系を使用して、エクソソームタンパク質シンデカンにPoI p53を融合した。MDA-MB-231がん細胞へのp53の、EVに媒介される内在的に活性化される放出可能な送達は、同じEVポリペプチド構築物を使用する放出不可能な送達よりin vitroで有意に有効であった。
図5は、非相同的末端結合(NHEJ)アッセイの結果を示す。レポータ系を含有するHEK293T赤血球を、ガイドRNA(gRNA)並びにエクソソームポリペプチドとしてCD81、単量体光誘導性切断に基づく放出系としてKaede及びPoIとしてCas9を含むポリペプチド構築物を含む線維芽細胞由来EVでトランスフェクトした。EVは、エクソソーム産生過程の間に青色光に曝露した又はしなかったいずれかの細胞培養から得た。Kaedeの切断を誘導し、それによりCas9を放出する短い加速の光に曝露した細胞から得たエクソソームだけが、陽性細胞のパーセンテージの増加を示した。同様に、図6は、光に曝露した細胞から採取したEVで処理した細胞のハイレゾリューションメルティング(HRM)分析の結果を示す。図5と同じポリペプチド構築物を含む線維芽細胞EVは、生物活性があるCas9及びgRNAの効率的な細胞内送達の結果としてAAVS座にCas9に媒介される突然変異を誘導した。図7は、UV/青色光照射後にEVにおいて機能的Cas9を与える単量体光誘導性放出ポリペプチドDendra2によってCD63に融合されたCas9を含むポリペプチド構築物を含む羊膜上皮細胞由来EVのNHEJアッセイにおける効果を示す。図8は、UV/青色光に曝露した細胞から採取したWJ-MSC EVで処理した細胞のHRM結果を示す。図7と同じポリペプチド構築物を含むEV(しかし今回は、WJ-MSC由来EV)は、生物活性があるCas9及びgRNAの効率的な細胞内送達の結果としてAAVS座にCas9に媒介される突然変異を誘導した。図9は、WASPを標的した一本鎖可変断片(scFv)-KikGR-CD63ポリペプチド構築物を搭載し、UV光に曝露してscFvを標的骨髄由来マクロファージ細胞内に放出するHEK EVにより達成されたNfKB応答の強力な下方制御を示す。
図10は、IL2受容体を発現するために刺激され、IL2Rαサブユニットに対するscFvを搭載したHEK EVで同時に処理されたJurkat細胞の結果を示す。FACS分析によると、陽性対照及びscFv-Dendra2-CD63を搭載した(及びUV光に曝露した)EVだけが、Jurkat細胞の細胞表面においてIL2Rの下方制御を誘導した。図11は、腫瘍性タンパク質erb-2に対して標的したscFvを搭載するEVで処理したerbB-2陽性卵巣癌腫細胞系SKOV3の結果を示す。細胞死を、処置後48時間でアッセイした。scFv-Dendra2-CD63を搭載した(及びその後短時間UV光に曝露した)EVだけが、陽性対照と同程度のレベルの細胞死を誘導した。
図12は、NLSBP-NLSに基づく放出系及びレシピエント細胞において標的遺伝子HMOX1発現を誘導する関連効果を使用してBM-MSC由来EVにNRF2転写因子を搭載した結果を示す。NLSBP(KPNA1、別名インポーチンα5)をエクソソームタンパク質CD63に融合し、NRF2と共にEV供給源細胞(BM-MSCに加えて、様々な型の免疫細胞が、好結果で試験された)において同時発現させた。同時発現は、ウェスタンブロッティングにより推定されるように、NRF2単独の発現と比較して有意に増強されたNRF2のEVソーティングをもたらす。この戦略を使用してNRF2を搭載したEVの送達は、HEK細胞アッセイにおいて標的遺伝子発現の誘導をもたらす。例えばAlix及びシンテニンを使用する場合、他のEVタンパク質に基づくポリペプチド構築物の生成も類似の効果をもたらした。図13は、図5と類似であるが、放出系としてシス切断性インテイン(アミノ酸配列Val-Val-Val-His-Asnを含む)をCD63、CD81(データ不掲載)、及びシンテニン(データ不掲載)並びにCas9に融合し、アミノ上皮細胞を使用して送達した実験を示す。図13から分かるように、突然変異されていないインテインだけが、NHEJの関連するレベルを誘導した。
NLS-NLSBPポリペプチドに基づく内在的に活性化される放出系の別の例は、エクソソームタンパク質CD47へのKPNA2の融合、線維芽細胞におけるそれと転写因子HSF1との同時発現、従って、エクソソームへのHSF1搭載を含む。線維芽細胞由来エクソソームを単離し、それを使用して、培養培地中で低又は高濃度カリウムに供したマウス初代小脳顆粒ニューロンを処理した。HSF1を搭載したEV処理は、アポトーシス誘導低カリウム条件でNLS-NLSBP放出系を持たない対照エクソソームによる処置と比較して有意に高い細胞生存率をもたらした。

Claims (20)

  1. （ｉ）少なくとも１つの対象のポリペプチド（ＰｏＩ）；
    （ｉｉ）少なくとも１つのエクソソームポリペプチド；及び
    （ｉｉｉ）ポリペプチドに基づく放出系
    を含む少なくとも１つのポリペプチド構築物を含む細胞外小胞（ＥＶ）であって、
    前記ポリペプチドに基づく放出系が、内在的活性化により前記少なくとも１つのエクソソームポリペプチドから前記少なくとも１つのＰｏＩを放出し、
    前記ＰｏＩが、ＲＮＡ結合タンパク質及び／又はＤＮＡ結合タンパク質である、
    ＥＶ。
  2. 前記ＥＶが、少なくとも１つの対象のポリヌクレオチドを更に含む、請求項１に記載のＥＶ。
  3. 前記対象のポリヌクレオチドが、ＲＮＡ結合ＰｏＩ又はＤＮＡ結合ＰｏＩとの相互作用を通じて前記ＥＶに輸送される、請求項２に記載のＥＶ。
  4. 前記対象のポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、短ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はスプライシング切り替え若しくはサイレンシングのためのアンチセンス剤である、請求項１又は２に記載のＥＶ。
  5. 前記ＲＮＡ結合タンパク質が、ｍＲＮＡ結合タンパク質（ｍＲＢＰ）、プレｒＲＮＡ結合タンパク質、ｔＲＮＡ結合タンパク質、小核若しくは核小体ＲＮＡ結合タンパク質、非コードＲＮＡ結合タンパク質、転写因子（ＴＦ）、又はそのドメイン若しくは誘導体である、請求項１から４のいずれか一項に記載のＥＶ。
  6. 前記ＲＮＡ結合タンパク質が、複数、又は他のＲＮＡ結合タンパク質との組み合わせで、存在する、請求項１から５のいずれか一項に記載のＥＶ。
  7. 前記ポリペプチドに基づく放出系が、シス切断性放出系及び核局在化シグナル（ＮＬＳ）−核局在化シグナル結合タンパク質（ＮＬＳＢＰ）（ＮＬＳ−ＮＬＳＢＰ）放出系から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載のＥＶ。
  8. 前記シス切断性系が、インテインである、請求項７に記載のＥＶ。
  9. 少なくとも１つのＰｏＩを含むＥＶであって、前記ＰｏＩが、ポリペプチドに基づく放出系の内在的活性化を通じて少なくとも１つのエクソソームポリペプチドから放出されたものであり、前記ＰｏＩが、ＲＮＡ結合タンパク質又はＤＮＡ結合タンパク質である、ＥＶ。
  10. 前記ＥＶが、対象のポリヌクレオチドを更に含む、請求項９に記載のＥＶ。
  11. 前記ＥＶが、少なくとも１つの標的化部分を更に含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＥＶ。
  12. 請求項１から１１のいずれか一項に記載のＥＶを製造する方法であって、
    （ｉ）ＲＮＡ結合タンパク質及び／又はＤＮＡ結合タンパク質である少なくとも１つのＰｏＩ、内在的に活性化可能なポリペプチドに基づく放出系、並びに少なくとも１つのエクソソームポリペプチドを含む少なくとも１つのポリペプチド構築物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物を、ＥＶ産生細胞に導入する工程；
    （ｉｉ）前記少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物によりコードされる少なくとも１つのポリペプチド構築物を、前記ＥＶ産生細胞中で発現させる工程；並びに
    （ｉｉｉ）前記ＥＶ産生細胞からＲＮＡ結合タンパク質又はＤＮＡ結合タンパク質を含むＥＶを回収する工程
    を含む、方法。
  13. 精製工程を更に含み、前記ＥＶが、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、ビーズ溶出ＬＣ、サイズ排除ＬＣ、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、回転濾過、タンジェンシャルフローフィルトレーション、中空繊維濾過、遠心分離、免疫沈降、又はその任意の組合せを含む群から選択される手順を通じて精製される、請求項１２に記載のＥＶを製造する方法。
  14. （ｉ）ＲＮＡ結合タンパク質又はＤＮＡ結合タンパク質である少なくとも１つのＰｏＩ；
    （ｉｉ）少なくとも１つの内在的に活性化可能なポリペプチドに基づく放出系；及び
    （ｉｉｉ）少なくとも１つのエクソソームポリペプチド
    をコードするポリヌクレオチド構築物。
  15. （ｉ）ＲＮＡ結合タンパク質又はＤＮＡ結合タンパク質である少なくとも１つのＰｏＩ；
    （ｉｉ）少なくとも１つの内在的に活性化可能なポリペプチドに基づく放出系；及び
    （ｉｉｉ）少なくとも１つのエクソソームポリペプチド
    を含むポリペプチド構築物。
  16. （ｉ）少なくとも１つの、請求項１４に記載のポリヌクレオチド構築物；
    （ｉｉ）少なくとも１つの、請求項１５に記載のポリペプチド構築物；及び／又は
    （ｉｉｉ）少なくとも１つの、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＥＶ
    を含む細胞。
  17. （ｉ）少なくとも１つの、請求項１４に記載のポリヌクレオチド構築物；
    （ｉｉ）少なくとも１つの、請求項１５に記載のポリペプチド構築物；
    （ｉｉｉ）少なくとも１つの、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＥＶ；及び／又は
    （ｉｖ）請求項１６に記載の細胞；
    並びに、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤
    を含む、医薬組成物。
  18. 医薬における使用のための、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＥＶ及び／又はＥＶの集団を含む組成物。
  19. 遺伝的疾患、神経炎症性障害、神経変性障害、リソソーム蓄積疾患、筋ジストロフィー、肝疾患又はがんを治療する方法における使用のための、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＥＶ及び／又はＥＶの集団を含む組成物。
  20. 前記治療する方法が、タンパク質補充療法又は酵素補充療法の方法である、請求項１９に記載の組成物。
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