KR102253731B1 - 치료학적 폴리펩타이드를 포함하는 엑소좀 - Google Patents

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임레 마거
매튜 우드
안달로우씨 사미르 엘
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조엘 노르딘
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Abstract

본 발명은 치료학적 폴리펩타이드의 세포외 소포체 (EV)-매개된 세포내 및 막내 전달을 위한 본 발명의 방출 기전에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 엑소좀 폴리펩타이드에 방출가능하게 부착된 치료학적 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 EV에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 EV와 관련된 제조 방법, 약제학적 조성물, 의학 용도 및 응용, 및 다양한 다른 구현예에 관한 것이다.

Description

치료학적 폴리펩타이드를 포함하는 엑소좀
본 발명은 세포외 소포체 (vesicle) (EV) 치료제에 관한 것이고, 여기서, 상기 EV는 적어도 하나의 목적하는 폴리펩타이드 (PoI)를 포함한다.
항체와 이의 항원 간의 정교한 특이성, 또는 이를 위한 임의의 유형의 단백질계 생물약제와 이의 표적 간의 관련성은 치료학적 개입을 위한 이상적인 기반이다. 그러나, 항체 및 단백질 생물학적 제제의 치료학적 용도는 대형 분자종의 세포내 환경으로의 매우 제한된 접근 때문에 세포외 표적에 제한된다. 세포 내부로의 치료학적 폴리펩타이드의 전달을 위한 다양한 소포체가 연구 중에 있고 최근 연구는 예를 들어, 세포-침투 펩타이드(예를 들어, 문헌(참조: Dinca et al., Int J Mol Sci, 2016)에 의해 검토됨) 및 기존의 수송 경로를 표적화하는 이특이적 항체(문헌참조: Yu et al., Sci Trans Med, 2014)의 유용성을 보여주었다.
완전히 상이한 접근법이 독창적인 특허 출원 WO2013/084000에서 채택되었고 이는 생물치료제의 세포내 전달을 위한 엑소좀의 용도를 개시한다. 보다 구체적으로, WO2013/084000은 폴리펩타이드계 치료제가 외인성 및 내인성 로딩 기술 둘 다를 통해 어떻게 엑소좀으로 로딩될 수 있는지를 개시한다. 엑소좀의 외인성 로딩은 모 세포로부터 단리 후 목적하는 폴리펩타이드의 엑소좀으로의 전기천공 또는 형질감염을 사용하여 수행될 수 있는 반면, 내인성 로딩은 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 작제물을 사용하여 모 세포를 형질감염시킴에 이어서 상기 작제물을 과발현시키고 생물치료학적 폴리펩타이드를 포함하는 엑소좀을 수거함을 기반으로 한다.
또 다른 획기적인 특허 출원(WO2014/168548)은 적어도 부분적으로 소포체의 외부 상에 존재하여 소포체외 환경으로 디스플레이되도록 적어도 하나의 치료학적 폴리펩타이드에 융합된 적어도 하나의 캐리어 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 작제물이 이들의 막에 부착되어 있는 엑소좀과 같은 치료학적 전달 소포체를 개시한다. 다른 특허 출원은 단백질 생물학적 제제, 예를 들어, WO2015/138878의 경우에, 헤파린-결합 상피 성장 인자(HB-EGF)의 전달을 위해 엑소좀의 사용을 시도하였다.
그러나, 생활성 단백질 생물학적 제제, 특히, 항체/세포내 항체 (intrabody) 및 특이적 세포내 표적과 상호작용하도록 의도된 다른 폴리펩타이드의 성공적인 세포내 전달은 흔히 목적하는 치료학적 폴리펩타이드가 이의 유리되고 비접합된 형태로 고효율로 전달되는 것을 필요로 한다. 단리 후 엑소좀의 외인성 로딩은 흔히 폴리펩타이드의 로딩을 위해 복잡하고 비효과적인 전략이고 유사하게 선행 기술 분야의 내인성 로딩 전략은 강내 EV 로딩이 비효율적이거나 목적하는 폴리펩타이드(PoI)가 이의 생활성 비접합된 형태로 존재하지 않음을 시사한다. 최근에, WO2016/178532는 단백질-운반 EV를 생성하기 위한 광유전학적 방법을 개시하였고, 상기 방법에서, 2개의 복합 이량체 광유전학적(optogenetic) 작제물이 모 세포에 도입된다. 외인성으로 적용된 광 노출 시, 2개의 상이한 광유전학적 단백질들은 연합하고 광 노출 중단시 단백질들은 해리한다. 상기 방법은 단백질을 엑소좀으로 수송하고 후속적으로 이를 이의 엑소좀 수송체로부터 방출하기 위해서는 광원으로의 생물학적 물질의 연장된 장기 노출을 필요로 한다. 결과로서, 상기 방법은 확장성, 잠재적 독성 문제와 관련된 문제점을 갖고 있고 또한 부분적으로 장기 외인성 광 적용으로 인해 수행하기가 매우 어렵다. 추가로, 상기 이량체 작제물은 다중 벡터가 필요하고 단백질의 잘못된 폴딩의 위험, 독성 단백질 응집 및 해독 오류, 및 단백질 간의 불완전한 연합 및 해리의 위험이 실질적으로 증가함을 의미한다.
발명의 요약
따라서, 본 발명의 목적은 단백질 생물학적 제제의 표적 세포로의 전달과 관련된 상기 확인된 문제점들을 극복하고 당업계 내 기존의 필요성을 충족시키고, 예를 들어, 항체, 세포내 항체, 효소 대체 치료요법을 위한 효소, 또는 유전자 편집 효소, 또는 표적 세포 또는 표적 조직에서 생활성 효과를 갖도록 의도된 임의의 다른 유형의 폴리펩타이드가 세포내 표적에 도달할 수 있도록 하는 것이다. 본 발명은 이것을 세포외 소포체 (EV)-기반 치료제를 사용함에 의해 성취하고, 상기 치료제는 적어도 하나의 목적하는 폴리펩타이드/단백질 (PoI)을 포함하는 엑소좀 또는 임의의 다른 유형의 EV를 기반으로 하고, 여기서, 상기 PoI는 내인성으로 활성화될 수 있는 폴리펩타이드-기반 시스템으로부터 방출되고 이어서 표적 세포로, 예를 들어, 특이적으로 적합한 세포 격실로 또는 표적 세포의 기관으로 전달된다. 본 발명의 방출 시스템은 엑소좀 폴리펩타이드와 PoI의 활성화될 수 있는 방출가능한 접착을 가능하게 하는 도메인 간의 융합 단백질을 기초로 하고, 이는 PoI가 내인성 활성화 유발제를 통해 예를 들어, EV의 루멘으로, EV의 막으로 또는 표적 세포 또는 표적 조직의 임의의 격실 또는 기관으로 방출될 수 있음을 의미한다. 중요하게, 폴리펩타이드계 방출 도메인의 내인성 활성화는 상기 방법이 고도로 확장가능하고 이 동안에 생물학적 물질이 연장된 기간 동안 잠재적으로 독성 외인성 자극 또는 조건에 노출되는 여분의 단계를 포함하지 않고 치료제 플랫폼을 거쳐 이동할 수 있음을 의미한다. 임의의 이론에 국한되는 것 없이, 상기 내인성 활성화는 pH 강하, 결합 파트너에 대한 경쟁 및 일반적으로 폴리펩타이드계 방출 도메인의 활성화를 통한 PoI의 방출 유발하는데 도움이 될 수 있는 세포 생물학적 조건의 임의의 변화의 결과일 수 있다.
목적하는 비접합된 치료학적 폴리펩타이드의 EV의 루멘 또는 막으로의 전달을 위한 상기 고도로 정교한 접근법은 치료학적 목적의 생활성 폴리펩타이드가 표적 세포의 세포내 환경 및/또는 임의의 유형의 세포막 구조물 (예를 들어, 세포질막, 핵, 리소좀 또는 소포체 (endoplasmic reticulum)(ER)과 같은 기관의 막 또는 임의의 다른 유형의 막 격실)로 극히 효율적으로 전달될 수 있게 한다. 본 발명은 따라서 예를 들어, 임의의 유형의 단백질 또는 펩타이드의 도입 또는 대체를 위해, 폴리펩타이드의 임의의 유형의 세포내 및/또는 막내 전달에 적용될 수 있다. 비제한적인 예는 예를 들어, 리소좀 저장 질환과 같은 유전학적 비정상을 포함하는 질환에서 부재이거나 불활성인 효소, 또는 표적에서 대체되거나 보다 높은 농도로 존재할 필요가 있는 임의의 유형의 세포내 또는 통합 막 단백질일 수 있다. 추가의 비제한적인 예로서, 본 발명은 암의 치료에서 매우 유용하고, 여기서, 본 발명의 EV는 세포내 환경으로 종양 억제제 단백질(또는 이의 변이체 또는 유도체), 예를 들어, p53 또는 p21, 또는 종양형성 경로에 결합하고 이를 저해하는 임의의 유형의 폴리펩타이드(예를 들어, 세포내 항체 또는 항체)를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예는 전사 인자 또는 염증 반응을 조절하기 위한 신호전달 경로의 성분을 전달하거나, 조직 복구를 유도하거나 이들이 이들 자체가 치료학적 활성을 부여할 수 있는 단일 또는 이중 RNA 가닥과 함께 운반할 수 있는 RNA-결합 단백질을 전달하는 것을 포함한다.
본 발명은 따라서 특히 적어도 하나의 PoI를 포함하는 EV에 속하고, 여기서, 상기 적어도 하나의 PoI는 내인성으로 활성화될 수 있는 방출 시스템을 통해 엑소좀 폴리펩타이드에 부착된다. 명료하게 하기 위해, 본 발명은 따라서 방출 시스템에 의해 EV의 루멘으로 및/또는 EV의 막으로 방출된 PoI를 포함하는 EV 둘다에 관한 것이고 상기 EV는 방출가능한 방식으로 내인성으로 활성화될 수 있는 폴리펩타이드계 방출 시스템에 여전히 부착된 PoI를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드 작제물(이는 목적하는 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 기반 내인성으로 활성화될 수 있는 방출 도메인 및 엑소좀 폴리펩타이드를 포함한다)의 모듈성은 비접합된 PoI(가용성 PoI로서 또는 막-연합된 PoI로서 상기 언급된 바와 같은, 여기서, 상기 PoI는 외부 환경 또는 내부 환경 중 하나에 또는 막관통 양상으로 둘다와 대면할 수 있다)의 전달을 위해 EV의 고도로 조절가능한 내인성 생성을 가능하게 한다. 이것은 엑소좀 단백질에 영구적으로 접합되어 있는 PoI 또는 임의의 엑소좀 폴리펩타이드의 도움 없이 EV로 로딩된 PoI, 또는 외인성 광원으로 연장된 장기 노출의 결과로서 EV로 수송되고 방출되는 PoI의 내인성 로딩만을 기재하고, 이것은 로딩 및 생성 공정이 본 발명에 따른 로딩 및 EV 생성과 비교하여 극히 비효율적이고 매우 복잡하고, 확장가능하지 않고/않거나 잠재적으로 독성임을 의미하는 선행 기술과는 완전히 대조적이다.
추가로, 본 발명은 PoI를 포함하는 EV의 로딩 및 생산을 위한 여러 신규 방법, 상기 생산을 가능하게 하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 세포 및 이와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 작제물에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 강내 및/또는 막-연합된 비접합된 목적하는 폴리펩타이드(PoI)의 EV-매개된 전달을 위해, 시스-절단하는 폴리펩타이드(즉, 펩타이드의 목적하는 부분의 방출(이것은 다양한 기전, 예를 들어, 스플라이싱 또는 절단에 의해 일어날 수 있다)을 유발하여 이어서 PoI를 방출시키는 아미노산의 특정 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 펩타이드) 및 핵 국소화 신호(NLS)-결합 폴리펩타이드(NLSBP) (예를 들어, 인포틴 알파 폴리펩타이드)의 용도에 관한 것이다. 하나의 별도의 구현예에서, 본 발명자들은 매우 신속한 광 부스트에 의해 유발될 수 있는 (WO2016/178532에서와 같은 연장된 광 노출 기반 수송 및 방출 시스템과는 반대로) 단순한 단량체성 폴리펩타이드 기반 방출 시스템의 용도를 고려하였다.
본 발명은 추가로 비접합된 PoI의 세포내 전달을 위한 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 방법은 표적 세포를, (i) 내인성으로 유발된 방출 도메인(들)을 통해 엑소좀 폴리펩타이드에 방출가능하게 부착된 PoI 또는 (ii) 엑소좀 폴리펩타이드로부터 내인성 활성화를 통해 (정상적으로 EV의 루멘 또는 막 내부에서) 방출되는 PoI를 포함하는 EV와 접촉시키는 단계를 포함한다. EV는 전형적으로 표적 세포에 진입하여 이의 폴리펩타이드 카고를 전달하여 치료학적 폴리펩타이드의 고도로 효율적인 세포내 또는 막내 전달을 유도할 수 있다. 따라서, 이들의 생산 및 세포내 전달을 위한 EV 및 방법은 예를 들어, 특히, 암, 염증 및 자가면역, 신경염증 및 신경변성성 장애, 유전학적 질환, 리소좀 저장 장애, 기관 손상 및 부전증, DMD와 같은 근육 위축증, 심혈관 및 대사 장애, 신장 및 간 질환, 예를 들어, 비-알콜성 간질환 (NASH) 등 내에서 다수의 질환 및 병의 예방 및/또는 치료에서의 확장된 의학적 잠재력을 갖는다.
도 1은 목적하는 폴리펩타이드 (PoI)의 방출을 위한 시스-절단하는 방출 시스템 (인테인(intein)과 같은)을 포함하는 폴리펩타이드 작제물의 도식적 도해를 보여준다.
도 2는 PoI의 방출을 위한 단량체성 단기 광-유도된 절단 방출 시스템을 포함하는 폴리펩타이드 작제물의 일반적 도해를 보여준다. 단기 광 부스트는 방출 시스템의 절단을 유도함으로써 임의의 독성 효과 없이 그리고 확장성에 대한 문제 없이 PoI를 방출시킨다.
도 3은 인테인-GBA 풍부한 융합 단백질이 풍부한 EV로 처리된 GBA-결핍 세포의 결과를 보여준다. 수용자 세포는 생활성 GBA의 전달 후 글루코세레브로사이드 수준의 감소를 경험한다. 유사한 실험은 NPC1-결핍 섬유아세포에서 수송체 NPC1과 함께 수행하였다.
도 4는 PoI의 방출을 위한 GFP-유사 덴드라(Dendra) 단백질을 기반으로 하는 광-유도된 절단 방출 시스템을 포함하는 폴리펩타이드 작제물을 도시한다. 덴드라는 광의 단기 부스트에 의해 활성화될 수 있는 단량체성 방출 시스템이다.
도 5는 비-상동성 말단-연결 (NHEJ) 검정의 결과를 보여준다. 리포터 시스템을 함유하는 HEK293T-적혈구 세포는 가이드 RNA (gRNA) 및 엑소좀 폴리펩타이드로서 CD81, 단량체성 광-유도된 절단-기반 방출 시스템으로서 Kaede 및 PoI로서 Cas9를 포함하는 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 엑소좀으로 형질감염시켰다. 세포 배양물로부터 수득된 경우의 엑소좀은 엑소좀 생산 공정 동안에 청색 광의 단기 부스트에 노출되거나 노출되지 않는다. Kaede의 절단을 유도함으로써 Cas9을 방출시키는 광 노출된 세포로부터 수득된 엑소좀만이 양성 세포의 백분율에서의 증가를 보여주었다.
도 6은 광에 노출된 세포로부터 수거된 EV로 처리된 세포의 고해상 용융 (HRM) 분석 결과를 보여준다. 도 5에서와 같이 동일한 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 EV는 생활성 Cas9 및 gRNA의 효율적인 세포내 전달의 결과로서 AAVS 유전자좌내 Cas9-매개된 돌연변이를 유도하였다.
도 7은 단량체성 광-유도된 방출 폴리펩타이드 덴드라2를 통해 CD63에 융합된 Cas9를 포함하여 UV/청색광 조사 후 EV에서 Cas9가 기능성이 되도록 하는 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 EV의 NHEJ 검정에서의 효과를 보여준다.
도 8은 UV/청색 광에 노출된 세포로부터 수거된 EV로 처리된 세포의 HRM 결과를 보여준다. 도 7에서와 같이 동일한 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 EV는 생활성 Cas9 및 gRNA의 효율적인 세포내 전달의 결과로서 AAVS 유전자좌내 Cas9-매개된 돌연변이를 유도하였다.
도 9는 UV-광에 노출되어 표적 골수 유래된 마크로파아지 세포 내부에서 scFv를 방출하는 WASP-표적화된 단일쇄 가변 단편 (scFv)-KikGR-CD63 폴리펩타이드 작제물이 로딩된 EV에 의해 성취되는 NfKB 반응의 강력한 하향 조절을 보여준다.
도 10은 IL2-수용체를 발현하도록 자극되고 동시에 IL2R-알파 서브유니트를 향해 scFv가 로딩된 EV로 처리된 유르캣 (Jurkat) 세포의 결과를 보여준다. 양성 대조군 및 scFv-덴드라2-CD63 (및 UV-광에 노출된)이 로딩된 EV 만이 FACS 분석에 따라 유르캣 세포의 세포 표면 상에 IL2R의 하향 조절을 유도하였다.
도 11은 발암단백질 erb-2를 향해 표적화된 scFv가 로딩된 EV로 처리된 erbB-2-양성 난소 암종 세포주 SKOV3의 결과를 보여준다. 세포사는 처리 후 48시간 째에 분석하였다. scFv-덴드라2-CD63이 로딩되고 (이후 UV-광에 노출된) EV 만이 양성 대조군에 상응하는 수준으로 세포사를 유도하였다.
도 12는 NLSBP-NLS-기반 방출 시스템을 사용한 NRF2 전사 인자의 EV로의 로딩 결과 및 수용자 세포에서 표적 유전자 HMOX1 발현을 유도하는데 있어서 관련 효과를 보여준다. NLSBP (KPNA1 a.k.a. 임포르틴(importin) α5)는 엑소좀 단백질 CD63과 융합시키고 EV 공급원 세포 (다양한 유형의 면역 세포가 양호한 결과와 함께 시험되었다)에서 NRF2와 함께 동시 발현시켰다. 동시-발현은 단독의 NRF2의 발현과 비교하여 웨스턴 블롯팅에 의한 평가시 NRF2의 유의적으로 증진된 EV 분류를 유도한다. 상기 전략을 사용하여 NRF2 로딩된 EV의 전달은 EV 수용자 세포에서 표적 유전자 발현의 유도를 유발한다.
도 13은 도 5에서와 같이 유사한 실험을 보여주지만 여기서 CD63, CD81 (데이터는 나타내지 않음), 및 신테닌 (데이터는 나타내지 않음)과 융합되고 Cas9와 융합된 방출 시스템으로서 시스-절단하는 인테인 (아미노산 서열 Val-Val-Val-His-Asn을 포함하는)을 사용한다. 도 13으로부터 알 수 있는 바와 같이, 단지 돌연변이되지 않은 인테인만이 NHEJ의 관련 수준을 유도하였다.
도 14는 인테인-기반 폴리펩타이드 방출가능한 시스템을 사용하여 엑소좀 내 Cre 리컴비나제 집적의 웨스턴 블롯-분석의 도해를 보여준다. 레인 1-3은 엑소좀을 보여주고 레인 5-7은 이들 각각의 전체 세포 용해물을 보여준다. 레인 1 및 5 - 가용성 NLSCre; 레인 2&6 CD63-인테인-Cre; 레인 3&7 CD63-인테인-NLSCre; 4 단백질 래더(ladder). 적색 - Alix 로딩 대조군; 녹색 - Cre 리컴비나제
본 발명은 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 EV에 관한 것이고, 상기 EV는 이어서 (i) 적어도 하나의 PoI, (ii) 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드, 및 (iii) 적어도 하나의 폴리펩타이드 기반 방출 시스템을 포함하고, 여기서, 적어도 하나의 PoI는 방출 시스템의 도움으로 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드에 방출가능하게 부착되고, 여기서, 상기 방출 시스템은 내인성으로 활성화될 수 있고 PoI의 방출은 따라서 임의의 외인성 자극에 의존하지 않고 자동적으로 유발된다. 추가로, 본 발명은 또한 EV 내, 필수적으로 EV의 루멘 내 또는 EV 막과 연합하여 (예를 들어, 막내로), 방출 시스템의 도움으로 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드로부터 방출되는 적어도 하나의 PoI를 포함하는 EV에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 하기에서 보다 상세하게 기재될 다양한 관련 양상에 관한 것으로서, 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 작제물 및 상기 작제물을 포함하는 세포, 시험관내 및 생체내 목적하는 폴리펩타이드/단백질의 생산 방법 및 세포내 전달 방법, 및 상기 EV 및 상기 EV를 함유하는 약제학적 조성물의 의학적 적용에 관한 것이다.
편의와 명료하게 하기 위해, 본원에 사용된 특정 용어를 하기에 총괄하여 기재한다. 달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 특징, 양상, 구현예 또는 대안이 마쿠쉬 그룹 측면으로 기재되는 경우, 당업자는 본 발명이 또한 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 서브그룹 측면에서 기재되는 것으로 인지할 것이다. 당업자는 추가로 이로써 본 발명이 또한 마쿠쉬 그룹의 개별 구성원 또는 구성원의 서브그룹 측면에서 기재되는 것으로 인지할 것이다. 추가로, 본 발명의 양상 및/또는 구현예 중 하나와 연계하여 기재된 구현예 및 특징은 또한 필요한 부분만 약간 수정하여 본 발명의 모든 다른 양상 및/또는 구현예에 적용됨을 주지해야 한다. 예를 들어, EV와 연계하여 기재되는 적어도 하나의 다양한 목적하는 폴리펩타이드(PoI)는 폴리펩타이드 작제물과 관련해서 또는 EV를 포함하는 약제학적 조성물과 관련해서 또는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 작제물의 발현 생성물로서 기재되고 관련된 것으로 이해되어야만 한다. 추가로, 특정 양상과 관련하여 기재된 특정 구현예, 예를 들어, 특정 의학적 증상의 치료에 속하는 양상과 관련하여 기재된 바와 같은 EV의 투여 경로는 또한 본래에 또한 본 발명의 약제학적 조성물 또는 세포내 전달 방법에 대한 양상/구현예와 같은 다른 양상 및/또는 구현예와 같은 다른 양상 및/또는 구현예와 연계하여 관련된 것일 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 목적하는 폴리펩타이드(PoI), 엑소좀 폴리펩타이드, 내인성으로 활성화될 수 있는 방출 시스템 및 표적화 모이어티, 세포 공급원 및 모든 다른 양상, 구현예 및 대안은 본 발명의 범위 및 취지로부터 벗어나는 것 없이 임의의 모든 가능한 조합으로 자유롭게 조합될 수 있다. 추가로, 본 발명의 임의의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 임의의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 (각각 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열)은 임의의 소정의 분자가 이와 연합된 기술적 효과를 수행하는 능력을 보유하는 한 본래의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 서열로부터 상당히 이탈할 수 있다. 이들의 생물학적 성질이 보유되는 한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 본래의 서열과 비교하여 50% 정도로 많이 (예를 들어, BLAST 또는 ClustalW를 사용하여 계산되는) 이탈할 수 있지만, 가능한한 높은 서열 동일성이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 목적하는 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 펩타이드/폴리펩타이드 기반 방출 시스템 및 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드의 조합(융합)은 각각의 폴리펩타이드의 특정 분절이 대체되고/되거나 변형될 수 있음을 의미하고, 이는 본래의 서열로부터의 이탈이 주요 성질이 보존되는 한 상당할 수 있음을 의미한다. 따라서, 유사한 이유가 당연히 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 적용된다.
용어 “세포외 소포체” 또는 “EV” 또는 “엑소좀”은 예를 들어, 세포로부터 수득될 수 있는 임의의 유형의 소포체, 예를 들어, 마이크로소포체(예를 들어, 세포의 세포질막으로부터 방출된 임의의 소포체), 엑소좀 (예를 들어, 엔도-리소좀 경로로부터 유래된 임의의 소포체), 아폽토시스성 바디(예를 들어, 아폽토시스성 세포로부터 수득될 수 있는), 마이크로입자(예를 들어, 혈소판으로부터 유래될 수 있는), 엑토좀 (혈청 중 예를 들어, 호중구 및 단핵세포로부터 유래할 수 있는), 프로스타토좀(예를 들어, 전립선 암 세포로부터 수득될 수 있는), 또는 카디오좀 (예를 들어, 심장 세포로부터 유래될 수 있는) 등에 관한 것으로 이해될 것이다. 추가로, 상기 용어는 또한 세포외 소포체 모사체, 막 압출 또는 다른 기술 등을 통해 수득되는 세포막 소포체 뿐만 아니라 LDL, VLDL, HDL 및 킬로마이크론과 같은 지단백질 입자에 관한 것으로 이해될 것이다. 필수적으로, 본 발명은 목적하는 폴리펩타이드 (PoI) 및 상기 PoI를 함유하는 폴리펩타이드 작제물에 대한 전달 또는 수송 소포체로서 작용할 수 있는 임의의 유형의 지질 기반 구조체 (소포체 형태 또는 임의의 다른 유형의 적합한 형태를 갖는)에 관한 것일 수 있다. EV의 의학적 및 과학적 용도 및 적용을 기술 하는 경우, 본 발명이 정상적으로 다수의 EV, 즉, 수천, 수백만, 수십억만, 1조 또는 심지어 1000조 또는 100경(예를 들어, 103-1018)의 EV, 또는 심지어 보다 큰 집단의 EV (>1018의 EV 입자)를 포함할 수 있는 EV 집단에 관한 것임이 당업자에게 자명할 것이다. 동일 맥락에서, 예를 들어, 특정 유형의 PoI 및/또는 PoI를 포함하는 특정 유형의 폴리펩타이드를 포함하는 EV에 대한 것일 수 있는 용어 “집단”은 상기 집단을 구성하는 다수의 엔티티 (전형적으로 입자로서 계수되는)를 포괄하는 것으로 이해된다. 다른 말로, 복수개로 존재하는 경우 개별 EV는 EV 집단을 구성한다. 따라서, 당연히, 본 발명은 당업자에게 자명한 바와 같이 다양한 PoI를 포함하는 개별 EV 및 다양한 PoI를 포함하는 EV를 포함하는 집단 둘다에 관한 것이다.
용어 “엑소좀 폴리펩타이드” 및 “엑소좀 단백질” 및 “EV 폴리펩타이드” 및 “EV 단백질”은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 폴리펩타이드 작제물을 적합한 소포체 구조물, 즉, 적합한 EV로 수송하기 위해 사용될 수 있는 (전형적으로 엑소좀 단백질 뿐만 아니라 적어도 하나의 목적하는 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 폴리펩타이드 기반 방출 시스템을 포함하는) 임의의 폴리펩타이드에 관한 것으로 이해된다. 보다 구체적으로, 용어 “엑소좀 폴리펩타이드”는 폴리펩타이드 작제물의 소포체 구조물, 예를 들어, 엑소좀으로의 수송, 트래픽킹 또는 셔틀링을 가능하게 할 수 있는 임의의 폴리펩타이드 (상기 언급된 바와 같이 전형적으로 적어도 하나의 PoI 및 적어도 하나의 폴리펩타이드 기반 방출 시스템을 포함하지만 또한 표적화 펩타이드/폴리펩타이드를 포함할 수 있는)를 포함하는 것으로 이해된다. 상기 엑소좀 폴리펩타이드의 예는 예를 들어 CD9, CD53, CD63, CD81, CD54, CD50, FLOT1, FLOT2, CD49d, CD71, CD133, CD138, CD235a, ALIX, 신테닌-1, 신테닌-2, Lamp2b, TSPAN8, TSPAN14, CD37, CD82, CD151, CD231, CD102, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, CD11a, CD11b, CD11c, CD18/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c, CD49e, CD51, CD61, CD104, Fc 수용체, 인터류킨 수용체, 면역글로불린, MHC-I 또는 MHC-II 성분들, CD2, CD3 엡실론, CD3 제타, CD13, CD18, CD19, CD30, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD110, CD111, CD115, CD117, CD125, CD135, CD184, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6A1, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA-DM, HSPG2, L1CAM, LAMB1, LAMC1, LFA-1, LGALS3BP, Mac-1 알파, Mac-1 베타, MFGE8, SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTI1A, VTI1B, 및 이의 임의의 조합물이지만, 폴리펩타이드 작제물을 EV로 수송할 수 있는 다수의 다른 폴리펩타이드는 본 발명의 범위내에 포함된다. EV 단백질은 전형적으로 인간 기원이고 Uniprot, RCSB, 등과 같은 다양한 공개적으로 가용한 데이터베이스에서 발견될 수 있다.
용어 “목적하는 폴리펩타이드”, “목적하는 단백질”, “목적하는 치료학적 폴리펩타이드”, “PoI”, “생물치료제”, “생물학적 제제”, 및 “단백질 생물학적 제제”는 본원에서 상호교환적으로 사용되고 예를 들어, 표적에 결합함을 통해 및/또는 상호작용 파트너와 상호작용하는 임의의 다른 방식으로 치료 목적을 위해 사용될 수 있고/있거나 단백질을 대체하고/하거나 기존의 세포내 단백질을 보충하거나 보완함으로써 이의 치료학적 효과를 발휘하는 임의의 폴리펩타이드에 관한 것으로 이해된다. 상기 용어는 하기의 비제한적인 예의 목적하는 치료학적 폴리펩타이드를 나타낼 수 있다: 항체, 세포내 항체, 단일쇄 가변 단편 (scFv), 어피바디(affibody), 바이-오크(bi-och) 다중특이적 항체 또는 결합제, 수용체, 리간드, 예를 들어, 효소 대체 치료요법 또는 유전자 편집을 위한 효소, 종양 억제제, 바이러스 또는 세균 저해제, 세포 구성 단백질, DNA 및/또는 RNA 결합 단백질, DNA 복구 저해제, 뉴클레아제, 프로테이나제, 인테그라제, 전사 인자, 성장 인자, 아폽토시스 저해제 및 유도제, 독소 (예를 들어, 슈도모나스 외독소), 구조적 단백질, 신경영양성 인자, 예를 들어, NT3/4, 뇌-유래된 신경영양성 인자(BDNF) 및 신경 성장 인자 (NGF) 및 이의 개별 서브유니트, 예를 들어, 2.5S 베타 서브유니트, 이온 채널, 막 수송체, 단백질항상성 인자, 세포 신호전달에 관여하는 단백질, 해독- 및 전사 관련 단백질, 뉴클레오타이드 결합 단백질, 단백질 결합 단백질, 지질 결합 단백질, 글리코사미노글리칸(GAG) 및 GAG-결합 단백질, 대사 단백질, 세포 스트레스 조절 단백질, 염증 및 면역계 조절 단백질, 미토콘드리아 단백질, 및 열 쇼크 단백질, 등. 하나의 바람직한 구현예에서, PoI는 Cas 폴리펩타이드가 EV에 의해 전달되면 표적 세포에서 이의 뉴클레오타이드 활성을 수행하도록 할 수 있는 RNA 가닥과 연합된 (즉, 이와 함께 운반되는) 온전한 뉴클레아제 활성을 갖는 CRISPR-연합된 (Cas) 폴리타이드이다. 대안적으로, 또 다른 바람직한 구현예에서, Cas 폴리펩타이드는 표적화된 유전학적 가공을 가능하게 하기 위해 촉매적으로 불활성일 수 있다. 또 다른 대안은 단일 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 Cpf1과 같은 임의의 다른 유형의 CRISPR 이펙터일 수 있다. PoI로서 Cpf1의 내포는 본 발명의 특히 바람직한 구현예인데 그 이유는 이것이 엇갈린(staggered) 이중-가닥 절단을 통해 표적 DNA를 절단하기 때문이고, Cpf1은 액시드아미노코커스 (Acidaminococcus) 또는 라흐노스피라세아(Lachnospiraceae)로부터 수득될 수 있다. 또 다른 예시적 구현예에서, Cas 폴리펩타이드는 또한 유전자 발현을 특이적으로 유도하기 위해 전사 활성화인자 (예를 들어, P3330 코어 단백질)와 융합될 수 있다. 추가의 바람직한 구현예는 리소좀 저장 장애에 대한 효소, 예를 들어, 글루코세레브로시다제, 예를 들어, 이미글루세라제, 알파-갈락토시다제, 알파-L-이두로니다제, 이두로네이트-2-설파타제 및 이두르설파제, 아릴설파타제, 갈설파제, 산-알파 글루코시다제, 스핑고마이엘리나제, 갈락토세레브로시다제, 갈락토실세라미다제, 세라미다제, 알파-N-아세틸갈락토사미니다제, 베타-갈락토시다제, 리소좀 산 리파제, 산 스핑고마이엘리나제, NPC1, NPC2, 헤파린 설파미다제, N-아세틸글루코사미니다제, 헤파린-α-글루코사미니드-N-아세틸트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사민 6-설파타제, 갈락토스-6-설페이트 설파타제, 갈락토스-6-설페이트 설파타제, 하이알루로니다제, 알파-N-아세틸 뉴라미니다제, GlcNAc 포스포트랜스퍼라제, 무코리핀1, 팔미토일-단백질 티오에스테라제, 트리펩티딜 펩티다제 I, 팔미토일-단백질 티오에스테라제 1, 트리펩티딜 펩티다제 1, 바테닌, 린클린, 알파-D-만노시다제, 베타-만노시다제, 아스파르틸글루코사미니다제, 알파-L-푸코시다제, 시스티노신, 카뎁신 K, 시알린, LAMP2, 및 헥소아미니다제를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 PoI를 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, PoI는 예를 들어, 염증 반응을 변형시키는 세포내 단백질, 예를 들어, 후생적 단백질, 예를 들어, 메틸라제 및 브로모도메인, 또는 근육 기능을 변형시키는 세포내 단백질, 예를 들어, 전사 인자, 예를 들어, MyoD 또는 Myf5, 근육 수축을 조절하는 단백질, 예를 들어, 미오신, 액틴, 칼슘/결합 단백질, 예를 들어, 트로포닌, 또는 구조적 단백질, 예를 들어, 디스트로핀, 우트로핀, 티틴, 네불린, 디스트로핀-연합 단백질, 예를 들어, 디스트로브레빈, 신트로핀, 신코일린, 데스민, 사코글리칸, 디스트로글리칸, 사코스판, 아그린, 및/또는 푸쿠틴일 수 있다. PoI는 전형적으로 이들의 명칭, 임의의 다른 명명법에 의해 달리 지적되지 않는 경우 또는 당업자에게 공지된 바와 같이 인간 기원의 단백질 또는 펩타이드이고, 이들은 Uniprot, RCSB, 등과 같은 다양한 대중에게 가용한 데이터베이스에서 발견될 수 있다.
“EV 내부에서 방출된” 또는 “표적 세포 내부에서 방출된”의 문맥에서와 같은 용어 “내부에서 방출된”은 EV (또는 표적 세포) 내부에서 완전히 및/또는 부분적으로 목적하는 폴리펩타이드 (PoI)의 방출을 의미하는 것으로 이해될 수 있고, 즉, PoI는 EV (또는 표적 세포)의 루멘으로, 완전히 또는 부분적으로 EV (또는 표적 세포)의 막으로(예를 들어, 막관통 구성으로) 또는 EV (또는 표적 세포) 막의 외부 상으로 방출된다. 상기 용어는 또한 EV 막 (또는 표적 세포)의 외부 측면 상으로 PoI의 방출을 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 추가로, 이것은 또한 임의의 생물학적 시스템, 예를 들어, 특정 조직 또는 표적 기관 내부에서 방출됨을 포함할 수 있다.
용어 “내인성 활성화”, “내인성 유발” 및 이의 변이체(예를 들어, “내인성으로 활성화될 수 있는” 또는 “내인성으로 유발된”)은 임의의 외인성 자극 없이 방출 시스템에 의해 PoI의 방출의 활성화, 유도 및/또는 유발에 관한 것으로 이해될 것이고, 즉, PoI의 방출은 EV 내부에서 또는 세포 내부에서 주변 엑소좀 및/또는 세포 및/또는 생물학적 환경의 단순한 작용에 의해 (예를 들어, pH의 변화, 염분과 같은 다른 생리학적 파라미터의 변화, 결합 파트너 간의 경쟁, 효소적 활성, 예를 들어, 단백질용해 활성 등)의 결과로서 유발된다.
용어 “공급원 세포” 또는 “EV 공급원 세포” 또는 “모 세포” 또는 “세포 공급원” 또는 “EV-생산 세포” 또는 임의의 다른 유사 용어는 적합한 세포 배양 조건하에서, 예를 들어, 현탁 배양에서 또는 부착 배양에서 또는 임의의 다른 유형의 배양 시스템에서 EV를 생산할 수 있는 임의의 유형의 세포에 관한 것으로 이해될 것이다. 본 발명에 따른 공급원 세포는 광범위한 세포, 예를 들어, 중간엽 줄기 또는 기질 세포(예를 들어, 골수, 지방 조직, 와르톤의 젤리(Wharton’s jelly), 주산기 조직, 치아 싹, 제대혈 등으로부터 수득될 수 있는), 양막 세포, 양막 상피 세포, 골수 억제제 세포, 이의 인간 배아 신장 (HEK) 세포가 하나의 비제한적인 예를 나타내는 불멸화된 세포주, 수지상 세포(DC) 또는 다른 면역계 세포, 예를 들어, 마크로파아지, 단핵구, B- 또는 T-세포, NK 세포, 호중구, 호산구, 비만 세포 또는 호염구 등으로부터 선택될 수 있다. 일반적으로, EV는 필수적으로 1차 세포 공급원 또는 불멸화된 세포주인 임의의 세포 공급원으로부터 유래할 수 있다. EV 공급원 세포는 임의의 배아, 태아 및 성인 신체 줄기 세포 유형일 수 있고 이는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 및 임의의 방법에 의해 유래된 다른 줄기 세포를 포함한다. 신경학적 질환을 치료하는 경우, 당업자는 공급원 세포로서, 예를 들어, 1차 신경 세포, 성상교세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포, 및 신경 선조체 세포를 사용하는 것을 고려할 수 있다. 상기 공급원 세포는 동종이계, 자가유래, 또는 심지어 치료받을 환자에 대해 성질에서 이종성일 수 있고, 즉, 세포는 환자 자신 또는 관련 없거나, 매치되거나 매치되지 않는 공여자로부터 기원할 수 있다. 특정 상황에서, 동종이계 세포는 의학적 견지에서 바람직할 수 있는데 이는 이들이 특정 징후를 앓는 환자의 자가유래 세포로부터 수득될 수 없는 면역-조절 효과를 제공할 수 있기 때문이다. 예를 들어, 말초 또는 신경학적 염증을 치료하는 것과 관련하여, 동종이계 MSC는 상기 세포로부터 수득될 수 있는 EV가 예를 들어, 마크로파아지 및/또는 호중구 표현형 스위칭 (염증 촉진 M1 또는 N1 표현형으로부터 각각 항-염증 M2 또는 N2 표현형으로)을 통한 면역 조절을 가능하게 할 수 있기 때문에 바람직할 수 있다. 역으로, 고형물 또는 혈액학적 악성 종양을 치료하기 위해 EV를 사용하는 경우, EV-생산 세포 공급원으로서 DC와 같은 면역 세포를 선택하는 것이 바람직할 수 있다.
제1 양상에서, 본 발명은 적어도 하나의 목적하는 폴리펩타이드 (PoI)를 포함하는 EV에 관한 것이고, 여기서, 상기 적어도 하나의 PoI는 엑소좀 폴리펩타이드에 방출가능하게 부착되어 있다. PoI의 엑소좀 폴리펩타이드로의 부착은 방출가능하여 목적하는 치료학적 폴리펩타이드의 EV로의 효율적이고, 방해받지 않는 로딩 및 내인성으로 유발된 방출을 가능하게 한다. PoI와 엑소좀 폴리펩타이드 간의 방출가능한 부착은 EV 내부에서 및/또는 후속적으로 표적 세포 또는 표적 조직 내부에서 PoI의 내인성으로 활성화될 수 있는 방출을 가능하게 하여 로딩 및 치료학적 활성을 최적화할 수 있는 본 발명의 방출 시스템에 의해 매개되는 특성이다. 상기 방출 시스템은 외부 자극에 대한 필요 없이 활성화되거나 유발될 수 있는 다양한 방출가능한 폴리펩타이드 상호작용 시스템(즉, 상기 방출 시스템은 전형적으로 세포 또는 EV 내, 또는 필수적으로 임의의 생물학적 시스템 내에서 내인성 활성에 의해 유발된다), 예를 들어, 시스-절단 폴리펩타이드-기반 방출 시스템(예를 들어, 인테인을 기반으로), 핵 국소화 신호 (NLS) - NLS 결합 단백질 (NLSBP) 기반 방출 시스템 또는 다른 단백질 도메인을 기준으로 하는 방출 시스템을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있는 폴리펩타이드 기반 시스템이다. 하나의 구현예에서, 단량체성 광-유도된 절단-기반 방출 시스템이 사용될 수 있고, 여기서, 단지 매우 짧은 광 부스트를 사용하여 단량체성 단백질 도메인의 내인성 단백질용해 절단을 개시하고 PoI를 방출한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 인테인 방출 시스템에 방출가능하게 부착된 목적하는 폴리펩타이드 및/또는 EV 내부에서 또는 표적 세포 또는 표적 기관 내부에서 인테인 방출 시스템으로부터 방출된 목적하는 폴리펩타이드 (PoI)를 포함하는 EV에 관한 것이다. 인테인 방출 시스템을 사용하는 전형적인 폴리펩타이드 작제물은 다음과 같이 도식적으로 기재될 수 있다(하기의 표기법은 임의의 C 및/또는 N 말단 방향을 도시하는 것으로서 해석되지 말아야 하고 이것은 단지 설명을 목적으로 하는 것으로 의미된다):
PoI - 시스-절단하는 폴리펩타이드 - 엑소좀 단백질
대안적으로, 폴리펩타이드 작제물은 하기와 같이 EV의 표면상에 디스플레이될 표적화 모이어티를 포함하도록, 심지어 목적하는 조직 또는 세포 유형을 표적화함에 의해 이의 치료학적 잠재력을 추가로 증진시키기 위해 디자인될 수 있다:
PoI - 시스-절단하는 폴리펩타이드 - 엑소좀 단백질 - 표적화 모이어티
상기 시스-절단하는 폴리펩타이드 기반 방출 시스템은 신속하거나 느리게 절단하는 방출 시스템일 수 있다. 특정 경우에, 당업자는 신속-절단하는 시스-절단하는 방출 시스템 (예를 들어, 신속-절단하는 시스-절단하는 인테인)의 사용을 선택할 수 있는 반면, 느리게-절단하는 방출 시스템은 다른 세팅에서 유리할 수 있다. 일반적으로, 느리게-절단하는 방출 시스템은 PoI의 EV로의 로딩을 위해 보다 긴 시간을 허용하기 위해 사용될 수 있는 반면, 신속-절단하는 시스템은 EV가 신속히 수거될 필요가 있는 경우 바람직할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 시스-절단하는 방출 시스템은 인테인 시스템을 기반으로 하고, 여기서, 상기 인테인의 C-말단 부분은 아미노산 서열 Val-Val-Val-His-Asn 또는 Val-Val-Val-His-Asn-Cys를 포함할 수 있다. 절단되거나 다른 방식으로 최적화된 인테인, 즉, 하나 이상의 아미노산이 관능성을 증진시키기 위해 제거되거나 대체된 인테인은 또한 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 임의의 이론에 국한되는 것 없이, 절단 또는 증가된-관능성 돌연변이가 인테인의 pH 응답을 증가시킬 수 있고, 이는 추가로 EV가 세포내이입 공정을 통해 세포로 내재화될 수 있기 때문에 EV 기반 전달 시스템으로부터 생활성 PoI를 방출시키는데 있어서 이의 용도를 증가시키는 것으로 추정된다. 그러나, 보다 광범위하게, 상기 시스-절단하는 방출 시스템은 다양한 다른 폴리펩타이드 기반 방출 시스템, 예를 들어, 소르타제 A, N-말단 프로테아제, FrpC, 및 시스테인 프로테아제 도메인, 또는 다른 적합한 시스-절단 방출 시스템 및 이의 임의의 조합을 포함하는 시스-절단하는 시스템의 그룹으로부터 선택될 수 있다. 시스-절단하는 방출 단백질은 강내 엑소좀 폴리펩타이드 말단에 EV 내부에서 또는 EV 막으로 PoI의 방출을 가능하게 하기에 유리하게 부착될 수 있지만, 다른 부착점, 예를 들어 통합 부착점이 또한 사용될 수 있다.
발명의 하나의 구현예에서, PoI를 EV로 가이드하는 엑소좀 폴리펩타이드로부터 PoI의 방출은 광-유도된 절단에 의해 성취될 수 있다. 선행 기술 분야에서와 같지 않게, 본 발명은 단량체성 광-유도된 절단-기반 방출 시스템을 사용하고, 이것은 짧은 광 부스트 후 내인성 활성화를 진행하고 단량체성 단백질, 예를 들어Kaede, KikGR, EosFP, tdEosFP, mEos2, PSmOrange, 및 GFP-유사 덴드라 단백질 덴드라 및 덴드라2를 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다. CRY2-CIBN과 같은 광유전학적 이량체화 시스템과 같지 않게, 단량체성 단백질, 예를 들어, 덴드라, Kaede, KikGR, EosFP, tdEosFP, mEos2, PSmOrange 및 덴드라2는 단지 소형 잔기 폴리펩타이드 도메인을 PoI 상에 잔류시키는 이점을 갖고 이는 상기 전달된 PoI의 생활성이 음성적으로 영향받지 않음을 의미한다. 추가로, 광유전학적 이량체화 도메인과는 대조적으로, 광-유도된 절단 기반 방출 시스템은 제어하기가 상당히 용이하고, 이는 PoI의 EV로의 로딩이 매우 정확함을 의미한다. 본 발명의 광-유도된 절단-기반 방출 시스템은 따라서 시험관내 및 생체내 둘다에서 단순히 적합한 파장의 광에 노출시킴에 의해(덴드라, Kaede, KikGr 및 대부분의 다른 광-유도된 절단-기반 방출 단백질의 경우에 UV 또는 청색 광, 반면 PSmOrange의 경우에, 적-오렌지 스펙트럼 내 보다 긴 파장) 목적하는 시점에서 및 목적하는 위치에서 PoI의 고도로 제어가능한 방출을 가능하게 한다. 중요하게, 절단-기반 광-유도된 방출 시스템은 단지 절단의 내인성 공정을 수행하기 위해 매우 짧은 광 부스트를 요구하고, 이것은 연장되고 복잡한 광 노출 기간의 잠재적 독성 효과가 회피될 수 있음을 의미한다. 광-유도된 절단 방출 시스템을 기반으로 하는 폴리펩타이드 작제물은 다음과 같이 도식적으로 기재될 수 있다(하기의 표기법은 임의의 C 및/또는 N 말단 방향을 도시하는 것으로서 해석되지 말아야 하고 이것은 단지 설명을 목적으로 하는 것으로 의미된다):
PoI - 덴드라 - 엑소좀 단백질
PoI - Kaede - 엑소좀 단백질
EV 생산 공정 동안에 적합한 시간에, PoI, 광-유도된 절단 시스템 및 엑소좀 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 작제물은 적합한 파장의 광 부스트에 노출시켜 PoI의 절단 및 방출을 유도한다. UV 또는 청색광으로의 단기 노출 시, PoI와 엑소좀 폴리펩타이드 간의 융합으로서 삽입될 수 있는 덴드라 또는 다른 단량체성 UV/청색광-반응성 광-유도된 절단 방출 단백질은 내부 펩타이드 골격 절단을 통해 절단되어 PoI와 엑소좀 단백질을 유리시킨다. 소형 폴리펩타이드 도메인은 PoI 및 엑소좀 폴리펩타이드 둘다 상에 유지될 수 있지만 PoI의 활성은 이들 소형 잔기들의 존재에 의해 방해받지 않는다.
본 발명의 여전히 또 다른 구현예에서, 상기 방출 시스템은 핵 국소화 신호(NLS) 결합 폴리펩타이드(NLSBP)와 NLS 간의 상호작용을 기반으로 할 수 있다. 상기 NLSBP-NLS 방출 시스템은 적어도 하나의 전형적 또는 비-전형적 NLS를 포함하는 적어도 하나의 PoI를 포함할 수 있다. 추가의 대안으로서, NLSBP에 결합하지만 NLSLS PoI의 핵 입수를 유발하지 않는 NLS-유사 서열 (NLSLS)이 사용될 수 있다. NLS는 중복 RNA/DNA 결합 도메인의 존재 또는 부재하에 천연적으로 존재하는 NLSLS 또는 NLS (핵을 향하도록 지정된 대부분의 PoI, 예를 들어, 전사 인자들 및 뉴클레아제의 경우에서와 같이)일 수 있거나 NLS는 본래에 NLS를 포함하지 않는 PoI와 재조합적으로 융합시킨다. 엑소좀 폴리펩타이드는 이어서 적합한 NLSBP (예를 들어, 임포틴 알파 또는 베타 계열, 예를 들어, 임포틴 알파 KPNA1, 또는 핵 입수에 관여하는 임의의 다른 단백질로부터 기원하는)를 포함하도록 변형시켜 NLS-NLSBP 방출 시스템의 내인성 활성화시, NLS-함유 PoI와 NLSPB-함유 엑소좀 폴리펩타이드 사이에 방출가능한 부착을 생성시킨다. PoI의 방출 유발제는 전형적으로 상이한 NLS-NLSBP 쌍 간의 경쟁에 의해 구동되고 이는 PoI의 방출을 유도한다. NLS-NLSBP 방출 시스템을 기반으로 하는 폴리펩타이드 작제물은 도식적으로 다음과 같이 기재될 수 있다(하기의 표기법은 임의의 C 및/또는 N 말단 방향을 도시하는 것으로서 해석되지 말아야 하고 이것은 단지 설명을 목적으로 함을 의미한다):
PoI-NLS - NLSBP-엑소좀 단백질
상기 언급된 바와 같이, 표적 세포에 존재하는 NLSBP는 (NLS-함유 PoI의 EV 매개된 전달시) NLSBP-함유 엑소좀 폴리펩타이드를 경쟁적으로 능가하여 PoI가 내인성으로 유리되고 올바른 세포 격실로 트래픽킹되도록 한다. 천연적으로, NLSBP-NLS-기반 방출 시스템은 목적하는 폴리펩타이드를 위해 매우 적합하고 이는 핵 및/또는 핵소체에서 이들의 목적하는 활성을 발휘함을 의미하지만 세포질 또는 다른 세포내 격실로 향하도록 지정된 목적하는 단백질은 또한 NLS-NLSBP 방출 시스템과 상용성일 수 있고, 특히 NLS 대신 NLSLS를 사용하는 경우 상용성일 수 있다. NLSBP-NLS 방출 시스템의 비제한적인 예는 다음을 포함할 수 있다: KPNA1-NRF2, KPNA6-STAT3, KPNB1-STAT3, KPNA2-및 HSF1. NLSBP는 임포틴 알파 및 베타 계열로부터의 임포틴, 및 KPNA1, KPNA2, KPNA3, KPNA4, KPNA5, KPNA6, KPNA7, KPNB1, IPO4, IPO5, IPO7, IPO8, IPO9, IPO11, IPO13, TPNO1, TNPO2, TNPO3, HIKESHI, SNUPN, HEATR3, 및 다른 RAN 결합 단백질을 포함하는 다른 NLS-결합 단백질을 포함할 수 있다. NLS-함유 단백질은 전사 인자, 뉴클레아제 및 다른 핵 단백질, 예를 들어, CREB, C/EBP, bZIP, bHLH, MyoD, cMyc, SERBP, NF-1, Cys4, GATA-인자, OCT4, NANOG, KLF4, SOX2, HSF1, STAT3, SMAD3, p53, MEF2, SRF, NFkB, CAS9, 아연 핑거 뉴클레아제, hnRNPA1, hnRNPA2, NUP153, RPL23A, RPS7, RPL5, RPL23A, H2A, H2B, H3 및 H4 히스톤, TNRC6A, SRP19, SNAI1, PRKCI, HSP70, U1 snRNP, U2 snRNP, U4 snRNP, U5 snRNP, 및 U6 snRNP와 같은 비제한적인 예로부터 선택될 수 있다. 일반적으로, 적합한 PoI의 비제한적인 예는 예를 들어, Cas 및 Cas9 (이것은 다른 세균 중에서도 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터 RNA-가이드된 DNA 엔도뉴클레아제이다)와 같은 뉴클레아제; NF-κB 및 NRF2와 같은 전사-관련 단백질; 히스톤 및 폴리머라제와 같은 DNA-결합 단백질; 다양한 유형의 RNA를 수송하기 위해 사용될 수 있는 hnRNPA1-2 및 MS2 코트 단백질과 같은 RNA-결합 단백질; 핵 표적, NPC1, NPC2 및 GBA 등과 같은 효소 대체 치료요법을 위한 효소 등과 함께 항체 및/또는 세포내 항체이다. 본 발명의 바람직한 예는 KPNA1을 CD63에 융합시키고 MSC 또는 양막 상피 세포와 같은 적합한 EV 공급원 세포에서 MyoD를 동시 발현시킴으로써 예를 들어, DMD를 치료하는데 이어서 강한 적용 가능성을 갖는 치료학적 EV를 수득하는 것이다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 전형적으로 치료학적 또는 예방학적 목적을 위해 그러나 잠재적으로 또한 화장용을 위해 필수적으로 임의의 목적하는 폴리펩타이드 (PoI)를 포함하는 EV-기반 치료제에 관한 것이다. PoI - 또는 다수(즉, 하나 이상)의 PoI를 사용되는 경우에서 PoI들은 다수의 아미노산을 포함하는 임의의 분자, 즉, 단백질 또는 펩타이드인 임의의 적합한 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 PoI는 치료학적, 예방학적 또는 화장학적 폴리펩타이드의 하기의 비제한적인 예의 어느 하나로부터 선택될 수 있다: 항체, 세포내 항체, 단일쇄 가변 단편 (scFv), 어피바디, 바이-오크 다중특이적 항체 또는 결합제, 수용체, 리간드, 리소좀 저장 질환 (LSD)에서 부재이고/이거나 결함이 있는 효소와 같은 효소, 종양 억제제, 예를 들어, p53, pVHL, APC, CD95, ST5, YPEL3, ST7, 및 ST14, 바이러스 또는 세균 억제제, 세포 구성 단백질, DNA 및/또는 RNA 결합 단백질, 뉴클레아제, 예를 들어, Cas, Cas9, 및 Cpf1, 프로테이나제, 인테그라제, 전사 인자, 성장 인자, 아폽토시스 저해제 및 유도제, 구조적 단백질, 이온 채널, 막 수송체, 단백질 항상성 인자, 세포 신호전달에 관여하는 단백질, 해독- 및 전사 관련 단백질, 뉴클레오타이드 결합 단백질, 단백질 결합 단백질, 지질 결합 단백질, 글리코사미노글리칸(GAG) 및 GAG-결합 단백질, 대사적 단백질, 세포 스트레스 조절 단백질, 염증 및 면역계 조절 단백질, 미토콘드리아 단백질, 및 열 쇼크 단백질 등. EV가 고도의 효율적 방식으로 세포내 환경에 도달할 수 있다는 사실은 막대한 수의 세포내 표적이 약제의 표적이 될 수 있음을 의미한다. 따라서, 목적하는 치료학적 단백질(PoI)은 전형적으로 세포내 표적에 결합하는 단백질 (예를 들어, 발암성 단백질, 예를 들어, c-Myc에 대한 또는 이의 세포내 상호작용의 파트너에 결합하는 데코이 수용체에 대한 세포내 항체) 또는 세포내 목적하는 효과를 발휘하도록 되어 있는 PoI(상기 PoI는 예를 들어, 뒤센 근위축증(DMD)의 치료제로서의 디스트로핀, 소실 또는 결함 단백질 (예를 들어, 효소 대체 치료요법을 위한 NPC1, GBA, 또는 AGAL, 등과 같은 효소, 헌팅틴 단백질 또는 예를 들어, 헌팅톤 질환 또 다른 신경변성 장애의 치료를 위한 헌팅틴 단백질 또는 BDNF의 대체를 위한 PoI, 암 치료를 위한 p53과 같은 종양 억제제, 또는 염증 질환의 치료를 위한 NFkB 저해제일 수 있다)이다. 본 발명의 EV의 도움으로 전달되는 세포내 항체에 대한 목적하는 표적은 알파-시누클레인, LRRK2, Tau, 베타 아밀로이드, APP, C9orf72, SOD1, TDP43, FUS 및 프리온 단백질의 병리학적 형태를 포함할 수 있다. 상당한 치료학적 잠재력을 갖는 PoI의 한가지 부류는 RNA-결합 단백질(RBP)이고, 이것은 mRNA, 짧은-헤어핀 RNA 또는 마이크로RNA와 같은 RNAi 제제, 또는 스플라이스-스위칭 또는 사일런싱을 위한 안티센스 제제의 세포내 전달을 돕기 위해 사용될 수 있다. RNA-결합 단백질의 비제한적인 예는 hnRNPA1, hnRNPA2B1, DDX4, ADAD1, DAZL, ELAVL4, IGF2BP3, SAMD4A, TDP43, FUS, FMR1, FXR1, FXR2, EIF4A1-3, MS2 코트 단백질, 및 이의 임의의 도메인, 부분 또는 유도체이다. 보다 광범위하게, RNA-결합 단백질 및 도메인의 특정 서브클래스, 예를 들어, mRNA 결합 단백질 (mRBP), 예비-rRNA-결합 단백질, tRNA-결합 단백질, 소핵 또는 핵소체 RNA-결합 단백질, 비-암호화 단백질 및 전사 인자 (TF). 추가로, 다양한 도메인 및 유도체가 또한 RNA 카고의 수송을 위해 PoI로서 사용될 수 있다. RNA-결합 PoI의 비제한적인 예는 소형 RNA-결합 도메인 (RBD) (이것은 단일가닥 및 이중가닥 RBD(ssRBD 및 dsRBD) 둘다일 수 있다), 예를 들어, DEAD, KH, GTP_EFTU, dsrm, G-patch, IBN_N, SAP, TUDOR, RnaseA, MMR-HSR1, KOW, RnaseT, MIF4G, zf-RanBP, NTF2, PAZ, RBM1CTR, PAM2, Xpo1, Piwi, CSD, 및 리보솜_L7Ae를 포함한다. 상기 RNA-결합 도메인은 다수로, 단독으로 또는 다른 것들과의 조합으로 존재할 수 있고, 또한 이들의 주요 기능(즉, 목적하는 RNA 카고, 예를 들어, mRNA 또는 짧은 RNA를 수송하는 능력)이 유지되는 한, 이와 같은 보다 큰 RNA-결합 단백질 작제물의 일부를 형성할 수 있다.
추가로 상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 엑소좀 폴리펩타이드는 필수적으로 적어도 하나의 PoI를 EV로 수송할 수 있는 임의의 적합한 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 이것이 EV로 수송된 후 PoI의 실제 국소화는 엑소좀 폴리펩타이드의 성질 및/또는 PoI의 성질에 따라 다양할 수 있고, 즉, PoI는 EV의 루멘으로, EV 막으로, 막-연합된 위치로 및/또는 EV의 임의의 다른 적합한 부분으로 수송될 수 있다. 상기 엑소좀 폴리펩타이드의 비제한적인 예는 예를 들어 CD81, Itab1, Mfge8, CD63, CD151, Hspg2, Lgals3bp, Col6a1, Agrn, Tspan14, Lamc1, Lamb1, Tfrc, CD47, CD82, Slit2, 신테닌, Alix, 신데칸(Syndecan), 시냅토타그민(synaptotagmin), Lamp2, Lamp2b, CD13, CD86, 플로틸린, 신탁신-3, LiCAM, LFA-1, Mac-1 알파 및 베타, Vti-1A 및 B, ICAM-1, CD2, CD18, CD37, CD36, CD53, CD82, CXCR4, FcR, CD40, CD40L, CD41a, CD44, CD45, 및 테트라스파닌, GluR2/3, HLA-DM, 면역글로불린, MHC-I 또는 MHC-II 및 이의 성분, 및 TCR 베타, 및 PoI를 포함하는 폴리펩타이드 작제물을 EV로 수송할 수 있는 많은 다른 폴리펩타이드이다.
여전히 또 다른 구현예에서, 본 발명의 EV는 적어도 하나의 표적화 모이어티를 추가로 포함한다. 전형적으로, 표적화 모이어티는 생체내 및/또는 시험관내에서 올바른 조직 또는 세포 유형으로의 도달을 촉진시키기 위해 전형적으로 표적화 모이어티와 EV 단백질 간의 융합 단백질 형태로 EV의 표면 상에(즉, EV 막으로부터 소포체외 환경으로 돌출된) 존재한다. 상기 EV는 또한 선택된 조직 또는 격실로의 침투를 증가시키기 위한 침투 증진제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 침투 증진제는 적합한 엑소좀 폴리펩타이드를 갖는 융합 작제물로서 EV의 표면 상에 발현된 펩타이드 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 침투 증진제는 예를 들어, 세포-침투 펩타이드 (CPP) (예를 들어, Tat, 트랜스포르탄, 트랜스포르탄 10, 폴리-Arg, MPG, Pep-1, 페네트라틴, 등), 항체 (내재화를 촉진시키는 세포 표면 수용체, 예를 들어, 트랜스페린 수용체 또는 인슐린 수용체를 표적화할 수 있는), 또는 어피바디, 또는 EV의 내재화 및/또는 조직 침투를 증가시키는 임의의 다른 유형의 분자일 수 있다. 표적화 모이어티와 유사하게, 침투 증진제는 엑소좀 폴리펩타이드와 적어도 하나의 침투 증진제 사이의 융합 작제물의 생성을 통해 EV의 표면 상에 발현될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 강한 치료학적 효능을 갖는 EV를 대량으로 생산하기 위해 고도로 효과적인 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 (a) 적어도 하나의 PoI, 내인성으로 활성화될 수 있는 폴리펩타이드 기반 방출 시스템 및 엑소솜 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 작제물을 공급원 세포로 도입하는 단계, 및 (b) 폴리뉴클레오타이드 작제물(들)로부터 상응하는 폴리펩타이드(들)을 발현하는 단계를 포함한다. 전형적으로, 상기 방법은 또한 (c) 단백질 기반 방출 도메인의 내인성 유발을 통해 PoI가 EV로 방출되는, 공급원 세포에 의해 생성된(즉, 방출된) EV를 수거하는 단계를 포함한다.
적합한 폴리뉴클레오타이드 작제물의 공급원 세포 (전형적으로 EV의 생성을 위해 적합한 EV-생산 세포 유형을 포함하는 세포 배양물)로의 도입은 다양한 통상적인 기술, 예를 들어, 형질감염, 바이러스-매개된 형질전환, 전기천공 등을 사용하여 성취될 수 있다. 형질감염은 통상적인 형질감염 시약, 예를 들어, 리포좀, CPP, 양이온성 지질 또는 중합체, 인산칼슘, 덴드리머 등을 사용하여 수행될 수 있다. 바이러스-매개된 형질감염은 또한 고도로 적합한 방법이고, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 벡터와 같은 통상적인 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 바이러스 매개된 형질감염은 특히 세포 뱅킹을 위해 안정한 세포주를 생성하는 경우, 즉, EV-생산 세포 공급원의 마스터 세포 뱅크 (MCB) 및 워킹 세포 뱅크 (WCB)를 생성하는 경우 적절하다.
특정 경우에, 하나 초과의 폴리뉴클레오타이드 작제물을 공급원 세포로 도입하는 것이 유리할 수 있다. 이것은 예를 들어, NLS-NLSBP 방출 시스템을 사용할 때의 경우일 수 있다. 상기 경우에, 폴리뉴클레오타이드 작제물에 의해 암호화된 폴리펩타이드 작제물은 별도로 해독되고 이어서 해독 후 공급원 세포 내부에서 폴리펩타이드 (예를 들어, NLS를 포함하는 PoI 및 NLSBP에 융합된 엑소좀 단백질) 간에 목적하는 특이적 상호작용을 한다. 다른 한편, 덴드라-기반 방출 시스템 또는 시스-절단 방출 시스템 (예를 들어, 인테인 방출 시스템)과 같은 단량체성 시스템을 사용하는 경우, 단일 폴리펩타이드 작제물을 암호화하도록 하기 위해 단일 폴리뉴클레오타이드 작제물을 공급원 세포에 도입하는 것이 보다 유리할 수 있다. 추가의 구현예에서, 세포 배양 세포에 의한 EV의 생산은 상기 세포를 증가된 EV 생산을 유도할 수 있는 상이한 조건에 노출시킴에 의해 증진될 수 있다. 혈청 고갈, 저산소증, TNF알파 또는 인터페론과 같은 사이토킨으로의 노출, 바필로마이신과 같은 항생제, 및 다른 물질은 EV 생산, EV의 수율 및 또한 품질을 증가시키기 위해 사용될 수 있는 방법이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 작제물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 작제물은 전형적으로 적어도 하나의 PoI, 적어도 하나의 내인성으로 활성화될 수 있는 폴리펩타이드 기반 방출 시스템 또는 폴리펩타이드 기반 방출 시스템의 일부 및 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 스트레치를 포함한다. 비제한적인 예는 리소좀 저장 장애를 치료를 위한 효소 PoI (예를 들어, NPC1 또는 GBA), 시스-절단하는 인테인 및 엑소좀 폴리펩타이드, 예를 들어, CD81, 신테닌 또는 CD63을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 작제물이다. 따라서, 본 발명은 당연히 또한 상응하는 폴리펩타이드 작제물, 즉, 적어도 하나의 PoI, 적어도 하나의 내인성으로 유발된 폴리펩타이드 기반 방출 시스템 또는 폴리펩타이드 기반 방출 시스템의 일부 및 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 작제물에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 또한 상기 언급된 폴리뉴클레오타이드(들) 및/또는 상기 언급된 폴리펩타이드(들)을 포함하는 EV-생산 세포 (전형적으로 세포 배양물 형태로 존재하는 세포 그러나 또한 이와 같은 개별 세포)에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 시험관내 또는 생체내 PoI의 세포내 환경으로 또는 표적 세포의 막으로 전달을 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (i) 내인성으로 활성화될 수 있는 펩타이드-기반 방출 시스템을 사용하여 엑소좀 폴리펩타이드에 방출가능하게 부착된 PoI 또는 (ii) EV 내부에서 또는 표적 세포 내부에서 엑소좀 폴리펩타이드로부터 방출된 PoI를 포함하는 EV와 표적 세포를 접촉시킴을 포함한다. 중요하게, 선행 기술 분야에서와 같지 않게, 본 발명의 PoI는 실질적으로 비접합된 형태로 표적 세포로 전달되고, 즉, 미지의 PoI는 PoI의 활성을 잠재적으로 방해할 수 있는 대형 엑소좀 단백질 (또는 이량체 광유전학적 단백질의 경우에, 광유전학적 이량체)에 접합되지 않는다. 예를 들어, WO2014/168548은 엑소좀 단백질에 접합된 목적하는 치료학적 폴리펩타이드를 포함하는 엑소좀을 교시하고 이는 엑소좀 단백질에 접합되었음에도 불구하고 이들의 의도된 활성을 발휘할 수 있는 특정 유형의 치료학적 단백질에 대한 우수한 전략이다. 그러나, 본 발명의 방법은 임의의 외인성 자극에 대한 필요 없이 이들의 목적하는 위치(들)에서 PoI를 유리시키는 본 발명의 조절가능한 내인성으로 활성화될 수 있는 방출 시스템을 통해, 보다 광범위한 범위의 치료학적 PoI의 전달을 가능하게 할 수 있다.
본 발명에 따른 특정 구현예에서, PoI는 내인성으로 유발된 단백질 기반 방출 시스템의 도움으로 엑소좀 폴리펩타이드에 접합된 통합 막 단백질일 수 있다. 통합 막 PoI는 EV의 외부, 내부 또는 둘다의 표면 상에 존재할 수 있다. 임의의 이론에 국한되는 것 없이, 표적 세포로 취득되는 통합 막 PoI를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 EV는 소포체 (ER)로 트래픽킹되는 것으로 추정된다. EV의 내용물, 즉, 통합막 PoI를 포함하는 폴리펩타이드 작제물은 ER에서 프로세싱되고 분류됨에 이어서 ER 매개되어 표적 세포의 적당한 격실로 트랙픽킹될 수 있다. 따라서, 폴리펩타이드 기반 방출 시스템의 도움으로 통합 세포질막 단백질(예를 들어, G 단백질 커플링된 수용체 (GPCR))에 접합된 엑소좀 단백질을 포함하는 폴리펩타이드 작제물은 표적 세포의 세포질막으로 이동하는 반면 리소좀성 막에 본래 존재하는 막 단백질(즉, 리소좀성 막 단백질)은 표적 세포의 리소좀으로 이동한다. 막 PoI의 하나의 특정 중요한 예는 NPC1이고, 이는 콜레스테롤의 막 수송체이고 결함이 있는 경우 저장 장애인 니만-픽(Niemann-Pick) 질환을 유발한다.
PoI의 방출은 상기된 바와 같이 PoI 및/또는 엑소좀 폴리펩타이드에 융합된 내인성으로 활성화될 수 있는 폴리펩타이드 기반 방출 시스템에 의해 매개된다. 유리한 구현예에서, 후속적 폴리펩타이드 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 작제물은 방출 시스템이 PoI와 엑소좀 폴리펩타이드 사이에 위치하도록 디자인된다. 이러한 정렬은 상기 작제물의 용이한 제조와 목적하는 위치에서 PoI의 효율적인 방출을 가능하게 한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 EV를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 전형적으로, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제로 제형화된 적어도 한 유형의 치료학적 EV (즉, 특정 목적하는 PoI를 갖는 EV 집단)를 포함한다. 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제는 임의의 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어, 고체 또는 액체 충전제, 희석제, 부형제, 담체, 용매 또는 캡슐화 물질을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있고, 이들은 예를 들어, 치료학적 전달 소낭을 현탁시키는데 또는 이를 하나의 기관 또는 신체 일부를 또 다른 기관 또는 신체 일부로(예를 들어, 혈액으로부터 목적하는 임의의 조직 및/또는 기관 및/또는 신체 부분으로) 운반하거나 수송하는 활성을 유지하는데 관여할 수 있다.
본 발명은 또한 PoI를 포함하는 EV의 화장품 응용에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 피부 케어 제품, 예를 들어, 크림, 로션, 겔, 에멀젼, 연고, 페이스트, 산제, 도찰제, 선스크린, 샴푸, 등에 관한 것이고, 이들은 건조 피부, 주름, 접힘(fold), 릿지(ridge) 및/또는 피부 자국과 같은 증상 및 문제점을 개선시키고/시키거나 완화시키기 위해 적합한 EV를 포함한다. 화장품 및 치료제 특성 둘다의 하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 EV는 PoI로서 보툴리눔 독소 (예를 들어, 보톡스, 예를 들어, 보툴리눔 독소 유형 A-G)를 포함할 수 있다(보툴리늄 독소는 필수적으로 화장용으로만 사용될 수 있는 것이 아니라 예를 들어, 편두통 및 실조증의 치료를 위해 적용될 수 있다). 바람직한 구현예에서, 재생 성질을 갖는 적합한 엑소좀-생산 세포 (예를 들어, 중간엽 줄기 세포)로부터 수득될 수 있는 EV (적어도 한 유형의 PoI를 포함하는)는 주름, 라인, 폴드, 릿지 및/또는 피부 자국의 화장학적 또는 치료학적 완화에 사용하기 위한 화장 크림, 로션 또는 겔에 포함된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 의약에 사용하기 위한 본 발명에 따른 EV에 관한 것이다. 당연히, 본 발명에 따른 PoI를 포함하는 EV가 의약에 사용되는 경우, 사실 정상적으로 사용되는 것은 EV 집단이다. 환자에게 투여되는 EV의 용량은 EV에 로딩된 PoI의 양, 치료되거나 완화될 질환 또는 증상, 투여 경로, PoI 자체의 약리학적 작용, 및 다양한 관련 다른 파라미터에 의존한다.
본 발명의 EV는 예방학적 및/또는 치료학적 목적을 위해, 예를 들어, 본 발명의 EV는 다양한 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료 및/또는 완화에 사용하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 EV가 적용될 수 있는 질환의 비제한적인 예는 크론 질환, 궤양성 대장염, 강직성 척추염, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 전신 홍반성 낭창, 사르코이드증, 특발성 폐 섬유증, 건선, 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 관련 주기적 증후군 (TRAPS), 인터류킨-1 수용체 길항제의 결핍 (DIRA), 자궁내막증, 자가면역 간염, 피부 경화증, 근염, 뇌졸중, 급성 척수 손상, 혈관염, 길레인-바레 증후군, 급성 심근경색, ARDS, ??혈증, 뇌수막염, 뇌염, 간부전증, 신부전증, 이식-대-숙주 질환, 뒤센 근위축증 및 다른 근위축증, 리소좀성 저장 질환, 예를 들어, 고셔 질환, 패브리 질환, MPS I, II (헌터 증후군), 및 III, 니만-픽 질환(Niemann-Pick disease), 폼페(Pompe) 질환, 등, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환 및 다른 트리뉴클레오타이드 반복체-관련 질환을 포함하는 신경변성 질환, 치매, ALS, 암-유도된 악액질, 식욕부진증, 2형 진성 당뇨병, 및 다양한 암을 포함한다.
실제로 모든 유형의 암은 본 발명에 대한 관련 표적, 예를 들어, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 급성 골수 백혈병, 부신피질 암종, AIDS-관련 암, AIDS-관련 림프종, 항문암, 어펜딕스 암, 성상교세포종, 소뇌 또는 대뇌, 기저-세포 암종, 담관암, 방광암, 골 종양, 뇌간 신경교종, 뇌암, 뇌 종양 (소뇌 성상교세포종, 소뇌 성상교세포종/악성 교종, 뇌실막세포종, 수모세포종, 근원 양성 원시 신경 외배엽 종양, 시각 경로 및 시상 하부 신경 교종), 유방암, 기관지 선암종/카르시노이드, 버킷 림프종, 카르시노이드 종양 (아동기, 위장), 미지의 1차 암종, 중추 신경계 림프종, 소뇌 성상교세포종/악성 교종, 자궁경부암, 만성 림프구 백혈병, 만성 골수 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 결장암, 피부 T-세포 림프종, 결합조직성 소원형세포종양, 자궁내막암, 뇌실막세포종, 식도암, 두개외 생식 세포 종양, 고환외 생식 세포 종양, 간외 담관암, 눈암 (안내 흑색종, 망막아종), 담낭암, 위(위장)암, 위장 카르시노이드 종양, 위장 기질 종양(GIST), 생식 세포 종양(두개외, 고환외, 또는 난소), 임신성 융모성 종양, 교종 (뇌간 교정, 대뇌 성상교세포종, 시각 경로 및 시상 하부 신경 교종), 위 카르시노이드, 모발 세포 백혈병, 두경부암, 심장암, 간세포 (간)암, 호지킨 림프종, 하인두암, 안내 흑색종, 섬 세포 암종 (내분비 췌장), 카포시 육종, 신장암 (신장 세포암), 후두암, 백혈병 ((급성 림프아구성(또한 급성 림프구 백혈병으로 호칭됨), 급성 골수종 (또한 급성 골수 백혈병으로 호칭됨), 만성 림프구종 (또한 만성 림프구 백혈병으로 호칭됨), 만성 골수종(또한 만성 골수 백혈병으로 호칭됨), 모발 세포 백혈병)), 입술 및 경구, 구강암, 지방육종, 간암 (1차), 폐암 (비-소 세포, 소 세포), 림프종 ((AIDS-관련 림프종, 버킷 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 (호지킨을 제외한 모든 림프종으로 분류되는) 림프종, 1차 중추신경계 림프종)), 수모세포종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 잠복 원발성 전이성 비늘모양 경부암, 입암, 다발성 내분비 신생물 증후군, 다발성 골수종/혈장 세포 신생물, 균상식육종, 골수이형성/골수증식성 질환, 골수성 백혈병, 만성 골수 백혈병(급성, 만성), 골수종, 비강 및 부비동암, 비인두 암종, 신경모세포종, 구강암, 구인두암, 골육종/골의 악성 섬유조직구종, 난소암, 난소 상피암(표면 상피-기질 종양), 난소 생식 세포 종양, 난소 낮은 악성 잠재력 종양, 췌장암, 췌장섬 세포암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 갈색세포종, 송과체 성상교세포종, 송과체 배아종, 송과체아세포종 및근원 양성 원시 신경 외배엽 종양, 뇌하수체 선암종, 흉막폐아세포종, 전립선암, 직장암, 망막 세포 암종(신장암), 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종(어윙 계열의 종양 육종, 카포시 육종, 연조직 육종, 자궁 육종), 세자리 증후군(Sezary syndrome), 피부암 (비흑색종, 흑색종), 소장암, 편평 세포, 비늘 모양 경부암, 위암, 근원 양성 원시 신경 외배엽 종양, 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선 암, 전이 세포암, 신우 및 요관의 일시적 세포암, 요도암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 발덴스트룀 거대글로불린혈증, 및/또는 빌름 종양이 있다.
본 발명에 따른 EV는 다양하게 상이한 투여 경로를 통해 인간 또는 동물 대상체에게 투여될 수 있다: 예를 들어, 귓바퀴 (귀), 협측, 결막, 피부, 치음, 전기-삼투압, 자궁내, 부비강내, 기관내, 장, 경막외, 양막외, 체외, 혈액투석, 침윤, 간질, 복부내, 양막내, 동맥내, 관절내, 담관내, 기관지내, 활액낭내, 심장내, 연골내, 꼬리내, 해면체내, 강내(intracavitary), 대뇌내, 수조내, 각막내, 두정내 (치음), 관상동맥내, 음경해면체내, 피내, 추간판내, 관내, 십이지장내, 경막내, 상피내, 식도내, 위내, 잇몸내, 회장내, 병변내, 강내, 림프구내, 수질내, 뇌막내, 근육내, 안내, 난소내, 심막내, 복막내, 늑막내, 전립선내, 폐내, 부비강내, 척추내, 활액막내, 건내, 고환내, 낭내, 흉부내, 관내, 종양내, 고막내, 자궁내, 혈관내, 정맥내, 정맥내 볼러스 주입, 정맥내 점적 주입, 심실내, 방광내, 유리체내, 이온도입법, 관개, 후두, 비강, 비위(nasogastric), 폐색성 드레싱 기술, 눈, 경구, 구강인두, 기타, 비경구, 경피, 관절주위, 경막주위, 신경주위, 치근막, 직장, 호흡 (흡입), 안와, 연조직, 지주막하, 결막하, 피하, 설하, 점막하, 국소, 경피(transdermal), 경점막, 경태반, 경기관, 경고막, 요관, 요도, 및/또는 질 투여, 및/또는 상기 투여 경로의 임의의 조합.
추가의 양상에서, 본 발명은 상기 언급된 바와 같이 (a) 적어도 하나의 PoI, 내인성으로 활성화될 수 있는 폴리펩타이드 기반 방출 시스템 및 엑소좀 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 작제물(들)을 세포 공급원 (전형적으로 세포 배양물)에 도입하는 단계, (b) 상기 폴리뉴클레오타이드 작제물(들)에 의해 암호화된 상기 폴리펩타이드 작제물(들)을 발현하는 단계 및 (c) 상기 세포에 의해 생성된 EV를 수거하는 단계를 포함하는 EV를 생산하는 (또는 보다 정확하게는 EV 집단을 생산하는) 방법에 관한 것이다. PoI를 방출시키기 위해 단량체성 광-유도된 절단 시스템을 사용하는 경우, 상기 EV를 적합한 파장의 광에 단기 노출시키는 추가의 단계가 상기 생산 방법에 부가된다. 상기 광 노출 단계는 EV가 세포 내부에서 여전히 형성되는 동안에, EV가 지금 바로 세포 배양 배지로 방출된 경우, EV가 추가로 프로세싱되는 경우(예를 들어, 접선 유동 여과 (TFF), 한외여과, 비드-용출 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피 또는 이의 임의의 조합), 또는 필수적으로 적합한 경우 마다 세포 공급원, EV 생산 특징 및 EV 자체에 의존하여 수행될 수 있다. 적합한 배양 시스템은 통상의 2D 세포 배양물, 3D 세포 배양물, 생물반응기, 중공-섬유 생물반응기 등을 포함한다.
상기 방법은 또한 상기 공급원 세포를 혈청 고갈, 저산소증, 바필로마이신 또는 사이토킨, 예를 들어, TNF-알파 및/또는 IFN-감마에 노출시켜 수득한 EV의 수율 또는 성질에 영향을 미침을 포함할 수 있다. 상기 EV 생산 규모 및 타임라인은 EV-생산 세포 또는 세포주에 과중하게 의존할 것이고 따라서 당업자에 의해 상응하게 조정될 수 있다.
상기 생산 방법은 정제 단계를 추가로 포함할 수 있고, 여기서, 상기 EV는 액체 크로마토그래피 (LC), 비드-용출 LC, 크기-배제 LC, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 회전 여과, 접선 유동 여과, 중공 섬유 여과, 원심분리, 면역침전 등 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 과정을 통해 정제된다.
유리한 구현예에서, 상기 EV의 정제는 여과 (바람직하게 한외여과 (UF), 접선 유동 여과 (TFF) 또는 중공 섬유 여과) 및 비드-용출 또는 크기 배제 크로마토그래피 (LC)의 연속 조합을 사용하여 수행된다. 상기 정제 단계 조합은 최적화된 정제를 유도하고 이어서 보다 우수한 치료학적 활성을 유발한다. 추가로, 통상적으로 엑소좀을 정제하기 위해 사용되는 초원심분리 (UC)와 비교하여, 연속 여과-크로마토그래피는 상당히 보다 신속하고 보다 높은 제조 용적으로 대규모로 할 수 있고, 이에 대해서 선행 기술 분야에서 주로 사용되는 현행 UC 방법은 상당한 결점이 있다.
상기된 예시적 양상, 구현예, 대안 및 변이는 본 발명의 범위로부터 벗어나는 것 없이 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 지금부터 본 발명은 추가로 첨부된 실시예와 함께 예시될 것이고, 이는 또한 본 발명의 범위 및 요지로부터 벗어나는 것 없이 상당히 변형될 수 있다.
실험부
재료 및 방법
·작제물 디자인 및 클로닝
다양한 시스-절단하는 내인성으로 활성화될 수 있는 폴리펩타이드 기반 방출 시스템 (예를 들어, 느리게 절단하는 인테인, 신속하게 절단하는 인테인, 소르타제 A 및 FrpC)은 여러 PoI (예를 들어, Cre, NPC1, IL10, RNA-결합 MS2 코트 단백질) 및 엑소좀 폴리펩타이드(CD81, CD63, CD9, 신테닌, 신데칸, Alix, CD133, 등)와 조합하여 평가되었다. 유사하게, 다양한 NLS-NLSBP 방출 시스템 및 단량체성 광 유도된-방출 시스템은 PoI 및 EV 단백질과 함께 평가되었다. NLS-NLSBP 시스템은 다음을 포함한다: KPNA1-NRF2, KPNA6-STAT3, KPNB1-STAT3, KPNA2-HSF1. NLSBP는 임포틴 알파 및 베타 계열로부터의 임포틴, 및 KPNA1, KPNA2, IPO8, TPNO1, HIKESHI, SNUPN, HEATR3, 및 기타 RAN 결합 단백질을 포함하는 다른 NLS 결합 단백질을 포함한다. NLS 함유 단백질들은 다양한 전사 인자들, 뉴클레아제 및 기타 핵 단백질, 예를 들어, bHLH, MyoD, cMyc, HSF1, STAT3, p53, NFkB, Cas9, HSP70, 및 U1 snRNP를 포함한다. 단량체성 광-유도된 절단 시스템은 다음을 포함한다: Kaede, KikGR, EosFP, 및 Dendra. PoI는 NPC1, GBA, AGAL, 헌팅틴, BDNF, NFkB 슈퍼-리프레서, RNA-결합 단백질 및 도메인, 예를 들어, hnRNPA1, MS2 코트 단백질, G-패치 등을 포함한다. RNA-결합 단백질의 경우에, 이들은 목적하는 폴리뉴클레오타이드와 조합되었고, 상기 RNA-결합 단백질은 EV로 이끌린다. 다수의 엑소좀 단백질이 평가되었다: CD81, CD63, CD9, 신데칸, Alix, CD133, 신테닌-1, 신테닌-2, Lamp2b, TSPAN8, 및 TSPAN14, 및 이의 변이체 및 도메인.
시스-절단하는 방출 시스템 작제물 및 단량체성 광-유도된 절단 시스템을 평가하는 경우, ORF는 전형적으로 합성에 의해 생성되었고 포유동물 발현 벡터 pSF-CAG-Amp에 클로닝하였다. 간략하게, 합성된 DNA 및 벡터 플라스미드는 제조업자의 지시(NEB)에 따라 효소 NotI 및 SalI로 분해하였다. 제한 절단된, 정제된 DNA 단편들은 제조업자의 지시 (NEB)에 따라 T4 리가제를 사용하여 함께 연결하였다. 성공적인 연결 반응은 앰피실린-보충된 플레이트 상의 세균 형질전환을 위해 선택되었다. 형질감염을 위한 플라스미드는 제조업자의 지시에 따라 ‘maxi-prep’에 의해 생성하였다.
NLS-NLSBP 방출 시스템의 경우에, ORF 서열은 정상적으로 구입하였고(제조원: Origene Technologies, Inc.) 증폭시키고 pIRES 바이시스트론 발현 벡터(Clonetech, Laboratories Inc.)의 MSC A 부위에 클로닝하여 해독시 NLSBP 단백질이 엑소좀 폴리펩타이드와 융합된 키메라로서 발현되도록 하였다. NLS는 NLS가 부재인 PoI 상에 융합시키거나, 사용되는 PoI 상에 이미 존재하는 경우, 가끔씩 유전학적으로 변형시킨다. 클로닝 대부분은 NE빌더 HiFi DNA 어셈블리 클로닝 키트(NEB, Inc.)를 사용하여 수행하였고 생거 서열 분석 (Sanger sequencing) (Source BioScience)을 사용하여 확인하였다. pIRES 벡터는 전이유전자 둘다가 동시에 바이시스트론 발현할 수 있도록 하여 EV-생산 세포가 전이유전자 둘다를 동시에 발현하는 것을 확실히 한다. 플라스미드로 NEB 5-알파 컴피턴트 이. 콜라이 세포 (NEB, Inc.)를 형질전환시키고 제조업자의 추천에 따라 진탕 배양기에서 밤새 성장시켰다. 플라스미드는 제조업자(Macherey-Nagel)의 지침에 따라 단리하고‘maxi-prep’키트를 사용하여 정제하였다.
ㆍ세포 배양 및 형질감염
실험 디자인 및 검정에 의존하여, 특정 경우에, 비-바이러스 일시적 형질감염 및 엑소좀 생산은 통상적인 2D 세포 배양물에서 수행하였고, 반면, 다른 경우에, 바이러스 매개된 형질도입을 사용하여 전형적으로 상이한 유형의 생물반응기에서 배양되는 안정한 세포주를 생성하였다. 간결한 설명을 위해, 단지 몇개의 실시예가 본원에서 언급된다.
HEK293T 세포는 전형적으로 15 cm 디쉬 (디쉬 당 9x106 세포)로 씨딩하였고 ATCC에 의해 추천된 바와 같이 혈청-함유 DMEM 중에서 밤새 방치하였다. 다음 날, 세포는 직접적으로 세포 상으로 부가된 지질복합체화된 DNA로 일시적으로 형질감염시켰다. 간략하게, DNA 및 폴리에틸렌이민(PEI)은 실온에서 20분 동안 함께 조합하기 전, 5분 동안 OptiMEM 중에서 별도로 항온처리하였다. 지질복합체화된 DNA 및 세포는 6시간 동안 동시 항온처리하고 이후 조건화된 배양 배지는 48시간 동안 OptiMEM으로 변화시켰다. 디쉬, 플라스크 및 다른 세포 배양 용기에서 평가된 다른 세포 및 세포주는 골수-유래된 중간엽 기질 세포(BM-MSC) 및 와톤 젤리-유래된 MSC (WJ-MSCs), 암니온 세포, 섬유아세포, 다양한 내피 및 상피 세포, 및 다양한 면역 세포 및 세포주를 포함하였다.
PoI, 방출 시스템, 및 엑소좀 폴리펩타이드의 다양한 조합을 위해 적합한 세포주의 바이러스 형질도입 및 생성의 경우에, 세포 공급원, 예를 들어, BM-MSC, WJ-MSC, 섬유아세포, 암니온 세포, 섬유아세포, 다양한 내피 및 상피 세포는 전형적으로 렌티바이러스 (LV)를 사용하여 바이러스 형질도입하였다. 전형적으로, 감염 24시간 전에, 100.000개의 세포(예를 들어, 섬유아세포, MSC, 등) 또는 200.000개 세포(예를 들어, HEK293T)는 6-웰 플레이트에 분주한다. 2 uL의 LV 및 임의로 폴리브렌(또는 헥사디메트린 브로마이드, 웰 상에 8 ug/mL의 최종 농도)을 첨가하고 형질도입 24시간 후, 형질도입된 세포의 세포 배지는 새로운 완전 배지로 변화시킨다. 형질도입 후 72시간 째에, 푸로마이신 선택(4-6μg/ml)은 정상적으로 7일 동안 수행하고 이어서 폴리펩타이드 작제물의 안정한 발현에 대해 분석하였다.
안정한 세포는 2D 배양물 또는 생물반응기, 전형적으로 중공-섬유 생물반응기에서 배양하였고 조건화된 배지는 후속적으로 엑소좀 제조를 위해 수거하였다. 다양한 제조 및 정제 단계들을 수행하였다. 표준 작업흐름은 상등액의 예비-세정 단계, 여과-기반 농축 단계, 단백질 오염물의 크로마토그래피 기반 제거 단계 및 시험관내 및 생체내 검정을 위해 적합한 완충액 중 수득한 엑소좀 조성물의 임의의 제형화 단계를 포함한다.
ㆍ검정 및 분석
웨스턴 블롯은 EV 내 PoI의 농축을 평가하기 위한 고도로 간편한 분석적 방법이다. 간략하게, SDS-PAGE는 제조업자 지침(Invitrogen, Novex PAGE 4-12% 겔)에 따라 수행함으로써, 1 x 1010 엑소좀 및 20 ug의 세포 용해물을 웰당 로딩하였다. SDS-PAGE 겔로부터의 단백질은 제조업자의 지침 (Immobilon, Invitrogen)에 따라 PVDF 막으로 이동시켰다. 막은 공급업자의 지침 (Primary antibodies - Abcam, Secondary antibodies - Licor)에 따라 오딧세이 차단 완충액 (Licor) 중에서 차단시키고 PoI 및 엑소좀 단백질에 대한 항체로 탐침하였다. 분자 프로브는 680 및 800 nm 파장에서 가시화하였다. 도 14는 PoI로서 Cre 리컴비나제 및 엑소좀 단백질로서 Alix의 조합에 대한 이의 도해를 보여준다.
EV 크기 결정을 위해, 나노입자 트랙킹 분석(NTA)은 분석 소프트웨어를 장착한 NanoSight 기구를 사용하여 수행하였다. 모든 기록을 위해, 본원 발명자는 13 또는 15의 카메라 수준 및 모든 사후 획득 설정을 위한 자동 기능을 사용하였다. 전자 현미경 및 형광성 현미경을 자주 사용하여 PoI 위치 및 방출을 이해하고 EV를 정량하고 분석하였다.
EV는 다양한 방법, 전형적으로 TFF 및 LC와 같은 여과의 조합을 사용하여 단리하고 정제하였다. 전형적으로, EV-함유 배지를 수거하고 5분 동안 300 g에서 저속 회전에 적용함에 이어서 10분 동안 2000 g 회전에 적용하여 보다 큰 입자 및 세포 잔해를 제거하였다. 이어서 상등액은 0.22 μm 시린지 여과기를 사용하여 여과하고 상이한 정제 단계에 적용하였다. 대형 용적을 투석여과하고 100 kDa 컷오프 여과기를 갖는 Vivaflow 50R 접선 유동 (TFF) 장치 (Sartorius) 또는 100 또는 300 kDa 컷오프 중공 섬유 여과기를 갖는 KR2i TFF 시스템 (SpectrumLab)을 사용하여 투석여과하고 대략 20 ml로 농축시켰다. 예비 농축된 배지는 후속적으로
Figure 112018129896019-pct00001
KTA프라임 플러스 또는
Figure 112018129896019-pct00002
KTA 순수 25 크로마토그래피 시스템 (GE Healthcare Life Sciences)에 연결된, 비드-용출 칼럼 (HiScreen or HiTrap Capto Core 700 column, GE Healthcare Life Sciences)상에 로딩하였다. 칼럼 평형화를 위한 유속 세팅, 샘플 로딩 및 제위치 과정의 칼럼 세정은 제조업자의 지침에 따라 선택하였다. 샘플은 UV 흡광도 크로마토그램에 따라 수거하였고 Amicon Ultra-15 10 kDa 분자량 컷-오프 회전-여과기 (Millipore)를 사용하여 100 μl의 최종 용적으로 농축시키고 추가의 다운스트림 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다. 단백질 및 RNA 용출 프로필을 평가하기 위해, 100 kDa 및 300 kDa 중공 섬유 여과기를 사용한 KR2i TFF 시스템을 사용하여 배지를 농축시키고 정용여과하고 샘플을 Tricorn 10/300 세파로스 4 신속 흐름 (S4FF) 칼럼 (제조원: GE Healthcare Life Sciences) 상에서 분석하였다.
ㆍ 실시예
도 3은 GBA 효소와 엑소좀 단백질 CD63 사이에 삽입된 느리게 절단하는 인테인을 포함하는 폴리펩타이드 작제물이 풍부한 BM-MSC EV로 처리된 GBA-결핍 환자-유래된 림프구의 결과를 보여준다. HPLC-기반 검정을 사용하여, 수용자 세포는 자유롭게 방출된 GBA의 EV-매개된 전달 후 지질 글루코세레브로사이드의 수준에서 감소를 나타냈다. 유사 실험은 PoI로서 지질 수송체 단백질 NPC1, 신속하게 절단하는 인테인-기반 방출 시스템 및 엑소좀 단백질 CD133을 포함하는 폴리펩타이드 작제물을 사용하여 수행하였다. 상기 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 EV는 NPC1을 NPC-1 결핍 섬유아세포에 효율적으로 전달하여 비-기능성 방출 시스템을 포함하는 대조군 EV와는 반대로 상당히 보다 높은 수준의 기능성 콜레스테롤 수송을 유도하였다.
또 다른 실시예에서, 내인성으로 활성화될 수 있는 N-말단 프로테아제-기반 방출 시스켐을 사용하여 EV-생산 모 세포로서 섬유아세포와 함께 PoI p53을 엑소좀 단백질 신데칸에 융합시켰다. 시험관내에서 p53의 MDA-MB-231 암 세포로의 EV-매개된 내인성으로 활성화된 방출가능한 전달은 동일한 EV 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 방출가능하지 않은 전달 보다 상당히 보다 효과적이었다.
도 5는 비-상동성 말단-연결 (NHEJ) 검정의 결과를 보여준다. 리포터 시스템을 함유하는 HEK293T-적혈구 세포는 가이드 RNA (gRNA) 및 엑소좀 폴리펩타이드로서 CD81, 단량체성 광-유도된 절단-기반 방출 시스템으로서 Kaede 및 PoI로서 Cas9를 포함하는 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 섬유아세포-유래된 EV로 형질감염시켰다. 세포 배양물로부터 수득된 경우의 EV는 엑소좀 생산 공정 동안에 청색 광에 노출되거나 노출되지 않는다. Kaede의 절단을 유도함으로써 Cas9를 방출시키는 광의 짧은 부스트에 노출된 세포로부터 수득된 엑소좀만이 양성 세포의 백분율에서의 증가를 보여주었다. 유사하게 도 6은 광에 노출된 세포로부터 수거된 EV로 처리된 세포의 고해상 용융 (HRM) 분석 결과를 보여준다. 도 5에서와 같이 동일한 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 섬유아세포 EV는 생활성 Cas9 및 gRNA의 효율적인 세포내 전달의 결과로서 AAVS 유전자좌내 Cas9-매개된 돌연변이를 유도하였다. 도 7은 단량체성 광-유도된 방출 폴리펩타이드 덴드라2를 통해 CD63에 융합된 Cas9를 포함하여 UV/청색광 조사 후 EV에서 Cas9가 기능성이 되도록 하는 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 양막 상피-세포 유래된 EV의 NHEJ 검정에서의 효과를 보여준다. 도 8은 UV/청색 광에 노출된 세포로부터 수거된 WJ-MSC EV로 처리된 세포의 HRM 결과를 보여준다. 도 7에서와 같이 동일한 폴리펩타이드 작제물(그러나, 이번에는 WJ-MSC-유래된 EV에서)을 포함하는 EV는 생활성 Cas9 및 gRNA의 효율적인 세포내 전달의 결과로서 AAVS 유전자좌내 Cas9-매개된 돌연변이를 유도하였다. 도 9는 UV-광에 노출되어 표적 골수 유래된 마크로파아지 세포 내부에서 scFv를 방출하는 WASP-표적화된 단일쇄 가변 단편(scFv)-KikGR-CD63 폴리펩타이드 작제물이 로딩된 HEK-EV에 의해 성취되는 NfKB 반응의 강력한 하향 조절을 보여준다.
도 10은 IL2-수용체를 발현하도록 자극되고 동시에 IL2R-알파 서브유니트를 향해 scFv가 로딩된 KEK EV로 처리된 유르캣 (Jurkat) 세포의 결과를 보여준다. 양성 대조군 및 scFv-덴드라2-CD63 (및 UV-광에 노출된)이 로딩된 EV 만이 FACS 분석에 따라 유르캣 세포의 세포 표면 상에 IL2R의 하향 조절을 유도하였다. 도 11은 발암단백질 erb-2를 향해 표적화된 scFv가 로딩된 EV로 처리된 erbB-2-양성 난소 암종 세포주 SKOV3의 결과를 보여준다. 세포사는 처리 후 48시간 째에 분석하였다. scFv-덴드라2-CD63이 로딩되고 (이후 UV-광에 잠시 노출된) EV 만이 양성 대조군에 상응하는 수준으로 세포사를 유도하였다.
도 12는 NLSBP-NLS-기반 방출 시스템을 사용한 NRF2 전사 인자의 BM-MSC-유래된 EV로의 로딩 결과 및 수용자 세포에서 표적 유전자 HMOX1 발현을 유도하는데 있어서 관련 효과를 보여준다. NLSBP (KPNA1, 또한 임포르틴 α5로서 공지된)는 엑소좀 단백질 CD63과 융합시키고 EV 공급원 세포 (BM-MSC에 추가로, 다양한 유형의 면역 세포가 양호한 결과함께 시험되었다)에서 NRF2와 함께 동시 발현시켰다. 동시-발현은 단독의 NRF2의 발현과 비교하여 웨스턴 블롯팅에 의한 평가시 NRF2의 유의적으로 증진된 EV 분류를 유도한다. 상기 전략을 사용한 NRF2 로딩된 EV의 전달은 HEK 세포에서 표적 유전자 발현의 유도를 유발한다. 다른 EV 단백질을 기초로 하는 폴리펩타이드 작제물의 생성은 또한 예를 들어, Alix 및 신테닌을 사용하는 경우와 유사한 효과를 유도하였다. 도 13은 도 5에서와 같이 유사한 실험을 보여주지만 여기서 CD63, CD81 (데이터는 나타내지 않음), 및 신테닌 (데이터는 나타내지 않음)과 융합되고 Cas9와 융합된 방출 시스템으로서 시스-절단하는 인테인 (아미노산 서열 Val-Val-Val-His-Asn을 포함하는)을 사용하고 아미노 상피 세포를 사용하여 전달하였다. 도 13으로부터 알 수 있는 바와 같이, 단지 돌연변이되지 않은 인테인만이 NHEJ의 관련 수준을 유도하였다.
NLS-NLSBP 폴리펩타이드-기반 내인성으로 활성화된 방출 시스템의 또 다른 예는 KPNA2를 엑소좀 단백질 CD47로 융합시키고 이를 섬유아세포에서 전사 인자 HSF1과 동시 발현함에 따라서 HSF1을 엑소좀으로 로딩함을 포함한다. 섬유아세포-유래된 엑소좀을 단리하였고 이를 사용하여 이들의 배양 배지에서 낮거나 높은 칼륨 농도에 적용된 마우스 1차 소뇌 과립 신경 세포를 처리하였다. HSF1-로딩된 EV 처리는 아폽토시스-유도 낮은 칼륨 조건에서 NLS-NLSBP 방출 시스템이 없는 대조군 엑소좀을 사용한 처리와 비교하여 상당히 보다 높은 세포 생존능을 유도하였다.
<110> Evox Therapeutics Ltd <110> Oxford University Innovation Ltd <120> Exosomes Comprising Therapeutic Polypeptides <130> EVOX-002/001WO 328109-2018 <140> PCT/GB2017/051479 <141> 2017-05-25 <150> GB1609216.5 <151> 2016-05-25 <160> 2 <170> KopatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 1 Val Val Val His Asn 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 2 Val Val Val His Asn Cys 1 5

Claims (17)

  1. (i) 적어도 하나의 목적하는 폴리펩타이드(polypeptide of interest: PoI);
    (ii) 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드; 및
    (iii) 폴리펩타이드-기반 방출 시스템
    을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 세포외 소포체 (extracellular vesicle: EV)로서,
    여기서, 상기 폴리펩타이드-기반 방출 시스템이 내인성 활성화 시 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드로부터 적어도 하나의 PoI를 방출시키고, 상기 폴리펩타이드-기반 방출 시스템이 인테인 방출 시스템 또는 핵 국소화 신호 (nuclear localization signal: NLS)-핵 국소화 신호-결합 단백질 (nuclear localization signal-binding protein: NLSBP)(NLS-NLSBP) 방출 시스템으로부터 선택되고,
    상기 PoI가 항체, 세포내 항체 (intrabody), 단일쇄 가변 단편, 애피바디(affibody), 효소, 종양 억제제, 바이러스 또는 세균 저해제, 세포 구성 단백질(cell component proteins), DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, DNA 및 RNA 결합 단백질, DNA 복구 저해제, 뉴클레아제, 프로테이나제, 인테그라제, 전사 인자, 성장 인자, 아폽토시스 저해제 및 유도제, 독소, 구조적 단백질, 신경영양성 인자, 막 수송체, 뉴클레오타이드 결합 단백질, 열 쇼크 단백질, CRISPR-관련 단백질 및 이들의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 치료적 폴리펩타이드인, 세포외 소포체(EV).
  2. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀 폴리펩타이드가 CD9, CD53, CD63, CD81, CD54, CD50, FLOT1, FLOT2, CD49d, CD71, CD133, CD138, CD235a, ALIX, 신테닌-1, 신테닌-2, Lamp2b, TSPAN8, TSPAN14, CD37, CD82, CD151, CD231, CD102, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, CD11a, CD11b, CD11c, CD18/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c, CD49e, CD51, CD61, CD104, 테트라스파닌, Fc 수용체, 인터류킨 수용체, 면역글로불린, MHC-I 또는 MHC-II 성분들, CD2, CD3 엡실론, CD3 제타, CD13, CD18, CD19, CD30, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD110, CD111, CD115, CD117, CD125, CD135, CD184, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6A1, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA-DM, HSPG2, L1CAM, LAMB1, LAMC1, LFA-1, LGALS3BP, Mac-1 알파, Mac-1 베타, MFGE8, SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTI1A 및 VTI1B를 포함하는 그룹으로부터 선택되는, EV.
  3. 제1항에 있어서, 상기 EV가 적어도 하나의 목적하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, EV.
  4. 제3항에 있어서, 상기 목적하는 폴리뉴클레오타이드가 RNA-결합 PoI 또는 DNA-결합 PoI와의 상호작용을 통해 상기 EV로 수송되는, EV.
  5. 적어도 하나의 PoI를 포함하는 EV로서, 상기 PoI가 폴리펩타이드-기반 방출 시스템의 내인성 활성화를 통해 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드로부터 방출되고,
    여기서, 상기 폴리펩타이드-기반 방출 시스템이 인테인 방출 시스템 또는 NLS-NLSBP 방출 시스템으로부터 선택되고,
    상기 PoI가 항체, 세포내 항체 (intrabody), 단일쇄 가변 단편, 애피바디(affibody), 효소, 종양 억제제, 바이러스 또는 세균 저해제, 세포 구성 단백질, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, DNA 및 RNA 결합 단백질, DNA 복구 저해제, 뉴클레아제, 프로테이나제, 인테그라제, 전사 인자, 성장 인자, 아폽토시스 저해제 및 유도제, 독소, 구조적 단백질, 신경영양성 인자, 막 수송체, 뉴클레오타이드 결합 단백질, 열 쇼크 단백질, CRISPR-관련 단백질 및 이들의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 치료적 폴리펩타이드인, EV.
  6. 제5항에 있어서, 상기 EV가 목적하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, EV.
  7. 제1항에 있어서, 상기 EV가 적어도 하나의 표적화 모이어티를 추가로 포함하는, EV.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 EV를 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
    i. 적어도 하나의 PoI, 내인성으로 활성화될 수 있는 폴리펩타이드-기반 방출 시스템, 및 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드를 포함하는 적어도 하나의 폴리펩타이드 작제물을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 작제물을 EV-생산 세포로 도입하는 단계;
    ii. 상기 EV-생산 세포에서, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 작제물에 의해 암호화된 적어도 하나의 폴리펩타이드 작제물을 발현하는 단계; 및
    iii. 상기 EV-생산 세포로부터 PoI를 포함하는 EV를 수거하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  9. i. 항체, 세포내 항체 (intrabody), 단일쇄 가변 단편, 애피바디(affibody), 효소, 종양 억제제, 바이러스 또는 세균 저해제, 세포 구성 단백질, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, DNA 및 RNA 결합 단백질, DNA 복구 저해제, 뉴클레아제, 프로테이나제, 인테그라제, 전사 인자, 성장 인자, 아폽토시스 저해제 및 유도제, 독소, 구조적 단백질, 신경영양성 인자, 막 수송체, 뉴클레오타이드 결합 단백질, 열 쇼크 단백질, CRISPR-관련 단백질 및 이들의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 치료적 폴리펩타이드인, 적어도 하나의 PoI;
    ii. 인테인 방출 시스템 또는 NLS-NLSBP 방출 시스템으로부터 선택되는, 적어도 하나의 내인성으로 활성화될 수 있는 폴리펩타이드-기반 방출 시스템; 및
    iii. 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드
    를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 작제물.
  10. i. 항체, 세포내 항체 (intrabody), 단일쇄 가변 단편, 애피바디(affibody), 효소, 종양 억제제, 바이러스 또는 세균 저해제, 세포 구성 단백질, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, DNA 및 RNA 결합 단백질, DNA 복구 저해제, 뉴클레아제, 프로테이나제, 인테그라제, 전사 인자, 성장 인자, 아폽토시스 저해제 및 유도제, 독소, 구조적 단백질, 신경영양성 인자, 막 수송체, 뉴클레오타이드 결합 단백질, 열 쇼크 단백질, CRISPR-관련 단백질 및 이들의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 치료적 폴리펩타이드인, 적어도 하나의 PoI;
    ii. 인테인 방출 시스템 또는 NLS-NLSBP 방출 시스템으로부터 선택되는, 적어도 하나의 내인성으로 활성화될 수 있는 폴리펩타이드-기반 방출 시스템; 및
    iii. 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드
    를 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
  11. (i) 제9항에 따른 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 작제물;
    (ii) 제10항에 따른 적어도 하나의 폴리펩타이드 작제물; 및
    (iii) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 EV
    중 하나 이상을 포함하는 세포.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 EV를 표적 세포와 접촉시킴을 포함하는, 적어도 하나의 PoI의 세포내 전달을 위한 시험관내(in vitro) 방법.
  13. 의약에 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 EV 또는 EV 집단.
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