CN109234237B - 一种装载ABCA1 mRNA的外泌体及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种装载ABCA1 mRNA的外泌体构建方法，属于基因药物技术领域，构建ABCA1融合表达载体和CD9融合表达载体，ABCA1融合表达载体中为ABCA1的CDS序列和串联的RNA结合蛋白识别序列，CD9融合表达载体为CD9的CDS序列和对应的RNA结合蛋白编码基因，将ABCA1融合表达载体与CD9融合表达载体共转染肝细胞，培养后收集外泌体，即得装载ABCA1 mRNA的外泌体。所述构建方法可提高ABCA1 mRNA加载外泌体中的效率，克服分子量大的ABCA1 mRNA分子无法有效装载到外泌体的问题，获得大量含有ABCA1 mRNA的外泌体。

Description

一种装载ABCA1 mRNA的外泌体及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因药物技术领域，尤其涉及一种装载ABCA1 mRNA的外泌体及其构建方法和应用。
背景技术
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因。脂质代谢障碍为动脉粥样硬化的病变基础，其特点是受累动脉病变从内膜开始，一般先有脂质和复合糖类积聚、出血及血栓形成，进而纤维组织增生及钙质沉着，并有动脉中层的逐渐蜕变和钙化，导致动脉壁增厚变硬、血管腔狭窄。病变常累及大中肌性动脉，一旦发展到足以阻塞动脉腔，则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死。由于在动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样，因此称为动脉粥样硬化。
传统动脉粥样硬化的防治主要是通过他汀类药物，降低胆固醇的合成。然而这一传统方法并没有真正针对LDL-c升高和HDL-c降低的原因，而只是简单直接的降低胆固醇的合成。
三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)以ATP为能源，促进细胞内游离胆固醇和磷脂流出，并结合到细胞表面贫脂的载脂蛋白AⅠ(apoA-Ⅰ)，这一过程对于减少血管壁脂质蓄积、泡沫细胞形成和血管壁验证反应均有重要意义。ABCA1是肝脏控制HDL(高密度脂蛋白胆固醇)表达的重要分子，是初始HDL形成的关键分子。流行病学研究发现部分患者存在ABCA1的多态性。增加ABCA1的表达，可以改善HDL水平，对ABCA1表达障碍及HDL相对不足的患者具有潜在的作用。然而，如何增加肝脏表达ABCA1成为关键问题。
外泌体能够高效递送其包裹的蛋白或核酸进入肝脏。如何将治疗具体疾病的基因加载入外泌体是一个重要的科学问题，特别是ABCA1分子量大，不容易装载。
发明内容
本发明为了解决现有技术中分子量大ABCA1无法装载到外泌体的问题，提供了一种装载ABCA1 mRNA的外泌体构建方法，成功将ABCA1的mRNA包装入外泌体中，所得装载ABCA1 mRNA的外泌体能够有效增加肝脏ABCA1蛋白的表达，从源头上促进HDL合成，可用于制备预防或治疗粥样动脉硬化的药物中。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种装载ABCA1 mRNA的外泌体构建方法，包括以下步骤：
(1)构建ABCA1融合表达载体，所述ABCA1融合表达载体包括ABCA1的CDS序列与串联的RNA结合蛋白识别序列；
(2)构建CD9融合表达载体，所述CD9融合表达载体包括膜蛋白CD9的CDS序列和RNA结合蛋白编码基因；
(3)将ABCA1融合表达载体与CD9融合表达载体共转染至肝细胞，培养转染后肝细胞，收集外泌体，即得装载ABCA1 mRNA的外泌体；
所述串联的RNA结合蛋白识别序列选自RNA结合蛋白反应元件AREs或RNA结合蛋白反应元件QREs：
当所述串联的RNA结合蛋白识别序列为RNA结合蛋白反应元件AREs时，所述RNA结合蛋白编码基因为RNA结合蛋白HuR编码基因；
当所述串联的RNA结合蛋白识别序列为RNA结合蛋白反应元件AREs时，所述RNA结合蛋白编码基因为RNA结合蛋白QKI编码基因；
当所述串联的RNA结合蛋白识别序列为RNA结合蛋白反应元件QREs时：
ABCA1融合表达载体包括ABCA1-QREs融合基因，所述ABCA1-QREs融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
CD9融合表达载体包括CD9-QKI融合基因，所述CD9-QKI融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。
优选的，所述RNA结合蛋白反应元件AREs的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述RNA结合蛋白反应元件QREs的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。
优选的，当所述串联的RNA结合蛋白识别序列为RNA结合蛋白反应元件AREs时：
ABCA1融合表达载体包括ABCA1-AREs融合基因，所述ABCA1-AREs融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
CD9融合表达载体包括CD9-HuR融合基因，所述CD9-HuR融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
优选的，所述ABCA1融合表达载体和/或CD9融合表达载体以真核表达载体为骨架，所述真核表达载体独立地选自pcDNA3.1(-)、pcDNA3.1(+)、pWPI或pEGFP-N。
优选的，所述步骤(3)中，肝细胞选自原代培养的肝细胞或永生化的肝细胞。
优选的，所述步骤(3)中，转染时ABCA1-AREs表达载体和CD9-HuR表达载体的数量比为0.5～1.5:0.5～1.5。
优选的，所述步骤(3)中，所述转染后肝细胞培养48～72h时，收集外泌体。
优选的，所述步骤(3)中，收集外泌体的方法包括PEG沉淀法、差速离心法或密度分离法。
本发明提供了上述技术方案所述方法构建的装载ABCA1 mRNA的外泌体，所述外泌体中蛋白浓度不低于2μg/μL。
本发明还提供了前述技术方案所述方法构建的装载ABCA1 mRNA的外泌体或上述技术方案所述装载ABCA1 mRNA的外泌体在制备预防或治疗粥样动脉硬化的药物中的应用。
本发明取得的有益效果：
本发明提供了一种装载ABCA1 mRNA的外泌体构建方法，分别构建包括ABCA1的CDS序列与串联的RNA结合蛋白识别序列的ABCA1融合表达载体、构建包括膜蛋白CD9的CDS序列和RNA结合蛋白编码基因的CD9融合表达载体，将ABCA1融合表达载体与CD9融合表达载体共转染至肝细胞，培养转染后肝细胞，收集外泌体，即得装载ABCA1 mRNA的外泌体；所述串联的RNA结合蛋白识别序列选自AREs或QREs，当所述串联的RNA结合蛋白识别序列为HuR反应元件AREs时，所述RNA结合蛋白编码基因为RNA结合蛋白HuR编码基因；当所述串联的RNA结合蛋白识别序列为QKI反应元件QREs时，所述RNA结合蛋白编码基因为QKI编码基因。
本发明所述ABCA1融合表达载体中携带有ABCA1-AREs或ABCA1-QREs融合序列，区别于天然的ABCA1 mRNA，在共转染后的肝细胞中编码产生ABCA1-AREs mRNA序列或ABCA1-QREs mRNA序列，其中携带有多个串联的ARE或QRE序列。以构建含有ABCA1-AREs的ABCA1融合表达载体为例，当串联的RNA结合蛋白识别序列为AREs时，RNA结合蛋白编码基因相应的选择为HuR编码基因。CD9-HuR表达载体在转染后肝细胞中表达产生CD9-HuR融合蛋白，CD9-HuR融合蛋白能够高效进入外泌体，融合蛋白中的HuR与ABCA1-AREs mRNA序列中的RNA结合蛋白反应元件AREs发生强有力的结合，形成CD9-HuR融合蛋白与ABCA1-AREs mRNA序列的复合体，利用CD9-HuR融合蛋白能够高效进入外泌体的能力辅助ABCA1加载进入外泌体，克服了ABCA1 mRNA的分子量较大无法大量加载进入外泌体的问题。
本发明所述构建方法能够提高ABCA1的mRNA加载到外泌体中的效率，克服了分子量大的ABCA1 mRNA分子无法有效装载到外泌体中的问题，能够获得大量装载ABCA1 mRNA的外泌体。
附图说明
图1为不同转染后的ABCA1相对表达量；
图2为实施例3不同处理后的小鼠肝脏细胞ABCA1表达量。
具体实施方式
本发明提供了一种装载ABCA1 mRNA的外泌体构建方法，包括以下步骤：
(1)构建ABCA1融合表达载体，所述ABCA1融合表达载体包括ABCA1的CDS序列与串联的RNA结合蛋白识别序列；
(2)构建CD9融合表达载体，所述CD9融合表达载体包括膜蛋白CD9的CDS序列和RNA结合蛋白编码基因；
(3)将ABCA1融合表达载体与CD9融合表达载体共转染至肝细胞，培养转染后肝细胞，收集外泌体，即得装载ABCA1 mRNA的外泌体；
所述串联的RNA结合蛋白识别序列选自RNA结合蛋白HuR反应元件AREs或RNA结合蛋白QKI反应元件QREs：
当所述串联的RNA结合蛋白识别序列为AREs时，所述RNA结合蛋白编码基因为HuR编码基因；
当所述串联的RNA结合蛋白识别序列为QREs时，所述RNA结合蛋白编码基因为QKI基因。
在本发明中，所述ABCA1的CDS序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，为ABCA1的mRNA序列。
本发明选择RNA结合蛋白识别序列与ABCA1的CDS序列构建为融合基因，是为了协助ABCA1 mRNA高效加载进入外泌体。在本发明中，所述RNA结合蛋白识别序列为多个RNA结合序列串联而成，所述串联数量优选为3～10，更优选为5～6。通过串联RNA结合序列能够增强ABCA1与串联的RNA结合蛋白识别序列形成的融合基因与RNA结合蛋白的结合强度，以提高ABCA1 mRNA加载到外泌体中的效率。
在本发明中，当所述串联的RNA结合蛋白识别序列为AREs时，其串联数量优选为3～8，更优选为6。本发明优选的，所述AREs的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；进一步优选的，所述ABCA1-AREs融合序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
SEQ ID No.2：5’-cgaaatttacccatttacccatttacccatttacccatttacccatttatt-3’。其中划线部分为串联的重复部分。
在本发明中，当所述串联的RNA结合蛋白识别序列为QREs时，其串联数量优选为3～6，更优选为4。本发明优选的，所述RNA结合蛋白QKI反应元件QREs的核苷酸序列如SEQ IDNo.11所示。
SEQ ID No.11：5’-actaataataataaaactaataataataaaactaataataataaaactaata ataat-3’，其中划线部分为串联的重复部分。
在本发明中，所述ABCA1融合表达载体的构建方法优选的包括以下步骤：
A1、合成ABCA1-AREs或ABCA1-QREs基因序列；
A2、以真核表达载体为骨架，以EcoRV酶切所述真核表达载体后，将所述ABCA1-AREs基因序列或ABCA1-QREs基因序列连接到真核表达载体上，得到ABCA1-AREs表达载体或ABCA1-QREs表达载体。
在本发明中，所述ABCA1-AREs表达载体优选的以真核表达载体为骨架，所述真核表达载体优选的包括但不限于pcDNA3.1(-)、pcDNA3.1(+)、pWPI或pEGFP-N。本发明对所述真核表达载体的来源无特殊限定，市售购买即可。
在本发明中，所述RNA结合蛋白编码基因表达的RNA结合蛋白能够与RNA结合蛋白反应元件相结合，利用CD9序列和RNA结合蛋白编码序列所表达的融合蛋白能够大量进入外泌体的作用，与带有RNA结合蛋白反应元件的ABCA1 mRNA融合基因(ABCA1-AREs或ABCA1-QREs)形成复合体，辅助带动ABCA1 mRNA进入外泌体，提高ABCA1 mRNA加载到外泌体的效率。
在本发明中，所述膜蛋白CD9的CDS序列的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示：
atgccggtcaaaggaggcaccaagtgcatcaaatacctgctgttcggatttaacttcatcttctggcttgccgggattgctgtccttgccattggactatggctccgattcgactctcagaccaagagcatcttcgagcaagaaactaataataataattccagcttctacacaggagtctatattctgatcggagccggcgccctcatgatgctggtgggcttcctgggctgctgcggggctgtgcaggagtcccagtgcatgctgggactgttcttcggcttcctcttggtgatattcgccattgaaatagctgcggccatctggggatattcccacaaggatgaggtgattaaggaagtccaggagttttacaaggacacctacaacaagctgaaaaccaaggatgagccccagcgggaaacgctgaaagccatccactatgcgttgaactgctgtggtttggctgggggcgtggaacagtttatctcagacatctgccccaagaaggacgtactcgaaaccttcaccgtgaagtcctgtcctgatgccatcaaagaggtcttcgacaataaattccacatcatcggcgcagtgggcatcggcattgccgtggtcatgatatttggcatgatcttcagtatgatcttgtgctgtgctatccgcaggaaccgcgagatggtc。
在本发明中，当所述串联的RNA结合蛋白识别序列为AREs时，所述RNA结合蛋白编码序列相应的为HuR编码序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述CD9融合表达载体中包括CD9-HuR基因，所述CD9-HuR基因的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.6所示。
在本发明中，当所述串联的RNA结合蛋白识别序列为QKI反应元件QREs时，所述RNA结合蛋白编码序列相应的为QKI编码序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；所述CD9融合表达载体中包括CD9-HuR基因，所述CD9-HuR基因的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.14所示。
在本发明中，所述CD9融合表达载体的构建方法优选的包括以下步骤：
B1、以成纤维细胞cDNA为模板，以RNA结合蛋白编码基因的引物对进行PCR扩增，得到RNA结合蛋白编码基因；
B2、以成纤维细胞cDNA为模板，以膜蛋白CD9的CDS序列的引物对进行PCR扩增，得到膜蛋白CD9的CDS序列；
B3、以真核表达载体为骨架，将膜蛋白CD9的CDS序列和RNA结合蛋白编码基因依次克隆至所述真核表达载体中，得到CD9融合表达载体。
在本发明中，所述成纤维细胞cDNA优选的通过以下方式得到：从肌肉细胞中抽提总RNA，将所得总RNA反转录为成纤维细胞cDNA。
在本发明中，所述RNA结合蛋白HuR编码基因的引物对优选为：
上游引物(SEQ ID No.7)：5’-ggctcgagatgtctaatggttatgaaga-3’，其中含有限制性内切酶Xho1的酶切位点；
下游引物(SEQ ID No.8)：5’-ccgaattcttatttgtgggacttgttggt-3’，其中含有限制性内切酶EcoR1的酶切位点。
在本发明中，所述RNA结合蛋白QKI编码基因的引物对优选为：
上游引物(SEQ ID No.15)：5’-ggctcgagcggctgctggacgaag-3’；
下游引物(SEQ ID No.16)：5’-ccgaattcttagcctttcgttgggaaagcc-3’；
在本发明中，所述膜蛋白CD9的CDS序列的引物对优选为：
上游引物(SEQ ID No.9)：5’-gggctagcaccatgccggtcaaaggaggcacca-3’，其中含有限制性内切酶Nhe1的酶切位点；
下游引物(SEQ ID No.10)：5’-ggctcgaggaccatctcgcggttcctg-3’，其中含有限制性内切酶Xho1的酶切位点。
在本发明中，所述真核表达载体优选的包括但不限于pcDNA3.1(-)、pcDNA3.1(+)、pWPI或pEGFP-N。本发明对所述真核表达载体的来源无特殊限定，市售购买即可。
以所述RNA结合蛋白HuR为例：本发明首先利用限制性内切酶Nhe1和Xho1将膜蛋白CD9的CDS序列连接到真核表达载体上，得到CD9表达载体；再利用限制性内切酶将RNA结合蛋白HuR编码基因连接到CD9表达载体上，得到CD9-HuR表达载体，所述CD9-HuR表达载体中，HuR基因连接在CD9的CDS序列的3’末端。
本发明构建ABCA1融合表达载体和CD9融合表达载体后，将ABCA1融合表达载体与CD9融合表达载体共转染至肝细胞，得到转染后肝细胞；培养所述转染后肝细胞，收集外泌体，即得装载ABCA1 mRNA的外泌体。
在本发明中，所述共转染时ABCA1融合表达载体与CD9融合表达载体的数量比优选为0.5～1.5:0.5～1.5，更优选为1:1。在本发明中，共转染时，优选的将ABCA1融合表达载体、CD9融合表达载体、Lipofectamine 2000和DMEM培养基混合，得到混合溶液；所述混合溶液室温下孵育15～30min后添加至铺有肝细胞的孔板中，转染5～8h，即得转染后肝细胞，其中含有ABCA1融合表达载体与CD9融合表达载体。
在本发明中，所述混合溶液中，ABCA融合表达载体质量、CD9融合表达载体质量、Lipofectamine 2000体积和DMEM培养基体积之比优选为1.5～3μg:1.5～3μg:4～10μL:40～60μL，更优选为2μg:2μg:6μL:50μL。所述Lipofectamine 2000为转染试剂，所述DMEM培养基按照常规方式配制或购买即可。
在本发明中，所述肝细胞优选为原代培养的肝细胞或永生化的肝细胞。本发明选择肝细胞作为外泌体包装细胞是因为目标细胞是肝脏，肝细胞产生的外泌体具有良好的靶向性和相容性，避免潜在的副作用。
在本发明中，培养所述转染后肝细胞时优选的以体积浓度10％血清的DEME培养基替换混合液培养12h，再更换为无血清的DEME培养基培养，在总培养时间48～72h之间收集外泌体，即得装载ABCA1 mRNA的外泌体。在本发明中，所述培养温度优选为36.5～37.5℃，更优选为37℃；所述培养湿度优选为饱和湿度。所述培养过程中，ABCA1融合表达载体在肝细胞中表达ABCA1 mRNA-串联的RNA结合蛋白识别序列的融合基因；CD9融合表达载体在肝细胞中表达CD9-RNA结合蛋白的融合蛋白；所述融合基因中的串联的RNA结合蛋白识别序列与所述融合蛋白中的RNA结合蛋白紧密结合，形成复合体，进而可以借助CD9与外泌体的亲和性使复合体被快速、高效的加载进入外泌体中，有效提高ABCA1 mRNA加载外泌体的效率。
在本发明中，所述收集外泌体的方式优选的包括但不限于PEG沉淀法、差速离心法或密度分离法。
采用本发明提供的方法构建装载ABCA1 mRNA的外泌体，能够使大分子的ABCA1mRNA被有效装载到外泌体，实现利用外泌体递送大量ABCA1的目的。
本发明还提供了一种上述技术方案所述方法构建的装载ABCA1 mRNA的外泌体，所述外泌体中的蛋白浓度不低于2μg/μL。本发明构建的含有ABCA1 mRNA的外泌体静脉注射或腹腔注射给药后，可显著提高小鼠肝脏细胞中ABCA1蛋白的表达，进而实现调节小鼠血液中LDL-c和HDL-c含量的作用，具有潜在的脂代谢调节功能。
本发明还提供了上述技术方案所述方法构建的装载ABCA1 mRNA的外泌体或上述技术方案所述装载ABCA1 mRNA的外泌体在制备预防或治疗粥样动脉硬化的药物中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)在ABCA1的CDS序列(如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列)的3’端后面融合一段特定的RNA结合蛋白HuR的结合序列AREs(如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列)，即ABCA1-AREs基因(如SEQ ID No.3所示核苷酸序列)，按照SEQ ID No.3所示核苷酸序列合成ABCA1-AREs基因。
(2)以pcDNA3.1(-)作为骨架，通过限制性内切酶EcoRV酶切pcDNA3.1(-)载体，将酶切后得到的线性载体与合成的ABCA1-AREs基因混合并连接，筛选，得到pcDNA3.1-ABCA1-AREs表达载体。
(3)Trizol提取小鼠肌肉细胞总RNA；利用Promega M-MLV反转录酶对总RNA进行反转录得小鼠成纤维细胞cDNA：
所述反转录体系为：RNA模板2μg、5×RT buffer4μl、dNTP混合液(10mM)2μl、0.1MDTT 2μl和M-MLV逆转录酶1μl，总体系共20μl。将反转录体系混合后低速离心，置于37℃恒温箱中作用1h，随后80℃失活5min，得到小鼠成纤维细胞cDNA，-20℃保存。
(4)以小鼠成纤维细胞cDNA为模板，以RNA结合蛋白HuR的引物对进行PCR扩增得到RNA结合蛋白HuR的CDS基因(如SEQ ID No.2所示)；
所述RNA结合蛋白HuR编码基因的引物对为：
上游引物(SEQ ID No.7)：5’-ggctcgagatgtctaatggttatgaaga-3’，其中含有限制性内切酶Xho1的酶切位点；
下游引物(SEQ ID No.8)：5’-ccgaattcttatttgtgggacttgttggt-3’，其中含有限制性内切酶EcoR1的酶切位点。
PCR反应体系为：PfuMix10μl、引物(上下游混合10pmol/μl)1μl、cDNA模板1μl和ddH2O 8μl，总体系共20μl。
PCR反应条件为：预变性，95℃3min；循环：95℃15s，56℃15s，72℃2min，共设32个循环。
(5)以小鼠成纤维细胞cDNA为模板，以膜蛋白CD9的CDS序列的引物对进行PCR扩增得到膜蛋白CD9基因(如SEQ ID No.4所示)；
在本发明中，所述膜蛋白CD9的CDS序列的引物对优选为：
上游引物(SEQ ID No.9)：5’-gggctagcaccatgccggtcaaaggaggcacca-3’，其中含有限制性内切酶Nhe1的酶切位点；
下游引物(SEQ ID No.10)：5’-ggctcgaggaccatctcgcggttcctg-3’，其中含有限制性内切酶Xho1的酶切位点。
PCR反应体系为：PfuMix10μl、引物(上下游混合10pmol/μl)1μl、cDNA模板1μl和ddH2O 8μl，总体系共20μl。
PCR反应条件为：预变性，95℃3min；循环：95℃15s，58℃15s，72℃1min，共设30个循环。
(6)以pcDNA3.1为骨架，通过限制性内切酶Nhe1和Xho1将步骤(5)扩增得到的膜蛋白CD9基因连接到pcDNA3.1载体上，得到pcDNA3.1-CD9载体；
以pcDNA3.1-CD9载体为骨架，通过限制性内切酶Xho1和EcoR1将步骤(4)扩增得到的RNA结合蛋白HuR的CDS基因连接到pcDNA3.1-CD9载体上，得到pcDNA3.1-CD9-HuR表达载体。
(7)以5×105个/孔AML12肝细胞接入多孔板中，以无血清DMEM培养基在37度、5％-10％CO2、饱和湿度条件下培养过夜，得到铺设有AML12细胞的多孔板；
按照每孔加入：步骤(2)构建的pcDNA3.1-ABCA1-AREs表达载体2μg、步骤(6)构建的pcDNA3.1-CD9-HuR表达载体2μg、50μL DEME培养基和6μL Lipofectamine 2000转染试剂的比例进行充分混合，得到混合液，室温静置20min，添加至铺设有AML12细胞的多孔板中，37度、5％-10％CO2、饱和湿度条件下转染6h，得到转染后肝细胞AML12，其中含有pcDNA3.1-ABCA1-AREs表达载体和pcDNA3.1-CD9-HuR表达载体。
(8)以体积浓度10％血清的DMEM培养基对混合液进行更换，37度、5％-10％CO2、饱和湿度条件下培养12h后，更换无血清的DMEM培养基继续培养，总培养时间达到48h后开始收集外泌体，至培养72h时为止，所得外泌体经差速离心方法分离提取，得到装载ABCA1mRNA的外泌体溶液。根据外泌体定量的方法，采用外泌体所含蛋白浓度进行定量，我们将得到的外泌体溶于100μLPBS溶液，该外泌体溶液的蛋白浓度为2μg/μL，即外泌体中含有的蛋白量约200μg。
实施例2
本次试验对ABCA1 mRNA加载外泌体效率进行验证：
检测方法：通过Trizol裂解外泌体，参照RNA提取试剂盒的说明书提取RNA，在提取过程中按照说明书建议添加糖原沉淀RNA，随后进行反转录，然后以qPCR检测目标RNA分子的加载效率。
ABCA1 mRNA相对表达量的计算公式为：选取β-actin为内参基因，采用2-ddCt计算ABCA1 mRNA在各外泌体中的相对表达量。
样品：以未转染任何载体的肝细胞表达的外泌体作为对照(Empty vector)；按照实施例1所述步骤(3)～(6)制备得到pcDNA3.1-CD9-HuR表达载体；按照实施例1所述步骤(1)～(2)制备得到pcDNA3.1-ABCA1-AREs表达载体。
按照图1中所示加减号分为6组(加号(+)表示试验中添加了该物质，减号(-)表示试验中未添加该物质)，各组分别按照实施例1步骤(8)进行转染、培养和外泌体提取。所得外泌体按照上述检测方法进行qPCR检测并计算ABCA1的相对表达量。
检测结果如图1所示，可以看出，将pcDNA3.1-ABCA1-AREs表达载体和pcDNA3.1-CD9-HuR表达载体共转染后，ABCA1装载进入外泌体的量有显著提高。表明当外泌体包装细胞同时转染CD9-HuR和ABCA1-AREs时，ABCA1被高效装载进入外泌体。
实施例3
取实施例1制备得到的外泌体100μL通过尾静脉注射入C57小鼠体内，48小时后，处死小鼠进一步收集肝脏组织。同时以PBS作为对照组，与上述操作相同。
采用WB检测ABCA1和对照组在肝脏的表达情况，所用的引物如表1所示，结果如图2所示。
表1WB检测时采用的反应引物
Figure BDA0001819577450000121
Figure BDA0001819577450000131
其中β-actin为内参，PBS表示对照组处理的小鼠肝脏中ABCA1表达量，Exo-ABCA1-AREs表示实施例1制备的外泌体注射小鼠后期肝脏中ABCA1表达量。由图2可以看出，本发明构建的装载ABCA1 mRNA的外泌体显著提高了小鼠肝脏细胞中的ABCA1表达量。
实施例4
按照常规方法构建HFD模型小鼠(高脂饲养小鼠)，将实施例1制备的外泌体100μL/次通过尾静脉注射入HFD模型小鼠，每周一次，连续3周。3周后处死小鼠，眼窝取血，检测小鼠血液中的LDL-c和HDL-c含量。同时以等剂量的PBS作为对照组，按照上述步骤进行注射。检测结果如表2所示。
如表1所示，装载ABCA1 mRNA的外泌体能够显著提高小鼠高密度脂蛋白(HDL-c)水平，降低低密度脂蛋白(LDL-c)水平，提示其对动脉粥样硬化具有防治功能。
表2装载ABCA1 mRNA的外泌体对小鼠脂代谢水平的影响
组别 LDL-c(mg/dl) HDL-c(mg/dl)
HFD+PBS 153.1±19.1 44.3±12.8
HFD+ABCA1-AREs外泌体 121.2±11.3 67.4±16.2
实施例5
(1)在ABCA1的CDS序列(如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列)的3’端后面融合一段特定的RNA结合蛋白QKI的结合序列QREs(如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列)，即ABCA1-QREs基因(如SEQ ID No.12所示核苷酸序列)，按照SEQ ID No.12所示核苷酸序列合成ABCA1-QREs基因。
(2)以pcDNA3.1(-)作为骨架，通过限制性内切酶EcoRV酶切pcDNA3.1(-)载体，将酶切后得到的线性载体与合成的ABCA1-AREs基因混合并连接，筛选，得到pcDNA3.1-ABCA1-QREs表达载体。
(3)Trizol提取小鼠肌肉细胞总RNA；利用Promega M-MLV反转录酶对总RNA进行反转录得小鼠成纤维细胞cDNA：
所述反转录体系为：RNA模板2μg、5×RT buffer4μl、dNTP混合液(10mM)2μl、0.1MDTT 2μl和M-MLV逆转录酶1μl，总体系共20μl。将反转录体系混合后低速离心，置于37℃恒温箱中作用1h，随后80℃失活5min，得到小鼠成纤维细胞cDNA，-20℃保存。
(4)以小鼠成纤维细胞cDNA为模板，以RNA结合蛋白QKI的引物对进行PCR扩增得到RNA结合蛋白QKI的部分CDS基因(如SEQ ID No.13所示)；
所述QKI编码基因的引物对为：
上游引物(SEQ ID No.15)：5’-ggctcgagcggctgctggacgaag-3’，其中含有限制性内切酶Xho1的酶切位点；
下游引物(SEQ ID No.16)：5’-ccgaattcttagcctttcgttgggaaagcc-3’，其中含有限制性内切酶EcoR1的酶切位点。
PCR反应体系为：PfuMix10μl、引物(上下游混合10pmol/μl)1μl、cDNA模板1μl和ddH2O 8μl，总体系共20μl。
PCR反应条件为：预变性，95℃3min；循环：95℃15s，56℃15s，72℃2min，共设32个循环。
(5)以小鼠成纤维细胞cDNA为模板，以膜蛋白CD9的CDS序列的引物对进行PCR扩增得到膜蛋白CD9基因(如SEQ ID No.4所示)；
在本发明中，所述膜蛋白CD9的CDS序列的引物对优选为：
上游引物(SEQ ID No.9)：5’-gggctagcaccatgccggtcaaaggaggcacca-3’，其中含有限制性内切酶Nhe1的酶切位点；
下游引物(SEQ ID No.10)：5’-ggctcgaggaccatctcgcggttcctg-3’，其中含有限制性内切酶Xho1的酶切位点。
PCR反应体系为：PfuMix10μl、引物(上下游混合10pmol/μl)1μl、cDNA模板1μl和ddH2O 8μl，总体系共20μl。
PCR反应条件为：预变性，95℃3min；循环：95℃15s，58℃15s，72℃1min，共设30个循环。
(6)以pcDNA3.1为骨架，通过限制性内切酶Nhe1和Xho1将步骤(5)扩增得到的膜蛋白CD9基因连接到pcDNA3.1载体上，得到pcDNA3.1-CD9载体；
以pcDNA3.1-CD9载体为骨架，通过限制性内切酶Xho1和EcoR1将步骤(4)扩增得到的RNA结合蛋白QKI的部分基因序列连接到pcDNA3.1-CD9载体上，得到pcDNA3.1-CD9-QKI表达载体。
(9)以5×105个/孔AML12肝细胞接入多孔板中，以无血清DMEM培养基在37度、5％-10％CO2、饱和湿度条件下培养过夜，得到铺设有AML12细胞的多孔板；
按照每孔加入：步骤(2)构建的pcDNA3.1-ABCA1-QREs表达载体2μg、步骤(6)构建的pcDNA3.1-CD9-QKI表达载体2μg、50μL DEME培养基和6μL Lipofectamine 2000转染试剂的比例进行充分混合，得到混合液，室温静置20min，添加至铺设有AML12细胞的多孔板中，37度、5％-10％CO2、饱和湿度条件下转染6h，得到转染后肝细胞AML12，其中含有pcDNA3.1-ABCA1-QREs表达载体和pcDNA3.1-CD9-QKI表达载体。
以体积浓度10％血清的DMEM培养基对混合液进行更换，37度、5％-10％CO2、饱和湿度条件下培养12h后，更换无血清的DMEM培养基继续培养，总培养时间达到48h后开始收集外泌体，至培养72h时为止，所得外泌体经差速离心方法分离提取，得到装载ABCA1 mRNA的外泌体溶液。
由以上实施例可知，本发明提供所述构建方法能够显著提高外泌体中装载ABCA1的量，克服了分子量较大ABCA1无法有效装载外泌体的问题，为ABCA1递送人体提供了新的规模化生产途径。
本发明构建的装载ABCA1 mRNA的外泌体注射后能够显著提高肝脏中ABCA1表达量，进而提高HDL-c水平、降低LDL-c水平，即表明本发明构建的装载ABCA1 mRNA的外泌体具有调节脂代谢功能，可用于制备预防或治疗粥样动脉硬化的药物中。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国人民解放军第四军医大学
<120> 一种装载ABCA1 mRNA的外泌体及其构建方法和应用
<130> ZDC18FP00517
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6786
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcttgtt ggcctcagct gaggttgctg ctgtggaaga acctcacttt cagaagaaga 60
caaacatgtc agctgctgct ggaagtggcc tggcctctat ttatcttcct gatcctgatc 120
tctgttcggc tgagctaccc accctatgaa caacatgaat gccattttcc aaataaagcc 180
atgccctctg caggaacact tccttgggtt caggggatta tctgtaatgc caacaacccc 240
tgtttccgtt acccgactcc tggggaggct cccggagttg ttggaaactt taacaaatcc 300
attgtggctc gcctgttctc agatgctcgg aggcttcttt tatacagcca gaaagacacc 360
agcatgaagg acatgcgcaa agttctgaga acattacagc agatcaagaa atccagctca 420
aacttgaagc ttcaagattt cctggtggac aatgaaacct tctctgggtt cctgtatcac 480
aacctctctc tcccaaagtc tactgtggac aagatgctga gggctgatgt cattctccac 540
aaggtatttt tgcaaggcta ccagttacat ttgacaagtc tgtgcaatgg atcaaaatca 600
gaagagatga ttcaacttgg tgaccaagaa gtttctgagc tttgtggcct accaagggag 660
aaactggctg cagcagagcg agtacttcgt tccaacatgg acatcctgaa gccaatcctg 720
agaacactaa actctacatc tcccttcccg agcaaggagc tggctgaagc cacaaaaaca 780
ttgctgcata gtcttgggac tctggcccag gagctgttca gcatgagaag ctggagtgac 840
atgcgacagg aggtgatgtt tctgaccaat gtgaacagct ccagctcctc cacccaaatc 900
taccaggctg tgtctcgtat tgtctgcggg catcccgagg gaggggggct gaagatcaag 960
tctctcaact ggtatgagga caacaactac aaagccctct ttggaggcaa tggcactgag 1020
gaagatgctg aaaccttcta tgacaactct acaactcctt actgcaatga tttgatgaag 1080
aatttggagt ctagtcctct ttcccgcatt atctggaaag ctctgaagcc gctgctcgtt 1140
gggaagatcc tgtatacacc tgacactcca gccacaaggc aggtcatggc tgaggtgaac 1200
aagaccttcc aggaactggc tgtgttccat gatctggaag gcatgtggga ggaactcagc 1260
cccaagatct ggaccttcat ggagaacagc caagaaatgg accttgtccg gatgctgttg 1320
gacagcaggg acaatgacca cttttgggaa cagcagttgg atggcttaga ttggacagcc 1380
caagacatcg tggcgttttt ggccaagcac ccagaggatg tccagtccag taatggttct 1440
gtgtacacct ggagagaagc tttcaacgag actaaccagg caatccggac catatctcgc 1500
ttcatggagt gtgtcaacct gaacaagcta gaacccatag caacagaagt ctggctcatc 1560
aacaagtcca tggagctgct ggatgagagg aagttctggg ctggtattgt gttcactgga 1620
attactccag gcagcattga gctgccccat catgtcaagt acaagatccg aatggacatt 1680
gacaatgtgg agaggacaaa taaaatcaag gatgggtact gggaccctgg tcctcgagct 1740
gacccctttg aggacatgcg gtacgtctgg gggggcttcg cctacttgca ggatgtggtg 1800
gagcaggcaa tcatcagggt gctgacgggc accgagaaga aaactggtgt ctatatgcaa 1860
cagatgccct atccctgtta cgttgatgac atctttctgc gggtgatgag ccggtcaatg 1920
cccctcttca tgacgctggc ctggatttac tcagtggctg tgatcatcaa gggcatcgtg 1980
tatgagaagg aggcacggct gaaagagacc atgcggatca tgggcctgga caacagcatc 2040
ctctggttta gctggttcat tagtagcctc attcctcttc ttgtgagcgc tggcctgcta 2100
gtggtcatcc tgaagttagg aaacctgctg ccctacagtg atcccagcgt ggtgtttgtc 2160
ttcctgtccg tgtttgctgt ggtgacaatc ctgcagtgct tcctgattag cacactcttc 2220
tccagagcca acctggcagc agcctgtggg ggcatcatct acttcacgct gtacctgccc 2280
tacgtcctgt gtgtggcatg gcaggactac gtgggcttca cactcaagat cttcgctagc 2340
ctgctgtctc ctgtggcttt tgggtttggc tgtgagtact ttgccctttt tgaggagcag 2400
ggcattggag tgcagtggga caacctgttt gagagtcctg tggaggaaga tggcttcaat 2460
ctcaccactt cggtctccat gatgctgttt gacaccttcc tctatggggt gatgacctgg 2520
tacattgagg ctgtctttcc aggccagtac ggaattccca ggccctggta ttttccttgc 2580
accaagtcct actggtttgg cgaggaaagt gatgagaaga gccaccctgg ttccaaccag 2640
aagagaatat cagaaatctg catggaggag gaacccaccc acttgaagct gggcgtgtcc 2700
attcagaacc tggtaaaagt ctaccgagat gggatgaagg tggctgtcga tggcctggca 2760
ctgaattttt atgagggcca gatcacctcc ttcctgggcc acaatggagc ggggaagacg 2820
accaccatgt caatcctgac cgggttgttc cccccgacct cgggcaccgc ctacatcctg 2880
ggaaaagaca ttcgctctga gatgagcacc atccggcaga acctgggggt ctgtccccag 2940
cataacgtgc tgtttgacat gctgactgtc gaagaacaca tctggttcta tgcccgcttg 3000
aaagggctct ctgagaagca cgtgaaggcg gagatggagc agatggccct ggatgttggt 3060
ttgccatcaa gcaagctgaa aagcaaaaca agccagctgt caggtggaat gcagagaaag 3120
ctatctgtgg ccttggcctt tgtcggggga tctaaggttg tcattctgga tgaacccaca 3180
gctggtgtgg acccttactc ccgcagggga atatgggagc tgctgctgaa ataccgacaa 3240
ggccgcacca ttattctctc tacacaccac atggatgaag cggacgtcct gggggacagg 3300
attgccatca tctcccatgg gaagctgtgc tgtgtgggct cctccctgtt tctgaagaac 3360
cagctgggaa caggctacta cctgaccttg gtcaagaaag atgtggaatc ctccctcagt 3420
tcctgcagaa acagtagtag cactgtgtca tacctgaaaa aggaggacag tgtttctcag 3480
agcagttctg atgctggcct gggcagcgac catgagagtg acacgctgac catcgatgtc 3540
tctgctatct ccaacctcat caggaagcat gtgtctgaag cccggctggt ggaagacata 3600
gggcatgagc tgacctatgt gctgccatat gaagctgcta aggagggagc ctttgtggaa 3660
ctctttcatg agattgatga ccggctctca gacctgggca tttctagtta tggcatctca 3720
gagacgaccc tggaagaaat attcctcaag gtggccgaag agagtggggt ggatgctgag 3780
acctcagatg gtaccttgcc agcaagacga aacaggcggg ccttcgggga caagcagagc 3840
tgtcttcgcc cgttcactga agatgatgct gctgatccaa atgattctga catagaccca 3900
gaatccagag agacagactt gctcagtggg atggatggca aagggtccta ccaggtgaaa 3960
ggctggaaac ttacacagca acagtttgtg gcccttttgt ggaagagact gctaattgcc 4020
agacggagtc ggaaaggatt ttttgctcag attgtcttgc cagctgtgtt tgtctgcatt 4080
gcccttgtgt tcagcctgat cgtgccaccc tttggcaagt accccagcct ggaacttcag 4140
ccctggatgt acaacgaaca gtacacattt gtcagcaatg atgctcctga ggacacggga 4200
accctggaac tcttaaacgc cctcaccaaa gaccctggct tcgggacccg ctgtatggaa 4260
ggaaacccaa tcccagacac gccctgccag gcaggggagg aagagtggac cactgcccca 4320
gttccccaga ccatcatgga cctcttccag aatgggaact ggacaatgca gaacccttca 4380
cctgcatgcc agtgtagcag cgacaaaatc aagaagatgc tgcctgtgtg tcccccaggg 4440
gcaggggggc tgcctcctcc acaaagaaaa caaaacactg cagatatcct tcaggacctg 4500
acaggaagaa acatttcgga ttatctggtg aagacgtatg tgcagatcat agccaaaagc 4560
ttaaagaaca agatctgggt gaatgagttt aggtatggcg gcttttccct gggtgtcagt 4620
aatactcaag cacttcctcc gagtcaagaa gttaatgatg ccatcaaaca aatgaagaaa 4680
cacctaaagc tggccaagga cagttctgca gatcgatttc tcaacagctt gggaagattt 4740
atgacaggac tggacaccaa aaataatgtc aaggtgtggt tcaataacaa gggctggcat 4800
gcaatcagct ctttcctgaa tgtcatcaac aatgccattc tccgggccaa cctgcaaaag 4860
ggagagaacc ctagccatta tggaattact gctttcaatc atcccctgaa tctcaccaag 4920
cagcagctct cagaggtggc tctgatgacc acatcagtgg atgtccttgt gtccatctgt 4980
gtcatctttg caatgtcctt cgtcccagcc agctttgtcg tattcctgat ccaggagcgg 5040
gtcagcaaag caaaacacct gcagttcatc agtggagtga agcctgtcat ctactggctc 5100
tctaattttg tctgggatat gtgcaattac gttgtccctg ccacactggt cattatcatc 5160
ttcatctgct tccagcagaa gtcctatgtg tcctccacca atctgcctgt gctagccctt 5220
ctacttttgc tgtatgggtg gtcaatcaca cctctcatgt acccagcctc ctttgtgttc 5280
aagatcccca gcacagccta tgtggtgctc accagcgtga acctcttcat tggcattaat 5340
ggcagcgtgg ccacctttgt gctggagctg ttcaccgaca ataagctgaa taatatcaat 5400
gatatcctga agtccgtgtt cttgatcttc ccacattttt gcctgggacg agggctcatc 5460
gacatggtga aaaaccaggc aatggctgat gccctggaaa ggtttgggga gaatcgcttt 5520
gtgtcaccat tatcttggga cttggtggga cgaaacctct tcgccatggc cgtggaaggg 5580
gtggtgttct tcctcattac tgttctgatc cagtacagat tcttcatcag gcccagacct 5640
gtaaatgcaa agctatctcc tctgaatgat gaagatgaag atgtgaggcg ggaaagacag 5700
agaattcttg atggtggagg ccagaatgac atcttagaaa tcaaggagtt gacgaagata 5760
tatagaagga agcggaagcc tgctgttgac aggatttgcg tgggcattcc tcctggtgag 5820
tgctttgggc tcctgggagt taatggggct ggaaaatcat caactttcaa gatgttaaca 5880
ggagatacca ctgttaccag aggagatgct ttccttaaca aaaatagtat cttatcaaac 5940
atccatgaag tacatcagaa catgggctac tgccctcagt ttgatgccat cacagagctg 6000
ttgactggga gagaacacgt ggagttcttt gcccttttga gaggagtccc agagaaagaa 6060
gttggcaagg ttggtgagtg ggcgattcgg aaactgggcc tcgtgaagta tggagaaaaa 6120
tatgctggta actatagtgg aggcaacaaa cgcaagctct ctacagccat ggctttgatc 6180
ggcgggcctc ctgtggtgtt tctggatgaa cccaccacag gcatggatcc caaagcccgg 6240
cggttcttgt ggaattgtgc cctaagtgtt gtcaaggagg ggagatcagt agtgcttaca 6300
tctcatagta tggaagaatg tgaagctctt tgcactagga tggcaatcat ggtcaatgga 6360
aggttcaggt gccttggcag tgtccagcat ctaaaaaata ggtttggaga tggttataca 6420
atagttgtac gaatagcagg gtccaacccg gacctgaagc ctgtccagga tttctttgga 6480
cttgcatttc ctggaagtgt tctaaaagag aaacaccgga acatgctaca ataccagctt 6540
ccatcttcat tatcttctct ggccaggata ttcagcatcc tctcccagag caaaaagcga 6600
ctccacatag aagactactc tgtttctcag acaacacttg accaagtatt tgtgaacttt 6660
gccaaggacc aaagtgatga tgaccactta aaagacctct cattacacaa aaaccagaca 6720
gtagtggacg ttgcagttct cacatctttt ctacaggatg agaaagtgaa agaaagctat 6780
gtatga 6786
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgaaatttac ccatttaccc atttacccat ttacccattt acccatttat t 51
<210> 3
<211> 6837
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggcttgtt ggcctcagct gaggttgctg ctgtggaaga acctcacttt cagaagaaga 60
caaacatgtc agctgctgct ggaagtggcc tggcctctat ttatcttcct gatcctgatc 120
tctgttcggc tgagctaccc accctatgaa caacatgaat gccattttcc aaataaagcc 180
atgccctctg caggaacact tccttgggtt caggggatta tctgtaatgc caacaacccc 240
tgtttccgtt acccgactcc tggggaggct cccggagttg ttggaaactt taacaaatcc 300
attgtggctc gcctgttctc agatgctcgg aggcttcttt tatacagcca gaaagacacc 360
agcatgaagg acatgcgcaa agttctgaga acattacagc agatcaagaa atccagctca 420
aacttgaagc ttcaagattt cctggtggac aatgaaacct tctctgggtt cctgtatcac 480
aacctctctc tcccaaagtc tactgtggac aagatgctga gggctgatgt cattctccac 540
aaggtatttt tgcaaggcta ccagttacat ttgacaagtc tgtgcaatgg atcaaaatca 600
gaagagatga ttcaacttgg tgaccaagaa gtttctgagc tttgtggcct accaagggag 660
aaactggctg cagcagagcg agtacttcgt tccaacatgg acatcctgaa gccaatcctg 720
agaacactaa actctacatc tcccttcccg agcaaggagc tggctgaagc cacaaaaaca 780
ttgctgcata gtcttgggac tctggcccag gagctgttca gcatgagaag ctggagtgac 840
atgcgacagg aggtgatgtt tctgaccaat gtgaacagct ccagctcctc cacccaaatc 900
taccaggctg tgtctcgtat tgtctgcggg catcccgagg gaggggggct gaagatcaag 960
tctctcaact ggtatgagga caacaactac aaagccctct ttggaggcaa tggcactgag 1020
gaagatgctg aaaccttcta tgacaactct acaactcctt actgcaatga tttgatgaag 1080
aatttggagt ctagtcctct ttcccgcatt atctggaaag ctctgaagcc gctgctcgtt 1140
gggaagatcc tgtatacacc tgacactcca gccacaaggc aggtcatggc tgaggtgaac 1200
aagaccttcc aggaactggc tgtgttccat gatctggaag gcatgtggga ggaactcagc 1260
cccaagatct ggaccttcat ggagaacagc caagaaatgg accttgtccg gatgctgttg 1320
gacagcaggg acaatgacca cttttgggaa cagcagttgg atggcttaga ttggacagcc 1380
caagacatcg tggcgttttt ggccaagcac ccagaggatg tccagtccag taatggttct 1440
gtgtacacct ggagagaagc tttcaacgag actaaccagg caatccggac catatctcgc 1500
ttcatggagt gtgtcaacct gaacaagcta gaacccatag caacagaagt ctggctcatc 1560
aacaagtcca tggagctgct ggatgagagg aagttctggg ctggtattgt gttcactgga 1620
attactccag gcagcattga gctgccccat catgtcaagt acaagatccg aatggacatt 1680
gacaatgtgg agaggacaaa taaaatcaag gatgggtact gggaccctgg tcctcgagct 1740
gacccctttg aggacatgcg gtacgtctgg gggggcttcg cctacttgca ggatgtggtg 1800
gagcaggcaa tcatcagggt gctgacgggc accgagaaga aaactggtgt ctatatgcaa 1860
cagatgccct atccctgtta cgttgatgac atctttctgc gggtgatgag ccggtcaatg 1920
cccctcttca tgacgctggc ctggatttac tcagtggctg tgatcatcaa gggcatcgtg 1980
tatgagaagg aggcacggct gaaagagacc atgcggatca tgggcctgga caacagcatc 2040
ctctggttta gctggttcat tagtagcctc attcctcttc ttgtgagcgc tggcctgcta 2100
gtggtcatcc tgaagttagg aaacctgctg ccctacagtg atcccagcgt ggtgtttgtc 2160
ttcctgtccg tgtttgctgt ggtgacaatc ctgcagtgct tcctgattag cacactcttc 2220
tccagagcca acctggcagc agcctgtggg ggcatcatct acttcacgct gtacctgccc 2280
tacgtcctgt gtgtggcatg gcaggactac gtgggcttca cactcaagat cttcgctagc 2340
ctgctgtctc ctgtggcttt tgggtttggc tgtgagtact ttgccctttt tgaggagcag 2400
ggcattggag tgcagtggga caacctgttt gagagtcctg tggaggaaga tggcttcaat 2460
ctcaccactt cggtctccat gatgctgttt gacaccttcc tctatggggt gatgacctgg 2520
tacattgagg ctgtctttcc aggccagtac ggaattccca ggccctggta ttttccttgc 2580
accaagtcct actggtttgg cgaggaaagt gatgagaaga gccaccctgg ttccaaccag 2640
aagagaatat cagaaatctg catggaggag gaacccaccc acttgaagct gggcgtgtcc 2700
attcagaacc tggtaaaagt ctaccgagat gggatgaagg tggctgtcga tggcctggca 2760
ctgaattttt atgagggcca gatcacctcc ttcctgggcc acaatggagc ggggaagacg 2820
accaccatgt caatcctgac cgggttgttc cccccgacct cgggcaccgc ctacatcctg 2880
ggaaaagaca ttcgctctga gatgagcacc atccggcaga acctgggggt ctgtccccag 2940
cataacgtgc tgtttgacat gctgactgtc gaagaacaca tctggttcta tgcccgcttg 3000
aaagggctct ctgagaagca cgtgaaggcg gagatggagc agatggccct ggatgttggt 3060
ttgccatcaa gcaagctgaa aagcaaaaca agccagctgt caggtggaat gcagagaaag 3120
ctatctgtgg ccttggcctt tgtcggggga tctaaggttg tcattctgga tgaacccaca 3180
gctggtgtgg acccttactc ccgcagggga atatgggagc tgctgctgaa ataccgacaa 3240
ggccgcacca ttattctctc tacacaccac atggatgaag cggacgtcct gggggacagg 3300
attgccatca tctcccatgg gaagctgtgc tgtgtgggct cctccctgtt tctgaagaac 3360
cagctgggaa caggctacta cctgaccttg gtcaagaaag atgtggaatc ctccctcagt 3420
tcctgcagaa acagtagtag cactgtgtca tacctgaaaa aggaggacag tgtttctcag 3480
agcagttctg atgctggcct gggcagcgac catgagagtg acacgctgac catcgatgtc 3540
tctgctatct ccaacctcat caggaagcat gtgtctgaag cccggctggt ggaagacata 3600
gggcatgagc tgacctatgt gctgccatat gaagctgcta aggagggagc ctttgtggaa 3660
ctctttcatg agattgatga ccggctctca gacctgggca tttctagtta tggcatctca 3720
gagacgaccc tggaagaaat attcctcaag gtggccgaag agagtggggt ggatgctgag 3780
acctcagatg gtaccttgcc agcaagacga aacaggcggg ccttcgggga caagcagagc 3840
tgtcttcgcc cgttcactga agatgatgct gctgatccaa atgattctga catagaccca 3900
gaatccagag agacagactt gctcagtggg atggatggca aagggtccta ccaggtgaaa 3960
ggctggaaac ttacacagca acagtttgtg gcccttttgt ggaagagact gctaattgcc 4020
agacggagtc ggaaaggatt ttttgctcag attgtcttgc cagctgtgtt tgtctgcatt 4080
gcccttgtgt tcagcctgat cgtgccaccc tttggcaagt accccagcct ggaacttcag 4140
ccctggatgt acaacgaaca gtacacattt gtcagcaatg atgctcctga ggacacggga 4200
accctggaac tcttaaacgc cctcaccaaa gaccctggct tcgggacccg ctgtatggaa 4260
ggaaacccaa tcccagacac gccctgccag gcaggggagg aagagtggac cactgcccca 4320
gttccccaga ccatcatgga cctcttccag aatgggaact ggacaatgca gaacccttca 4380
cctgcatgcc agtgtagcag cgacaaaatc aagaagatgc tgcctgtgtg tcccccaggg 4440
gcaggggggc tgcctcctcc acaaagaaaa caaaacactg cagatatcct tcaggacctg 4500
acaggaagaa acatttcgga ttatctggtg aagacgtatg tgcagatcat agccaaaagc 4560
ttaaagaaca agatctgggt gaatgagttt aggtatggcg gcttttccct gggtgtcagt 4620
aatactcaag cacttcctcc gagtcaagaa gttaatgatg ccatcaaaca aatgaagaaa 4680
cacctaaagc tggccaagga cagttctgca gatcgatttc tcaacagctt gggaagattt 4740
atgacaggac tggacaccaa aaataatgtc aaggtgtggt tcaataacaa gggctggcat 4800
gcaatcagct ctttcctgaa tgtcatcaac aatgccattc tccgggccaa cctgcaaaag 4860
ggagagaacc ctagccatta tggaattact gctttcaatc atcccctgaa tctcaccaag 4920
cagcagctct cagaggtggc tctgatgacc acatcagtgg atgtccttgt gtccatctgt 4980
gtcatctttg caatgtcctt cgtcccagcc agctttgtcg tattcctgat ccaggagcgg 5040
gtcagcaaag caaaacacct gcagttcatc agtggagtga agcctgtcat ctactggctc 5100
tctaattttg tctgggatat gtgcaattac gttgtccctg ccacactggt cattatcatc 5160
ttcatctgct tccagcagaa gtcctatgtg tcctccacca atctgcctgt gctagccctt 5220
ctacttttgc tgtatgggtg gtcaatcaca cctctcatgt acccagcctc ctttgtgttc 5280
aagatcccca gcacagccta tgtggtgctc accagcgtga acctcttcat tggcattaat 5340
ggcagcgtgg ccacctttgt gctggagctg ttcaccgaca ataagctgaa taatatcaat 5400
gatatcctga agtccgtgtt cttgatcttc ccacattttt gcctgggacg agggctcatc 5460
gacatggtga aaaaccaggc aatggctgat gccctggaaa ggtttgggga gaatcgcttt 5520
gtgtcaccat tatcttggga cttggtggga cgaaacctct tcgccatggc cgtggaaggg 5580
gtggtgttct tcctcattac tgttctgatc cagtacagat tcttcatcag gcccagacct 5640
gtaaatgcaa agctatctcc tctgaatgat gaagatgaag atgtgaggcg ggaaagacag 5700
agaattcttg atggtggagg ccagaatgac atcttagaaa tcaaggagtt gacgaagata 5760
tatagaagga agcggaagcc tgctgttgac aggatttgcg tgggcattcc tcctggtgag 5820
tgctttgggc tcctgggagt taatggggct ggaaaatcat caactttcaa gatgttaaca 5880
ggagatacca ctgttaccag aggagatgct ttccttaaca aaaatagtat cttatcaaac 5940
atccatgaag tacatcagaa catgggctac tgccctcagt ttgatgccat cacagagctg 6000
ttgactggga gagaacacgt ggagttcttt gcccttttga gaggagtccc agagaaagaa 6060
gttggcaagg ttggtgagtg ggcgattcgg aaactgggcc tcgtgaagta tggagaaaaa 6120
tatgctggta actatagtgg aggcaacaaa cgcaagctct ctacagccat ggctttgatc 6180
ggcgggcctc ctgtggtgtt tctggatgaa cccaccacag gcatggatcc caaagcccgg 6240
cggttcttgt ggaattgtgc cctaagtgtt gtcaaggagg ggagatcagt agtgcttaca 6300
tctcatagta tggaagaatg tgaagctctt tgcactagga tggcaatcat ggtcaatgga 6360
aggttcaggt gccttggcag tgtccagcat ctaaaaaata ggtttggaga tggttataca 6420
atagttgtac gaatagcagg gtccaacccg gacctgaagc ctgtccagga tttctttgga 6480
cttgcatttc ctggaagtgt tctaaaagag aaacaccgga acatgctaca ataccagctt 6540
ccatcttcat tatcttctct ggccaggata ttcagcatcc tctcccagag caaaaagcga 6600
ctccacatag aagactactc tgtttctcag acaacacttg accaagtatt tgtgaacttt 6660
gccaaggacc aaagtgatga tgaccactta aaagacctct cattacacaa aaaccagaca 6720
gtagtggacg ttgcagttct cacatctttt ctacaggatg agaaagtgaa agaaagctat 6780
gtatgacgaa atttacccat ttacccattt acccatttac ccatttaccc atttatt 6837
<210> 4
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgccggtca aaggaggcac caagtgcatc aaatacctgc tgttcggatt taacttcatc 60
ttctggcttg ccgggattgc tgtccttgcc attggactat ggctccgatt cgactctcag 120
accaagagca tcttcgagca agaaactaat aataataatt ccagcttcta cacaggagtc 180
tatattctga tcggagccgg cgccctcatg atgctggtgg gcttcctggg ctgctgcggg 240
gctgtgcagg agtcccagtg catgctggga ctgttcttcg gcttcctctt ggtgatattc 300
gccattgaaa tagctgcggc catctgggga tattcccaca aggatgaggt gattaaggaa 360
gtccaggagt tttacaagga cacctacaac aagctgaaaa ccaaggatga gccccagcgg 420
gaaacgctga aagccatcca ctatgcgttg aactgctgtg gtttggctgg gggcgtggaa 480
cagtttatct cagacatctg ccccaagaag gacgtactcg aaaccttcac cgtgaagtcc 540
tgtcctgatg ccatcaaaga ggtcttcgac aataaattcc acatcatcgg cgcagtgggc 600
atcggcattg ccgtggtcat gatatttggc atgatcttca gtatgatctt gtgctgtgct 660
atccgcagga accgcgagat ggtc 684
<210> 5
<211> 984
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgtctaatg gttatgaaga ccacatggcg gaagactgca gggatgacat tgggagaacg 60
aatttaattg tcaactacct ccctcagaac atgacccaag aggaactacg aagtctgttc 120
agcagcattg gcgaggttga atctgcaaag cttattcggg ataaagtagc aggacacagc 180
ttgggctacg gttttgtgaa ctatgtgact gcaaaagatg cagagagagc aatcagcaca 240
ctgaacggct tgagactcca gtccaaaacc attaaggtgt catatgctcg cccaagctca 300
gaggtcatca aagatgccaa cttatacatc agtgggctcc caaggaccat gacacagaag 360
gatgtggaag acatgttttc tcggtttggg cgaatcatca actccagggt ccttgtggat 420
cagaccacag gtttgtccag aggggttgcc tttatccggt ttgacaaacg gtcagaagca 480
gaagaggcaa ttaccagttt caatggtcat aaacccccag gttcctccga gcccatcaca 540
gtgaagtttg cagccaatcc caaccagaac aaaaacatgg ctctcctctc gcagctgtac 600
cactcgcctg ctaggcggtt tggaggccct gtacaccacc aggcacagag attcaggttc 660
tcccctatgg gtgtagatca catgagtggg atttctggtg tcaatgtccc cggcaatgct 720
tcctcgggct ggtgcatctt catctacaac cttgggcaag acgccgatga ggggatcctc 780
tggcagatgt ttggcccctt tggtgcagtt accaatgtga aagtgattcg tgatttcaac 840
accaacaagt gcaaagggtt tggttttgtg accatgacaa actatgaaga agctgcaatg 900
gccatagcaa gtctgaacgg ctaccgcctg ggggacaaaa ttttacaggt ttccttcaaa 960
accaacaagt cccacaaata atag 984
<210> 6
<211> 1674
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgccggtca aaggaggcac caagtgcatc aaatacctgc tgttcggatt taacttcatc 60
ttctggcttg ccgggattgc tgtccttgcc attggactat ggctccgatt cgactctcag 120
accaagagca tcttcgagca agaaactaat aataataatt ccagcttcta cacaggagtc 180
tatattctga tcggagccgg cgccctcatg atgctggtgg gcttcctggg ctgctgcggg 240
gctgtgcagg agtcccagtg catgctggga ctgttcttcg gcttcctctt ggtgatattc 300
gccattgaaa tagctgcggc catctgggga tattcccaca aggatgaggt gattaaggaa 360
gtccaggagt tttacaagga cacctacaac aagctgaaaa ccaaggatga gccccagcgg 420
gaaacgctga aagccatcca ctatgcgttg aactgctgtg gtttggctgg gggcgtggaa 480
cagtttatct cagacatctg ccccaagaag gacgtactcg aaaccttcac cgtgaagtcc 540
tgtcctgatg ccatcaaaga ggtcttcgac aataaattcc acatcatcgg cgcagtgggc 600
atcggcattg ccgtggtcat gatatttggc atgatcttca gtatgatctt gtgctgtgct 660
atccgcagga accgcgagat ggtcctcgag atgtctaatg gttatgaaga ccacatggcg 720
gaagactgca gggatgacat tgggagaacg aatttaattg tcaactacct ccctcagaac 780
atgacccaag aggaactacg aagtctgttc agcagcattg gcgaggttga atctgcaaag 840
cttattcggg ataaagtagc aggacacagc ttgggctacg gttttgtgaa ctatgtgact 900
gcaaaagatg cagagagagc aatcagcaca ctgaacggct tgagactcca gtccaaaacc 960
attaaggtgt catatgctcg cccaagctca gaggtcatca aagatgccaa cttatacatc 1020
agtgggctcc caaggaccat gacacagaag gatgtggaag acatgttttc tcggtttggg 1080
cgaatcatca actccagggt ccttgtggat cagaccacag gtttgtccag aggggttgcc 1140
tttatccggt ttgacaaacg gtcagaagca gaagaggcaa ttaccagttt caatggtcat 1200
aaacccccag gttcctccga gcccatcaca gtgaagtttg cagccaatcc caaccagaac 1260
aaaaacatgg ctctcctctc gcagctgtac cactcgcctg ctaggcggtt tggaggccct 1320
gtacaccacc aggcacagag attcaggttc tcccctatgg gtgtagatca catgagtggg 1380
atttctggtg tcaatgtccc cggcaatgct tcctcgggct ggtgcatctt catctacaac 1440
cttgggcaag acgccgatga ggggatcctc tggcagatgt ttggcccctt tggtgcagtt 1500
accaatgtga aagtgattcg tgatttcaac accaacaagt gcaaagggtt tggttttgtg 1560
accatgacaa actatgaaga agctgcaatg gccatagcaa gtctgaacgg ctaccgcctg 1620
ggggacaaaa ttttacaggt ttccttcaaa accaacaagt cccacaaata atag 1674
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggctcgagat gtctaatggt tatgaaga 28
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccgaattctt atttgtggga cttgttggt 29
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gggctagcac catgccggtc aaaggaggca cca 33
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggctcgagga ccatctcgcg gttcctg 27
<210> 11
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
actaataata ataaaactaa taataataaa actaataata ataaaactaa taataat 57
<210> 12
<211> 6843
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggcttgtt ggcctcagct gaggttgctg ctgtggaaga acctcacttt cagaagaaga 60
caaacatgtc agctgctgct ggaagtggcc tggcctctat ttatcttcct gatcctgatc 120
tctgttcggc tgagctaccc accctatgaa caacatgaat gccattttcc aaataaagcc 180
atgccctctg caggaacact tccttgggtt caggggatta tctgtaatgc caacaacccc 240
tgtttccgtt acccgactcc tggggaggct cccggagttg ttggaaactt taacaaatcc 300
attgtggctc gcctgttctc agatgctcgg aggcttcttt tatacagcca gaaagacacc 360
agcatgaagg acatgcgcaa agttctgaga acattacagc agatcaagaa atccagctca 420
aacttgaagc ttcaagattt cctggtggac aatgaaacct tctctgggtt cctgtatcac 480
aacctctctc tcccaaagtc tactgtggac aagatgctga gggctgatgt cattctccac 540
aaggtatttt tgcaaggcta ccagttacat ttgacaagtc tgtgcaatgg atcaaaatca 600
gaagagatga ttcaacttgg tgaccaagaa gtttctgagc tttgtggcct accaagggag 660
aaactggctg cagcagagcg agtacttcgt tccaacatgg acatcctgaa gccaatcctg 720
agaacactaa actctacatc tcccttcccg agcaaggagc tggctgaagc cacaaaaaca 780
ttgctgcata gtcttgggac tctggcccag gagctgttca gcatgagaag ctggagtgac 840
atgcgacagg aggtgatgtt tctgaccaat gtgaacagct ccagctcctc cacccaaatc 900
taccaggctg tgtctcgtat tgtctgcggg catcccgagg gaggggggct gaagatcaag 960
tctctcaact ggtatgagga caacaactac aaagccctct ttggaggcaa tggcactgag 1020
gaagatgctg aaaccttcta tgacaactct acaactcctt actgcaatga tttgatgaag 1080
aatttggagt ctagtcctct ttcccgcatt atctggaaag ctctgaagcc gctgctcgtt 1140
gggaagatcc tgtatacacc tgacactcca gccacaaggc aggtcatggc tgaggtgaac 1200
aagaccttcc aggaactggc tgtgttccat gatctggaag gcatgtggga ggaactcagc 1260
cccaagatct ggaccttcat ggagaacagc caagaaatgg accttgtccg gatgctgttg 1320
gacagcaggg acaatgacca cttttgggaa cagcagttgg atggcttaga ttggacagcc 1380
caagacatcg tggcgttttt ggccaagcac ccagaggatg tccagtccag taatggttct 1440
gtgtacacct ggagagaagc tttcaacgag actaaccagg caatccggac catatctcgc 1500
ttcatggagt gtgtcaacct gaacaagcta gaacccatag caacagaagt ctggctcatc 1560
aacaagtcca tggagctgct ggatgagagg aagttctggg ctggtattgt gttcactgga 1620
attactccag gcagcattga gctgccccat catgtcaagt acaagatccg aatggacatt 1680
gacaatgtgg agaggacaaa taaaatcaag gatgggtact gggaccctgg tcctcgagct 1740
gacccctttg aggacatgcg gtacgtctgg gggggcttcg cctacttgca ggatgtggtg 1800
gagcaggcaa tcatcagggt gctgacgggc accgagaaga aaactggtgt ctatatgcaa 1860
cagatgccct atccctgtta cgttgatgac atctttctgc gggtgatgag ccggtcaatg 1920
cccctcttca tgacgctggc ctggatttac tcagtggctg tgatcatcaa gggcatcgtg 1980
tatgagaagg aggcacggct gaaagagacc atgcggatca tgggcctgga caacagcatc 2040
ctctggttta gctggttcat tagtagcctc attcctcttc ttgtgagcgc tggcctgcta 2100
gtggtcatcc tgaagttagg aaacctgctg ccctacagtg atcccagcgt ggtgtttgtc 2160
ttcctgtccg tgtttgctgt ggtgacaatc ctgcagtgct tcctgattag cacactcttc 2220
tccagagcca acctggcagc agcctgtggg ggcatcatct acttcacgct gtacctgccc 2280
tacgtcctgt gtgtggcatg gcaggactac gtgggcttca cactcaagat cttcgctagc 2340
ctgctgtctc ctgtggcttt tgggtttggc tgtgagtact ttgccctttt tgaggagcag 2400
ggcattggag tgcagtggga caacctgttt gagagtcctg tggaggaaga tggcttcaat 2460
ctcaccactt cggtctccat gatgctgttt gacaccttcc tctatggggt gatgacctgg 2520
tacattgagg ctgtctttcc aggccagtac ggaattccca ggccctggta ttttccttgc 2580
accaagtcct actggtttgg cgaggaaagt gatgagaaga gccaccctgg ttccaaccag 2640
aagagaatat cagaaatctg catggaggag gaacccaccc acttgaagct gggcgtgtcc 2700
attcagaacc tggtaaaagt ctaccgagat gggatgaagg tggctgtcga tggcctggca 2760
ctgaattttt atgagggcca gatcacctcc ttcctgggcc acaatggagc ggggaagacg 2820
accaccatgt caatcctgac cgggttgttc cccccgacct cgggcaccgc ctacatcctg 2880
ggaaaagaca ttcgctctga gatgagcacc atccggcaga acctgggggt ctgtccccag 2940
cataacgtgc tgtttgacat gctgactgtc gaagaacaca tctggttcta tgcccgcttg 3000
aaagggctct ctgagaagca cgtgaaggcg gagatggagc agatggccct ggatgttggt 3060
ttgccatcaa gcaagctgaa aagcaaaaca agccagctgt caggtggaat gcagagaaag 3120
ctatctgtgg ccttggcctt tgtcggggga tctaaggttg tcattctgga tgaacccaca 3180
gctggtgtgg acccttactc ccgcagggga atatgggagc tgctgctgaa ataccgacaa 3240
ggccgcacca ttattctctc tacacaccac atggatgaag cggacgtcct gggggacagg 3300
attgccatca tctcccatgg gaagctgtgc tgtgtgggct cctccctgtt tctgaagaac 3360
cagctgggaa caggctacta cctgaccttg gtcaagaaag atgtggaatc ctccctcagt 3420
tcctgcagaa acagtagtag cactgtgtca tacctgaaaa aggaggacag tgtttctcag 3480
agcagttctg atgctggcct gggcagcgac catgagagtg acacgctgac catcgatgtc 3540
tctgctatct ccaacctcat caggaagcat gtgtctgaag cccggctggt ggaagacata 3600
gggcatgagc tgacctatgt gctgccatat gaagctgcta aggagggagc ctttgtggaa 3660
ctctttcatg agattgatga ccggctctca gacctgggca tttctagtta tggcatctca 3720
gagacgaccc tggaagaaat attcctcaag gtggccgaag agagtggggt ggatgctgag 3780
acctcagatg gtaccttgcc agcaagacga aacaggcggg ccttcgggga caagcagagc 3840
tgtcttcgcc cgttcactga agatgatgct gctgatccaa atgattctga catagaccca 3900
gaatccagag agacagactt gctcagtggg atggatggca aagggtccta ccaggtgaaa 3960
ggctggaaac ttacacagca acagtttgtg gcccttttgt ggaagagact gctaattgcc 4020
agacggagtc ggaaaggatt ttttgctcag attgtcttgc cagctgtgtt tgtctgcatt 4080
gcccttgtgt tcagcctgat cgtgccaccc tttggcaagt accccagcct ggaacttcag 4140
ccctggatgt acaacgaaca gtacacattt gtcagcaatg atgctcctga ggacacggga 4200
accctggaac tcttaaacgc cctcaccaaa gaccctggct tcgggacccg ctgtatggaa 4260
ggaaacccaa tcccagacac gccctgccag gcaggggagg aagagtggac cactgcccca 4320
gttccccaga ccatcatgga cctcttccag aatgggaact ggacaatgca gaacccttca 4380
cctgcatgcc agtgtagcag cgacaaaatc aagaagatgc tgcctgtgtg tcccccaggg 4440
gcaggggggc tgcctcctcc acaaagaaaa caaaacactg cagatatcct tcaggacctg 4500
acaggaagaa acatttcgga ttatctggtg aagacgtatg tgcagatcat agccaaaagc 4560
ttaaagaaca agatctgggt gaatgagttt aggtatggcg gcttttccct gggtgtcagt 4620
aatactcaag cacttcctcc gagtcaagaa gttaatgatg ccatcaaaca aatgaagaaa 4680
cacctaaagc tggccaagga cagttctgca gatcgatttc tcaacagctt gggaagattt 4740
atgacaggac tggacaccaa aaataatgtc aaggtgtggt tcaataacaa gggctggcat 4800
gcaatcagct ctttcctgaa tgtcatcaac aatgccattc tccgggccaa cctgcaaaag 4860
ggagagaacc ctagccatta tggaattact gctttcaatc atcccctgaa tctcaccaag 4920
cagcagctct cagaggtggc tctgatgacc acatcagtgg atgtccttgt gtccatctgt 4980
gtcatctttg caatgtcctt cgtcccagcc agctttgtcg tattcctgat ccaggagcgg 5040
gtcagcaaag caaaacacct gcagttcatc agtggagtga agcctgtcat ctactggctc 5100
tctaattttg tctgggatat gtgcaattac gttgtccctg ccacactggt cattatcatc 5160
ttcatctgct tccagcagaa gtcctatgtg tcctccacca atctgcctgt gctagccctt 5220
ctacttttgc tgtatgggtg gtcaatcaca cctctcatgt acccagcctc ctttgtgttc 5280
aagatcccca gcacagccta tgtggtgctc accagcgtga acctcttcat tggcattaat 5340
ggcagcgtgg ccacctttgt gctggagctg ttcaccgaca ataagctgaa taatatcaat 5400
gatatcctga agtccgtgtt cttgatcttc ccacattttt gcctgggacg agggctcatc 5460
gacatggtga aaaaccaggc aatggctgat gccctggaaa ggtttgggga gaatcgcttt 5520
gtgtcaccat tatcttggga cttggtggga cgaaacctct tcgccatggc cgtggaaggg 5580
gtggtgttct tcctcattac tgttctgatc cagtacagat tcttcatcag gcccagacct 5640
gtaaatgcaa agctatctcc tctgaatgat gaagatgaag atgtgaggcg ggaaagacag 5700
agaattcttg atggtggagg ccagaatgac atcttagaaa tcaaggagtt gacgaagata 5760
tatagaagga agcggaagcc tgctgttgac aggatttgcg tgggcattcc tcctggtgag 5820
tgctttgggc tcctgggagt taatggggct ggaaaatcat caactttcaa gatgttaaca 5880
ggagatacca ctgttaccag aggagatgct ttccttaaca aaaatagtat cttatcaaac 5940
atccatgaag tacatcagaa catgggctac tgccctcagt ttgatgccat cacagagctg 6000
ttgactggga gagaacacgt ggagttcttt gcccttttga gaggagtccc agagaaagaa 6060
gttggcaagg ttggtgagtg ggcgattcgg aaactgggcc tcgtgaagta tggagaaaaa 6120
tatgctggta actatagtgg aggcaacaaa cgcaagctct ctacagccat ggctttgatc 6180
ggcgggcctc ctgtggtgtt tctggatgaa cccaccacag gcatggatcc caaagcccgg 6240
cggttcttgt ggaattgtgc cctaagtgtt gtcaaggagg ggagatcagt agtgcttaca 6300
tctcatagta tggaagaatg tgaagctctt tgcactagga tggcaatcat ggtcaatgga 6360
aggttcaggt gccttggcag tgtccagcat ctaaaaaata ggtttggaga tggttataca 6420
atagttgtac gaatagcagg gtccaacccg gacctgaagc ctgtccagga tttctttgga 6480
cttgcatttc ctggaagtgt tctaaaagag aaacaccgga acatgctaca ataccagctt 6540
ccatcttcat tatcttctct ggccaggata ttcagcatcc tctcccagag caaaaagcga 6600
ctccacatag aagactactc tgtttctcag acaacacttg accaagtatt tgtgaacttt 6660
gccaaggacc aaagtgatga tgaccactta aaagacctct cattacacaa aaaccagaca 6720
gtagtggacg ttgcagttct cacatctttt ctacaggatg agaaagtgaa agaaagctat 6780
gtatgaacta ataataataa aactaataat aataaaacta ataataataa aactaataat 6840
aat 6843
<210> 13
<211> 840
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctcgagcggc tgctggacga agaaattagc agagtacgga aagacatgta caatgacacg 60
ttaaatggca gtacagagaa aagaagtgca gaattgcctg acgcggtggg acccattgtt 120
cagttacaag agaaacttta tgtgcctgta aaagaatacc ctgattttaa ttttgttggg 180
agaatccttg gacctagagg acttacagct aaacaacttg aagcagaaac gggatgtaaa 240
ataatggtcc gaggcaaagg ctcaatgagg gataaaaaga aggaggagca aaatagaggc 300
aagcccaatt gggagcatct aaatgaagac ttacatgtac taatcactgt ggaagatgct 360
cagaacagag cagaaatcaa gctgaagaga gcggttgaag aagtgaagaa gttactggta 420
cctgcggctg aaggtgaaga cagcctgaag aagatgcagc tgatggagct tgcaattctg 480
aatggcacct acagagacgc caacattaaa tcaccagccc ttgccttttc tcttgcagca 540
actgcccagg ctgctccaag gatcatcact gggcctgcgc ctgtcctccc accagctgct 600
ctgcgtacac ctacgccagc tggccctacc ataatgcctt tgatcagaca aatacagacc 660
gctgtcatgc caaacggaac tcctcaccca actgctgcaa tagtccctcc agggcctgaa 720
gctgggttaa tctacacacc ctatgaatac ccctacacat tggcaccagc tacatcaatc 780
cttgagtacc ctattgaacc cagtggtgtg ttaggtatgg ctttcccaac gaaaggctaa 840
<210> 14
<211> 1524
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgccggtca aaggaggcac caagtgcatc aaatacctgc tgttcggatt taacttcatc 60
ttctggcttg ccgggattgc tgtccttgcc attggactat ggctccgatt cgactctcag 120
accaagagca tcttcgagca agaaactaat aataataatt ccagcttcta cacaggagtc 180
tatattctga tcggagccgg cgccctcatg atgctggtgg gcttcctggg ctgctgcggg 240
gctgtgcagg agtcccagtg catgctggga ctgttcttcg gcttcctctt ggtgatattc 300
gccattgaaa tagctgcggc catctgggga tattcccaca aggatgaggt gattaaggaa 360
gtccaggagt tttacaagga cacctacaac aagctgaaaa ccaaggatga gccccagcgg 420
gaaacgctga aagccatcca ctatgcgttg aactgctgtg gtttggctgg gggcgtggaa 480
cagtttatct cagacatctg ccccaagaag gacgtactcg aaaccttcac cgtgaagtcc 540
tgtcctgatg ccatcaaaga ggtcttcgac aataaattcc acatcatcgg cgcagtgggc 600
atcggcattg ccgtggtcat gatatttggc atgatcttca gtatgatctt gtgctgtgct 660
atccgcagga accgcgagat ggtcctcgag cggctgctgg acgaagaaat tagcagagta 720
cggaaagaca tgtacaatga cacgttaaat ggcagtacag agaaaagaag tgcagaattg 780
cctgacgcgg tgggacccat tgttcagtta caagagaaac tttatgtgcc tgtaaaagaa 840
taccctgatt ttaattttgt tgggagaatc cttggaccta gaggacttac agctaaacaa 900
cttgaagcag aaacgggatg taaaataatg gtccgaggca aaggctcaat gagggataaa 960
aagaaggagg agcaaaatag aggcaagccc aattgggagc atctaaatga agacttacat 1020
gtactaatca ctgtggaaga tgctcagaac agagcagaaa tcaagctgaa gagagcggtt 1080
gaagaagtga agaagttact ggtacctgcg gctgaaggtg aagacagcct gaagaagatg 1140
cagctgatgg agcttgcaat tctgaatggc acctacagag acgccaacat taaatcacca 1200
gcccttgcct tttctcttgc agcaactgcc caggctgctc caaggatcat cactgggcct 1260
gcgcctgtcc tcccaccagc tgctctgcgt acacctacgc cagctggccc taccataatg 1320
cctttgatca gacaaataca gaccgctgtc atgccaaacg gaactcctca cccaactgct 1380
gcaatagtcc ctccagggcc tgaagctggg ttaatctaca caccctatga atacccctac 1440
acattggcac cagctacatc aatccttgag taccctattg aacccagtgg tgtgttaggt 1500
atggctttcc caacgaaagg ctaa 1524
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggctcgagcg gctgctggac gaag 24
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccgaattctt agcctttcgt tgggaaagcc 30
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaggcaatgg cactgaggaa g 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cagataatgc gggaaagagg a 21
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctgtccctgt atgcctctg 19
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atgtcacgca cgatttcc 18

Claims (10)

1.一种装载ABCA1mRNA的外泌体构建方法，包括以下步骤：
(1)构建ABCA1融合表达载体，所述ABCA1融合表达载体包括ABCA1的CDS序列与串联的RNA结合蛋白识别序列；
(2)构建CD9融合表达载体，所述CD9融合表达载体包括膜蛋白CD9的CDS序列和RNA结合蛋白编码基因；
(3)将ABCA1融合表达载体与CD9融合表达载体共转染至肝细胞，培养转染后肝细胞，收集外泌体，即得装载ABCA1mRNA的外泌体；
所述串联的RNA结合蛋白识别序列选自RNA结合蛋白反应元件AREs：
当所述串联的RNA结合蛋白识别序列为RNA结合蛋白反应元件AREs时，所述RNA结合蛋白编码基因为RNA结合蛋白HuR编码基因。
2.根据权利要求1所述装载ABCA1mRNA的外泌体构建方法，其特征在于，所述RNA结合蛋白反应元件AREs的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求2所述装载ABCA1mRNA的外泌体构建方法，其特征在于，当所述串联的RNA结合蛋白识别序列为RNA结合蛋白反应元件AREs时：
ABCA1融合表达载体包括ABCA1-AREs融合基因，所述ABCA1-AREs融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
CD9融合表达载体包括CD9-HuR融合基因，所述CD9-HuR融合基因的核苷酸序列如SEQID No.6所示。
4.根据权利要求1所述装载ABCA1mRNA的外泌体构建方法，其特征在于，所述ABCA1融合表达载体和/或CD9融合表达载体以真核表达载体为骨架，所述真核表达载体独立地选自pcDNA3.1(-)、pcDNA3.1(+)、pWPI或pEGFP-N。
5.根据权利要求1所述装载ABCA1mRNA的外泌体构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，肝细胞选自原代培养的肝细胞或永生化的肝细胞。
6.根据权利要求3或5所述装载ABCA1mRNA的外泌体构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，转染时ABCA1-AREs表达载体和CD9-HuR表达载体的数量比为0.5～1.5:0.5～1.5。
7.根据权利要求1或5所述装载ABCA1mRNA的外泌体构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述转染后肝细胞培养48～72h时，收集外泌体。
8.根据权利要求1或5所述装载ABCA1mRNA的外泌体构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，收集外泌体的方法包括PEG沉淀法、差速离心法或密度分离法。
9.权利要求1～8任意一项所述方法构建的装载ABCA1mRNA的外泌体。
10.权利要求1～8任意一项所述方法构建的装载ABCA1mRNA的外泌体或权利要求9所述装载ABCA1mRNA的外泌体在制备预防或治疗粥样动脉硬化的药物中的应用。
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