CN103205435A

CN103205435A - 利用内含肽系统大肠杆菌表达乳铁蛋白改良肽lf-6的方法

Info

Publication number: CN103205435A
Application number: CN2013101264943A
Authority: CN
Inventors: 汪以真; 张海文; 韩菲菲; 栾超
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-04-11
Filing date: 2013-04-11
Publication date: 2013-07-17

Abstract

本发明公开了一种利用内含肽系统大肠杆菌表达乳铁蛋白改良肽LF-6的方法。步骤如下：a、PCR扩增具大肠杆菌密码子偏好性的改良肽LF-6目的基因；b、利用pTWIN1载体和改良肽LF-6目的基因构建改良抗菌肽LF-6的重组表达质粒及相应的克隆菌株；c、鉴定阳性转化子，亚克隆至大肠杆菌表达菌株；d、挑单克隆阳性大肠杆菌表达菌株接种至摇瓶，诱导表达后收集菌液，超声破碎离心获得含融合蛋白的上清；e、对含融合蛋白的上清进行在柱纯化与LF-6的切割释放及进一步通过RP-HPLC分析制备与质谱鉴定；f、对纯化所得抗菌肽LF-6进行抑菌活性验证。本发明利用内含肽融合表达系统在大肠杆菌中成功重组表达猪乳铁蛋白改良肽LF-6，实现了在柱纯化与无酶切割释放，简单易行成本低。

Description

利用内含肽系统大肠杆菌表达乳铁蛋白改良肽LF-6的方法

技术领域

本发明属于生物技术和基因工程技术领域，具体的说是涉及一种通过氨基酸替换手段对天然抗菌肽LFP-20进行分子改良，并利用内含肽系统在大肠杆菌中重组表达改良肽LF-6的研究。

背景技术

目前，由于抗生素在动物饲料，临床疾病等的大量使用，使细菌产生了严重的耐药性问题，直接威胁人类健康。抗菌肽属于一类小分子阳离子多肽，是生物先天免疫的重要成分，由于其独特的膜作用机制，不易导致细菌耐药性产生，且具有抗菌谱广，水溶性好，对真核细胞毒性低等特点，具有替代抗生素的潜力。猪乳铁蛋白肽LFP-20是猪乳铁蛋白经胃蛋白酶水解产生的一种20氨基酸的天然抗菌肽，其细胞毒性低，安全性好，通过氨基酸替换进行分子改良，改良肽LF-6在对真核细胞细胞毒性低的情况下抗菌活性提升数倍，由于上述特点，使得改良肽LF-6在医疗，畜牧，食品等领域的应用具有极大的发展潜力。

抗菌肽的来源主要有天然提取，化学合成与利用基因工程技术进行重组表达，从生物中天然提取产量小，且分离纯化的难度大，成本过高，而化学合成抗菌肽虽然周期短，难度相对较小，获得的抗菌肽成品纯度可以达到95%以上，但是价格昂贵，以上两种方法都不利于抗菌肽的广泛应用，而利用日益发展成熟的基因工程技术进行抗菌肽的重组表达具有不少的优势。

基因工程技术主要利用原核或真核表达系统对蛋白或多肽进行表达，具有操作相对简单，生产周期较短，可高密度发酵生产，成本较为低廉等优点，因此利用基因工程表达抗菌肽具有将其推广应用的巨大潜力。本实验室前期利用毕赤酵母这一较为成熟的表达系统对改良肽LF-6进行重组表达，其优点在于LF-6对真核细胞几乎无毒性，因此可以在毕赤酵母中直接进行表达，但结果表明利用酵母系统能成功表达LF-6,但表达周期长且产量低，因此改用原核表达系统中最为成熟的大肠杆菌表达系统实施，其优点在于生长周期短，产量较高，成本相对便宜，但缺点在于抗菌肽LF-6的持续表达会对大肠杆菌产生毒害作用，因此必须加入融合伴侣中和抗菌肽的毒性。但融合表达涉及到融合蛋白的切割及抗菌肽LF-6的释放与纯化，这一成本占全部成本的60%-70%左右，因此采用一种简单高效的分离纯化方法至关重要。

内含肽（intein）是未成熟的蛋白前体中的一段待剪切序列，在前体蛋白转化为成熟蛋白的过程中，通过自剪切作用从前体蛋白中释放，内含肽由于其独特的蛋白质自剪切功能被普遍应用于蛋白质工程领域。pTWIN1表达载体(NEB USA)大小为7375bp,具有两个经基因工程改造的内含肽intein1和intein2,其中intein1源于集胞藻属sp dna B的基因改造，在其C端融合抗菌肽，可以通过改变缓冲液的温度与pH值实现抗菌肽与intein1的分离，intein2源于蟾蜍型分支杆菌属xenopi gyrA的基因改造，在其N端融合抗菌肽，可以通过加入一定浓度的硫醇试剂如二硫苏糖醇（DTT）4℃过夜封闭反应实现抗菌肽与intein2的分离，这是融合蛋白分离的结构基础。此外，在intein1的N端和intein2的C端分别结合有几丁质结合域（ChitinBinding Domain）,可与几丁质填料发生特异性很强的结合，这是融合蛋白纯化的结构基础。

本实验室通过对天然存在的LFP-20进行分子改良，抗菌活性及细胞毒性筛选获得表现最佳的改良肽LF-6，在此基础上，为了深入研究改良肽LF-6在动物体内的免疫调节作用，需要积累一定量的LF-6进行动物体内实验。由于改良肽LF-6氨基酸序列发生改变，无法从天然动物体内提取，此外，动物实验用量较大，化学合成法成本太高。

发明内容

本发明在于公开了乳铁蛋白改良肽LF-6的氨基酸序列，并采用内含肽介导，以几丁质结构域为结构基础的pTWIN1表达载体，实现改良肽LF-6在大肠杆菌中的重组表达及在柱无酶自切割与纯化，后续通过G-10葡聚糖凝胶层析，RP-HPLC制备LF-6，并进行质谱及体外抑菌活性验证。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种利用内含肽系统大肠杆菌表达乳铁蛋白改良肽LF-6的方法，步骤如下：

a、PCR扩增具大肠杆菌密码子偏好性的改良肽LF-6目的基因；

b、利用pTWIN1载体和改良肽LF-6目的基因构建改良抗菌肽LF-6的重组表达质粒及相应的克隆菌株；

c、鉴定阳性转化子，亚克隆至大肠杆菌表达菌株；

d、挑单克隆阳性大肠杆菌表达菌株接种至摇瓶，诱导表达后收集菌液，超声破碎离心获得含融合蛋白的上清；

e、对含融合蛋白的上清进行在柱纯化与LF-6的切割释放及进一步通过RP-HPLC分析制备与质谱鉴定；

f、对纯化所得抗菌肽LF-6进行抑菌活性验证。

所述的步骤a中改良肽LF-6的氨基酸序列为：KWRQWQSKWRRTNPWFWIRR（SEQ ID NO:1），依据大肠杆菌的密码子偏好性对其对应的密码子进行优化后的基因序列为：

AAGTGGCGTCAGTGGCAGAGCAAATGGCGTCGCACCAACCCGTGGTTTTGGATTCGCCGC（SEQ ID NO:2），在LF-6目的基因前后两端设计与表达载体对应的限制性酶切位点NdeI和SpeI序列,为提高双酶切效率，在NdeI序列前和SpeI序列后分别设计保护碱基GGGAATTC,CC,设计合成了两条引物F1和R1：

F1:5-GGGAATTCCATATGAAGTGGCGTCAGTGGCAGAGCAAATGGCGTCGCA-3（SEQ ID NO:3）；

R1:5-GGACTAGTGCATCTCCCGTGATGCAGCGGCGAATCCAAAACCACGGGTTGGTGCGACGCCATTTGCTCTGC-3（SEQ ID NO:4）；利用重叠区基因扩增拼接法进行PCR扩增LF-6目的基因。

所述的步骤b中，pTWIN1载体与PCR扩增的改良肽LF-6目的基因PCR回收产物分别经NdeI,SpeI双酶切后，在T4DNA连接酶的作用下将目的片段构建至载体pTWIN1相应多克隆位点，得到pTWIN1-LF-6-intein2-CBD的重组质粒，热激转化至E.coli DH5α感受态细胞，获得的阳性转化子经菌落PCR后用于测序分析。

所述的步骤c中，测序正确的大肠杆菌表达菌株进行扩大培养，提取质粒，热激转入感受态E.coli BL21(DE3)pLysS中，在含有1%氨苄（AP）的抗性平板中筛选阳性克隆，挑阳性单克隆接种至含1%AP的LB培养基，活化后制备成甘油菌保种于-80℃备用。

所述的步骤d中所述，配制1%的AP抗性平板，涂板甘油菌BL21(DE3)-pTWIN1-LF-6-intein2-CBD于平板上，将长出的单克隆接种至含1%AP的LB培养基中过夜活化，次日再按1%接种量接种至已提前灭菌的含有200mlLB培养基的1L摇瓶中，共5瓶1L发酵液，37℃，250rpm培养，菌体长至OD600≈0.5时每瓶加入诱导剂IPTG20μl至终浓度为0.1mM，调整温度转速分别为30℃，180rpm诱导3h,4℃，10000g,离心10分钟收集菌液，用Buffer1：20mM Tris-HCL,1M NaCl,1mM EDTA,pH8.0，0.1%吐温20清洗，10000g离心5分钟，重复清洗一次，然后以原培养体积1:50的比例加入Buffer1彻底重悬菌液，冰上超声破碎，14800g离心30分钟，收集上清液过0.45微米滤膜除杂后冻存于-40℃用于下一步纯化使用。

所述的步骤e中，将几丁质填料装于AKTA柱中用于在柱切割纯化，实验仪器为AKTAEXPLORER蛋白纯化仪，连接好管路后，先用15个柱体积的去离子水清洗柱中填料，并调整UV280基线平衡，再用10个柱体积的Buffer2（20mM Tris-HCL,2M NaCl,1mM EDTA,pH8.0，0.1%吐温20）平衡柱子，然后将收集的可溶表达上清以1ml/min的速度自动上柱，待目的蛋白与填料结合充分后，用Buffer2充分洗脱杂蛋白至UV280回复至基线，用5个柱体积含有30mM DTT的Buffer3（20mM Tris-HCL,1M NaCl,1mM EDTA,pH8.5）以5ml/min的流速快速浸润AKTA柱，将柱子两端封口后于4℃反应24h，次日，用Buffer3以1ml/min的流速冲洗柱子并收集流出液，重组表达肽LF-6即在流出液中，上述纯化效果采用Tricine-SDS-PAGE作为鉴定方法。

所述的步骤e中，将流出液进行冷冻干燥浓缩，通过Sephadex G-10葡聚糖凝胶对其中的盐分和DTT进行初步分离，再次冷冻干燥后，用于RP-HPLC分析，并通过制备型RP-HPLC，制备一定样品并进行质谱鉴定。

所述的步骤f中，将E.coli ATCC25922,E.coli K88S.aureus ATCC25923进行活化，划线于MH琼脂平板，于37℃培养18-24h；挑取过夜培养后MH琼脂平板上的单菌落接种于3mL新鲜MH肉汤培养基中，37℃恒温震荡培养18-24h，转速250rpm；取上述过夜培养菌悬液转接至新鲜MH肉汤培养基中，按1:100的比例转接，37℃下250rpm恒温震荡培养2-5h至OD₆₀₀nm=0.5；取OD₆₀₀nm=0.5的菌悬液10μL至10mL新鲜MH肉汤培养基中，涡旋混匀，调整细菌数为5×10⁵-1×10⁶CFU/mL，用于MIC，MBC的测定；向无菌96孔平板中的第一到第八孔各加入90μL制备好的菌悬液，第十一孔加入100μL菌悬液设为阳性对照孔，第十二孔加100μL MH肉汤培养基设为阴性对照孔；从第一孔到第八孔逐一加入10μL相应浓度的肽稀释液，不加抗菌物质，使待测肽的终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1μg/mL；将培养板置于37℃下保湿静置培养18-24h；培养后观察各孔底部是否有细菌沉淀产生，无肉眼可见细菌沉淀的最小浓度可判定为多肽的MIC；MIC就是能完全抑制细菌生长的抗菌物质最低浓度，自没有细菌生长的平板孔中各取10μL内容物涂布于MH琼脂平板上，每孔做三个重复，待完全吸收后，37℃下培养18-24h，根据是否有菌落生长来确定抗菌物质的MBC，MBC就是能阻止残余菌形成菌落的抗菌物质最低浓度；

所述的步骤f中，将E.coli K88菌株划板于MH琼脂平板，于37℃培养18-24h；过夜培养后挑MH琼脂平板上的单菌落接种于3mL新鲜MH肉汤培养基中，37℃恒温震荡培养18-24h，转速250rpm，取上述过夜培养菌悬液30μl转接至3mL新鲜MH肉汤培养基中，按1:100的比例转接，37℃下250rpm恒温震荡培养2h至OD₆₀₀≈0.5；取菌悬液10μl至10mL新鲜MH肉汤培养基中，涡旋混匀，用于杀菌曲线的测定；以合成肽LF-6为阳性对照，取样的时间点分别设定在肽作用的0、5、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180min，同时设置去离子水为空白对照，每个2ml离心管中加入1mL配好菌悬液，同时各管分别加入终浓度为4μg/ml的抗菌肽，置于37℃，250rpm震荡培养；在对应时间点，自各管中分别取10μl菌悬液，加至90μl蒸馏水中稀释,倍比稀释4次，混匀后每个稀释度取3×10μl菌悬液至MH琼脂平板培养基上，待完全吸收后，37℃倒置培养；过夜培养后，取3个重复总菌落数在30-200个的稀释浓度进行菌落计数，用Excel软件作图对比分析重组表达抗菌肽LF-6与合成肽LF-6的动态杀菌效果；

所述的步骤f中，牛津杯法测定重组表达产物的抑菌活性：配制双层固体培养基：第一层固体培养基采用15mL的MH培养基，待其凝固后，接着配第二层半固体培养基，琼脂浓度为第一层一半的MH半固体培养基；取5mL MH半固体培养基，待其温度降至50℃左右后，加入OD600=0.6的活化金黄色葡萄球菌悬液50μL，混匀后平铺到凝固的第一层培养基上；在半固体培养基凝固之前，正置放入牛津杯，使其可以插入第二层培养基中，而第一层固体培养基恰好作为其支撑；半固体培养基凝固后，取200μL浓度为50μg/ml待测样品加入到牛津杯中，37℃培养过夜后，观察抑菌圈大小，判断样品的抑菌活性。

本发明的有益效果：

利用内含肽系统在大肠杆菌中成功表达获得乳铁蛋白改良肽LF-6,通过intein2与几丁质结合域（CBD）的结构特点，表达的融合蛋白特异性结合在几丁质填料上，通过Buffer2洗去其余杂蛋白，加入一定浓度的硫醇试剂如二硫苏糖醇（DTT）4℃过夜封闭反应实现改良肽LF-6的切割释放，而融合伴侣仍然结合在树脂上，含有LF-6的切割液通过G-10葡聚糖凝胶过滤，RP-HPLC分离可进一步制得LF-6样品，其得率为2mg/L,整个体系无需酶切，即避免了昂贵切割酶的使用，且可在柱上切割之前进行在柱纯化，方法操作便捷，高效，试用成本较低，为进一步研究改良肽LF-6在体内发挥的免疫效应提供了可能性，同时，本发明体系同样适用于其他抗菌肽的制备。

附图说明

图1为重组菌株BL21(DE3)-pTWIN1-LF-6-intein2-CBD获取流程示意图。

图2为重组质粒结构示意图。其中图2.1是原质粒pTWIN1示意图，图2.2是原质粒中的CBD-intein1基因被LF-6基因替换后的重组质粒pTWIN1-LF-6-intein2-CBD示意图。

图3为菌落PCR鉴定DH5α-pTWIN1-LF-6-intein2-CBD。其中泳道M为DNA Marker(最前面两条条带分别为100bp,75bp),泳道1为以pTWIN1-LF-6-intein2-CBD为模板，LF-6的5’端和intein基因为引物的PCR产物。

图4为100μg/mL1%AP抗性平板筛选获得阳性克隆BL21(DE3)-pTWIN-LF-6-intein2-CBD（白色菌落即为克隆菌株）。

图5为通过Tricine-SDS-PAGE分析每个在柱切割纯化步骤的实施效果。

其中泳道1为诱导前菌体总蛋白，泳道2为诱导后菌体，泳道3为超声破碎后可溶上清，泳道4为可溶上清流经CBD填料后收集的流穿液，泳道5为加入DTT化学切割试剂后4℃封闭过夜切割反应后的流出液，泳道6为经过G10葡聚糖凝胶柱脱盐后的收集液。泳道M为蛋白Marker（Invitrogen，Marker从上至下依次为：260，160，110，60，50，40，30，15，10，2.5kDa)。

图6为通过Tricine-SDS-PAGE验证成功切割释放LF-6。其中图6.1中泳道M为蛋白Marker（Marker从上至下依次为：260，160，110，60，50，40，30，15，10，2.5kDa),泳道1为切割反应完成后2%SDS洗脱液，反映切割效率，泳道2为切割液。图6.2中泳道M为蛋白Marker，指示分子量同上，泳道1为切割液过G-10葡聚糖凝胶柱后再次冷冻干燥浓缩的样品。

图7为通过G-10葡聚糖凝胶过滤，LF-6与DTT进行了初步分离，同时去除大量盐份。其中标注峰1代表抗菌肽LF-6及少量蛋白大分子，标注峰2代表被分离的大部分DTT。所有过程在紫外吸收波长280nm下监测完成。

图8为通过分析型RP-HPLC后，LF-6与DTT全部分离。

其中图8.1中标注峰1代表DTT标样。

图8.2中标注峰1代表抗菌肽LF-6，标注峰2代表残留的DTT,同时在后面还监测到一些小杂峰，可能为一些大分子蛋白。

图9为通过质谱对制备的LF-6进行分子量鉴定。如图中框线所标注，检测值与理论分子量2900.5kDa相符。

图10为以合成肽LF-6作为阳性对照，去离子水作为空白对照，测定重组表达肽LF-6对大肠杆菌E.coil K88的动态杀菌效果。从图中绘制曲线所反映的动态杀菌效果可以看出，重组肽LF-6与合成肽LF-6对大肠杆菌E.coil K88具有相近的杀菌效果。

图11为通过牛津杯法检测重组表达肽LF-6对金黄色葡萄球菌S.aureus ATCC25923的抑菌效果，以土霉素，新霉素为阳性对照，去离子水为空白对照。其中A为50μg/ml的重组肽LF-6,B为5μg/ml的土霉素，C为5μg/ml的新霉素，D为去离子水，从图中可以看出，重组抗菌肽LF-6对金黄色葡萄球菌S.aureusATCC25923表现出一定的抑菌效果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细描述，实施例仅是描述而非限定本发明。

实施例1：改良肽LF-6基因的合成及重组表达载体pTWIN1-LF-6-intein2-CBD的构建和重组表达菌株BL21(DE3)-pTWIN1-LF-6-intein2-CBD的获得。

一、SOE-PCR法扩增含酶切位点NdeI和SpeI的改良肽LF-6基因：

抗菌肽LF-6氨基酸序列为：KWRQWQSKWRRTNPWFWIRR，利用在线分析软件JCAT依照大肠杆菌密码子偏好性对其基因进行优化，优化后的碱基序列为：

AAGTGGCGTCAGTGGCAGAGCAAATGGCGTCGCACCAACCCGTGGTTTTGGATTCGCCGC，以该碱基序列为目的基因，通过Primer Premier5.0软件进行引物设计，引物序列如下：

F1:5-GGGAATTCCATATGAAGTGGCGTCAGTGGCAGAGCAAATGGCGTCGCA-3；

R1:5-GGACTAGTGCATCTCCCGTGATGCAGCGGCGAATCCAAAACCACGGGTTGGTGCGACGCCATTTGCTCTGC-3；

上游引入NdeI限制性酶切位点，下游引入SpeI限制性酶切位点。为提高双酶切效率，在NdeI序列前和SpeI序列后分别引入保护碱基GGGAATTC,CC。

SOE-PCR扩增抗菌肽LF-6基因，PCR反应体系及条件为：ddH2O 30μl,10*buffer(含Mg2+)5μl,DNTP(2.5mmol)4μl,F1,R1（50pmol/μl）5μl,Taq酶1μl,共50μl,反应条件如下：95℃预变性4min,95℃变性30s,55℃30s,72℃延伸1min,30循环，72℃延伸10min，PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳后用对目的条带进行割胶回收，-20℃保存备用。

二、重组表达载体pTWIN1-LF-6-intein2-CBD的构建与重组表达菌株BL21(DE3)-pTWIN1-LF-6-intein2-CBD的筛选获取：

将pTWIN1（购买于NEB公司）质粒与PCR扩增后回收的目的片段分别进行NdeI,SpeI双酶切反应（反应条件与体系参照NEB说明书），产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后割胶回收纯化质粒的大片段与目的基因片段，通过T4连接酶，16℃进行1h的连接反应后，通过热激转化（具体方法见《分子克隆》）至大肠杆菌DH5α菌株，转化菌落涂板于1%的AP抗性平板，次日挑板中长出的单克隆活化后通过菌液PCR鉴定及上海生工测序。菌落PCR引物分别参照目的基因LF-6的5’端目的基因序列与内含肽的通用引物Mxe intein Reverse Primer设计，从图3可以看出有大小为99bp的特异性片段出现，测序结果比对分析进一步表明LF-6基因已克隆至pTWIN1质粒的正确位置，即成功获取pTWIN1-LF-6-intein2-CBD重组质粒。

将测序正确的DH5α阳性克隆菌株用于质粒扩增，通过质粒抽提试剂盒（BioFlux）提取质粒，通过热激转化将质粒转入感受态大肠杆菌BL21(DE3)中（Novagen USA）,短时间活化后立即铺于含有1%AP的抗性平板，置于37℃的恒温培养箱中培养24h,次日挑取长出的单菌落(如图4所示)至含有1%AP的试管中进行活化，活化后的菌株用20%的甘油保存于-80℃备用。

实施例2：抗菌肽LF-6工程菌BL21(DE3)-pTWIN1-LF-6-intein2-CBD的诱导表达及纯化。

一、融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达：

配制1%的AP抗性平板，涂板甘油菌BL21(DE3)-LF-6-intein2-CBD于平板上，置于37℃的恒温培养箱中培养24h，将长出的单克隆接种至含1%AP的LB培养基中二次活化，次日，再按1%接种量接种至已提前灭菌的含有200mlLB培养基的1L摇瓶中，共5瓶1L培养液，37℃，250rpm培养，菌体长至OD600≈0.5时每瓶加入诱导剂IPTG20μl（至终浓度为0.1mM），调整温度转速分别为30℃，180rpm下诱导3h,4℃，10000g,离心10′收集菌液，用Buffer1（20mM Tris-HCL,1M NaCl,1mM EDTA,pH8.0，0.1%吐温20）清洗，10000g离心5′，重复清洗一次，然后以原培养体积1:50的比例加入Buffer1彻底重悬菌液，冰上超声破碎（连续超声3次，每次8′，单次为超声5″,停5″，冰浴，450W,6级变幅杆）。4℃，14800g离心30′，收集上清液过0.45微米滤膜除杂（millipore USA），冻存于-40℃用于下一步纯化使用。

二、融合蛋白的在柱纯化与抗菌肽LF-6的切割释放：

将几丁质填料装于AKTA柱中(GE USA规格：10ml），用于在柱切割纯化，实验仪器为AKTAEXPLORER（GE USA）蛋白纯化仪，连接好管路后，先用15个柱体积的去离子水清洗柱中填料，并调整UV280基线平衡，再用10个柱体积的Buffer2（20mM Tris-HCL,2M NaCl,1mM EDTA,pH8.0，0.1%吐温20）平衡柱子，然后将收集的可溶表达上清以1ml/min的速度自动上柱，待目的蛋白与填料结合后，用Buffer2充分洗脱杂蛋白至UV280回复至基线，用5个柱体积含有30mM DTT的Buffer3（20mM Tris-HCL,1M NaCl,1mM EDTA,pH8.5）快速浸润填料，立即将柱子两端封口后于4℃反应24h，次日，用Buffer3以1ml/min的流速冲洗柱子并收集流出液，重组表达肽LF-6即在切割液中。如图5所示，融合蛋白分子量大小约为30.74kDa，通过泳道1，2对比，可以证明融合蛋白成功进行了诱导表达，通过泳道3，4对比，可以证明融合蛋白成功结合在CBD填料上（泳道4中30.74kDa这一融合蛋白条带消失），泳道5和泳道6在2.5kDa附近有一条带，可以证明抗菌肽LF-6成功进行了切割释放。为了进一步证明抗菌肽LF-6成功释放，图6.1中的泳道1通过2%SDS非离子型去污剂的洗涤，发现没有融合蛋白结合在填料上，表明切割完全，同时图6.1的泳道2和图6.2中的泳道1分别为切割液和过G-10脱盐后收集液的浓缩后样品图，图中显示在2.5kDa附近有一明显条带，初步分析为重组抗菌肽LF-6。

三、抗菌肽LF-6的脱盐处理，RP-HPLC制备及质谱鉴定：

将流出液进行冷冻干燥浓缩，通过Sephadex G-10（GE USA）葡聚糖凝胶填料对其中的盐分和DTT进行初步分离去除，由于DTT和盐分的分子量和抗菌肽LF-6分子量相比小很多，因此DTT的出峰时间会滞后于抗菌肽LF-6，根据这一特点，可以很好的将DTT与目的肽进行初步分离，从图7中可以看出，在紫外波长为280nm的监测下，肽与蛋白等大分子与DTT可以分离，但肽与蛋白混合物不能通过G-10填料分开，所以峰形均一对称，DTT小分子由于分离时间长，盐分等杂质的影响，所以峰形波动不整齐，收集对应峰值的流出液用于冷冻干燥浓缩，进行RP-HPLC制备。制备所得样品进行质谱鉴定分析。在进行RP-HPLC制备前，首先利用分析型RP-HPLC获取抗菌肽LF-6的洗脱参数，参考有关多肽洗脱条件的文献设定洗脱梯度与时间，准备100μl样品，用枪头转入进样针，除去气泡，用分析型反相高效液相色谱测试样品中峰型分布以及分离度，在UV280处检测出峰时间及对应乙腈浓度，同时，由于DTT在280nm处也有吸收峰干扰，因此准备100μl一定浓度的DTT标品，以相同的洗脱条件进行DTT洗脱参数的确定，排除DTT带来的干扰，如图8.1所示，在此基础上延长洗脱时间，以实现目的肽与其他杂质有足够的分离时间，得到最佳的洗脱效果，用制备型色谱仪进行样品制备，制备前将收集液冷冻干燥浓缩至2ml左右的进样量，用针筒手动进样2ml后，以分析性色谱仪的优化参数做等度洗脱，在UV280下收集吸收峰对应的流出液，流出液于﹣40℃冰冻后冷冻干燥浓缩，最后配制成一定浓度水溶液，冻存于-80℃备用。

色谱条件：Agilent Zorbax SB-C18柱（2.1mm×150mm，5μm），流动相：乙腈:水=20%-60%（0.1%TFA）柱温25℃，流速：1mL/min，进样量为20μL，洗脱时间为45min。

先用分析型RP-HPLC摸索洗脱条件，实际进样量为20μl,乙腈的洗脱梯度为20%-60%，结合流动相速度与洗脱时间可以判断乙腈浓度约在25%时抗菌肽LF-6被洗脱下来，且可以与DTT较好分离，如图8.2所示，在此条件下，换到制备型RP-HPLC,将样品上清冷冻干燥浓缩至约2ml后进样，用25%的乙腈等梯度洗脱，在8分钟左右收集到目的肽。在通过制备型RP-HPLC获得目的肽LF-6后，-40℃冷冻再用冷冻干燥机进行浓缩，冷冻浓缩后的肽呈雪花粉状，配制成100ug/ml浓度水溶液后，上样电喷雾四级杆飞行时间质谱进行分子量验证，测试结果（图9）表明重组表达肽的分子量与理论值符合，因此可以初步认为改良肽LF-6重组表达成功。

质谱条件：ESI（电喷雾离子源），负离子检测，雾化气压力设为30psi；干燥气（N2）流速设为7L/min，干燥气温度设为350℃。

实施例3：制备所得抗菌肽LF-6的抗菌活性验证：

一、最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）测定

将本实验室保存的E.coli ATCC25922,E.coli K88S.aureus ATCC25923进行活化，划线于MH琼脂平板，于37℃培养18-24h；挑取过夜培养后MH琼脂平板上的单菌落接种于3mL新鲜MH肉汤培养基中，37℃恒温震荡培养18-24h，转速250rpm；取上述过夜培养菌悬液转接至新鲜MH肉汤培养基中（按1:100的比例转接，37℃下250rpm恒温震荡培养2-5h至OD600nm=0.5；取OD600nm=0.5的菌悬液10μL至10mL新鲜MH肉汤培养基中，涡旋混匀，调整细菌数为5×10⁵-1×10⁶CFU/mL，用于MIC，MBC的测定；向无菌96孔平板中的第一到第八孔各加入90μL制备好的菌悬液，第十一孔加入100μL菌悬液设为阳性对照孔，第十二孔加100μL MH肉汤培养基设为阴性对照孔；从第一孔到第八孔逐一加入10μL相应浓度的肽稀释液，，使待测肽的终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1μg/mL；将培养板置于37℃下保湿静置培养18-24h，培养后观察各孔底部是否有细菌沉淀产生，无肉眼可见细菌沉淀的最小浓度可判定为多肽的MIC。MIC就是能完全抑制细菌生长的抗菌物质最低浓度。

自没有细菌生长的平板孔中各取10μL内容物涂布于MH琼脂平板上，每孔做三个重复，待完全吸收后，37℃下培养18～24h，根据是否有菌落生长来确定抗菌物质的MBC。MBC就是能阻止残余菌形成菌落的抗菌物质最低浓度。

结果如下表1所示，从表1中可以看出除了对E.coli K88的MIC与MBC值略有差异外，对其他两种菌的MIC与MBC值相同。

表1：合成与重组肽LF-6对三种细菌的MIC和MBC值

二、通过对大肠杆菌E.coli K88的动态杀菌曲线验证重组肽LF-6的抑菌活性：

将本实验室保存的E.coli K88甘油菌划板于MH琼脂平板，于37℃培养18-24h；挑取单菌落过夜培养后转接至4mL新鲜MH肉汤培养基中，250rpm，37℃恒温震荡培养18-24h，，取上述过夜培养菌悬液40μl转接至4mL新鲜MH肉汤培养基中（按1:100的比例转接），37℃下250rpm恒温震荡培养1-3h至OD600≈0.5（不同菌种培养时间不同）；取OD600≈0.5的菌悬液10μl至10mL新鲜MH肉汤培养基中（稀释1000倍），涡旋混匀，此时细菌数在2×10⁵-7×10⁵CFU/mL，用于杀菌曲线的测定（稀释好的菌悬液须在30分钟内使用），以合成肽LF-6为阳性对照，取样的时间点分别设定在肽作用的0、5、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180min。同时设置去离子水为空白对照；每个2ml离心管中加入1mL配好菌悬液，同时各管分别加入终浓度为4μg/ml的抗菌肽，置于37℃震荡培养；在对应时间点，自各管中分别取10μl菌悬液，加至90μl蒸馏水中稀释10倍，依此系列稀释4次，混匀后每个稀释度取3×10μl菌悬液至MH琼脂平板培养基上，待完全吸收后，37℃倒置培养；过夜培养后，取3个重复总菌落数在30-200个的稀释浓度进行菌落计数，用Excel软件作图分析两种来源抗菌肽LF-6动态杀菌效果。从图10中曲线所反映的动态杀菌效果可以看出，重组肽LF-6与合成肽LF-6对大肠杆菌Ecoil K88具有相近的杀菌效果。

三、通过牛津杯法验证重组肽LF-6对金黄色葡萄球菌S.aureus ATCC25923的抑菌效果：

牛津杯法测定重组表达产物的抑菌活性：配制双层固体培养基：第一层固体培养基采用15mL的MH培养基，待其凝固后，接着配琼脂浓度为第一层一半的MH半固体培养基；取5mLMH半固体培养基，待其温度降至50℃左右后，加入OD₆₀₀=0.6的活化金黄色葡萄球菌悬液50μL，混匀后平铺到凝固的第一层培养基上；在半固体培养基凝固之前，正置放入牛津杯，使其可以插入第二层培养基中，而第一层固体培养基作为其支撑；半固体培养基凝固后，取200μL，浓度为50μg/ml待测样品加入到牛津杯中，37℃培养过夜后，观察抑菌圈大小，判断样品的抑菌活性。从图11中可以看出，重组抗菌肽LF-6对金黄色葡萄球菌S.aureusATCC25923表现出一定的抑菌效果。但其对金黄色葡萄球菌S.aureus ATCC25923的抑菌效果不如土霉素和新霉素这两种抗生素。

上述实验结果表明：通过内含肽系统介导乳铁蛋白改良肽LF-6在大肠杆菌中的重组表达，不仅可以在不需要购买昂贵切割酶的情况下将抗菌肽LF-6从融合蛋白中释放出来，且可以实现在柱切割功能的同时完成在柱纯化。与传统的抗菌肽融合表达体系相比，此系统重组表达抗菌肽操作简单高效，成本较低，纯度高，且抑菌活性与合成肽几乎一致，为后续利用改良肽LF-6进行小鼠免疫保护试验奠定了基础。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术进行的若干改进与润饰，均视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 利用内含肽系统大肠杆菌表达乳铁蛋白改良肽LF-6的方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> Sus scrofa

<400> 1

Lys Trp Arg Gln Trp Gln Ser Lys Trp Arg Arg Thr Asn Pro Trp Phe

1 5 10 15

Trp Ile Arg Arg

20

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 优化后LF-6的基因序列

<400> 2

aagtggcgtc agtggcagag caaatggcgt cgcaccaacc cgtggttttg gattcgccgc 60

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物 F1

<400> 3

gggaattcca tatgaagtgg cgtcagtggc agagcaaatg gcgtcgca 48

<210> 4

<211> 71

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物 R1

<400> 4

ggactagtgc atctcccgtg atgcagcggc gaatccaaaa ccacgggttg gtgcgacgcc 60

atttgctctg c 71

Claims

1.一种利用内含肽系统大肠杆菌表达乳铁蛋白改良肽LF-6的方法，其特征在于，步骤如下：

a、PCR扩增具大肠杆菌密码子偏好性的改良肽LF-6目的基因；

c、鉴定阳性转化子，亚克隆至大肠杆菌表达菌株；

f、对纯化所得抗菌肽LF-6进行抑菌活性验证。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤a中改良肽LF-6的氨基酸序列为：KWRQWQSKWRRTNPWFWIRR（SEQ ID NO:1 ），依据大肠杆菌的密码子偏好性对其对应的密码子进行优化后的基因序列为：AAGTGGCGTCAGTGGCAGAGCAAATGGCGTCGCACCAACCCGTGGTTTTGGATTCGCCGC（SEQ ID NO:2 ），在LF-6目的基因前后两端设计与表达载体对应的限制性酶切位点 NdeI 和SpeI序列,为提高双酶切效率，在NdeI序列前和 SpeI序列后分别设计保护碱基 GGGAATTC,CC,设计合成了两条引物 F1和R1：

F1:5- GGGAATTCCATATGAAGTGGCGTCAGTGGCAGAGCAAATGGCGTCGCA -3（SEQ ID NO:3 ）；

R1:5- GGACTAGTGCATCTCCCGTGATGCAGCGGCGAATCCAAAACCACGGGTTGGTGCGACGCCATTTGCTCTGC -3（SEQ ID NO:4）；利用重叠区基因扩增拼接法进行PCR扩增LF-6目的基因。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤b中，pTWIN1载体与 PCR扩增的改良肽LF-6目的基因PCR 回收产物分别经 NdeI,SpeI 双酶切后，在T4 DNA连接酶的作用下将目的片段构建至载体 pTWIN1相应多克隆位点，得到pTWIN1-LF-6-intein2-CBD的重组质粒，热激转化至E.coliDH5α感受态细胞，获得的阳性转化子经菌落PCR后用于测序分析。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤c中，测序正确的大肠杆菌表达菌株进行扩大培养，提取质粒，热激转入感受态E.coli BL21(DE3)pLysS中，在含有1%氨苄（AP）的抗性平板中筛选阳性克隆，挑阳性单克隆接种至含1% AP的LB培养基，活化后制备成甘油菌保种于-80℃备用。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤d中所述，配制1%的AP抗性平板，涂板甘油菌BL21(DE3)-pTWIN1-LF-6-intein2-CBD于平板上，将长出的单克隆接种至含1%AP的LB培养基中过夜活化，次日再按1%接种量接种至已提前灭菌的含有200mlLB培养基的1L摇瓶中，共 5 瓶1L发酵液，37℃，250rpm 培养，菌体长至OD600≈0.5时每瓶加入诱导剂IPTG 20μl至终浓度为0.1mM，调整温度转速分别为30℃，180rpm诱导3h, 4℃，10000g,离心10分钟收集菌液，用 Buffer1：20mM Tris-HCL,1M NaCl,1mM EDTA,pH8.0，0.1%吐温20清洗，10000g离心 5分钟，重复清洗一次，然后以原培养体积 1:50 的比例加入Buffer1彻底重悬菌液，冰上超声破碎，14800g 离心 30分钟，收集上清液过0.45微米滤膜除杂后冻存于-40℃用于下一步纯化使用。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤e中，将几丁质填料装于AKTA柱中用于在柱切割纯化，实验仪器为 AKTA EXPLORER蛋白纯化仪，连接好管路后，先用15 个柱体积的去离子水清洗柱中填料，并调整UV280基线平衡，再用 10 个柱体积的Buffer2（20mM Tris-HCL,2M NaCl,1mM EDTA,pH8.0，0.1%吐温20）平衡柱子，然后将收集的可溶表达上清以1ml/min的速度自动上柱，待目的蛋白与填料结合充分后，用Buffer2充分洗脱杂蛋白至UV280回复至基线，用5个柱体积含有30mM DTT的Buffer3（20mM Tris-HCL,1M NaCl,1mM EDTA,pH8.5）以5ml/min的流速快速浸润AKTA柱，将柱子两端封口后于4℃反应24h，次日，用 Buffer3以1ml/min的流速冲洗柱子并收集流出液，重组表达肽LF-6即在流出液中，上述纯化效果采用Tricine-SDS-PAGE作为鉴定方法。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤e中，将流出液进行冷冻干燥浓缩，通过Sephadex G-10葡聚糖凝胶对其中的盐分和DTT进行初步分离，再次冷冻干燥后，用于RP-HPLC分析，并通过制备型RP-HPLC，制备一定样品并进行质谱鉴定。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤f中，将E.coli ATCC25922,E.coli K88 S.aureus ATCC25923进行活化，划线于MH琼脂平板，于37 ℃培养18-24 h；挑取过夜培养后MH琼脂平板上的单菌落接种于3 mL新鲜MH肉汤培养基中，37 ℃恒温震荡培养18-24 h，转速250 rpm；取上述过夜培养菌悬液转接至新鲜MH肉汤培养基中，按1:100的比例转接，37 ℃下250 rpm恒温震荡培养2-5h至OD₆₀₀nm=0.5；取OD₆₀₀nm=0.5的菌悬液10 μL至10 mL新鲜MH肉汤培养基中，涡旋混匀，调整细菌数为5×10⁵-1×10⁶ CFU/mL，用于MIC，MBC的测定；向无菌96孔平板中的第一到第八孔各加入90 μL制备好的菌悬液，第十一孔加入100 μL菌悬液设为阳性对照孔，第十二孔加100 μL MH肉汤培养基设为阴性对照孔；从第一孔到第八孔逐一加入10 μL相应浓度的肽稀释液，不加抗菌物质，使待测肽的终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1μg/mL；将培养板置于37℃下保湿静置培养18-24h；培养后观察各孔底部是否有细菌沉淀产生，无肉眼可见细菌沉淀的最小浓度可判定为多肽的MIC；MIC就是能完全抑制细菌生长的抗菌物质最低浓度，自没有细菌生长的平板孔中各取10 μL内容物涂布于MH琼脂平板上，每孔做三个重复，待完全吸收后，37 ℃下培养18-24 h，根据是否有菌落生长来确定抗菌物质的MBC，MBC就是能阻止残余菌形成菌落的抗菌物质最低浓度；

所述的步骤f中，将E.coli K88菌株划板于 MH 琼脂平板，于 37℃培养 18-24h；过夜培养后挑MH琼脂平板上的单菌落接种于3mL新鲜MH肉汤培养基中，37℃恒温震荡培养18-24h，转速 250rpm，取上述过夜培养菌悬液30μl转接至 3mL 新鲜MH肉汤培养基中，按1:100的比例转接，37℃下 250rpm 恒温震荡培养 2h 至 OD₆₀₀ 为0.5；取菌悬液 10μl 至 10mL 新鲜 MH 肉汤培养基中，涡旋混匀，用于杀菌曲线的测定；以合成肽LF-6为阳性对照，取样的时间点分别设定在肽作用的 0、5、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180min，同时设置去离子水为空白对照，每个2ml离心管中加入1mL配好菌悬液，同时各管分别加入终浓度为4μg/ml的抗菌肽，置于 37℃，250rpm震荡培养；在对应时间点，自各管中分别取 10μl 菌悬液，加至 90μl 蒸馏水中稀释,倍比稀释 4 次，混匀后每个稀释度取 3×10μl 菌悬液至 MH琼脂平板培养基上，待完全吸收后，37℃倒置培养；过夜培养后，取3个重复总菌落数在30-200 个的稀释浓度进行菌落计数，用 Excel 软件作图对比分析重组表达抗菌肽LF-6与合成肽LF-6的动态杀菌效果；

所述的步骤f中，牛津杯法测定重组表达产物的抑菌活性：配制双层固体培养基：第一层固体培养基采用15 mL的MH培养基，待其凝固后，接着配第二层半固体培养基，琼脂浓度为第一层一半的MH半固体培养基；取5 mL MH半固体培养基，待其温度降至50℃左右后，加入OD600=0.6的活化金黄色葡萄球菌悬液50 μL，混匀后平铺到凝固的第一层培养基上；在半固体培养基凝固之前，正置放入牛津杯，使其可以插入第二层培养基中，而第一层固体培养基恰好作为其支撑；半固体培养基凝固后，取200 μL浓度为50μg/ml待测样品加入到牛津杯中，37℃培养过夜后，观察抑菌圈大小，判断样品的抑菌活性。