CN108660147B - 一种利用hu蛋白带动乳铁蛋白肽的表达以及纯化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种利用HU蛋白带动乳铁蛋白肽的表达以及纯化的方法，主要内容包括：制备重组表达载体pET‑22b‑HUβ‑Lfb和pET‑22b‑HUβ’‑Lfb，将构建好的重组载体分别转化到大肠杆菌感受态细胞BL21中，之后过夜培养，菌液接种到LB培养液中，摇床培养，然后加入IPTG，并放入摇床中；筛选到所释放的蛋白为水溶性且大小正确的阳性菌株即所需阳性菌株，最后通过裂解透析洗脱并高温加热等操作得到HU‑Lfb和HUβ’‑Lfb蛋白原液。本发明可以简化融合蛋白的设计及纯化方法，避免了融合蛋白设计Linker的繁琐步骤，并利用其耐高温特性简化了纯化该融合蛋白的方法。

Description

一种利用HU蛋白带动乳铁蛋白肽的表达以及纯化的方法
技术领域
本发明属于于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种利用HU蛋白带动乳铁蛋白肽的表达以及纯化的方法。
背景技术
融合蛋白技术，是将两种基因片段拼接在一起，为了达到融合表达的目的，现有技术是在基因片段之间添加具有特定氨基酸序列的接头序列，即连接肽。连接肽的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要，以及连接肽的序列选择等方面选择对蛋白的表达及纯化都具有较大的影响。因此，连接肽的设计直接影响融合蛋白的表达与纯化，然而目前对连接肽序列的设计还没有可靠的标准，影响融合蛋白的表达效果。因此选择一种简单、方便的融合蛋白的表达方式是一个研究的方向。
组蛋白样蛋白HU来源于大肠杆菌菌株U93，是一种能与DNA非特异性结合的类似组蛋白的耐热的小分子蛋白质。HU蛋白由两个同源亚基Hupα和Hupβ组成，是最保守的核酸结合蛋白，不但能与单链DNA结合，还可非特异性结合双链DNA，也有发现其对于缺口和弯曲的DNA有特定偏好。HU蛋白作为一种与DNA非特异性结合的蛋白，在细菌染色体的压缩和排列过程中扮演了重要角色，它除了维持DNA的超螺旋和压缩状态外，还能对DNA的结构起到一些特殊作用，如DNA的弯曲、基因转录调控、起始于复制原点的复制、核蛋白复合物在装配时所需的位点特异性重组反应，以及通过蛋白质-RNA相互作用控制的翻译起始等。同时，HU蛋白也是一种热稳定性蛋白，在高温加热的状态下依然能够保持活性，可以利用其特性来辅助表达小蛋白，并且其热稳定性可以优化蛋白纯化步骤，是一种简便的辅助蛋白。
乳铁蛋白肽(Lactofeerrcin)是乳铁蛋白在酸性环境下经胃蛋白酶作用，从N端释放的一段多肽，是一类富含色氨酸的小分子抗菌肽。研究发现，乳铁蛋白肽除不能结合铁离子外，具备乳铁蛋白的所有生物学活性，如抗菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、消炎及参与免疫反应等。由于其具有普通抗生素所不具有的一系列优点，包括广谱抗菌能力和不易产生耐药性的特点，能抑制病毒、真菌增殖，但对真核细胞几乎没有毒性，而且不含有稀有氨基酸和外源化学成分，是一种健康安全的产品。因此，关于乳铁蛋白肽的结构、功能、作用机制及基因工程成为研究热点。虽然不同哺乳动物的乳铁蛋白肽氨基酸长度不同，但其一级结构具有较高的同源性。来源于牛的乳铁蛋白的抗菌肽称为乳铁蛋白B，它不易被胃蛋白酶进一步酶解，且具有耐热、无抗原性、免疫调节作用、广谱抑菌和对肠道有益菌无害等作用，是研究抗菌肽的理想模板。
发明内容
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种利用HU蛋白带动乳铁蛋白肽的表达以及纯化的方法，本发明的HU蛋白保有其耐高温特性，经90℃加热后除去大量杂蛋白，再通过离心力除去沉降蛋白即获得纯化的融合蛋白。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种利用HU蛋白带动乳铁蛋白肽的表达以及纯化的方法，包括以下步骤：
1)构建重组表达载体pET-22b-HUβ-Lfb；
2)构建重组表达载体pET-22b-HUβ’-Lfb；
3)将构建好的重组载体pET-22b-HUβ-Lfb和pET-22b-HUβ’-Lfb分别转化到大肠杆菌感受态细胞BL21中，之后取含重组质粒的阳性菌株并加入LB液体培养基中过夜培养，接着菌液按1％比例接种到50ml的LB培养液中，放入37℃摇床培养至其OD值为0.6～0.8；然后加入异丙基硫代半乳糖苷，并放入37℃摇床中诱导表达5小时，摇床转速为180rpm；
4)取诱导表达后的菌液经3000×g离心15min得到菌体，裂解，释放蛋白质，并通过SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况，从而筛选到所释放的蛋白具有水溶性且大小正确的阳性菌株即所需阳性菌株；
5)将获得的阳性菌液经3000×g离心15min，收集大肠杆菌菌体，于-70℃冷冻放置过夜，备用；将收集到的大肠杆菌菌体悬浮在裂解缓冲液B-PER中，冰上超声裂解菌体，裂解液经27000×g离心15min，于上清液中加入体积比10％的PEI至终浓度为体积浓度0.35％和终浓度0.75M的NaCl，4℃放置至核酸沉淀，之后17000×g离心20min，于上清液中添加饱和硫酸铵至其体积分数为50％，在4℃放置1h，接着17000×g离心15min，去沉淀，上清液中加入硫酸铵至完全饱和，然后17000×g离心30min，取硫酸铵沉淀溶解在缓冲液A，透析36h，换液三次；透析后的溶液上样至强阳离子交换柱，用透析缓冲液NaCl梯度洗脱，收集0.2M和0.25M的NaCl洗脱峰，并以弱阳离子交换柱及0.25M NaCl梯度洗脱该洗脱峰，得到HU蛋白原液，将原液进行90℃加热20min后以转速14000×g，4℃下离心20min取上清液即得融合蛋白溶液；加入甘油至其体积分数为50％，-70℃保存待用。
进一步地，步骤1)中构建重组表达载体pET-22b-HUβ-Lfb具体为：取来源于大肠杆菌U93的HU的1个亚基的基因片段即HUβ亚基和乳铁蛋白肽的基因片段，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示，将乳铁蛋白肽基因片段直接连接于HU基因片段，使用PCR方法对目的片段扩增，并使用小量质粒提取试剂盒提取质粒Pet22b，对目的片段和质粒进行NedⅠ和EcoRⅠ的双酶切，通过T4连接酶连接，热激法转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即得到重组表达载体pET-22b-HUβ-Lfb。
进一步地，步骤2)中的构建重组表达载体pET-22b-HUβ’-Lfb具体为：取来源于大肠杆菌U93的HU的1个亚基的基因片段即HUβ亚基和乳铁蛋白肽的基因片段，将HUβ基因片段苯丙氨酸与亮氨酸替换为丙氨酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；将乳铁蛋白肽序列与修改后Huβ序列连接，使用PCR方法对目的片段扩增，并使用小量质粒提取试剂盒提取质粒Pet22b；对目的片段和质粒进行NedⅠ和EcoRⅠ的双酶切，通过T4连接酶连接，热激法转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组表达载体pET-22b-HUβ’-Lfb。
进一步地，步骤5)中，裂解缓冲液的组分为：0.05M Tris、0.2M氯化钠、0.01MEDTA、10％v/v甘油、pH 7.5。
进一步地，缓冲液的组分：0.02M Tris、0.001M EDTA、0.1M NaCl、10％v/v甘油、pH7.5。
进一步地，步骤5)中强阳离子交换柱采用SP琼脂糖凝胶柱，弱阳离子交换柱采用lCM-琼脂糖柱。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明是一种刨除linker直接用小蛋白带动更小蛋白表达的方法，避免得到融合蛋白后切除linker的步骤。
2)本发明利用的HU蛋白表达量较高，且为可溶性表达，利用HU带动小蛋白表达可获得小蛋白的可溶性表达。
3)本发明利用HU蛋白的耐高温特性可通过加热一并除去杂蛋白，达到简化纯化蛋白的目的。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明蛋白表达的sds-page电泳检测图；其中，M：蛋白质分子量标准，1：诱导前的HUβ-Lfb，2：诱导后的HUβ-Lfb，3：诱导后的HUβ’-Lfb；
图2是本发明蛋白纯化后的sds-page的电泳检测图；其中，M：mark，1：HUβ-Lfb，2：HUβ’-Lfb；
图3是本发明pET-22b-HUβ-Lfb的构建图；
图4是本发明pET-22b-HUβ’-Lfb的构建图。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1利用HU蛋白带动乳铁蛋白肽的表达的方法
(1)、取来源于大肠杆菌U93的HU的1个亚基的基因片段即HUβ亚基和乳铁蛋白肽的基因片段(订购于life官网)，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示，将乳铁蛋白肽基因片段直接连接于HU基因片段，使用PCR方法对目的片段扩增，并使用小量质粒提取试剂盒提取质粒Pet22b，对目的片段和质粒进行NedⅠ和EcoRⅠ的双酶切，通过T4连接酶连接，热激法转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组表达载体pET-22b-HUβ-Lfb，如图3所示；
(2)、取来源于大肠杆菌U93的HU的1个亚基的基因片段即HUβ亚基和乳铁蛋白肽的基因片段，将HUβ基因片段苯丙氨酸与亮氨酸替换为丙氨酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；将乳铁蛋白肽序列与修改后Huβ亚基序列连接，使用PCR方法对目的片段扩增，并使用小量质粒提取试剂盒提取质粒Pet22b；对目的片段和质粒进行NedⅠ和EcoRⅠ的双酶切，通过T4连接酶连接，热激法转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组表达载体pET-22b-HUβ’-Lfb，如图4所示；
(3)、将构建好的重组载体pET-22b-HUβ-Lfb和pET-22b-HUβ’-Lfb分别转化到大肠杆菌感受态细胞BL21中，之后取含重组质粒的阳性菌株并加入LB液体培养基中过夜培养，接着菌液按体积百分比为1％接种到50ml的LB培养液中，放入37℃摇床培养至其OD值为0.6～0.8；然后加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，并放入37℃摇床中诱导表达5小时，摇床转速为180rpm；
(4)、取诱导表达后的菌液经3000×g离心15min得到菌体，裂解，释放蛋白质，并通过SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况，从而筛选到所释放的蛋白具有水溶性且大小正确的阳性菌株即所需阳性菌株。
将获得的大肠杆菌菌体进行sds-page电泳，由图1可以看出，融合蛋白在大肠杆菌中正常表达，大小约15kDa，正确。
实施例2利用HU蛋白带动乳铁蛋白肽的纯化的方法
利用实施例1中的步骤(3)与(4)的操作培养获得大量所需阳性菌株菌液，经3000×g离心15min，收集大肠杆菌菌体，于-70℃冷冻放置过夜，备用。将收集到的大肠杆菌菌体悬浮在裂解缓冲液B-PER中，冰上超声裂解菌体，裂解液经27000×g离心15min，于上清液中加入体积比10％的PEI至终浓度为0.35％(体积比)和终浓度0.75M的NaCl，4℃放置至核酸沉淀，之后17000×g离心20min，于上清液中添加饱和硫酸铵至其体积分数为50％，在4℃放置1h，接着17000×g离心15min，去沉淀，上清液中加入硫酸铵至完全饱和，然后17000×g离心30min，取硫酸铵沉淀溶解在缓冲液A，透析36h，换液三次；透析后的溶液上样至强阳离子交换柱，用透析缓冲液NaCl梯度洗脱，收集0.2M和0.25M的NaCl洗脱峰，并以弱阳离子交换柱及0.25M NaCl梯度洗脱该洗脱峰，得到HU蛋白原液，将原液进行90℃加热20min后以转速14000×g，4℃下离心20min取上清液即得融合蛋白溶液。加入甘油至其体积分数为50％，-70℃保存待用。
其中，裂解缓冲液的组分为：0.05M Tris、0.2M氯化钠、0.01M EDTA、10％v/v甘油、pH 7.5；缓冲液的组分：0.02M Tris、0.001M EDTA、0.1M NaCl、10％v/v甘油、pH 7.5。强阳离子交换柱采用SP琼脂糖凝胶柱，弱阳离子交换柱采用lCM-琼脂糖柱。
由图2可以看出，纯化后的蛋白溶液在90℃加热后仍保有活性，大小约15kDa，从而证明本思路正确性。
本发明通过将耐高温DNA结合蛋白与乳铁蛋白肽直接连接表达，实现了刨除linker的正确表达，并利用其耐高温特性简化了融合蛋白的纯化方法，为简化实验提供了新的思路。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 戚智青 刁勇
<120> 一种利用HU蛋白带动乳铁蛋白肽的表达以及纯化的方法
<130> 2017
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 273
<212> DNA
<213> HUβ亚基
<400> 1
gtgaataaat ctcaattgat cgacaagatt gctgcagggg ctgatatctc taaagctgcg 60
gctggccgtg cgttagatgc tattattgct tccgtaactg aatctctgaa agaaggggat 120
gatgtagcac tggtaggttt tggtactttt gccgttaaag agcgtgctgc ccgtactggc 180
cgcaacccgc agaccggtaa agagatcacc atcgctgctg ctaaagtacc gagcttccgt 240
gcaggtaaag cactgaaaga cgcggtaaac taa 273
<210> 2
<211> 78
<212> DNA
<213> 乳铁蛋白肽
<400> 2
ttcaaatgcc gccgttggca gtggcgtatg aaaaaactgg gtgcgccgtc tattacctga 60
gtgcgtcgcg cgttctaa 78
<210> 3
<211> 273
<212> DNA
<213> HUβ亚基
<400> 3
atgaataaat ctcaattgat cgacaagatt gctgcagggg ctgatatctc taaagctgcg 60
gctggccgtg cggctgatgc tattattgct tccgtaactg aatctctgaa agaaggggat 120
gatgtagcag cggtaggtgc gggtactgct gccgttaaag agcgtgctgc ccgtactggc 180
cgcaacccgc agaccggtaa agagatcacc atcgctgctg ctaaagtacc gagcttccgt 240
gcaggtaaag cactgaaaga cgcggtaaac taa 273

Claims (2)

1.一种利用HU蛋白带动乳铁蛋白肽的表达以及纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）构建重组表达载体pET-22b-HUβ-Lfb；
2）构建重组表达载体pET-22b-HUβ’-Lfb；
3）将构建好的重组载体pET-22b-HUβ-Lfb和pET-22b-HUβ’-Lfb分别转化到大肠杆菌感受态细胞BL21中，之后取含重组质粒的阳性菌株并加入LB液体培养基中过夜培养，接着菌液按1% 比例接种到50 ml的LB培养液中，放入37℃摇床培养至其OD 值为0.6 ～0.8 ；然后加入异丙基硫代半乳糖苷，并放入37℃摇床中诱导表达5小时，摇床转速为180rpm；
4）取诱导表达后的菌液经3000×g离心15min得到菌体，裂解，释放蛋白质，并通过SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况，从而筛选到所释放的蛋白具有水溶性且大小正确的阳性菌株即所需阳性菌株；
5）将获得的阳性菌液经3000×g离心15min，收集大肠杆菌菌体，于-70°C冷冻放置过夜，备用；将收集到的大肠杆菌菌体悬浮在裂解缓冲液B-PER中，冰上超声裂解菌体，裂解液经27000×g离心15min，于上清液中加入体积比10%的PEI至终浓度为体积浓度0.35%和终浓度0.75 M的 NaCl，4°C放置至核酸沉淀，之后17000×g离心20min，于上清液中添加饱和硫酸铵至其体积分数为50%，在 4°C放置1h，接着17000×g离心15min，去沉淀，上清液中加入硫酸铵至完全饱和，然后17000×g离心30min，取硫酸铵沉淀溶解在缓冲液A，透析36h，换液三次；透析后的溶液上样至强阳离子交换柱，用透析缓冲液NaCl梯度洗脱，收集0.2 M和0.25 M 的NaCl洗脱峰，并以弱阳离子交换柱及0.25 M NaCl梯度洗脱该洗脱峰，得到HU蛋白原液，将原液进行90℃加热20min后以转速14000×g，4℃下离心20min取上清液即得融合蛋白溶液；加入甘油至其体积分数为50%，-70℃保存待用；
所述步骤1）中构建重组表达载体pET-22b-HUβ-Lfb具体为：取来源于大肠杆菌U93的HU的1个亚基的基因片段即HUβ亚基和乳铁蛋白肽的基因片段，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO：1、SEQ ID NO： 2所示，将乳铁蛋白肽基因片段直接连接于HU基因片段，使用PCR方法对目的片段扩增，并使用小量质粒提取试剂盒提取质粒Pet22b，对目的片段和质粒进行NedⅠ和EcoRⅠ的双酶切，通过T4连接酶连接，热激法转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即得到重组表达载体pET-22b-HUβ-Lfb；
所述步骤2）中的构建重组表达载体pET-22b-HUβ’-Lfb具体为：取来源于大肠杆菌U93的HU的1个亚基的基因片段即HUβ亚基和乳铁蛋白肽的基因片段，将HUβ基因片段苯丙氨酸与亮氨酸替换为丙氨酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；将乳铁蛋白肽序列与修改后Huβ序列连接，使用PCR方法对目的片段扩增，并使用小量质粒提取试剂盒提取质粒Pet22b；对目的片段和质粒进行NedⅠ和EcoRⅠ的双酶切，通过T4连接酶连接，热激法转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组表达载体pET-22b-HUβ’-Lfb；
所述步骤5）中，裂解缓冲液B-PER的组分为： 0.05 M Tris、0.2 M氯化钠、0.01 MEDTA、10% v / v甘油、pH 7.5。
2.根据权利要求1所述的利用HU蛋白带动乳铁蛋白肽的表达以及纯化的方法，其特征在于，所述缓冲液的组分：0.02 M Tris、0.001 M EDTA、0.1 M NaCl、10% v / v甘油、pH7.5。
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CN101812459A (zh) * 2010-03-26 2010-08-25 黑龙江省科学院微生物研究所 编码抗菌肽Lactoferricin B的核酸及其原核表达方法
CN103205435A (zh) * 2013-04-11 2013-07-17 浙江大学 利用内含肽系统大肠杆菌表达乳铁蛋白改良肽lf-6的方法
CN105200037A (zh) * 2015-09-21 2015-12-30 华侨大学 一种利用非特异性结合蛋白来提高基于pcr的基因合成技术灵敏度的方法
CN105200074A (zh) * 2015-09-21 2015-12-30 华侨大学 一种利用dna非特异性结合蛋白hu蛋白构建克隆载体的方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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