CN105200037A - 一种利用非特异性结合蛋白来提高基于pcr的基因合成技术灵敏度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用非特异性结合蛋白来提高基于PCR的基因合成技术灵敏度的方法，其通过如下步骤实现：S1：设计需要合成的DNA序列，得到混合重叠寡核苷酸；其中，每个序列都有25bp的重叠寡核苷酸，以覆盖整个DNA序列(200到1500碱基)；S2：将含有脱氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核苷酸引物，以及作为模板的上述混合重叠寡核苷酸的反应液中加入HU蛋白原液；S3：按照常规PCR的解链，退火，延伸三个步骤进行反复的循环，将目的核酸片段合成并且扩增。采用上述方案后，本发明方法能够特异性地、高效地合成和扩增目标核酸序列。
Description
技术领域
本发明是涉及一种基于PCR的基因合成技术为基础的核酸分子合成和扩增技术的方法，主要涉及一种耐热的，非特异性结合的蛋白来提高基于PCR的基因合成技术灵敏度的方法。
背景技术
重叠延伸PCR技术(genesplicingbyoverlapextensionPCR，简称SOEPCR)由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。重叠延伸PCR技术是根据目的基因的核苷酸序列，将目的基因分成70～90bp不等的多条引物,分段进行合成,利用相连片段间20～30bp重叠的核苷酸部分互相搭桥、互为模板,通过几轮连续的PCR反应将各个片段组合成为目的基因。
来源于大肠杆菌菌株U93的组蛋白样蛋白(HU)是与DNA非特异结合的类似组蛋白的耐热的小分子蛋白质。HU是由两个同源亚基HupA和HupB组成，是最保守的核酸结合蛋白，可非特异性结合双链DNA，也有发现其对于缺口和弯曲的DNA有特定偏好。HU蛋白不但能像结合单链DNA的SSB蛋白一样与单链DNA结合，同时还能结合双链的DNA。HU蛋白作为一种与DNA非特异性结合的蛋白，在细菌染色体的压缩和排列过程中扮演了重要角色。它除了维持DNA的超螺旋和压缩状态外，还能对DNA的结构起到一些特殊作用，如DNA的弯曲、基因转录调控、起始于复制原点的复制、核蛋白复合物在装配时所需的位点特异性重组反应，以及通过蛋白质-RNA相互作用控制的翻译起始等。
在PCR反应中,反应液的组成及热循环反应条件的优化是决定反应成败的关键,对于重叠延伸PCR反应而言更是如此。为了最大限度地避免碱基的错配,重叠延伸PCR反应一般采用高保真DNA聚合酶。传统的高保真DNA聚合酶虽具有较好的校正能力,但其扩增效率一直难以令人满意。虽然一些既具有校正功能又具有很强延伸能力的DNA聚合酶已陆续被开发应用，但是效果也仍需加强。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用非特异性结合蛋白来提高基于PCR的基因合成技术灵敏度的方法，并且能够有效地提高合成和扩增目标核酸序列的灵敏度。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用非特异性结合蛋白来提高基于PCR的基因合成技术灵敏度的方法，通过如下步骤实现：
S1：设计需要合成的DNA序列，得到混合重叠寡核苷酸；其中，每个序列都有25bp的重叠寡核苷酸，以覆盖整个DNA序列(200到1500碱基)；
S2：将含有脱氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核苷酸引物，以及作为模板的上述混合重叠寡核苷酸的反应液中加入HU蛋白原液；其中，HU蛋白原液的浓度为130ng/μl。
S3：按照常规PCR的解链，退火，延伸三个步骤进行反复的循环，将目的核酸片段合成并且扩增。
采用上述方案后，本发明中将含有脱氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核苷酸引物，以及作为模板的混合重叠寡核苷酸的反应液中加入非特异性结合蛋白HU蛋白，按照常规PCR的解链，退火，延伸三个步骤进行反复的循环，从而将目的核酸片段合成并且扩增。本发明方法能够特异性地、高效地合成和扩增目标核酸序列。
附图说明
图1是HU蛋白活性电泳检测图(环状的双链DNA作为底物)；
图2是HU蛋白活性电泳检测图(双链线性DNA作为底物)；
图3是HU蛋白活性电泳检测图(单链线性DNA作为底物)；
图4A是非特异性结合蛋白对HU-β蛋白基因合成影响的电泳检测图；
图4B是非特异性结合蛋白对Pro-Tgase蛋白基因合成影响的电泳检测图；
图5中HU蛋白SDS-PAGE电泳检测图。
具体实施方式
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
本发明一种利用非特异性结合蛋白来提高基于PCR的基因合成技术灵敏度的方法，通过如下步骤实现：
S1：设计需要合成的DNA序列，得到混合重叠寡核苷酸；其中，每个序列都有25bp的重叠寡核苷酸，以覆盖整个DNA序列(200到1500碱基)；
S2：将含有脱氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核苷酸引物，以及作为模板的上述混合重叠寡核苷酸的反应液中加入HU蛋白原液；其中，HU蛋白原液的浓度为130ng/μl。
S3：按照常规PCR的解链，退火，延伸三个步骤进行反复的循环，将目的核酸片段合成并且扩增。
上述混合重叠寡核苷酸(所有的重叠寡核苷酸链)由LifeTechnologies公司合成。
一、HU-β蛋白的活性检测
(1)将不同浓度的HU-β蛋白加入到相同量的pET-22b质粒中，室温下静置10min后用1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，发现由加入低浓度蛋白到高浓度蛋白后，pET-22b质粒的条带发生了明显的移动，结果如图1所示。图1中：
M：DNA分子量Marker；
1：质粒(Z)与shiftbuffer(SB)混合液；
2：Z与SB混合液体系内加入稀释5倍的0.2μlHU；
3：Z与SB混合液体系内加入稀释5倍的2μlHU；
4：Z与SB混合液体系内加入1μlHU；
5：Z与SB混合液体系内加入1.8μlHU；
6：Z与SB混合液体系内加入2μlHU；
7：Z与SB混合液体系内加入2.5μlHU；
8：Z与SB混合液体系内加入3μlHU；
9：Z与SB混合液体系内加入3.5μlHU；
10：Z与SB混合液体系内加入4μlHU；
11：Z与SB混合液体系内加入4.5μlHU；
12：Z与SB混合液体系内加入5μlHU。
(2)将不同浓度的HU-β蛋白加入到相同量的线性双链DNA(hu-b的PCR产物)中，室温下静置10min后用2％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，发现由加入低浓度蛋白到高浓度蛋白后，线性双链DNA的条带发生了明显的移动，结果如图2所示。图2中：
M：DNA分子量Marker；
1：PCR的DNA产物(P)与shiftbuffer(SB)混合液；
2：P与SB混合液体系内加入1μlHU蛋白原液；
3：P与SB混合液体系内加入2μlHU；
4：P与SB混合液体系内加入3μlHU；
5：P与SB混合液体系内加入4.5μlHU；
6：P与SB混合液体系内加入5.5μlHU；
7：P与SB混合液体系内加入6.5μlHU；
8：P与SB混合液体系内加入8μlHU；
9：P与SB混合液体系内加入9μlHU。
(3)将不同浓度的HU-β蛋白加入到相同量的线性单链DNA(单链引物)中，室温下静置10min后用3％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，发现由加入低浓度蛋白到高浓度蛋白后，线性单链DNA的条带发生了明显的移动，结果如图3所示。图3中：
M：DNA分子量Marker；
1：Oligo65bp(O)与shiftbuffer(SB)混合液；
2：O与SB混合液体系内加入1μlHU蛋白原液；
3：O与SB混合液体系内加入2μlHU；
4：O与SB混合液体系内加入3μlHU；
5：O与SB混合液体系内加入4.5μlHU；
6：O与SB混合液体系内加入5.5μlHU；
7：O与SB混合液体系内加入6.5μlHU；
8：O与SB混合液体系内加入8μlHU；
9：O与SB混合液体系内加入9μlHU；
10：O与SB混合液体系内加入9.5μlHU。
二、在基于PCR的基因合成体系中加入HU蛋白
为了探索HU-β对基于PCR的基因合成效率的影响，我们使用PCR对HU-β蛋白基因和Pro-Tgase蛋白基因进行合成，在分别加入了不同浓度的HU-β蛋白后，合成产物经1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，发现加了HU-β蛋白的PCR合成产物中目的片段的产量与没加的相比有如下变化：在一定浓度的HU-β蛋白下合成效率有较显著的增强，浓度达到一定值后合成效率反而变小，结果见图4A、图4B所示。
图4A中：
M：DNA分子量Marker；
1：HU-β蛋白基因的PCR合成体系(H)的结果检测
2：H体系中加入0.5μlHU蛋白原液；
3：H体系中加入1μlHU蛋白原液；
4：H体系中加入2μlHU蛋白原液；
5：H体系中加入4μlHU蛋白原液。
图4B中：
M：DNA分子量Marker；
1：Pro-Tgase蛋白基因的PCR合成体系(T)的结果；
2：T体系中加入0.5μlHU蛋白原液；
3：T体系中加入1μlHU蛋白原液；
4：T体系中加入2μlHU蛋白原液；
5：T体系中加入4μlHU蛋白原液。
实施例1：
本发明中，寡核苷酸引物设计过程如下：
1、使用的软件：GenSearch
2、GenSearch输出的结果(HUgene的合成引物和Pro-Tgasegene的合成引物)(用重叠技术合成的，即把一个片段分成很多小段，然后利用重叠原理将其合成，设计的就是分开后的所有小段)如下：
设计出的HUgene的合成引物见表1：
表1
设计出的Pro-Tgasegene的合成引物见表2：
表2
实施例2、HU蛋白的制备
1)将来源于大肠杆菌的HU-α或HU-β亚基或者是HU-α和HU-β的二聚体分别插入pET22表达载体中，其中，HU-α亚基的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示，HU-β亚基的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示，通过连接转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组表达载体pET22-Hu-α或者pET22-Hu-β或者是Hu-α和Hu-β的二聚体；
2)使用大肠杆菌感受态细胞BL21对构建好的重组载体pET22-HU-α或者pET22-HU-β或者是HU-α和HU-β的二聚体进行转化，取含重组质粒的阳性菌株加入LB液体培养基中培养过夜，之后菌液按体积比1％比例接种到50ml的LB培养液中，放入37℃摇床培养至其OD值为0.6～0.8；加入IPTG，将菌液放入37℃摇床中诱导表达3.5h，摇床转速为160rpm\min；
3)取诱导表达后的菌液离心得到菌体，裂解，释放蛋白质，并通过SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况，结果如图1(图1中：M是蛋白分子量Marker；M左侧为待检测蛋白的电泳条带)所示的蛋白为水溶性的、且大小正确即10.5kDa，从而筛选到所释放的蛋白为水溶性且大小正确的阳性菌株即所需阳性菌株；
4)利用上述操作2)与3)的操作培养获得大量所需阳性菌株，菌液经3000×g离心15min，收集大肠杆菌菌体，于-70℃冷冻放置过夜，备用；将收集到的大肠杆菌菌体悬浮在裂解缓冲液(组分为：0.05MTris、0.2M氯化钠、0.01MEDTA、10％V/v甘油、pH7.5)，冰上超声裂解菌体，裂解液经27000×g离心15min，于上清液中加入体积比10％的PEI至终浓度为0.35％(体积比)和终浓度0.75M的NaCl，4℃放置至核酸沉淀，之后17000×g离心20min，于上清液中添加饱和硫酸铵至其体积分数为50％，在4℃放置1h，接着17000×g离心15min，去沉淀，上清液中加入硫酸铵至完全饱和，然后17000×g离心30min，取硫酸铵沉淀溶解在缓冲液(组分：0.02MTris、0.001MEDTA、0.1MNaCl、10％V/v甘油、pH7.5)，透析36h，换液三次；透析后的溶液上样至强阳离子交换柱，用透析缓冲液NaCl梯度洗脱，收集0.2M和0.25M的NaCl洗脱峰，并以弱阳离子交换柱及0.25MNaCl梯度洗脱该洗脱峰，得到HU蛋白原液，将原液进行85℃加热20min后以转速14000×g，4℃下离心20min取上清液即得非特异性DNA结合蛋白HU蛋白。加入甘油至其体积分数为50％，-70℃保存待用。
其中，强阳离子交换柱采用SP琼脂糖凝胶柱，弱阳离子交换柱采用lCM-琼脂糖柱。
将洗脱后所得的HU蛋白原液即非特异性DNA结合蛋白进行SDS-PAGE分析，结果如图5所示，大小约为10.5kDa，纯度为95％左右，即HU蛋白原液的浓度为：130ng/μl。
且将本发明制备所得的非特异性DNA结合蛋白的DNA序列交由经金斯瑞测序公司进行测序，测序结果表明，制备所得的非特异性DNA结合蛋白的DNA序列与现有文献报道的HU蛋白一致；GenBank:NC010079.1其序列如序列表中SEQIDNO：3、SEQIDNO：4所所示，从而说明制备所得的非特异性DNA结合蛋白即为HU蛋白。
5)-1HU的活性检测(环状的双链DNA作为底物)
按照表3配置10μl的反应体系：
表3
表3中，所用的稀释蛋白是将HU蛋白原液稀释5倍，即1μlHU蛋白原液加入4μlbufferA混合均匀。
如表3所示，在反应液中，加入不同体积的实施例2得到的HU蛋白，室温下静置10min。之后分别取5μl反应液进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果见图1。可见在加入HU蛋白后，HU与双链DNA结合，随着加入量的增加，DNA条带逐渐上移。表明纯化出的蛋白HU有活性并且与环状的双链DNA相互作用。
-2HU的活性检测(线性状的双链DNA作为底物)
按照表4配置10μl的反应体系：
表4
如表4所示，在反应液中，加入不同体积的实施例2得到的HU蛋白(浓度相同)，室温下静置10min。之后分别取5μl反应液进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果见图2。可见在加入HU蛋白后，HU与线性状的双链DNA结合，随着加入量的增加，DNA条带逐渐上移。表明纯化出的蛋白HU有活性并且与线性状的双链DNA相互作用。
-3HU的活性检测(单链线性状的DNA作为底物)
按照表5配置10μl的反应体系：
表5
如表5所示，在反应液中，加入不同体积实施例2得到的HU蛋白(浓度相同)，室温下静置10min。之后分别取5μl反应液进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果见图3。可见在加入HU蛋白后，HU与线性状的单链DNA结合，随着加入量的增加，DNA条带上移。表明纯化出的有活性的蛋白HU可以与单链DNA相互作用。
实施例3：非特异性结合蛋白对PCR合成的影响
设计好的寡核苷酸链由LifeTechnologies公司合成。订购的各寡核苷酸链分别用10mMTris-HCl(pH8.5)溶解至100μM浓度，再将所有的寡核苷酸链混合并用蒸馏水稀释至得到1μM浓度的寡核苷酸链混合液，在PCR反应体系中加入此寡核苷酸链混合液作模板，并至所有的寡核苷酸链的终浓度为25nM。
(1)HU基因合成中加蛋白
按表6配制PCR反应液20μl：
表6
在分别加入了不同体积实施例2得到的HU蛋白(浓度相同)后，合成产物经1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，发现加了HU-β蛋白的PCR合成产物中目的片段的产量与没加的相比有如下变化：在一定浓度的HU-β蛋白下合成效率有较显著的增强，浓度达到一定值后合成效率反而变小,结果见图4A。
(2)Pro-Tgase基因合成中加蛋白
按表7配制PCR反应液20μl：
表7
在分别加入不同体积实施例2得到的HU蛋白(浓度相同)后，合成产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，发现加了HU-β蛋白的PCR合成产物中目的片段的产量与没加的相比有如下变化，在一定浓度的HU-β蛋白下合成效率有较显著的增强，浓度达到一定值后合成效率反而变小,结果见图4B。
Claims (1)
1.一种利用非特异性结合蛋白来提高基于PCR的基因合成技术灵敏度的方法，其特征在于：通过如下步骤实现：
S1：设计需要合成的DNA序列，得到混合重叠寡核苷酸；其中，每个序列都有25bp的重叠寡核苷酸，以覆盖整个DNA序列(200到1500碱基)；
S2：将含有脱氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核苷酸引物，以及作为模板的上述混合重叠寡核苷酸的反应液中加入HU蛋白原液；其中，HU蛋白原液的浓度为130ng/μl；
S3：按照常规PCR的解链，退火，延伸三个步骤进行反复的循环，将目的核酸片段合成并且扩增。
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