KR20200092205A - Cas10/Csm4를 이용한 사이클릭 올리고아데닐레이트 제조방법 - Google Patents

Cas10/Csm4를 이용한 사이클릭 올리고아데닐레이트 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Cas10/Csm4를 이용한 사이클릭 올리고아데닐레이트(cOA) 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 CRISPR Ⅲ-A형의 Cas10/Csm4 서브복합체, 상기 Cas10/Csm4 서브복합체와 ATP의 반응시 타깃 RNA 없이 신규한 물질인 사이클릭 올리고아데닐레이트(cyclic oligo-adenylate (cOA))를 제조하는 방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 cOA, 상기 Cas10/Csm4 서브 복합체를 포함하는 cOA 합성용 조성물, 및 cOA 합성용 키트에 관한 것이다.

Description

Cas10/Csm4를 이용한 사이클릭 올리고아데닐레이트 제조방법 {The preparation method of cyclic oligoadenylate using Cas10/Csm4}
본 발명은 Cas10/Csm4 서브 복합체 및 이를 이용한 사이클릭 올리고아데닐레이트(cOA) 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 CRISPR Ⅲ-A형의 Cas10/Csm4 서브복합체, 상기 Cas10/Csm4 서브복합체와 ATP의 반응시 타깃 RNA 없이 신규한 물질인 사이클릭 올리고아데닐레이트(cyclic oligo-adenylate (cOA))를 제조하는 방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 cOA, 상기 Cas10/Csm4 서브 복합체를 포함하는 cOA 합성용 조성물, 및 cOA 합성용 키트에 관한 것이다.
지구상에 다양하고 풍부하게 존재하는 박테리오파지(Bacteriophage)가 미생물군의 생태에 미치는 영향력은 매우 크다. 파지로부터 감염을 피하기 위한 미생물 숙주의 선천성 면역 시스템으로는 수용체 전환(receptor switching), 제한 시스템 변형(restriction modification) 등이 연구되고 있었는데, 최근 핵산서열 기반의 적응 면역 시스템이 발견되었다.
박테리아와 고세균은 외부에서 침입한 핵산서열의 일부 조각을 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat) 영역의 DNA 반복 요소 한쪽 끝에 새로이 삽입함으로써 바이러스와 플라스미드의 침입에 대한 면역성을 획득한다. CRISPR를 통한 적응면역 기전은 외부 DNA의 습득, CRISPR RNA(crRNA)의 생합성, 표적 간섭(target interference)의 세가지 단계로 구분할 수 있다. 상기 단계는 CRISPR 시스템에 일반적이지만, CRISPR 유전자자리와 각 단계에 관여하는 단백질은 매우 다양하다.
CRISPR는 염색체상에서 공통적인 구조로 나타나는 반복 DNA(repeat DNA)로서, 각 CRISPR 유전자자리는 20-50bp의 짧은 반복서열(repeat sequence) 시리즈와 이들 사이의 각각의 고유한 간격서열(spacer sequence)로 구성되어 있다. 상기 반복서열의 계통발생학적 유사성을 근거로 CRISPR을 분류하며, CRISPR의 계통발생학적 분포는 불균등하게 약 90%의 고세균류와 약 50%의 박테리아 게놈(genome)에서 발견된다.
한편, 각각의 CRISPR 부근에는 다양한 cas 유전자들이 존재한다. CRISPR 및 Cas 단백질은 함께 작용하며, 2가지 class, 6가지 Cas 타입과 각각의 서브타입으로 분류할 수 있다(class 1: typeⅠ A-U, typeⅢ A-D, typeⅣ A-B, class 2: typeⅡ A-C, typeⅤ, type Ⅵ).
CRISPR Ⅲ-A형 은 다양한 단위체로 구성된 Csm 복합체를 형성한다. 상기 Csm 복합체가 신규 신호물질을 생산하는 것은 최근에 밝혀졌다.
종래, 상기 Csm 복합체는 세포 내(in vivo)에서만 구성이 되며, cOA를 생산하기 위해서는 타깃 RNA를 첨가하여야만 하였다.
이에, 신규 물질인 cOA의 효율적이고 용이한 생산, 고순도로 대량 생산이 가능한 cOA 제조방법의 개발이 요구되고 있다.
본 발명자들은 cOA 제조방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, Cas10/Csm4 서브복합체를 제조하고, 이를 이용할 경우, 타깃 RNA 또는 ssDNA 없이도 cOA를 제조할 수 있음을 확인하였다. 이에, 상기 서브 복합체를 이용한 cOA의 제조방법을 개발하였고, 상기 제조방법에 의해 제조된 cOA, 상기 Cas10/Csm4 서브 복합체를 포함하는 cOA 합성용 조성물, 및 cOA 합성용 키트를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 Cas10/Csm4 서브 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 Cas10/Csm4 서브 복합체와 ATP를 반응시키는 단계를 포함하는, 사이클릭 올리고아데닐레이트(cyclic oligo-adenylate (cOA)) 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 제조방법으로 제조된, cOA를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 Cas10/Csm4 서브 복합체를 포함하는 cOA 합성용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 Cas10/Csm4 서브 복합체를 포함하는 cOA 합성용 키트를 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 Cas10/Csm4 서브 복합체를 제공한다.
본 발명의 "크리스퍼(CRISPR)"는 규칙적으로 사이 간격을 두고 분포하는 짧은 회문 구조의 반복 서열로서, 박테리아 또는 고세균 세포에 의해 외래 DNA를 파괴하는 데 사용되는 유형 Ⅰ, Ⅱ, 또는 Ⅲ의 DNA 절단 시스템의 인자를 암호화하는 특정 유전자자리(유전자좌)를 말한다.
본 발명의 "Ⅲ형 크리스퍼 시스템" 및 "Ⅲ형 크리스퍼-Cas 시스템"은 본원에서 상호적으로 사용되며, 기능복합체에 기초하여 Csm을 포함하는 Ⅲ-A형과 측을 포함하는 Ⅲ-B형으로 분류된다. 상기 Ⅲ형 크리스퍼 시스템은 세포에 위협이 되는 전사가 시작될 때까지 외래 DNA를 무시하며, 이러한 과정을 통해 숙주가 항생제 내성 유전자와 같은 프로파지(prophage)에 포함된 유리한 유전자를 획득하는 이점을 갖는다. Ⅲ형 시스템은 PAM이 결여된 것이 특징인데, 크리스퍼(CRISPR) 자리에서의 자가 면역을 피하기 위해 Csm 또는 Cmr 복합체는 crRNA의 반복 유래 서열과 표적 간의 상보성을 확인하여 완전 일치하는 경우에는 절단하지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 구현 예에서, 상기 Ⅲ형 시스템은 Cas10/Csm4 서브 복합체를 구성하는 고세균 유래 Ⅲ-A형 시스템일 수 있으며, 상기 고세균은 써모코커스(Thermococcus) 속 미생물일 수 있으며, 보다 구체적으로 써모코커스 온누리누스(Thermococcus onnurineus)일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 써모코커스 온누리네우스 NA1 (Thermococcus onnurineus NA1)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "Cas"는 크리스퍼-결합 엔도뉴클레아제이며, cas 유전자에 의해 암호화되는 Cas 단백질이다. 적합한 RNA 성분과 복합체인 경우, Cas 엔도뉴클레아제는 특정 DNA 표적 서열의 전부 또는 일부를 절단할 수 있다. Cas 엔도뉴클레아제는 표적 서열에서 DNA 이중 가닥을 풀 수 있고, Cas와 복합체인 crRNA 또는 가이드 RNA에 의한 표적 서열의 인식에 의해 매개되는 바와 같이, 적어도 하나의 DNA 가닥을 절단한다.
상기 "crRNA(크리스퍼 RNA)"는 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체를 형성할 수 있어 복합체에 DNA 결합 특이성을 제공하는 RNA 서열이다. crRNA는 DNA 표적 서열의 가닥에 상보적인 가변 표적화 도메인(VT)을 포함하기 때문에 DNA 결합 특이성을 제공하다. crRNA는 crRNA가 유래된 크리스퍼 유전자자리의 반복 영역에 의해 암호화되는 반복 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 "Csm"은 Ⅲ형 크리스퍼-카스(CRISPR-Cas) 시스템에서 처리 및 간섭 시 다중 단백질 CRISPR RNA(crRNA)-이펙터 복합체에 의해 매개되는데, 이 때 형성되는 복합체를 구성하는 구조체이다. 상기 Csm 복합체는 Cas10(또는 Csm1), Csm2, Csm3, Csm4, Csm5 및 Csm6 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
상기 Csm 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다. 구체적으로, 상기 Csm 단백질은 설포로버스 솔파타리쿠스 (Sulfolobus solfataricus), 테르무스 테르모필리루스 (Thermus thermophilus), 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus), 스타필로코코스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermis) 및 써모코커스 온누리네우스(Thermococcus onnurineus)유래일 수 있고, 구체적으로, 써모코커스 온누리네우스 NA1 (Thermococcus onnurineus NA1) 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "복합체"는 Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, 및 crRNA가 상호 작용하여 형성된 거대 단백질 및 핵산의 복합 분자를 의미하며, "단위체"는 상기 복합체를 형성할 수 있는, 결합되지 않은 형태의 소단위 단백질인 Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, 및 crRNA를 의미한다.
본 발명의 "서브 복합체"는 고분자를 이루는 기본 구조체이고, 복합체를 구성하는 아단위체로서, 복합체의 형성 전, 상기 단위체가 1개 이상 결합한 상태를 의미한다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 복합체는 Ⅲ-A형 CRISPR의 Csm 복합체일 수 있고, 상기 복합체를 이루는 아단위체로서 기능을 하는 서브 복합체는 Cas10/Csm4 서브 복합체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "Cas10"은 본 발명에서 Csm1과 혼용되어 사용될 수 있고, 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 상기 서열번호 1의 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 특히 구체적으로는 97% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 코딩하는 아미노산 서열이라면 제한없이 포함한다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명의 "상동성"은 상기 Cas10 단백질을 코딩하는 유전자의 아미노산 서열에 있어서, 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 정렬(align)시킨 후 서열 간의 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
상기 "Csm4"는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 상기 서열번호 2의 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 특히 구체적으로는 97% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 코딩하는 아미노산 서열이라면 제한없이 포함한다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
상기 "상동성"은 전술한 바와 같다.
본 발명의 "Cas10/Csm4 서브 복합체"는 Csm 복합체의 일부 구성요소인 Cas10 및 Csm4로 이루어진 서브 복합체로서, 구체적으로 서열번호 1의 Cas10 및 서열번호 2의 Csm4로 이루어진 것일 수 있다. 본 발명의 Cas10/Csm4 서브 복합체는 수용성(soluble) 상태로 제조되는 것일 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 Cas10/Csm4 서브 복합체는 타깃 RNA 또는 ssDNA 없이 cOA를 제조할 수 있음을 확인하였으며, 이는 시험관 내(in vitro)에서 상기 서브 복합체가 cOA를 생산할 수 있음을 시사한다. 즉, 세포 내(in vivo)에서 복합체의 구성, 정제 등을 요하지 않아 용이하게 cOA의 대량 생산이 가능한 이점을 갖는다.
상기 "타깃 RNA(target RNA)"는 오탄당의 일종인 리보스를 기반으로 뉴클레오티드를 이루는 핵산을 말한다. DNA의 일부가 전사되어 생성되며, 단백질을 합성하는 과정에 작용하며, RNA는 효소로 기능을 할 수 있다. 상기 타깃 RNA는 특정 반응에서 표적으로 하는 RNA를 말한다.
상기 "ssDNA"는 단일가닥의 DNA로서, 상기 DNA는 핵산의 일종으로 세포의 핵 안에서 유전정보를 저장하는 물질이다.
Ⅲ형-Csm 복합체는 상보적 서열의 타깃 RNA를 crRNA에 의해 결합시키고, crRNA의 유도 영역(guide region)에 해당하는 타깃 RNA를 절단할 수 있다. 또한, Csm 복합체는 상보적인 RNA 전사체의 결합 없이 서열 특이적으로 표적 ssDNA 기질을 절단할 수 있다.
한편, 본 발명의 Cas10/Csm4 서브 복합체는 상기 타깃 RNA 또는 ssDNA 없이 cOA를 제조할 수 있다는 점에 특징이 있다.
본 발명의 "시험관 내(in vitro)"는 살아있는 생명체 내부가 아니라 시험관과 같이 제어가 가능한 환경에서 수행되는 실험 과정을 말한다. 상기 시험관 내부의 환경에서는 다양한 변인을 용이하게 통제할 수 있어 효율적으로 결과를 확인할 수 있다.
상기 "정제"는 불순물을 제거하고 화합물의 순도를 높이기 위해 이루어지는 과정을 말한다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 정제는 세포 외, 즉 시험관 내에서 이루어지며, Cas10/Csm4 서브 복합체 및 cOA를 제조하는 방법일 수 있다.
본 발명의 Cas10/Csm4 서브 복합체는 Csm 단백질 단위체가 결합하여 cOA를 생산할 수 있는 구조 및 기능을 갖는다면, 당업계의 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 구체적으로, 실시예 1에 기재된 제조방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제한되지 않는 서브 복합체의 제조방법으로는, 공동 형질 전환(Co-transformation), 이중 발현 벡터(Duet-vector)를 이용한 공동 발현(Co-expression), 개별 단위체 단백질 발현 후 혼합 등이 있을 수 있다.
본 발명의 Cas10/Csm4 서브 복합체를 제조하는 방법은 상기 제조된 Cas10/Csm4 서브 복합체를 정제하는 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 Cas10/Csm4 서브 복합체를 정제하는 단계는 당업계의 공지된 임의의 방법으로 수행될 수 있고, 구체적으로는 실시예 1을 참조할 수 있으나, 제조된 Cas10/Csm4 서브 복합체의 순도를 높일 수 있는 방법이라면 제한 없이 이용될 수 있다.
비제한적인 정제 방법으로는 친화성 크로마토그래피, 크기-배제　크로마토그래피　또는 이온 교환　크로마토그래피를 포함하는 다양한 공지의 방법들을 적용할 수 있으며, 필요에 따라서는 보다 높은 순도로 정제하기 위해 복수개의 서로 다른 방법을 조합하여 사용할 수 있다.
상기 "친화성 크로마토그래피"는 특정 분자와 분석 물질간의 친화성의 차이에 기반을 두는 크로마토그래피 기법이다. 단백질을 히스티딘, 바이오틴, 또는 항원으로 표식을 해두면 정지상에 특이적으로 결합한다. 정제 과정이 종료되면, 상기 표식은 제거되고 순수한 단백질을 수득하게 된다.
상기 "크기 배제 크로마토그래피"는 물질의 크기에 따라 칼럼을 통과하는 속도가 다른 특성을 이용하여 분리하는 크로마토그래피 기법이다. 작은 분자는 상대적으로 용출 속도가 느리고, 큰 분자는 이동상을 따라 빠르게 용출된다. 상기 기법은 정제 과정의 초기 단계에서 이용된다.
상기 "이온 교환 크로마토그래피"는 물질의 전하 차이를 이용한 크로마토그래피 기법이다. 전하를 띠지 않는 정지상을 사용하며, 전하를 띠는 이온, 아미노산, 단백질을 분리하기 위해 사용된다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, Cas10/Csm4 서브 복합체는 상기 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 Cas10/Csm4 서브 복합체와 ATP를 반응시키는 단계를 포함하는, 사이클릭 올리고아데닐레이트(cyclic oligo-adenylate (cOA)) 제조방법을 제공한다.
본 발명의 "Cas10/Csm4 서브 복합체"는 상기에서 기재된 바와 같다.
본 발명의 "ATP"는 아데노신 삼인산(adenosine triphosphate)으로, 아데노신에 3분자의 인산이 결합한 뉴클레오티드이다. 생체 내 에너지의 저장, 공급, 및 운반을 중개하고 있는 중요한 물질로서 아데노신 이인산(ADP)로 가수분해 됨에 따라 에너지를 방출한다.
본 발명의 "사이클릭 올리고아데닐레이트(cyclic oligo-adenylate (cOA))"는 항바이러스 2차 신호전달 물질로서 일종의 RNA 분해효소로서, AMP의 3 내지 6으로 구성된 고리로 이루어져 있고, Ⅲ형 CRISPR 이펙터 복합체에 의해 ATP로부터 변환되어 생성된다.
본 발명의 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 ATP는 Cas10/Csm4 서브 복합체와 반응하여 사이클릭 올리고아데닐레이트(cyclic oligoadenylate (cOA))로 변환됨을 확인하였다. 다만, 상기 Cas10 단일의 단위체만으로는 cOA 물질이 생산되지 않으며, 본 발명의 Cas10/Csm4 서브 복합체에서 cOA가 생산됨을 확인하였다. 이는, Csm 복합체와 타깃 ssDNA 또는 RNA를 함께 배양하였을 때 생산되는 cOA와 유사한 수준임을 확인하였다(도 5).
본 발명의 다른 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 Cas10/Csm4 서브 복합체는 ATP와 결합할 수 있음을 확인하였고(도 4), 타깃 RNA 없이 상기 서브 복합체에서 cOA가 생산될 수 있음을 확인하였다(도 5). 따라서, 타깃 RNA 분해 없이 cOA가 생산되므로, 지속적으로 cOA의 대량 생산이 가능한 이점이 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 Cas10/Csm4 서브 복합체와 ATP의 반응은 40℃ 내지 60℃, 20분 내지 60분의 조건에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 Cas10/Csm4 서브 복합체와 Cas10/Csm3 서브 복합체의 cOA 생산을 비교분석하기 위해 각각의 서브 복합체를 제조하고 ATP와 반응시켜 본 결과, Cas10/Csm4 서브 복합체에서 타깃 RNA 없이 ATP와 반응하여 cOA를 생산하는 것을 확인하였고, 다른 서브 복합체인 Cas10/Csm3에서는 cOA가 생산되지 않는 것을 확인하였다(도 7).
본 발명의 "cOA 제조방법"은 상기 생산된 cOA를 정제하는 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 cOA를 정제하는 단계는 당업계의 공지된 임의의 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 정제 방법으로는 친화성 크로마토그래피, 크기-배제　크로마토그래피　또는 이온 교환　크로마토그래피를 포함하는 다양한 공지의 방법들을 적용할 수 있으며, 필요에 따라서는 보다 높은 순도로 정제하기 위해 복수개의 서로 다른 방법을 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 "친화성 크로마토그래피", "크기 배제 크로마토그래피", 및 "이온 교환 크로마토그래피"는 상기에서 기재된 바와 같다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 제조방법으로 제조된, cOA를 제공한다.
본 발명의 "cOA"는 항바이러스 2차 신호전달 물질로서 일종의 RNA 분해효소이다. cOA는 AMP의 3 내지 6으로 구성된 고리로 이루어져 있고, Ⅲ형 CRISPR 이펙터 복합체에 의해 ATP로부터 변환되어 생성된다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 Cas10/Csm4 서브 복합체를 포함하는 cOA 합성용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "Cas10/Csm4 서브 복합체", 및 "cOA"는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 "합성"은 화학반응을 통해 목적하는 화합물을 생성하는 과정을 말한다. 목적하는 물질을 수득할 때까지 여러 단계의 화학 반응이 일어날 수 있으며, 각 단계에서 부수하여 화학적, 물리적인 단리·정제·분석이 이루어질 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 합성은 cOA를 목적하는 화합물로서 수득하는 과정일 수 있으며, 상기 cOA는 ATP로부터 생성될 수 있다.
본 발명의 "cOA 합성용 조성물"은 타깃 RNA 없이 cOA를 합성하는 Cas10/Csm4 서브 복합체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 cOA 합성용 조성물을 이용하여 시험관 내(in vitro) 조건에서 타깃 RNA의 부존재 하에서 cOA를 생산하는데 이용될 수 있다. 상기 조성물은 상기 서브 복합체에 안정화 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 Cas10/Csm4 서브 복합체를 포함하는 cOA 합성용 키트를 제공한다.
본 발명의 용어 "Cas10/Csm4 서브 복합체", "cOA", 및 "합성"은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 "키트"는 특정한 목적을 둔 구성물 세트를 의미하며, 본 발명에서 특정한 목적은 cOA 합성용이고, 상기 구성물로는 Cas10/Csm4 서브 복합체, ATP, cOA 합성용 시약, 및 완충용액을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 완충용액은 Tris-HCl, NaCl, 및 β-merchaptoethanol을 포함할 수 있다.
본 발명의 "cOA 합성용 키트"는 타깃 RNA 없이 cOA를 합성하는 Cas10/Csm4 서브 복합체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 cOA 합성용 조성물을 이용하여 시험관 내(in vitro) 조건에서 타깃 RNA의 부존재하에서 cOA를 생산하는데 이용될 수 있다.
또한, 상기 키트는 cOA의 합성에 있어서, 높은 정확도와 우수한 합성능, 증폭능을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 본 발명의 Cas10/Csm4 서브 복합체를 이용한 cOA 제조방법은 시험관 내에서 cOA의 대량 생산이 가능하고, 타깃 RNA 분해 없이 지속적으로 cOA의 생산이 가능하다.
본 발명의 Cas10/Csm4 서브 복합체를 이용한 cOA 제조방법은 시험관 내에서 cOA의 대량 생산이 가능하고, 타깃 RNA 분해 없이 지속적으로 cOA를 생산할 수 있다.
도 1은 시험관 내(in vitro)에서 Cas10/Csm4 서브 복합체의 정제 및 cOA 합성 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 Cas10/Csm4 서브 복합체를 친화성 크로마토그래피와 크기 배제 크로마토그래피를 통해 분리하고 정제한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 Cas10/Csm4 서브 복합체의 구조를 나타낸 도이다.
도 4는 Cas10과 Csm4 사이에 ATP 결합 위치를 나타낸 도이다.
도 5는 ATP가 신규한 물질인 cOA로 전환되는 것을 확인한 도이다.
도 6은 Cas10과 Csm4 사이의 ATP 결합 및 cOA 합성을 수반하는 주요 잔기를 나타낸 도이다.
도 7은 Cas10/Csm4 서브 복합체, Cas10/Csm3 서브 복합체, Cas10 단일 구조체, Csm 복합체와 타깃 RNA 배양 시 ATP와의 반응 결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: Cas10/Csm4 서브 복합체의 제조
1-1. 클로닝 및 단백질 정제
본 발명의 Cas10/Csm4 서브 복합체 제조를 위해, Cas10(ToCsm1) 및 ToCsm4 (Ton_0893 및 Ton_0896)를 코딩하는 유전자를 Thermococcus onnurineus NA1 게놈 DNA로부터 PCR로 증폭하였다.
Cas10 및 Csm4 유전자를 디자인된 프라이머(서열번호 3의 Cas10의 F-primer, 서열번호 4의 Cas10의 R-primer, 서열번호 5의 Csm4의 F-primer, 및 서열번호 6의 Csm4의 R-primer) 및 n-Pfu 특수 중합 효소(Enzynomics)를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 95℃에서 2초간 변성(denaturation) 후 95℃에서 10초 변성, 62℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 1분 30초(Cas10), 30초(csm4) 신장(elongation) 및 30 초 최종 신장은 72℃에서 5분간 지속시켰다.
이후, PCR 생성물은 AccuPrep® Gel Purification Kit (Bioneer)를 사용하여 정제하였다. 클로닝(cloning)을 위한 pRSFD-1 벡터는 2개의 표적 유전자의 동시 발현을 위한 2개의 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함한다. 2개의 유전자를 연결하는 동안, Csm4와 Cas10의 순서로 연결(ligation)을 수행하여 이미 클로닝된 유전자의 절단을 방지하였다.
pRSFD 벡터를 37℃에서 30분 동안 Nde1 및 Kpn1을 사용하여 이중 소화(double digestion)시키고, DNA를 1% 아가로스겔 및 겔추출키트(Bioneer)를 사용하여 정제하였다. 정제된 벡터와 PCR 생성물인 삽입물(insert)를 1:2의 비율로 혼합하고 EZ-Fusion Cloning Core Kit (Enzynomics)를 사용하여 37℃에서 15분간 반응시켰다.
Csm4를 MCS2(다중 클로닝 사이트 2)에 클로닝한 후, 동일한 방식으로 BamH1 및 HindⅢ를 사용하여 Cas10을 MCS1에 클로닝하였다. 재조합 플라스미드를 대장균 DH5α로 형질전환하고 재조합 DNA의 염기서열을 시퀀싱(Solgent)으로 확인하였다.
1-2. Cas10/Csm4 의 발현 및 용해도 테스트
발현 테스트를 수행하여 Cas10 및 Csm4 단백질의 동시 발현을 확인하였다. 플라스미드 DNA를 단백질 발현을 위한 숙주인 대장균 BL21-RIL로 형질전환시키고, 37℃에서 밤새 50ug/ml 카나마이신을 함유한 한천(agar) 플레이트에서 배양하였다. 콜로니를 채취하고 37℃에서 200ml LB 배지에서 배양하여 0.8의 OD 값에 도달시켰다. 단백질 발현은 0.5mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 18℃에서 16시간 동안 첨가하여 유도하였다. 세포를 원심분리기(4000rpm, 30분)로 수집하고 용해 완충액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤(Glycerol), 5 mM
Figure pat00001
-머캅토에탄올(mercaptoethanol))으로 초음파처리하여 단백질을 수득하였다. 발현된 단백질은 SDS-PAGE로 동정되었다.
1-3. 박테리아 세포 배양 및 정제
상기 발현 실험으로부터 얻은 결과에 기초하여, 총 9L Luria-Bertani(LB) 브로스 배지에서 대규모 세포 배양을 수행하였다. Casl0과 Csm4는 50ug/ml 카나마이신이 보충된 LB 배지 내 37℃에서 OD 값이 0.8까지 자라며, 동시에 발현된 단백질을 생산하기 위해 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)는 18℃에서 16시간동안 최종 농도가 0.5mM/L가 되도록 첨가되었다.
세포를 4000rpm에서 30분간 원심분리하여 수집하고, 초음파 처리(진폭-60%, 펄스-1초 온(on)/3초 오프(off), 총 시간은 1분, 6회)에 의해 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤(Glycerol), 5mM β-머캅토에탄올(mercaptoethanol), 1mM 페닐메틸술포닐플루오라이드(PMSF) 완충용액 내에서 세포를 용해시킨다.
세포가 용해되고 원심분리(13000rpm, 20분)된 후, 65℃에서 5분동안 정제를 위해 열 처리를 하였다. 원심분리 후, 가용성 상등액을 AKTA FPLC 시스템(GE Healthcare)으로 친화성 크로마토그래피 His-Trap HP 칼럼으로 정제하였다. 로딩버퍼는 용해 완충액과 동일하고, 용출 완충액은 로딩 완충액에 250mM 이미다졸(imidazole)을 첨가하였다. 용출된 분획은 Cas10/Csm4를 함유하였고, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 5 mM β-머캅토에탄올 완충용액에서 크기 배제 크로마토그래피로 연속적으로 적용하였다. 단백질 농도는 용출 완충액을 대조군을 사용하여 나노드랍(nanodrop)으로 결정하였다. 단백질의 순도 및 겉보기 분자량은 SDS-PAGE로 분석하였다.
실시예 2: Cas10/Csm4 서브 복합체와 ATP의 반응 확인
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조한 Cas10/Csm4 서브 복합체의 구조를 분석하고, Csm 복합체 전체를 요하지 않고 cOA를 생산할 수 있는지 확인하고자 하였다.
2-1. Cas10/Csm4 서브 복합체 내 ATP 결합 부위 확인
Cas10과 Csm4 사이에 입구(entrance hole)에 ATP 결합 부위가 있음을 확인하였다(도 4). Cas10/Csm4 서브복합체 구조 분석 결과, Cas10에 존재하는 2개의 Palm 도메인에 ATP가 직접적인 결합을 하고 있었으며, ATP 결합 부위의 한 단면을 Csm4가 구성하고 있는 것을 확인하였다.
2-2. Cas10/Csm4 서브 복합체와 ATP의 반응
Cas10/Csm4 서브 복합체와 ATP의 반응을 위해 55℃, 40분 동안 반응 완충액(25 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM KCl)에서 함께 배양하였다.
실시예 3: Cas10/Csm4 서브 복합체의 타깃 RNA 필요 여부 확인
Cas10/Csm4 서브 복합체에 의해 생성된 생산물을 동정하기 위해 반응 완충액(25 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM KCl)에서 1μM Cas10/Csm4 서브 복합체, 500μM ATP 및 5 mM NiSO4를 55℃에서 40분 동안 배양하였다.
본 발명의 Cas10/Csm4 서브 복합체는 타깃 ssDNA(또는 RNA) 없이 ATP와 반응하여 cOA가 합성됨을 확인하였다. 반면, Csm 복합체는 ATP와 반응하여 신규 물질인 cOA를 합성하는 데 타깃 ssDNA(또는 RNA)가 필요하고, Cas10의 단일 단백질 구조체일 경우, cOA 합성이 되지 않는 것을 확인하였다(도 5).
즉, Csm 복합체와 타깃ssDNA(또는 RNA)를 함께 배양(incubation) 시 cOA 합성되는 것과 Cas10/Csm4 서브 복합체와 ATP의 반응시 타깃 ssDNA(또는 RNA) 없이 cOA가 합성되는 결과는 cOA 산물을 생산한다는 점에서 유사하지만, 본 발명의 Cas10/Csm4 서브 복합체는 타깃 ssDNA(또는 RNA) 없이 수행된다는 점에서 보다 효율적이다.
또한, 상기 cOA는 Cas10과 Csm4의 양성 전하 잔기와 ATP의 인산기(phosphate group)가 상호작용하고, Cas10의 방향족 잔기(aromatic residue)가 ATP의 염기(base)와 상호작용하는 자리에서 합성되는 것을 확인하였다(도 6).
실시예 4: Cas10/Csm4 서브 복합체와 다른 복합체(또는 단위체)의 cOA 생산 비교
Cas10/Csm4 서브 복합체와 다른 복합체 또는 단위체의 cOA 생산을 비교분석하기 위해, 반응 완충액(25 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM KCl)에서 1μM Cas10/Csm4 서브 복합체, 1μM Cas10/Csm4 서브 복합체 돌연변이체, 1μM Cas10/Csm3 서브 복합체, 1μM Cas10 단일 구조체, 1μM Csm 복합체(+ 20uM 타깃 RNA), 500μM ATP 및 5 mM NiSO4를 55℃에서 40분 동안 배양하였다. Cas10/Csm4 서브 복합체 돌연변이체는 아미노산 단일 치환법을 이용하여 Cas10/Csm4 서브 복합체 중 cOA를 생산하는 Cas10의 주요 잔기인 589번 아스파르트산을 알라닌으로 치환하여 생산하였다.
그 결과, Cas10/Csm4 서브 복합체에서 타깃 RNA 없이 ATP와 반응하여 cOA를 생산하는 것을 확인하였고, 다른 서브 복합체인 Cas10/Csm3에서는 cOA가 생산되지 않는 것을 확인하였다. 또한 Cas10/Csm4 서브 복합체의 돌연변이체와 Cas10 단일 구조체에서는 cOA가 생산되지 않았다(도 7).
이는, cOA 생산을 위해서 Cas10/Csm4 서브 복합체가 중요한 구조체임을 시사한다. 특히, Cas10 단일 구조체에서는 cOA가 생산되지 않는 결과를 통해, Cas10/Csm4 서브 복합체의 Csm4 단위체에서 ATP와 반응하여 cOA를 생산하는 것으로 판단된다. 이는 Csm 복합체의 cOA 합성 메커니즘에 있어서 Csm4가 중요한 역할을 담당하고 있음을 시사하고, Cas10/Csm4 서브 복합체만으로도 cOA가 합성됨을 통해 보다 용이하고 효율적으로 cOA를 생산할 수 있음을 본 발명을 통해 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 Cas10/Csm4 서브 복합체를 이용한 cOA 제조방법은 시험관 내(in vitro)에서 cOA의 대량 생산이 가능하며, 타깃 RNA 분해 없이 지속적으로 cOA를 생산할 수 있어 cOA 생산을 위해 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> The preparation method of cyclic oligoadenylate using Cas10/Csm4 <130> KPA181246-KR <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 777 <212> PRT <213> Thermococcus onnurineus <400> 1 Met Glu Ile Asp Glu Leu Thr Ala Leu Gly Gly Leu Leu His Asp Ile 1 5 10 15 Gly Lys Pro Val Gln Arg Ala Gly Leu Tyr Ser Gly Asp His Ser Thr 20 25 30 Gln Gly Ala Arg Phe Leu Arg Asp Leu Ala Glu Asn Thr Gly Arg Ala 35 40 45 Glu Tyr Glu Leu Leu Ser Leu Phe Ser Glu Phe His His Lys Gly His 50 55 60 Met Lys Asn Asp Glu Leu Met Ile Arg Arg Ile Lys Glu Leu Ser Pro 65 70 75 80 Glu Arg Phe Gly Leu Thr Met Glu Asp Val Leu Asn Ala Leu Trp Ile 85 90 95 Val Tyr Glu Ala Asp Asn Leu Ala Ser Gly Glu Arg Glu Glu Gly Gln 100 105 110 Pro Gln Ala Ser Arg Pro Leu Tyr Ser Val Phe Asn Pro Gly Lys Ala 115 120 125 Tyr Pro Trp Ala Glu Leu Asp Phe Glu Lys Glu Leu Pro Val Pro Gly 130 135 140 Asp Val Phe Ser Ile Arg Ser Gln Asp Tyr Arg Glu Leu Val Lys Arg 145 150 155 160 Leu Trp Glu Glu Leu Ser Lys Ala Lys Leu Arg Ser Asp Arg Leu Leu 165 170 175 Pro Val Leu Glu Lys Tyr Leu Thr Phe Val Ser Ser Val Thr Ser Glu 180 185 190 Gly Asn Ile Ile Ser Leu Tyr Asp His Met Arg Met Thr Ser Ala Ile 195 200 205 Ala Leu Ala Met Leu Arg Ala Gly Cys Thr Ala Glu Asp Val Arg Ser 210 215 220 Gly Arg Cys Arg Lys Glu Lys Arg Phe Leu Leu Ile Glu Gly Asp Phe 225 230 235 240 Ser Gly Ile Gln Asp Phe Ile Tyr Arg Val Ser Gly Lys Gly Thr Leu 245 250 255 Lys Tyr Leu Arg Ala Arg Ser Ala Tyr Leu Glu Leu Ile Gly Trp Asp 260 265 270 Val Val Leu Glu Ile Leu Ser Arg Leu Gly Leu Thr Arg Ala Asn Val 275 280 285 Val Phe Asn Ala Gly Gly His Phe Met Ile Ile Ala Gln Asn Thr Pro 290 295 300 Asp Ala Val Lys Glu Leu Glu Glu Ile Arg Ala Lys Ala Val Glu Trp 305 310 315 320 Leu Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Asp Leu Tyr Leu Ala Ile Glu Trp Glu 325 330 335 Pro Val Ser Gly Arg Glu Phe Gly Arg Glu Gly Gly Lys Asn Leu Phe 340 345 350 Ala Glu Ala Arg Lys Arg Leu Lys His Lys Leu Thr Val Arg Lys Leu 355 360 365 Lys Arg Phe Gly Glu Ile Lys Gly Leu Phe Glu His Gly His Thr Glu 370 375 380 Arg Leu Ala Glu Cys Pro Val Cys Gly Arg Glu Leu Pro Glu Gly Lys 385 390 395 400 Leu Glu Pro Ser Ala Ser Asp Pro Glu Thr Lys Val Cys Pro Thr Cys 405 410 415 Asn Arg Leu Val Ser Leu Gly Gly Asn Leu Pro Lys Leu Leu Gly Phe 420 425 430 Gly Arg Thr Ala Lys Asn Asp Ala Gly Val Leu Val Glu Gly Pro Phe 435 440 445 Ser Gly Phe Val Pro Tyr Leu Gln Gly Gly Arg Pro Val Gly Glu Gln 450 455 460 Ile Leu Val Lys Asn Thr Leu Asn Pro Gly Glu Ile Pro Glu Ser Ala 465 470 475 480 Gln Phe Val Pro Tyr Phe Val Ala Asp Tyr Phe Lys Lys Asp Pro Lys 485 490 495 Gly Gly Val Ala Thr Phe Glu Glu Leu Ser Met Ala Ser Thr Gly Thr 500 505 510 Arg Arg Leu Gly Val Met Lys Gly Asp Val Asp Arg Leu Gly Glu Phe 515 520 525 Phe Ser Ser Met Asp Ser Pro Ser Lys Leu Ala Thr Ala Ser Arg Phe 530 535 540 Met Asp Tyr Phe Phe Lys Gly Tyr Ile Gly Ala Ile Ile Glu Gly Lys 545 550 555 560 Phe Gly Tyr Ile Ile Gly Asp Val Pro Ser Leu Arg Asp Trp Pro Glu 565 570 575 Glu Pro Asp Ile Val Val Val Tyr Ala Gly Gly Asp Asp Phe Phe Ile 580 585 590 Val Gly Ala Trp Asp Gln Ile Phe Glu Leu Ala Phe Arg Val Arg Arg 595 600 605 Ala Phe Asn Ala Tyr Thr Gly Gly Lys Leu Thr Leu Ser Val Gly Leu 610 615 620 Gly Tyr Phe Asp Glu Arg Thr Pro Ile Tyr Arg Met Ala Asp Val Val 625 630 635 640 Ser Glu Arg Leu Asp Thr Ala Lys Asp Glu Gly Arg Asn Arg Val Phe 645 650 655 Val Val Gly Arg Ser Arg Pro Leu Asp Gly Lys His Lys Leu Ser Tyr 660 665 670 Glu Trp Asn His Tyr Glu Glu Leu Trp Arg Thr Tyr Ala Pro Arg Ile 675 680 685 Tyr Ala Gly Asn Gly Arg Leu Lys Gly Lys Leu Glu Ser Lys Lys Gly 690 695 700 Leu Leu Trp Lys Leu Leu Glu Ile Arg Glu Leu Tyr Val Arg Asp Pro 705 710 715 720 Asn Asp Val Arg Trp Ala Tyr Leu Thr Ala Tyr Leu Leu Gly Arg His 725 730 735 Gly Leu Ser Asp Leu Phe Pro Glu Leu Val Gly Ile Asp Thr Lys Ala 740 745 750 Val Glu Arg Lys Glu Pro Gln Pro Val Tyr Trp Val Asp Gly Val Leu 755 760 765 Lys Ile Val Leu Met Ala Val Arg Arg 770 775 <210> 2 <211> 289 <212> PRT <213> Thermococcus onnurineus <400> 2 Met Pro Lys Phe Ile Ala Val Lys Leu Ile Pro Lys Gly Pro Phe Arg 1 5 10 15 Asp Ile Pro Arg Ala Asp Thr Leu Phe Gly Ala Ile Gly Asn Ala Ile 20 25 30 Ser Ala Ile His Gly Gln Ser Ala Val Glu Glu Leu Val Asp Ala Phe 35 40 45 Val Gly Gly Ala Arg Ile Ser Ser Ala Phe Pro Tyr Ser Gly Asp Thr 50 55 60 Tyr Tyr Leu Pro Lys Pro Leu Ser Val Glu Pro Ala Leu Glu Gly Ile 65 70 75 80 Leu Thr Gly Leu Asp Glu Glu Glu Arg Tyr Thr Thr Ala Lys Arg Leu 85 90 95 Arg Lys Ala Lys Tyr Leu Asp Leu Lys Asn Phe Glu Leu Ala Leu Arg 100 105 110 Leu Arg Pro Phe Thr Ile Pro Glu Glu Ile Pro Tyr Ala Arg Val Asp 115 120 125 Val Pro Arg Val Val Leu Asp Arg Val Thr Gln Asp Ser Ser Ile Tyr 130 135 140 Phe Trp Glu Glu Ile Arg Phe Arg Glu Lys Ser Gly Val Tyr Phe Leu 145 150 155 160 Tyr Ser Gly Pro Arg Glu Val Phe Asp Gly Tyr Ile Ala Pro Ala Met 165 170 175 Arg Phe Leu Gly Asp Thr Gly Ile Gly Gly Lys Ser Thr Trp Gly Ala 180 185 190 Gly Leu Phe Glu Val Glu Phe His Glu Met Lys Ile Asp Ala Pro Gly 195 200 205 Ser Glu Tyr Ser Val Thr Leu Ser Asn Ala Leu Pro Thr Lys Thr Pro 210 215 220 Val Leu Trp Arg Leu Leu Arg Lys Gly Gly Trp Ser Phe Gly Arg Arg 225 230 235 240 Lys Pro Arg Met Thr Phe Ile Ala Glu Gly Ser Ile Val Lys Asn Asp 245 250 255 Pro Gly Gly Met Glu Arg Leu Glu Leu Gly Leu Ser His Glu Val Tyr 260 265 270 Val Tyr Gly Leu Thr Phe Pro Leu Gly Val Glu Leu Pro Glu Gly Leu 275 280 285 Glu <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas10-F <400> 3 tcatcaccac agccaggatc catggaaatc gatgaa 36 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas10-R <400> 4 gcattatgcg gccgcaagct ttcacctcct aaccgc 36 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Csm4-F <400> 5 taagaaggag atatacatat gatgccgaag ttcatt 36 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Csm4-R <400> 6 tttaccagac tcgagggtac ctcattccag accctc 36

Claims (10)

  1. Ⅲ-A형의 CRISPR-Cas 단위체인 Cas10과 Csm4를 포함하는, Cas10/Csm4 서브 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Cas10은 서열번호 1의 아미노산 서열, 상기 Csm4는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것인, Cas10/Csm4 서브 복합체.
  3. Cas10/Csm4 서브 복합체와 ATP를 반응시키는 단계를 포함하는, 사이클릭 올리고아데닐레이트(cyclic oligo-adenylate (cOA)) 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 Cas10/Csm4 서브 복합체는 써모코커스 온누리누스(Thermococcus onnurineus) 유래인 것인, cOA 제조방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 Cas10은 서열번호 1의 아미노산 서열, 상기 Csm4는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것인, cOA 제조방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 제조방법은 시험관 내(in vitro)에서 수행되는 것인, cOA 제조방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 cOA는 상기 Cas10/Csm4 서브 복합체에서 타깃 RNA 또는 ssDNA 없이 생산되는 것인, cOA 제조방법.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된, 사이클릭 올리고아데닐레이트(cOA).
  9. 제1항의 Cas10/Csm4 서브 복합체를 포함하는, cOA 합성용 조성물.
  10. 제1항의 Cas10/Csm4 서브 복합체를 포함하는, cOA 합성용 키트.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220100392A (ko) * 2021-01-08 2022-07-15 한국생명공학연구원 5'-삼인산올리고아데닐레이트 제조방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110069283A (ko) * 2009-12-17 2011-06-23 한국해양연구원 Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ. ＮＡ1 으로부터의 유용한 유전자들

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110069283A (ko) * 2009-12-17 2011-06-23 한국해양연구원 Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ. ＮＡ1 으로부터의 유용한 유전자들

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMBO Reports, 2017, Vol.18, pp.826-840 1부.* *
NATURE, 2017, Vol.548, pp.543-548 1부.* *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220100392A (ko) * 2021-01-08 2022-07-15 한국생명공학연구원 5'-삼인산올리고아데닐레이트 제조방법

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