KR100673836B1 - 스태필로써머스 마리너스 유래의 내열성 ｄｎａ 연결효소 - Google Patents

Abstract

본 발명은 초고온성 고세균 (hyperthermophilic archaebacteria)인 스태필로써머스 마리너스 (Staphylothermus marinus) 유래의 내열성 DNA 연결효소에 관한 것이다.

스태필로써머스 마리너스 DNA 연결효소 (Staphylothermus marinus DNA ligase, Sma DNA ligase), 연결효소 연쇄반응 (ligase chain reaction, LCR), DNA 연결반응 (DNA ligation), 닉 연결 활성 (nick closing activity)

Description

스태필로써머스 마리너스 유래의 내열성 ＤＮＡ 연결효소{Thermostable DNA ligase of Staphylothermus marinus}

도 1은 스태필로써머스 마리너스 DNA 연결효소 유전자 전체를 포함하고 있는 약 1.8 kb 의 스태필로써머스 마리너스 DNA 연결효소 유전자의 위치를 나타낸다. 도 1에서 C, H, S 및 X는 각각 제한효소 ClaI, HindⅢ, SacI 및 XbaI을 나타낸다. 화살표는 스태필로써머스 마리너스 DNA 연결효소 유전자의 위치와 크기를 나타낸다.

도 2은 스태필로써머스 마리너스 DNA 연결효소의 아미노산 서열을 아케아 (Archaea) 유래의 ATP 의존성 DNA 연결효소들의 아미노산 서열과 비교하여 나타낸 것이다. 도 2에서 Sma , Ape , Pab 및 Tko는 각각 스태필로써머스 마리너스, 에어로파이럼 퍼닉스 (Aeropyrum pernix), 파이로코커스 아비씨 (Pyrococcus abyssi) 및 써머코커스 코다카렌시스 (Thermococcus kodakarensis) DNA 연결효소를 나타낸 것이며, 스태필로써머스 마리너스 DNA 연결효소와 동일한 아미노산서열은 박스로 표시하였다. 또한 밑줄은 DNA 연결반응 활성에서 중요한 역할을 하는 잘 보존된 아미노산들을 나타낸다.

도 3은 서열번호 6과 7의 프라이머를 이용하여 증폭된 PCR 산물을 대장균에 서 발현시키기 위한 발현벡터 (pESML) 구축을 보여준다.

도 4는 대장균에서 발현된 스태필로써머스 마리너스 DNA 연결효소의 정제단계에 따른 정제상태를 변성 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 결과를 나타낸 것이다. 레인 1은 IPTG로 유도하지 않은 세포파쇄물, 레인 2는 IPTG 유도 후 열처리를 하지 않은 세포파쇄물, 레인 3은 80℃에서 50분간 열처리한 후 원심분리한 상층액, 레인 4는 UNO^TM S6 컬럼 정제산물, 레인 5는 HisTrap^TM FF 컬럼 정제산물이다. 또한 M은 저분자량 마커 (low molecular weight marker)를 나타낸다.

도 5는 정제된 스태필로써머스 마리너스 DNA 연결효소를 이용하여, 다양한 보조인자 (cofactor) 사용에 따른 DNA 연결효소의 활성 정도를 상대적으로 나타낸 그래프이다.

도 6은 정제된 스태필로써머스 마리너스 DNA 연결효소를 이용하여 금속 보조인자 (metal cofactor) 사용에 따른 DNA 연결효소의 활성 정도를 상대적으로 나타낸 그래프이다.

도 7은 정제된 스태필로써머스 마리너스 DNA 연결효소를 이용하여 MgCl₂과 MnCl₂ 의 농도에 따른 DNA 연결효소 활성의 정도를 상대적으로 나타낸 그래프이다. 도 9에서 ● 및 ○는 MgCl₂ 및 MnCl₂을 각각 나타낸다.

도 8은 정제된 스태필로써머스 마리너스 DNA 연결효소 활성의 정도를 pH에 따라 상대적으로 나타낸 그래프이다.

도 9는 정제된 스태필로써머스 마리너스 DNA 연결효소의 활성의 정도를 온도에 따라 상대적으로 나타낸 그래프이다.

도 10은 정제된 스태필로써머스 마리너스 DNA 연결효소를 이용하여, 열처리에 따른 연결효소의 내열성을 상대적으로 나타낸 그래프이다. 도 9에서 ○, ●, ▲ 및 ◆은 각각 75℃, 85℃, 95℃ 및 100℃에서 열처리를 나타낸다.

도 11은 정제된 스태필로써머스 마리너스 DNA 연결효소를 이용하여, KCl 농도에 따른 DNA연결효소의 활성 정도를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 초고온성 고세균 (hyperthermophilic archaebacteria)인 스태필로써머스 마리너스 (Staphylothermus marinus) 균주 유래의 내열성 DNA 연결효소에 관한 것이다.

DNA 연결효소 (deoxyribonucleic acid ligase, DNA ligase, E. C. number 6.5.1.1)는 ATP 또는 NAD⁺의 고에너지 아데닐레이트 (high energy adenylate)를 이용하여 DNA의 3'-OH 말단과 5'-P 말단 사이의 한 가닥이 절단된 닉 (nick)이나 두 가닥 모두 절단된 DNA 단편들을 연결시키는 효소로서 DNA 복제 (replication), 재 조합 (recombination), 수리 (repair) 및 유전자 클로닝 (cloning)에 필수 효소이다 (참조: Coozzareli et al., 1967 ; Olivera and Lehman, 1976 ; Weiss and Richardson, 1967).

DNA 연결 반응 (DNA ligation)은 다음과 같은 3단계의 과정으로 이루어진다. 1) 연결효소-아데닐레이트 중간체를 형성하여 2) DNA 가닥의 5'-인산기에 아데닐레이트기를 전이하고 3) 인접한 DNA 가닥의 3'-OH 말단이 활성화 된 5'-P 말단과 반응하여 두 가닥 사이에 이인산에스테르결합 (phosphodiester bond)이 형성된다 (참조: Becker et al., 1967 ; Gumport and Lehman, 1971 ; Modrich and Lehman, 1973).

DNA 연결효소는 미생물, 바이러스, 동물 등에서 다양하게 분리되었으며, 특히 T4, T7 박테리오파아지 (bacteriophage)와 대장균에서 가장 많이 연구되었다 (참조: Armstron et al., 1983 ; Dunn and Studier, 1981 ; Ishino et al., 1986). 박테리오파아지 T4 DNA 연결효소의 in vitro 실험의 경우, 점착성 말단 (cohesive-end) 및 비점착성 말단 (blunt-end) 연결 반응 시에 ATP를 보조인자 (cofactor)로 필요로 하며 (참조: Weiss and Richardson, 1967), 대장균 DNA 연결효소의 경우에는 NAD⁺를 이용하여 점착성말단 (cohesive-end) 연결 반응을 할 수 있으며, PEG 또는 Ficoll 존재하에 비점착성말단 (blunt-end) 연결도 가능한 것으로 보고되었다 (참조: Zimmerman and Pheiffer, 1983).

최근, 내열성 DNA 연결효소를 이용한 연결효소 연쇄반응 (ligase chain reaction, 이하 ‘LCR’ 이라고 함) 기술이 소개되어, 내열성 DNA 연결효소는 유전자 조작 실험인 단순한 DNA 연결 반응에 사용될 뿐만 아니라, 유전자 변이에 의한 질병을 쉽게 확인할 수 있는 필수 효소가 되었다. 내열성 DNA 연결효소를 이용한 LCR 기술은 내열성 DNA 중합효소를 이용한 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, 이하 ‘PCR’이라고 함) 기술과 함께 임상연구에 서로 보완될 수 있는 필수적인 실험기술로 대두되었다 (참조: Barany, 1991). LCR 기술은 어떤 유전자 염기서열의 변이에 의해 발생하는 유전병 (예, sickle β^s-globin)을 PCR보다도 더욱 정확히 진단할 수 있다는 장점이 있다. 변이가 일어난 부위를 기준으로 정상적인 DNA 염기서열에 상보적인 4개의 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotides)를 각각 합성하여 프라이머 (primer)로 이용한다. PCR과 유사한 방법으로 LCR은 94℃ 1분간 변성, 65℃ 2분간 프라이머 어닐링 (annealing) / 연결반응 (ligation)의 2단계 thermocycle을 약 25-30회 정도 반복한 후, 그 반응물을 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에서 쉽게 확인할 수 있는 방법이다. 정상인 DNA는 연결 반응되어 증폭이 일어나 분자량이 커지지만, 변이가 일어난 환자의 유전자, 즉, 잘못 짝지어진 (mismatch) 올리고뉴클레오타이드들은 연결이 되지 않으므로 증폭되지 않는다 (참조: Barany, 1991).

또한, 게놈내의 다중 삼염기서열반복 (multiple trinucleotide repeats)부위를 검출할 수 있는 “RED(Repeat Expansion Detection)" (참조: Schalling et al., 1993), 특이 부위에 단일 또는 다중 점 돌연변이를 도입시키는 방법인 ” Simultaneous Mutagenesis of Multiple Sites" (참조: Rouwendal et al., 1993) 등의 방법이 개발되면서 DNA 연결효소가 다양하게 적용되고 있다.

내열성 DNA 연결효소에 관한 연구는 써머스 (Thermus) 속의 균주인 써머스 써머필러스 HB8 (Thermus thermophilus HB8) (참조: Takahashi et al., 1984 ; Barany and Gelfand, 1991 ; Lauer et al., 1991), 써머스 필리포미스 (Thermus filiformis) (참조: Kim and Kwon, 1998 ; Lee et al., 2000; Jeon et al., 2004) 등과 아케아(Archae) 균주인 디설퓨로로부스 앰비밸런스(Desulfurolobus ambivalens)(참조: Kletzin, 1992)등을 비롯해 유리아케오타 (euryarchaeota)와 크렌아케오타 (crenarchaeota) 모두에서 연구가 많이 되고 있다. 내열성 Tth DNA 연결효소는 Takahashi 등에 의해 써머스 써머필러스 HB8 균주로부터 처음으로 정제되어 생화학적인 특성이 밝혀졌으며 (참조: Takahashi et al., 1984), 1991년에 Tth DNA 연결효소 유전자가 Francis Barany 등과 Gail Lauer 등의 서로 다른 두 그룹에 의해 대장균에 클로닝되어 DNA 염기서열이 동시에 보고되었다 (참조: Barany and Gelfand, 1991 ; Lauer et al., 1991). 특히 써머스 필리포미스 DNA 연결효소(Thermus filiformis DNA ligase)는 삼차구조가 완전히 밝혀졌으며, 대장균 DNA 연결효소와 마찬가지로 NAD⁺를 필요로 하나 상당히 열에 안정하다는 특징을 가진다 (참조: Lee et al., 2000; Jeon et al., 2004).

그러나, 현재까지 초고온성 고세균인 스태필로써머스 마리너스 유래의 DNA 연결효소에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

이런 배경하에, 본 발명자는 아케아 (Archaea) 유래의 내열성 ATP 의존성 DNA 연결효소들의 보존된 부위들의 아미노산 서열을 기초로 하여 PCR을 하고, Sma DNA 연결효소 유전자 일부분을 증폭하여 밝힌 단편의 염기서열을 중심으로 5' 상류 (N 말단 아미노산) 방향의 염기서열과 3' 하류 (C 말단 아미노산) 방향의 염기서열에 해당하는 프라이머를 각각 합성하여 프라이머 워킹 (primer walking) PCR 방법으로 스태필로써머스 마리너스에서 내열성 DNA 연결효소를 동정하고 효소의 특징을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 DNA 연결효소(DNA ligase)를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 DNA 연결효소를 코딩하는 핵산 분자를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 DNA 연결효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 DNA 연결효소를 발현하는 벡터를 제조하는 단계; 상기 벡터를 숙주세포로 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 상기 형질전환체로부터 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 DNA 연결효소를 제조하는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 DNA 연결효소를 이용하여 핵산에서의 포스포디에스터 결합 형성을 촉매하는 방법을 제공하기 위함이다.

하나의 양태로서 본 발명은 초고온성 고세균 (hyperthermophilic archaebacteria) 스태필로써머스 마리너스 (Staphylothermus marinus) 균주 유래의 내열성 DNA 연결효소에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, “DNA 연결효소 (DNA ligase)"는 이중가닥 핵산 (double stranded nucleic acid)에서 인접한 5'-인산기 (5'-phosphoryl group)과 3'-수산화기 (3'-hydroxyl group) 간의 포스포디에스터 연결 (phosphodiester linkage) 형성을 촉매하는 효소를 의미한다. 본 발명의 DNA 연결효소는 초고온성 고세균인 스태필로써머스 마리너스에서 유래한 효소로 다음과 같은 과정으로 동정되었다.

스태필로써머스 마리너스 게노믹 DNA (genomic DNA)로부터 DNA 연결효소 유전자를 선별하기 위해, 아케아 (Archaea) 유래의 ATP 의존성 DNA 연결효소 (ATP-dependent DNA ligase)들의 잘 보존된 부위들 사이의 아미노산 서열을 기초로 하여 프라이머들 (primers)을 제작하였다. 스태필로써머스 마리너스 게노믹 DNA를 주형 (template)으로 하여 상기 제작한 프라이머들을 이용하여 DNA 중합효소 연쇄반응을 수행하여, Sma DNA 연결효소의 아미노산 서열이 잘 보존된 부분의 DNA 절편을 증폭 하여 DNA 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을 NCBI BLAST search를 통해 분석한 결과 ATP 의존성 DNA 연결효소들의 잘 보존된 아미노산 서열들과 매우 상동성이 있다는 것을 확인하였으며, 이 DNA 절편의 염기서열을 중심으로 하여 5' 상류방향 (N 말단)과 3' 하류방향 (C 말단)의 프라이머들 (primers)을 각각 합성하였으며, 프라이머 워킹 (primer walking) 방법으로 염기서열을 결정하고, 전체 염기서열로부터 아미노산 서열을 유추하였다. 그 결과, Sma DNA 연결효소는 종지코돈 (stop codon)을 포함하여 1836 염기에 의해 코딩되는 611개의 아미노산을 가지는 단백질로, 약 69.288Da의 분자량을 가지는 것으로 밝혀졌다. Sma DNA 연결효소의 아미노산 서열을 종래의 내열성 ATP 의존성 DNA 연결효소들의 아미노산 서열과 비교 분석한 결과, 본 발명의 Sma DNA 연결효소는 종래의 ATP 의존성 DNA 연결효소들과 상동성을 가지며 DNA 연결 반응 시에 중요하게 작용하는 보존된 6개의 모티프 (motif)로 추정되는 아미노산 서열을 포함하고 있다. 결정된 상기 유전자를 대장균에서 발현시키고 분리하여 DNA 닉 연결 활성 (nick closing activity)을 측정한 결과, DNA 연결 활성을 가지는 신규 DNA 연결효소임을 확인할 수 있었다.

상기 방법으로 분리된 본 발명의 스태필로써머스 마리너스 유래 DNA 연결효소는 다음과 같은 특징을 가진다. Sma DNA 연결효소는 ATP, ADP 및 CTP를 보조인자 (cofactor)로 사용하며, Mg^{2 +}와 Mn^{2 +}을 금속 보조인자로 사용한다. Sma DNA 연결효소는 pH 6 내지 7에서 최적의 활성을 나타낸다. 또한, Sma DNA 연결효소는 65 내지 90℃에서 70% 이상의 활성을 보이며 100℃에서 2.8시간 동안 50%의 활성을 나 타내었다. 또한, Sma DNA 연결효소는 KCl의 10 내지 100mM의 넓은 범위에서 60% 이상의 활성을 보인다.

본 발명에서 제공하는 Sma DNA 연결효소는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가진다. 또한, 본 발명의 Sma DNA 연결효소는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질 뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체를 포함한다. Sma DNA 연결효소의 변이체란 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 경우에 따라서는 인산화 (phosphorylation), 황화 (sulfation), 아크릴화 (acrylation), 당화 (glycosylation), 메틸화 (methylation), 파네실화 (farnesylation) 등으로 수식 (modification)될 수도 있다.

본 발명의 단백질 변이체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내거나 바람직하게는 단백질의 특성이 변형된 변이체이다. 예를 들어, 천연의 단백질이 효소 활성을 보이는 않는 강산성이나 강알카리에서도 효소활성을 나타낼 수 있고, 저온이나 고온에서도 장시간 효소 활성을 가지도록 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증대된 변이체이다. 또는, 효소 촉매활성이 증가된 변이체이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지 는 DNA 연결효소를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명의 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 DNA 연결효소를 코딩하는 핵산 분자는 바람직하게는 서열번호 1의 핵산서열을 가진다.

DNA 연결효소를 코딩하는 핵산 서열은 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 상기 핵산 서열은 천연에서 분리되거나 인위적으로 합성 또는 유전적 재조합 방법을 통하여 제조할 수 있다.

본 발명의 DNA 연결효소를 코딩하는 핵산 분자는 이를 발현하는 벡터에 의해 제공된다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 DNA 연결효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, “벡터”는 숙주 세포에 DNA를 도입하여 단백질을 발현시키기 위한 수단을 말하며, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함한다. 바람직하게는, 플라스미드 벡터이다.

적합한 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종지코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시 코돈 및 종지 코돈은 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임 (in frame)에 있어야 한다. 일반 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 사용할 수 있는 프로모터는 예들 들어, λP_L, lac, trp, tac, T7 프로모터 등의 유도 가능하고 강력한 프로모터가 있다. 사용할 수 있는 시그널 서열은, 숙주가 대장균인 경우에는 예들 들어, PhoA, OmpA, PelB 등이, 숙주가 바실러스속 균인 경우에는 예들 들어, α-아밀라아제, 서브틸리신 등이, 숙주가 효모인 경우에는 예들 들어, MFα, SUC2 등이 있다.

본 발명의 구체적인 실시에서는, 발현벡터 pET-22b(+)에 삽입하여 Sma DNA 연결효소 생산을 위한 재조합 플라스미드 (pESML)를 제작하였다. 상기와 같이 구축된 pESML를 경기도 수원시 권선구 서둔동 소재의 농촌진흥청 농업생명공학연구원 한국농업미생물자원센터에 2005년 10월 11일자로 기탁번호 KACC 95040P으로서 기탁하였다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기의 재조합 벡터로 형질 전환되어 DNA 연결효소를 생산하는 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 Sma DNA 연결효소를 포함하는 벡터를 숙주세포로 형질전환하기 위하여 본 발명에서 숙주세포로의 “형질전환”에는 핵산을 세포내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법 (electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘 (CaPO₄) 침전, 염화칼슘 (CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매기된 형질전환, PEG, 텍스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

상기 벡터로 형질전환되는 숙주세포는 바람직하게는 원핵세포이다. 대장균(Escherichia coli), 로도코커스 (rhodococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 아에로피엄 (Aeropyrum), 피로코커스(Pyrococcus), 써머코커스 (Thermococcus), 시폴러버스 (Syfolobus) 써머플라스마(Thermoplasma), 써모프로퍼우스 (Thermoproteus), 마스티고클라더스 (Mastigocladus), 바실러스(Bacillus), 시네토코커스 (Synechococcus) 및 써르무스 (Thermus) 등을 예로 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는 대장균으로, 대장균 XL-1 블루, 대장균 BL21(DE3), 대장균 JM109, 대장균 DH 시리즈, 대장균 TOP10 및 대장균 HB101 등을 예로 들 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 DNA 연결효소를 발현하는 벡터를 제조하는 단계; 상기 벡터를 숙주세포로 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 상기 형질전환체로부터 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 DNA 연결효소를 제조하는 방법에 관한 것이다.

DNA 연결효소를 발현하는 벡터를 제조하는 방법은 제한효소 및 연결효소를 이용하는 당 분야의 일반적인 재조합 기술에 따른다.

벡터를 숙주세포로 형질전환시키는 방법 및 숙주세포의 종류는 상술한 바와 같다.

형질전환체의 배양은 DNA 연결효소의 발현을 가능하게 하는 적절한 조건하에서 통상적인 방법으로 수행된다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 세포의 성장과 생존에 필수적인 모든 영양소를 함유해야 한다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원, 미량원소 성분 등을 포함한다. 또한, 항생제를 포함할 수 있다. 형질전환체의 배양 온도 및 시간은 배양 조건에 따라 조절할 수 있다. 또한, 단백질을 IPTG (isopropyl-b-D-thiogalactopyranose) 등의 유도제를 이용하여 발현을 유도할 수 있다.

단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있다. 예를 들어, 세포를 원심분리하여 수집하고 프렌치 프레스, 초음파 분쇄기 등을 이용하여 세포를 파쇄하고, 세포 잔여물을 원심분리로 제거하여 상등액을 얻는다. 과발현에 의해 응집된 옥시게나제 단백질은, 적절한 용액에서 단백질을 용해시키고 및 변성시키고 재폴딩시켜서 얻을 수 있다 (Kohno, Meth. Enzym., 185:187-195, 1990). 글루타티온, 디티오트레이톨, β-머캅토에탄올, 시스틴 및 시스타민의 산화 및 환원 시스템이 사용하고 요소, 구아니딘, 아르기닌 등의 재폴딩제 등을 이용한다.

숙주세포로부터 획득한 단백질을 포함하는 용액을 염석 (예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전 (아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 한외여과법, 크로마토그래피(예들 들어, 겔 여과, 이온 교환, 친화도 크로마토그래피) 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 DNA 연결효소 단백질을 정제할 수 있다 (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990).

본 발명의 구체적인 실시에서는, pESML을 E. coli -BL21(DE3)-RIL 균주로 형질전환시키고 암피실린 (Ampicillin)과 클로람페니콜 (Chloramphenicol)을 포함하는 37℃ LB broth에서 배양하며, 흡광도가 약 0.7가 될 때 IPTG를 첨가하여 단백질 과발현을 유도하였다. 세포를 파쇄하여 상층액을 회수하고 UNO^TM S6 컬럼 (BIO-RAD, USA) 및 HisTrap^TM FF (Amersham Co., Sweden) 컬럼을 이용한 크로마토그래피를 수행하여 Sma DNA 연결효소를 분리하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 DNA 연결효소 이용하여 핵산에서의 포스포디에스터 결합 형성을 촉매하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 DNA 연결효소는 이중가닥 DNA(double stranded DNA)에서 인접한 5'-인산기(5'-phosphoryl group)과 3'-수산화기 (3'-hydroxyl group) 간의 포스포디에스터 연결(phosphodiester linkage) 형성을 촉매하는 모든 반응에 이용할 수 있다. 이런 반응은 예를 들어 접착말단 (cohesive termini) 또는 평활말단 (blunt termini)을 가지는 이중가닥 DNA의 연결; 접착말단 DNA에 올리고뉴클레오타이드 링커 또는 어뎁터의 연결; DNA 이중가닥, RNA 이중가닥 또는 DNA-RNA 하이브리드에서 닉(nick)의 복구; 연결효소 연쇄반응 (ligase Chain Reaction: LCR); 반복 확장 검출 (Repeat Expansion Detection: RED); 다중 위치에서의 표적 부위 돌연변이(Simultaneous Mutagenesis of Multiple Sites) 등이 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 국한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야 및 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 스태필로써머스 마리너스 균주의 배양

스태필로써머스 마리너스 균주 (DSM 3639)(참조: Stetter, K. O. et al ., 1986, Int . J. Syst . Bacteriol . 36, 573-576)는 약간 변형된 DSMZ 377 배지에서 배양하였다. 약간 변형된 DSMZ 377 배지의 준비는 다음과 같이 하였다. 배지 성분들 (1 ℓ당 peptone 5.0 g, yeast extract 1.0 g, elemental sulfur 30.0 g, NaCl 13.85 g, MgSO₄ㆍ7H₂O 3.5 g, MgCl₂ㆍ6H₂O 2.75 g, KCl 0.325 g, NaBr 0.05 g, H₃BO₃ 0.015 g, SrCl₂ㆍ6H₂O 7.5 mg, (NH₄)₂SO₄ 10.0 mg, citric acid 5.0 mg, KI 0.05 mg, CaCl₂ㆍ2H₂O 0.75 g, KH₂PO₄ 0.5 g, NiCl₂ㆍ6H₂O 2.0 mg, Rezazurin 1.0 mg) 과 미량원소 용액 (trace element solution) 10.0 ㎖을 준비한 다음, 5 N 황산으로 pH 6.3-6.5를 맞췄다. 120 ㎖ serum bottle (Wheaton Co., USA)에 배지 용액 100 ㎖을 넣고, 질소가스를 이용하여 배지 용액을 포함한 serum bottle 내부를 30분간 교환한 다음, 고무병 마개와 알루미늄 링으로 serum bottle의 입구를 막은 후, 5% 소디움썰파이드 (Na₂Sㆍ9H₂O) 용액을 소량 주입하여 환원시킨 다음 95℃에서 3-5일간 멸균하였다. 멸균된 주사기를 이용하여 스태필로써머스 마리너스 균주를 1% 접종한 후, 90℃에서 5-7일간 배양하였다.

실시예 2: 스태필로써머스 마리너스 게노믹 DNA 의 분리

게노믹 DNA의 분리는 칼러 (Kahler)의 방법을 다음과 같이 약간 변형하여 수행하였다 (참조: Kahler, M., 2000, J. Bacteriol. 182, 655-663). 혐기적 조건하에서 배양된 배양액으로부터 Whatman 필터 (USA)를 통해 황을 제거시킨 후, 원심분리로 균체를 회수하였다. 20% 수크로즈(sucrose)를 포함하는 10 mM Tris-HCl (pH8.0) 완충용액 3ml로 균체를 현탁하고, 얼렸다 녹이기 (freezing and thawing)을 2회 반복하여 세포막을 약화시킨 후, Triton X-100을 최종농도 0.3%가 되도록 첨가하여 상온에서 1시간동안 보관하였다. 여기에 SET (150 mM NaCl / 1 mM EDTA / 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)) 완충용액 3 ㎖과 10% SDS와 RNase (10 mg/㎖) 10 ㎕를 첨가하고 55℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 160 ㎕ proteinase K (1.6 mg/㎕)를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 55℃에서 두 시간 더 반응시켰다. 반응액을 팔콘 튜브 (Falcon tube)로 옮긴 후 chloroform / isoamylalcohol (24 : 1) 용액을 동량 첨가하여 하룻밤 동안 천천히 흔들어주면서 DNA를 추출한 후, 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 이 상층액에 상층액의 2배 부피의 100% 에탄올과 1/10배 부피의 3 M 쇼듐 아세테이트 (pH 5.2)를 첨가하여 게노믹 DNA를 침전시킨 후, 70% 에탄올로 세척하여 진공 건조시킨 다음, TE (10 mM Tris-HCl (pH 7.6) / 1 mM EDTA) 완충용액에 녹였다. 상기와 같이 분리된 스태필로써머스 마리너스 게노믹 DNA는 260 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.

실시예 3: PCR 을 이용한 Sma DNA 연결효소 유전자의 확보

스태필로써머스 마리너스 게노믹 DNA로부터 Sma DNA 연결효소 유전자를 선별하기 위해, NCBI BLAST search를 통해 기존에 보고된 8종류의 아케아 유래의 ATP 의존성 DNA 연결효소들을 선별하여 잘 보존된 부위 2곳을 아래와 같이 선정하였다. 여기에서 약어 Sto는 설포로부스 토코다이 (Sulfolobus tokodaii)(참조: NCBI protein accession number NP-376074), Shi는 설포로부스 시바테 (Sulfolobus shibatae) (참조: NCBI protein accession number AAF61267), Dam은 디설포로부스 엠비벨랜스 (Desulfurolobus ambivalens) (참조: NCBI protein accession number S26383), Pae는 파이로벡큐럼 에어로필럼 (Pyrobaculum aerophilum) (참조: NCBI protein accession number AAD00532), Tvo는 써머플라스마 볼카니엄 (Thermoplasma volcanium) (참조: NCBI protein accession number NP-111756), Mma는 메탄노사르시나 마제이 (Methanosarcina mazei) (참조: NCBI protein accession number NP-633919), Tko는 써머코커스 코다카렌시스 (Thermococcus kodakarensis) (참조: NCBI protein accession number BAD86329), Pab는 파이로코커스 아비씨 (Pyrococcus abyssi) (참조: NCBI protein accession number CAC20743)의 ATP 의존 DNA 연결효소의 잘 보전된 아미노산 서열만을 각각 나타낸 것이다.

Sto DYKYDG DLVVVG

Shi DYKYDG DLVVVG

Dam DYKYDG DLVMVG

Pae EYKYDG DLVVVG

Tvo EYKYDG DLTVVG

Mma EEKYDG DLVVVG

TKO EIKYDG DLVIIG

Pab EIKYDG DLVIIG

PCR 방법으로 Sma DNA 연결효소의 유전자를 찾기 위해서 모든 가능성 있는 아미노산을 포함시켜 혼합 (mixed) 프라이머를 제조하였다. N-말단 프라이머 1은 아미노산 서열 E(D)YKYDG에 해당되는, 서열번호 3의 염기서열 5' GA(N) TAT(C) AAA(G) TAT(C) GAT(C) GGA(T) 3'을 합성하였다. 이 때 3번째 코돈은 축퇴성 코돈 (degenerate codon)을 이용하였다. C-말단 방향 부위는 아미노산 서열 비교에서 크게 차이가 나는 영역이 있어서 혼합 프라이머의 복잡성을 피하기 위해서 2개의 프라이머를 합성하였다. C-말단 프라이머 1은 아미노산 서열 DLVVVG에 해당되는, 서열번호 4의 염기서열 3' CTA(G) A(G)AT(A) CAT(A) CAA(T) CAA(T) CCA(T) 5'을 합성하였으며, 이 때 3번째 코돈은 축퇴성 코돈을 이용하였다. C-말단 프라이머 2는 아미노산 서열 DLVIIG에 해당되는, 서열번호 5의 염기서열 3' CTA(G) A(G)AT(A) CAT(A) TAA(T) TAA(T) CCA(T) 5'을 합성하였으며, 이 때 3번째 코돈은 축퇴성 코돈을 이용하였다.

이들 프라이머들을 이용하여 N-말단 프라이머 1과 C-말단 프라이머 1, N-말단 프라이머 1과 C-말단 프라이머 2를 각각의 조합으로 나누어 스태필로써머스 마리너스 게노믹 DNA를 주형 (template)으로하여 PCR을 실시한 결과 N-말단 프라이머 1와 C-말단 프라이머 1의 조합에서 약 540 bp의 DNA 절편이 증폭되는 것을 확인하였다. 이들 DNA 절편을 아가로스 겔에 전기영동을 한 후, QIA quick Gel Extraction Kit (QIAGEN Gmbh, Germany)를 사용하여 추출ㆍ정제하여 MACROGEN (주)에 시퀀싱을 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 염기서열을 NCBI BLAST search를 통해 조사한 결과 ATP 의존성 DNA 연결효소와 높은 유사성이 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이를 Sma DNA 연결효소 유전자를 선별하기 위한 중심부위로 사용하였다.

실시예 4: 프라이머 워킹 ( primer walking ) 방법을 이용한 Sma DNA 연결효소 유전 자의 중심부위로부터 미지의 인접한 DNA 부위의 탐색

실시예 3에서 분리한 스태필로써머스 마리너스 게노믹 DNA와 상기와 같이 제조한 보존된 중심부위의 염기서열을 이용하여, 서열번호 11 내지 15에 해당하는, 5' 상류방향 (N 말단)과 3' 하류방향 (C 말단)의 프라이머들을 각각 합성하였다. 이를 토대로, 여러 가지 제한효소로 절단된 스태필로써머스 마리너스의 게노믹 DNA에 LA (Long and Accurate) PCR in vitro Cloning Kit (TaKaRa, Japan)를 이용하여 각 제한효소에 맞는 Kit내에 들어 있는 올리고 카세트 (oligo cassette) DNA를 첨가하여 DNA 연결효소로 연결시킨다. 본 실험에서는 보존된 중심부위의 염기서열에 인접한 미지의 5' 상류방향 (N 말단)의 DNA 절편을 확보하기 위해서 스태필로써머스 마리너스의 게노믹 DNA를 HindⅢ로 절단한 후, 여기에 HindⅢ 올리고 카세트 DNA를 첨가하여 DNA 연결효소로 연결반응시켰다. 이 DNA 연결 반응액을, 보존된 중심부위의 염기서열을 이용하여 제작한 서열번호 11의 5' 상류방향 (N 말단)의 SmaATPN-1 프라이머와 올리고 카세트 DNA내의 프라이머들을 이용하여 PCR하여 약 700 bp의 DNA 절편을 증폭하였다. 이들 PCR 단편들은 아가로스 겔에 전기영동을 한 후, QIA quick Gel Extraction Kit (QIAGEN Gmbh, Germany)를 사용하여 추출ㆍ정제하여 MACROGEN (주)에 시퀀싱을 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 또 보존된 중심부위의 염기서열에 인접한 미지의 3' 하류방향 (C 말단)의 DNA 절편을 확보하기 위해서 스태필로써머스 마리너스의 게노믹 DNA를 XbaⅠ으로 처리한 다음 여기에 XbaⅠ올리고 카세트 DNA를 첨가하여 DNA 연결효소로 연결반응시켰다. 이 DNA 연결 반응액을, 보존된 중심부위의 염기서열을 이용하여 제작한 서열번호 12의 3' 상류방향 (C 말단)의 SmaATPC-1 프라이머들과 올리고 카세트 DNA내의 프라이머들을 이용하여 PCR하여 약 500 bp의 DNA 절편을 증폭하였다. 상기와 동일한 방법으로 증폭된 DNA 절편의 염기서열을 결정하였다. 이 방법을 통해 Sma DNA 연결효소 유전자의 많은 염기서열 영역을 확보하였으나, 아직 완전한 유전자의 염기서열을 확보하지 못했다. 따라서 또 다른 방법으로 인접한 미지의 염기서열을 찾을 수 있는 Walking Speedup Kit (Seegene, Korea)를 이용하였다. Walking Speedup Kit (Seegene, Korea)를 이용하여 Kit 내의 4가지 랜덤 (random) 프라이머와 전기한 LA PCR in vitro Cloning Kit 방법을 이용하여 알아낸 유전자 염기서열을 토대로 합성한 서열번호 13과 14의 5' 상류방향 (N 말단)의 SmaATPN-2 프라이머와 SmaATPN-3 프라이머로, 제한효소를 처리하지 않은 완전한 스태필로써머스 마리너스의 게노믹 DNA를 이용하여 2회의 PCR을 거쳐 약 700 bp의 DNA 절편을 특이적으로 증폭하였다. 증폭된 DNA 절편들을 아가로스 겔에 전기영동을 한 후, QIA quick Gel Extraction Kit (QIAGEN Gmbh, Germany)를 사용하여 추출ㆍ정제하여 MACROGEN (주)에 시퀀싱을 의뢰하여 염기서열을 각각 결정하였다. 또 서열번호 15의 3' 하류방향 (C 말단)의 SmaATPC-2 프라이머 1개를 이용하여 2회의 PCR을 통하여 약 1kb의 DNA 절편을 증폭하여 상기와 동일한 방법으로 염기서열을 결정하였다. 이들 절편들의 염기서열을 결정한 결과, 시작코돈을 포함하는 5' 상류방향 (N 말단 부분)과 종지코돈을 포함하는 3' 하류방향 (C 말단 방향)의 염기서열을 확보하였다.

Sma DNA 연결효소 유전자를 코딩하는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 결 정하였다. DNASTAR (DNASTAR Inc., USA) 프로그램을 이용하여, Sma DNA 연결효소 유전자는 종지코돈 (stop codon)을 포함하여 1,836 bp로 이루어져 있으며, 611개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화하고 있는 것으로 확인되었다. 또한 이로부터 추정되는 분자량이 69,288 Da이라는 것을 확인하였다.

실시예 5: Sma DNA 연결효소 유전자의 제한효소 지도 작성

LA PCR in vitro Cloning Kit 사용 시에 이용한 제한효소 부위를 나타내었다. Sma DNA 연결효소 유전자 내에서, kit내의 카세트를 이용할 수 있는 제한효소 부위는 HindⅢ와 XbaⅠ이었다. 이용하지 않은 제한효소 부위도 제한효소에 표기하여, Sma DNA 연결효소 유전자의 제한효소 지도를 작성하였다 (도 1).

실시예 6: Sma DNA 연결효소의 아미노산 서열 결정 및 종래의 DNA 연결효소들의 아미노산 서열과의 비교분석

컴퓨터 프로그램인 DNASTAR (DNASTAR Inc., USA)을 이용하여 실시예 4에서 결정된 Sma DNA 연결효소 유전자의 염기서열로부터 아미노산 서열을 유추한 다음, 컴퓨터 프로그램인 NCBI BLAST Search (USA)를 이용하여 전기 아미노산 서열을 종래의 에어로파이럼 퍼닉스, 파이로코커스 아비씨, 써머코커스 코다카렌시스 ATP 의존성 DNA 연결효소들의 아미노산 서열과 주요 6개의 모티프 (motif)를 비교 분석하 였다 (도 2). Sma DNA 연결효소는 611개의 아미노산으로 구성되어진 새로운 ATP 의존성 DNA 연결효소임이 확인되었다. Sma DNA 연결효소는 에어로파이럼 퍼닉스, 파이로코커스 아비씨, 써머코커스 코다카렌시스 DNA 연결효소들과 각각 67%, 40% 및 40%의 아미노산 서열 상동성을 보였는데, Sma DNA 연결효소 서열 내부에는 내열성 ATP 의존성 DNA 연결효소들에서 잘 보존된 6개의 모티프를 가지고 있음을 확인하였는데, 특히 DNA 연결 활성 중 아데닐레이션 (Adenylation)에 관여되는 모티프 I 에서 매우 높은 아미노산 서열 상동성을 가지는 것으로 확인되었다.

실시예 7: Sma DNA 연결효소 유전자의 발현을 위한 발현벡터의 구축

실시예 4에서 결정된 Sma DNA 연결효소 유전자의 염기서열로부터 N-말단 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 프라이머 (5' 말단 프라이머)와 C-말단 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 염기에 상보적인 프라이머 (3′말단 프라이머)를 각각 제작한 후, PCR을 통해 Sma DNA 연결효소 유전자를 증폭시켰다. 5′ 말단 프라이머 SmLigN (5′-AGGATTACATATGGCTGCACAGCAGAGCGAA-3′ 서열번호 6)는 Sma DNA 연결효소 유전자의 개시코돈 (ATG)을 포함하는 제한효소 NdeI 절단부위를 포함하는 31개의 염기로 합성하였으며, 3′말단 프라이머 SmLigC (5′-ATAACTCGAGTTCAGATAATTTCTTTAGTTGTCTTTT-3′ 서열번호 7)는 Sma DNA 연결효소 유전자의 종지코돈 (TAA)를 제외시키고 대신 발현벡터내의 6개의 히스티딘 다음에 오는 종지코돈 (TGA)에서 멈추도록 제한효소 XhoI 절단부위를 포함하는 37 개의 염기로 합성하였다. 실시예 2에서 분리된 스태필로써머스 마리너스 게노믹 DNA를 주형 DNA (template DNA)로 사용하여, PCR을 수행하였다. PCR은 0.2 ㎍ 스태필로써머스 마리너스 게노믹 DNA와 20 pmole의 5′말단 프라이머 및 3′말단 프라이머, 200 μM dNTPs, 10X PyroAce DNA 중합효소 완충용액 및 2.5 U Super PyroAce DNA 중합효소로 이루어진 혼합 조성액을 95℃에서 3분간 반응시킨 후 94℃ 50초, 58℃에서 60초, 72℃에서 240초의 조건으로 30회 반복한 후, 마지막 72℃에서 10분간 반응시켰다. DNA 사이즈 마커 (size marker)와 함께 0.8% 아가로스 겔에 전기영동하여 약 1.8 kb 위치에 밴드가 존재하는 것을 확인하였다. PCR이 끝난 반응 혼합물을 1% 아가로스 겔에 전기영동하여, PCR을 통해 증폭된 약 1.8 kb의 DNA 산물을 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen Gmbh, Germany)을 사용하여 정제하여 회수하였다. 회수된 DNA를 제한효소 NdeI 및 XhoI으로 절단한 다음, 1% 아가로스 겔에 다시 전기영동하여 약 1.8 kb 위치에 해당하는 겔 단편을 전기의 Kit를 사용하여 Sma DNA 연결효소 유전자 절편을 정제하여 회수하였다. 정제된 Sma DNA 연결효소 유전자 절편을 동일한 제한효소로 절단된 발현벡터 pET-22b(+) (Novagen, USA)에 삽입하여 T4 DNA 연결효소를 사용하여 연결시킨 후, 일렉트로포레이션 (electroporation) 방법으로 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL (Stratagene, USA)에 형질전환시켰다 (참조: Sambrook, J. et al., 1989, Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press). 형질전환체들로부터 알카리 용균법에 의해 플라스미드 DNA를 분리한 다음, 제한효소 NdeI 및 XhoI으로 절단한 후, 0.8% 아가로스 겔에 DNA 사이즈 마커와 함께 전기영동하여 Sma DNA 중합효소 유전자가 발 현벡터내에 정확히 삽입되어 있는지의 여부를 재확인하였다.

상기와 같이 구축된 Sma DNA 연결효소 유전자의 발현을 위한 발현벡터를 pESML로 명명하였다 (도 3). 상기 Sma DNA 연결효소 유전자 및 유전자를 포함하는 발현벡터 및 발현벡터를 포함한 대장균을 농촌진흥청 농업생명공학연구원 한국농업미생물자원센터에 2005년 10월 11일 기탁유전자명은 Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL / pESML, 기탁번호 KACC 95040P으로 기탁하였다.

실시예 8: Sma DNA 연결효소의 발현 및 정제

실시예 7에서 구축된 발현벡터 pESML를 함유한 균주 E. coli-BL21(DE3)-RIL를 암피실린 (Ampicillin)과 클로람페니콜 (Chloramphenicol)이 각각 100 ㎍/㎖과 50 ㎍/㎖ 농도로 첨가된 LB broth 배지 3 ㎖에 접종하여 37℃에서 10시간 정도 전배양한 다음, 각각 100 ㎍/㎖과 50 ㎍/㎖ 농도로 암피실린과 클로람페니콜이 첨가된 LB broth 배지 1 ℓ에 1% 접종하여 600 nm 파장에서 측정한 흡광도가 0.7이 될 때까지 37℃에서 배양한 후, 최종 농도가 0.5 mM이 되도록 IPTG를 첨가하고, 다시 6시간 동안 배양을 계속하였다. 이어서, 원심분리를 통해 균체를 회수한 다음, sonication buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.4) / 1 mM EDTA /1 mM PMSF)를 첨가하여 현탁한 다음, 초음파를 통해 균체를 파괴시켰다. 완전히 깨어지지 않은 세포와 세포조각들을 제거하기 위해 파쇄액을 13,000 rpm에서 원심분리한 후, 상층액을 취하였다. 대장균 유래의 단백질들을 제거하기 위하여 상층액을 80℃에서 50분간 열처 리한 후, 원심분리를 통해 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액은 Buffer A (20 mM Tris-HCl (pH 7.4) / 1 mM EDTA)로 평형화된 UNO^TM S6 컬럼 (BIO-RAD, USA)에 주입된 후, 0.1-1 M NaCl로 용출시켰다. 활성을 갖는 프랙션 (fraction)들은 회수한 후, 0.5 M NaCl을 포함하고 1 mM EDTA를 포함하지 않는 buffer A에 투석 (dialysis)시킨 후, HisTrap^TM FF (Amersham Co., Sweden) 컬럼을 통과시켰다. 활성을 갖는 프랙션을 완충액으로 평형화된 HisTrap^TM FF 컬럼에 주입시켜 0.1-0.5 M Imidazol로 용출시켰다. 활성을 갖는 프랙션들을 회수한 후, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4)에 투석하여 Imidazol을 제거한 후 4℃에 저장하여, 이를 Sma DNA 연결효소 특성 조사에 사용하였다.

실시예 9: 단백질 농도 및 SDS - PAGE 분석

실시예 8에서 정제한 효소단백질 농도의 정량은 Lowry 방법에 의해 BSA를 표준 단백질로 하여 측정하였다 (참조: Lowry et al., 1951). 그리고 SDS-PAGE 분석을 통해 C 말단에 6개의 히스티딘을 포함하는 재조합 Sma DNA 연결효소가 69 kDa이라는 것을 확인하였다 (도 4). 재조합 Sma DNA 연결효소와 실시예 4를 통한 Sma DNA 연결효소의 추정 분자량과 일치한다는 것을 확인하였다.

실시예 10: DNA 연결효소 활성 측정을 위한 방법과 준비

DNA 연결효소의 연결반응 활성 측정을 위해 닉 연결활성 분석 (nick closing activity assay)방법을 사용하였다. 방사성 동위원소를 사용하지 않는 간접적인 방법으로, Thorbjarnardottir 등의 방법 (참조: Thorbjarnardottir et al., 1995)을 선택하였다. 기질 (substrate)은, 이중 가닥 DNA 중 한쪽 가닥은 주형 (template) DNA로 70개의 긴 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide) SM-Tem이고 다른 가닥은 주형 올리고뉴클레오타이드과 상보적으로 닉(nick)이 존재하는 2개의 올리고뉴클레오타이드가 존재하도록 하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드를 (주)바이오나아에 의뢰하여 제작하였다. 주형 (template) DNA인 SM-Tem의 염기서열은 서열번호 8의, 5'-GACGCGAACCACGGTACTCGACGCTCCTCTAGACCCGACCTGTTGGCATGCAGCTACGGATCCGGACTCG-3'이다. 그리고 주형 DNA의 5' 영역에 상보적인 올리고뉴크레오타이드 3SM-Com의 염기서열은 서열번호 9의 5'-GGTCTAGAGGAGCGTCGAGTACCGTGGTTCGCGTC-3'이고, 주형 DNA의 3' 영역에 상보적인 올리고뉴크레오타이드 5SM-Com의 염기서열은 서열번호 10의 5'-CGAGTCCGGATCCGTAGCTGCATGCCAACAGGTCG-3' 이다. 이들 기질로 이용되는 올리고뉴클레오타이드 중 3SM-Com은 3'-OH 말단에 비오틴 (biotin)을 5' 말단에 인산 (phosphate)을 넣어서 합성하고, 다른 올리고뉴클레오타이드 5SM-Com의 5'-P 말단쪽에 형광인 프루오르스세인(fluorescein)을 넣어 합성하였다. 그리고 이들 올리고뉴클레오타이드들을 각각 5 pmol씩을 취하여 94℃에서 5분간 처리하여 변성시킨 후 25℃에서 20분간 방치하여 어닐링 (annealing)한 다음 기질로 이용하여 전기 DNA 연결효소의 닉 연결 활성 (nick closing activity)을 조사하는데 기질로 사용하였 다.

또 효소 반응기로서 96-웰 플레이트를 사용하였으며, 효소 반응기질인 3SM-Com은 3'-OH 말단에 결합되어 있는 비오틴 (biotin)이 96-웰 마이크로플레이트에 잘 결합할 수 있도록 스트렙타아비딘 (streptavidin)의 코팅을 아래와 같이 하였다. 96-웰 마이크로플레이트의 각 웰당 100 ㎕의 코팅완충액 (carbonate buffer)(1 L당 1.59 g Na₂CO₃, 2.93 g NaHCO₃, 0.2 g NaN₃)에 0.5 ㎍의 스트렙타아비딘 (streptavidin)을 녹여 첨가한 후, 37℃에서 2시간 동안 방치하여 스트렙타아비딘을 코팅했다. 전기의 웰에 2% BSA가 포함된 1X TBST (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20)를 넣어 37℃에서 30분 동안 방치하여 코팅되지 않은 부분을 채워 (blocking)주었고, 웰을 1X TBST 완충액으로 3회 씻어주었다.

실시예 11: Sma DNA 연결효소의 특성 조사

DNA 연결반응 활성의 측정은 Thorbjarnardottir 등의 방법 (참조: Thorbjarnardottir et al., 1995)을 이용하여 다음과 같이 수행하였다. 반응 혼합물 (정제된 Sma DNA 연결효소액 0.2 pmol, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 0.01% BSA, 실시예 10에서 제조된 닉이 있는 70 염기 DNA 기질 (substrate) 5 pmol, 1 mM ATP) 20 ㎕를 70℃에서 20분간 반응시킨 후, 얼음에서 급랭 시켰다. 100 mM EDTA를 2 ㎕ 첨가하여 반응을 종결시킨 후 전기 반응액 20 ㎕을 실시예 10의 코팅된 96-웰 플레이트에 옮겨서 1X TBST 30 ㎕을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 반응액을 제거하고 웰을 멸균수로 씻어 (washing) 주고 0.1 N NaOH를 70 ㎕을 첨가하여 5분간 변성시켰다. 멸균수로 2회 1X TBST로 2회 씻어준 후, 알칼라인 포스파타아제 (alkaline phosphatase, 이하 ‘APase’라고 함)가 결합된 형광인 프루오르스세인 (fluorescein)에 대한 2차 항체 (second antibody)를 1/1000로 희석하여 50 ㎕ 씩 넣고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응액을 제거한 후 1X TBST로 6회 씻어낸 다음, APase에 대한 기질 용액 (5 mM ρNPP, 100 mM Tris-HCl (pH 9.0), 1 mM MgCl₂, 0.5 mM ZnCl₂)을 70 ㎕ 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켜 발색 반응이 일어나도록 하였다. ELISA reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하여 닉연결 활성 (nick closing activity)을 측정하였다.

먼저 전기 Sma DNA 연결효소의 보조인자 (cofactor) 사용여부에 대한 영향을 조사하였다. ATP 뿐만 아니라 ADP에서도 80% 이상의 활성이 나타났으며, CTP 사용 시에도 40% 이상의 활성을 나타내었다 (도 5). 금속 보조인자에 대한 영향을 조사하였다. 여러 가지 2가 양이온의 사용여부를 조사한 결과 Mg^{2 +}와 Mn^{2 +}에서는 높은 활성이 나타났으며, Ca^{2 +}와 Zn^{2 +}에서는 저해되는 현상을 나타내었다 (도 6). Mg^{2 +}와 Mn^{2 +}의 농도에 따른 활성을 조사한 결과 두 종류 모두 6 mM 농도에서 최적의 활성을 나타내었다 (도 7). 전기 Sma DNA 연결효소의 pH에 대한 영향을 조사하였다. 20 mM MES-NaOH (pH 6.0-7.0)와 20 mM Tris-HCl (pH 7.0-9.0)에서 활성을 조사한 결과 20 mM Tris-HCl (pH 6.5)에서 최적의 활성이 확인되었다 (도 8). 전기 Sma DNA 연결효소의 온도에 대한 영향을 조사하였다. 40-90℃에서 활성을 조사한 결과 75℃에서 최적으로 확인되었다 (도 9). 전기 Sma DNA 연결효소의 내열성을 조사하기 위해, 각각 100℃, 95℃, 85℃ 및 75℃에서 0-4시간동안 열처리를 한 후, 상기의 방법에 의해 활성을 측정한 결과 100℃에서 2.8시간 동안 50%의 활성을 나타내었다 (도 10). 다음으로 Sma DNA 연결효소의 KCl (0-200 mM)에 대한 영향을 조사한 결과 0-40 mM 까지 활성이 증가함을 확인하였다 (도 11). 이 결과로부터 발현벡터 pESML를 가지는 균주에서 발현된 단백질은 분명하게 DNA 연결 활성을 가지는 내열성 DNA 연결효소임이 확인되어, 본 발명의 유전자는 스태필로써머스 마리너스부터 분리된 DNA 연결효소 (Staphylothermus marinus DNA ligase, Sma DNA ligase) 유전자임을 다시 한 번 확인할 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 스태필로써머스 마리너스 (Staphylothermus marinus)로부터 새로운 내열성 DNA 연결효소 (Staphylothermus marinus DNA ligase, Sma DNA ligase) 를 제공하며, 상기 효소를 핵산에서의 포스포디에스터 결합 형성을 촉매하는 다양한 반응에 이용할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

1. 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 DNA 연결효소(DNA ligase)
2. 제1항의 DNA 연결효소를 코딩하는 핵산 분자.
3. 제2항에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드를 서열을 가지는 핵산 분자.
4. 제1항의 DNA 연결효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
5. 제4항에 있어서, 벡터가 pESML인 재조합 벡터.
6. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
7. 제1항의 DNA 연결효소를 발현하는 벡터를 제조하는 단계; 상기 벡터를 숙주세포로 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 상기 형질전환체로부터 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 DNA 연결효소를 제조하는 방법.
8. 제1항의 DNA 연결효소 이용하여 핵산에서의 포스포디에스터 결합 형성을 촉매하는 방법.

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